Przedmiotem wynalazku jest srodek do wykrywania bialka oraz sposób wytwarzania srodka do wykrywa¬ nia bialka.Wykrywanie bialka w plynach ustrojowych, zwlaszcza w moczu, zajmuje bardzo wazne miejsce w rozpoz¬ nawaniu chorób nerek. Dlatego juz od dluzszego czasu opracowywane sa szybkie metody wykrywania i oznaczania bialek. Przewaznie chodzi tu o srodki zawierajace bibuly testowe, nasycone substancja buforowa i tak zwanym wskaznikiem bledu proteinowego. Wskaznikami bledu proteinowego sa wskazniki pH, których wartosc pK zmienia sie w przypadku obecnosci bialka. Zaleznie od tego, w jakim kierunku wartosc pK zostaje przesunieta przez bialko, nalezy nastawic buforem taka wartosc pH, która lezy powyzej lub ponizej wartosci pK, zwlaszcza wlasnie poza zakresem zmiany barwy wskaznika. Korzystne sa takie wskazniki, które przy zanurzeniu w moczu wolnym od bialka wystepuja w malo zabarwionej postaci tak, ze obecnosc bialka prowadzi do bardziej lub mniej calkowitego przejscia wskaznika w postac silnej zabarwiona i przez to do czulej zmiany barwy.Najbardziej znanymi wskaznikami bledu proteinowego jest ester etylowy czterobromofenoloftaleiny i blekit czterobromofenolowy (osmiobromofenolosulfoftaleina). W literaturze opisanych jest caly szereg takich bibul testowych do wykrywania bialka, które czesto róznia sie tylko stosowanymi substancjami dodatkowymi takimi, jak anionowe srodki zwilzajace, barwniki, nieorganiczne siarczany i podobne, i na ogól pozwalaja na czule wykrywanie bialka.Wszystkie znane bibuly testowe wykazuja jednak powazna niedogodnosc, a mianowicie w taki sam sposób jak z bialkiem reaguja z produktami przemiany wystepujacych czesto w moczu srodków leczniczych, jak na przyklad chininy, chinidyny, resochiny i innych zwiazków zawierajacych azot.Celem wynalazku bylo wiec opracowanie srodka zawierajacego bibuly testowe, przy uzyciu których zaklócenie powodowane przez zwiazki zawierajace azot nie bedzie wystepowalo w ogóle albo bedzie tak male, ze mozna go nie brac pod uwage, a jednoczesnie których czulosc wykrywania nie bedzie mniejsza niz znanych bibul testowych.2 103 510 Wedlug wynalazku srodek do wykrywania bialka stanowi chlonny nosnik, impregnowany wskaznikiem pH z grupy wskazników bledu proteinowego i odpowiednia substancja buforowa o wartosci pH 2,5-4,5 charaktery¬ zujacy sie tym, ze jako wskaznik zawiera zwiazek z grupy osmiochlorowcosulfoftalein i co najmniej jeden nie mieszajacy sie z woda, prosty lub rozgaleziony poliglikol propylenowy o ciezarze czasteczkowym 500—10000, ewentualnie posiadajacy jeszcze inne niskie grupy oksyalkilenowe, w ilosci liczac na 100 ml rotworu impregnuja¬ cego 0,5—5 g poliglikolu propylenowego, 10—30 g buforu i 0,02—2 g wskaznika oraz substancje pomocnicze.Jako chlonne nosniki stosuje sie zwlaszcza bibule filtracyjna, poza tym równiez plytki z wlókien, azbest lub podobne.Do srodka wedlug wynalazku stosuje sie przede wszystkim proste poliglikole propylenowe, ponadto produkty polimeryzacji blokowej tlenku propylenu i tlenku etylenu jak równiez zwiazki rozgalezione, w których tlenek propylenu depolimeryzowany jest do wielowartosciowych alkoholi, takich jak na przyklad trójmetylolo- Sropan, jjliperyaa^lllo pentaerytryt i które ewentualnie zmodyfikowane sa jeszcze tlenkiem etylenu. Poliglikole propylenowe stosowane w sposobie wedlug wynalazku musza posiadac ciezar czasteczkowy okolo 500—10000.Tego jodzaju, poliglikole propylenowe sa znane i stosowane w technice do najrózniejszych celów, na zyj zwilzajace! inne.Ich dzialanie wedlug wynalazku nie bylo do przewidzenia i dlatego jest bardzo.zaskakujace, poniewaz rozpuszczalne w wodzie przedstawiciele tej grupy, jak na przyklad poliglikol propylenowy o ciezarze czasteczko¬ wym okolo 400 albo czyste poliglikole etylnowe nie dzialaja w sensie pozadanym wedlug wynalazku.Rzecza szczególna jest to, ze bibuly testowe o poadanych wlasciwosciach wytwarza sie sposobem wedlug wynalazku przy uzyciu poliglikoli propylenowych tylko ze wskaznikami bledu proteinowego z klasy osmiochlo¬ rowcosulfoftalein. Z innymi, dajacymi sie zreszta stosowac wskaznikami bledu proteinowego, na przyklad estrem etylowym czterobromofenoloftaleiny, otrzymuje sie bibuly testowe, które wprawdzie nie reaguja z zasadami azotowymi, ale ich reakcja z bialkiem równiez jest silnie oslabiona.Jako wskazniki wchodza w rachube: osmiobromofenolosulfoftaleina (blekit czterobromofenolowy), os- miochlorofenolosulfoftaleina (blekit czterochlorofenolowy) oraz chlorowcowane w sposób mieszany przedsta¬ wiciele na przyklad 3',3",5',5"-czterobromof3nolo-3,4,5,6-czterochlorosulfoftaleina, 3',3",5',5"-czterochlorofe- no1o-3,4,5,6-czterobromosulfoftaleina i 3',3"-d wuchloro-5',5"-dwubromofenolo-3,4,5,6-czterochlorosulfoftaleina, Pierwsze trzy zwiazki znane sa z literatury, a pozostale wskazniki sa nowe, lecz mozna je wytwarzac znanymi sposobami, na przyklad droga reakcji znanych bezwodników kwasów czterochlorowcobenzenosulfokar- boksylowych z fenolem albo 2-chlorowcofenolami w obecnosci kwasów Lewis'a, na przyklad chlorku cynowego i chlorowania lub bromowania otrzymanych fenolosulfoftalein w obojetnych rozpuszczalnikach, na przyklad chlorem wzglednie bromem w lodowatym kwasie octowym.Najkorzystniejsze sa wskazniki, zawierajace cztery atomy chloru w pozycji 3',3",5' i 5", poniewaz w przypadku ich stosowania zaklócenie spowodowane zasadami azotowymi jest jeszcze slabsze niz przy odpowiednich zwiazkach bromowanych.Do wytwarzania bibul testowych do wykrywania bialka nalezy stosowac silny bufor, który przy zanurzeniu równiez wplynie ustrojowym, majacym byc moze, inna wartosc pH, utrzyma stale pH tak, ze zmiana barwy wskaznika bedzie polegala wyraznie na przesunieciu wartosci pK przez bialko, a nie na zmianie wartosci pH. Zazwyczaj przy wskaznikach sulfoftaleinowych nastawia sie bufor na wartosc pH, znajdujaca sie mniej wiecej ponizej zakresu zmiany pH wskaznika, przez co wskaznik wystepuje calkowice w malo barwnej postaci kwasowej. Lepsza czulosc wobec bardzo malych stezen bialka otrzymuje sie, jezeli wartosc pH buforu lezy w zakresie zmiany barwy wskaznika. Lecz to prowadzi do tego, ze po zanurzeniu w moczu czesc wskaznika juz zmienila sie, a zabarwienie swiadczace o próbie negatywnej jest trudniejsze do odróznienia od niewielkiego zabarwienia z tytulu obecnosci bialka.Dalsza nieoczekiwana wlasciwoscia poliglikoli propylenowych wedlug wynalazku jest to, ze powstrzymuja one rozpoczynajaca sie zmiane barwy wskaznika zasadniczo bez wywierania wplywu na czulosc wobec bialka.Przez „zakres zmiany barwy" wskaznika rozumie sie w ogólnosci zakres pH o jedna jednostke powyzej i ponizej wartosci pK w czystej wodzie. Do wytwarzania bibul testowych wedlug wynalazku do wykrywania bialka stosuje sie korzystnie wartosci pH, które leza okolo 1,0 jednostki ponizej do okolo 0,5 jednostki powyzej • wartosci pK stosowanych wskazników. Poniewaz wartosci te wynosza 3,5—4,0, uzyteczny zakres wartosci pH wynosi od okolo 2,5 do okolo 4,5. Przy nizszych wartosciach pH wystepuje na ogól oslabienie reakcji z bialkiem, a przy wyzszych spotegowanie reakcji z zasadami azotowynr i z normalnym moczem. Korzystna wartosc pH zalezy poza wskaznikiem od rodzaju poliglikoli propylenowych stonowanych wedlug wynalazku oraz pozostalych reagentów i oznacza sie ja latwo droga prostych doswiadczen seryjnych, w których wartosc pH i ilosc buforu jest tak zmieniana, ze wskaznik po zanurzeniu w moczu, nie zawierajacym bialka, wykazuje jeszcze czyste „kwasowe" zabarwienie. 1103 510 3 W rachube wchodza wszystkie bufory, posiadajace w wymienionym zakresie dobra pojemnosc buforowa, a wiec na przyklad mieszaniny kwasu cytrynowego, jablkowego, winowego i innych z ich solami alkalicznymi wzglednie amonowymi.Chociaz poliglikole propylenowe w srodku wedlug wynalazku wykazuja po czesci wlasciwosci powierz- chniowo czynne, korzystnie jest dodac jeszcze tradycyjne srodki powierzchniowo-czynne w celu lepszego rozdrobnienia. Wchodza tu w rachube przede wszystkim niejonogenne srodki zwilzajace, zwlaszcza etoksylowane alkohole tluszczowe i fenole, zawierajace 1—4 grup oksyetylenowych. Anionowe srodki zwilzajace wzmacniaja reakcje z zasadami azotowymi, podczas gdy kationowe srodki powierzchniowo-czynne powoduja silna blednie dodatnia reakcje wskaznika w przypadku gdy nie stosuje sie bardzo kwasowych buforów, które hamuja reakcje z bialkiem. Dlatego te obydwie klasy srodków powierzchniowo-czynnych sa nieodpowiednie.Oczywiscie mozna równiez dodawac substancje speczniajace lub zagestniki, które moga opózniac wykwitanie odczynników ze stosowanej bibuly testowej, przy czym nalezy ewentualnie zbadac, czy substancje te maja zdolnosc mieszania sie z substancjami buforowymi. Skuteczne okazaly sie na przyklad hydroksyetylocelu- loza i hydroksypropyloceluloza.Poza tym do odczynników mozna dodac równiez odczynnik kompleksotwórczy, zwlaszcza siarczan magnezowy.Poliglikole propylenowe wedlug wynalazku oraz pozostale skladniki stosuje sie w nizej podanych ilosciach, w odniesieniu do 100 ml roztworu impregnujacego, a mianowiecie poliglikole propylenowe wedlug wynalazku 0,5—5 g, zwlaszcza 1—2 g, bufor 10—30 g, zwlaszcza 15—2n gf wskaznik 0,02—0,2 g, zwlaszcza 0,05—0,1 g, substancja powierzchniowo-czynna 0,0—1,0 g, zwlaszcza 0,2—0,5 g.Jako rozpuszczalniki wymienionych skladników stosuje sie mieszaniny wody i niskich alkoholi, w których rozpuszczaja sie wszystkie skladniki. Sposobem wedlug wynalazku najpierw przeprowadza sie impregnacje wstepna buforem z wody, a potem impregnuje sie roztworem pozostalych skladników w rozpuszczalniku organicznym.Gotowe bibuly testowe mozna stosowac jako takie albo naklejone w znany sposób na rekojesciach, albo zwlaszcza umocowuje sie je miedzy podkladki z tworzyw sztucznych i siatki o drobnych oczkach.Nastepujace przyklady objasniaja blizej wynalazek, przy czym skutecznosc wobec wplywu zasad azotowych zilustrowana jest w ten sposób, ze dodawana jest taka ilosc chininy, która powoduje zabarwienie, jakie dalaby albumina w ilosci 5 mg% (górna granica normalnego wydzielania). Im wieksza jest wiec ta ilosc, tym mniej zaklócony jest test przez chinine. Zaklócenie spowodowane innymi zasadami azotowymi, jak na przyklad chinidyna, resochina benzydamina i innymi, jest tego samego rzedu wielkosci jak zaklócenie chinina.Przyklad I. Bibule filtracyjna (Schleicher & Schiill 2316) nasyca sie kolejno dwoma roztworami o ponizszych skladach i suszy kazdorazowo w temperaturze 60°C: Roztwór 1: kwas cytrynowy,jednowodzian 20 g amoniak, 25% wodnyroztwór okolo 10 ml wodadestylowana do 100 ml wartosc pH roztworu ustawia sie na 4,1.Roztwór 2: 3',3",5',5"-czterochlorofenolo-3,4,5,6- czterobromosulfoftaleina (pK =3,9) 50 mg poliglikol propylenowy o srednim ciezarze czasteczkowym 1200 (Polyglykol P 1200(R)) 2 g metanol do 100 ml Bibula testowa reaguje z normalnym moczem dajac zabarwienie zólte, a z moczami, zawierajacymi albumi¬ ne wystepuja zabarwienia zielone do niebieskozielonych ze wzrastajaca intensywnoscia.Mocze, zawierajace chinine w ilosci okolo 100 mg % daja takie samo zabarwienie zielone, jak mocze z 5 mg % albuminy.Bibula testowa o takim samym skladzie, ale bez poliglikolu propylenowego, reaguje z normalnym moczem dajac zabarwienie zielone. Zielone zabarwienie spowodowane zawartoscia 5 mg % albuminy trudne jest do odróznienia od zabarwienia próby negatywnej. Dlatego przeprowadzono porównanie z reakcja 25 mg % albuminy i otrzymano, ze juz okolo 25 mg % chininy powoduje zabarwienie odpowiadajace tej zawartosci bialka.W przypadku stosowania handlowych bibul testowych 2—5 mg% chininy powoduje zabarwienie odpowia¬ dajace obecnosci 5 mg % albuminy.Przyklad II. Bibule filtracyjna (Schleicher &Schii II2316) nasyca sie kolejno dwoma roztworami o nastepujacych skladach i suszy w temperaturze 60°C:4 103 610 Roztwór 1: kwas cytrynowy,Jednowodzian 20 g amoniak, 25% wodnyroztwór okolo 6 ml wodadestylowana do 100 ml Wartosc pH roztworu ustawia sie na 3,1.Roztwór 2: 3'l3",5\5"#3,4,5,6-osmiobromofenolo- sulfoftaleina (blekit czterobromofenolowy, pK =3,6) 50 mg poliglikol propylenowy o srednim ciezarze czasteczkowym 2000 (Polyglykol P 2000(R)) 1 g nonylofenol, eteryfikowany 1—2 resztami oksyetylenowymi (Antarox CO 210(R)) 0,4 g metanol do 100 ml Mozna równiez te obydwa roztwory zastapic polowa ilosci rozpuszczalnika i polaczyc je przed impreg¬ nacja.Bibula testowa reaguje z normalnym moczem dajac zabarwienie zólte, a z moczami, zawierajacymi albumine, daje zabarwienie zielone ze wzrastajaca intensywnoscia.Mocze, zawierajace chinine w ilosci okolo 50 mg% daja takie samo zabarwienie, jak mocze zawierajace mg% albuminy.Bibula testowa o takim samym skladzie, ale bez poliglikolu propylenowego, reaguje z normalnym moczem dajac zielone zabarwienie.W przypadku tej bibuly testowej zawartosc 10 mg% chininy daje takie samo zabarwienie, jakie dawaloby 5 mg% albuminy.Jezeli zamiast nonylofenolu eteryfikowanego 1—2 resztami oksyetylenowymi (Antarux CO 210) zastosuje sie 0,4 g alkoholu kokosowego zeteryfikowanego dwoma resztami oksyetylenowymi (Genapol C 020 (R)) albo 0,2 g trójbutylofenolu zeteryfikowanego czterema resztami oksyetylenowymi (Sapogenat T 0,40 (R)), orzymuje sie praktycznie takie same bibuly testowe.Przyklad III. Bibule filtracyjna (Schleicher& Schul12316) impregnuje sie wstepnie 15% wodnym roztworem dwuwodorocytrynianu sodowego (pH 3,5) i suszy w temperaturze 60°C. Tak wstepnie zaimpregono- wana bibule nasyca sie nastepnie roztworami o ponizszych skladach, po czym suszy kazdorazowo w tenperaturze 60° C.Roztwór 1: 3',3",5',5",3,4,5,6K)smiochlorofenolo- sulfoftaleina 50 mg poliglikol propylenowy wedlug tablicyI 1 g metanol do 100 ml Wlasciwosci tych bibul testowych odpowiadaja w zasadzie bibulom wytworzonym sposobem wedlug przykladu I.Roztwór 2: 3',3"-dwubromo-5',5"-dwuchlorofenolo-3,4,5,6- czterochlorosulfoftaleina 50 ml Desmophen 7200(R) 1 g metanol do 100 ml Wlasciwosci tych bibul testowych odpowiadaja w zasadzie bibulom wytworzonym wedlug przykladu II.Roztwór 3: 3',3",5',5"-czterobromofenolo-3,4,5,6-cztero- chlorosulfoftaleina 50 mg Desmophen 7200(R) 1 g metanol do 100 ml Wlasciwosci tych bibul testowych odpowiadaja w zasadzie bibulom wytworzonym wedlug przykladu II.103510 TabI i ca I Nazwa handlowa Sklad chemiczny (wedlug oswiadczenia producenta) Sredni ciezar molowy 4000 3800 3100 3500 3000 6300 2600 3800 4500 3800 Liczba hydroksy Iowa okolo 42 okolo 49 okolo 46 okolo 56 okolo 27 okolo 64 okolo 29 okolo 37 PolyglykolP400(R) Desmophen7200(R Desmophen7100(R) Desmophen3800(R) Desmophen3400(P) PluracolTPE6542(R) PluracolTP2540(R) PluracolMK73(R) PluracolMK92(R) PluronicL101(R) prosty poliglikol propylenowy rozgaleziony poliglikol propylenowy, modyfikowany tlenkiem etylenu rozgaleziony poliglikol propylenowy, modyfikowany tlenkiem etylenu czesciowo rozgaleziony poliglikol propylenowy rozgaleziony poliglikol propylenowy, modyfikowany tlenkiem etylenu rozgaleziony poliglikol propylenowy na bazie trój- metylolopropanu, modyfikowany tlenkiem etylenu rozgaleziony poliglikol propylenowy na bazie trój- metylolopropanu rozgaleziony poliglikol propylenowy na bazie gli¬ ceryny rozgaleziony poliglikol propylenowy na bazie trój- metylolopropanu prosty poliglikol propylenowy, modyfikowany 10% tlenku etylenu Przyklad IV. Bibule filtracyjna (Schleicher &Schul mi o ponizszych skladach i suszy w temperaturze 60°C: Roztwór 1: 2316) impregnuje sie kolejno dwoma roztwora- kwas jablkowy lug sodowy 6N hydroksyetyloceluloza (Natrosol 250 G (R)) woda destylowana Wartosc pH roztworu nastawia sie na 3,5 Roztwór 2: blekit czterobromofenylowy PolyglykolP1200(R) chloroform 15g okolo 16 ml 2g do 100 ml 0,6 g 3y do 100 ml :iwosci tej bibuly testowej odpowiadaja w zasadzie bibulom wytworzony PL PL PL PL PL