MXPA05005032A

MXPA05005032A - Sustancia fki-1033 novedosa y proceso para producir la misma.

Info

Publication number: MXPA05005032A
Application number: MXPA05005032A
Authority: MX
Inventors: Satoshi Omura; Kazuro Shiomi; Rokuro Masuma
Original assignee: Kitasato Inst
Priority date: 2002-11-12
Filing date: 2002-11-12
Publication date: 2008-02-05
Also published as: ATE419373T1; EP1561820A1; NZ539986A; JP4176077B2; ES2318053T3; JPWO2004044214A1; EP1561820B1; EP1561820A4; BR0215937A; DE60230686D1; CA2504309A1; AU2002344494A1; US20060111280A1; US7541336B2; WO2004044214A1; NO20052150L

Abstract

La presente invencion esta comprendida de microorganismo de cultivo que tienen la capacidad para producir la sustancia FKI-1033 representado por la formula: (ver formula) en un medio, la sustancia FKI-1033 de acumulacion en el medio de cultivo, y la sustancia FKI-1033 aislada de la masa cultivada. La sustancia FKI-1033 de este modo obtenida tiene actividad de inhibicion de union de rianodina, actividad insecticida y actividad antihelmintica, y se espera como farmacos utiles como agroquimicos, farmacos y medicamentos veterinarios en efectividad y toxicidad.

Description

SUSTANCIA FKI-1033 NOVEDOSA Y PROCESO PARA PRODUCIR LA MISMA Campo Técnico La presente invención se relaciona a la sustancia FKI-1033 novedosa, que es efectiva como agroquímicos, medicinas y farmacéuticos veterinarios que tienen una actividad de inhibición de unión rianodina, una actividad insecticida y actividad antihelmíntica y producción de la misma .

Técnica Antecedente El insecticida ha contribuido indudablemente a incrementar la producción de recursos alimenticios y suministro estable, sin embargo, ha ocasionado grandes problemas tales como la toxicidad residual y la destrucción de sistemas ecológicos. Los parásitos se han reducido como los resultados de la mejora en la higiene y progreso medioambiental de antihelmínticos, aunque recientemente, los parásitos aferentes, parásitos zoonóticos, parásitos optimísticos y parásitos derivados de perecederos se incrementa, y como un resultado varios parásitos llegan a ser un problema. En la estabilidad del ganado y la agricultura, los parásitos provocan gran carga económica en el presente . Entre los parásitos, con respecto a la infección de helminto, muchos compuestos se utilizan, tales como ivermectina, mebendazol, praziquantel, etc. Sin embargo, los agentes antihelmínticos actualmente utilizados no son siempre satisfactorios en vista de la efectividad y toxicidades, y nuevos agentes aún se demandan.

Descripción de la invención Un receptor de rianodina es un canal iónico que induce Ca2+ de almacenamiento intracelular en el citoplasma con nivel de Ca2+ incrementado en el citoplasma, y se describe como un receptor de la planta alcaloide, rianodina que muestra la actividad insecticida. En los mamíferos, tres tipos del receptor rianodina, es decir tipo 1 (el tipo muscular de esqueleto) , tipo 2 (el tipo miocardio) y tipo 3 (el tipo cerebral) , que se codifican independientemente en el gen, se conocen como un resultado de la clonación de gen. La estructura primaria del receptor de rianodina ha sido explicado (Takeshima, H., Ann. N. Y. Acad. Sci. 707, 165-177, 1993) . Se identifica en los insectos y helmintos como el receptor de rianodina que no pertenece a los tres tipos anteriores (Takeshima, H. Proteins, Nucleic Acids and Enzymes, 43: 1603-1609, 1998). En consecuencia, se reportó que entre las sustancias que inhiben la unión de rianodina en el receptor de rianodina, aquellos tienen selectividad elevada en insectos y los helmintos se prevén como insecticidas y sustancias antihelmínticas (M. Schmitt et al. Pesticide Sci. 48: 375-385, 1996) . Se ha enfocado el estudio del receptor rianodina y se continúa explorando los inhibidores de unión de rianodina de los productos de cultivo microbiano para obtener fármacos novedosos que se satisfacen en la efectividad y toxicidad del fármaco, y como un resultado, se ha encontrado que el compuesto novedoso, la sustancia FKI-1033, que se produce por la cepa del hongo FKI-1033 tuvo una actividad de inhibición de unión de rianodina así como que tiene actividad insecticida y actividad antihelmíntica, y se complementa en la presente invención. La presente invención tiene un aspecto para proporcionar la sustancia FKI-1033 novedosa, que es efectiva como agroquímicos, medicinas y farmacéuticos veterinarios que tienen una actividad de inhibición de unión rianodina, una actividad insecticida y actividad antihelmíntica y la producción de la misma. La sustancia F I-1033 puede obtenerse cultivando un microorganismo que pertenece al hongo que tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 en un medio, la acumulación de sustancia FKI-1033 en la masa cultivada y la sustancia FKI-1033 aislada de la masa cultivada.

Un objeto de la presente invención es proporcionar la sustancia FKI-1033 novedosa representada por la siguiente estructura química: Otro objeto de la presente invención es proporcionar un proceso para la producción de la sustancia FKI-1033 novedosa que comprende cultivar un microorganismo que tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 en un medio, la sustancia FKI-1033 de acumulación en el medio de cultivo y la sustancia FKI-1033 aislada de la masa cultivada. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar un microorganismo Verticillium sp. FKI-1033 FERM BP-8291 que pertenece al hongo de género. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar el microorganismo Verticillium sp . FKI-1033 que tiene la capacidad para producir la sustancia F I-1033 y que pertenece al hongo de género. Un objeto adicional de la presente invención es proporcionar el microorganismo Verticillium sp . FKI-1033 FERM BP-8291 que tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 y que pertenece al hongo de género. El objeto adicional de la presente invención es proporciona el proceso para la producción de la sustancia FKI-1033 novedosa en donde el microorganismo tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 es Verticillium sp. FKI-1033 FERM BP-8291 o su cepa mutante que tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033. El objeto adicional de la presente invención es proporcionar la sustancia FKI-1033 que tiene una actividad de inhibición de unión rianodina y la sustancia FKI-1033 que tiene la actividad insecticida y la actividad antihelmíntica. El objeto adicional de la presente invención es proporciona el uso de la sustancia FKI-1033 para la producción de agroguímicos, medicinas y farmacéuticos veterinarios que tienen la actividad insecticida y la actividad antihelmíntica entre las sustancias que inhiben la unión de rianodina en el receptor rianodina. El objeto adicional de la presente invención es proporciona la sustancia FKI-1033 para la producción de agroguímicos, medicinas y farmacéuticos veterinarios que tienen la actividad insecticida y la actividad antihelmíntica entre las sustancias que inhiben la unión de rianodina en el receptor rianodina.

El microorganismo que tiene la capacidad para producir la sustancia FKI-1033 novedosa representada por la fórmula en lo anterior (de aquí en delante designada como "microorganismo de producción de sustancia FKI-1033" ) es el hongo, y puede ser el microorganismo que tiene la capacidad para producir la sustancia FKI-1033 de la presente invención sin limitación especifica. El ejemplo preferible de la cepa utilizada para la producción de la sustancia FKI-1033 de la presente invención es la cepa Verticillium sp. FKI-1033 que fue nuevamente aislada de una muestra de suelo recolectada en Kagoshima Pref. por la presente invención. Las propiedades taxonómicas de la cepa son como sigue. (1) Características morfológicas La cepa muestra relativamente buen crecimiento en el medio agar de glucosa de papa, medio agar de harina de maíz, medio agar de Miura, medio agar de extracto de malta y medio agar de avena. La Conidiogénesis en cada medio se modera . La observación microscópica de las colonias que crecen en el medio agar de extracto de malta se mostró tejido reticulado de los hongos con septo, y los conidioforos que brotaron de la micelia aérea con ramificación en algunos momentos. La fialida se observó directamente del tejido reticulado de los hongos aéreos o sólo o dos a cuatro verticilaciones en la parte media o la parte superior de las conidioforas . La longitud de la fialida fue de 25-80 µm con dilatación ligera en la base (2.0-2.8 µm) y reducción con la forma cuneiforme de la parte superior. Las conidias fueron suglobosa a oval (2.5-4.0 X 2.0-3.0 µm) y la masa conidial viscosa formada de la parte superior de la fialida. (2) Propiedades de cultivo en varios medios agar Las observaciones macroscópicas de la cepa cultivada en varios medios agar a 25°C durante 7 días se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 (3) Propiedades fisiológicas (1) Condición de crecimiento óptimo Las condiciones de crecimiento óptimo de las cepas fue de pH 5-7 y 18.5-29.0°C. (2) Rango de crecimiento El rango de pH para el crecimiento de la cepa fue de 4-10, y el rango de temperatura fue de 6.5-31°C. (3) Naturaleza: aeróbico Como un resultado de la comparación con las propiedades morfológicas, las propiedades de cultivo y las propiedades fisiológicas de la cepa FKI-1033 y las cepas conocidas, la presente cepa se identificó como una cepa que pertenece al género Verticillium, y se refiere a Verticillium sp. FKI-1033. La cepa se depositó como Verticillium sp. FKI-1033 en el Depósito de Organismo de Patente Internacional, Instituto Nacional de la Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada de AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japón. La fecha de depósito fue el 21 de octubre de 2002 como deposición ?o. FERM BP-8219 La producción de la sustancia FKI-1033 de la presente invención puede realizarse cultivando la sustancia FKI-1033 produciendo microorganismos que pertenecen a un hongo en un medio, el aislamiento de la masa cultivada de la misma y la purificación de la misma. Ya que las propiedades taxonómicas generales de los microorganismos son muy fácilmente mutadas y no son estables, no sólo los mutantes naturales aunque también los mutantes artificiales obtenidos por irradiación ultravioleta convencional o tratamiento con inductor mutante tal como ?-metil-?1 -nitro-?-nitrosoguanidina, incluyendo toda la sustancia FKI-1033 que produce las cepas que pertenecen al hongo pueden utilizarse en la presente invención. Las fuentes nutrientes adecuadas para la producción de la sustancia FKI-1033 pueden ser las fuentes nutrientes de hongo. Por ejemplo, las fuentes nutrientes que pueden utilizarse son comercialmente disponibles de las fuentes de nitrógeno tales como peptona, extracto de carne, licor impregnado de maíz, polvo de semilla de algodón, polvo de cacahuetes, carne de soya, extracto de levadura, NZ-amina, hidrolizato de caseína, nitrato de sodio, nitrato de amonio y sulfato de amonio, carbohidratos tales como glicerina, almidón, glucosa, galactosa y mañosa, o fuentes de carbono tales como ácidos grasos, y sales inorgánicas tales como cloruro de sodio, fosfato, carbonato de calcio y sulfato de magnesio, solo o en combinación de los mismos. Si es necesario, las sales de metal de traza, aceite animal, vegetal y mineral como un agente antiespumante puede agregarse . Estas son sustancias preferibles que pueden utilizarse mediante la producción de microorganismo y útiles para la producción de la sustancia FKI-1033, y todos los materiales conocidos para el cultivo del hongo pueden utilizarse. En la producción de masa de la sustancia FKI-1033, el cultivo líguido se aplica preferiblemente. La temperatura de cultivo puede aplicarse dentro de un rango de crecimiento de la cepa de producción y la producción de la sustancia FKI-1033. La condición de cultivo de aquí en adelante descrita puede opcionalmente seleccionarse dependiendo de las propiedades del microorganismo de producción de la sustancia FKI-1033. La sustancia FKI-1033 puede extraerse utilizando el solvente orgánico inmiscible al agua tal como cloroformo y acetato de etilo de líquido cultivado. Además de la extracción anterior, los métodos de aislamiento conocidos utilizados para la recolección de la sustancia soluble en grasa tales como cromatografía de adsorción, cromatografía de partición, cromatografía de filtración de gel, raspadura de cromatografía de capa delgada, cromatografía de contracorriente centrífuga y cromatografía líquida de alto rendimiento puede aplicarse en combinación o repetidamente para obtener la sustancia purificada. Las propiedades fisicoquímicas de la sustancia FKI-1033 de la presente invención son como siguen. (1) Naturaleza: aceite incoloro (2) Peso molecular: 875.5397 (M+Na, espectroscopia de masa de bombardeo de átomo rápido de resolución elevada) (3) Fórmula molecular C4H76N4O? (4) Rotación específica: [ ]D25 = -53.0° (c = 0.2, metanol) (5) Espectro de absorción ultravioleta (en metanol) : absorción máxima en 202 nm (e = 19700) (6) Espectro de absorción infrarroj (KBr) : absorción máxima en 3467, 2956, 2933, 2862, 1743, 1662, 1464, 1416, 1205, 1084 cm"1 (7) """H protón NMR: Cambio químico en cloroformo de deuterio y la constante de acoplamiento de giro se midieron utilizando un espectrómetro Unity Inova 600 NMR, Varian Inc., el Cambio químico Norteamericano (ppm) y la constante de acoplamiento de giro (Hz) se muestran en la Tabla 2. (8) 13C NMR: Cambio químico en cloroformo de deuterio se midió utilizando un espectrómetro Unity Inova 600 NMR, Varian Ine . , el Cambio químico Norteamericano (ppm) se muestra en la Tabla 2. (9) La solubilidad en solvente: Soluble en metanol, etanol, acetato de etilo y cloroformo. Difícilmente soluble en agua y n-hexano. (10) Reacción de color: Positivo para ácido sulfúrico.

Tabla 2 ^C *H 171.2s 171. Os 170.8s x 4 170. Os 169.9s X 2 169.8s 169.3s x 3 169.2s 71.6d 5.11dd (ÍH, J=2.5, 10.6) 71.3d x 3 5.42m (3H) 71. Od 5.45dd (1H, J=5.3, 8.4) 70.8d 5.36dd (ÍH, J=5.3, 9.0) 70.7d 5.32dd (ÍH, J=3.3, 10.1) 54.4d 4.56q ( 1H, J=7 3) 51.94d x 3 5.40q ( 3H, J=7 2) 51.85d 5.54q ( ÍH, J=7 4) 51.76d 5.30q 1H, J=7 4) 51.5d 5.53q ( ÍH, J=7 3) 31.5q 3.18s 3H) 31.40t x 5 1.31m 10H) 31.36t x 2 1.30m 4H) 31.2t 1.78m 2H) 31.lt 1.78m 2H) 31. Ot x 3 1.78m 6H) 30.98t 1.78m 2H) 30.97q 2.96s Í3H) 30.92t 1.78m f2H) 30.73q x 3 2.91s (9H) 30.66q 3. Oís (3H) 29.4q 2.89S (3H) 25.lt 1.30m (2H) 24.83t 1.30m (2H) 24.82t 1.30m (2H) 24.76t x 4 1.30m (8H) 22.42t x 4 1.30m (8H) 22.39t x 3 1.30m (6H) 15.9q 1.59d (3H, J=7 3) 15. Oq 1.41d (3H, J=7 4) 14.8q 1.45d (3H, J=7 3) 14.2q x 3 1.38d (9H, J=7 2) 14. Oq 1.39d (3H, J=7 4) 13.93q x 3 0.88m (9H) 13.90q 0.88m (3H) 13.88q x 3 0.88m (9H) En la Tabla, cada símbolo muestra: s: singlete, d: doblete, t: triplete, q: cuarteto, m: multiplete, H: número de protón, J: constante de acoplamiento (Hz) . Como un resultado de la discusión y examinación detallada de varias propiedades fisicoquímicas y datos espectrales de la sustancia FKI-1033, la estructura química de la sustancia de FKI-1033 se determinó para representarse por la siguiente fórmula. El protón y el espectro 13C NMR de la sustancia FKI-1033, se mostraron la tensión de señal 1.75 veces por encima de la fórmula molecular. Esto puede ser debido a que la sustancia FKI-1033 puede existir en la forma de dos tipos de isómero conformacional con una relación de 3:4. En un isómero conformacional, el número de señal puede solamente observarse en 1/4 del mismo. Esto sugiere que la conformación es la simetría de rotación de cuatro veces .

Como se describe de aquí en adelante, varias propiedades fisicoquímicas de la sustancia FKI-1033 se describen en detalle, y ningún compuesto idéntico con estas propiedades se ha reportado, consecuentemente las sustancias de FKI-1033 se determinó como una sustancia novedosa. La actividad de inhibición de unión de rianodina de la sustancia FKI-1033 de la presente invención se explicará en detalle como sigue . (1) Preparación de la fracción del receptor rianodina sin purificar del insecto se realizó como sigue. El tórax y las patas de diez insectos adultos de Periplaneta americana se congelaron con nitrógeno líquido y se cortaron finamente, y se homogenizaron tres veces en 15 ml de tampón 50 mm Tris HCl (pH 7.4) que contiene lupeptina 4 µg/ml y pepstatina 3 µg/ml utilizando un homogenizador de cuchillo a 0°C, 24,000 rpm durante 30 seg. El homogenado se filtró utilizando ropa de algodón en capas dobles y el filtrado se centrifugó a 4°C, 3,000 rpm durante 20 minutos. El sobrenadante obtenido se centrifugó a 4°C, 30,000 rpm durante 30 minutos y el precipitado se suspendió en 1 ml de tampón 20 mm Tris HCl (pH 8.0) que contiene 0.3 M de sacarosa, cloruro de calcio 500 µM, y cloruro de potasio 1.5 M y se homogenizó con un crisol de vidrio para obtener la fracción del receptor rianodina sin purificar. La fracción del receptor de rianodina sin purificar se utilizó diluyendo aproximadamente 7 veces con el tampón A (tampón 20 mm TrisHCl (pH 8.0) que contiene 4 µg/ml de aprotinina, 4 µg/ml leupeptina, 0.3 M de sacarosa y 500 µM de cloruro de calcio) inmediatamente antes del uso. (2) Preparación de la fracción del receptor rianodina sin purificar de mamífero se realizó como sigue. Los músculos de las patas traseras del ratón ICR se cortaron finamente, y 3.0 g de las mismas se homogeneizaron a 0°C, 1,000 rpm durante 3 x 30 seg. utilizando el homogenizador de vidrio en 15 ml de tampón B (20 mM Tris-HCl tampón (pH 8.0) que contiene aprotinina 4 µg/ml y leupeptina 4 µg/ml) . El homogenado se transfirió en el tubo de microprueba, y el homogenizador vitro también se lavó con 7.5 ml de tampón B, y la solución lavada también se agregó al microtubo de prueba, el cual se agitó, entonces se centrifugó utilizando ultracentrífugo enfriado a 4°C, 25,000 x g durante 40 min. Se agregó 2.4 ml del tampón B al precipitado obtenido y se suspendió para obtener la fracción del receptor de rianodina sin purificar del ratón origen. (3) La actividad de unión del receptor de rianodina sin purificar de Periplaneta americana se sometió a ensayo como sigue. Se agregaron 70 µl del tampón A, 10 µl de solución de etanol de 0.1 nM rianodina y 10 µl de 20 nM [9,21-3H] (N) rianodina en la microplaca de 96 pozos (Corning Inc. the U.S.) . Se agregaron 10 µl de la fracción del receptor de rianodina sin purificar de Periplaneta americana para iniciar la reacción, y se agitó a temperatura ambiente durante 90 minutos utilizando el mezclador de microplaca. La mezcla de reacción se filtró con el filtro de fibra de vidrio (Wallac Ine, Printed Filtermat B) utilizando un cosechador 96 Mach III M (Tomtech Inc.), y se lavó tres veces con 300 µl de 20 mM Tris HCl tampón (pH 8.0) a temperatura baja. El filtrado se secó utilizando el horno de microondas. Una hoja de cintilador (Wallac Inc. U.S., MeltiLex™ B/HS) se recubrió en el mismo y la hoja se fusionó en la placa caliente. La radioactividad se midió midiendo la intensidad de fluorescencia del filtro utilizando el contador de cintilación (Wallac Inc. the U.S., MicroBeta™ TriLux) . La actividad de inhibición de unión de rianodina de la sustancia FKI-1033 se sometió a ensayo agregando la sustancia FKI-1033 inicialmente en el ensayo de la actividad de unión de rianodina y se calculó por la siguiente ecuación cuando se comparó con la actividad de unión de rianodina de control . Actividad de inhibición de unión de rianodina = (1 (radioactividad en la adición de la sustancia FKI- 1033/Radioactividad de control) ) lOO . De acuerdo a los resultados calculados de la ecuación anterior, la sustancia FKI-1033 mostró la actividad de inhibición de unión de rianodina, IC50 = 4.2 µM, contra el receptor de rianodina del origen Periplaneta americana. (4) Actividad de unión del receptor de rianodina de mamífero sin purificar se sometió a ensayo como sigue. Se agregaron 70 µl del tampón A, 10 µl de solución de etanol de 0.1 nM de rianodina y 10 µl de 20 nM [9,21-3H] (N) de rianodina en la microplaca de 96 pozos (Corning Inc. the U.S.) . Se agregó 10 µl de la fracción del receptor de rianodina sin purificar del ratón origen para iniciar la reacción, y se agitaron a temperatura ambiente durante 90 minutos, utilizando el mezclador de microplaca. La mezcla de reacción se filtró con el filtro de fibra de vidrio (Wallac Ine, Printed Filtermat B) utilizando el cosechador 96 Mach III M (Tomtech Inc.), y se lavó tres veces con 300 µl de tampón 20 mm Tris HCl (pH 8.0) a baja temperatura. El filtrado se secó utilizando el horno de microondas. La hoja de cintilación (Wallac Inc. the U.S., MeltiLex® B/HS) se recubrió en el mismo y la hoja se fusionó en la placa caliente. La radioactividad se midió utilizando la intensidad de fluorescencia del filtro utilizando el contador de cintilación. (Wallac Inc. the U.S., MicroBeta™ TriLux) . La actividad de inhibición de unión de rianodina de la sustancia FKI-1033 se sometió a ensayo agregando la sustancia FKI-1033 inicialmente en el ensayo de la actividad de unión de rianodina y se calculó por la siguiente ecuación cuando se comparó con la actividad de unión rianodina control . Actividad de la inhibición de unión de rianodina = (1 - (Radioactividad en la adición de la sustancia FKI-1033/Radioactividad de control) ) x 100 De acuerdo al resultado calculado de la ecuación anterior, la sustancia FKI-1033 mostró la actividad de inhibición de unión de rianodina, IC50 = 53.9 µM, contra el receptor de rianodina del ratón origen. Por consiguiente, de acuerdo a los resultados del ensayo anterior, la sustancia FKI-1033 se confirmó para mostrar más de diez veces la actividad de inhibición de unión de rianodina potente contra el receptor de rianodina de insecto que el receptor de rianodina de mamífero . (5) La actividad anti-microbiana de FKI-1033 se muestra como sigue . Los discos de papel (Advantech Inc., Japón, diámetro 6 mm) se empaparon con 10 µl de solución de metanol (1 mg/ml) de sustancia FKI-1033, y el solvente se eliminó con secado durante tiempo constante. Entonces los discos se colocaron en la placa de agar que contiene cada microorganismo de prueba. Las placas de agar se incubaron a 35°C durante ese tiempo. 24 horas, se midió el diámetro de la zona de inhibición de crecimiento que rodea el disco de papel. Los resultados se muestran en la Tabla 3.

Tabla 3 Microorganismo de prueba Diámetro de zona de inhibición (mm) Staphylococcus aureus ATCC 6538p Bacillus subtilis ATCC 6633 Micrococcus luteus ATCC 9341 Mycobacterium smegmatis ATCC 607 Escherichia coli NIHJ Escherichia coli NIHJ JC-2 (IFO 12734] Pseudomonas aeruginosa IFO 3080 Xanthomonas campestris pv. oryzae KB 88 Bacteroides fragilis ATCC 23745 Acholeplasma laidra ii KB 174 Candida albicans KF1 Saccharomyces cerevisiae KF 26 Pyricularia oryzae KF 180 Aspergillus niger ATCC 6275 Mucor racemosus IFO 4581 Como se muestra en la Tabla 3 en lo anterior, la sustancia FKI-1033 mostró actividades inhibitorias sin crecimiento contra varios microorganismos. (6) Actividades anti-nematodo y anti-artrópodo de la sustancia FKI-1033 se explicaron en detalle como sigue. La solución de metanol de la sustancia FKI-1033 se agregó en la placa de 96 pozos (Corning Inc., the U.S.), se eliminó el metanol in vacuo, se agregaron 250 µl del medio de prueba (lecitina 0.01%, carbonato ácido de sodio 7.5 M, cloruro de potasio 7.5 mM, dihidrato de cloruro de calcio 7.5 mM y heptahidrato de sulfato de magnesio 7.5 mM) y se agitó durante 15 min. Se agregaron 50 µl del tampón que contiene los diversos nauplios de Artemia salina, que se eclosionan en el tampón, al mismo, y alrededor de diez nematodos, Caenorhabditis elegans, los cuales se proliferan en un medio agar para el crecimiento de nematodo se agregan al mismo. La apariencia de estos organismos se observa después de 2 días bajo microscopio, y la sustancia FKI-1033 inhibe el crecimiento de los artrópodos y nematodos a 20 µg/ml. Consecuentemente, la sustancia FKI-1033 puede utilizarse como farmacéuticos tales como el inhibidor de unión de rianodina, insecticida o agente antihelmíntico.

Mejor modo de llevar a cabo la invención La presente invención se explica con un ejemplo pero no se interpretará como limitante dentro del ejemplo. Cada cepa en forma de bloque de Verticillium sp. FKI-1033 FERM BP-8219 cultivada en el medio de inclinación de agar se inoculó en un frasco Erlenmeyer de 500 ml que contiene 100 ml del medio líquido (pH 6.0) que consiste de glucosa 2.0%, Polipepton (Nihon Seiyaku Co., Japón) 0.5%, extracto de levadura (Oriental Yeast Co., Japón) 0.2%, agar 0.1%, fosfato dihidrógeno de potasio 0.1%, heptahidrato de sulfato de magnesio 0.05% y agua, y se agita el cultivo a 27°C durante 3 días. Cada 20 ml del líquido de cultivo de semilla se agrega en cada uno de los 4 frascos del frasco Erlenmeyer de 500 ml que contiene cada uno 80 ml de agua desionizada y esterilizada y diluida. Cada 10 ml del cultivo de semilla diluida se inoculó en 24 frascos Roux (capacidad 1 litro) que contiene 240 g del medio de producción (arroz italiano 150 g, agua de la llave 90 ml , heptahidrato de sulfato de hierro (II) 0.9 mg, pentahidrato sulfato de cobre (II) 0.9 mg y hexahidrato de cloruro de cobalto 0.9 mg) , y estáticamente cultivado a 27°C durante 13 días. Se agregó una solución mezclada de metanol : agua = 2:1 (200 ml) a cada uno de los 24 frascos Roux (1 litro), vigorosamente agitado y dejado en permanencia durante 3 horas. El metanol se eliminó in vacuo, y la solución acuosa obtenida se extrajo dos veces con la cantidad igual de acetato de etilo. Utilizando sulfato de sodio anhidro, la solución de acetato de etilo se deshidrató y se secó in vacuo para obtener 2.53 g de la sustancia oleosa café oscuro. Esta se cargó en una columna de gel de sílice (f 2.8 x 14.0 cm) empacada con hexano, lavada con una mezcla de hexano acetato de etilo (100:75), eluída con una mezcla de hexano -acetato de etilo (100:150) y concentrada in vacuo para obtener 183 mg de la sustancia oleosa café oscura. La sustancia se cargó en columna Sephadex LH-20 (f 2.7 x 92 cm) y eluída con metanol para obtener 86.5 mg de la sustancia FKI-1033 como la sustancia oleosa incolora.

Aplicabilidad industrial Como se explicó en lo anterior, la sustancia FKI- 1083 se produjo cultivando el microorganismo que tiene la capacidad para producir la sustancia FKI-1033 en el medio, acumulando la sustancia FKI-1033 en el medio, aislando la sustancia FKI-1033 de la masa cultivada La sustancia FKI-1033 tiene actividad de inhibición de unión de rianodina, actividad insecticida y actividad antihelmíntica, y se espera como sustancia FKI-1033 novedosa útil para los químicos agrícolas , fármacos y medicamentos veterinarios que pueden ser satisfactorios en el punto de efectividad, toxicidad, etc.

Claims

REIVINDICACIONES 1. Una sustancia FKI-1033 representada por la fórmula :
2. Un proceso para la producción de la sustancia FKI-1033 que comprende cultivar un microorganismo que pertenece al hongo y que tiene la capacidad para producir la sustancia FKI-1033 en un medio, acumulando la sustancia FKI- 1033 en el medio de cultivo y aislando la sustancia FKI-1033 de la masa cultivada.
3. Un microorganismo que es Verticillium sp. FKI- 1033 FERM BP-8219 que pertenece al hongo.
4. Un microorganismo de Verticillium sp. FKI-1033 tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 de la reivindicación 1 y pertenece al hongo.
5. El microorganismo de acuerdo a la reivindicación 4, en donde el microorganismo tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 y es Verticillium sp. FKI-1033 FERM BP-8219.
6. El proceso para la producción de la sustancia FKI-1033 en donde el microorganismo tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033 es Verticillium sp. FKI-1033 FERM BP-8219 que pertenece al hongo o mutante del mismo gue tiene la capacidad de producir la sustancia FKI-1033.
7. La sustancia FKI-1033 de acuerdo a la reivindicación 1, ue tiene la actividad de inhibición de unión de rianodina.
8. La sustancia FKI-1033 de acuerdo a la reivindicación 1, que tiene la actividad insecticida y la actividad antihelmíntica.
9. Un inhibidor de unión de ríanodina que comprende la sustancia FKI-1033 como un ingrediente activo.
10. Un agente insecticida y antihelmíntico que comprenden las sustancias FKI-1033 como un ingrediente activo .
11. El inhibidor de unión de rianodina, el agente de insecticida y antihelmíntico que comprende las sustancias de FKI-1033 como el ingrediente activo.
12. Uso de la sustancia FKI-1033 para la producción de agroqulmicos, fármacos y medicamentos veterinarios gue tiene la actividad insecticida y la actividad antihelmíntica en las sustancias que inhiben la unión de rianodina en el receptor de rianodina .
13. La sustancia FKI-1033 para la producción de agroguímicos, fármacos y medicamentos veterinarios que tienen la actividad insecticida y la actividad antihelmíntica en sustancias que inhiben la unión de rianodina al receptor de rianodina.