NO861302L - Rekombinant humant renin. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremstillingen av praktiske mengder sjeldne, verdifulle proteiner ved anvendelse av rekombinante teknikker. Spesielt vedrører oppfinnelsen fremstillingen av humant renin i mengder som er tilstrekkelig til å tillate anvendelse som en reagens ved diagnose og ved medisinsammensetning.

Renin er et kritisk protein i "angiotensinsystemet" som kontrollerer vasokonstriksjon/dilatering. Følgelig har forbedrede terapier for sykdoms-tilstander som er en følge av inkorrekte spenningsnivåer i vaskulærsystemet, hovedsakelig hypertensjon, vært fokusert på kontrollen av dette systemet.

Hovedtrekkene for angiotensinsystemets virkning ved blodtrykksregulering er kjente. Det vasoaktive midlet er et oktapeptid, angiotensin II, som virker direkte slik at den glatte vaskulærmuskelen trekkes sammen, og som også induserer frigjøring av aldosteron fra binyrebarken. Nivåene av angiotensin II bestemmes ved hastigheten for inaktivering ved angioten-sinaser og hastigheten for dannelse ved en totrinnsprosess fra angiotensinogen. Det hastighetsbegrensende trinnet ved omvandlingen av angiotensinogen til antiotensin II er trinnet som katalyseres av renin - dvs. omvandlingen av angiotensinogen til angiotensin I. (Det andre trinnet, omvandlingen av angiotensin I til angiotensin II bevirkes ved hjelp av "overførende enzym".) Renin utskilles in vivo i sidekarnøstene i nyren. Det syntetiseres som et proreninforstadium, som deretter bearbeides slik at den aktive reninformen oppstår.

De forskjellige trekkene ved det ovenfor nevnte angiotensinsystemet gir et antall muligheter for fremstilling av legemidler. En stor familie av legemidler, e-adrenerginhibitorer (e-blokkerere) har vært benyttet i stor grad, og er kjent for å virke, i det minste delvis, ved at de inhiberer reninsekresjonen fra sidekarnøstene i nyrene. Overførende enzyminhibitorer har vært benyttet; eksempler på overførende enzyminhibitorer innbefatter kaptopril og enalapril; stoffer som påvirker angiotensin II-virkningen direkte innbefatter saralasin, som er en konkurrerende inhibitor for angiotensin II-binding. In vitro- og in vivo-studier har vært gjennomført vedrørende direkte renininhibitorer, såsom antirenin- antistoffer og angiotensin I-analoger. Imidlertid har disse ikke resultert i tilfredsstillende, terapeutisk nyttige materialer.

Ingen av de terapiene som idag er tilgjengelige gir en tilfredsstillende løsning på problemet med hypertensjon. De stoffene som er i bruk som legemidler har uforutsigbar virksomhet, og har ofte uønskede bivirkninger på grunn av en lang rekke biologiske aktiviteter i tillegg til den ønskede. Noen kan ikke administreres oralt. Dette gjelder spesielt renininhibi-torene, hvorav noen er vist å være aktive ved nedsetting av blodtrykk hos både dyr og mennesker når de administreres intravenøst eller intramuskulært (iHaber, E., "Hypertension and the Angiotensin System: Therapeutic Approaches" (1984) Raven Press 133-145; Gagnol, J.P., et al., Abstracts International Society of Hypertension (1984) 10:376).

Renin selv er et utskilt protein som har et forstadium, en "prorenin" - form. Proteinet overføres derfor innledningsvis som "preprorenin". Humant nyrepreprorenin inneholder, fra den N-terminale enden, en 20 aminosyre-rest-signalsekvens som tapes ved utskillelse, et "pro"-segment på 46 aminosyrerester som spaltes in vivo og er utsatt for in vitro-spaltning ved trypsin, og det modne proteinet inneholder 340 aminosyrer (Imai, T., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) (1983) 807405). Prorenin eller renin utskilles sannsynligvis som glykoprotein, dette fremgår ved dets affinitet for konkanavalin A-sepharose. Modent humant nyrerenin har en molekylvekt på 37.200 dalton uten sukkerrestene, og viser en molekylvekt på ca. 40.000 i sin glykosylerte form (Yokosawa, H., et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:3498-3502).

cDNA for humant nyrerenin er fremstilt, og den fullstendige nukleotidsekvensen er bestemt (Imai, T., et al., (supra)). Denne sekvensen og den avledede proteinsekvensen er vist i figur 1. Imidlertid har ingen av renin, prorenin og preprorenin blitt fremstilt ved anvendelse av rekombinante teknikker, og det humane reninet oppnådd ved rensing har i mengde vært begrenset til det som kan isoleres fra plasma eller nyre. Et protein som har reninaktivitet fremstilt fra kjertel i underkjeven hos mus er krystallisert og foreløpige røntgendiffraksjonsdata er oppnådd; tredimensjonale modeller av det humane proteinet er foreslått ut fra analogi (Carlson, W., et al., Abstracts International Society Hypertension

(1984) 10:154). Utilstrekkelig humant reninmateriale har imidlertid vært tilgjengelig til å tillate eksperimentell bestemmelse av den tredimensjonale strukturen.

Innenfor teknikken mangler en fremgangsmåte for tilveiebringelse av praktiske mengder humant nyrerenin eller dets forstadium som er tilstrekkelig til å tilveiebringe substrat for bestemmelse av tredimensjonal struktur, og utforme egnede legemidler basert på denne strukturen. Den generelle fremgangsmåten med å basere utformingen av spesifikke vekselvirkende ligander på den romlige konfigurasjonen av det ønskede materialet har vært anvendt med hell med andre proteiner, innbefattet utformingen av ligander som er spesifikke for binding til 2,3-difosfo-glyseratsetet i humant hemoglobin (Beddell, C.R., et al., Brit. J. Pharmacol. (1976) 57:201-209; Beddell, C.R., ibid (1979) 65:535-543); anti-kreftfarmasøytika som bindes spesifikt til dihydrofolatreduktase (Hansch, C, et al., J. Med. Chem. (1982) 25:777-784); og tyroid hormonanaloger som bindes til prealbumin (Blaney, J.M., et al., J. Med. Chem. (1982) 25:785-790); og elastaseinhibitorer (Hughes, D.L., et al., J. Mol. Biol.

(1982) 162:645-658).

Relativt dårlige inhibitorer bestående av reninprosekvens er også fremstilt for muserenin og humant renin av Evin et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA (1984) 8h48 - 52; og Boger et al., Nature (1983) 303:81-84. Lokalise-ringen av den pepsinogene "pro"-sekvensen på det aktive setet av pepsin som beskrevet av James, M., et al., Nature (1986) 319:33-38, antyder imidlertid at denne relativt dårlige virkningen ville kunne overvinnes dersom det rene krystallinske proteinet var tilgjengelig i tilstrekkelig mengde til å tillate egnet studium av det aktive setet.

I tillegg er det ønskelig å oppnå store mengder renin for anvendelse som standarder ved diagnostiske analyser med sikte på reninnivåer i blod-strømmen eller andre væsker. På det nåværende tidspunkt er disse immuno-logiske analysene ikke standardiserte ved hjelp av egnede kontroll-materialer. Videre er det behov for humant renin som en reagens ved sorteringsforsøk for potensielle renininhibitorer hvor sorteringsinnret-ningene derved vil være frie for vekselvirkningsreaksjonene som opptrer ved de urene preparatene som idag er tilgjengelige.

Det ville også være ønskelig å oppnå rekombinant renin som et utskilt modent protein. Utskillingen av modent insulin fra hypofyseceller transformert med en vektor som koder for proinsulin er oppnådd ved å behandle disse cellene med en cyklisk AMP-analog som en sekretagog (Moore, H-P.H., et al., Cell (1983) 35:531-538). Oppførselen av det rekombinante insulinet utnytter derfor tilsynelatende utskillings-mekanismen som anvendes av disse cellene ved fremstillingen av ACTH og endorfin (Mains, R.E., et al., J. Biol. Chem. (1981) 89:21-28).

Som en sammenfatning må det fastslås at det idag ikke finnes noen lett tilgjengelig kilde for renset humant reninprotein, og ingen kilde for den rekombinanten formen av dette proteinet, på tross av behovet for slik tilførsel for tilveiebringelse av terapi og diagnose av hypertensjon og andre sykdommer i vaskulærsystemet.

Ved hjelp av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes renin i tilstrekkelig mengde til å oppfylle de idag erkjente behovene for dette proteinet. Tilstrekkelige mengder gjøres tilgjengelige ved rekombinante teknikker slik at egnet medisinutforming muliggjøres og det tilveiebringes tilstrekkelige mengder som diagnostiske standardsubstanser. I tilegg tilveiebringer tilgjengeligheten av rekombinante materialer og fremgangsmåter for fremstilling av dette stoffet mulighet for modifikasjon av proteinsekvensene slik at strukuren av enzymet optimaliseres for et hvilket som helst ønsket formål.

Følgelig vedrører et trekk ved oppfinnelsen rekombinant fremstilt renin og dets forstadier enten i glykosylert eller uglykosylert form. Ifølge andre trekk vedrører oppfinnelsen ekspresjonsvektorer som er egnede for fremstilling av disse proteinene, verter transformert med DNA-sekvenser som koder for disse, fremgangsmåter for fremstilling av rekombinant renin, prorenin og preprorenin, og terapeutiske materialer utformet komplementært til strukturen av det rekombinant fremstilte materialet. Ifølge et annet trekk vedrører oppfinnelsen en fremgangsmåte for effektiv utskillelse av modent renin fra kultiverte pattedyrceller. Ved nok et trekk vedrører oppfinnelsen rensefremgangsmåter for renin og prorenin, spesielt fremstilt ved rekombinant teknikk.

Figur 1 viser den fullstendige nukleotidsekvensen for preproreninkodende

DNA, sammen med den avledede aminosyresekvensen.

Figur 2 viser konstruksjonen av en ekspresjonsvektor som koder for preprorenin og som resulterer i utskillelse av prorenin fra pattedyrcellekulturer. Figur 3a og 3b viser konstruksjonen av bakterielle ekspresjonsvektorer

for renin-beslektede proteiner.

Figur 4 viser en SDS-polyakrylamidgel av proteiner immunoutfelt fra supernatanter av CHO-celler transformert med renin-kodende plasmider og dyrket i nærvær av 35S -metionin. Figur 5 viser SDS-polyakrylamidgeler av proteiner merket med<35>g_

metionin ekstrahert fra E. coli transformert med renin-kodende vektorer.

Figur 6 viser SDS-polyakrylamidgeler av proteiner merket med<35>g_

metionin fra mediet av AtT20-celler immunoutfelt med anti-renin.

Slik betegnelsen her benyttes vedrører "renin" et protein som har en aminosyresekvens som i det vesentlige tilsvarer sekvensen vist i figur 1 som det modne proteinet - dvs. 340 aminosyresekvensen begynnende ved posisjon 66. Det skal naturligvis understrekes at renin, i likhet med alle proteiner, kan være tilstede i nøytral form eller saltform, avhengig av pH i omgivelsene eller av oppløsningene hvorfra det er fremstilt. Både nøytrale former og saltformer er innbefattet i definisjonen. I tillegg kan renin, i likhet med mange proteiner, eksistere i konjugering med andre molekyler, hovedsakelig karbohydratrester - dvs. i glykosylert eller uglykosylert form. Andre "sidekjedemodifikasjoner" kan også finne sted, som f.eks. konjugering med fosfat, oksydasjon av f.eks. sulfhydrylrester, forestring av hydroksyler osv. Disse modifikasjonene er også innbefattet så lenge "reninaktiviteten", definert som evnen til å katalysere omvandlingen av angiotensinogen til angiotensin I ikke ødelegges. Endelig er det kjent at sekvensen selv kan endres i mindre omfang, f.eks. ved addisjon, utelukkelse, eller substitusjon av en eller flere aminosyrerester. Slike endrede former er også innbefattet så lenge de bevarer reninaktiviteten. Spesielt skal det understrekes at som tilfellet er for mange proteiner, kan bare en del av den modne aminosyresekvensen være påkrevet for aktivitet.

"Prorenin" og "preprorenin" er definert tilsvarende med referanse til figur 1. (De tilsvarende tallene som det refereres til i figuren er tallene under aminosyreresten og uten parenteser.) Følgelig er preproreninet representert ved hele den viste aminosyresekvensen og proreninet ved den fra rest 21 til rest 406. Den modne sekvensen er den fra rest 66 til rest 406. Det antas at den innledende 20 aminosyrepresekvensen fra rest 1 til og med 20 avspaltes når proteinet vandrer gjennom det grove endoplastiske retikulum; "pro"-sekvensen fra rest 21 til 66 er spaltbart in vitro ved å anvende et proteolytisk enzym av den egnede spesifisitet, såsom trypsin. Enzymatisk inaktivt renin, antagelig prorenin, finnes virkelig i plasma (Sealey, J.E., et al., Endocrine Rev. (1980) h365-391) og i nyren selv (Chang, J.J., et al., Hypertension (1981) 3:509-515). Det synes som om noe, men ikke alt, proreninet som finnes i humant plasma har opphav i nyren (Derkx, F.H.M., et al., Hypertension (1983) 5^244-256).

Reninaktivitet kan analyseres ved inkubering med humant angiotensinogen og måling av angiotensin I (AI) som er generert ved anvendelse av en standard immunoanalyse.

"Renset" eller "rent" refererer til materialet som er fritt for stoff som normalt ledsager stoffet slik det foreligger i naturlig tilstand. Følgelig refererer "rent" renin f.eks. til renin som ikke inneholder materialer det normalt er forbundet med i in situ-omgivelsene i humant plasma eller nyrer. Naturligvis kan "rent" renin innbefatte materialer spesifikt knyttet til stoffet, som f.eks. dets glykosidrester.

"Operabelt forbundet" refererer til en sideposisjon hvori komponentene har en slik konfigurasjon at de utøver sin vanlige funksjon. Følgelig er kontrollsekvenser eller promotorer som er operabelt forbundet til en kodende sekvens i stand til å bevirke ekspresjonen av den kodende sekvensen.

"Kontrollsekvens" refererer til en DNA-sekvens eller sekvenser som, når de er egnet forbundet til en ønsket kodende sekvens, er i stand til å bevirke dens ekspresjon i verter som er kompatible med slike sekvenser. Slike kontrollsekvenser innbefatter promotorer i både prokaryotiske og

eukaryotiske verter, og, innbefatter i prokaryotiske organismer også ribosome bindingssetesekvenser og i eukaryoter, terminale signaler. Ytterligere faktorer som er påkrevde eller nyttige for å bevirke ekspresjon kan også identifiseres. Slik betegnelsen her er benyttet, refererer "kontrollsekvenser" ganske enkelt til en hvilken som helst DNA-sekvens som er påkrevet for å bevirke ekspresjon i den spesielle verten som benyttes.

"Ekspresjonssystem" refererer til en DNA-sekvens som inneholder DNA som koder for et ønsket produkt som er operabelt forbundet med en hvilken som helst kontrollsekvens som kan være påkrevet for å bevirke ekspresjon av den kodende sekvensen.

"Celler" eller "cellekulturer" eller "rekombinante vertsceller" eller "vertsceller" benyttes ofte om hverandre som det vil fremgå fra det følgende. Disse betegnelsene innbefatter den aktuelle cellen og naturligvis etterkommeren av denne. Det skal understrekes at ikke alle etterkommere er nøyaktig identiske med den opphavelige cellen, på grunn av tilfeldige mutasjoner eller forskjeller i omgivelsene. Imidlertid er slike endrede etterkommere innbefattet i disse betegnelsene, så lenge som etterkommeren bevarer de egenskapene som er relevante med egenskapene for den opprinnelig transformerte cellen.

Generelt er oppfinnelsen rettet mot fremstillingen av rensede former av renin (eller prorenin) i praktiske mengder og fritt for forurensninger som ledsager slike proteiner i naturlige omgivelser. Rekombinante teknikker gir en ideell fremgangsmåte for å nå dette målet. DNA-sekvensene som koder for det ønskede rening eller proreninproduktet kan ligeres inn i egnede vektorer og eksprimeres i enten prokaryotiske eller eukaryotiske verter, derved tilveiebringes en tilnærmet ubegrenset kilde for disse proteinene. Presekvensen kan også med fordel benyttes, spesielt i eukaryoter, for å bevirke sekresjon av det ønskede produktet. Sekresjon er naturligvis ønskelig, idet det tillater et enkelt og ukomplisert første rensetrinn bestående av at cellene fjernes fra kulturmediet. Antallet proteiner som utskilles av de fleste rekombinante vertsceller er begrenset, slik at nivået av innledende forurensning vil være betydelig lavere for utskilte proteiner.

Utskilt protein fra samlinger av pattedyrceller, f.eks. CHO-celler bør inkuberes med eller uten trypsin for å analysere for reninaktivitet, idet CHO-celler utskiller renin tilnærmet utelukkende i den inaktive pro-f ormen og trypsin omvandler prorenin til renin. Reninaktivitet i supernatanter fra CHO-celler kan forøkes 25 ganger ved behandling av det utskilte proteinet med trypsin før analyse. En rekke verts- og kontrollsystemer er tilgjengelige; det foretrukne kontrollsystemet anvender metallotionein-promotoren. Kultivering av disse cellene inneholdende preproreninsekvenser under kontroll av metallotionein-promotoren i nærvær av 2-7,5 x 10"^ M ZnS04øker reninutskillelsen med en faktor 2-3. Innfatning av 10-^ M deksametason i kulturen resulterer også i en ytterligere 3-5 gangers økning i reninfremstillingen. Sekresjon av prorenin- og reninproduktene i serumfritt medium ved anvendelse av dette systemet er også mulig i nærvær av en induksjonsaktivator såsom jern.

Ved fremstilling i pattedyrceller som benytter den regulerte sekresjonsveien (i motsetning til den konstitutive veien - for en oversikt se Kelly,

, et al., Science (198 ) 230:25-32) stimulerer sekresjonen av modent protein, fremfor prorenin, ved anvendelse av et sekretagog. F.eks. i illustrasjonen nedenfor er det funnet at et slikt sekretagog, en cyklisk AMP analog, er i stand til å bevirke sekresjon av renin i moden form fra en hypofysecellelinje transformert med et ekspresjonssystem for preprorenin. Det antas at det modne rekombinante reninet, på samme måte som andre modne hormoner som normalt utskilles fra disse cellene, lagres i sekresjonskorn som viser respons på sekretagog ved å hemme innholdet inn i kultursupernatanten.

Oppfinnelsen innbefatter en fremgangsmåte for å bevirke sekresjon av modent renin fra egnet transformerte celler med opphav i vev som anvender den regulerte sekresjonsveien, som vev fra endokrine og eksokrine kjertler, f.eks. hypotalamus, biskjoldbruskkjertel, hjertekammer osv., eller neuroner, basofile celler, og plater. For å bevirke sekresjon, etter at fremstillingen av de rekombinante reninet har vært opprettholdt i et betydelig tidsrom, behandles cellene med et sekretagog for å frigjøre den modne formen. Sekretagoger er generelt kjente og innbefatter cykliske AMp-analoger, kalsiumionoforer, og norepinefrin. Disse forbin- deisene tilføres i en mengde som er effektiv for å oppnå frigjøring, avhengig av sekretagoget som anvendes.

En hvilken som helst av cDNA-sekvensen, den genomiske sekvensen, og hybrider derav, kan eksprimeres avhengig av naturen av den rekombinante verten og kontrollsystemene som benyttes. I illustrasjonen nedenfor fremstilles cDNA fra nyrecelle mRNA og undersøkes med den egnede genomiske sekvensen. cDNA er også fremstilt av Murakami (se Imai (supra)). Imidlertid er vertsceller fra pattedyr f.eks. i stand til å eksprimere intronholdige genomiske sekvenser, og å danne egnet opp-spaltet mRNA.

Rensefremgangsmåter for oppnåelse av den modne eller pro-formen av renin fra rekombinante kulturer er også beskrevet. For renin innbefatter fremgangsmåten hydrofob vekselvirkningskromatografi (HIC), pepstatinkromatografi og anionutveksling. For prorenin er HIC utilstrekkelig idet omvandling til det modne proteinet finner sted. Derfor fremstilles prorenin ved trinnvis anvendelse av pepstatinkromatografi, størrelses-utelukkelse, og anionutveksling.

For renin behandles en kultursupernatant for å fjerne celleavfall, og påføres deretter på en hydrofob kolonne, såsom "Phenyl 5PW" i saltoppløs-ning, og elueres deretter med en avtakende saltgradient i pH 8-buffer. Et antall egnede adsorpsjonsmidler er kommersielt tilgjengelige, f.eks. "Synchropak Propyl" (Synchrom, Linden, IN) og "Phenyl Superose"

(Pharmacia). Fraksjonene som inneholder prorenin (eller renin) utvinnes, behandles med trypsin (f.eks. knyttet til "Sepharose"-perler) og påføres deretter på en pepstatinkolonne. Pepstatin er en inhibitor som er i stand til å binde renin og aktivert prorenin effektivt; dette er hovedsakelig et affinitetstrinn. Et antall bærere kan benyttes for å anvende pepstatinet. Reninet elueres med fortynnet syre, og underkastes deretter anion-utvekslingskromatografi ved ca. pH 7; det oppnås i ren form i det gjennomstrømmede volumet. En hvilken som helst egnet anionveksler-harpiks kan benyttes, såsom DEAE eller en annen ioneveksler, hvorav mange er kommersielt tilgjengelige. Som eksempler kan nevnes Beckman SAX Ultrasil" og "Synchrom AX300".

For prorenin tilføres den klargjorte kultursupernatanten på pepstatinkolonnen, som elueres med syre som ovenfor og de proreninholdige fraksjonene underkastes størrelsesutelukkelses-HPLC ved å anvende f.eks. "TSK 4000 SW" eller en sammenliknbar gel som er i stand til å utelukke forurensninger med både høy og lav molekylvekt, som f.eks. "Toyo Soda u-Spherogel TSK" eller "Beckman Biosil 250", og deretter anionveksles slik at man oppnår proreninet i gjennomstrømningsvolumet på samme måte som ovenfor.

Ønskeligheten for oppnåelse av rent rekombinant humant renin og prorenin har flere grunner. For det første kan mg-mengder av materialet oppnås ved å anvende denne fremgangsmåten. Mg-mengder er i stand til krystallisasjon slik at tredimensjonale studier ved anvendelse av røntgen-diffraksjonsanalyse og datamaskinanalyse muliggjøres. Dette tillater slutninger vedrørende formen av molekylet, derved defineres egnede former for stoffer som kan anvendes som inhibitorer for enzymaktivi-teten som normalt vises av renin. Inhibitorer er allerede angitt for "overførende enzym", katalysatoren for den etterfølgende omvandlingen av angiotensin I til angiotensin II. Generelt har disse antagonistene vært "dipeptider" hvis vekselvirkninger med overførende enzym stabiliseres ved modifikasjon av "restene" som deltar i peptidbindingen slik at "dipeptidets" evne til å vekselvirke spesifikt med det overførende enzymet økes. Følgelig sammenføyer peptidbindingen spesifikt valgte karboksylsyrer og aminer (ikke nødvendigvis aminosyrer). Disse "dipeptidene" har konfigurasjon som en tredimensjonal rekke slik at de er komplementære med konturene av det ønskede målet, overførende enzym. Et tilsvarende romlig arrangement i form av lås-nøkkel vil oppstå ved molekyler som er komplementære med overflatekonturene av det krystalliserte reninet ifølge oppfinnelsen. Det skal bemerkes at "overflate" innbefatter vindinger som vender innover, og innbefatter spesifikt det aktive setet. Videre betyr "komplementært" at i tillegg til de romlige strukturene som "passer", er vekselvirkninger mellom proteinet og molekylet som stemmer overens med dets overflatekonturer attraktive og positive. Disse vekselvirkningene kan være hydrogenbinding, ionisk- eller hydrofob affinitet.

Følgelig vedrører oppfinnelsen analoge stabiliserte peptidantagonister (2-15 aminosyrer) til renin som er kjennetegnet ved tredimensjonale konturer som er komplementære med de tredimensjonale konturene av overflaten av rekombinant renin (eller prorenin). Med peptid menes i denne sammenheng at antagonisten inneholder karboksylsyreamidbindinger svarende til en mindre enn antallet rester. Karboksylsyre- og amin-bestanddelene må ikke nødvendigvis være a-aminosyrer. En spesielt foretrukket kilde for peptidene er aminosyresekvensen av "pro"-delen av prorenin.

For det andre har humant renin en ekskvisitt, spesifikk enzymatisk aktivitet som imidlertid er betydelig forskjellig fra aktiviteten for ikke-primat renin. Humant renin spalter Leu-Val-bindingen i humant angiotensinogen, og Leu-Leu-bindingen i ikke-primat angiotensinogener. Ingen andre kjente substrater eksisterer. Ikke-primate reniner, f.eks. renin fra underkjevekjertel hos mus, spalter ikke humant angiotensinogen. Følgelig har humant renin en unik spesifisitet som atskiller seg fra den for ikke-primat renin.

For det tredje er, selv uten hjelp av en tredimensjonal strukturbestem-melse, renset renin ifølge oppfinnelsen av betydning som en reagens ved sortering av renin-inhibitorer in vitro som en ad hoc fremgangsmåte for bedømmelse. Urene reninpreparater som nå er tilgjengelige gir forvirrende resultater på grunn av virkningen av forurensningene på forsøksresul-tatene. F.eks. vil forurensninger som viser seg selv å være inhibitorer, aktivatorer, eller substrater for renin påvirke bedømmelsen. Følgelig vil en betydelig forbedring i de nåværende sorteringsteknikkene for renin-inhibitorer bevirkes ved tilgjengeligheten av det rensede humane reninproteinet.

Fordi tilgjengeligheten av materialer for rekombinant fremstilling av et protein tillater sekvensmodifisering, f.eks. ved sete-spesifikk mutagenese, er i tillegg modifikasjon av egenskapene for produktproteinet, som f.eks. dets substrat spesifisitet mulig. Derfor tilveiebringer de rekombinante vektorene ifølge oppfinnelsen utgangsmaterialer som gjør det mulig å oppnå en serie aktiveringsproteaser for et spektrum av omvandlinger.

Endelig er det rekombinante reninet ifølge oppfinnelsen også nyttig ved tilveiebringelse av en spesifikk og følsom diagnostisk analyse for humant renin i biologiske prøver. Det foreligger på det nåværende tidspunkt ingen kommersielt tilgjengelig direkte immunoanalyse for renin i blodstrømmen, selv om immunoanalyser har vært benyttet innen forskning. Kjennskap til renin eller prorenin-nivåene er av stor betydning for fastleggelse av egnede terapier (Laragh, J.H., "Hypertension and the Angiotensin System: Therapeutic Approaches" (1984) Raven Press side 46-69). De kliniske analysene som nå benyttes er basert på renin-aktivitet, dvs. de er enzymanalyser, og er forbundet med betydelige feil. For å tilveiebringe en direkte immunoanalysefremgangsmåte for klinisk anvendelse, som nå er tilgjengelig bare innenfor forskning, vil det være påkrevet å tilveiebringe egnede standarder av renset humant renin (Menard, J., et al., Abstracts International Society Hypertension (1984) 10:152; Ojihara, T., et al., (ibid) (1984) 10:47; Galen, F.X., et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. (1979) 48:1041-1043). Tilgjengeligheten av renset rekombinant prorenin og renin vil tilveiebringe dette materialet for standardisering og kalibrering, både for den direkte immunoanalysen og fordi nåværende anvendte renin-aktivitetsanalysene. Nivået av prorenin eller renin i blodstrømmen kan følgelig benyttes både som en innledende diagnose for å vurdere sykdom-men, og også som et overvåkningssystem for å registrere effektiviteten av en terapeutisk behandling.

De fleste av de teknikkene som benyttes for å transformere celler, konstruere vektorer, ekstrahere budskaps-RNA, fremstille cDNA-forråd og liknende er hyppig anvendt innen teknikken, og de fleste fagmenn er kjent med de standardkildematerialer som beskriver de spesifikke betingelsene og fremgangsmåtene. Imidlertid vil de følgende avsnittene tjene som en rettesnor.

Verter og kontrollsekvenser

Både prokaryotiske og eukaryotiske systemer kan benyttes for å eksprimere de renin-kodende sekvensene; prokaryotiske verter er naturligvis mest hensiktsmessige for klonefremgangsmåter. Prokaryoter representeres vanligvis ved forskjellige stammer av E. coli; imidlertid kan andre mikrobielle stammer også benyttes. Plasmidvektorer som inneholder replikasjonsseter og kontrollsekvenser avledet fra et spesies som er kompatibelt med verten benyttes; f.eks. transformeres E. coli typisk ved anvendelse av derivater av pBR322, et plasmid avledet fra et E. coli- spesies av Bolivar et al., Gene (1977) 2:95. pBR322 inneholder gener for ampicillin- og tetracyklinresistens, og tilveiebringer derved ekstra markører som enten kan beholdes eller ødelegges ved konstruksjon av den ønskede vektoren. Vanlig anvendt prokaryotiske kontrollsekvenser som her er definert inneholdende promotorer for transkripsjonsinitiering, eventuelt med en operator, sammen med ribosombindingssetesekvenser, innbefatter slike vanlige anvendte promotorer som3-laktamase (penicilli-nase) og laktose (lac) promotorsystemer (Chang, et al., Nature (1977) 198:1056 og tryptofan (trp) promotorsystemet (Goeddel, et al., Nucleic Acids Res. (1980) 8:4057) og den X-avledede PL-promotoren og N-gen-ribosombindingssete (Shimatake, et al., Nature (1981) 292:128).

I tillegg til bakterier kan eukaryotiske mikrober, såsom gjær, også benyttes som verter. Laboratoriestammer av Saccharomyces cerevisiae, bakergjær, er mest anvendt selv om et antall andre stammer er vanlig tilgjengelige. Vektorer som anvender f.eks. 2 u opphavet for replikering ifølge Broach, J.R., Meth. Enz. (1983) 101:307, eller andre gjær kompatible opphav for replikering (se f.eks. Stinchcomb et al., Nature (1979) 282:39, Tschempe et al., Gene (1980) Hhl57 og Clarke, L. et al., Meth. Enz.

(1983) 101:300) kan benyttes. Kontrollsekvenser for gjærvektorer innbefatter promotorer for syntesen av glykolytiske enzymer (Hess et al., J. Adv. Enzyme Req. (1968), 7:149; Holland et al., Biochemistry (1978) 17:4900). Andre kjente promotorer innbefatter promotoren for 3-fosfogly-serat kinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem. (1980) 255:2073), og promotorene for andre glykolytiske enzymer. Andre promotorer, som har den ekstra fordelen med transkripsjon kontrollert ved vekstbetingelser er promotorområdene for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, nedbrytbare enzymer forbundet med nitrogenmetabolisme, og enzymer som er ansvarlige for maltose- og galaktose-utnyttelse. Det antas også at terminatorsekvenser er ønskelig ved 3'-enden av de kodende sekvenser. Slike terminatorer finnes i det 3'-utranslaterte området som følger etter de kodende sekvensene i gjær-avledede gener.

Det er naturligvis også mulig å eksprimere gener som koder for polypep-tider i eukaryotiske vertscellekulturer avledet fra flercellede organismer. Se f.eks. Axel et al., 4.399.216. Disse systemene har den ekstra fordelen at de er i stand til å spalte av introner og kan følgelig benyttes direkte til å eksprimere genomiske fragmenter. Nyttige vertscellelinjer innbefatter VERO og HeLa-celler, og ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO-celler). Ekspresjonsvektorer for slike celler innbefatter vanligvis promotorer og kontrollsekvenser som er kompatible med pattedyrceller som f.eks. de vanlige anvendte tidlige og sene promotorene for Simian virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature (1978) 273:113) eller andre virus-promotorer som de avledet fra polyoma, Adenovirus 2, bovint papiloma-virus, eller avian sarcoma-viruser. Den kontrollerbare promotoren hMTII (Karin, M., et al., Nature (1982) 299:797-802) kan også benyttes. Generelle trekk vedrørende transformasjoner av pattedyrcelle-vertssystemer er beskrevet av Axel (supra). Det fremgår nå at også "forøker"-områder er viktige ved optimalisering av ekspresjon; disse er generelt sekvenser som finnes ovenfor eller nedenfor promotorområdet i ikke-kodende DNA-områder. Opphavet for replikering kan om nødvendig oppnås fra viruskilder. Imidlertid er integrering i kromosomet en vanlig mekanisme for DNA-replikering i eukaryoter.

Transformasjoner

Avhengig av vertscellen som benyttes, utføres transformasjonen ved standard teknikker som er egnede for slike celler. Kalsiumbehandling ved anvendelse av kalsiumklorid, som beskrevet av Cohen, S.N., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) (1972) 69:2110, eller RbC^-fremgangsmåten beskrevet av Maniatis, et al., "Molecular Cloning: A Laboraratory Manual" (1982), Cold Spring Harbor Press, s. 254 kan benyttes for prokaryoter eller andre celler som inneholder betydelige celleveggbarrierer. For pattedyrceller uten slike cellevegger kan kalsiumfosfat-utfellingsmetoden ifølge Graham og van der Eb, Virology (1978) 52:546, eventuelt som modifisert av Wigler, M., et al., Cell (1979) 16:777-785 benyttes. Transformasjoner i gjær kan utføres ved fremgangsmåten ifølge Van Solingen, P., et al., J. Bact. (1977) 130:946 eller ifølge Hsiao, C.L., et al., Proe. Nati. Acad. Sei.

(USA) (1979) 76:3829.

Vektorkonstruksjon

Konstruksjon av egnede vektorer som inneholder de ønskede kodene og kontrollsekvensene anvender standard ligerings- og restriksjonsteknikker som er velkjente innen teknikkens stand. Isolerte plasmider, DNA- sekvenser, eller syntetiserte oligonukleotider spaltes, tilpasses og religeres i den ønskede formen.

DNA-sekvensene som danner vektorene er tilgjengelige fra en rekke kilder. Ryggradsvektorer og kontrollsystemer finnes generelt på tilgjengelige "verts"-vektorer som benyttes for hoveddelen av sekvensene ved konstruksjonen. Typiske sekvenser er angitt ovenfor. For den relevante kodende sekvensen kan den innledende konstruksjonen være, og er vanligvis, et spørsmål om å tilbakevinne de egnede sekvensene fra cDNA eller genome DNA-samlinger. Når sekvensen er beskrevet, er det imidlertid mulig å syntetisere hele genesekvensen in vitro med utgangspunkt i de individuelle nukleosidderivatene. Hele genesekvensen for gener av klebbare lengder, f.eks. 500-1000 bp kan fremstilles ved å syntetisere individuelle, overlappende, komplementære oligonukleotider og fylle inn enkeltkjedede ikke-overlappende deler ved å anvende DNA-polymerase i nærvær av deoksyribonukleotidtrifosfater. Denne fremgangsmåten har vært benyttet med hell ved konstruksjon av flere gener av kjente sekvenser. Se f.eks. Egde, M.D., Nature (1981) 292:756; Nambair, K.P., et al., Science

(1984) 223:1299; Jay, Ernest, J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Syntetiske oligonukleotider fremstilles ved fremgangsmåten ifølge Efimov, V.A., et al., (Nucleic Acids Res. (1982) 6875-6894), og kan fremstilles ved å anvende kommersielt tilgjengelige automatiserte oligonukleotid-syntetiseringsinnretninger. Kinase av enkeltkjeder før rekombinasjon eller for merking oppnås ved å anvende et overskudd, f.eks. ca. 10 enheter polynukleotidkinase til 1 nmol substrat i nærvær av 50 raM tris, pH 7,6, 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 1-2 mM ATP, 1,7 pmole -y32P-ATP (2,9 mCi/mmol), 0,1 mM spermidin, 0,1 mM EDTA.

Når komponentene av de ønskede vektorene følgelig er tilgjengelige, kan de skjæres opp og ligeres ved å anvende standard restriksjons- og ligeringsfremgangsmåter.

Sete spesifikk DNA-spaltning utføres ved å behandle med det egnede restriksjonsenzymet (eller -enzymene) under betingelser som generelt er kjente innen teknikken, og hvor detaljene ved fremgangsmåten er angitt av fabrikantene av disse kommersielt tilgjengelige restriksjonsenzymene. Se f.eks. produktkataloger fra New England Biolabs. Generelt spaltes ca. 1 ug plasmid eller DNA-sekvens ved hjelp av en enhet av enzym i ca. 20 ul bufferoppløsning; i eksemplene som følger anvendes typisk et overskudd av restriksjonsenzym for å sikre fullstendig nedbrytning av DNA-sub-stratet. Inkuberingstider på ca. en time til to timer ved ca. 37"C er brukbare, selv om variasjoner kan tolereres. Etter hver inkubering fjernes protein ved ekstraksjon med fenol/kloroform, og kan etterfølges av eterekstraksjon, og nukleinsyren utvinnes fra de vandige fraksjonene ved utfelling med etanol. Om ønsket kan størrelsesseparasjon av de spaltede fragmentene utføres ved hjelp av polyakrylamidgel eller agarose-gel elektroforese ved å anvende standard teknikker. En generell be-skrivelse av størrelsesseparasjoner finnes i Methods in Enzymology (1980) 65:499-560.

Restriksjonsspaltede fragmenter kan være buttendet ved behandling med det store fragmentet av E. coli DNA-polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire deoksynukleotidtrifosfåtene (dNTPs) ved å anvende inkuberingstider på ca. 15-25 minutter ved 20-25° C i 50 mM tris pH 7,6, 50 mM NaCl, 6 mM MgCl2, 6 mM DTT og 5-10 uM dNTPs. Klenow-fragmentet fyller inn ved 5'-klebrige ender, men bryter tilbake fremtredende 3'-enkeltkjeder, selv om de fire dNTP'ene er tilstede. Om ønsket, kan selektiv gjenoppbygning utføres ved å tilføre bare den ene av, eller valgte, dNTPs innenfor de begrensningene som ligger i naturen av de klebrige endene. Etter behandling med Klenow ektraheres blandingen med fenol/kloroform og etanol-utfelles. Behandling med egnede betingelser med Sl nuklease eller Bal-31 resulterer i hydrolyse av eventuell enk elt - kjedet del.

Ligeringer utføres i 15-50 ul volumer under følgende standard betingelser og temperaturer: f.eks. 20 mM tris-Cl pH 7,5, 10 mM MgC^, 10 mM DTT, 33 ug/ml BSA, 10 mM 50 mM NaCl, og enten 40 uM ATP, 0,01-0,02 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 0°C (for ligering av "klebrige ender") eller 1 mM ATP, 0,3-0,6 (Weiss) enheter T4 DNA-ligase ved 14 °C (for ligering av "butte ender"). Intermolekylære ligeringer av "klebrige ender" utføres vanligvis ved 33-100 ug/ml totale DNA-konsentrasjoner (5-100 nM total sluttkonsentrasjon). Intermolekylære ligeringer av butte ender utføres ved en total sluttkonsentrasjon på 1 uM.

Ved vektorkonstruksjon under anvendelse av "vektor fragmenter", behandles vektor fragmentet vanligvis med bakteriell alkalisk fosfatase (BAP) eller kalvetarm alkalisk fosfatase (CIP) for å fjerne 5'-fosfatet og forhindre religering av vektoren. Nedbrytninger gjennomføres ved pH 8 i ca. 150 mM tris, i nærvær av Na<+>og Mg<+2>ved anvendelse av 1 enhet BAP eller CIP pr. ug vektor ved 60"C i ca. en time. For å utvinne nukleinsyrefragmentene ekstraheres preparatet med fenol/kloroform og etanol-utfelles. Alternativt kan religering forhindres i vektorer som er dobbeltnedbrutt ved ekstra restriksjonsenzymnedbrytning og separasjon av de uønskede fragmentene.

For porsjoner av vektorer avledet fra cDNA eller genomisk DNA som krever sekvensmodifiseringer kan sete spesifikk primerrettet mutagenese anvendes. Denne gjennomføres ved å anvende et primer syntetisk oligo-nukleotid som er komplementært med et enkeltkjedet fag DNA som skal mutageneres bortsett fra begrenset mistilpasning, representerende den ønskede mutasjonen. Kort sagt, benyttes det syntetiske oligonukleotidet som en primer for å rette syntesen av en kjedekomplementær til fagen, og den resulterende dobbeltkjedede DNA transformeres til et fag-bærende vertsbakterium. Kulturer av de transformerte bakteriene belegges i toppagar, slik at det tillates platedannelse av enkeltceller som inneholder fagen.

Teoretisk vil 50% av de nye platene inneholde fagen som har, som en enkelt kjede, den muterte formen; 50% vil ha den opprinnelige sekvensen. De resulterende platene hybridiseres med kinasert syntetisk primer ved en temperatur som tillater hybridisering av en eksakt tilpasning, men hvorved mistilpasninger med den opprinnelige kjeden er tilstrekkelig til å forhindre hybridisering. Plater som hybridiserer med proben uttas deretter, kultiveres, og DNA'en utvinnes.

Bekreftselse av konstruksjon

Ved konstruksjonene angitt nedenfor, bekreftes korrekte ligeringer for plasmidkonstruksjonen ved først å transformere E. coli-stammen MC1061 oppnådd fra dr. M. Casadaban (Casadaban, M., et al., J. Mol. Biol. (1980) 138:179-207) eller en annet egnet vert med ligeringsblandingen. Egnede transformasjonsmidler velges på grunnlag av ampicillin-, tetracyklin- eller annen antibiotikaresistens eller ved anvendelse av andre markeringer avhengig av modus for plasmidkonstruksjon, som er kjent innenfor teknikkens stand. Plasmider fra transformasjonsmidlene fremstilles deretter ved fremgangsmåten ifølge Clewell, D.B., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) (1969) 62:1159, eventuelt etter kloramfenicol-forsterkning (Clewell, D.B., J. Bacteriol (1972) 110:667). Isolert DNA analyseres ved restriksjon og/eller sekvenseres ved dideoksy-fremgangsmåten ifølge Sanger, F., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) (1977) 74j5463 som videre beskrevet av Messing, et al., Nucleic Acids Res. (1981) 9:309, eller ved fremgangsmåten ifølge Maxam, et al., Methods in Enzymology (1980) 65:499.

Vertsstammer som benyttes ved kloning og ekspresjon ved foreliggende oppfinnelse er som følger: For kloning og sekvensering, og for ekspresjon av konstruksjon under kontroll av de fleste bakteriepromotorer ble det benyttet E. coli-stamme MC1061.

Cellene som ble benyttet for pattedyrekspresjon er ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) eller en human hypofysecellelinje betegnet AtT-20.

Eksemplene som følger skal illustrere, men ikke begrense, foreliggende oppfinnelse. Det DNA-kodende preproreninet og dets bearbeidede produkter oppnås ved å probe en cDNA-samling konstruert fra nyrecelle-mRNA. Imidlertid vil det ikke være påkrevet å gjenta denne fremgangsmåten idet sekvensen nå er kjent, og celler inneholdende en vektor som inneholder den fullstendige kodende sekvensen for humant prorenin som følger etter en modifisert human signalsekvens er deponert ved American Type Culture Collection. CBI-2B5, inneholdende pPP14 ble deponert ved ATCC 26. mars 1985 og har aksesjonsnummer CRL 8758. Fremgangsmåter for å oppnå hele genesekvenser, når først den ønskede sekvensen er kjent, er nå tilgjengelig. Se f.eks. Edge, M.D., et al., Nature (1981) 292:756; Nambiar, K.P., et al., Science (1984) 223:1299 eller Jay, E., et al., J. Biol. Chem. (1984) 259:6311.

Eksempel 1

Fremstilling av den preproreninkodende sekvensen.

En cDNA-samling ble fremstilt fra oligo dT primerbehandlet polyA<+>RNA, renset fra nyren fra et menneskelig ulykkesoffer. cDNA-samlingen ble konstruert i bakteriofagvektoren XgtlO og undersøkt med egnede fragmenter av Charon-4 humant renin genomiske kloner som er oppnådd fra en human genomisk samling ved undersøkelse med reninet cDNA-fragmenter fra underkjevekjertelen hos mus. Samlingen ble fremstilt ved standard fremgangsmåter slik at man oppnådde dobbeltkjedet cDNA fra mRNA, det ble dannet butte ender på cDNA med DNA-polymerase I (Klenow), tilsatt av kommersielt tilgjengelige EcoRI-forbindingsledd, avspaltning med EcoRI, og ligering av fragmentene i EcoRI-nedbrutteXgtlO-vektorer. To positivt responderende cDNA-kloner sammen, viste seg, når de ble oppdelt ved å anvende dideoksyfremgangsmåten ifølge Sanger (supra), å inneholde hele den reninkodende sekvensen og det 3'-merket utranslaterte området bortsett fra manglende 7 basepar ved 5'-enden av signalsekvensen. De to klonene innbefatter 1211 bp av kodende område, etterfulgt av hele det 3' 198 bp utranslaterte området, i sin tur etterfulgt av en polyA-hale. Tildelingen av sekvensen til de egnede preproreninkodonene og avlesningsrammen ble utført ved sammenlikning med den publiserte sekvensen ifølge Imai, et al., (supra). To klonede fragmenter resulterer på grunn av det unike EcoRI-setet ved posisjon 762 som vist i figur 1.

(Det er videre vist, ved undersøkelse av den humane genomiske samlingen at den genomiske strukturen er kompleks, og inneholder 10 kodende eksoner. Genomiske kloner ble ikke benyttet i konstruksjonene nedenfor.)

cDNA-sekvensene som koder for preproreninproteinet ble overført i pUC9 som de to EcoRI-innskuddene for å oppnå de klonede vektorene pHRl og pHR2. pHRl inneholder 5'-delen og pHR2 inneholder 3'-delen. pHRl inneholder 5'-delen og pHR2 inneholder 3'-delen. pHRl og pHR2 ble fremstilt ved å kutte cDNA fra XgtlO ved å anvende EcoRI og ligere hvert av de resulterende fragmentene inn i EcoRI-spaltet pUC9.

Eksempel 2

Konstruksjon av en pattedyrekspresjonsvektor for preprorenin. Konstruksjonen av pPP14, en ekspresjonsvektor for preprorenin kompatibel med pattedyrverter og som har de kodende sekvensene under kontrollen av den humane metallotionein-II (hMT-II) promotoren er vist i figur 2. For å konstruere pPP14 ble pMT.PRO benyttet som en vert-ekspresjoonsvektor. pMT.PRO likner pHSl, beskrevet i US søknad nr. 701.296, inngitt 13. februar 1985, og pMT401, beskrevet i US patent-søknadene nr. 616.488 og 622.639, inngitt henholdsvis 1. juni 1984 og 20. juni 1984. Alle de foregående US patentsøknadene er overdratt til den samme kilde som foreliggende søknad, og er innbefattet heri som referanser.

Både pHSl og pMT401-plasmidene inneholder 840 bp av hMT-II-sekvensen fra p84H (Karin, M., et al., Nature (1982) 299:297-802) som strekker seg fra Hindlll-setet ved posisjon -765 av hMT-II-genet til basen +70. pMT.PRO inneholder et tilsvarende hMT-II-fragment som imidlertid videre innbefatter ATG-startkodonet når det ligeres inn i pUC8. Alle tre vektorer oppnås ved ligering av de egnede pMT-II-sekvensene inn i pUC8 (Vieira, J., et al., Gene (1982) 19:259-268). For å konstruere pMT.PRO ble hMT-II-sekvensen skåret fra pMTII-BPV (Karin, M., et al., Proe. Nati. Acad. Sei. (USA) (1983) 80:4040-4044) som et Hindlll/Hindlll-fragment som deretter ble nedbrutt med BamHI slik at man fikk promotoren og 5'-transkripsjonsdelen. Hindlll/BamHI-fragmentet inneholdende hMT-II-sekvensene ble deretter innført i Hindlll/BamHI-nedbrutt pUC8 for å oppnå pMT.PRO.

For å konstruere pPP14 ble pMT.PRO nedbrutt med BamHI, innfylt ved anvendelse av DNA-polymerase (Klenow) i nærvær av de fire dNTP'ene, og deretter nedbrutt med EcoRI. EcoRI skjærer like nedenfor det unike BamHI-setet som følger ATG-startkodonet. 5'-delen av preproreningenet ble skåret fra pHRl ved hjelp av EcoRI-nedbrytning, og ligert under betingelser med klebrige ender til EcoRI-halen av den åpnede pMT.PRO-vektoren. Ca. 50% av innskuddene vil være i korrekt orientering. Ligeringsblandingen ble deretter behandlet med DNA-polymerase I (Klenow) i nærvær av de fire dNTP'ene, for å gjøre det gjenværende EcoRI-setet butt. Endelig ble vektoren igjen sendt rundt ved ligering, og blandingen transformert i E. coli MC1061 til Amp^. Kolonier inneholdende den korrekte konstruksjonen, med 5'-delen av de preproreninkodende sekvensene i leseramme med ATG tilveiebrakt ved hMT-II-promotorområdet og 5'-transkriptet, ble utplukket og kultivert. Konstruksjon av det mellomliggende plasmidet ble bekreftet ved restriksjonsanalyse og sekvensering.

Det resulterende mellomliggende plasmidet synes ute av stand til å akseptere den EcoRI-utkuttede 3'-delen oppnådd fra pHR-2 i den korrekte orienteringen. Dette problemet ble overvunnet ved å erstatte ryggradsvektoren for mellomproduktet, som var avledet fra pUCS, med de tilsvarende sekvensene fra pUC9. For å gjøre dette ble mellom vektor en behandlet med Hindlll og EcoRI, og fragmentet inneholdende hMT-II promotor/preprorenin 5'-delen innført i Hindlll/EcoRI nedbrutt pUC9. Det resulterende modifiserte mellomproduket ble deretter nedbrutt med ERcoRI og ligert med EcoRI/EcoRI-fragmentet isolert fra pHR2 for å generere pPP14, som inneholder hele den preproreninkodende sekvensen.

Siden grenseområdet mellom ATG-startkodonet av pMT.PRO og den 5'-terminale delen av de preproreninkodende sekvensene ble sammenføyet ved ligering med butte ender etter reparasjon av henholdsvis BamHI og EcoRI-spaltede seter, er sekvensen i grenseområdet

5'-C CATGGATCAATTCCGATGG, derved plasseres det understrekede ATG-startkodonet vist i leserammen med resten av den kodende sekvensen. Overstrekningen indikerer grenseområdet for innfylte BamHI og EcoRI-~seter. Følgelig er den kodende sekvensen for N-terminalen av pre-proteinet av signalsekvensen Met-asp.gln-phe-arg-trp, som inneholder to ekstra aminosyrer sammenliknet med den opprinnelige tilsvarende N-terminale sekvensen, som er Met-asp-gly-trp.

Den resulterende vektoren, pPP14, ble deretter benyttet som beskrevet nedenfor for ekspresjon av preprorenin i vertspattedyrceller, innbefat-tende ovarieceller fra kinesisk hamster (CHO) og AtT-20 celler.

"Kinesisk hamsterovarie" (CHO)-celler innbefatter standardcellelinjen ATCC CCL-61, og dens slektninger isolert fra det samme kildevevet, så vel som derivater derav. Derivater er mutanter av linjen som kan atskille

seg genotypisk eller fenotypisk fra den opprinnelige linjen, men som oppnås fra denne ved frivillig eller ufrivillig mutasjon.

Tilsvarende innbefatter AtT-20 celler ATCC-cellelinjen CCL-89 og dens slektninger og derivater som beskrevet ovenfor.

pPP14-konstruksjonen er også modifisert ved innføring av et 1120 bp Hindlll/Hindlll-fragment fra SV40 (baser 5171-1046) inn i Hindlll-setet ovenfor promotoren. Det innførte fragmentet inneholder SV40-forsterker-området.

Eksempel 3

Konstruksjon av bakterielle ekspresjonsvektorer for renin og prorenin.

To bakterielle ekspresjonsvektorer ble fremstilt, en for modent renin (betegnet pLF5) og den andre for prorenin (betegnet pAA6). I begge tilfeller var vertplasmidet pKT52, som inneholder "tre"-promotoren etterfulgt av en ATG. Konstruksjonen av pKT52 er beskrevet i US søknadene nr. 616.488 og 622.639 (supra). Kort fortalt inneholder "trc"-promotoren de øvre delene av trp-motoren og de nedre, operator-inneholdende områdene av lac-promotoren, og ble opprinnelig fremstilt fra to lett tilgjengelige plasmider inneholdende disse promotorene. For å konstruere trc-promotoren som en HamHI/Hindlll-kassett, ble et mellom-plasmid pKKlO-0 fremstilt inneholdende hybrid-promotoren.

For å fremstille pKK10-0 ble pEA300 (Amman, E., et al., Gene (1983) • 25^167-178) nedbrutt med PvuII og Clal, innfylt ved anvendelse av bare dCTP i nærvær av DNA-polymerase (Klenow), etterfulgt av nedbrytning med mungbønne-nuklease, og det store vektorfragmentet ble isolert. Dette vektorfragmentet inneholder de øvre delene av trp-promotoren. Fragmentet ble ligert med et 55 bp butt-ende Hpall/PvuII-nedbrytningsprodukt utskåret fra pGLlOl (Lauer, G., et al., J. Mol. Appl. Genet (1981) hl39-147), som ble fremstilt ved å nedbryte pGLlOl med PvuII og Hpall etterfulgt av reparasjon i nærvær av dGTP og merket dCTP. Dette fragmentet inneholder lac-operatorområdet. Ligeringsproduktet av disse to fragmentene med butte ender var pKK10-0.

Et BamHI-sete ble innført i pKK10-0 ovenfor trp/lac (tre) promotor/- operatoren ved nedbrytning med EcoRI, innfylt med Klenow, og innføring av BamHI-forbindingsleddet 5'-CCGGATCCGG. Det resulterende plasmidet, pKKlO-1 ble nedbrutt med PvuII, og ligert til Ncol-forbindingsleddet, 5'-ACCATGGT, nedbrutt med Ncol, innfylt, og deretter ligert til et dobbeltkjedet forbindingsledd inneholdende Pstl- og Hindlll-seter tilveiebrakt som to komplementære oligonukleotider, 5'-GCTGCAGCCAAGCTTGG-3' og dens komplement. Ligeringsblandingen ble transformert i E. coli til Amp^. Det isolerte plasmidet DNA ble nedbrutt med BamHI og Hindlll, og det lille BamHI/Hindlll-fragmentet oppnådd på elektroforese inneholder trc-promotoren.

For å fullstendiggjøre pKT52 ble BamHI/Hindlll-fragmentet inneholdende trc-promotoren ligert inn i det store fragmentet oppnådd fra BamHI/Hindlll-nedbrytningen av pKK10-2 (Brosius, J., Gene (1984) 27:161-172) som inneholder Amp^-genet og opphavet for replikasjonen. Det resulterende plasmidet, pKK233-l ble nedbrutt til avslutning med Pvul og deretter delvis med Bgll og ligert med 360 bp PvuI/Bgll-fragmentet inneholdende den tilsvarende delen av ampicillinresistensgenet, men manglende et Pstl-sete fra pUC8. Ligeringsblandingen ble benyttet til å transformere E. coli og transformantene ble undersøkt med hensyn på nærværet av bare Pstl-sete nær trc-promotoren. Den korrekte konstruksjonen, pKK233-2, ble nedbrutt med EcoRI og PvuII, innfylt med dATP og dTTP, og religert slik at man oppnår den korrekte konstruksjonen pKT52.

pKT52 inneholder den ønskede trc-promotoren, et nedre ATG-startkodon, og nedre Ncol, Pstl og Hindlll-seter.

For pLF5 (vist i figur 3a) ble de reninkodende sekvensene fremstilt som følger: 5'-delen av renin cDNA ble utskåret fra pHRl ved hjelp av EcoRI - nedbrytning og isolering av 698 bp-fragmentet. Fragmentet ble nedbrutt med Sau3AI for å frigjøre det 472 bp nedre fragmentet som begynner ni kodoner inn i den modne reninkodende sekvensen. Dette fragmentet ble deretter ligert inn i BamHI/EcoRI-nedbrutt pBR322. Det resulterende mellomplasmidet ble nedbrutt med BamHI/PvuII og de parede, syntetiske komplementære oligonukleotidene

5'-CTGACCCTTGG CA ACACCACCT CT T CT G T

G ACT G G GAACCGT T GT G GT G GAGAAGACACT AG - 5',

som tilveiebringer de manglende kodonene, ble ligert inn i det nedbrutte plasmidet. PvuII-setet nær den øvre terminalen gjenskapes ved denne fremgangsmåten. Det resulterende mellomplasmidet ble nedbrutt med EcoRI og PvuII slik at man fikk et 501 bp-fragment inneholdende de 5'-kodende sekvensene for modent renin.

3'-terminalsekvensene ble oppnådd som et 645 bp-fragment med EcoRI/- Hindlll-nedbrytning av et pHR2-derivat hvori pHR2 var modifiset ved spaltning med SacI, dannelse av butte ender med T4-polymerase, tilsats av Hindlll- f orbindingsledd, og spaltning med Hindlll. EcoRI/Hindlll-nedbrytningsproduktet ble klonet inn i pUC9 som også var nedbrutt med EcoRI og Hindlll.

De to porsjonene ble deretter ligert inn i et Ncol (reparasjon)/Hindlll-nedbrytningsprodukt av pKT52, hvor pKT52 derved tilveiebringer den butte enden ATG nedenfor trc-promotoren. (Se figur 3a.) Det resulterende ekspresjonsplasmidet, pLF5, inneholder hele den reninkodende sekvensen i leserammen med ATG-startkodonet under kontrollen av trc-promotoren.

For å oppnå pAA6 (figur 3b) ble en prokaryotisk ekspresjonsvektor for prorenin, pHRl nedbrutt med Aval og EcoRI for å oppnå et 171 bp EcoRI/Aval-fragment og et 527 bp Aval/EcoRI-fragment. Etter separasjon på en 5% akrylamidgel og elektroeluering, ble det 171 bp fragmentet videre underkastet restriksjon med Rsal som spaltes ved startsetet for prorenin hvilket gir et 112 bp fragment.

De ovenfor omtalte 527 bp og 112 bp fragmentene ble ligert, sammen med et 645 bp fragment generert ved EcoRI/Hindlll-nedbrytning av pLF5 for å tilveiebringe de nedre kodende sekvensene, i det ovenfor nevnte Ncol (reparasjon)/Hindlll-nedbrytningsproduktet av pKT52. Den resulterende vektoren pAA6, inneholder proreninsekvensene i ramme med ATG-startkodonet for pKT52 og under kontrollen av trc-promotoren. (Se figur 3b.)

Eksempel 4

Ekspresjon av preproreninsekvenser i pattedyrceller.

Plateanalyser - CHO- celler

Pattedyrekspresjonsvektoren pPP14 ble anvendt til å transformere CHO-celler dyrket i 50% "Dulbecco's modified Eagles medium'750% "Coon's F12 medium" komplementert med 10% fetalt kalveserum. 20 ug plasmid (pPP14 DNA) sammen med 2 ug av markeringsplasmidet psV2:Neo ble tilført til cellene i 100 mm skåler ved anvendelse av standard kalsiumfosfat-utfellingsteknikken (supra) og et 15% glyserolsjokk 3 timer etter DNA-tilførselen. 24 timer etter transfeksjon ble cellene behandlet med 0,4 mg/ml G418 antibiotika og G418 resistente kolonier ble dyrket og analysert for fremstilling av det ønskede proteinet.

De G418-resistente koloniene ble indusert med 1-5 x 10"^ M ZnS04for å oppnå proteinproduksjon. Mediumet for de induserte cellene ble komplementert med<35>S-metionin, for å merke det syntetisete proteinet, kulturmediet ble fjernet og en del ble omsatt med antistoff fremstilt enten mot opprinnelig renin (anti-renin antistoffer) eller mot et syntetisk peptid representerende de C-terminale 12 aminosyrene av propeptid-sekvensen (anti-"pro" antistoffer). Immunoutf ellingene ble underkastet SDS-gel elektroforese, og båndene ble detektert ved autoradiografi. Både anti-renin og anti-"pro" antistoffer ga bånd av egnet molekylvekt svarende til prorenin.

En annen del av det merkede mediet ble behandlet først med 50 ug/ml trypsin i tris-buffer, pH 8, i 60 min. ved 25 °C. Det trypsinerte mediet ble deretter behandlet med enten anti-renin eller anti-"pro" antistoffer og immunoutfellingene ble underkastet SDS-gel elektroforese som ovenfor. Anti-renin antistoffene utfelte så et protein som ble vist å ha molekylvekten for modent renin. Anti-pro antiserum immunoutfelte ikke denne modne formen.

Figur 4 viser disse resultatene. Områder 1-3 representerer immunoutf ellinger av medium fra celle transformert med kontrollplasmid; områder 4-6 er immunoutf ellinger av medier fra celler transformert med pPP14. Områder 1 og 4, og 2 og 5 representerer immunoutf elling med henholdsvis anti-pro antistoffer og antirenin antistoffer. (Anti-humant renin antistoffer beskrevet i Dzau, V.J., et al., Clin. Exp. Hypertension (1983) A5(7-8):1207-1220 ble tilført av dr. Victor Dzau, Harvard Medical School.) Områder 3 og 6 er geler av immunoutf ellinger oppnådd fra trypsin-behandlede medier ved anvendelse av anti-renin antistoffer.

Generelt gir samlinger av CHO-celler utvalgt for G418 resistens etter transformasjon med pPP14 renin etter induksjon med 5 x 10"^ sinksulfat og 10~<6>M deksametason i nivåer på 0,02-0,2 jjg/ml. Det slik fremstilte reninet ble vist å være glykosylert ved sammenlikning av SDS-geler kjørt på<35>S metionin-merket utskilt renin med og uten behandling med endo

F.

Ved egnet seleksjon kan mye høyere nivåer av reninproduksjon oppnås. Ved en fremgangsmåte ble celler fra transformantsamlingen lagt ut i nærvær av 5 x 10"^ M sinksulfat i seriumfritt medium, og kolonier som vokste under disse betingelsene ble samlet, dyrket i serumholdig medium, og deretter analysert for reninproduksjon under standard induksjons-betingelser som beskrevet ovenfor. De høyeste reninproduserende klonene oppnådd ved denne fremgangsmåten produserte et gjennomsnitt på 0,8 ug/ml, og et klon av denne klassen, betegnet CBI-2B5 (supra) ble deponert ved ATCC med aksesjonsnummeret CRL 8758.

Kulturmediet for de pPP14-transformerte CHO-cellene betegnet CBI-2B5 dyrket i fravær av radioaktivt merke ble også direkte undersøkt for reninaktivitet. Prøver som var forbehandlet med trypsin under betingelsene beskrevet ovenfor ble benyttet i analysen; medier fra celler transfektert med plasmid ikke inneholdende reninsekvenser ble anvendt som kontrollprøver. I denne analysen ble humant angiotensinogen tilført som et substrat som, i nærvær av renin, omvandles til angiotensin I. Angiotensin I-produktet måles ved anvendelse av en konkurrerende immunoanalyseforpakning markedsført av Genentech-Travenol med<125>j_ merket angiotensin I som tracer. Medier fra CBI-2B5-celler behandlet med trypsin viste reninaktivitet i denne analysen ved nivåer på

30-50 x IO<3>ng angiotensin/time/ml kultur supe r natant når de ble analysert ved 25% maksimal substratkonsentrasjon. Trypsin-behandlede medier fra celler transformert med kontrollplasmid hadde ingen detekterbar aktivitet.

En annen cellelinje med høy produksjon ble oppnådd som følger: Cellene fra samlingen ble utlagt og replikert på et polyesterlag. Replikalaget ble deretter plassert mot et nitrocellulosefilter for binding av det utskilte celleproteinet. Filteret ble deretter omsatt med antiprorenin antiserum etterfulgt av behandling med ^<5>j protein A. Kloner som synes å ha de høyeste nivåene av reninsekresjon ifølge denne analysen ble samlet, dyrket i serumholdig medium, og igjen analysert for aktivitet under standardbetingelser. Det ble oppnådd kloner som produserte 1-4 ug/ml renin, og bare et slikt klon, tilfeldig utvalgt, CBI-AA2, ble valgt for studium under produksjonsbetingelser, som beskrevet nedenfor.

AtT- 20 transformanter

AtT-20 celler ble dyrket som beskrevet for CHO-celler ovenfor ved fremstilling for transformasjon, bortsett fra at det ble benyttet en 15% C02~atmosfære istedenfor en 5% C02-atmosfære. Transformasjon og seleksjon for vellykkede transformanter ved G418 resistens var som beskrevet for CHO-celler bortsett fra unntaket angitt nedenfor, og de utvalgte cellene ble undersøkt for reninproduksjon i supernatantvæsken ved å anvende plateanalysene beskrevet for CHO-cellene som produserte renin ovenfor, bortsett fra at bare serumholdig medium ble benyttet.

Linjer med høy produksjon utskilte både renin og prorenin i mediet; sekresjonen av renin kunne forøkes dramatisk ved å behandle cellene med 8-bromo cAMP. En sammenlikning av det utskilte materialet utfellbart med humant renin antiserum er vist i figur 6, beskrevet nedenfor.

Cellene ble dyrket som beskrevet ovenfor, podet med IO<6>celler pr. plate, og vasket den neste dagen med DME21 med 10% FCS. Cellene ble transfektert med 125 ug uPP-14 og 25 ug pSV2NEO og selektert i 250 ug/ml G418. Etter induksjon for ekspresjon som beskrevet ovenfor, og akkumulering av rekombinant produkt, ble kulturene behandlet, eller ikke behandlet, med 5 mM 8-bromo-cAMP, og etter 3 timer ble supernatantene analysert for reninaktivitet i nærvær og fravær av trypsin. (Aktivitet uten trypsin representerer modent renin, aktivitet i nærvær av trypsin representerer summen av rening og prorenin.) Resultatene er som følger: Følgelig resulterer addisjon av sekretagog i sekresjon av ca. et tillegg på 30 ng Al/ml/time i reninaktivitet.

Figur 6 viser en SDS-gel av immunoutf elte proteiner fra supernatanter av 35S -metionin-merkede celler som følger: utransfekterte AtT-20 celler, AtT-20 celler transfektert med pPP-14, og CHO-celler transformert med dette plasmidet. Cellene ble merket i 15 timer med ^35-metionin etter induksjon som beskrevet ovenfor. Mediumet ble samlet, og supernatanten ble immunoutfelt med et kanin-antihumantrenin-antiserum og protein A sepharose og underkastet 10% SDS-PAGE.

Område 2 representerer immunoutf ellingene fra disse innledende supernatantene fra utransformerte celler, område 7 fra transformerte AtT-20 celler, og område 13 fra transformerte CHO-celler. Som vist utskiller de transfekterte AtT-20 cellene både prorenin og renin; transfekterte CHO-celler utskiller bare prorenin-formen.

Brønner ble vasket med umerket medium, og inkubert i 3 timer i nytt umerket medium. Ved slutten av 3 timers perioden ble dette mediumet samlet (område 3, 9 og 15). Identiske brønner ble deretter behandlet i 3 timer med nytt medium inneholdende enten 5 mM 8-bromo cAMP (område 4, 10 og 16) eller 0 mM 8-bromo cAMP (område 5, 11 og 17).

Som vist i figur 6 avtok sekresjonen av merket renin eller prorenin som ventet etter fjernelse av 35S -metionin (område 9 og 15). Fortsatt inkubering resulterte i ytterligere reduksjon (område 11 og 17), men behandling med 5 mM Br-cAMP resulterte i sekresjon av merket renin fra AtT-20 celler (område 10), men ikke av prerenin fra CHO-celler (område 16).

AtT-20 kulturer inneholdende vellykkede transformanter underkastes også seleksjon for celler som er i stand til å opprettholdes under serumfrie betingelser. Kulturene dyrkes i 10% FCS til halvveis sammenløpning, og deretter byttes til serumfritt medium. Kulturplatene tilføres serumfritt medium inntil de fleste, men ikke alle, cellene er døde, hvorpå medium inneholdende 10% FCS tilsettes for å tillate atskillelse av overlevende celler. De overlevende cellene samles, belegges igjen, og etter en dag på 10% FCS byttes de igjen til serumfritt medium. Celler som overlever 2 uker dyrkes ved tilsats av medium inneholdende 10% FCS, klones ved begrenset fortynning, og analyseres for reninproduksjon etter induksjon ved anvendelse av sinkion og jern som induksjonsformidlere som beskrevet ovenfor.

Produksjonsnivå for reninkulturer

En flaske av forrådsceller inneholdende 1,0 x 10^ celler i 1 ml nedfrys-ningsmedium smeltes raskt ved risting ved 37 "C. Celler deles i like porsjoner og belegges i to 100 mm vevskulturskåler hver inneholdende 10 ml kompletteringsmedium. Fullstendige medier består av 10% fetal kalveserum i en 1:1 blanding av "Coon's F-12'VDulbecco's modified Eagle"-medier med 4,5 mg/ml glukose (DMEM-21). Antibiotika bestående av 50 enheter/ml penicillin/50 ug/ml streptomycin eller 400 ug/ml G418 kan tilsettes om ønsket. Forrådsmedia som er eldre enn 2 uker komplemen-teres med 2mM glutamin. Smeltede celler inkuberes ved 37°C i en 5% CC"2-inkubator inntil cellene har festet seg (ca. 30 min.). Mediene aspireres og cellene tilføres nytt kompletteringsmedium.

Celler får vokse til sammenflytning og overføres med trypsin ved standard fremgangsmåter for dyrking. Celler overføres ved en fortynning på >10 og <40 etter behov. Forrådsceller dyrkes for langvarig lagring og nedfryses ifølge standard fremgangsmåter.

850 cm^ rulleflasker podes med celler fra en sammenflytende T-150 flaske (~4 x 10^ celler). Rulleflasker av typen Corning er foretrukket. Celler overføres med trypsin ved standard fremgangsmåter og podes i 200 ml kompletteringsmedium komplettert med 10 mM Hepes, pH 7,2. Celler dyrkes i et rom ved 37 °C i et rullestativ som roterer med hastighet 6-7 min. pr. omdreining inntil sammenflytning.

Serumfritt induksjonsmedium (SFIM) for forøket reninproduksjon ved CBI-2B5 består av følgende: 10 mm Hepes, pH 7,2 (1 M forråds-Hepes filtreres gjennom et 0,2 n filter for sterilisering og lagres ved 4°C), 3 x 10"^ M FeSC>4 (1000 x forråds-FeSC>4 fremstilles i H2O, filtreres straks sterilt, fordeles i like store porsjoner på 1,5 ml i cellenedfrysningsflasker, og lagres ved - 80 °C). 5 x IO"<5>ZnS04(et 200 gangers forråd fremstilles i H2O, sterilfiltreres, fordeles i like porsjoner, og lagres ved 4°C); 10"^ M deksametason (et 1000 gangers forråd fremstilles i 100% etanol og lagres ved 4°C); "Coon's F12'7DMEM 21 (1:1); og glutaminsupplement om påkrevet, antibiotika etter ønske.

Cellene overføres til serumfritt medium på følgende måte:

Fullstendige medier aspireres fra rulleflasken og 200 ml DMEM 21 tilsettes. Flasken føres tilbake til rullestativet i 10 min. før aspirering av mediet og fornyet tilsats av 100-200 ml SFIM. Cellene f6res igjen når cellene har kondisjonert mediet med utskilt protein, ca. 100 ug/ml totalt protein bestemt ved Bradford-analyse. (Ca. 2 dager pr. 100 ml for CBI-2B5 ved begynnelsen av rulleforsøket, men tiden som er påkrevet for at cellene skal kondisjonere mediet kan avta med tiden etter omskift-ningen.) Cellene f&res igjen ved aspirering eller meget forsiktig avpipet-tering av mediet (cellene blir svært løst bundet til flasken med tiden) og fornyet tilsats av 100-200 ml SFIM.

CHO-transformantcellene betegnet CBI-AA2 ble fremstilt for rulleflaske-kulturvekst i 100 mm vevskulturskåler inneholdende 10 ml kompletteringsmedium (10% FCS i F12/DMEM21 og inneholdende 50 U/ml penicillin, 50 ug/ml streptomycin, eller 400 jjg/ml G-418). Cellene dyrkes inntil de har festet seg (30 min.), mediet fjernes, og cellene fores med nytt kompletteringsmedium. Cellene fikk gro til sammenflytning, og ble overført ved hjelp av trypsin ved standard fremgangsmåter for dyrking. 850 cm^ rulleflaske ble podet med celler fra en sammenflytende flaske (4 x 10^ celler) i 200 ml fullstendig medium komplementert med 10 mM Hepes, pH 7,2. Cellene ble dyrket ved 37"C med rotasjon inntil sammenflytning.

For å indusere produksjon av renin i serumfritt medium, ble det fullstendige mediet aspirert fra rulleflaskene og cellene ble vasket med 200 ml DMEM21. Cellene ble deretter tilført ca. 100-200 ml serumfritt induksjonsmedium (SFIM). SFIM består av F12/DMEM21 (1:1), inneholdende 1 mM Hepes, 3 x 10"<5>M FeS04, 5 x IO"<5>M ZnS04, og IO"<6>M deksametason. Cellene ble igjen f6ret med SFIM i en syklus bestemt ved mengden av utskilt protein - dvs. når ca. 100 ug/ml totalt protein var utskilt, bestemt ved Bradford-analyse. Generelt fant dette nivået for samlet proteinproduksjon sted i løpet av ca. 2 dager. CBI-AA2 viste reninproduksjonsnivåer på 1 ug/ml eller ca. 0,5 ug/ml/dag.

Rensing av renin

Renin ble renset fra serumfrie CHO-cellesupernatanter ved trinnsvis anvendelse av hydrofob vekselvirkningskromatografi, pepstatinaffinitets-kromatografi, og anionvekslingskromatografi.

HIC

Nærmere bestemt ble 1,5 M NaCl tilsatt til CHO-supernatanter, og oppløst ved forsiktig risting ved romtemperatur. Oppløsningen ble filtrert gjennom et 8 um prefilter ("Sartorius Sartopure capsule"), og 0,45 um filtrer ("Sartorius cellulose nitrate"), ved anvendelse av en "Sartorius"-ultrafiltreringsapparatur med peristaltisk pumpe. Filtratet ble lagret ved 4°C inntil det var klart for hydrofob vekselvirkningskromatografi (HIC-hydrophobic interaction chromatography). Ved hvert HIC-forsøk ble det anvendt 4 liter filtrert supernatant, hvortil det var tilsatt 0,02% natrium-azid. Kolonnen som ble anvendt var en "Phenyl 5 PW" preparativ HPLC-kolonne (7,5 x 2,1 cm, Toyo Soda Company, Japan) plassert i et "Pharmacia FPLC" kromatografisystem, som innbefatter to "P-500 FPLC"-pumper kontrollert ved hjelp av "LCC-500"-kromatografikontrollinn-retningen. Prøven ble pumpet direkte på kolonnen ved en strømnings-hastighet på 6 ml/min. etter ekvilibrering med 1,5 M NaCl, 50 mM Tris-Cl, pH 8,0 (buffer A). Absorbansen av elueringsmidlet ble fulgt ved 280 nm med "Pharmacia UV-l"-absorbansdetektoren, og oppløsningsmiddel-veksling ved pumpe A ble oppnådd ved hjelp av motorventil "MV-8". Etter tilførsel av 1,5 liter supernatant, og re-ekvilibrering av kolonnen til buffer A, ble bundne proteiner eluert med en avtakende saltgradient: en 15 min. lineær gradient til 95% buffer B (50 mM Tris-Cl, pH 8,0), etterfulgt av en 15 min. lineær gradient til 100% B. Fraksjoner inneholdende prorenin (bedømt ved hjelp av trypsin-aktiverbar reninaktivitet) ble samlet og ytterligere 1,5 liter supernatant ble tilført.

Pepstatin - kolonne

De samlede fraksjonene fra HIC ble trypsinaktivert fra prorenin til renin ved tilsats av trypsinkonjugerte Sepharose 4B-perler (koplingsfremgangs-måte var som angitt i Pharmacia-litteråturen, under anvendelse av ca. 20 mg/ml trypsin fra Boehringer Mannheim). Etter sentrifugering for å fjerne perlene, ble reninoppløsningen dialysert med 20 mM NaOAc, pH 5,7 (tilførselsbuffer), og eventuelt resulterende bunnfall ble fjernet ved hjelp av en andre sentrifugering. Denne prøven (500 ml, fra to 4-liters HIC-forsøk) ble tilført (ved ca. 1 ml/min.) på en 40 ml pepstatin-kolonne ekvilibrert med tilførselsbuffer (kolonnen fremstilt ved fremgangsmåten ifølge Murakami, K., et al., Biochem. Biophys. Res. Comm. (1975) 62:757-763, ved anvendelse av aminoheksylsepharose som bærer). Etter vasking av kolonnen med 1 M NaCl i tilførselsbuffer, etterfulgt av tilførselsbuffer alene, ble reninet eluert med 0,1 N eddiksyre, rettet inn i rør inneholdende nøytraliserende mengder av 2 M Tris-Cl, pH 8,0.

Anionutveksling

Eluat fra pepstatinkolonnen ble ytterligere renset ved ioneveksling HPLC, ved anvendelse av en anionpatron i en "Brownlee NewGuard HPLC guard"-holder som en kontroll, og DEAE "5 PW" (7,5 x 0,75 cm, Toyo Soda Company) som analytisk kolonne. HPLC-systemet besto av to "Beckman/Altex HOA"-pumper med "421" kontroller, "Eldex" pumpemoni-tor, og "Kratos Spectroflow 757" absorbansdetektor med variabel bølge-lengde, innstilt på 280 nm og koplet til en "Kipp and Zonen BD 40 chart recorder". Prøve (ca. 100 ml, fra 4 pepstatinforsøk) ble pumpet på kolonnen ved 1 ml/min., etter ekvilibrering med 100 mM trietylammoniumacetat, pH 7,0. Gjennomstrømmet materiale som viste absorbans ved 280 nm ble samlet, og inneholdt i det vesentlige rent aktivt renin med spesifikk aktivitet 400 -900 Goldblatt-enheter pr. mg.

Rensing av prorenin

På grunn av betydelig aktivering av prorenin til renin under passasje over HIC-kolonnen, ble CHO-supernatanter anvendt uten HIC-trinnet for rensing av prorenin. Rensefremgangsmåten innbefatter pepstatinaffinitets-, størrelsesutelukkelses- og ionevekslingskromatografi. Inaktivt renin er ute av stand til binding til renin-inhibitorer, supernatantene aktiveres ved hjelp av syre før de tilføres på pepstatin. 1 M glysin, pH 3,3, tilsettes dråpevis i løpet av 18 timer ved 4°C til en omrørt oppløsning av supernatant inntil oppløsningen har pH 3,3. Dette aktiverte proreninet tilføres på en pepstatinkolonnen som på forhånd er ekvilibrert med 20 mM NaOAc, pH 5,7. Etter trinnvis vasking med utgangsbuffer, buffer pluss 1 M NaCl, deretter buffer alene, elueres proreninet med 0,1 M eddiksyre. De samlede fraksjonene inneholdende prorenin tørkes under vakuum, og resuspenderes i et lite volum 100 mM trietylammoniumacetat, pH 7,0. Idet fraksjonene inneholder forurensninger med både høy og lav molekylvekt, vil de neste trinnene innbefatte HPLC-kromatografi som er vist å fjerne disse forurensningene fra tidligere rensinger av prorenin: Først størrelsesutelukkelseskromatografi på "TSK 4000 SW"-kolonne (Toyo Soda Company) i den ovenfor nevnte bufferen, etterfulgt av tilsats av 1 M Tris-Cl, pH 7,0 (for å oppnå en endelig konsentrasjon på 0,1 M Tris) og DEAE-kromatografi som beskrevet ovenfor for aktivt renin. Gjennom-strømningsf raks joner fra denne kolonnen skal inneholde rent prorenin.

Eksempel 5

Ekspresjon av renin og prorenin i bakterieceller

For bakteriell ekspresjon ble enten pLF5 eller pAA6 anvendt til å transformere E. coli MC1061-celler til Amp^ og de transformerte cellene ble dyrket på et M9-medium inneholdende 1 mM IPTG i 3-5 timer til en OD på 0,2-0,5. (IPTG er et standard induksjonsmiddel for kontrollsekvenser regulert ved lac-operator.) Cellene ble deretter puls-merket med ^ S-metionin, høstet, lyset ved hjelp av lydpåvirkning eller behandling med 5% trikloreddiksyre, og celleekstraktene ble analysert for de ønskede proteinene ved hjelp av SDS-gel-elektroforese.

Ekstraktene ble behandlet med enten anti-renin eller anti-"pro" antistoffer, og immunoutf ellingene ble underkastet SDS-gel-elektroforese. Celler transformert med pAA6 ga immunobunnfall med anti-"pro" antistoffer som migrerte på geler til posisjoner svarende til den korrekte molekylvekten for prorenin. Celler transformert med pLF5 gjorde ikke dette. Hverken ekstraktene fra pLF5 eller pAA6 ga protein som ble immunoutfelt med anti-renin antistoffer. Det antas at denne manglende utfellingen skyldes konformasjonsavhengigheten av anti-renin antistoffet som ble anvendt.

Resultatene ovenfor er generelt vist i figur 5. Områder 1, 3, 5 og 6 representerer totalt 5% TCA-utfelte proteiner fra E. coli transformert med henholdsvis pKT52, pAA6, pLF5 og pKT52. Nærværet av et bånd ved ca. 42 kD molekylvekt i område 3 og ved ca. 37 kD molekylvekt i område 5, hvilke bånd er fraværende i områdene 1 og 6, fremgår klart. Områder 2 og 4 er geler kjørt på immunobunnfall med anti-pro antistoffer fra ekstrakter av celler inneholdende henholdsvis pKT52 og pAA6. Det immunoutfelte proteinet fra den pAA6-transformerte organismen migrerer svarende til den samme molekylvekten som det antatte prorenin-båndet i det samlede ekstraktet.

Protein svarende til 37 kD båndet referert til ovenfor ble renset fra bakterier inneholdende pLF5 ved differensiell sentrifugering og preparativ gel-elektroforese, eluert, og det resulterende utvunnede proteinet ble underkastet N-terminal sekvensering. Den N-terminale sekvensen for proteinet som derved ble oppnådd Met-leu-thr-leu-gly-asn-thr-thr, som svarer til den korrekte N-terminale sekvensen for Met-renin.

Claims (13)

1. Ekspresjonssystem, karakterisert ved at det innbefatter DNA sekvenskodende humant renin, prorenin eller preprorenin operabelt knyttet til en kontrollsekvens som er kompatibel med en rekombinant vertscelle og i stand til å bevirke ekspresjon av den nevnte DNA sekvensen i nevnte rekombinante vertsceller.

2. System ifølge krav 1, karakterisert ved at kontroll - sekvensen er kompatibel med en pattedyrvert.

3. System ifølge krav 1, karakterisert ved at kontroll - sekvensen er kompatibel med en bakteriell vert.

4. Rekombinante vertsceller, karakterisert ved at de er transformert med et rekombinant DNA sekvenskodende renin, prorenin eller preprorenin.

5. Celler ifølge krav 4, karakterisert ved at den rekombinante DNA sekvensen videre innbefatter kontrollsekvenser som er operabelt knyttet til det DNA kodende reninet, proreninet eller preproreninet.

6. Celler ifølge krav 4, karakterisert ved at de utgjøres av pattedyrceller.

7. Celler ifølge krav 4, karakterisert ved at de utgjøres av bakterieceller.

8. Fremgangsmåte for fremstilling av humant renin eller prorenin, karakterisert ved at den innbefatter kultivering av cellene ifølge krav 4 og utvinning av reninet eller proreninet fra kulturen.

9. Peptid (2-15 aminosyrerester) karakterisert ved at det har en tredimensjonal overflatekontur som er komplementær med den tredimensjonale overflatekonturen av en del av overflaten av krystallisert rekombinant renin, hvori peptidet er en inhibitor for reninaktivitet.

10. Preparat, karakterisert ved at det innbefatter rekombinant fremstilt humant renin eller prorenin fritt for forurensninger.

11. Fremgangsmåte for fremstilling av utskilt, kultivert modent rekombinant renin, karakterisert ved at den innbefatter behandling av pattedyrceller som normalt anvender en regulert sekre-sjonsvei, som er modifisert slik at de inneholder et ekpresjonssystem for preprorenin, og som er indusert til å eksprimere preprorenin-genet med et sekretagog.

12. Fremgangsmåte for rensing av renin fra cellekultursupernatanter, karakterisert ved at den innbefatter hydrofob vekselvirkningskromatografi (HIC), pepstatinkromatografi, og anionveksling.

13. Fremgangsmåte for rensing av prorenin fra cellekultursupernatanter, karakterisert ved at den innbefatter pepstatinkromatografi, størrelsesutelukkelse, og anionutveksling.