NO892303L - Stabilisert fgf-sammensetning og fremstilling derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en stabilisert sammensetning av fibroblast-vekstfaktor (nedenfor forkortet FGF) eller muteinet derav og produksjon derav.

FGF ble først separert som en faktor med sterk vekstfremmende virkning på fibroblaster såsom Balb/c3T3-celler [Gospodarowicz; Nature, 249, 123 (1974)]. For tiden er FGF kjent for å ha en vekstf remmende virkning på nesten alle mesoderm-avledede celler. FGF kan grovt bli klassifisert ut fra isoelektrisk punkt i to typer: basisk FGF (nedenfor forkortet bFGF) og sur FGF (nedenfor forkortet aFGF). På grunn av de har sterk vekstfremmende virkning og plasminogen aktivatorinduserende virkning på endoteliske celler, er det ventet at disse FGF-typene har potensial for anvendelse som angiogenesisfremmer, et terapeutisk medikament ved skader og et forebyggende og terapeutisk medikament for trombose og arteriosklerose.

FGF har vanligvis blitt renset, til og med til enkelt-substansnivå, fra dyreorganer, f.eks. bovin hypofysekjertel, denne konvensjonelle metoden er ufordelaktig idet det f.eks. er en kvantitetsbegrensning på produksjonen og tilveiebragt FGF kan utvise uønsket antigenisitet på grunn av det er avledet fra et heterogent dyr. En metode for FGF-masse-produksjon er nylig blitt utviklet hvori rekombinant DNA-teknologi er anvendt for å uttrykke et klonet humant FGF-gen i mikroorganismer eller dyreceller [se FEBS Letters, 213, 189-194 (1987) og Europa patentpublikasjon nr. 237.966].

FGF taper hurtig aktivitet i en vandig oppløsning og i tillegg reduseres den biologiske aktiviteten på grunn av lyofilisasjon. I tillegg, når FGF blir administrert over lang tid, f.eks. ved intravenøs dryppinfeksjon, er det vanskelig å unngå at potensiteten reduseres i løpet av administrasjons-perioden og dette utgjør et stort problem.

Det er rapportert at FGF-inaktivering kan bli forhindret ved tilsetning av en bestemt type glykosaminoglykan, såsom heparin [Journal of Cellular Physiology, 128, 475 (1986)], men det er vanskelig å anvende heparin i injeksjoner, osv. på grunn av at det har en sterk antikoagulerende virkning.

For å forbedre stabiliteten til FGF i en oppløsning eller under lyofiliserende betingelser er de forskjellige forbin-delsene som generelt er blitt formulert inn i injeksjonene blitt undersøkt. Ingen tilfredsstillende metode for stabilisering er inntil nå blitt funnet og det gjenstår å utvikle en slik metode.

På grunn av disse forholdene har foreliggende oppfinnere utført undersøkelser og funnet ut at stabiliteten til FGF eller muteinet derav blir uventet betraktelig øket ved å bringe FGF eller dets mutein i kontakt med glukansulfat såsom dekstransulfat i en vandig oppløsning. Oppfinnerne utførte ytterligere undersøkelser basert på dette funnet og utviklet foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse vedrører

(1) en stabilisert sammensetning som omfatter (a) FGF eller dets mutein og (b) glukansulfat;

(2) en fremgangsmåte for fremstilling av en stabilisert sammensetning som omfatter at man bringer FGF eller dets

mutein i kontakt med glukansulfat i et vandig medium; og (3) en fremgangsmåte for stabilisering av FGF eller dets mutein, som omfatter at man bringer FGF eller dets mutein i kontakt med glukansulfat i et vandig medium.

FGF anvendt i foreliggende oppfinnelse kan være et basisk FGF (nedenfor også betegnet bFGF) eller et surt FGF (nedenfor også betegnet aFGF).

Som eksempler på FGF i foreliggende oppfinnelse kan pattedyr-avledet FGF bli nevnt. Eksempler på pattedyr omfatter mennesker, aper, svin, boviner, sauer og hester.

Eksempler på FGF omfatter FGF ekstrahert fra forskjellige organer som allerede er blitt funnet å inneholde FGF, såsom hjernen eller hypofysekjertelen og FGF produsert ved rekombinant DNA-teknologi.

Som et eksempel på FGF, kan FGF tilveiebragt ved rekombinant DNA-teknologi [PCT International Publication No. WO/87/01728; FEBS Letters, 213, 189-194 (1987); Europa patentpublikasjon nr. 237.966].

I foreliggende beskrivelse blir rekombinant humant basisk FGF noen ganger forkortet til rhbFGF.

FGF-muteinet i foreliggende oppfinnelse har hovedsakelig en aminosyresekvens resulterende fra variasjon av sekvensen til det opprinnelige peptidet eller proteinet; idet slike variasjoner omfatter aminosyretilsetning, konstituent aminosyredelesjon og konstituent aminosyresubstitusjon med annen aminosyre.

Slik tilsetning av aminosyre omfatter tilsetning av minst en aminosyre.

Slik delesjon av konstituent aminosyre omfatter delesjon av minst en bFGF-konstituent aminosyre.

Slik substitusjon av konstituent aminosyre med andre aminosyrer omfatter substitusjon av minst en bFGF-konstituent aminosyre med annen aminosyre.

Den minst ene aminosyren I muteinet som har minst en tilsatt aminosyre til bFGF ekskluderer metionin fra initierings-kodonet anvendt for peptidekspresjon og signalpeptid.

Antall tilsatte aminosyrer er minst 1, men det kan være en hvilken som helst forutsatt at bFGF-karakteristika ikke blir tapt. Foretrukne aminosyrer bør innbefatte noen eller alle aminosyresekvensene til proteiner som er homologe med bFGF og som utviser aktiviteter som ligner de til bFGF.

Når det gjelder antall deleterte bFGF-konstituent aminosyrer i foreliggende mutein som mangler minst en bFGF-konstituent aminosyre kan det være et hvilket som helst forutsatt at bFGF-karakteristika ikke blir tapt.

Som eksempler på slike delerte konstituent aminosyrer kan følgende nevnes: Delesjon av aminosyrer fra aminoterminalenden eller karboksylterminalenden; 10 residier i aminoterminalenden til humant bFGF:

Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser

14 residier i aminoterminalenden til humant bFGF:

Met-Pro-Ala-Leu-Pro-Glu-Asp-Gly-Gly-Ser-Gly-Ala-Phe-Pro

41 residier i aminoterminalenden til humant bFGF:

1 2 3 4 41

Met-Pro-Ala-Leu- .... -Val

eller 61 residuer i karboksylterminalenden til humant bFGF: 87 88 146 147

Lys-Cys- -Lys-Ser

er deletert.

Som eksempler på et slikt mutein hvori konstituent aminosyren(e) er deletert, kan et mutein av bFGF som mangler 7 til 46 aminosyreresidier fra karboksylterminalende nevnes.

Som eksempler på foretrukne aminosyresekvenser som kan mangle, kan aminosyresekvenser respektivt begynnende ved rhbFGF-aminosyrenumrene 102, 106, 115, 119, 124, 130 og 138 nevnes.

Disse aminosyresekvensene kan bli erstattet med en annen aminosyre. Når det gjelder antall på minst 1 bFGF-konstituent aminosyre før substitusjon i mutein som har minst en bFGF-konstituent aminosyre substituert med andre aminosyrer, kan det være en hvilken som helst, forutsatt at bFGF-karakteristika ikke blir tapt.

Som eksempler på konstituent aminosyrer før substitusjon, kan cystein og aminosyrer som er forskjellig fra cystein nevnes. Cystein er foretrukket. Som konstituent aminosyre forskjellig fra cystein før substitusjon, kan aspartansyre, arginin, glycin, serin, valin osv. nevnes.

Når konstituent aminosyren før substitusjon er cystein, kan substituerte aminosyrer fortrinnsvis utgjøre for eksempel nøytrale aminosyrer. Som spesifikke eksempler på slike nøytrale aminosyrer kan glycin, valin, alanin, leucin, isoleucin, tyrosin, fenylalanin, histidin, tryptofan, serin, treonin og metionin nevnes. Serin og treonin er spesifikt foretrukket.

Når konstituent aminosyren før substitusjon er en hvilken som helst forskjellig fra cystein, blir det for andre substituerte aminosyrer valgt aminosyrer som er forskjellige fra aminosyren før substitusjon i en egenskap såsom hydrofili-sitet, hydrofobisitet eller elektrisk ladning.

Når konstituent aminosyren før substitusjon er aspartansyre, utgjør substituerte aminosyrer asparagin, treonin, valin, fenylalanin og arginin, idet asparagin og arginin er foretrukket.

Når konstituent aminosyren før substitusjon er arginin, utgjør substituerte aminosyrer glutamin, treonin, leucin, fenylalanin og aspartansyre, idet glutamin er foretrukket. Når konstituent aminosyren før substitusjon er glycin, omfatter substituerte aminosyrer treonin, leucin, fenylalanin, serin, glutaminsyre og arginin, idet treonin er foretrukket.

Når konstituent aminosyren før substitusjon er serin, omfatter substituerte aminosyrer metionin, alanin, leucin, cystein, glutamin, arginin og aspartansyre, idet metionin er foretrukket.

Når konstituent aminosyren før substitusjon er valin, omfatter substituerte aminosyrer serin, leucin, prolin, glycin, lysin og aspartansyre, idet serien er foretrukket.

Som konstituent aminosyre før substitusjon er aspartansyre, arginin, glycin, serin og valin foretrukket.

Som substituert aminosyre er asparagin, glutamin, arginin, treonin, metionin, serin og leucin foretrukket.

Som en foretrukket utførelsesform ved substitusjon i muteinet, er en substitusjon av serin for cystein (dvs. cystein blir erstattet med serin) mest foretrukket.

I nevnte substitusjon kan ikke mindre enn 2 substitusjoner oppstå og to eller tre substitusjoner er foretrukket.

Muteinet ifølge foreliggende oppfinnelse kan være en kombina-sjon av to eller tre av de ovenfor nevnte addisjonene, delesjonene og substitusjonene.

Som mutein er muteiner hvori minst en av konstituent aminosyren human basisk FGF er blitt erstattet med annen aminosyre foretrukket.

I tillegg til konvensjonell DNA-rekombinasjonsteknikk, blir seterettet mutagenese anvendt for å produsere muteinet ifølge foreliggende oppfinnelse. Den nevnte teknikk er velkjent, og er beskrevet i Genetic Engineering, Lather, R.F. og Lecoq, J.P., Academic Press, s. 31 til 50 (1983). Mutagenese rettet mot oligonukleotid er beskrevet i Genetic Engineering: Principles and Methods, Smith, M. og Gillam, S., Plenum Press, Vol. 3, s. 1 til 32 (1981).

Produksjon av det strukturelle genet som koder for muteinet ifølge foreliggende oppfinnelse blir for eksempel utført ved: (a) hybridisering med en mutagen oligonukleotidprimer av et enkelt-trådet DNA omfattende 1 tråd av det strukturelle genet til FGF (Primeren er komplementær til en region av tråden som omfatter kodonet for cysteinet som skal bli erstattet eller til en region av antisenstripletten parret med kodonet, med unntagelse av en mismatch med det kodonet og en kodon for den andre aminosyren og som tilfellet kan tilsi, med det kodonet og antisenstriplett-kodonet.), (b) longering av primeren ved anvendelse av DNA-polymerase

for å danne en mutasjonsbar heterodupleks, og

(c) replikering av denne mutasjonsbare heterodupleksen.

phgage-DNA inneholdende det mutasjonsbare genet blir deretter isolert og inkorporert inn i et plasmid.

Ved anvendelse av plasmidet blir en vertscelle transformert for å gi en transformant.

Transformanten blir dyrket i et kulturmedium for å muliggjøre produksjon av mutein.

Eksempler på FGF-muteinene anvendt i foreliggende oppfinnelse omfatter muteinene beskrevet i Biochemical and Biophysical Research Communication, 151, 701-708 (1988), Europa patentpublikasjon nr. 281.822, Europa patentpublikasjon nr. 288.687 (Europa patentsøknad nr. 88103047.2) som korre sponderer med japansk patentsøknad nr. 50249/1988, Europa patentsøknad nr. 89101162.9 (inngitt 24. januar 1989).

Eksempler glukansulfat som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse omfatter dekstransulfat, cyklodekstrinsulfat, 3—1,3-glukansulfat. Glukansulfatet er et svovelholdig ester-derivat av D-glukosepolymeren. Glukansulfatet har fortrinnsvis et svovelinnhold som ikke er mindre enn omtrent 3% (v/v). Det er mer foretrukket at svovelinnholdet er på omtrent 12 til 20% (v/v) og enda mer foretrukket 16 til 20$ (v/v). Dekstransulfat er spesielt foretrukket.

Eksempler på dekstransulfat som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse omfatter sulfat av dekstran, Idet dekstranet blir produsert fra sukrose under innvirkning av mikroorganismer såsom Leuconostoc mesenteroides. Dekstransulfat er et sulfat av dekstran hvori hovedstrukturen er cx( l->6 )-binding, og svovelinnholdet er vanligvis ikke mindre enn omtrent 12%, fortrinnsvis omtrent 16 til 20%. Gjennomsnittlig molekylvekt er i området på fra omtrent 1000 til 40.000.000, fortrinnsvis i området på fra omtrent 3000 til 1.000.000, og dekstransulfatet er veldig oppløselig i vann. Dekstransulfat er en kjent forbindelse og kan bli produsert ved i seg selv kjent metode.

Eksempler på cyklodekstrin for cyklodekstrinsulfat i foreliggende oppfinnelse omfatter cyklodekstrin produsert fra stivelse under innvirkning av mikroorganismer såsom Bacillus macerans. Cyklodekstrin med en ringstruktur av D-glukosemolekyler bundet med a( l-»4 )-binding, er delt inn i forskjellige typer etter antallet ringdannende D-glukosemolekyler: a-type (6 molekyler), p-type (7 molekyler), -y-type (8 molekyler) og andre. Hvilke som helst av disse typene kan bli anvendt i foreliggende oppfinnelse.

Cyklodekstrinsulfat er en rester etter sulfatering av disse cyklodekstrinene, og denne sulfatering blir utført ifølge allerede kjent metode. Eksempler på metode for sulfatering omfatter metoder beskrevet i US patent nr. 2.923.704 og japansk patentsøknad utlegnlngsnr. 36422/1975.

Svovelinnholdet til cyklodekstrinsulfat overskrider vanligvis 3# (v/v), fortrinnsvis ved omtrent 12 til 24* (v/v). Cyklodekstrinsulfat har et kjennetegn idet det er veldig oppløselig i vann.

Grad av sulfatering av cyklodekstrinsulfat i foreliggende oppfinnelse kan være på et hvilket som helst nivå over 12*

(v/v) beregnet som svovelinnhold; spesielt cyklodekstrinsulfat inneholdende omtrent 16 til 21* (v/v) svovel er fordelaktig. Blandinger av cyklodekstrinsulfater med forskjellig grad av sulfatering kan bli anvendt og et enkelt cyklodekstrinsulfat tilveiebragt ved rensing til en enkelt grad av sulfatering kan også bli anvendt. Rensingen kan f.eks. bli oppnådd ved konsentrering til tørrhet av en reaksjonsblanding inneholdende et alkalimetallsalt av cyklodekstrinsulfat, oppløsning av det resulterende konsen-trat i vann og blanding av denne vandige oppløsningen med et hydrofilt oppløsningsmiddel for å separere det ønskede produktet.

Eksempler på p<->l,3-glukan for p-1,3-glukansulfat i foreliggende oppfinnelse omfatter rettkjedet p<->l,3-glukan produsert av mikroorganismer hørende til slekten Alcaligenes eller Agrobacterium. p-l,3-glukan kan også være i form av en lavmolekylvektspolymer med en rett p<->1,3-glukanstruktur som lett kan bli tilveiebragt ved hydrolyse av rettkjedet p<->1,3-glukan.

Curdlan (også kjent som termogelbart polysakkarid PS, kommersielt tilgjengelig fra Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) er kjent for å være et vann-uoppløselige, termogeldann-bar, uforgrenet glukan som har bare rettkjedet g<->1,3-glukanbinding og som blir produsert av mikrobielle stammer hørende til slekten Alcaligenes eller Agrobacterium (japansk patentpublikasjon nr. 7.000/1968, 32.673/1973 og 32.674/1973). Curdlan-produsentene Alcaligenes faecalis var. myxogenes NTK-u-stammen, Agrobacterium radiobacter-stammen og Agrobacterium radiobacter U-19-stammen er respektivt oppført under ATCC-21680, ATCC-6466 og ATCC-21679 i American Type Culture Collection Catalogue of Strains, I, 15. utgave, 1982.

Egenskapene til det partielle hydrolysatet (lavmolekylvekts-derivatene) av curdlan og en metode for produksjonen derav er allerede beskrevet i detalj i japansk patentsøknad laid-open nr. 83798/1980.

Direktkjedet P-l,3-glukan er dermed en forbindelse represen-tert med formelen:

hvor n betyr et tall fra 4 til omtrent 1000.

Ovenfor nevnte p-l,3-glukan kan ha en hvilken som helst gjennomsnittlig grad av polymerisasjon (DP) under 1000. Det partielle hydrolysatet med en DP varierende fra 6 til omtrent 300 er spesielt anbefalt og partielt hydrolysat med en DP fra 15 til omtrent 200 er foretrukket.

n og DP i formel (1) omfatter forholdet DP-2 - n.

Sulfatet til rettkjedet B-l,3-glukan i foreliggende oppfinnelse er en ester resulterende fra sulfonering av tre hydroksylgrupper i intermediatmonosakkaridet og hydroksyl-gruppene i terminale monosakkaridenheter i hvilke som helst av disse p-l,3-glukan eller de lavere polymerene derav; en ester med en gjennomsnittlig grad av substitusjon (DS) på 0,5 til 3 pr. monosakkaridenhet blir vanligvis anvendt og en ester med en DS på 1 til 2 blir fortrinnsvis anvendt.

Sulfatering av rettkjedet p<->l,3-glukan eller lavmolekylvekts-polymeren derav kan bli oppnådd ved å tillate at et sulfa-teringsmiddel, såsom klorsulfonsyre eller et kompleks av et svovelholdig anhydrid og en organisk base, såsom pyridin, dimetylformamid, trimetylamin eller dimetylanilin dertil virker på p<->l,3-glukan [Journal of Biological Chemistry, 239, 2986 (1964 )].

g<->i,3-glukansulfat anvendt i foreliggende oppfinnelse er veldig oppløselig i vann med lav toksisitet.

Svovelinnholdet i p<->1,3-glukansulfat er vanligvis over 5*

(v/v), fortrinnsvis omtrent 10 til 24* (v/v) og det er veldig oppløselig i vann.

Glukansulfat anvendt i foreliggende oppfinnelse viser veldig lav toksisitet overfor varmblodige dyr og sammensetningene og FGF eller muteinet derav i foreliggende oppfinnelse har dermed en fordel idet det trygt kan bli administrert oralt eller parenteralt til varmblodige dyr.

Glukansulfatet som kan anvendes i foreliggende oppfinnelse kan være fritt eller i form av et salt. Som salt kan det f.eks. nevnes natriumsalt, kaliumsalt, monosalt, trimetyl-ammoniumsalt. osv.

Når glukansulfat blir bragt i kontakt med FGF eller muteinet derav i et vandig medium kan dette utføres ved først å tilsette glukansulfat i fri tilstand og deretter ved å tilsette en tilstrekkelig mengde av et alkali eller en syre for å justere pH'en ønskelig. Ved tilsetning av alkali kan dekstransulfatet ta form som et salt i det vandige mediet, eller så kan en blanding av fri dekstransulfat og glukansulfat i saltformen eksistere sammen.

Når FGF eller muteinet derav ifølge foreliggende oppfinnelse blir bragt i kontakt med glukansulfat i et vandig medium, blir dette fortrinnsvis utført i nærvær av di- eller tri-basisk karboksylsyre for å gi et mer stabilisert FGF eller muteinet derav.

Eksempler på dl-basisk karboksylsyre omfatter tartarsyre, maleinsyre, malinsyre, fumarsyre, osv.

Eksempler på ti-basisk karboksylsyre omfatter sitronsyre, iso-sitronsyre, osv.

De ovenfor nevnte karboksylsyrene kan være frie eller i form av et salt. Det er også mulig at fri karboksylsyre blir satt til et vandig medium hvor en tilstrekkelig mengde alkali eller syre blir tilsatt for å justere pH'en. Ved tilsetning av alkali kan dekstransulfatet ta en form som et salt i det vandige mediumet, eller så kan en blanding av fri dekstransulfat og dekstransulfat i saltform eksistere sammen.

Når FGF eller mutein derav blir bragt i kontakt med dekstransulfat i et vandig medium varierer mengden av glukansulfat fra omtrent 0,1 til 100 mol, fortrinnsvis fra omtrent 0,5 til 4 mol, relativt til 1 mol FGF eller muteinet derav.

Konsentrasjonen av dekstransulfat i et vandig medium varierer fortrinnsvis fra omtrent 0,0005 til 5 w/v-*, fortrinnsvis fra omtrent 0,01 til 1 w/v-*.

Konsentrasjonen av FGF i et vandig medium varierer fortrinnsvis fra omtrent 0,0005 til 5 w/v-*, fortrinnsvis fra omtrent 0,01 til 1 w/v-*.

Mengden av karboksylsyre er fortrinnsvis slik at konsentrasjonen derav i et vandig medium varierer fra 1 mM til 1 M, fortrinnsvis fra omtrent 10 mM til 500 mM.

For å bringe FGF eller muteinet derav I kontakt med glukansulfat og videre med karboksylsyre i et vandig medium tilveiebringes hensikten bare ved blanding av disse materialene i det vandige mediumet.

Som vandig medium kan et hvilket som helst vandig medium for injeksjon bli anvendt, spesielt destillert vann for injeksjon, fysiologisk saltvann og glukoseoppløsning er foretrukket. Buffere såsom fosfatbuffer og tris-hydroksymetyl-aminometan-HCl-buffer kan også bli anvendt som vandig medium i foreliggende oppfinnelse.

Når FGF eller muteinet derav, glukansulfat og karboksylsyre blir blandet, kan de være i vandige oppløsninger, eller så kan en blanding av disse materialene i fast form bli løst opp i vann. Blanding av disse materialene blir utført ved temperaturer varierende fra 0 til 40°C og fortrinnsvis ved en pH varierende fra omtrent 3 til 10, fortrinnsvis fra omtrent 5 til 9. Tiden som er nødvendig for blandingen varierer vanligvis fra omtrent 1 til 30 minutter.

Ved fremgangsmåtene beskrevet ovenfor kan en stabilisert sammensetning av FGF eller muteinet derav bli tilveiebragt.

Det er bekreftet at i den stabiliserte sammensetning av FGF eller muteinet derav har det oppstått at FGF eller muteinet derav og glukansulfat bindes sammen i et visst forhold for å danne et kompleks og komplekset av FGF eller muteinet derav kan bli isolert om ønskelig. Eksempler på metoder for Isolering og samling omfatter gelfiltrering med Sephadex eller TSK-gel, ionebyttekromatografi ved anvendelse av DEAE-eller CM-Toyopearl og isoelektrisk fraksjonering. Komplekset av FGF eller muteinet derav kan dermed bli Isolert og samlet som ønskelig, eller det kan bli anvendt som sammensetning uten isolering.

Komplekset tilveiebragt på denne måten er et kompleks dannet av FGF eller muteinet derav og glukansulfat i et forhold på omtrent 1:0,5 til omtrent 1:5. Komplekset dissosierer i nærvær av en høy konsentrasjon salt, f.eks. 1 M NaCl, og anvendelse av et oppløsnlngsmiddel med høy ionestyrke må unngås i løpet av isoleringen.

En sammensetning av stabilisert FGF eller muteinet derav blir dermed tilveiebragt. Som vist i arbeidseksemplene nedenfor er sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse stabilt med hensyn på varme, pH og protease.

Sammensetningen ifølge foreliggende oppfinnelse er spesielt stabil under sure og alkaliske betingelser, samt under nøytrale betingelser.

Sammensetningen av FGF eller muteinet derav kan trygt bli administrert oralt eller parenteralt til varmblodige dyr (f.eks. mennesker, mus, rotter, hamstere, kaniner, hunder, katter) direkte eller i en farmasøytisk sammensetning (f.eks. injeksjoner, tabletter, kapsler, oppløsninger, salver) med farmakologisk akseptable bærere, tilsetningsstoffer eller fortynningsmidler.

Det er foretrukket at preparatet er i form av injeksjon, oppløsning for injeksjon, frossent preparat eller lyofilisert preparat.

Ved formulering av sammensetningen til en farmasøytisk sammensetning kan farmakologisk akseptable tilsetningsstoffer, fortynningsmidler, hjelpestoffer, osv. bli anvendt i henhold til en kjent metode for farmasøytisk produksjon.

Når sammensetningen blir formulert til en injiserbar, vandig oppløsning, blir den ønskede oppløsningen fremstilt ved en standard metode som anvender et oppløsningsmiddel såsom et vandig oppløsningsmiddel (f.eks. destillert vann), vann-oppløselig oppløsningsmiddel (f.eks. fysiologisk saltvann, Ringers oppløsning), eller et oljeholdig oppløsningsmiddel (f.eks. sesamolje, olivenolje), eller om ønskelig, et tilsetningsstoff såsom et oppløsningshjelpemiddel (f.eks. natriumsalicylat, natriumacetat), buffer (f.eks. natriumcitrat, glycerin), isotonisert middel (f.eks. glukose, invert sukker), stabilisator (f.eks. humant serumalbumin, poly-etylenglykol), konserveringsmiddel (f.eks. benzylalkohol, fenol) eller smertestillende middel (f.eks. benzalkoniumklorid, prokainhydroklorid).

Når sammensetningen blir formulert til et fast preparat for injeksjon, kan det ønskede preparatet bli fremstilt ved bruk av en rutinemessig metode ved anvendelse av et fortynningsmiddel (f.eks. destillert vann, fysiologisk saltvann, glukose), tilsetningsstoff (f.eks. karboksymetylcellulose (CMC), natriumarginat), konserveringsmiddel (f.eks. benzylalkohol, benzalkoniumklorid, fenol) eller smertestillende middel (f.eks. glukose, kalsiumglukonat, prokainhydroklorid).

For formulering av sammensetningen til et farmasøytisk preparat kan monosakkarider (f.eks. glukose), aminosyrer, forskjellige salter og humant serumalbumin bli tilsatt og et isotoniserende middel, en pH-regulator, smertestillende middel, antiseptisk middel, osv. kan også bli tilsatt for å preparere et stabilt og effektivt preparat av FGF eller muteinet derav.

FGF-sammensetningen eller muteinet derav tilveiebragt ved hvilke som helst av de ovenfor nevnte metodene har fibroblast-vekstfremmende virkning og andre virkninger og er veldig stabil og har lav toksisitet. Det kan derfor bli anvendt som et middel som fremmer leging av brannsår, sår, postoperativt vev eller, basert på angiogenisk virkning, som et terapeutisk medikament for trombose og arteriosklerose.

Sammensetningen kan også bli anvendt som et reagens for akselerering av cellevekst.

FGF-sammensetningen eller muteinet derav ifølge foreliggende oppfinnelse blir ved anvendelse som hvilke som helst av de ovenfor nevnte farmasøytiske preparatene f.eks. administrert til de ovenfor nevnte varmblodige dyrene i en hensiktsmessig mengde valgt i området fra omtrent 1 pg/kg til 100 jjg/kg daglig, beregnet som dosen av FGF eller muteinet derav med hensyn på administrasjonsveien, symptomene, osv.

FGF-sammensetningen eller muteinet derav ifølge foreliggende oppfinnelse blir når det blir anvendt som et reagens for akselerering av cellevekst fortrinnsvis satt til mediumet i en mengde på omtrent 0,01 til 10 pg, fortrinnsvis omtrent 0,1 til 10 pg pr. liter medium, beregnet som mengden av FGF eller muteinet derav.

På grunn av at FGF eller muteinet derav kan bli stabilisert ved å bringe det i kontakt med glukansulfat i et vandig medium som beskrevet ovenfor og stabilisert sammensetning av FGF eller muteinet kan dermed bli tilveiebragt og det er derfor mulig å formulere FGF eller muteinet derav til et farmasøytisk preparat, mens effekten forblir stabil.

Den antikoagulerende virkningen av glukansulfat tilveie-bringer ingen problemer ved administrering av sammensetningen ifølge oppfinnelsen på grunn av at det er svakere sammen-lignet med heparin.

Ved å bringe FGF eller muteinet derav i kontakt med glukansulfat i et vandig medium kan en stabilisert sammensetning av FGF eller muteinet derav bli tilveiebragt. Stabilisert sammensetning av FGF eller muteinet derav kan dermed bli formulert til farmasøytiske preparater, mens effekten av FGF eller muteinet derav blir beholdt.

Fig. 1 viser basesekvensen som koder for humant bFGF og

aminosyresekvensen avledet derfra.

Fig. 2 viser gelfiltreringsmønsteret av rhbFGF-mutein CS23-sammensetningen og lavmolekylvektsheparin tilveiebragt i eksempel 12.

Rekombinant humant basisk FGF (nedenfor også forkortet rhbFGF) anvendt i arbeidseksemplene presentert nedenfor blir produsert ved metoden beskrevet i Europa patentpublikasjon (nedenfor også referert til som EP-publikasjon) nr. 237.966. rhbFGF blir dermed produsert og renset ved metoden beskrevet i eksemplene 1, 3 og 6 eller 8 i EP-publ ikasj on nr. 237.966 ved anvendelse av transformanten Escherichia coli K12 MM294/pTB669 (IFO 14532, FERM BP-1281).

Rekombinant humant basisk FGF-mutein CS23 (nedenfor også betegnet rhbFGF-mutein CS23) anvendt i eksemplene presentert nedenfor blir produsert ved hjelp av metodene beskrevet i eksemplene 7 og 24 i EP-publikasjon nr. 281.822, referanseeksemplene 10 i EP-publikasjon nr. 288.687 (EP-søknad nr. 88103047.2) som korresponderer med japansk patentsøknad nr. 50249/1988, eller Biochemical and Biophysical Research Communications, 151, 701-708 (1988). rhbFGF-mutein CS23 er dermed blitt produsert og renset ved metodene beskrevet i referanseeksemplene 1 til og med 3 presentert nedenfor (metodene er de samme som de som er beskrevet i de ovenfor nevnte referansene) ved anvendelse av rekombinant Escherichia coli MM294/pTB762 (IFO 14613, FERM BP-1645).

De ovenfor nevnte transformantene E. coli K12 MM294/pTB669 (inneholdende plasmid pTB669 anvendt i referanseeksempel 1 nedenfor) og E. coli MM294/pTB762 (se referanseeksempel 3 nedenfor) er blitt deponert til the Institute for Fermen tation, Osaka (IFO), Japan og til the Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry of International Trade and Industry (FRI), Japan. Aksesjonsnumrene og deponeringsdatoene er vist i tabell 1. Når det gjelder deponering til FRI, ble deponeringene opprinnelig utført under aksesjonsnumrene betegnet ved FERM P-numrene. Deponeringene ble omdannet til deponeringer under the Budapest Treaty og transformantene er blitt lagret ved Instituttet (FRI) under aksesjonsnumrene betegnet ved FERM BP-numrene.

Ved nummerering av aminosyrene i humane bFGF-aminosyresekvenser beskrevet ovenfor eller i de følgende referanseeksemplene blir Met ved den N-terminale enden av den humane bFGF-aminosyresekvensen vist i fig. 1 bestemt som første aminosyre.

Referanseeksempel 1

(Produksjon av rekombinante DNA'er inneholdende mutein-kodende basesekvens)

(1) Kloning av humant bFGF-gen i M13-vektor:

Plasmid pTB669 tilveiebragt i eksempel 3 i Europa patentpublikasjon nr. 237.966 ble spaltet med restrik-sjonsenzymene EcoRI og BamHI. Fagvektor M13mp8 [J. Messing, Methods in Enzymology, 101, 20-78 (1983)] replikerende form (RF) DNA ble spaltet med restrik-sjonsenzymene EcoRI og BamHI og ble blandet med det humane bFGF DNA-fragmentet avledet fra spaltet pTB669. Blandingen ble deretter ligert sammen ved hjelp av T4 DNA-ligase og ligert DNA ble transformert inn i en infiserbar celle av stammen Escherichia coli JM105, den resulterende transformanten ble inokulert på en plate ved anvendelse av Xgal som en indikator [J.Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309-321 (1981)]; plaque inneholdende den rekombinante fagen (hvite plaque) ble tatt opp, basesekvensen til den rekombinante regionen ble bestemt ved dideoksynukleotidsyntisk kjedeterminerings-metoden [J. Messing et al., Nucleic Acids Research, 9, 309 (1981)], og det ble dermed bekreftet at humant bFGF DNA var blitt nøyaktig innsatt.

Fra denne M13-P0-klonen ble enkelt-trådet fag-DNA renset, og dette ble deretter anvendt som en templat for sete-rettet mutagenese ved anvendelse av et syntetisk oligonukleotid.

(2) Sete-spesifikk mutagenese:

I nærvær av 0,1 mM adenosintrifosfat (ATP), 50 mM Tris-(hydroksymetylaminometanhydroklorid (Tris-HCl, pH 8,0), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol (DTT) og 9 enheter

T4—kinase, i en totalmengde på 50 pl, ble 40 pikomol av det syntetiske oligonukleotidet:

5' > CGT TCT TGC TGT AGA GCC GCT < 3'

[primer for endring av Cys26 til Ser (gjenkjennings-sekvensen til restriksjonsenzymet Rsal forsvinner)] behandlet med T4-kinase ved 37"C i en time. Denne kinase-behandlede primer en (12 pikomol) ble oppvarmet ved 67°C i 5 minutter og ved 42" C i 25 minutter i 50 pl av en

blanding inneholdende 50 mM NaCl, 1,0 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl2og 10 mM p<->merkaptoetanol, idet primeren ble hybridisert til 5 pg enkelt-trådet (ss) M13-PO DNA. Den sammensmeltede blandingen ble deretter avkjølt på is, og den ble satt til 50 pl av en reaksjonsblanding inneholdende 0,5 mM deoksynukleotid-trifosfat (dNTP), 80 mM Tris-HCl (pH 7,4), 8 mM MgCl2,

100 mM NaCl, 9 enheter DNA-polymerase I Klenow-fragment, 0,5 mM ATP og 2 enheter T4 DNA-ligase, og reaksjonen ble utført ved 37° C i 3 timer, og ved 25° C i 2 timer, idet reaksjonen ble stoppet ved tilsetning av 2 pl 0,2 mM EDTA. Reaksjonsproduktet ble anvendt for å transformere infiserbare JM105-celler og transformantcellene tilveiebragt på denne måten ble latt vokse over natt, mens ssDNA ble isolert fra kulturemediumsupernatanten. Ved anvendelse av dette ssDNA som en templat for den andre cyklusen av primerforlengingen, ble gel-renset RF-type DNA transformert inn i injiserbare JM105-celler; de resulterende transformantcellene ble spredt over en agarplate, og dyrket over natt for å tilveiebringe fagplaque.

(3) Sete-rettet mutagenese:

Fremgangsmåten (2) ovenfor ble gjentatt, men den anvendte syntetiske oligonukleotidprimeren var:

5' > AAC GAT TAG CGC TCA CTC C < 3'

som forandrer cystein-70-kodende kodonet slik at kodonet koder for serin. (En gjenkjenningssekvens til restriksjonsenzym Haell ble produsert.)

(4) Sete-rettet mutagenese:

Fremgangsmåten i (2) ovenfor ble gjentatt, men den anvendte syntetiske oligonukleotidprimeren var:

5' > GTA ACA GAC TTA GAA GCT AGT < 3'

som forandrer cystein-88-kodende kodonet slik at kodonet koder for serin. (En gjenkjenningssekvens for restriksjonsenzym Alu ble produsert.)

(5) Sete-rettet mutagenese:

Fremgangsmåten i (2) ovenfor ble gjentatt, men den anvendte syntetiske oligonukleotidprimeren var:

5' > TCG AAG AAG AAA GAC TCA TCC < 3'

som dermed forandrer cystein-93-kodende kodonet slik at

kodonet koder for serin. (En gjenkjenningssekvens for restriksjonsenzym Hinfl ble produsert.) (6) Screening og identifikasjon av plaque som er blitt mutagene: Skåler inneholdende muterte M13-P0 plaque [ovenfor i (1)] og 2 skåler inneholdende ikke-muterte M13-P0

fagplaque ble avkjølt til 4°C, og plaquene fra hver skål ble overført til 2 runde nitrocellulosefiltere ved å beholde et tørt filter plassert på agarskålen i 5 minutter når det gjelder det første filteret, og i 15 minutter når det gjelder det andre filteret. Filtrene ble deretter holdt i 5 minutter på tykke filterpapir nedsenket i 0.2N NaOH, 1,5 M NaCl og 0,2* Triton X-100, hvorpå de ble nøytralisert ved å plassere de i ytterligere 5 minutter på filterpapir nedsenket i 0,5 M Tris-HCl med en pH-verdi på 7,5 og 1,5 M NaCl. Filtrene ble vasket to ganger på filterpapir nedsenket i 2 x SSC (standard natriumcitrat) på samme måte, og ble tørket, og deretter tørket ved 80"C i 2 timer i en vakuumovn. De overlappende filtrene ble utsatt for prehybridisering ved 55°C i 4 timer med 10 ml/filter av en DNA-hybridiseringsbuffer-oppløsning (5 x SSC) med en pH-verdi på 7,0 inneholdende 4 x Denhardts-oppløsning (polyvinylpyrrolidon, Ficoll og

bovint serumalbumin, 1 x = 0,02*), 0,1* natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM natriumfosfatbufret oppløsning med en pH-verdi på 7,0 og 100 jjg/ml denaturert laksesperm-DNA. Hybridisasjon ble utført ved 42° C i 24 timer med IO<5>cpm/ml av en oligonukleotidprimer. Hver av filtrene ble vasket i en bufferoppløsning for vasking inneholdende 0,1* SDS og en reduserende mengde SSC ved 5 0°C i 30 minutter. Filtrene ble deretter først vasket med en bufferoppløsning inneholdende 2 x SSC og kontrollfUtrene, som inneholdt ikke-muterte M13-P0 plaque, ble undersøkt for radioaktivitet ved anvendelse av en Geigerteller. Mens SSC-konsentrasjonen gradvis ble redusert, ble kontrollf Utrene vasket helt det ikke var noe

gjenværende påvisbar radioaktivitet på filtrene. Den minimale konsentrasjonen av SSC som ble anvendt var 0,1 x SSC. Filtrene ble tørket i luft og autoradiogrammene ble tatt etter 2 til 3 dagers utsetting ved -70° C. Screening ble utført av 10.000 muterte M13-P0 plaque og 100 ikke-muterte kontrollplaque ved anvendelse av en kinase-behandlet oligonukleotidprobe. Ingen av kontroll-plaquene hybridiserte til proben, mens 3 til 10 av de muterte M13-P0 plaquene hybridiserte til proben.

En av de muterte M13-P0 plaquene ble tatt ut, og inokulert i et JM105 kulturmedium. Fra supernatanten ble et ssDNA preparert, og fra de bakterielle cellepelletene ble dobbelt-trådet (ds) DNA preparert. Analyser av basesekvensene ved anvendelse av hensiktsmessige oligonukleotidprimere og ssDNA'er ble utført.

Som et resultatet ble det respektivt bekreftet at TGC (Cys-26) kodonet var blitt forandret til et TCT (Ser) kodon, TGT (Cys-70) kodon til et AGC (Ser) kodon, TGT (Cys-88) kodon til et TCT (Ser) kodon, og TGT (Cys-93) kodon til et TCT (Ser) kodon.

I de muterte M13-P0 fagene, hvori faget hvori kodonet Cys-26 var blitt et Ser-kodende kodon ble betegnet M13-P1, faget hvori kodonet Cys-70 var blitt et Ser-kodende kodon, M13-P2, faget hvori kodonet Cys-88, M13-P3, og fagen hvori kodonet Cys-93 var blitt et Ser-kodende kodon, M13-P4.

Referanseeksempel 2

(Screening og identifikasjon av plaque som var blitt gjort mutagene)

Skåler inneholdende muterte M13-P2 fag plaque tilveiebragt i referanseeksempel 1 og 2 skåler inneholdende ikke-muterte M13-P2 fag plaque tilveiebragt i referanseeksempel 1 ble avkjølt til 4°C, og plaquen fra hver plate ble overført til 2 runde nitrocellulosefiltere ved å holde et tørt filter plassert på agarskålen i 5 minutter når det gjelder det første filteret, og i 15 minutter når det gjelder det andre filteret. Filtrene ble deretter holdt i 5 minutter på tykke filterpapir nedsenket i 0,2N NaOH, 1,5 M NaCl og 0,2* Triton X-100, og deretter ble de nøytralisert ved å plassere dem i ytterligere 5 minutter på filterpapir nedsenket i 0,5 M Tris-HCl (pH 7,5) og 1,5 M NaCl. Filtrene ble vasket to ganger på filter nedsenket i 2 x SSC (standard natriumcitrat) på samme måte, og ble tørket, og dette ble etterfulgt av tørking ved 80°C i 2 timer i en vakuumovn. De overlappede filtrene ble utsatt for prehybridisering ved 55°C i 4 timer med 10 ml/filter av en DNA-hybridiseringsbufferoppløsning (5 x SSC) med en pH-verdi på 7,0 inneholdende 4 x Denhardts-oppløsning (polyvinylpyrrolidon, Ficoll og bovint serumalbumin, 1 x = 0,02*), 0,1* natriumdodecylsulfat (SDS), 50 mM natriumfosfatbufret oppløsning med en pH-verdi på 7,0 og 100 jjg/ml denaturert laksesperm-DNA. Hybridisasjonen ble utført ved 42" C i 24 timer med IO<5>cpm/ml av en oligonukleotidprimer. Filtrene ble vasket i en bufferoppløsning for vasking inneholdende 0,1* SDS og en reduserende mengde SSC ved 50°C i 30 minutter. Filtrene ble deretter først vasket med en bufferoppløsning inneholdende 2 x SSC og kontrollfUtrene, som inneholdt ikke-muterte M13-P2 plaque, ble undersøkt for radioaktivitet ved anvendelse av en Geigerteller. Mens SSC-konsentrasjonen ble gradvis redusert, ble kontrollfUtrene vasket helt til det ikke forble noe påvisbar radioaktivitet igjen på filtrene. Den minimale SSC-konsentrasjonen som ble anvendt var 0,1 x SSC. Filtrene ble tørket i luft, og radioautograflene ble tatt ut etter 2 til 3 dagers utsetting ved -70°C. Screening ble utført på 10.000 muterte M13-P2 plaque og 100 ikke-muterte kontrollplaque ved anvendelse av en kinase-behandlet oligonukleotidprobe. Ingen av kontroll-plaquene hybridiserte til proben, mens 3 til 10 av de muterte M13-P2 plaquene hybridiserte til proben.

En av de muterte M13-P2 plaquene ble tatt ut, og inokulert i et JM105-kulturmedium. Fra den resulterende supernatanten ble ssDNA preparert og fra de bakterielle cellepelletene ble en dobbelt-trådet (ds) DNA preparert. Analyser ble utført på basesekvensene ved anvendelse av hensiktsmessige oligonukleotidprimere og ssDNA'er.

Som et resultat ble det respektivt bekreftet at TGC (Cys-26) kodonet var blitt forandret til et TCT (Ser) kodon; TGT (Cys-88) kodonet, til et TCT (Ser) kodon; og TGT (Cys-93) kodonet, til et TCT (Ser) kodon.

Fra de muterte M13-P2 fagene, ble fag hvori kodonene Cys-26 og -70 var blitt Ser-kodende kodoner betegnet M13-P12; fag hvori kodonene Cys-70 og -88 var blitt Ser-kodende kodoner, M13-P23; og fag hvori kodonene Cys-70 og -93 var blitt Ser-kodende kodoner, M13-P24.

Referanseeksempel 3

(Ekspresjon i Escherichia coli av gener som koder for humant bFGF-mutein)

(1) Konstruksjon av plasmid pTB762 for human bFGF-mutein-ekspresjon: M13-P23 replikerende form (RF) tilveiebragt i referanseeksempel 2 ovenfor ble spaltet ved anvendelse restrik-sjonsenzymene EcoRI og Pstl for å tilveiebringe omtrent 0,5 kb DNA-fragment inneholdende regionen som koder for humant bFGF-mutein.

Separat ble plasmid ptrp781 [Kurokawa, T. et al., Nucleic Acids Research, 11,3077-3085 (1983)] DNA inneholdende en trp-promoter spaltet ved anvendelse av EcoRI-PstI for å separere et 3,2kb DNA-fragment inneholdende en trp-promoter, et tetracyklinresistensgen og et plasmid replikasjonsinitieringssete. Det ovenfor nevnte 0,5 kb EcoRI-PstI DNA-fragmentet inneholdende genregionen som koder for humant bFGF-mutein og dette 3,2 kb DNA-fragmentet ble ligert sammen ved bruk av T4 DNA-ligase-j reaksjon for å konstruere plasmid pTB762 for human bFGF-muteinekspresjon.

Ved anvendelse av dette pTB762-plasmidet ble Escherichia coli MM294 transformert, men stammen Escherichia coli MM294/pTB762 (IFO 14613, FERM BP-1645) ble tilveiebragt og inneholder plasmid pTB762 inneholdende det mutein CS23-kodende genet.

(2) Preparering av bakterielt celleekstrakt:

Den ovenfor nevnte transformanten ble dyrket i et M9-medium inneholdende 1* glukose, 0,4* kasaminosyre og 8Hg/ml tetracyklin og når Klett-verdien ble omtrent 200, ble 3p<->indolylakrylsyre tilsatt til en konsentrasjon på 25 pg/ml og dette ble etterfulgt av dyrking i ytterligere 4 timer. Etter dyrking ble de bakterielle cellene samlet og suspendert i en 10* sukroseoppløsning inneholdende en 1/20-mengde 20 mM Tris-HCl (pH 7,6). Til denne suspensjonen ble fenylmetylsulfonylfluorid (PMSF) til 1 mM, EDTA til 10 mM, NaCl til 0,1 M, spermidinhydroklorid til 10 mM og lysozym til 100 pg/ml tilsatt (hvert tall angir den finale konsentrasjonen), og blandingen ble latt stå ved 0"C i 45 minutter, hvorpå den ble utsatt for ultra-sonikering i 30 sekunder. Denne oppløsningen ble sentrifugert ved 18.000 rpm, (Sorval sentrifuge, SS34 rotor) i 30 minutter for å tilveiebringe en supernatant, som deretter ble anvendt som et bakterielt celleekstrakt . (3) Human bFGF-aktivitet i det bakterielle celleekstraktet: Muse BALB/c3T3-celler, i en mengde på 2 x 10^-celler pr. brønn, ble inokulert i et DMEM-medium inneholdende 5* kalveserum på Nunc 96-brønn mikrotiterplate (flat bunn) idet hver brønn inneholdt 0,2 ml av mediumet, og disse ble dyrket. Neste dag ble mediumet erstattet med et DMEM-medium inneholdende 0,5* kalveserum. Etter dyrking i 3 dager ble 10 pl av det bakterielle celleekstraktet, som tidligere ble fortynnet i serie i 5-gangers trinn med et DME-medium inneholdende 0,5* BSA, tilsatt hver brønn, og dyrket. 20 timer senere ble 2 pl<3>H-Tdr (5 Ci/mmol, 0,5 mCi/ml RCC Amersham) satt til hver brønn. 6 timer senere ble cellene strippet ved behandling med en fosfat-bufret oppløsning (PBS) inneholdende 0,2* trypsin-0,02* EDTA, og cellene ble høstet på et glassfilter ved hjelp av en Titertech-cellehøster, og mengden<5>H-Tdr i cellene bestemt ved anvendelse av en scintillasjonsteller.

Det bakterielle celle-ekstraktet fra E. coli MM294/pTB762 utviste FGF-aktivitet.

rhbFGF-mutein CS23, hvori Cys ved 70- og 88-posisjonene av humant bFGF var blitt erstattet med Ser, ble dermed tilveiebragt. (4) Et 25 ml ekstrakt tilveiebragt i (3) ovenfor (fremstilt fra 500 ml kulturmedium) ble sendt gjennom en kolonne (2 cm diameter x 10 cm) bestående av DEAE-cellulose (DE52, Whatman, UK) ekvilibrert med 20 mM tris-HCl, pH 7,4, i en 0,2 M NaCl-oppløsning for å fjerne nukleinsyrekomponen-tene fra ekstraktet. Eluatet fra kolonnen og kolonne-vaskingene med 20 mm Tris-HCl, pH 7,4, i en 0,2 M NaCl-oppløsning ble kombinert (60 ml av fraksjonen sendt gj ennom DEAE).

Denne fraksjonen ble utsatt for HPLC (high performance liquid chromatography) (Gilson, Frankrike) gjennom en heparin-kolonne Shodex AF-pak HR-894 (8 mm ID x 5 cm, produsert av Showa Denko, Japan). Kolonnen ble vasket med sekvensiell tiltetting av en 20 mM tris-HCl-oppløsning, pH 7,4, og 20 mM tris-HCl, pH 7,4, i en 0,5 M NaCl-oppløsning, hvorpå den ble utsatt for lineær gradient-eluering (60 ml volum, 1,0 l/min. strømningshastighet) med en gradient på 0,5 M til 2 M NaCl i en 20 mM tris-HCl-buf f er, pH 7,4.

Toppfraksjonen eluerte mellom 15 og 25 min. av elueringstiden ble funnet å inneholde rhbFGF-mutein CS23 og denne fraksjonen ble samlet. Den spesifikke aktiviteten til fraksjonen var 1,1 mg-protein FGF/mg protein, beregnet på basis av FGF-aktiviteten til standardprøven av bovint hjerne-avledet FGF (over 95* renhet) produsert av Takara Shuzo Co., Ltd., Japan.

Referanseeksempel 4

Fremstilling av natriumsaltet av3-cyklodekstrintetradecan-sulfat (a) 5 g 3-cyklodekstrin ble løst opp i 250 ml dimetylformamid. Til denne oppløsningen ble 15 g svoveltrioksyd-trimetylamin-komplekssalt tilsatt over en periode på 5 min., mens oppløsningen ble omrørt ved 70°C og dette ble etterfulgt av risting i 16 timer ved konstant temperatur. Etter avkjøling av blandingen ble 250 ml etanol tilsatt og dette ble etterfulgt av dekantering for å samle det uoppløselige materialet som deretter ble vasket med en liten mengde etanol. Resten ble løst opp i 250 ml vann og det uoppløselige materialet ble deretter filtrert. Til filtratet ble 75 ml av en vandig oppløsning av 30 w/v-* natriumacetat tilsatt, og dette ble etterfulgt av risting i en time ved romtemperatur. (b) Reaksjonsblandlngen tilveiebragt ovenfor inneholdende natriumsaltet av e-cyklodekstrin-tetradecansulfat ble konsentrert til tørrhet under redusert trykk. Konsen-tratet ble løst opp i 75 ml vann. Til denne oppløsningen ble 150 ml etanol tilsatt og det gummiaktige faste stoffet ble samlet ved dekantering. Det gummiaktig faste stoffet ble gjort til pulver ved tilsetning av 30 ml etanol og ble samlet ved filtrering og tørket til 10,3 g av sluttforbindelsen.

Elementanalyse (som 042^5077814^14):

Beregnet: C 19,68; H 2,20; S 17,51 (*)

Funnet: C 20,67; H 3,40; S 16,29

[a]§<2>= + 83,5°(c = 1,55, vann)

Vanninnhold: 1,5* w/w (Karl Fischers metode).

Referanseeksempel 5

2,5 g p<->l,3-glukan (curdlan) med en gjennomsnittsgrad av polymerisasjon på 540 ble suspendert i 100 ml dimetylformamid. Til denne suspensjonen ble 12,5 g trimetylamin-sulfonsyre fremstilt fra 13,5 g klorsulfonsyre og 11,7 g trietylamin tilsatt og dette ble etterfulgt av reaksjon i 24 timer i isvann, idet røring av blandingen foregikk. Reaksjonsblandingen ble tilstrekkelig dialysert mot 0,5 M ammoniumbikarbonat, hvorpå den ble lyofilisert til 4,4 g av det ønskede produktet. Ammoniumsaltet av e-1,3-glukansulfat tilveiebragt på denne måten hadde en gjennomsnittlig grad av substitusjon (DS) på 1,04 (sulfatinnhold 12,7*).

Referanseeksempel 6

2,5 g e-l,3-glukan lavmolekylvektspolymer (gjennomsnittlig grad av polymerisasjon 6), tilveiebragt ved partiell hydrolyse (95°C, 40 min.) av p-l,3-glukan med en gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad på 540 med 90* maursyre ble suspendert i 150 ml dimetylformamid. Til denne suspensjonen ble 50 g trietylaminsulfonsyre tilsatt og dette ble etterfulgt av 24 timers reaksjon i isvannbad, mens omrøring av blandingen pågikk. Reaksjonsblandingen ble utsatt for gelfiltrering gjennom en 2,5 1 Sephadex G-25 (fin) kolonne ekvilibrert med 0,02 M ammoniumbikarbonat. Eluatet ble analysert for sukkerinnhold ved fenolsulfonsyre-metoden. Sukkerfraksjonene ble deretter kombinert sammen og lyofilisert til 5,6 g p<->1,3-glukansulfat. Det ønskede produktet tilveiebragt på denne måten hadde en DS på 1,12 (svovelinnhold 13,3*).

Referanseeksempel 7

2,5 g p<->l,3-glukan lavmolekylvektspolymer (gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad 26), tilveiebragt ved partiell hydrolyse (900C, 40 min.) av p<->l,3-glukan med en gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad på 540 med 90* maursyre ble suspendert i 150 ml dimetylformamid. Til denne suspensjonen ble 50 g trietylamin-sulfonsyre tilsatt og dette ble etterfulgt av reaksjon i 24 timer i isvannbad, mens omrøring av blandingen pågikk. Reaksjonsblandingen ble behandlet på samme måte som i referanseeksempel 6 for å gi 6,1 g ammoniumsalt av p<->1,3-glukansulfat. Det ønskede produktet tilveiebragt på denne måten hadde en DS på 1,22 (svovelinnhold 14,0*).

Referanseeksempel 8

2,5 g av en p-l,3-glukan lavmolekylvektspolymer (gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad 131) tilveiebragt ved partiell hydrolyse (80°C, 30 min.) av p<->l,3-glukan med en gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad på 540 med 85* maursyre ble suspendert i 100 ml dimetylformamid. Til denne suspensjonen ble 12,5 g trietylamin-sulfonsyre tilsatt og dette ble etterfulgt av reaksjon i 24 timer i isvannbad med omrøring av blandingen. Reaksjonsblandingen ble tilstrekkelig dialysert mot 0,5 M ammoniumbikarbonat, hvorpå den ble lyofilisert til 3,9 g ammoniumsalt av p<->1,3-glukansulfat. Det ønskede produktet tilveiebragt på denne måten hadde en DS på 1,46 (svovelinnhold 15,4*).

Referanseeksempel 9

Bestemming av FGF-aktivitet i arbeidseksemplene presentert nedenfor ble utført 1 henhold til en metode beskrevet i (1) eller (2) nedenfor.

(1) Muse BALB/c3T3-celler i suspensjon i et DMEM-medium inneholdende 5# kalveserum ble sådd ut på en Nunc 96-brønn mikrotiterplate (flat bunn) i en mengde på 0,2 ml (2 x IO<3>celler) pr. brønn og dyrket. Neste dag ble mediumet erstattet med et DMEM-medium inneholdende 0,5$ kalveserum. Etter dyrkning i tre dager ble 10 pl av det bakterielle celleekstraktet tidligere fortynnet i serie i 5 gangers trinn med et DME-medium inneholdende 0, 5% BSA,

tilsatt til hver brønn og dyrket. 20 timer senere ble 2 pl<5>H-Tdr (5 Ci/mmol, 0,5 Ci/ml RCC Amersham) tilsatt til hver brønn. 6 timer senere ble cellene strippet ved behandling med en fosfatbufferoppløsning (PBS) inneholdende 0,2* trypsin-0,02* EDTA, og cellene ble høstet på et glassfilter ved hjelp av en Titertech-cellehøster, mens mengden av<J>H-Tdr i cellene ble bestemt ved anvendelse av en scintillasjonsteller.

(2) Prøven som tidligere ble fortynnet i 2-gangers trinn med et DMEM-medium inneholdende 10* kalveserum, ble satt til en Nunc 96-brønn mikrotiterplate (flat bunn) i en mengde på 50 pl pr. brønn, mens føtale bovine hjerteendo-telialiske celler (CRL1395) kjøpt fra the American Type Culture Collection ble sådd ut i en mengde på 50 pl (2 x 10<3>celler) pr. brønn og dyrket i 3 dager. En MTT-oppløsning (5 mg/ml PBS, Sigma) ble deretter tilsatt i en mengde på 20 pl pr. brønn. 4,5 timer senere ble 100 pl 10* SDS-0,01N HC1 tilsatt og platen ble latt stå i en inkubator over natt, mens absorbansen ved 590 nm ble bestemt ved anvendelse av en Titertech Multiscan [Tada et al., Journal of Immunological Methods, 93, 157

(1986)].

Eksempel 1

Til et Dulbecco MEM-medium [Virology 8, 396 (1959)] inneholdende 10* føtalt kalveserum ble rhbFGF tilsatt til en konsentrasjon på 10 pg/ml og et salt av dekstransulfat til final konsentrasjon på sistnevnte var 25 pg/ml ble tilsatt og mediumet ble inkubert ved 37°C i 24 timer. Saltene av dekstransulfat var natriumsalter med gjennomsnittlig molekylvekt på 5000, 7500 eller 500.00 respektivt. Som en kontrollgruppe ble det samme mediumet uten tilsetning av dekstransulfatnatrium anvendt. De gjenværende aktivitetene etter 24 timer er vist i tabell 2. I kontrollen, var ingen vesentlig FGF-aktivitet gjenværende, mens i testgruppene var FGF-aktiviteten stabil.

Eksempel 2

Til et Dulbecco MEM-medium inneholdende 10% føtalt kalveserum ble rhbFGF-mutein CS23 tilsatt til konsentrasjonen av sistnevnte var 10 pg/ml og et salt av dekstransulfat slik at den finale konsentrasjonen av sistnevnte var 25 pg/ml ble videre tilsatt og mediet ble inkubert ved 37°C i 24 timer. Saltene av dekstransulfat var natriumsalter med en gjennomsnittlig molekylvekt på 5000, 7500 eller 500.00 respektivt. Som en kontrollgruppe ble det samme mediet uten tilsetning av dekstransulfatnatrium anvendt. De gjenværende aktivitetene etter 24 timer er vist i tabell 3. I kontrollen, forble ingen vesentlig aktivitet, mens i testgruppene var FGF-aktiviteten stabil.

Eksempel 3

Til en 20 mM f osfatbuf feroppløsning (pH 7,4) ble rhbFGF tilsatt til konsentrasjonen nådde 10 pg/ml og dekstransulfatnatrium (gjennomsnittlig molekylvekt 7500, svovelinnhold 17,4*) ble tilsatt i forskjellige forhold, etterfulgt av inkubasjon ved 37"C I 72 timer. Mengden av dekstransulfatnatrium som ble tilsatt var slik at konsentrasjonen derav oppnådde 0 til 16 mol relativt ti rbhFGF. Som kontroll ble det samme mediet uten dekstransulfat anvendt. De gjenværende aktivitetene etter 72 timer er vist i tabell 4.

Eksempel 4

Til en 20 mM f osfatbuf feroppløsning (pH 7,4) ble rhbFGF tilsatt til konsentrasjonen av sistnevnte var 10 pg/ml, og dekstransulfatnatrium og/eller natriumcitrat ble videre tilsatt, etterfulgt av frysetørring. Konsentrasjonen av dekstransulfatnatrium (gjennomsnittlig molekylvekt 7500, S—Innhold 17,4*) var 25 pg/ml, mens konsentrasjonen til natriumcitrat var 50 mM. De frysetørrede materialene ble gjenopprettet ved tilsetning av destillert vann og deretter ble de gjenværende aktivitetene bestemt. Resultatene er vist i tabell 5.

Eksempel 5

Til en 20 mM f osfatbuf feroppløsning (pH 7,4) ble rhbFGF tilsatt til konsentrasjonen av sistnevnte var 10 pg/ml og dekstransulfatnatrlum (gjennomsnittlig molekylvekt 7500, svovelinnhold 17,4*) ble videre tilsatt til en final konsentrasjon på 25 pg/ml, etterfulgt av inkubasjon ved 37°C i 72 timer. Derimot ble istedenfor ovenfor nevnte dekstransulfatnatrlum, natriumcitrat, natriummalat, natriummaleat, natriumfumarat eller natriumtartrat tilsatt til den ovenfor nevnte bufferoppløsningen slik at den finale konsentrasjonen ble 0,4 M, enkeltvis eller blandet sammen med dekstransulfatnatrlum (25 pg/ml), etterfulgt av inkubasjon ved 37" C i 24 timer. De gjenværende aktivitetene etter 72 timer er vist i tabell 6.

Eksempel 6

Til en 50 mM natriumcitratoppløsning, pH 7,4, ble rhbFGF tilsatt til en konsentrasjon på 100 pg/ml. Til denne blandingen ble et salt av dekstransulfat tilsatt en final konsentrasjon på 46 pg/ml (1:1 molart forhold), og dette ble etterfulgt av 30 min. inkubasjon ved 56°C. Saltet av dekstransulfat som ble anvendt var i form av et natriumsalt med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7500. En gruppe ikke-supplementert med dekstransulfat ble etablert som kontroll. Tabell 7 viser den gjenværende aktiviteten funnet 30 min. senere. Som vist ut fra resultatene i tabell 7, ble FGF-aktiviteten nesten borte i kontrollgruppen, mens FGF-aktiviteten var stabil selv ved en høy temperatur i dekstransulfatgruppen.

Eksempel 7

Til en 2 mM fosfatbufferoppløsning (pH 7,0) ble rhbFGF-mutein CS23, som tilveiebragt i referanseeksempel 3, tilsatt til 100 pg/ml konsentrasjon. Til denne blandingen ble dekstransulfatnatrium med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7500 tilsatt til en final konsentrasjon på 46 pg/ml (1:1 molart forhold) og dette ble etterfulgt av inkubasjon i 2 timer ved 37"C ved pH 3,0, 5,0, 7,4 eller 9,7. Tabell 8 viser den gjenværende FGF-aktiviteten funnet etter 2 timers inkubasjon.

Resultatene vist i tabell 8, viser at FGF-aktiviteten ble merkbart redusert ved en hvilken som helst pH i kontrollgruppen, men FGF-aktiviteten ble beholdt i høyt nivå i dekstransulfatgruppen.

Eksempel 8

Til 8 mM HC1, ble rhbFGF-mutein CS23, som tilveiebragt i referanseeksempel 3 og dekstransulfatnatrium med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7500, tilsatt til finale konsentra-sjoner på 100 pg/ml og 95 pg/ml, respektivt (1:1 molart forhold), mens pepsin ble tilsatt til 4 pg/ml konsentrasjon (final pH 2,1). En gruppe ikke supplementert med dekstran-sulf atnatrium ble anvendt som kontroll. Reaksjonsblandingen ble inkubert ved 37 °C i 30 min. og den gjenværende FGF-aktiviteten ble bestemt (Tabell 9). Nesten hele rhbFGF-mutein CS23-aktiviteten var borte i kontrollgruppen, men FGF-aktiviteten var fremdeles stabil med hensyn på pepsinspalting I dekstransulfatnatriumgruppen.

Eksempel 9

Til en 20 mM f osfatbuf feroppløsning (pH 7,4) ble rhbFGF-mutein CS23, tilveiebragt i referanseeksempel 3, tilsatt til 100 pg/ml konsentrasjon. Til denne blandingen ble dekstran-sulf atnatrium med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7500 tilsatt til 94 pg/ml (1:1 molart forhold) konsentrasjon, mens trypsin eller a-chymotrypsln ble tilsatt til en konsentrasjon på 4 pg/ml. Dette ble etterfulgt av inkubasjon ved 37"C i 16 timer. En gruppe ikke supplementert med dekstransulfatnatrium ble anvendt som kontroll. Nesten hele rhbFGF-mutein CS23 aktiviteten ble borte i kontrollgruppen, men aktiviteten forble stabil i nærvær av en protease såsom trypsin eller a-chymotrypsin i dekstransulfatnatriumgruppen (tabell 10).

Eksempel 10

Til Dulbecco's MEM-medium inneholdende 10* føtalt bovint serum ble rhbFGF tilsatt til en konsentrasjon på 10 pg/ml. Til denne blandingen ble p-cyklodekstrintetradecasulfat-natrium tilveiebragt i referanseeksempel 4, eller p<->1,3-glukansulfatammonium, tilveiebragt i referanseeksempel 5 til og med 8, tilsatt til en final konsentrasjon på 500 pg/ml og dette ble etterfulgt av inkubasjon i 24 timer ved 37° C. P—1,3-glukansulfatammonium som ble anvendt hadde en gjennomsnittlig polymerisasjonsgrad på 6 (svovelinnhold 13,5*), 26 (svovelinnhold 14,0*), 131 (svovelinnhold 15,4*) eller 540 (svovelinnhold 12,7*). En gruppe ikke supplementert med sulfatert glukan ble tilveiebragt som kontrollgruppe. Tabell 11 viser gjenværende FGF-aktivitet funnet etter 24 timers inkubasjon. Nesten hele FGF-aktiviteten var borte i kontrollgruppen, men FGF-aktiviteten var stabil i p<->cyklodekstrinsulfat- eller P-l,3-glukansulfatgruppen.

Eksempel 11

Til Dulbecco's MEM-medium inneholdende 10* føtalt bovinserum ble rhbFGF-mutein CS23 tilsatt til en konsentrasjon på 10 pg/ml. Til denne blandingen ble p<->cyklodekstrintetradeca-sulfatnatrium, tilveiebragt i referanseeksempel 4, eller<p>—l,3-glukansulfatammonium, tilveiebragt i referanseeksempel 5 til og med 8, tilsatt til en final konsentrasjon på 500 pg/ml. Dette ble etterfulgt av 24 timers inkubasjon ved 37°C. p<->1,3-glukansulfatammonium som ble anvendt hadde en polymerisasjonsgrad på 6 (svovelinnhold 13,5*), 26 (svovelinnhold 14,0*), 131 (svovelinnhold (15,4*) eller 540 (svovelinnhold 12,7*). En gruppe som ikke var supplementert med sulfatert glukan utgjorde kontrollgruppen. Tabell 12 viser gjenværende FGF-aktivitet funnet etter 24 timers inkubasjon. Nesten all FGF-aktivitet var borte i kontrollgruppen, men FGF-aktiviteten forble stabil i p<->cyklodekstrinsulfat eller p<->1,3-glukansulfatgruppen.

Eksempel 12

rhbFGF-mutein CS23, tilveiebragt i referanseeksempel 3 (980 pg/ml) og dekstransulfatnatrium med en gjennomsnittlig molekylvekt på 7500 (45 mg/ml), i et volumforhold på 1 til 1, ble blandet sammen. En 200 pl aliquot av sammensetningen ble applisert på en kolonne (0,75 x 60 cm) TSK-gel 3000SW (Tosoh, Ltd. Japan) og kolonnen ble dannet med en 0,1 M f osfatbuf feroppløsning (pH 6,0) inneholdende 0,1 M Na2SC>4. Strømningshastigheten var 1,0 ml/min. Proteinene ble registrert ved 230 nm. Blandingen ga to topper (se fig. 2): topp I (angitt med I) og topp II (angitt med II). De to toppene ble hver oppsamlet og analysert, topp I var et kompleks inneholdende rhbFGF-mutein CS23 og dekstransulfatnatrium i et l:4-forhold og topp II dekstransulfatnatrium.

Molekylvekten til komplekset ovenfor ble beregnet til omtrent 45000 ut fra flg. 2.

Eksempel 13

En stabil, injiserbar, vandig oppløsning (pH 7,4) inneholdende rhbFGF, 0,5 mg, dekstransulfatnatrium, 0,23 mg, natriumcitrat, 15 mg ble fremstilt.

Eksempel 14

En stabil, injiserbar, vandig oppløsning (pH 7,4) inneholdende rhbFGF-mutein CS23, 0,5 mg, dekstransulfatnatrium, 0,23 mg, natriumcitrat, 15 mg, ble fremstilt.

Claims (20)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av en stabilisert sammensetning omfattende (a) fibroblast-vekstfaktor (FGF) eller muteinet derav og (b) glukansulfat, karakterisert vedat man bringer FGF eller muteinet derav i kontakt med glukansulfat i et vandig medium.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at sammensetningen som anvendes omfatter et kompleks av FGF eller muteinet derav med glukansulfat.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at man anvender FGF-mutein og glukansulfat.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at FGF-muteinet er et mutein hvori minst en human basisk FGF-konstituent aminosyre erstattes med annen aminosyre.

5 . Fremgangsmåte ifølge krav 4,karakterisertved at muteinet er rhbFGF-mutein CS23, hvori cysteinene i posisjonene 70 og 88 til humant bFGF erstattes med seriner.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at glukansulfat som anvendes har et svovelinnhold på ikke mindre enn omtrent 3* (v/v).

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at glukansulfatet som anvendes har et svovelinnhold på omtrent 12 til 20* (v/v).

8. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at glukansulfatet som anvendes er dekstransulfat.

9. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at det videre omfatter di- eller tri-basisk karboksylsyre.

10. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at sammensetningen som anvendes er en farmasøytisk sammensetning som videre inneholder en farmasøytisk aksep-tabel bærer, beholder, hjelpestoff eller fortynningsmiddel.

11. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisertved at sammensetningen som anvendes er i form av injeksjon, oppløsning for injeksjon, frosset preparat eller lyofilisert preparat.

12. Fremgangsmåte ifølge krav 11,karakterisertved at sammensetningen som anvendes er i form av en injeksjon.

13. Fremgangsmåte for stabilisering av fibroblast-vekstfaktor (FGF) eller muteinet derav,karakterisertved at man bringer FGF eller muteinet derav i kontakt med glukansulfat i et vandig medium.

14. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at man bringer FGF-muteinet i kontakt med glukansulfat .

15. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at FGF-muteinet er et mutein hvori minst en human basisk FGF-konstituent aminosyre erstattes med annen aminosyre.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 15,karakterisertved at muteinet er rhbFGF-mutein CS23 hvori cysteinene i posisjonene 70 og 88 i humant bFGF erstattes med seriner.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at glukansulfatet som anvendes har et svovelinnhold som ikke er mindre enn omtrent 3* (v/v).

18. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at glukansulfatet som anvendes har et svovelinnhold på omtrent 12 til 20* (v/v).

19. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at glukansulfatet som anvendes er dekstransulfat.

20. Fremgangsmåte ifølge krav 13,karakterisertved at det videre omfatter di- eller tri-basisk karboksylsyre.