PL94196B1 - - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarza¬ nia srodka do wykrywania glikozy zwlaszcza w moczu.Wykrywanie glikozy w moczu ma duze znacze¬ nie dla rozpoznawania i przebiegu kontroli cuk¬ rzycy. Z tego powodu opisano w literaturze pa¬ tentowej duza liczbe sposobów wytwarzania srod¬ ków do wykrywania glikozy polegajacych na tak zwanych szybkich testach, z których niektóre znaj¬ duja sie w handlu. Opieraja sie one prawie wy¬ lacznie na nastepujacej zasadzie: glikoza utlenia¬ na jest tlenem za pomoca glikozooksydazy do kwasu glikonowego i nadtlenku wodoru, który za pomoca peroksydazy utlenia wskaznik do barwne¬ go zwiazku. Chociaz opisano szereg tych wskazni¬ ków, dotad stosuje sie przewaznie o-tolidyne.Ogólnie biorac dla tych testów na glikoze przy¬ jety jest zakres wartosci pH 4—7, który ustawia sie zwyklymi buforami takimi jak: fosforanowe, cytrynianowe i podobne. Korzystna jest jednakze prawie wylacznie wartosc pH 5, poniewaz przy tej wartosci pH czulosc i gradacja wyraznie sa optymalne (opisy patentowe St. Zjedn. Am. nr 3 050 373 i nr 2 848 308 oraz opis patentowy RFN nr 1598 809). Bibuly testowe o tej wartosci pH wykazuja jednakze powazna niedogodnosc pole¬ gajaca na tym, ze barwa reakcji przy tak zwanej „cukrzycowej kwasicy metabolicznej" (diabetycz- nej ketoacydozie) jest oslabiona, a nawet moze byc zupelnie niewidoczna. 2 Przy kwasicy metabolicznej wystepuja w mo¬ czu wieksze ilosci kwasu acetylooctowego i kwasu hydroksymaslowego, co zaklóca reakcje bibuly testowej z buforem o wartosci pH 5. Kwasica metaboliczna wystepuje glównie przy cukrzycy, ale takze przy innych schorzeniach i w stanach glodu.Cukrzycowa kwasica metaboliczna rózni sie od innych tylko tym, ze w moczu równoczesnie wy¬ stepuje glikoza. Szybki test na glikoze, który zaklócany jest przy kwasicy metabolicznej, nie jest wiec optymalnym testem ani do diagnozy róznicowej kwasicy metabolicznej, ani do diagnozy i do kontroli przebiegu cukrzycy.Doswiadczenia wykazaly, ze przez ustawienie war¬ tosci rpH bibuly testowej na glikoze w granicach ,8—6,2 zwlaszcza 6 mozna zmniejszyc zaklócenie spowodowane kwasica metaboliczna. Okazuje sie jednak, ze przy stosowaniu tradycyjnego buforu gradacja barwnej reakcji znacznie pogarsza sie, mimo unikania zaklócen we wszystkich przypad¬ kach. Poza tym w wielu przypadkach pozostawia¬ la wiele do zyczenia trwalosc bibuly testowej.Stwierdzono nieoczekiwanie, ze sposobem wedlug wynalazku otrzymuje sie srodek do wykrywania glikozy, dajacy reakcje czula, szybka, z dobra gra¬ dacja i niezaklócana przy kwasicy metabolicznej, jesli jako bufor zastosuje sie kwas 2-(N-morfolino)- -etanosulfonowy (MES). Bibuly te sa takze w pelni trwale przy dluzszym dzialaniu wyzszej tempera- 9419694196 3 tury, ma to szczególne znaczenie przy stosowaniu ich w krajach tropikalnych.Kwas*2-(N-morfolino)-etanosulfonowy jest wpraw¬ dzie znanym buforem; zostal on wprowadzony przez Good'a, Biochemistry 5 (1966), str. 467, do prac w ukladach biologicznych, jednakze wylacznie w fa¬ zie cieklej, a nie w przygotowanym stalym od¬ czynniku, jak bibuly testowe. Dla specjalisty bylo nie do przewidzenia, niespodziewane dzialanie tego specjalnego buforu, przy zastosowaniu go w bi¬ bulach testowych na glikoze, zwlaszcza, ze inne bufory stosowane w ukladach biologicznych jak na przyklad tak zwany „Tris" nie wykazuja dzia¬ lania odpowiadajacego MES (tablica). zadanym zakresie wartosci pH otrzymuje sie przy tym jednorodny roztwór.Obok glikozooksydazy, peroksydazy i wskaznika, zwlaszcza o-tolidyny, które dodawane sa w steze¬ niach powszechnie stosowanych, w sposobie wg wy¬ nalazku wytwarzania srodka do wykrywania gliko- zy moga znalezc zastosowanie jeszcze substancje pomocnicze takie jak: srodki ulatwiajace rozpusz¬ czanie (na przyklad poliwinylopdrolidon albo glikol polietylenowy) i srodki powierzchniowo czynne (na przyklad lauroilosarkozynian sodowy lub laurylo- siarczan sodowy).Korzystny jest dodatek zóltych barwników (na przyklad tartrazyny albo zólcieni naftolowej S) Bufor (pH 6,0) MES, 0,5 m (przyklad I) fosforan 0,25 molowy cytrynian 0,25 molowy cytrynian 0,5 molowy tris-cyitrynian 0,05 molowy imidazol, 0,25 molowy 3^aminopirydyna, 0,5 molowy malonian, 05 molowy maleinian, 0,125 molowy pirofosforan, porównaj z pH 5: cytrynian, 0,25 molowy Tablica I Barwa reakcji z 100—1000 mg °/o glikozy w moczu jasnozielona do niebieskocziarnej jasnozielona do szaro¬ zielonej jasnozielona do szaro¬ zielonej jasnozielona do ciemno¬ zielonej jasnozielona do zielonej jasnozielona do szaro¬ zielonej jasnozólta do jasnozie¬ lonej szarozielona do ciemno¬ zielonej jasnozielona do szaro¬ zielonej jasnozielona do ciemno¬ zielonej ciemnozielona do nie- bieskoczarnej Zaklócenie przez 250 mg °/o kwasu acetylo-octowego i 2000 mg °/© kwasu P-hydroksymaslowego w moczu bez zaklócen umiarkowane zaklócenie umiarkowane zaklócenie umiarkowane zaklócenie male zaklócenie silne zaklócenie male zaklócenie umiarkowane zaklócenie umiarkowane zaklócenie umiarkowane zaklócenie silne zaklócenie Spadek reaktywnosci po 30 dniach przy 60°C praktycznie nie ma spadku bardzo silny spadek silny spadek silny spadek silny spadek bardzo silny spadek brak reaktywnosci silny spadek umiarkowany spadek [ bardzo silny spadek maly spadek Jak wynika z tablicy I, tylko MES stosowany jako substancja buforowa daje optymalne pod kazdym wzgledem bibuly testowe. W przypadku stosowania zwyklych i równiez niepospolitych bu¬ forów otrzymuje sie bibuly testowe, które wyka¬ zuja czesciowo znaczne zaklócenia spowodowane kwasem aoetylooctowym i hydroksymaslowym (to znaczy przy kwasicy metabolicznej) i oprócz tego sa mniej czule i/albo mniej trwale.Bufor MES stosowany w sposobie wedlug wy¬ nalazku dodawany jest w stezeniach 25—75 mmoli, zwlaszcza 50 mmoli na 100 ml roztworu impreg¬ nacyjnego. Zadany zakres wartosci pH 5,8—6,3, zwlaszcza 6,0 otrzymuje sie przez dodanie wodnej zawiesiny kwasu 2-(N-morfolino)-etanosulfonowego z konieczna iloscia stezonego lugu sodowego. W 50 55 65 powodujacych bardziej wyrazna zmiane barwy.Jako chlonne nosniki stosuje sie przede wszyst¬ kim bibuly filtracyjne, lecz takze stosowac mozna runa i filce z celulozy albo tworzyw sztucznych.W sposobie wytwarzania korzystnej formy u- zytkowej nowych srodków do wykrywania glikozy nasyca sie chlonny nosnik, zwlaszcza bibule fil¬ tracyjna roztworem zawierajacym wyzej podane skladniki i nastepnie suszy sie w podwyzszonej temperaturze, korzystnie w temperaturze 50°C.Jako rozpuszczalniki do roztworu impregnacyj¬ nego stosuje sie przede wszystkim mieszaniny skla¬ dajace sie z wody h latwo lotnych rozpuszczalni¬ ków organicznych, np. nizszych alkoholi.W ten sposób otrzymane przez pociecie paski testowe moga byc uzywane jako takie. W razie5 94 196 6 potrzeby mozna bibulowe paski wspawac miedzy folie ze sztucznego tworzywa (porównaj opis pa¬ tentowy RFN nr 1.546.307) albo na tego rodzaju folie naspawac wzglednie nakleic, korzystnie wspa- wa sie je miedzy folie ze sztucznego tworzywa i siatke o drobnych oczkach wedlug opisu paten¬ towego RFN nr 2.118.455.Ponizsze przyklady wyjasniaja blizej wynalazek bez ograniczenia jego zakresu.Przyklad I. Bibule filtracyjna (Schleicher i Schiill 597 NF) nasyca sie roztworem o naste¬ pujacym skladzie i suszy w temperaturze 50°C: Glikozooksydaza 222 mg Peroksydaza 28 mg Bufor MES (pH 6,0; 1,0 molowy wodny roztwór) 50 ml Tartrazyna 80 mg o-tolidyna 420 mg Etanol 33 ml Woda destylowana do 100 ml Bibula testowa reaguje z moczami, które zawie¬ raja od 50 do 1000 mg 8/o glikozy dajac zabarwie¬ nie jasno zielone o dobrej gradacja do niebiesko- -czarnego. Mocze, które zawieraja dodatkowo 250 mg % acetylooctanu i okolo 2000 mg °/o kwasu (3-hydroksymaslowego wykazuja praktycznie taka sama barwe reakcji. Poza tym nie obserwuje sie zadnej zmiany przy przechowywaniu bibuly testo¬ wej przez 15 dni w temperaturze 60°C, ani przez 4 miesiace w temperaturze 40°C.Przyklad II. Bibule filtracyjna (Whatman Nr 6) nasyca sie roztworem o nastepujacym skla¬ dzie i suszy w temperaturze 50°C: Glikozooksydaza 222 mg Peroksydaza 28 mg Bufor MES (pH 5,8; 1,0 molowy wodny roztwór) 65 ml Tartrazyna 80mg Poliwinylopirolidon 300 mg o-tolidyna 420 mg Etanol 30 ml Woda destylowanado 100 ml Bibula testowa posiada praktycznie te same wlasciwosci jak bibula testowa otrzymana wedlug sposobu opiasanego w przykladzie I.Przyklad III. Bibule filtracyjna (Schleicher i Schiill 595) nasyca sie roztworem o nastepujacym skladzie i suszy w temperaturze 50^C: Glikozooksydaza 222 mg Peroksydaza 28 mg Bufor MES (pH 6,2; 1,0 molowy wodny roztwór) 25 ml Lauroilosarkozynian sodowy 100 mg Zólcien naftolowa S 100 mg o-tolidyna 420 mg Etanol 33 ml Woda destylowana do 100 ml Ta bibula testowa posiada praktycznie te same wlasciwosci jak bibula testowa otrzymana spo¬ sobem wedlug przykladu I. PL PL

Claims (7)

1. Zastrzezenia patentowe 20 1. Sposób wytwarzania srodka do oznaczania gli¬ kozy polegajacy na impregnacji chlonnego nosnika glikozooksydaza, peroksydaza, wskaznikiem, bu¬ forem i ewentualnie substancjami pomocniczymi, znamienny tym, ze chlonny nosnik nasyca sie 25 wskaznikiem, buforem w postaci kwasu 2-(N-mor- folino)-etanosulfonowego i ewentualnie substancja¬ mi pomocniczymi i nastepnie suszy sie w podwyz¬ szonej temperaturze, korzystnie w temperaturze 50°C. 30 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie bufor o wartosci pH 5,8—6,

2.

3. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie bufor o wartosci pH 6.

4. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 85 jako chlonny nosnik stosuje sie bibule filtracyj¬ na.

5. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze jako wskaznik stosuje sie o-4olidyne.

6. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze 40 jako substancje pomocnicze stosuje sie srodek u- latwiajacy rozpuszczanie i srodek powierzchniowo czynny.

7. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze stosuje sie dodatkowo zólty barwnik. PL PL