NO327207B1

NO327207B1 - Forbindelser som er spesifikke overfor adenosin-A1, A2A og A3-reseptor samt anvendelse derav for fremstilling av medikamenter og fremgangsmate for fremstilling av forbindelsene

Info

Publication number: NO327207B1
Application number: NO20032482A
Authority: NO
Inventors: Arlindo Lucas Castelhano; Bryan Mckibben; David J Witter
Original assignee: Osi Pharm Inc
Priority date: 2000-12-01
Filing date: 2003-06-02
Publication date: 2009-05-11
Also published as: JP4579497B2; EP1347980A4; ZA200303729B; MEP35308A; YU42703A; OA13295A; CN1489590A; CZ20031831A3; NO20032482D0; MXPA03004717A; AU2002248151B2; CA2430577A1; BR0115847A; NZ525885A; NO20032482L; HUP0400692A3; CN1263757C; IL155962A0; EA007254B1; EA200300628A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører forbindelser som angitt i krav 1, 28, 29 og 44, anvendelse derav som angitt i krav 18, 20, 30, 34, 44 og 58, farmasøytiske sammensetninger inneholdende slike forbindelser som angitt i krav 22, 25, 35, 41 og 50 samt fremgangsmåter for fremstilling av slike forbindelser som angitt i krav 55.

Bakgrunn for oppfinnelsen

Adenosin er en generell modulator for mange fysiologiske aktiviteter, spesielt innen de kardiovaskulære og nervesys-temene. Effektene av adenosin synes å bli overført av spesifikke celleoverflatereseptorproteiner. Adenosin modulerer mange fysiologiske funksjoner innbefattende induksjon av bedøvelse, vasodilatasjon, undertrykkelse av hjertehastighet og kontraktilitet, inhibering av blodplateaggregering, stimulering av glukoneogenese og inhibering av lipolyse. I tillegg til dets effekter på ade-nylat cyklase har adenosin blitt vist på åpne kalsiumkanaler, redusere innløp gjennom kalsiumkanaler og inhibere eller stimulere fosfoinositidforbruk via reseptormedierte mekanismer (se for eksempel CE. Muller og B. Stein "Adenosine Receptor Antagonists: Structures and Potential Therapeutic Applications," Current Pharmaceutical Design, 2, 501 (1996) og CE. Muller "Ai-Adenosine Reseptor Antagonists," Exp. Opin. Ther. Patents 7(5):419 (1997)).

Adenosinreseptorer som tilhører superfamilien purinresepto-rer som for tiden er oppdelt i Pi (adenosin) og P2 (ATP, ADP og andre nukleotider) reseptorer. Fire reseptorsubty-per for nukleosidet adenosin har foreløpig blitt klonet fra forskjellige arter innbefattende mennesker. To reseptor-subtyper (Ai og A2a) oppviser affinitet for adenosin i nano-molarområdet, mens to andre kjente subtyper A2b og A3 er la-vaffinitetsreseptorer med affinitet for adenosin i det lav-mikromolare området. Ai og A3 adenosinreseptoraktivering

kan føre til en inhibering av adenylatcyklaseaktivitet,

mens A2a- og A2b-aktivering forårsaker en stimulering av adenylatcyklase.

Noen Ai-antagonister har blitt utviklet for behandling av kognitiv sykdom, nyresvikt og hjertearrytmi. Det har blitt antydet at A2a-antagonister kan være gunstige for pasienter som lider av Morbus Parkinson (Parkinsons sykdom). Spesielt i betraktning av potensialet for lokal avlevering kan adenosinreseptorantagonister være verdifulle for behandling av allergisk inflammasjon og astma. Tilgjengelig informa-sjon (for eksempel Nyce og Metzger "DNA antisense Therapy for Asthma in an Animal Modell" Nature ( 1997) 385:721-5) indikerer at i denne patofysiologiske sammenheng kan Ai-antagonister blokkere kontraksjon av glatt muskulatur som ligger under pusteepitelet, mens A2b- eller A3-reseptorantagonister kan blokkere mastcelledegranulering, noe som mild-ner frigjøringen av histamin og andre inflammatoriske mediatorer. A2b-reseptorer har blitt oppdaget gjennom mage-tarmkanalen, spesielt i tarmen og tarmepitelet. Det har blitt antydet at A2b-reseptorer overfører cAMP-respons (Strohmeier et al., J. Bio. Chem. (1995) 270:2387-94).

Adenosinreseptorer har også blitt vist å eksistere på retina hos forskjellige pattedyrarter innbefattende bovin, porcin, ape, rotte, marsvin, mus, kanin og menneske(se Bla-zynski et al., Discrete Distributions of Adenosine Receptors in Mammalian Retina, Journal of Neurochemistry, volum 54, side 648-655 (1990); Woods et al., Characterization of Adenosine A!- Receptor Binding Sites in Bovine Retinal Mem-branes, Experimental Eye Research, volum 53, side 325-331

(1991) og Braas et al., Endogenous adenosine and adenosine receptors localized to ganglion cells of the retina, Pro-ceedings of the National Academy of Science, volum 84, side 3906-3910 (1987). Nylig rapporterte Williams observasjonen av adenosine transportseter i en dyrket human retinalcelle-linje (Williams et al., Nucleoside Transport Sites in a

Cultured Human Retinal Cell Line Established By SV- 40 T An-tigen Gene, Current Eye Research, volum 13, side 109-118

(1994)) .

Forbindelser som regulerer opptaket av adenosinopptak har tidligere blitt foreslått som potensielle terapeutiske midler til behandling av retinal og synsnervehodeskade. I US patent nr. 5.780.4 50 til Shade diskuterer Shade bruken av adenosinopptaksinhibitorer til behandling av øyelidelser. Shade beskriver ikke bruken av spesifikke A3-reseptorinhi-bitorer.

Ytterligere adenosinreseptorantagonister er nødvendige som farmakologiske verktøy og er av stor interesse som medikamenter i de ovenfor nevnte sykdommer og/eller tilstander.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse er basert på forbindelser som angitt i krav 1 og som selektivt binder til adenosin Ai-reseptor, for derved å behandle sykdom assosiert med Ax-adenosinreseptor hos et individ, ved å administrere til individet en terapeutisk effektiv mengde av slike forbindelser. Sykdommen som skal behandles er assosiert med kognitiv lidelse, nyresvikt, hjertearytmi, respiratorisk epitel, transmitterfrigjøring, bedøvelse, vasokonstriksjon, bradykardia, negativ hjerteinotropi og dromotropi, brankokonstriksjon, neutrofil kjemotakser, tilstand med oppstøt eller magesårtilstander.

Foreliggende oppfinnelse er basert, i det minste delvis, på den oppdagelse at visse N-6-substituerte 7-deazapuriner, beskrevet nedenfor, kan bli brukt for å behandle en N-6 substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand. Eksempler på slike tilstander innbefatter slike hvori aktiviteten av adenosinreseptorene er øket, for eksempel bronkitt, gastrointestinale lidelser eller astma. Disse tilstander kan bli karakterisert ved at adenosinreseptoraktivering kan føre til inhiberingen eller stimuleringen av adenylatcyklaseaktivitet. Sammensetninger og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen innbefatter enantiomerisk eller diastereomerisk ren N-6-substituert 7-deazapuriner. Foretrukne N-6 substituerte 7-deazapuriner innbefatter slike som har et aceta-mid, karboksamid, substituert cykloheksyl, for eksempel cykloheksanol eller en ureaenhet bundet til N-6-nitrogenet via en alkylenkjede.

Foreliggende oppfinnelse angår forbindelser som har strukturen:

hvori R1NR2 sammen danner en ring som har strukturen: eller Ri er H og R2 er: og, når RXNR2 sammen er

R5 er H, -CH2 (NC5H8) (OH) (C6H5) , -CH2OCH3, - (CH2) 2C (0) OH, - CH2OCH2C (0)NH2, -C(0)OH, -CH3, -CH20 (CH2) 20H, - CH2OCH2 (0) OCH3 eller -CH2OCH2C (0) OH, eller

når Ri er H og R2 er

er R5 -CH2 (N2C3H3) , -C(0)0H, CH20 (CH2) 20H, -C(0)0CH3 eller - C (0)NH2

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Oppfinnelsen angår videre farmasøytiske sammensetninger for å behandle en N-6-substituert 7-deazapurin responsiv tilstand hos et pattedyr, for eksempel astma, bronkitt, allergisk rhinitt, kronisk obstruktiv pulmonar sykdom, nyresykdommer, gastrointestinale sykdommer og øyelidelser. Den farmasøytiske sammensetning innbefatter en terapeutisk effektiv mengde av et N-6-substituert 7-deazapurin og et far-masøytisk akseptabelt bæremateriale.

Foreliggende oppfinnelse angår også pakkede farmasøytiske sammensetninger for å behandle en N-6-substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand hos et pattedyr. Den pakkede far-masøytiske sammensetning innbefatter en beholder inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av minst ett N-6-substituert 7-deazapurin samt instruksjoner for å bruke det N-6- substituerte 7-deazapurin for å behandle en N-6-substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand hos et pattedyr.

Deazapurinene ifølge denne utførelsesform kan fordelaktig være selektive Ai-reseptorantagonister. Disse forbindelser kan være anvendelige for flere terapeutiske anvendelser, så som for eksempel behandling av astma, nyresvikt assosiert med hjertesvikt samt glaukom.

I enda en annen utførelsesform kan forbindelser ifølge oppfinnelsen inhibere aktiviteten av en adenosinreseptor (for eksempel A3) i en celle hvor cellen settes i kontakt med N-6-substituert 7-deazapurin (for eksempel foretrukket en adenosinreseptorantagonist) .

Forbindelsene kan også anvendes til fremstilling av medikamenter for å behandle skade på øyet hos et dyr (for eksempel et menneske). Foretrukket er det N-6-substituerte 7- deazapurin en antagonist av A3-adenosinreseptorer i celler hos pattedyret. Skaden er på retina eller det optiske nervehodet og kan være akutt eller kronisk. Skaden kan for eksempel være et resultat av glaukom, ødem, schemi, hypoksia eller traume.

Oppfinnelsen angår også en farmasøytisk sammensetning omfattende en forbindelse ifølge krav 1. Fortrinnsvis er det farmasøytiske preparat en oftalmisk formulering (for eksempel en periokulær, retrobulbar eller intraokulær injeksjonsformulering, en systemisk formulering eller en kirurgisk påsprøytningsoppløsning).

Detaljert beskrivelse

Trekkene og andre detaljer i oppfinnelsen vil nå bli mer spesielt beskrevet og påpekt i kravene.

Uttrykket "N-6-substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand" er ment å innbefatte en sykdomstilstand eller tilstand, som er særpreget ved sin følsomhet overfor behandling med en forbindelse ifølge oppfinnelsen som beskrevet nedenfor. Typisk er slike tilstander assosiert med en økning av adenosin i en vertsorganisme slik at vertsorganismen ofte opplever fysiologiske symptomer som innbefatter, men ikke er begrenset til, frigjøring av toksiner, inflammasjon, koma, vannansamling, vektøkning eller vekttap, pankreatitt, emfysem, rheumatoid artritt, osteoartritt, multippel organsvikt, respiratorisk nødssyndrom hos barn og voksne, allergisk rhinitt, kronisk obstruktiv pulmonarisk sykdom, øyesykdommer, gastrointestinale sykdommer, fremming av hudsvulster, immunsvikt og astma. (Se for eksempel CE. Muller og B. Stein (Adenosine Receptor Antagonists: Structures and Potential Therapeutic Applications," Current Pharmaceutical Design, 2:501 (1996) and CE. Muller "Ai-Adenosine Receptor Antagonists," Exp. Opin. Ther. Patents 7( 5) : 419 (1997) og I. Fekotistove, R. Polosa, S. T. Holgate og I. Biaggioni "Adenosine A2B receptors: a novel therapeutic target in asthma?2 TIPS 19: 148 (1998)). Effektene som ofte er assosiert med slike symptomer innbefatter, men er ikke begrenset til, feber, kortpustethet, kvalme, diaré, svakhet, hodepine og til og med død. I en utførelsesform innbefatter en N-6-substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand de sykdomstilstander som blir fremmet ved stimulering av adenosinreseptorer, for eksempel Ai, A2a, A2b, A3 etc. slik at kalsiumkonsentrasjoner i celler og/eller aktivering av PLC (fosfolipase C) blir modulert.

I en foretrukket utførelsesform er en tilstand assosiert med adenosinreseptor(er). For eksempel virker forbindelsen som en antagonist. Eksempler på egnede responsive tilstander som kan bli behandlet med forbindelsene ifølge oppfinnelsen, for eksempel adenosinreseptor subtyper som medi-erer biologiske effekter, innbefatter sentralnervesystem-effekter (CNS), kardiovaskulære effekter, renale effekter, respiratoriske effekter, immunologiske effekter, gastrointestinale effekter og metabolske effekter. Den relative mengde adenosin i et individ kan bli assosiert til de nedenfor opplistede effekter, det vil si økede nivåer av adenosin kan sette i gang en effekt, for eksempel en uønsket fysiologisk respons, for eksempel et astmaangrep.

CNS-effekter innbefatter minsket transmittfrigjøring (Ai) , bedøvning (Ai) , minsket bevegelsesaktivitet (A2a) , antikon-vulserende aktivitet, kjemoreseptorstimulering (A2) og hy-peralgesia. Terapeutiske anvendelser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter behandling av demens, Alzheimers sykdom og hukommelsesforsterkning.

Kardiovaskulære effekter innbefatter vasodilatering (A2a) , (A2b) og (A3) , vasokonstriks jon (Ai), bradykardia (Ai), blodplateinhibering (A2a) , negativ hjerteinotropi og dromotropi (Ai), arytmi, takykardia og angiogenese. Terapeutiske anvendelser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter for eksempel forebygging av iskjemiindusert svekkelse av hjerte og kardiotoni, beskyttelse av myokardialt vev og gjeninnføring av hjertefunksjonen.

Nyreeffekter innbefatter senket GFR (Ai), mesangialcelle-kontraksjon (Ai) , antidiuresis (Ai) og inhibering av re-ningfrigjøring (Ax). Egnede terapeutiske anvendelser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter bruk av de oppfinneriske forbindelser som diuretiske, natriuretiske, kaliumsparende, nyrebeskyttende/forebyggende for akutt nyresvikt, antihypertensive, anti-ødematøse og anti-nefrit-tiske midler.

Respiratoriske effekter innbefatter bronkodilatering (A2) , bronkokonstriksjon (Ai) , kronisk obstruktiv pulmonar sykdom, allergisk rhinitt, slimutskillelse og pustsvekkelse (A2). Passende terapeutiske anvendelser for forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter anti-astmatiske anvendelser, behandling av lungesykdom etter transplantasjon og pustlidelser.

Immunologiske effekter innbefatter immunosupresjon (A2) , neutrofil kjemotaksis (Ai), neutrofil superoksidproduksjon (A2a) og mastcelledegranulering (A2b og A3) . Terapeutiske anvendelser av antagonister innbefatter allergisk- og ikke-allergisk inflammasjon, for eksempel frigjøring av histamin og andre inflammasjonsmediatorer.

Gastrointestinale effekter innbefatter inhibering av syre-sekresjon (Ai) hvor terapeutisk anvendelse kan innbefatte inhiberinger, oppstøt og ulcerative tilstander. Gastrointestinale effekter innbefatter også tykktarm-, tynntarm-og diarésykdom, for eksempel diarésykdom assosiert med betennelse på tynntarmen (A2b) .

Øyelidelser innbefatter hodeskade på retina og synsnerve, og traumerelaterte forstyrrelser (A3) . I en foretrukket utførelsesform er øyelidelsen grå stær.

Andre terapeutiske anvendelser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter behandling av fedme (lipolytiske egenskaper), hypertensjon, behandling av depresjon, avslap-pende angstdempende som antileptika og som avføringsmidler, for eksempel ved å gi motilitet uten å forårsake diaré.

Uttrykket "sykdomstilstand" er ment å innbefatte slike tilstander som er forårsaket av eller assosiert med uønskede nivåer av adenosin, adenylyl syklaseaktivitet, øket fysiologisk aktivitet assosiert med unormal stimulering av adenosinreseptorer og/eller en økning i cAMP. I en utførel-sesform er sykdomstilstanden for eksempel astma, kronisk obstruktiv pulmonar sykdom, allergisk rhinitt, bronkitt, nyresykdommer, gastrointestinale sykdommer eller øyesykdommer. Ytterligere sykdommer innbefatter kronisk bronkitt og cystisk fibrose. Passende eksempler på inflammatoriske sykdommer innbefatter ikke-lymfosytisk levkemi, myokardial iskemi, angina, infarkt, cerebrovaskulær iskemi, mellomlig-gende klaudikering, kritisk lemiskemi, venøs hypertensjon, åreknuter, venøs sårdannelse og arteriosklerose. Tilstander med svekket reperfusjon innbefatter for eksempel ethvert postkirurgisk traume, så som rekonstruktiv kirurgi, trombolysis eller angioplasti.

Uttrykket "behandling av en N-6 substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand" eller "behandling av en N-6 substituert 7-deazapurinresponsiv tilstand" er ment å innbefatte end-ringer i en sykdomstilstand eller forhold som beskrevet ovenfor, slik at fysiologiske symptomer i et pattedyr kan bli vesentlig minsket eller minimalisert. Uttrykket innbefatter også kontroll, forebygging eller inhibering av fysiologiske symptomer eller effekter assosiert med en unormal mengde adenosin. I en foretrukket utførelsesform er kontrollen av sykdomstilstanden eller forholdet slik at sykdomstilstanden eller forholdet blir fjernet. I en annen foretrukket utførelsesform er kontrollen selektiv slik at unormale nivå av adenosinreseptoraktivitet blir kontrollert, mens andre fysiologiske systemer og parametere er upåvirket.

Uttrykket "N-6 substituert 7-deazapurin" er kjent innen faget og er ment å innbefatte slike forbindelser som har formelen I:

"N-substituert 7-deazapuring" innbefatter farmasøytisk akseptable salter derav og, i en utførelsesform også visse N-6-substituerte puriner beskrevet heri.

Uttrykket "terapeutisk effektiv mengde" av en forbindelse ifølge oppfinnelsen som beskrevet nedenfor, indikerer den mengde av en terapeutisk forbindelse som er nødvendig eller tilstrekkelig til å utøve sin tiltenkte funksjon i et pattedyr. En effektiv mengde av den terapeutiske forbindelse kan variere i henhold til faktorer så som mengden av det forårsakende middel som allerede er til stede i pattedyret, alder, kjønn og vekt av pattedyret, og egenskapen til de terapeutiske forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse å påvirke en aktuell sykdomstilstand i pattedyret.

Den alminnelige fagpersonen vil være i stand til å studere de tidligere nevnte faktorer, og foreta en bestemmelse med hensyn til den effektive mengde av den terapeutiske forbindelse uten unødig eksperimentering. Et in vi tro eller in vivo assay kan også bli brukt til å bestemme en "effektiv mengde" av den terapeutiske forbindelse beskrevet nedenfor. Den vanlige fagpersonen ville velge en passende mengde av den terapeutiske forbindelse for anvendelse i de tidligere nevnte assay eller som en terapeutisk behandling.

En terapeutisk effektiv mengde minsker fortrinnsvis et symptom eller effekt assosiert med den aktuelle tilstand eller forhold som blir behandlet med minst omkring 20 %

(mer foretrukket med minst omkring 40 %, enda mer foretrukket med minst omkring 60 % og enda mer foretrukket med minst 80 %) i forhold til ubehandlede individer. Assays kan bli utformet av fagpersonen for å måle minskningen av slike symptomer og/eller effekter. Ethvert assay som er kjent innen faget, og som er i stand til å måle slike parametere er ment å kunne benyttes. For eksempel dersom astma er tilstanden som blir behandlet, så kan volumet av luft som presses ut fra lungene hos et individ bli målt før og etter behandling for måling av økningen i volumet ved å bruke en teknikk som er kjent innen faget. Likeledes dersom inflammasjon er tilstanden som blir behandlet så kan området som er betent bli målt før og etter behandling for måling av minskningen i området

som er betent ved å bruke en teknikk som er kjent innen faget.

Uttrykket "celle" innbefatter både prokaryote og eukaryote celler.

Uttrykket "dyr" innbefatter enhver organisme med adenosinreseptorer eller enhver organisme som er mottakelig for en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Eksempler på dyr innbefatter gjær, pattedyr, reptiler og fugler. Den innbefatter også transgene dyr.

Uttrykket "pattedyr" er kjent innen faget og er ment å innbefatte et dyr, mer foretrukket et varmblodig dyr, mer foretrukket kyr, sauer, griser, hester, hunder, katter, rot-ter, mus og mennesker.

Uttrykket "å modulere en adenosinreseptor" er ment å innbefatte slike tilfeller hvor en forbindelse samvirker med en adenosinreseptor(er) for å forårsake øket, minsket eller abnormal fysiologisk aktivitet assosiert med en adenosinreseptor eller etterfølgende kaskadeeffekter som stammer fra moduleringen av adenosinreseptoren. Fysiologiske aktiviteter assosiert med adenosinreseptorer innbefatter induksjon av bedøvelse, vasodilatering, senkning av hjertefrekvens og kontraktilitet, inhibering av blodplateaggregeringsevne, stimulering av glukoneogenese, inhibering av lipolyse, åp-ning av kaliumkanaler, redusering av strøm i kalsiumkanaler, osv.

Uttrykkene "modulere", "modulerende" og "modulering" er ment å innbefatte det å forhindre, fjerne eller inhibere den resulterende økning av uønsket fysiologisk aktivitet assosiert med abnormal stimulering av en adenosinreseptor, for eksempel i sammenheng med de terapeutiske metoder ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelsesform innbefatter uttrykket modulere antagonistiske effekter, for eksempel minskning av aktiviteten eller produksjonen av mediatorer for allergi og allergisk inflammasjon som stammer fra over-stimuleringen av adenosinreseptoren(e). For eksempel kan de terapeutiske deazapuriner ifølge oppfinnelsen samvirke med en adenosinreseptor for å inhibere, for eksempel adenylatcyklaseaktivitet.

Uttrykket "tilstand karakterisert ved unormal adenosinreseptoraktivitet" er ment å innbefatte de sykdommer, lidelser eller tilstander som er assosiert med unormal stimulering av en adenosinreseptor ved at stimuleringen av reseptoren forårsaker en biokjemisk og/eller fysiologisk hendel-seskjede som er direkte eller indirekte assosiert med sykdommen, lidelsen eller tilstanden. Denne stimulering av en adenosinreseptor må ikke være det eneste forårsakende middel for sykdommen, lidelsen eller tilstanden, men kun være ansvarlig for å forårsake enkelte av symptomene som typisk behandles. Den unormale stimulering av reseptoren kan være den eneste faktor, eller i det minste kan et annet middel være involvert i tilstanden som blir behandlet. Eksempler på tilstander innbefatter slike sykdomstilstander som er opplistet ovenfor, innbefattende inflammasjon, gastrointestinale lidelser og de symptomer som manifesteres ved tilstedeværelsen av øket adenosinreseptoraktivitet. Foretrukne eksempler innbefatter slike symptomer som er assosiert med astma, allergisk rhinitt, kronisk obstruktiv lungesykdom, emfysem, bronkitt, gastrointestinale sykdommer og grå stær.

Uttrykket "behandle eller behandling av en tilstand særpreget ved unormal adenosinreseptoraktivitet" er ment å innbefatte opphevelsen av eller minskningen av minst ett symptom som typisk er assosiert med tilstanden. Behandlingen innbefatter også opphevelse eller minskning av mer enn ett symptom. Foretrukket helbreder behandlingen, for eksempel fjerner i det vesentlige, symptomene assosiert med tilstanden.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan dannes fra vannopp-løselige prodroger som er beskrevet WO 99/33815, Internasjonal søknad nr. PCT/US98/04595, innlevert 9. mars 1998 og publisert 8. juli 1999. De vannoppløselige prodroger blir metabolisert in vivo til et aktivt medikament, for eksempel ved esterasekatalysert hydrolyse. Eksempler på potensielle prodroger innbefatter deazapuriner som, for eksempel R2 som sykloalkylsubstituert med -0C(0)(Z)NH2, hvor Z er en sidekjede til en naturlig eller unaturlig forekommende aminosyre eller analog derav, en a-, P~, y- eller oo-aminosyre eller et dipeptid. Foretrukne aminosyresidekjeder innbefatter slike fra glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, lysin, a-metylalanin, aminosyklopropan-karboksylsyre, azetidin-2-karboksylsyre, p-alanin, y-aminosmørsyre, alaninalanin eller glycinalanin.

I en spesiell foretrukket utførelsesform kan deazapurinene ifølge oppfinnelsen dannes fra vannoppløselige prodroger som kan bli metabolisert in vivo til et aktivt medikament, for eksempel ved esterasekatalysert hydrolyse. Foretrukket omfatter prodrogen en R2-gruppe som er sykloalkyl substituert med -0C(0)(Z)NH2 hvor Z er en sidekjede av en naturlig eller unaturlig forekommende aminosyre, en analog derav, en a-, P~, y- eller oo-aminosyre eller et dipeptid. Eksempler på foretrukne sidekjeder innbefatter sidekjedene til glycin, alanin, valin, leucin, isoleucin, lysin, a-metylalanin, aminosyklopropan-karboksylsyre, azetidin-2-karboksylsyre, p-alanin, y-aminosmørsyre, alaninalanin eller glycinalanin.

I en annen utførelsesform er forbindelsen ifølge oppfinnelsen 4-(cis-3-hydroksysyklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7ff-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

4-(cis-3-(2-aminoacetoksy)syklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7if-pyrrolo [2, 3d]pyrimidintrif luoreddiksyresalt. 4- (3-acetamido) piperidinyl-5, 6-dimetyl-2-fenyl-7if-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin.

4- (2-N' -metylureapropyl) amino-5, 6-dimetyl-2-fenyl-7if-pyr-

rolo[2,3d]pyrimidin.

4- (2-acetamidobutyl) amino-5, 6-dimetyl-2-f enyl-7ff-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin.

4- (2-N' -metylureabutyl) amino-5, 6-dimetyl-2-f enyl-7if-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin.

4- (2-aminosyklopropylacetamidoetyl) amino-2-f enyl-7ff-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin.

4-(trans-4-hydroksysykloheksyl)amino-2-(3-klorfenyl) - 1H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(trans-4-hydroksysykloheksyl)amino-2-(3-fluorfenyl) - 1H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(trans-4-hydroksysykloheksyl)amino-2-(4-pyridyl)-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin.

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan inhibere aktiviteten av en adenosinreseptor (for eksempel Ai, A2a, A3b, eller fortrinnsvis A3) i en celle.

I en utførelsesform kan forbindelsen ifølge oppfinnelsen være 4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-fenoksymetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(4-fluorfenoksy)metyl-2-fenyl-7if-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(4-klorfenoksy)metyl-2-fenyl-7if-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(4-metoksyfenoksy)metyl-2-fenyl-7if-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(2-pyridyloksy)metyl-2-fenyl-7ff-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(N-fenylamino)metyl-2-fenyl-7if-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(N-metyl-N-fenylamino)metyl-2-f enyl-7ff-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin, eller

4-(2-N'-metylureaetyl)amino-6-(4-fenoksymetyl)metyl-2-fenyl-7if-pyrrolo [2, 3d]pyrimidin,

Forbindelser ifølge oppfinnelsen kan inhibere aktiviteten av en adenosinreseptor (for eksempel en Aib adenosinreseptor) i en celle dersom cellen settes i kontakt med en forbindelse ifølge oppfinnelsen. Foretrukket er forbindelsen en antagonist av reseptoren.

I en annen utførelsesform angår oppfinnelsen en farmasøy-tisk sammensetning inneholdende en forbindelse ifølge oppfinnelsen samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

Uttrykket "alkyl" refererer til radikalet av mettede alifatiske grupper innbefattende rettkjedete alkylgrupper, forgrenete alkylgrupper, sykloalkyl (alisykliske) grupper, al-kylsubstituerte sykloalkylgrupper og sykloalkylsubstituerte alkylgrupper. Uttrykket alkyl innbefatter videre alkylgrupper som ytterligere kan innbefatte oksygen-, nitrogen-, svovel- eller fosforatomer ved å erstatte ett eller flere karboner av hydrokarbonstammen, for eksempel oksygen-, nitrogen-, svovel- eller fosforatomer. I foretrukne utførel-sesformer har en rettkjedet eller forgrenet alkyl 30 eller færre karbonatomer i sin stamme (for eksempel C1-C30 for rettkjedete, C3-C30 for forgrenete) og mer foretrukket 20 eller færre. Likeledes har foretrukne sykloalkyler fra 4 - 10 karbonatomer i sin ringstruktur, og har mer foretrukket 5, 6 eller 7 karboner i ringstrukturen.

Videre er uttrykket alkyl, som benyttet gjennom beskrivel-sen og kravene ment å innbefatte både "usubstituerte alkyler" og "substituerte alkyler" hvorav sistnevnte refererer til alkylenheter som har substituenter som erstatter et hydrogen på ett eller flere karboner av hydrokarbonstammen. Slike substituenter kan for eksempel innbefatte halogen, hydroksyl, alkylkarbonyloksy, arylkarbonyloksy, alkoksykarbonyloksy, aryloksykarbonyloksy, karboksylat, alkylkarbonyl, alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, alkyltiokarbonyl, alkoksyl, fosfat, fosfonat, fosfinat, cyano, amino (innbefattende alkylamino, dialkylamino, arylamino, diarylamino og alkylarylamino), acylamino (innbefattende alkylkarbonylamino, arylkarbonylamino, karbamoyl og ureido), amidino, imino, sulfhydryl, alkyltio, aryltio, tiokarboksylat, sulfater, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamid, nitro, trifluormetyl, cyano, azido, heterosyklyl, alkylaryl eller en aromatisk eller heteroaromatisk enhet. Det vil bli forstått av fagpersonen at enhetene substituert på hydrokarbonkjeden selv kan være substituert om passende. Sykloalkyler kan være ytterligere substituert, for eksempel med substituen-tene beskrevet ovenfor. En "alkylaryl"-enhet er en alkyl substituert med en aryl (for eksempel fenylmetyl (benzyl)). Uttrykket "alkyl" innbefatter også umettede alifatiske grupper som er analoge i lengde samt mulig substitusjon på alkylene beskrevet ovenfor, men som inneholder minst henholdsvis en dobbel eller trippel binding.

Uttrykket "aryl" som benyttet heri refererer til radikalet av arylgrupper innbefattende 5- og 6-leddete enkelring aromatiske grupper som kan innbefatte fra 0 til 4 heteroatomer, for eksempel benzen, pyrrol, furan, tiofen, imidazol, benzoksazol, benzotiazol, triazol, tetrazol, pyrazol, pyridin, pyrazin, pyridazin og pyrimidin og lignende. Arylgrupper innbefatter også polysykliske fuserte aromatiske grupper så som naftyl, kinolyl, indolyl og lignende. De arylgrupper som har heteroatomer i ringstrukturen kan også bli referert til som "arylheterosykliske forbindelser", "heteroaryler" eller "heteroaromatiske forbindelser". Den aromatiske ring kan være substituert ved en eller flere ringposisjoner med slike substituenter som beskrevet ovenfor, som for eksempel halogen, hydroksyl, alkoksy, alkylkarbonyloksy, arylkarbonyloksy, alkoksykarbonyloksy, aryloksykarbonyloksy, karboksylat, alkylkarbonyl, alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, alkyltiokarbonyl, fosfat, fosfonat, fosfinat, cyano, amino (innbefattende alkylamino, dialkylamino, arylamino, diarylamino og alkylarylamino), acylamino (innbefattende alkylkarbonylamino, arylkarbonylamino, karbamoyl og ureido), amidino, imino, sulfhydryl, alkyltio, aryltio, tiokarboksylat, sulfater, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamid, nitro, trifluormetyl, cyano, azido, heterosyklyl, alkylaryl eller en aromatisk eller heteroaromatisk enhet. Arylgrupper kan også være fuserte eller brobundet med alisykliske eller heterosykliske ringer som ikke er aromatiske for å danne en polysyklisk forbindelse (for eksempel tetralin).

Uttrykkene "alkenyl" og "alkynyl" refererer til umettede alifatiske grupper som er tilsvarende i lengde og mulig substitusjon til alkylene beskrevet ovenfor, men som inneholder minst henholdsvis en dobbel- eller trippelbinding. For eksempel angår oppfinnelsen cyano- og propargylgrupper.

Med mindre antallet karboner er angitt på annen måte betyr "lavere alkyl" som benyttet heri en alkylgruppe som definert ovenfor, men som har fra 1 til 10 karboner, mer foretrukket fra 1 til 6 karbonatomer i sin stammestruktur, enda mer foretrukket 1 til 3 karbonatomer i sin stammestruktur. Likeledes har "lavere alkenyl" og lavere alkynyl" lignende kjedelengder.

Uttrykkene "alkoksyalkyl", "polyaminoalkyl" og "tioalkok-syalkyl" refererer til alkylgrupper som beskrevet ovenfor, som ytterligere innbefatter oksygen-, nitrogen- eller svo-velatomer som erstatter ett eller flere karboner av hydrokarbonstammen, for eksempel oksygen-, nitrogen- og svovel-atomer.

Uttrykkene "polysyklyl" eller "polysyklisk radikal" refererer til radikalet av 2 eller flere sykliske ringer (for eksempel sykloalkyler, sykloalkenyler, sykloalkynyler, aryler og/eller heterosyklyler) hvor 2 eller flere karboner er felles for to tilstøtende ringer, for eksempel er ringene "fuserte ringer". Ringer som er bundet sammen via ikke-hosliggende atomer blir betegnet "brokoblete" ringer. Hver av ringene av den polysykliske forbindelse kan være substituert med slike substituenter som beskrevet ovenfor, som for eksempel halogen, hydroksyl, alkylkarbonyloksy, arylkarbonyloksy, arylkarbonyloksy, alkoksykarbonyloksy, aryloksykarbonyloksy, karboksylat, alkylkarbonyl, alkoksykarbonyl, aminokarbonyl, alkyltiokarbonyl, alkoksyl, fosfat, fosfonat, fosfinat, cyano, amino (innbefattende alkylamino, dialkylamino, arylamino, diarylamino og alkylarylamino), acylamino (innbefattende alkylkarbonylamino, arylkarbonylamino, karbamoyl og ureido), amidino, imino, sulfhydryl, alkyltio, aryltio, tiokarboksylat, sulfater, sulfonat, sulfamoyl, sulfonamido, nitro, trifluormetyl, cyano, azido, heterosyklyl, alkyl, alkylaryl eller en aromatisk eller heteroaromatisk enhet.

Uttrykket "heteroatom" som benyttet heri betyr ett atom av ethvert element annet enn karbon eller hydrogen. Foretrukne heteroatomer er nitrogen, oksygen, svovel og fosfor.

Uttrykket "aminosyrer" innbefatter naturlige og unaturlige forekommende aminosyrer funnet i proteiner så som glycin, alanin, valin, cystein, leucin, isoleucin, serin, treonin, metionin, glutaminsyre, asparaginsyre, glutamin, asparagin, lysin, arginin, prolin, histidin, fenylalanin, tyrosin og tryptofan. Aminosyreanaloger innbefatter aminosyrer med forlengede eller avkortede sidekjeder eller varianter av sidekjeder med passende funksjonelle grupper. Aminosyrer innbefatter også D- og L-stereoisomere av en aminosyre når strukturen av aminosyren tillater stereoisomere former. Uttrykket "dipeptid" innbefatter 2 eller flere aminosyrer bundet sammen. Fortrinnsvis er dipeptider to aminosyrer bundet via en peptidbinding. Spesielt foretrukne dipeptider innbefatter for eksempel alanin-alanin og glycin-alanin.

Det vil bemerkes at strukturen av enkelte av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter asymmetriske karbonatomer og opptrer således som rasemater og rasemiske blandinger, enkle enantiomere, diastereomere blandinger og individuelle diastereomere. Alle slike isomere former av disse forbindelser er uttrykkelig innbefattet i foreliggende oppfinnelse. Hvert sterogent karbon kan være av R-eller S-konfigurasjonen. Det vil følgelig bli forstått at isomerene som stammer fra slik asymmetri (for eksempel alle enantiomere og diastereomere) er innbefattet i omfanget av foreliggende oppfinnelse med mindre annet er angitt. Slike isomere kan bli fremskaffet i hovedsak i ren form ved klas-siske separasjonsteknikker og ved stereokjemisk kontrollert syntese.

Oppfinnelsen angår videre farmasøytiske sammensetninger for å behandle aktuelle sykdomstilstander i et pattedyr, for eksempel respiratoriske lidelser, (for eksempel astma, bronkitt, kronisk obstruktiv pulmonar lidelse og allergisk rinitt), nyresykdommer, gastrointestinale lidelser og øyelidelser. Den farmasøytiske sammensetning innbefatter en terapeutisk effektiv mengde av en forbindelse ifølge beskrevet ovenfor, og et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel. Det er underforstått at alle deazapurinene beskrevet ovenfor er innbefattet for terapeutisk behandling. Det er videre underforstått at deazapuriner ifølge oppfinnelsen kan bli brukt alene eller i kombinasjon med andre deazapuriner ifølge oppfinnelsen eller i kombinajson med ytterligere terapeutiske forbindelser så som for eksempel antibiotika, antiinflammatoriske eller an-tikreftmidler.

Uttrykket "antibiotikum" er gjenkjent innen faget og er ment å innbefatte slike substanser som fremstilles av voksende mikroorganismer og syntetiske derivater derav, som eliminerer eller inhiberer vekst av patogener og er selektiv toksiske mot patogener mens det gir minimale eller ingen skadelige effekter på det infiserte vertsindivid. Passende eksempler på antibiotika innbefatter, men er ikke begrenset til, hovedklassene av aminoglykosider, cefalospo-riner, kloramfenikoler, fuskidinsyrer, makrolider, penicil-liner, polymiksiner, tetrasykliner og streptomysiner.

Uttrykket "antiinflammatorisk" er innen faget gjenkjent og er ment å innbefatte slike midler som virker på kroppsmeka-nismer uten direkte å antagonisere det forårsakende middel for inflammasjonen så som glukokortikoider, aspirin, ibuprofen, NSAIDS, etc.

Uttrykket "antikreftmiddel" er gjenkjent innen faget, og er ment å innbefatte slike midler som minsker, fjerner eller forebygger vekst av kreftceller uten, fortrinnsvis på uhel-dig måte å påvirke andre fysiologiske funksjoner. Representative eksempler innbefatter cisplatin og syklofosfamid.

Når forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse blir administrert som farmasøytika til mennesker og dyr, kan de bli gitt som sådan eller som en farmasøytisk sammensetning inneholdende for eksempel 0,1 til 99,5 % (mer foretrukket 0,5 til 90 %) av aktiv bestanddel i kombinasjon med et far-masøytisk akseptabelt bæremiddel.

Uttrykket "farmasøytisk akseptabelt bæremiddel", som benyttet heri, betyr et farmasøytisk akseptabelt materiale, sammensetning eller vehikkel så som en væske eller et fast fyllstoff, fortynningsmiddel, eksipient, oppløsningsmiddel eller innkapslende materiale involvert i å bære eller transportere en forbindelse(r) ifølge foreliggende oppfinnelse inne i eller til individet slik at det kan utføre sin tiltenkte funksjon. Typisk blir slike forbindelser båret eller transportert fra et organ eller en del av kroppen til et annet organ eller del av kroppen. Hvert bæremiddel må være "akseptabelt" i den sammenheng at det er kompatibelt med de andre bestanddeler av formuleringen og ikke skadelig for pasienten. Noen eksempler på materialer som kan virke som farmasøytisk akseptable bæremidler innbefatter: sukre, så som laktose, glukose og sukrose; stivelser så som mais-stivelse og potetstivelse; cellulose og dets derivater så som natriumkarboksymetylcellulose, etylcellulose og cellu-loseacetat; forpulvret tragakant; malt; gelatin; talkum; eksipienter så som kokossmør og suppositoriumvoks; oljer så som peanøttolje, bomullsfrøolje, solsikkeolje, sesamolje, olivenolje, maisolje og soyabønneolje; glykoler så som propylenglykol; polyoler så som glycerin, sorbitol, mannitol og polyetylenglykol; estere så som etyloleat og etyllaurat; agar; buffrende midler så som magnesiumhydroksid og aluminiumhydroksid; algininsyre; pyrogenfritt vann; isotont fysiologisk saltvann; Ringers oppløsning; etylalkohol; fos-fatbufferoppløsninger og andre ikke-toksiske kompatible substanser som benyttes i farmasøytiske formuleringer.

Som angitt ovenfor kan visse utførelsesformer av foreliggende forbindelser inneholde en basisk funksjonell gruppe så som amino eller alkylamino, og er således i stand til å danne farmasøytisk akseptable salter med farmasøytisk akseptable syrer. Uttrykket "farmasøytisk akseptable salter" i denne sammenheng refererer til de relativt ikke-toksiske uorganiske og organiske syreaddisjonssalter av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse salter kan bli fremstilt in situ under sluttisoleringen og opprenskningen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, eller ved separat å omsette en renset forbindelse ifølge oppfinnelsen i sin frie baseform med en passende organisk eller uorganisk syre, og isolere saltet som således dannes. Representative salter innbefatter hydrobromid, hydroklorid, sulfat, bisul-fat, fosfat, nitrat, acetat, valerat, oleat, palmitat, stearat, laurat, benzoat, laktat, fosfat, tosylat, sitrat, maleat, fumarat, suksinat, tartrat, naftylat, mesylat, glu-koheptonat, laktobionat og laurylsulfonatsalter og lignende (Se for eksempel Berge et al., (1977) "Pharmaceutical Salts", J.Pharm.Sei. 66:1-19).

I andre tilfeller kan forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse inneholde en eller flere funksjonelle syregrup-per, og er således i stand til å danne farmasøytisk akseptable salter med farmasøytisk akseptable baser. Uttrykket "farmasøytisk akseptable salter", i disse tilfeller, refererer til de relativt ikke-toksiske, uorganiske og organiske baseaddisjonssalter av forbindelser ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse salter kan likeledes bli fremstilt in situ under sluttisoleringen og opprensningen av forbindelsene, eller ved separat å omsette den rensede forbindelse i sin frie syreform med en passende base så som hydroksidet, karbonatet eller bikarbonatet av et farmasøytisk akseptabelt metallkation med ammoniakk eller med et farmasøytisk akseptabelt organisk primært, sekundært eller tertiært amin. Representative alkali eller jordalkalinsalter innbefatter litium-, natrium-, kalium-, kalsium-, magnesium- og aluminiumsaltene og lignende. Representative organiske aminer som er anvendelige for fremstillingen av baseaddisjonssalter innbefatter etylamin, dietylamin, etylendiamin, etanolamin, dietanolamin, piperazin og lignende.

Uttrykket "farmasøytisk akseptable estere" refererer til de relativt ikke-toksiske, esterifiserte produkter av forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Disse estere kan bli fremstilt in situ under sluttisoleringen og opprenskningen av forbindelsene, eller ved separat å omsette den rensede forbindelse i sin frie syreform, eller hydroksyl med et passende esterifiserende middel. Karboksylsyrer kan bli omdannet til estere via behandling med en alkohol i nærvær av en katalysator. Hydroksylholdige derivater kan bli omdannet til estere via behandling med et esterifise-ringsmiddel så som alkanoylhalider. Uttrykket er videre ment å innbefatte lavere hydrokarbongrupper som er i stand til å bli solvatert under fysiologiske forhold, for eksempel alkylestere, metyl, etyl og propylestere. (Se for eksempel Berge et al., supra..)

Prodroger kan bli omdannet in vivo til de terapeutiske forbindelser ifølge oppfinnelsen (Se for eksempel R.B. Silverman, 1992 "The Organic Chemistry of Drug Design and Drug Action", Academic Press, kapittel 8). Slike prodroger kan bli brukt for å endre biofordelingen (for eksempel for å tillate forbindelser som typisk ikke ville gå inn i det reaktive setet hos proteasen), eller farmakokinetikker av den terapeutiske forbindelse. For eksempel kan en karboksylsyregruppe bli esterifisert, for eksempel med en metylgruppe eller en etylgruppe for å gi en ester. Når esteren administreres til et individ blir esteren spaltet, enzymatisk eller ikke-enzymatisk, reduktivt eller hydrolytisk for å gi den anioniske gruppe. En anionisk gruppe kan bli esterifisert med enheter (for eksempel acyloksymetylestere) som blir spaltet for å gi en intermediær forbindelse som derpå dekomponerer for å gi den aktiv forbindelse. I en annen utførelsesform er prodrogen en redusert form av et sulfat eller sulfonat, for eksempel en tiol, som blir oksidert in vivo til den terapeutiske forbindelse. Videre kan en anionisk enhet bli esterifisert til en gruppe som aktivt blir transportert in vivo, eller som selektivt blir tatt opp av måleorganer. Esteren kan bli valgt ut for å tillate spesifikk målretting av de terapeutiske enheter til spesielle reaktive seter som beskrevet nedenfor for bærerenheter.

Fuktemidler, emulgatorer og smøremidler, så som natriumlaurylsulfat og magnesiumstearat så vel som fargemidler, frigjøringsmidler, belegningsmidler, søtestoff, smaksstoff og parfymerende midler, preservativer og antioksidanter kan også være til stede i sammensetningene.

Eksempler på farmasøytisk akseptable antioksidanter innbefatter vannoppløselige antioksidanter så som askorbinsyre, cysteinhydroklorid, natriumbisulfat, natriummetabisulfitt, natriumsulfitt og lignende; oljeoppløselige antioksidanter så som askorbylpalmitat, butylert hydroksyanisol (BHA), butylert hydroksytoluen (BHT), lecitin, propylgallat, alfatokoferol og lignende; og metallchelaterende midler så som sitronsyre, etylendiamin, tetraeddiksyre (EDTA), sorbitol, vinsyre, fosforsyre og lignende.

Formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter slike som er egnet for oral, nasal, topisk, transdermal, bukkal, sublingual, rektal, vaginal og/eller parenteral administrasjon. Formuleringene kan passende bli presentert i enhetsdoseform, og kan bli fremstilt ved enhver fremgangsmåte som er kjent innen det farmakologiske området. Mengden aktiv bestanddel som kan bli kombinert med et bæremateriale for å danne en enkel doseringsform vil generelt være den mengde av forbindelsen som gir en terapeutisk effekt. Generelt vil av 100 % av denne mengde ligge fra omkring 1 % til omkring 99 % av aktiv bestanddel, fortrinnsvis omkring 5 % til omkring 70 %, mest foretrukket fra omkring 10 % til omkring 30 %.

Fremgangsmåter for å fremstille disse formuleringer eller sammensetninger innbefatter trinnet å bringe i assosiasjon en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse med bæremateriale og, eventuelt ett eller flere hjelpebestanddeler. Generelt blir formuleringene fremstilt ved uniformt og nært å bringe i assosiasjon en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse med flytende bærematerialer eller finfordelte faste bærematerialer eller begge deler, og så om nødvendig forme produktet.

Formuleringer ifølge oppfinnelsen som er egnet for oral administrasjon kan være i form av kapsler, poser, piller,

tabletter, sugetabletter (som bruker en smakssatt basis, vanligvis sukkrose og akasie eller tragakant), pulvere, granuler eller som en oppløsning eller en suspensjon i en vandig eller ikke-vandig væske, eller som en olje-i-vann eller vann-i-olje flytende emulsjon, eller som en eliksir eller sirup, eller som pastiller ved å bruke en inert base så som gelatin og glyserin, eller sukkrose og akasie) og/eller som munnskyll og lignende, hvor hver inneholder en på forhånd bestemt mengde av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse som en aktiv bestanddel. En forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse kan også bli administrert som en bolus, latverge eller pasta.

I faste doseringsformer ifølge oppfinnelsen for oral administrasjon (kapsler, tabletter, piller, drageér, pulvere, granuler og lignende) blir den aktive ingrediensen blandet med ett eller flere farmasøytisk akseptable bæremidler så som natriumcitrat eller dikalsiumfosfat og/eller enhver av de følgende: fyllmaterialer eller ekstendere så som stivelser, laktose, sukkrose, glukose, mannitol og/eller silikonsyre; bindemidler så som for eksempel karboksyme-tylcellulose, alginater, gelatin, polyvinylpyrrolidon, sukkrose og/eller akasie; fuktemidler så som glyserol; disintegrasjonsmidler så som agar-agar, kalsiumkarbonat, potet eller tapiokastivelse, algininsyre, visse silikater og natriumkarbonat; oppløsningsretarderende midler så som parafin; absorpsjonsakseleratorer så som kvaternære ammo-niumforbindelser; fuktemidler så som for eksempel cetylal-kohol og glyserolmonostearat; absorbsjonsmidler så som kaolin- og bentonittleire; smøremidler så som talkum, kal-siumstearat, magnesiumstearat, faste polyetylenglykoler, natriumlaurylsulfat og blandinger derav og fargestoffer. I tilfelle med kapsler, tabletter og piller kan de farma-søytiske sammensetninger også omfatte buffrende midler. Faste sammensetninger av lignende type kan også bli benyttet som fyllmidler i myke og harde fylte gelatinkapsler ved å bruke slike eksipienter som laktose eller melkesukre, så vel som polyetylenglykoler med høy molekylvekt og lignende.

En tablett kan bli laget ved kompresjon eller støping, eventuelt med ett eller flere hjelpebestanddeler. Sammen-pressede tabletter kan bli fremstilt ved å bruke bindemid-del (for eksempel gelatin eller hydroksypropylmetylcellulose), smøremiddel, inert fortynningsmiddel, preservativ, disintegrant (for eksempel natriumstivelseglykolat eller fornettet natriumkarboksymetylcellulose), overflateaktivt eller dispergerende middel. Støpte tabletter kan bli laget ved å støpe i en passende maskin en blanding av den forpulvrete forbindelse fuktet med et inert flytende fortynningsmiddel.

Tablettene og andre faste doseringsformer av de farmasøy-tiske sammensetningene ifølge oppfinnelsen, så som drageér, kapsler, piller og granuler kan eventuelt bli tilført hakk eller fremstilt med belegg og skall så som enteriske belegg og andre belegg som er velkjent innen den farmasøytiske formuleringsteknikk. De kan også bli formulert for å gi sakte eller kontrollert frigjøring av den aktive bestanddel deri ved å bruke, for eksempel hydroksypropylmetylcellulose i varierende mengder for å gi den ønskede

frigjøringsprofil, andre polymermatriser, liposomer og/eller mikrokuler. De kan bli sterilisert ved for eksempel filtrering gjennom et bakterietilbakeholdende filter eller ved å inkorporere steriliserende midler i form av sterile faste sammensetninger som kan bli oppløst i sterilt vann, eller et eller annet sterilt injiserbart medium umiddelbart før bruk. Disse sammensetninger kan også eventuelt inneholde opakifiserende midler og kan være av en sammensetning slik at de frigjør den aktive bestanddel (er) alene eller foretrukket i en viss del av magetarm-kanalen, eventuelt på en forsinket måte. Eksempler på inkluderende sammensetninger som kan bli brukt innbefatter polymere substanser og vokstyper. Den aktive bestanddel kan også være i mikroinnkapslet form, om passende med en eller flere av de ovenfor beskrevne eksipienter.

Flytende doseringsformer for oral administrasjon av forbindelsene ifølge oppfinnelsen innbefatter farmasøytisk akseptable emulsjoner, mikroemulsjoner, oppløsninger, suspensjoner, syruper og eliksirer. I tillegg til den aktive bestanddel kan flytende doseringsformer inneholde inerte fortynningsmidler som vanligvis benyttes innen faget så som for eksempel vann eller andre oppløsningsmidler, solu-biliseringsmidler og emulgatorer så som etylalkohol, isopropylalkohol, etylkarbonat, etylacetat, benzylalkohol, benzylbenzoat, propylenglykol, 1,3-butylenglykol, oljer (spesielt bomull-, jordnøtt-, mais-, korn-, oliven-, lakser- og sesamoljer), glyserol, tetrahydrofurylalkohol, polyetylenglykoler og fettsyreestere av sorbitan samt blandinger derav.

Ved siden av inerte fortynningsmidler kan de orale sammensetninger også innbefatte adjuvanter så som fuktemidler, emulgerende og suspenderende midler, søtningsstoff, smaks-stoffer, fargestoffer, parfymerende og preserverende midler.

Suspensjoner kan i tillegg til de aktive forbindelser inneholde suspenderende midler så som for eksempel etoksy-lerte isostearylalkoholer, polyoksyetylensorbitol og sor-bitanestere, mikrokrystallinsk cellulose, aluminiummeta-hydroksid, bentonitt, agar-agar og tragakant, samt blandinger derav.

Formuleringer av de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen for rektal eller vaginal administrasjon kan bli presentert som et suppositorium som kan bli fremstilt ved å blande en eller flere av forbindelsene ifølge oppfinnelsen med en eller flere egnede ikke-irriterende eksipienter eller bæremidler omfattende, for eksempel kokos-smør, polyetylenglykol, en suppositoriumvoks eller et salisylat, og som er fast ved romtemperatur, men flytende ved kroppstemperatur, og følgelig vil smelte i rektum eller vagina og frigjøre den aktive forbindelse.

Formuleringer ifølge foreliggende oppfinnelse som er egnet for vaginal administrasjon innbefatter også pessarer, tam-ponger, kremer, geler, pasta, skum eller sprayformuleringer inneholdende slike bæremidler som er kjent innen faget til å være passende.

Doseringsformer for den topiske eller transdermale administrasjonen av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse innbefatter pulvere, sprayer, salver, pastaer, kremer, lotion, geler, oppløsninger, plastere og inhalerende stoffer. Den aktive forbindelse kan bli blandet under sterile betingelser med et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel, og med ethvert preservativ, buffere, drivmidler som kan være nødvendig.

Salvene, pastaene, kremene og gelene kan inneholde, i tillegg til en aktiv forbindelse ifølge foreliggende oppfin-neise eksipienter så som animalsk og vegetabilsk fett, oljer, voks, parafiner, stivelse, tragakant, cellulosede-rivater, polyetylenglykoler, silikoner, bentonitter, silikonsyre, talkum og sinkoksid eller blandinger derav.

Pulvere og sprayer kan inneholde, i tillegg til en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse eksipienter så som laktose, talkum, silisiumsyre, aluminiumhydroksid, kalsi-umsilikater og polyamidpulver eller blandinger av disse substanser. Sprayer kan i tillegg inneholde vanlige drivmidler så som klorfluorhydrokarboner og flyktige usubstituerte hydrokarboner så som butan og propan.

Transdermale plastere har den ytterligere fordel å gi kontrollert avlevering av en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse til kroppen. Slike doseringsformer kan bli laget ved å løse opp eller dispergere forbindelsen i det passende medium. Absorpsjonsøkende midler kan også bli brukt for å øke strømmen av forbindelsen over huden. Graden av slik strøm kan bli kontrollert ved enten å til-veiebringe en hastighetskontrollerende membran eller dispergere den aktive forbindelse i en polymermatrise eller gel.

Oftalmiske formuleringer, øyesalver, pulvere, oppløsninger og lignende blir også påtenkt som å ligge innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse. Fortrinnsvis er det farmasøytiske preparat en oftalmisk formulering (for eksempel en periokulær, retrobulær eller intraokulær injeksjonsformulering, en systemisk formulering eller en kirurgisk fuktende formulering).

De oftalmiske formuleringer kan innbefatte en eller flere deazapuriner og en farmasøytisk akseptabel vehikkel. Forskjellige typer vehikler kan bli brukt. Vehiklene vil generelt være vandige av natur. Vandige oppløsninger er generelt foretrukket basert på hensynet til formulering så vel som en pasients mulighet til lett å administrere slike sammensetninger ved hjelp av å innstillere en eller to dråper av oppløsningene i det angrepne øyet. Imidlertid kan deazapurinene ifølge foreliggende oppfinnelse også lett bli inkorporert i andre typer sammensetninger så som suspensjoner, viskøse eller semiviskøse geler eller andre typer faste eller semifaste sammensetninger. De oftalmiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse kan også innbefatte forskjellige andre bestanddeler så som buffere, preservativer, kooppløsninger og viskositetsdannende midler.

Et passende buffersystem (for eksempel natriumfosfat, nat-riumacetat eller natriumborat) kan bli lagt til for å forhindre pH-drift under lagringsbetingelser.

Oftalmiske produkter blir typisk pakket i multidoseform. Preservativer er således nødvendige for å forhindre mikro-biell forurensning under bruk. Passende preservativer innbefatter: benzalkoniumklorid, timerosal, klorobutanol, metylparaben, propylparaben, fenyletylalkohol, dinatrium-edetat, sorbinsyre, polykvaternium-1 eller andre midler som er kjent for fagpersonen. Slike preservativer blir typisk benyttet ved et nivå på fra 0,001 til 1,0 % vekt/volum ("% w/v").

Når forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse blir administrert under intraokulære kirurgiske prosedyrer så som via retrobulbar eller periokular injeksjon og intraokular perfusjon eller injeksjon er anvendelsen av balanserte fuktende saltoppløsninger som vehikler foretrukket. BSS® Sterile Irrigating Solution and BSS Plus® Sterile Intra-ocular Irrigating Solution (Alcon Laboratories, Inc., Fort Worth, Texas, USA) er eksempler på fysiologisk balanserte intraokulære fuktende oppløsninger. Sistnevnte type opp-løsning er beskrevet i US patent nr. 4.550.022 (Garabedian, et al.,), hvis hele innhold er inkorporert herved i foreliggende beskrivelse per referanse. Retrobulbar og periocular injeksjon er kjent for fagmannen og er beskrevet i flere publikasjoner, inkludert for eksempel Ophthalmic Surgery: Principles of Practice, Ed., G. L. Spaeth, W.B. Sanders Co., Philadelphia, Pa., USA, s. 85-87 (1980).

Som indikert ovenfor er anvendelsen av deazapuriner for å forhindre eller redusere skade på retinalt og optisk ner-vehodevev ved det cellulære nivå et spesielt viktig aspekt av en utførelsesform av oppfinnelsen. Oftalmiske tilstander som kan bli behandlet, innbefatter, men er ikke begrenset til, retinopatier, makulær degenerering, okulær iskemi, grå stær og ødeleggelse assosiert med skade på oftalmisk vev så som iskemi reperfusjonsskader, fotokjemiske skader og skader assosiert med okulær kirurgi, spesielt skader på retina eller det optiske nervehode ved eksponering til lys eller kirurgiske instrumenter. Forbindelsene kan også bli brukt som et adjunkt til oftalmisk kirurgi, så som ved vitreal eller subkonjunktival injeksjon eller oftalmisk kirurgi. Forbindelsene kan bli brukt for akutt behandling av temporære tilstander eller kan bli administrert kronisk, spesielt i tilfelle med degenerativ sykdom. Forbindelsene kan også bli brukt profylaktisk, spesielt før okulær kirurgi eller ikke-invasive oftalmiske prosedyrer, eller andre typer kirurgi.

Farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, som er egnet for parenteral administrasjon omfatter en eller flere forbindelser ifølge oppfinnelsen, i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable, sterile, isotone, vandige eller ikke-vandige oppløsninger, dispersjoner, suspensjoner eller emulsjoner, eller sterile pulvere som kan bli rekonstituert til sterile, injiserbare oppløsninger eller dispersjoner like før bruk som kan inneholde antioksidanter, buffere, bakteriostatika, opp-løselige materialer som gjør formuleringen isoton med blodet hos den tiltenkte mottaker, eller suspenderende eller fortykkende midler.

Eksempler på egnede, vandige og ikke-vandige bæremidler som kan bli benyttet i de farmasøytiske sammensetninger ifølge oppfinnelsen, innbefatter vann, etanol, polyoler (så som glyserol, propylenglykol, polyetylenglykol og lignende) og egnede blandinger derav, vegetabilske oljer, så som olivenolje, og injiserbare organiske estere, så som etyloleat. Passende fluiditet kan bli opprettholdt for eksempel med bruk av belegningsmaterialer, så som lecitin, ved opprettholdelse av den nødvendige partikkelstørrelse i tilfelle med dispersjoner og ved bruken av overflateaktive stoffer.

Disse sammensetninger kan også inneholde adjuvanter, så som preserveringsmidler, fuktemidler, emulgeringsmidler og dispergerende midler. Hemming av virkningen av mikroorganismer kan bli sikret ved å innbefatte forskjellige anti-bakterielle og antisoppmidler, for eksempel paraben, klor-butanol, fenolsorbinsyre og lignende. Det kan også være ønskelig å innbefatte isotone midler, så som sukkere, nat-riumklorid og lignende, i sammensetningene. I tillegg kan forlenget absorpsjon av den injiserbare, farmasøytiske form bli fremskaffet ved å innbefatte midler som forsinker absorpsjon, så som aluminiummonostearat og gelatin.

I enkelte tilfeller, for å forlenge effekten av medikamentet, er det ønskelig å forsinke absorpsjonen av medikamentet fra subkutan eller intramuskulær injeksjon. Dette kan bli oppnådd ved bruken av en flytende suspensjon av krystallinsk eller amorf materiale som har dårlig vannoppløse-lighet. Absorpsjonsgraden av medikamentet avhenger så av dens oppløsningsgrad som i sin tur kan avhenge av krys-tallstørrelse og krystallinsk form. Alternativt blir forsinket absorpsjon av en parenteralt administrert medika-mentform oppnådd ved å oppløse eller suspendere medikamentet i en oljevehikkel.

Injiserbare depotformer blir dannet ved å forme mikroinn-kapslende matriser av de aktuelle forbindelser i biodegra-derbare polymerer, så som polylaktid-polyglykolid. Avhengig av forholdet mellom medikament og polymer og naturen til den spesielle polymer som er anvendt, kan hastigheten av medikamentfrigjøring bli kontrollert. Eksempler på andre bionedbrytbare polymerer innbefatter poly(ortoestere) og poly(anhydrider). Injiserbare depotformuleringer blir også fremstilt ved å fange inn medikamentet i liposomer eller mikroemulsjoner som er kompatible med kroppsvev.

Preparatene ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bli gitt oralt, parenteralt, topisk eller rektalt. De blir selvføl-gelig gitt i former som er egnet for hver administrasjons-rute. For eksempel blir de administrert i tablett- eller kapselform ved injeksjon, inhalering, øyelotion, salve, suppositorium etc, administrasjon ved injeksjon, infusjon eller inhalering, topisk med lotion eller salve og rektalt med suppositorier. Oral administrasjon er foretrukket.

Uttrykkene "parenteral administrasjon" og "administrert parenteralt" som brukt heri, betyr administrasjonsmåter som er forskjellige fra enteral og topisk administrasjon, vanligvis ved injeksjon og innbefatter uten begrensning intravenøs, intramuskulær, intraarteriell, intratekal, intrakapsulær, intraorbital, intrakardial, intradermal, intraperiotoneal, transtrakeell, subkutan, subkutikulær, intraartikulær, subkapsulær, subaraknoid, intraspinal og intrasternal injeksjon samt infusjon.

Uttrykkene "systemisk administrasjon", "administrert systemisk", "perifer administrasjon" og "administrert peri-fert" som benyttet heri, betyr administrasjonen av en forbindelse, medikament eller annet materiale annet enn direkte inn i sentralnervesystemet slik at det trenger inn i pasientens system og er således utsatt for metabolisme og andre lignende prosesser, for eksempel subkutan administrasjon .

Disse forbindelser kan bli administrert til mennesker og andre dyr for terapi med enhver passende administrasjons-rute, innbefattende oralt, nasalt, som ved for eksempel en spray, reaktalt, intravaginalt, parenteralt, intracister-nalt og topisk, som med pulvere, salver eller dråper, innbefattende bukalt og sublingualt.

Uavhengig av administrasjonsruten som velges blir forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, som kan bli brukt i en passende hydrert form, og/eller de farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, formulert til farmasøytisk akseptable doseringsformer ved konvensjonelle metoder som er kjent for fagpersonen.

Faktiske doseringsnivåer av de aktive bestanddeler i de farmasøytiske sammensetninger ifølge foreliggende oppfinnelse, kan bli variert for å opprettholde en mengde av den aktive bestanddel som er effektiv for å oppnå den ønskede, terapeutiske respons for en spesiell pasient, sammensetning og administrasjonsmåte uten å være toksisk for pasienten.

Det utvalgte doseringsnivå vil avhenge av en mengde faktorer, innbefattende aktiviteten av den spesielle forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, som benyttes, eller esteren, saltet eller amidet derav, administrasjonsruten, tiden for administrasjon, ekskresjonshastigheten av den spesielle forbindelse som blir benyttet, behandlingsvarig-heten, andre medikamenter, forbindelser og/eller materialer som benyttes i kombinasjon med den spesielle forbindelse som benyttes, alder, kjønn, vekt, tilstand, generell helse og tidligere medisinsk historie for pasienten som blir behandlet og lignende faktorer som er velkjent innen det medisinske området.

En lege eller veterinær som har vanlig kjennskap til faget kan lett bestemme og skrive ut den effektive mengde av den farmasøytiske sammensetning som er nødvendig. For eksempel kunne legen eller veterinæren starte doser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, benyttet i den farmasøytiske sammensetning ved nivåer som er lavere enn det som er nød-vendig for å oppnå den ønskede, terapeutiske effekt og gradvis øke doseringen inntil den ønskede effekt blir oppnådd.

Generelt vil en passende daglig dose av en forbindelse ifølge oppfinnelsen, være den mengde av forbindelsen som er den laveste dose som er effektiv for å gi en terapeutisk effekt. En slik effektiv dose vil generelt avhenge av faktorene som beskrevet ovenfor. Generelt vil intravenøse og subkutane doser av forbindelsen ifølge foreliggende oppfinnelse, for en pasient når de benyttes for den angitte analgesiske effekt, ligge i området fra omkring 0,0001 til omkring 200 mg pr kg kroppsvekt pr dag, mer foretrukket fra omkring 0,01 til omkring 150 mg pr kg pr dag, og enda mer foretrukket fra omkring 0,2 til omkring 140 mg pr kg pr dag.

Om ønsket, kan den effektive daglige dose av den aktive forbindelse bli administrert som to, tre, fire, fem, seks eller flere subdoser administrert separat ved passende in-tervaller gjennom dagen, eventuelt i enhetsdoseform.

Selv om det er mulig for en forbindelse ifølge foreliggende oppfinnelse, å bli administrert alene, er det foretrukket å administrere forbindelsen som en farmasøytisk sammensetning.

Foreliggende oppfinnelse angår også pakkede farmasøytiske sammensetninger for å behandle aktuelle sykdomstilstander, for eksempel uønsket øket adenosinreseptoraktivitet i et pattedyr. De pakkede farmasøytiske sammensetninger innbefatter en beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av minst ett deazapurin som beskrevet ovenfor samt instruksjoner for å bruke deazapurinet for å behandle den deazapurinresponsive tilstand i et pattedyr. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen, kan bli fremstilt ved å bruke standard fremgangsmåter for organisk syntese. Forbindelsene kan bli renset med revers fase HPLC, kromatografi, rekrystallisering etc. og deres struktur bekreftet med massespektral analyse, elementæranalyse, IR-og/eller NMR-spektroskopi.

Typisk blir syntese av intermediatene så vel som deazapurinene ifølge oppfinnelsen, utført i oppløsning. Tilset-ningene og fjerningen av en eller flere beskyttende grupper blir også typisk utført og er kjent for fagpersonen. Typiske, syntetiske skjemaer for fremstillingen av deaza-purinintermediatene ifølge oppfinnelsen, er skissert nedenfor i skjema 1.

I en annen utførelsesform av forbindelsen har forbindelsen strukturen:

I en utførelsesform av den farmasøytiske sammensetning er nevnte terapeutisk effektive mengde effektiv til å behandle en respiratorisk lidelse eller en fordøyelseskanallidelse.

I en annen utførelsesform av den farmasøytiske sammensetning er nevnte gastrointestinale lidelse diaré.

I en annen utførelsesform av den farmasøytiske sammensetning er nevnte respiratoriske lidelse astma, allergisk rhinitt eller kronisk obstruktiv pulmonar sykdom.

I en annen utførelsesform av den farmasøytiske sammensetning er nevnte farmasøytiske sammensetning en oftalmisk formulering.

I en annen utførelsesform av den farmasøytiske sammensetning er den farmasøytiske sammensetning en periokular, retrobulbar eller intraokkulær injeksjonsformulering.

I enda en annen utførelsesform av den farmasøytiske sammensetning er nevnte farmasøytiske sammensetning en systemisk formulering.

I en ytterligere utførelsesform av det farmasøytiske preparat er nevnte farmasøytiske sammensetning en kirurgisk besprøytningsoppløsning.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en pakket farma-søytisk sammensetning for å behandle en sykdom assosiert med Ai adenosinreseptor i et individ omfattende: (a) en beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av en adenosin Ai-spesifikk forbindelse, og (b) instruksjoner for å bruke nevnte forbindelse for å behandle nevnte sykdom i et individ.

Som benyttet heri betyr "en forbindelse er Ai-selektiv" at en forbindelse har en bindingskonstant til adenosin Al-reseptor på minst ti ganger høyere enn den til adenosin A2a, A2b eller A3.

Oppfinnelsen blir ytterligere illustrert av de følgende eksempler. Det bør bli forstått at modellene som benyttes gjennom eksemplene er aksepterte modeller og at påvisningen av effektivitet i disse modeller er prediktive for effektivitet i mennesker.

Foreliggende oppfinnelse vil bli bedre forstått fra de eksperimentelle detaljer som følger. Imidlertid vil fagpersonen lett forstå at de angitte metoder og resultater som er beskrevet kun er illustratoriske for oppfinnelsen.

EKSPERIMENTELLE DETALJER

Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan bli fremstilt ved å bruke standard metoder for organisk syntese. Forbindelsene kan bli renset med reversfase HPLC, kromatografi, rekrystallisering etc. og deres strukturer bekreftet med massespektral analyse, elementæranalyse, IR- og/eller NMR-spektroskopi.

Typisk blir syntese av intermediatene så vel som forbindelsene ifølge oppfinnelsen, utført i oppløsning. Tilsetningen og fjerningen av en eller flere beskyttende grupper er også typisk praksis for fagpersonen.

Generelt kan et beskyttet 2-amino-3-cyano-pyrrol bli behandlet med et acylhalid for å danne et karboksyamido-3-cyano-pyrrol som kan bli behandlet med sur metanol for å utføre ringlukning til pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on (Muller, CE. et al. J. Med. Chem. 40: 4396 (1997)). Fjerning av den pyrrolobeskyttende gruppe fulgt av behandling med et klorineringsmiddel, for eksempel fosfor oksyklorid, ga substituerte eller usubstituerte 4-klor-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidiner. Behandling av klorpyrimidinet med aminer ga 7-deazapuriner.

For eksempel ble et N-(1-dl-fenyletyl)-2-amino-3-cyano-pyrrol behandlet med et acylhalid i pyridin og diklormetan. Det resulterende N-(1-dl-fenyletyl)-2-fenylkarboksyamido-3-cyano-pyrrol ble behandlet med en 10:1-blanding av metanol/svovelsyre for å utføre ringlukning, noe som resulterte i et dl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. Fjerning av fenyletylgruppen ved behandling av pyrimidinet med polyfosforsyre (PPA) fulgt av P0C13 ga et nøkkelinter-mediat, 4-klor-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. Videre behandling av 4-klor-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidinet med forskjellige aminer gir forbindelser opplistet i tabell 1. Transesterifisering og alkylering av etylcyanoacetat med et a-haloketon gir en ketometylester. Beskyttelse av ketonet fulgt av behandling med et amidin (for eksempel alkyl, aryl eller alkylaryl) hydroklorid ga det resulterende ke-talbeskyttede pyrimidin. Fjerning av den beskyttende gruppe fulgt av syklisering og behandling med fosforholdig oksyklorid ga kloridintermediatet som kunne bli ytterligere behandlet med et amin for å gi et amin 6-substituert pyrrol. Videre kan alkylering av pyrrolnitrogenet bli ut-ført under betingelser som er kjent innen faget.

Kondensering av malononitril og et overskudd av et keton fulgt av bromering av produktet gir en blanding av et utgangsmateriale, monobrominerte og dibrominerte produkter som behandles med et alkylamin, arylamin eller alkylaryla-min. Det resulterende aminprodukt acyleres med et syreklord og det monoacylerte pyrrol sykliseres i nærvær av syre for å gi det pyrrimidin. Den pyrrolbeskyttende gruppe fjernes med polyfosforsyre og behandles med fosforholdig oksyklorid for å gi et klorinert produkt. Det klorinerte pyrrol kan derpå bli behandlet med et amin for å gi et amino 5-substituert pyrrol. Alkylering av pyrrolnitrogenet kan bli oppnådd under betingelser kjent innen faget.

Spesiell fremstilling av 6- metylpyrrolopyrimidiner Nøkkelreaksjonen mot 6-metylpyrrolopyrimidiner var cyklisering av et cyanoacetat med benzamidin til et pyrimidin. Det ble antatt at metylcyanoacetat ville cyklisere mer effektivt med benzamidin til et pyrimidin enn den tilsvarende etylester. Følgelig da transesterifisering og alkylering av etylcyanoacetat ved nærvær av NaOMe og et overskudd av en a-haloacetylenhet, for eksempel kloraceton, den ønskede metylester i 79 % utbytte. Ketoesteren ble dannet som acetalen i 81 % utbytte. En ny cykliseringsmetode til pyrimidinet ble oppnådd med et amidinhydroklorid, for eksempel benzamidinhydroklorid, med 2 ekvivalentdeler av DBU for å gi forbindelsen i 54 % isolert utbytte. Denne metode for-bedrer utbyttet fra 20 % ved å bruke de publiserte betingelser, som utnytter NaOMe under cykliseringen med guanidin. Cyklisering til pyrrolpyrimidin ble oppnådd via deblok-kering av acetalet i vandig HC1 i 78 % utbytte. Omsetning av med fosforoksyklorid ved tilbakeløps temperatur ga det tilsvarende 4-klorderivat. Kobling med trans-4-aminocykloheksanol i dimetylsulfoksid ved 135 °C ga produktet i 57 %. Fagpersonen vil forstå at valget av reagenser muliggjør stor fleksibilitet ved valg av den ønskede substituent R5.

Spesiell fremstilling av 5- metylpyrrolopyrimidiner

Knoevenagelkondensering av malononitril samt et overskudd av keton, for eksempel aceton ved koking under tilbakeløp i benzen ga 8 i 50 % utbytte etter destillering. Brominering av 8 med N-bromsuksinimid ved nærvær av benzoylperoksid i kloroform ga en blanding av utgangsmateriale, mono- og dibrominerte produkter (5/90/5) etter destillering (70 %). Blandingen ble omsatt med et a-metylalkylamin eller a-metylarylamin, for eksempel a-metylbenzylamin, for å gi aminopyrrolet. Etter passering gjennom en kort silikagel kolonne ble det delvis rensede amin (31 % utbytte) acylert med et syreklorid, for eksempel benzoylklorid for å gi mono- og diacylerte pyrroler, som ble separert med flash kromatografi. Sur hydrolyse av det disubstituerte pyrrol ga et kombinert utbytte på 29 % for acylpyrrolet. Cyklisering ved nærvær av konsentrert svovelsyre og DMF ga (23 %), som ble deblokkert med polyfosforsyre. Omsetning med fosforoksyklorid ved tilbakeløps temperatur ga det tilsvarende 4-klorderivat. Kobling med trans-4-aminocykloheksanol i dimetylsulfoksid ved 135 °C den aktuelle forbindelsen i 30 %. Fagpersonen vil forstå at valg av reagenser muliggjør stor fleksibilitet.

Alternativ synteserute til 5- metylpyrrolopyrimidiner

Denne alternative rute til de aktuelle pyrroler, 5-metylpyrrolopyrimidiner, involverer transesterifisering og al-kyling av etylcyanoacetat. Kondensering av med benzamidinhydroklorid med 2 ekvivalentdeler DBU gir pyrimidinet. Cyklisering til pyrrolpyrimidinet vil bli oppnådd via deblok-kering av acetalet i vandig HC1. Omsetning av forbindelsen med fosforoksyklorid ved tilbakeløpstemperatur ga det tilsvarende 4-klorderivat. Kobling med trans-4-aminocykloheksanol i dimetylsulfoksid ved 135 °C gir sluttforbindelsen. Denne prosedyre reduserer antallet syntesereaksjoner til målforbindelsen fra 9 til 4 trinn. Videre blir utbyttet dramatisk forbedret. Igjen vil fagpersonen forstå at valg av reagenser muliggjør stor fleksibilitet.

Oppfinnelsen er videre illustrert av de følgende eksempler og bør bli forstått at modellene brukt gjennom eksemplene er aksepterte modeller og at demonstrasjonen av effektivitet i disse modeller er prediktive for effektivitet i mennesker.

Eksemplifisering

Fremstilling 1:

En modifisering av alkyleringsmetoden til Seela og Lupke ble benyttet.<1> Til en iskald (0 °C) oppløsning av etylcyanoacetat (6,58 g, 58,1 mmol) i MeOH (20 ml) ble det sakte tilsatt en oppløsning av NaOMe (25 % vekt/volum; 58,1 mmol). Etter 10 minutter ble kloraceton (5 ml; 62,8 mmol) sakte tilsatt. Etter 4 timer ble oppløsningsmidlet fjernet. Den brune olje ble fortynnet EtOAc (100 ml) og vasket med H20 (100 ml). Den organiske fraksjon ble tørket, filtrert og konsentrert til en brun olje (7,79 g; 79 %). Oljen (3)

(skjema IV) var en blanding av metyl/etylesterprodukter (9/1), og ble brukt uten ytterligere opprensning. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 6_4,24 (q, J = 7,2 Hz, OCH2) , 3,91 (dd,

1H, J = 7,2, 7,0 Hz, CH) , 3,62 (s, 3H, OCH3) , 3,42 (dd, 1H, J = 15,0, 7,1 Hz, 1 x CH2); 3,02 (dd, 1H, J = 15,0, 7,0 Hz, 1 x CH2); 2,44 (s, 3H, CH3) , 1,26 (t, J = 7,1 Hz, ester-CH3) .

^eela, F.; Lupke, U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469.

Fremstilling 2:

Prosedyren til Seela og Liipke ble brukt.<1> Således ga beskyttelse av ketonet; 5,0 g, 32,2 mmol) med etylenglykol (4 ml, 64,4 mmol) ved nærvær av TsOH (100 mg) som en olje

(skjema IV; 5,2 g, 81,0 ) etter flash kromatografi (Si02; 3/7 EtOAc/heks, Rf 0,35). Inneholder fremdeles "5 % etylester: <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_4,24 (q, J = 7,2 Hz, OCH2) , 3,98 (s, 4H, 2 x acetal-CH2) , 3,79 (s, 3H, OCH3) , 3,62 (dd, 1H, J = 7,2, 7,0 Hz, CH) , 2,48 (dd, 1H, J = 15,0, 7,1 Hz, 1 x CH2), 2,32 (dd, 1H, J = 15,0, 7,0 Hz, 1 x CH2) ; 1,35 (s, 3H, CH3) , 1,26 (t, J = 7,1 Hz, ester-CH3) ; MS (ES):200,1 (M"+l).

<1>Seela, F.; Lupke, U. Chem. Ber. 1977, 110, 1462-1469.

Fremstilling 3:

En oppløsning av acetal 1 g, 5,02 mmol), benzamidin (786 mg, 5,02 mmol), og DBU (1,5 ml, 10,04 mmol) i tørr DMF (15 ml) ble oppvarmet til 85 °C i 15 timer. Blandingen ble fortynnet med CHC13 (30 ml) og vasket med 0,5 N NaOH (10 ml) og H20 (20 ml). Den organiske fraksjon ble tørket, filtrert og konsentrert til en brun olje. Flash kromatografi (Si02; 1/9 EtOAc/CH2Cl2, Rf 0,35) ble forsøkt, men materiale krystalliserte på kolonnen. Silikagelen ble vasket med MeOH. Fraksjoner inneholdende produktet (5) (skjema IV) ble konsentrert og brukt uten ytterligere opprensning (783 mg, 54,3 %) : <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 8, 24 (m, 2H, Ar-H) , 7,45 (m, 3H, Ar-H), 5,24 (br s, 2H, NH2) , 3,98 (s, 4H, 2 x acetal-CH2), 3,60-3,15 (m, 2H, CH2) , 1,38 (s, 3H, CH3) ; MS (ES):288,1 (M"+l).

Fremstilling av den aktuelle forbindelse: En oppløsning av acetal 4,43 g, 20,6 mmol)<1>, benzaminhydroklorid (3,22 g, 20,6 mmol), og DBU (6,15 ml, 41,2 mmol) i tørr DMF (20 ml) ble oppvarmet til 85 °C i femten timer. Blandingen ble fortynnet med 100 ml CHC13, og vasket med H20 (2 x 50 ml) . Den organiske fraksjonen ble tørket, filtrert og konsentrert til en mørk brun olje. Den mørke brune olje ble omrørt i IN HC1 (100 ml) i 2 timer ved romtemperatur. Den resulterende oppslemming ble filtrert noe som ga HCl-saltet av den aktuelle forbindelsen som et lys brunt faststoff (3,60 g, 70,6 %) ; <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 11,92 (s, 1H) , 8,05 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H), 7,05 (s, 1H, pyrrol-H); MS(ES):212,1 (M~+l).

Fremstilling 4:

En oppløsning av acetal (700 mg, 2,44 mmol) i IN HC1 (40 ml) ble omrørt i 2 timer ved RT. Den resulterende oppslemming ble filtrert noen som ga HCl-saltet av 2-fenyl-6-metyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on som et lys brunt faststoff (498 mg, 78,0 %) : <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 11,78 (s, 1H), 8,05 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H), 6,17 (s, 1H, pyrrol-H), 2,25 (s, 3H, CH3) ; MS(ES):226, 1 (M"+l) .

Fremstilling 5:

En modifikasjon av Chen et al.-krystalliseringsmetoden ble brukt.<1> Til en iskald (0 °C) oppløsning av bromid; 20,0 g, 108 mmol; 90 % ren) i isopropylalkohol (60 ml) ble sakte tilsatt en oppløsning av a-metylbenzylamin (12,5 ml, 97,3 mmol). Den sorte oppløsning ble tillatt å varme seg til RT og omrørt i 15 timer. Blandingen ble fortynnet med EtOAc (200 ml) og vasket med 0,5 N NaOH (50 ml). Den organiske fraksjon ble tørket, filtrert og konsentrert til en svart tjære (19,2 g; 94 %). Residuet ble delvis renset med flash-kromatografi (Si02; 4/96 MeOH/CH2Cl2, Rf 0,35) til et sort faststoff (6,38 g, 31 %) som forbindelsen dl-1-(1-fenyl-etyl)-2-amino-3-cyano-4-metylpyrrol: MS(ES): 226,1 (M~+l). <1>Chen, Y. L.; Mansbach, R. S.; Winter, S. M.; Brooks, E.; Collins, J.; Corman, M. L.; Dunaiskis, A. R.; Faraci, W. S.; Gallaschun, R. J.; Schmidt, A.; Schulz, D. W. J. Med. chem. 1997, 40, 1749-1754.

Fremstilling 6:

Til en oppløsning dl-1-(1-fenyletyl)-2-amino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol<1>. (14,9 g, 62,5 mmol) og pyridin (10,0 ml) i diklormetan (50,0 ml) ble det tilsatt benzoylklorid (9,37 g, 66,7 mmol) ved 0 °C. Etter omrøring ved 0 °C i 1 time, ble heksan (10,0 ml) tilsatt for å hjelpe utfelling av produktet. Oppløsningsmidlet ble fjernet in vacuo og det faste stoffet ble rekrystallisert fra EtOH/H20 for å gi 13,9 g (65 %) av dl-1-(1-fenyletyl)-2-fenylkarbonylamino-3-cyano-4,5-diemtylpyrrol. smp. 218-221 °C; <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,72 (s, 3H) , 1,76 (d, J = 7,3 Hz, 3H) , 1,98 (s, 3H), 5,52 (q, J = 7,3 Hz, 1H), 7,14 - 7,54 (m, 9H), 7,68-7,72 (dd, J = 1,4 Hz, 6,9 Hz, 2H), 10,73 (s, 1H); MS(ES):344,4 (M"+l).

1 Liebigs Ann. Chem. 1986, 1485-1505.

De følgende forbindelser ble oppnådd på en lignende måte.

Fremstilling 6A: dl-1-(1-fenyletyl)-2-(3-pyridyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,83 (d, J = 6,8 Hz, 3H) , 2,02 (s, 3H) , 2,12 (s, 3H), 5,50 (q, J= 6,8 Hz, 1H), 7,14-7,42 (m, 5H), 8,08 (m, 2H), 8,75 (m, 3H); MS(ES):345,2 (M"+l). dl-1-(1-fenyletyl)-2-(2-furyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,84 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 1,92 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 5,49 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 6,54 (dd, J= 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 7,12-7,47 (m, 7H); MS(ES):334,2 (M"+l), 230, 1. dl-1-(1-fenyletyl)-2-(3-furyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,80 (d, J = 7 Hz, 3H), 1,89 (s, 3H) , 2,05 (s, 3H), 5,48 (q, J = 7 Hz, 1H), 6,59 (s, 1H), 7,12-7,40 (m, 6H), 7,93 (s, 1H); MS(ES):334,1 (M"+l), 230,0. dl-1-(1-fenyletyl)-2-cyklofenylkarbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,82 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 1,88 (s, 3H), 2,05 (s, 3H), 1,63-1,85 (m, 8H), 2,63 (m, 1H), 5,43 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 6,52 (s, 1H) , 7,05-7,20 (m, 5H); MS(ES):336, 3 (M"+l) . dl-1-(1-fenyletyl)-2-(2-tieyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,82 (d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,96 (s, 3H), 2,09 (s, 3H), 5,49 (q, J= 6,8 Hz, 1H), 7,05-7,55 (m, 8H); MS(ES):350,1 (M"+l), 246,0. dl-1-(1-fenyletyl)-2-(3-tienyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,83 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,12 (s, 3H), 5,49 (q, J = 7,0 Hz, 1H), 6,90 (m, 1H), 7,18-7,36 (m, 6H), 7,79 (m, 1H) , MS(ES):350,2 (M"+l), 246, 1. dl-1-(1-fenyletyl)-2-(4-fluorfenyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,83 (d, J = 7,4 Hz, 3H) , 1,96 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 5,51 (q, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,16-7,55 (m, 9H), MS(ES):362,2 (M"+l), 258, 1. dl-1-(1-fenyletyl)-2-(3-fluorfenyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,83 (d, J = 7,4 Hz, 3H) , 1,97 (s, 3H), 2,10 (s, 3H), 5,50 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,05-7,38 (m, 7H), 7,67-7,74 (m, 2H); MS(ES):362,2 (M"+l), 258,1. dl-1-(1-fenyletyl)-2-(2-fluorfenyl)karbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,85 (d, J = 7,2 Hz, 3H) , 1,94 (s, 3H), 2,11 (s, 3H), 5,50 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 7,12-7,35 (m, 6H), 7,53 (m, 1H), 7,77 (m, 1H), 8,13 (m, 1H); MS(ES):362,2 (M"+l), 258,0. dl-1-(1-fenyletyl)-2-isopropylkarbonylamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,19 (d, J = 7,0 Hz, 6H) , 1,82 (d, J = 7,2 Hz, 3H), 1,88 (s, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,46 (m, 1H), 5,39 (m, J= 7,2 Hz, 1H), 6,64 (s, 1H), 7,11-7,36 (m, 5H) ; MS(ES):310,2 (M"+l) , 206, 1.

I tilfellet av acylering av dl-1-(1-fenyletyl)-2-amino-3-cyano-4-metylpyrrol, monoacylert dl-1-(1-fenyletyl)-2-ben-zoylamino-3-cyano-4-dimetylpyrrol og diacylert pyrrol dl-1-(1-fenyletyl)-2-dibenzoylamino-3-cyano-4-metylpyrrol ble oppnådd. Monoacylert pyrrol: <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_7,69 (d, 2H, J = 7,8 Hz, Ar-H), 7,58-7,12 (m, 8H, Ar-H), 6,18 (s, 1H, pyrrol-H), 5,52 (q, 1H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) , 2,05 (s, 3H, pyrrol-CH3), 1,85 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) ; MS(ES):330,2 (M"+l); diacylert pyrrol: <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6_7,85 (d, 2H, J = 7,7 Hz, Ar-H), 7,74 (d, 2H, J = 7,8 Hz, Ar-H), 7,52-7,20 (m, 9H, Ar-H), 7,04 (m, 2H, Ar-H), 6,21 (s, 1H, pyrrol-H), 5,52 (q, 1H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) , 1,77 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) ; 1,74 (s, 3H, pyrrol-CH3) ; MS(ES):434, 1 (M"+l) .

Fremstilling 7:

Til en oppløsning dl-1-(1-fenyletyl)-2-fenylkarboksyamino-3-cyano-4,5-dimetylpyrrol<1>. (1,0 g, 2,92 mmol) i metanol (10,0 ml) ble det tilsatt konsentrert svovelsyre (1,0 ml) ved 0 °C. Den resulterte blanding ble kokt under tilbakeløp i 15 timer og avkjølt til romtemperatur. Presipitatet ble filtrert for å gi 0,48 g (48 %) av dl-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6_2,02 (d, J = 7,4 Hz, 3H), 2,04 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 6,25 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,22-7,50 (m, 9H), 8,07-8,12 (dd, J = 3,4 Hz, 6,8 Hz, 2H) , 10,51 (s, 1H); MS(ES):344,2 (M"+l).

De følgende forbindelser ble oppnådd på en lignende måte som den i fremstilling 7: dl-5,6-dimetyl-2-(3-pyridyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H) -on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_2,03

(d, J = 7,2 Hz, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,42 (s, 3H) , 6,24 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 7,09-7,42 (m, 5H), 8,48 (m, 2H), 8,70 (m, 3H); MS(ES):345,1 (M"+l).

dl-5,6-dimetyl-2-(2-furyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,98

(d, J = 7,8 Hz, 3H), 1,99 (s, 3H), 2,37 (s, 3H), 6,12 (q, J

= 7,8 Hz, 1H), 6,48 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H) , 7,17-7,55 (m, 7H) , 9,6 (s, 1H) ; MS(ES):334,2 (M~+l) .

dl-5,6-dimetyl-2-(3-furyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,99

(d, J = 7 Hz, 3H), 2,02 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 6,24 (q, J = 7 Hz, 1H), 7,09 (s, 1H), 7,18-7,32 (m, 5H), 7,48 (s, 1H), 8,51 (s, 1H); MS(ES):334,2 (M"+l).

dl-5, 6-dimetyl-2-cyklopentyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,95

(d, J= 7,4 Hz, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 1,68-1,88 (m, 8H), 2,97 (m, 1H), 6,10 (q, J = 7,4 Hz, 1H) , 7,16-7,30 (m, 5H) , 9,29 (s, 1H) ; MS(ES):336, 3 (M"+l) .

dl-5,6-dimetyl-2-(2-tienyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,02

(d, J= 7,2 Hz, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,41 (s, 3H), 6,13 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 7,12 (dd, J = 4,8, 2,8 Hz, 1H), 7,26-7,32 (m, 5H), 7,44 (d, J = 4,8 Hz, 1H), 8,01 (d, J = 2,8 Hz, 1H), 11,25 (s, 1H); MS(ES):350,2 (M"+l).

dl-5,6-dimetyl-2-(3-tienyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,00

(d, J = 7,4 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,43 (s, 3H), 6,24 (q, J = 7,4 Hz, 1H), 7,24-7, 33 (m, 5H), 7, 33-7, 39 (m, 1H) , 7,85 (m, 1H), 8,47 (m, 1H), 12,01 (s, 1H); MS(ES):350,2 (M"+l).

dl-5,6-dimetyl-2-(4-fluorfenyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6 2,01

(d, J = 6,8 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,42 (s, 3H), 6,26 (q, J = 6,8 Hz, 1H), 7,12-7,36 (m, 7H), 8,23-8,30 (m, 2H), 11,82 (s, 1H) ; MS(ES):362, 3 (M"+l) .

dl-5,6-dimetyl-2-(3-fluorfenyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,02

(d, J= 7,4 Hz, 3H), 2,06 (s, 3H), 2,44 (s, 3H), 6,29 (q, J

= 7,4 Hz, 1H), 7,13-7,51 (m, 7H), 8, 00-8, 04 (m, 2H) , 11,72 (s, 1H) ; MS(ES):362,2 (M"+l) .

dl-5,6-dimetyl-2-(2-fluorfenyl)-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,00

(d, J= 7,2 Hz, 3H), 2,05 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 6,24 (q, J = 7,2 Hz, 1H), 7,18-7,45 (m, 8H), 8,21 (m, 1H), 9,54 (s, 1H); MS(ES):362,2 (M"+l).

dl-5,6-dimetyl-2-isopropyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,30

(d, J = 6,8 Hz, 3H), 1,32 (d, J = 7,0 Hz, 3H), 2,01 (s, 3H), 2,34 (s, 3H), 2,90 (m, 1H), 6,13 (m, 1H), 7,17-7,34 (m, 5H), 10,16 (s, 1H); MS(ES):310,2 (M"+l).

Fremstilling 8:

En oppløsning av dl-1-(1-fenyletyl)-benzoylamino-3-cyano-4-dimetylpyrrol (785 mg, 2,38 mmol) med konsentrert H2S04 (1 ml) i DMF (13 ml) ble omrørt ved 130 °C i 48 timer. Den sorte blanding ble fortynnet med CHC13 (100 ml) og vasket med 1 N NaOH (30 ml), og saltløsning (30 ml). Den organiske fraksjonen ble tørket, filtrert, og konsentrert og renset ved flash kromatografi (Si02; 8/2 EtOAc/heks, Rf 0,35) til et brunt faststoff (184 mg, 24 %) som dl-5-metyl-2-fenyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo[2, 3d]pyrimidin-4-(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_8,18 (m, 2H, Ar-H), 7,62-7,44 (m, 3H, Ar-H), 7,40-7,18 (m, 5H, Ar-H), 6,48 (s, 1H, pyrrol-H), 6,28 (q, 1H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) , 2,18 (s, 3H, pyrrol-CH3) , 2,07 (d, 3H, J = 7,2 Hz, CH-CH3) ; MS(ES):330,2 (M"+l) .

Fremstilling 9:

En blanding av dl-1-(1-fenyletyl)-2-amino-3-cyano-4, 5-di-metylpyrrol (9,60 g, 40,0 mmol) og av maursyre (50,0 ml, 98 %) ble kokt under tilbakeløp i 5 timer. Etter nedkjøling til romtemperatur og skraping til sidene av flaske, ble store mengder presipitat dannet og filtrert. Materialet ble vasket med vann inntil vaskinger viste nøytralt pH for å gi dl-5,6-dimetyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,96 (d, J = 7,4 hz, 3H), 2,00 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 6,21 (q, 7 = 7,4 Hz, 1H), 7,11-7,35 (m, 5H), 7,81 (s, 1H), 11,71 (s, 1H);

MS (ES) :268,2 (M"+l) .

Fremstilling 10: dl-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4 (3H)-on (1,0 g, 2,91 mmol) ble suspendert i polyfosforsyre (30,0 ml). Blandingen ble varmet ved 100 °C i 4 timer. Den varme suspensjon ble helt til isvann, omrørt kraftig for å dispergere suspensjon, og gjøre basisk til pH 6 med faststoff KOH. Det resulterende faste stoff ble filtrert og samlet for å gi 0,49 g (69 %) av 5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-de) 6_2,17 (s, 3H) , 2,22 (s, 3H) , 7,45 (br, 3H) , 8,07 (br, 2H), 11,49 (s, 1H), 11,82 (s, 1H); MS(ES):344,2 (M" + 1) •

De følgende forbindelser ble oppnådd på en lignende måte som den i fremstilling 10: 5-metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. MS(ES):226, 0 (M"+l) .

5,6-dimetyl-2-(3-pyridyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. MS(ES):241,1 (M"+l).

5,6-dimetyl-2-(2-furyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,13 (s, 3H) , 2,18 (s, 3H) , 6,39 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H), 6,65 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 7,85 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H), 11,45 (s, 1H), 11,60 (s, 1H); MS(ES):230,1 (M"+l).

5,6-dimetyl-2-(3-furyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,14 (s, 3H) , 2,19 (s, 3H) ,

6,66 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 8,35 (s, 1H), 11,3 (s, 1H) , 11,4 (s, 1H); MS(ES):230,1 (M~+l) .

5,6-dimetyl-2-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 1,57-1,91 (m, 8H) , 2,12 (s, 3H), 2,16 (s, 3H), 2,99 (m, 1H), 11,24 (s, 1H), 11,38 (s, 1H); MS(ES):232,2 (M"+l).

5,6-dimetyl-2-(2-tienyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,14 (s, 3H) , 2,19 (s, 3H) , 7,14 (dd, J = 3,0, 5,2 Hz, 1H), 7,70 (d, J = 5,2 Hz, 1H) , 8,10 (d, J = 3,0 Hz, 1H), 11,50 (s, 1H); MS(ES):246,1 (M~ + 1) •

5,6-dimetyl-2-(3-tienyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,17 (s, 3H), 2,21 (s, 3H), 7,66 (m, 1H), 7,75 (m, 1H), 8,43 (m, 1H), 11,47 (s, 1H), 11,69 (s, 1H); MS(ES):246,1 (M"+l).

5,6-dimetyl-2-(4-fluorfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,17 (s, 3H) , 2,21

(s, 3H), 7,31 (m, 2H), 8,12 (m, 2H), 11,47 (m, 1H); MS(ES):258,2 (M"+l).

5,6-dimetyl-2-(3-fluorfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,18 (s, 3H) , 2,21

(s, 3H), 7,33 (m, 1H), 7,52 (m, 1H), 7,85-7,95 (m, 2H), 11,56 (s, 1H) , 11,80 (s, 1H); MS(ES):258, 1 (M"+l) .

5,6-dimetyl-2-(2-fluorfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,18 (s, 3H) , 2,22

(s, 3H), 7,27-7,37 (m, 2H), 7,53 (m, 1H), 7,68 (m, 1H), 11,54 (s, 1H), 11,78 (s, 1H) ; MS(ES):258, 1 (M"+l) .

5,6-dimetyl-2-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 1,17 (d, J = 6,6 Hz, 6H) , 2,11 (s, 3H), 2,51 (s, 3H), 2,81 (m, 1H), 11,20 (s, 1H), 11,39 (s, 1H) ; MS(ES):206, 1 (M"+l) .

5,6-dimetyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4(3H)-on. <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 6 2,13 (s, 3H) , 2,17 (s, 3H) , 7,65 (s, 1H) ; MS(ES):164,0 (M"+l).

Fremstilling 11:

En oppløsning av 5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4 (3H)-on (1,0 g, 4,2 mmol) i fosforoksyklorid (25,0 ml) ble kokt under tilbakeløp i 6 timer og så konsentrert in vacuo til tørrhet. Vann ble tilsatt til residuet for å indusere krystallisering og det resulterende faste stoff ble filtrert og samlet opp for å gi 0,90 g (83 %) av 4-klor-5,6-dimetyl-2fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5_2,33 (s-3H), 2,33 (s, 3H) , 7,46-7,49 (m, 3H), 8,30-8,35 (m, 2H), 12,20 (s, 1H); MS(ES):258,1 (M~ + 1) •

De følgende forbindelser ble oppnådd på en lignende måte som den i fremstilling 11:

4-klor-5-metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

MS (ES) :244, 0 (M"+l) .

4-klor-6-metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):244, 0 (M"+l) .

4-klor-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-de) 8,35 (2, 2H) , 7,63 (br s, 1H) , 7,45 (m, 3H) , 6,47 (br s, 1H) ; MS(ES):230, 0 (M"+l) .

4-klor-5,6-dimetyl-2-(3-pyridyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):259, 0 (M"+l) .

4-klor-5,6-dimetyl-2-(2-furyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,35 (s, 3H) , 2,35 (s, 3H) , 6,68 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H), 7,34 (dd, J = 1,8 Hz, 3,6 Hz, 1H), 7,89 (dd, J = 1,8, 3,6 Hz, 1H); MS(ES):248,0 (M~ + 1) •

4-klor-5,6-dimetyl-2-(3-furyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,31 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) , 6,62 (s, 1H), 7,78 (s, 1H), 8,18 (s, 1H), 12,02 (s, 1H); MS(ES):248,1 (M"+l).

4-klor-5,6-dimetyl-2-cyklopentyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 1,61-1,96 (m, 8H) , 2,27 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 3,22 (m, 1H), 11,97 (s, 1H); MS(ES):250,1 (M"+l).

4-klor-5,6-dimetyl-2-(2-tienyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,29 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) , 7,14 (dd, J = 3,1 Hz, 4,0 Hz, 1H), 7,33 (d, J = 4,9 Hz, 1H), 7,82 (d, J= 3,1 Hz, 1H), 12,19 (s, 1H); MS(ES):264,1 (M"+l) .

4-klor-5,6-dimetyl-2-(3-tienyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,32 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H) , 7,62 (dd, J = 3,0 Hz, 5,2 Hz, 1H), 7,75 (d, J = 5,2 Hz, 1H), 8,20 (d, J= 3,0 Hz, 1H); MS(ES):264,0 (M~+l) .

4-klor-5,6-dimetyl-2-(4-fluorfenyl)-7H-pyrrolo[2, 3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2, 33 (s, 3H) , 2,33 (s, 3H), 7,30 (m, 2H), 8,34 (m, 2H), 12,11 (s, 1H); MS(ES):276,1 (M"+l).

4-klor-5,6-dimetyl-2-(3-fluorfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,31 (s, 3H) , 2,33 (s, 3H), 7,29 (m, 1H), 7,52 (m, 1H), 7,96 (m, 1H), 8,14 (m, 1H), 11,57 (s, 1H) ; MS(ES):276, 1 (M"+l) .

4-klor-5,6-dimetyl-2-(2-fluorfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, DMSO-d6) 6 2, 34 (s, 3H) , 2,34 (s, 3H), 7,33 (m, 2H), 7,44 (m, 1H), 7,99 (m, 1H), 12,23 (s, 1H) ; MS (ES) -. 216, 1 (M"+l) .

4-klor-5,6-dimetyl-2-isopropyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 1,24 (d, J = 6,6 Hz, 6H) , 2,28

(s, 3H), 2,28 (s, 3H), 3,08 (q, J = 6,6 Hz, 1H) , 11,95 (s, 1H); MS(ES):224,0 (M"+l).

4-klor-5,6-dimetyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, DMSO-d6) 5 2,31 (s, 3H) , 2,32 (s, 3H) , 8,40 (s, 1H) ; MS(ES):182,0 (M"+l) . dl-4-klor-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-7-(1-fenyletyl)pyrrolo-[2,3d]pyrimidin.

Fremstilling 12

Til en oppløsning av dl-1,2-diaminopropan (1,48 g, 20,0 mmol) og natriumkarbonat (2,73 g, 22,0 mmol) i dioksan (100,0 ml) og vann (100,0 ml) ble det tilsatt di-tert-di-karbonat (4,80 g, 22,0 mmol) ved romtemperatur. Den resulterende blanding ble omrørt i 14 timer. Dioksan ble fjernet in vacuo. Presipitatet ble filtrert fra og filtratet ble konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble triturert med EtOAc og så filtrert. Filtratet ble konsentrert in vacuo til tørrhet for å gi en blanding av dl-l-amino-2-(1,1-dimetyletoksy)karbonylaminopropan og dl-2-amino-l-(1,1-dimetyletoksy)karbonylaminopropan som ikke kunne av-skilles med normale kromatografimetoder. Blandingen ble brukt for reaksjonen i eksempel 8.

Fremstilling 13:

Til en oppløsning av Fmoc-(3-Ala-OH (1,0 g, 3,212 mmol) og oksalylklorid (0,428 g, 0,29 ml, 3,373 mmol) i diklormetan (20,0 ml) ble det tilsatt et par dråper N,N-dimetylformamid ved 0 °C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 1 time fulgt av tilsetning av cyklopropylmetylamin (0,229 g, 0,28 ml, 3,212 mmol) og trietylamin (0,65 g, 0,90 ml, 6,424 mmol). Etter 10 minutter ble blandingen behandlet med 1 M hydroklorid (10,0 ml) og den vandige blanding ble ekstrahert med diklormetan (3 x 30,0 ml). Den organiske oppløs-ning ble konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble behandlet med en oppløsning på 20 % piperidin i N,N-dime-tylforamid (20,0 ml) i en halv time. Etter fjerning av oppløsningsmidlet in vacuo, ble residuet behandlet med 1 M hydroklorid (20,0 ml) og etylacetat (20,0 ml). Blandingen ble separert og det vandige lag ble gjort basisk med fast natriumhydroksid til pH = 8. Presipitatet ble fjernet med filtrering og den vandige oppløsning ble utsatt for ione-byttekolonne eluert med 20 % pyridin for å gi 0,262 g (57 %) av N-cyklopropylmetyl (3-alaninamid. <X>H NMR (200 MHz, CD3OD) 5_0,22 (m, 2H) , 0,49 (m, 2H) , 0,96 (m, 2H) , 2,40 (t, 2H), 2,92 (t, 2H) , 3,05 (d, 2H) ; MS(ES):143,1 (M"+l) .

Fremstilling 14: N-tert-butoksykarbonyl-trans-1,4-cykloheksyldiamin.

trans-1,4-cykloheksyldiamin (6,08 g, 53,2 mmol) ble oppløst i diklormetan (100 ml). En oppløsning av di-t-butyldikarbonat (2,32 g, 10,65 mmol i 40 ml diklormetan) ble tilsatt via kannula. Etter 20 timer ble reaksjonsblandingen fordelt mellom CHCI3 og vann. Lagene ble separert og det vandige lag ble ekstrahert med CHCI3 (3x). De kombinerte organiske lag ble tørket over MgSCU, filtrert og konsentrert for å gi 1,20 g av et hvitt faststoff (53 %) . <1>R NMR (200 MHz,

CDCI3) 5 1,0-1,3 (m, 4H) , 1,44 (s, 9H) , 1,8-2,1 (m, 4H) , 2,62 (brm, 1H), 3,40 (brs, 1H), 4,37 (brs, 1H0);

MS (ES) :215,2 (M"+l) .

4-(N-acetyl)-N-tert-butoksykarbonyl-trans-1,4-cykloheksyl-diamin .

N-tert-butoksykarbonyl-trans-1,4-cykloheksyldiamin (530 mg, 2,47 mmol) ble oppløst i diklormetan (20 ml). Eddiksyreanhydrid (250 mg, 2,60 mml) ble tilsatt dråpevis. Etter 16 timer ble reaksjonen fortynnet med vann og CHCI3. Lagene ble avskilt og det vandige lag ble ekstrahert med CHCI3 (3x). De kombinerte organiske lag ble tørket over MgSO,}, filtrert og konsentrert. Rekrystallisering (EtOH/H20) ga 190 mg av hvite krystaller (30 %) . <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 0, 9-1, 30 (m, 4H) , 1,43 (s, 9H), 1,96-2,10 (m, 7H) , 3,40 (brs, 1H), 3,70 (brs, 1H), 4,40 (brs, 1H), 4,40 (brs, 1H); MS(ES):257, 1 (M"+l), 242, 1 (M"-15) , 201,1 (M"-56) .

4-(4-trans-acetamidocykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-(1-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(N-acetyl)-N-tert-butoksykarbonyl-trans-1,4-cykloheksyl-diamin (190 mg, 0,74 mmol), ble oppløst i diklormetan (5 ml) og fortynnet med TFA (6 ml). Etter 16 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert. Det grove faste stoff DMSO (2 ml), NaHC03 (200 mg, 2,2 mmol) og 4-klor-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (35 mg, 0,14 mmol) ble kombinert i en flaske og oppvarmet til 130 °C. Etter 4,5 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og fortynnet med EtOAc og vann. Lagene ble avskilt og det vandige lag ble ekstrahert med EtOAc (3x). De kombinerte organiske lag ble tørket over MgSO-j, filtrert og konsentrert. Kromatografi (preparatorisk silikaplate; 20:1 CHCl3:EtOH) ga 0,3 mg av et lys brunt faststoff (1 % utbytte). MS(ES):378,2 (M"+l),

4-(N-metansulfonyl)-N-tert-butoksykarbonyl-trans-1,4-cykloheksyldiamin.

trans-1,4-cykloheksyldiamin (530 mg, 2,47 mmol) ble oppløst i diklormetan (20 ml) og fortynnet med pyridin (233 mg, 3,0 mmol). Metansulfonylklorid (300 mg, 2,60 mmol) ble tilsatt dråpevis. Etter 16 timer ble reaksjonsblandingen fortynnet med vann og CHC13. Lagene ble avskilt og det vandige lag ble ekstrahert med CHCI3 (3x). De kombinerte organiske lag ble tørket over MgSCU, filtrert og konsentrert. Rekrystallisering (EtOH/H20) ga 206 mg av hvite krystaller (29 %).

<1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,10-1,40 (m, 4H), 1,45 (s, 9H), 2,00-2,20 (m, 4H), 2,98 (s, 3H), 3,20-3,50 (brs, 2H), 4,37 (brs, 1H); MS(ES):293,1 (M"+l), 278,1 (M"-15), 237,1 (M--56) .

4-(4-trans-metansulfamidocykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-(l-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(N-sulfonyl)-N-tert-butoksykarbonyl-trans-1,4-cyklohek-syldiamin (206 mg, 0,71 mmol), ble oppløst i diklormetan (5 ml) og fortynnet med TFA (6 ml). Etter 16 timer ble reak-sj onsblandingen konsentrert. Den grove reaksjonsblanding DMSO (2 ml), NaHC03 (100 mg, 1,1 mmol) og l-klor-5,6-dime-tyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin ble kombinert i en flaske og oppvarmet til 130 °C. Etter 15 timer ble reak-sj onsblandingen avkjølt til romtemperatur, og fortynnet med EtOAc (3x). De kombinerte organiske lag ble tørket over MgSOo filtrert og konsentrert. Kromatografi (preparatorisk silikaplate, 20:1 CHCl3/EtOH) ga 2,6 mg av et lys brunt faststoff (5 % utbytte). MS(ES):414,2 (M"+l).

Eksempel 1:

En oppløsning av 4-klor-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrro-lo[2,3d]pyrimidin (0,50 g, 1,94 mmol) og 4-trans-hydroksy-cykloheksylamin (2,23 g, 19,4 mmol) i metylsulfoksid (10,0 ml) ble oppvarmet til 130 °C i 5 timer. Etter avkjøling ned til romtemperatur, ble vann (10,0 ml) tilsatt og den resulterende vandige oppløsning ble ekstrahert til EtOAc (3 x 10,0 ml). Den kombinerte EtOAc-oppløsning ble tørket (MgS04) og filtrert, filtratet ble konsentrert in vacuo til tørrhet, residuet ble kromatografert på silikagel for å gi 0,49 g (75 %) av 4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. smp. 197-199 °C; <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,25-1,59 (m, 8H), 2,08 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,68-3,79 (m, 1H), 4,32-4,38 (m, 1H), 4,88 (d, J = 8 Hz, 1H), 7,26-7,49 (m, 3H), 8,40-8,44 (dd, J = 2,2, 8 Hz, 2H), 10,60 (s, 1H); MS(ES):337,2 (M"+l).

De følgende forbindelser ble oppnådd på lignende måte som den i eksempel 1: 4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-6-metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6_11,37 (s, 1H, pyrrol-NH), 8,45 (m, 2H, Ar-H), 7,55 (m, 3H, Ar-H), 6,17 (s, 1H, pyrrol-H), 4,90 (br d, 1H, NH), 4,18 (m, 1H, CH-O), 3,69 (m, 1H, CH-N), 2,40-2,20 (m, 2H), 2,19-1,98 (m, 2H), 2,25 (s, 3H, CH3) 1,68-1,20 (m, 4H); MS(ES):323,2 (M~ + 1) •

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5-metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_11,37 (s, 1H, pyrrol-NH), 8,40 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H, Ar-H), 5,96 (s, 1H, pyrrol-H), 4,90 (br d, 1H, NH), 4,18 (m, 1H, CH-O), 3,69 (m, 1H, CH-N), 2,38-2,20 (m, 2H), 2,18-1,98 (m, 2H), 2,00 (s, 3H, CH3) 1,68-1,20 (m, 4H); MS(ES):323,2 (M~ + 1) •

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-2-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. smp. 245,5-246,5 °C; <1>H NMR (200 MHz, CD3OD) 5 8,33 (m, 2H, Ar-H), 7,42 (m, 3H, Ar-H), 7,02 (d, 1H, J = 3,6 Hz, pyrrol-H), 6,53 (d, 1H, J = 3,6 Hz, pyrrol-H), 4,26 (m, 1H, CH-O), 3,62 (m, 1H, CH-N), 2,30-2,12 (m, 2H), 2,12-1,96 (m, 2H), 1,64-1,34 (m, 4H); MS, M+l = 309,3; Anal (Ci8H2oN40) C, H, N.

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(3-py-ridyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6_1,21-1,54 (m, 8H); 2,28 (s, 3H); 2,33 (s, 3H); 3,70 (m, 1H), 4,31 (m, 1H), 4,89 (d, 1H), 7,40 (m, 1H), 8,61 (m, 2H), 9,64 (m, 1H); MS(ES):338,2 (M"+l) .

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(2-fu-ryl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,26-1,64 (m, 8H); 2,22 (s, 3H); 2,30 (s, 3H); 3,72 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 4,85 (d, 1H), 6,52 (m, 1H), 7,12 (m, 1H), 7,53 (m, 1H) , 9,28 (s, 1H) ; MS(ES):327,2 (M"+l) .

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(3-fu-ryl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,25-1, 63 (m, 8H), 2,11 (s, 3H); 2,27 (s, 3H) , 3,71 (m,

1H), 4,20 (m, 1H), 4,84 (d, 1H), 7,03 (m, 1H), 7,45 (m, 1H), 8,13 (m, 1H), 10,38 (m, 1H); MS(ES):327,2 (M"+l).

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-cyklo-pentyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,26-2,04 (m, 16H), 2,26 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 3,15 (m, 1H), 3,70 (m, 1H), 4,12 (m, 1H), 4,75 (d, 1H); MS(ES):329,2 (M~+l) .

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(2-tie-nyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin-4-amin. <X>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,28-1,59 (m, 8H), 2,19 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,74 (m, 1H), 4,19 (m, 1H), 4,84 (d, 1H), 7,09 (m, 1H), 7,34 (m, 1H), 7,85 (m, 1H), 9,02 (s, 1H); MS(ES):343,2 (M~ +1) •

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(3-tie-nyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,21-1,60 (m, 8H), 1,98 (s, 3H), 2,23 (s, 3H), 3,66 (m, 1H), 4,22 (m, 1H), 7,27 (m, 1H), 7,86 (m, 1H), 8,09 (m, 1H), 11,23 (s, 1H); MS(ES):343,2 (M"+l).

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(4-flu-orfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,26-1,66 (m, 8H), 1,94 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 3,73 (m, 1H), 4,33 (m, 1H), 4,92 (d, 1H), 7,13 (m, 2H), 8,41 (m, 2H), 11,14 (s, 1H); MS(ES):355,2 (M"+l).

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(3-flu-orfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,26-1,71 (m, 8H), 2,06 (s, 3H), 2,30 (s, 3H), 3,72 (m, 1H), 4,30 (m, 1H), 4,90 (d, 1H), 7,09 (m, 1H), 7,39 (m, 1H), 8,05 (m, 1H), 8,20 (m, 1H), 10,04 (s, 1H); MS(ES):355,2 (M"+l) .

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-(2-flu-orfenyl)-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,30-1,64 (m, 8H), 2,17 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 3,73 (m,

1H), 4,24 (m, 1H), 4,82 (d, 1H), 7,28 (m, 2H), 8,18 (m, 1H), 9,02 (m, 1H), 12,20 (s, 1H) ; MS(ES):355, 3 (M"+l).

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-isopro-pyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,31 (d, J = 7,0 Hz, 6H), 1,30-1,65 (m, 8H), 2,27 (s, 3H), 2,28 (s, 3H), 3,01 (m, J = 7,0 Hz, 1H), 3,71 (m, 1H) , 4,14 (m, 1H), 4,78 (d, 1H); MS(ES):303,2 (M"+l).

dl-4-(2-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-iso-propyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,31-1,42 (br, 4H), 1, 75-1, 82 (br, 4H), 2,02 (s, 3H) , 2,29 (s, 3H), 3,53 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 5,08 (d, 1H) , 7,41-7,48 (m, 3H), 8,30 (m, 2H), 10,08 (s, 1H); MS(ES):337,2 (M~ + 1) • 4-(3,4-trans-dihydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):353,2 (M"+l). 4-(3,4-cis-dihydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):353,2 (M"+l). 4-(2-acetylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. smp. 196-199 °C; <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 6_1,72 (s, 3H) , 1,97 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H) , 3,59 (m, 2H) , 3,96 (m, 2H), 5,63 (br, 1H), 7,44-7,47 (m, 3H), 8,36-8,43 (dd, J = 1 Hz, 2H), 10,76 (s, 1H) ; MS(ES):324, 5 (M"+l) . dl-4-(2-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.<1 > <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,62 (m, 2H) , 1,79 (br, 4H) , 1,92 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 4,11 (m, 1H), 4,23 (m, 1H), 5,28 (d, 1H), 7,41-7,49 (m, 3H), 8,22 (m, 2H), 10,51 (s, 1H); MS(ES):323,2 (M"+l). <1> For fremstilling av 2-trans-hydroksycyklopentylamin, se PCT 9417090.

dl-4-(3-trans-hydroksycyklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.<1>

<X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,58-1,90 (br, 6H), 2,05 (s, 3H), 2.29 (s, 3H), 4,48-4,57 (m, 1H), 4,91-5,01 (m, 2H), 7,35-7,46 (m, 3H), 8,42-8,47 (m, 2H), 10,11 (s, 1H); MS(ES):323,2 (M"+l). 1 For fremstilling av 3-trans-hydroksycyklopentylamin, se EP-A-322242. dl-4-(3-cis-hydroksycyklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. 1 <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,82-2,28 (br, 6H), 2,02 (s, 3H), 2.30 (s, 3H), 4,53-4,60 (m, 1H), 4,95-5,08 (m, 1H), 5,85-5,93 (d, 1H), 7,35-7,47 (m, 3H), 8,42-8,46 (m, 2H), 10,05 (s, 1H) ; MS(ES):323,2 (M"+l) . <1> For fremstilling av 3-cis-hydroksycyklopentylamin, se EP-A-322242 . 4-(3,4-trans-dihydroksycyklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.<1 > <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 6_1,92-1,99 (br, 2H), 2,14 (s, 3H), 2,20 (br, 2H), 2,30 (s, 3H), 2,41-2,52 (br, 2H), 4,35 (m, 2H), 4,98 (m, 2H), 7,38-7,47 (m, 1H), 8,38-8,42 (m, 2H), 9,53 (s, 1H); MS(ES):339,2 (M"+l) . 1 For fremstilling av 3,4-trans-dihydroksycyklopentylamin, se PCT 9417090.

4-(3-amino-3-oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo [2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_2,02 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,71 (t, 2H), 4,18 (m, 2H), 5,75-5,95 (m, 3H), 7,38-7,48 (m, 3H), 8,37-8,41 (m, 2H), 10,42 (s, 1H); MS(ES):310,1 (M"+l).

4-(3-N-cyklopropylmetylamino-3-oksopropyl)amino-5,6-dime-tyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CD3OD) 5_0,51 (q, 2H) , 0,40 (q, 2H) , 1, 79-1, 95 (br, 1H) , 2,36 (s, 3H), 2,40 (s, 3H), 2,72 (t, 2H), 2,99 (d, 2H), 4,04 (t, 2H), 7,58-7,62 (m, 3H), 8,22-8,29 (m, 2H); MS(ES):364,2 (M"+l) .

4-(2-amino-2-oksoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo [2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CD3OD) 5 2,31 (s, 3H), 2,38 (s, 3H), 4,26 (s, 2H), 7,36 (m, 3H), 8,33 (m, 2H); MS(ES) :396,1 (M"+l) .

4-(2-N-metylamino-2-oksoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6_1,99 (s, 3H), 2,17 (s, 3H), 2,82 (d, 3H), 4,39 (d, 2H) , 5,76 (t, 1H), 6,71 (br, 1H), 7,41-7,48 (m, 3H), 8,40 (m, 2H), 10,66 (s, 1H) ; MS(ES):310,1 (M"+l) .

4-(3-tert-butyloksyl-3-oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,45 (s, 9H), 1,96 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 2,71 (t, 2H), 4,01 (q, 2H), 5,78 (t, 1H), 7,41-7,48 (m, 3H), 8,22-8,29 (m, 2H) ; MS(ES):367,2 (M"+l) .

4-(2-hydroksyetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,92 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,81-3,98 (br, 4H), 5,59 (t, 1H), 7,39-7,48 (m, 3H), 8,37 (m, 2H), 10,72 (s, 1H) ; MS(ES):283, 1 (M"+l) .

4-(3-hydroksypropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,84 (m, 2H), 1,99 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,62 (t, 2H), 3,96 (m, 2H), 3,35 (t, 1H), 7,39-7,48 (m, 3H), 8,36 (m, 2H), 10,72 (s, 1H); MS(ES):297,2 (M"+l).

4-(4-hydroksybutyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,71-1,82 (m, 4H), 1,99 (s, 3H) , 2,31 (s, 3H), 3, 68-3, 80 (m, 4H), 5,20

(t, 1H), 7,41-7,49 (m, 3H), 8,41 (m, 2H), 10,37 (s, 1H); MS(ES):311,2 (M"+l) .

4-(4-trans-acetylaminocykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(4-trans-metylsulfonylaminocykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(2-acetylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-7-(1-fe-nyletyl) pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(4-trans-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-(1-fenyletyl)pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(3-pyridylmetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-7-(1-fenyl-etyl) pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

4-(2-metylpropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-7-(1-fenyl-etyl) pyrrolo[2,3d]pyrimidin.

Eksempel 2:

Til en omrørt suspensjon av trifenylfosfin (0,047 g, 0,179 mmol) og benzonsyre (0,022 g, 0,179 mmol) i THF (1,0 ml) avkjølt til 0 °C ble det tilsatt 4-(4-trans-hydroksycyklo-heksyl) amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (0,05 g, 0,149 mmol) ved 0 °C. Dietylazodikarboksylat (0,028 ml, 0,179 mmol) ble så tilsatt dråpevis over 10 minutter. Reaksjonsblandingen ble så tillatt å varme seg til romtemperatur. Etter at reaksjonen var fullstendig i TCL ble reaksjonsblandingen stoppet med vandig natriumbikarbonat (3,0 ml). Den vandige fase ble avskilt og ekstrahert med eter (2 x 5,0 ml). De organiske ekstrakter ble slått sammen, tørket og konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble tilsatt eter (2,0 ml) og heksan (5,0 ml) hvorpå største delen av trifenylfosfinoksidet ble filtrert fra. Konsentrasjon av filtratet ga en viskøs olje som ble renset ved kolonne kromatografi (heksan:etylacetat = 4:1) for å gi 5,0 mg (7,6 %) av 4-(4-cis-benzoyloksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):441,3 (M~+l). Reaksjonsblandingen fremstilte også 50,0 mg (84 %) av 4-(3-cykloheksenyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):319,2 (M"+l).

Eksempel 3:

Til en oppløsning av 4-(4-cis-benzoyloksycykloehek-syl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (5,0 mg, 0,0114 mmol) i etanol (1,0 ml) ble det tilsatt 10 dråper 2M natriumhydroksid. Etter 1 timer ble reaksjonsblandingen ekstrahert med etylacetat (3 x 5,0 ml) og det organiske lag ble tørket, filtrert og konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble utsatt for kolonne kromatografi (heksan:etylacetat = 4:1) for å gi 3,6 mg (94 %) av 4-(4-cis-hydroksycykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):337,2 (M"+l).

De følgende forbindelser ble oppnådd på en lignende måte som den i eksempel 3: 4-(3-N,N-dimetyl-3-oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo [2,3d] pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 2,01 (s, 3H), 2,31 (s, 3H), 2,73 (t, 2H), 2,97 (s, 6H), 4,08 (m, 2H), 6,09 (t, 1H), 7,41-7,48 (m, 3H), 8,43 (m, 2H), 10,46 (s, 1H) ; MS(ES):338,2 (M"+l) .

4-(2-formylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrro-lo [2, 3d] pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,26 (s, 3H) , 2,37 (s, 3H), 3,59-3,78 (m, 2H), 3,88-4,01 (m, 2H), 5,48-5,60 (m, 1H), 7,38-7, 57 (m, 3H), 8,09 (s, 1H) , 8,30-8,45 (m, 2H), 8,82 (s, 1H); MS(ES):310,1 (M"+l).

4-(3-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES):338,2 (M"+l).

Eksempel 4

4-(3-tert-butyloksy-3-oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (70,0 mg, 0,191 mmol)) ble oppløst I trifluoreddiksyre:diklormetan (1:1, 5,0 ml). Den resulterende oppløsning ble omrørt ved romtemperatur i 1 time og så kokt under tilbakeløp i 2 timer. Etter avkjøling til romtemperatur ble blandingen konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble utsatt for preparativ tynnsjikts kromatografi (EtOAc:heksan:AcOH=7:2, 5:0,5) for å gi 40,0 mg (68%) av 4-(3-hydroksy-3- oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz,CD2OD) 6 2,32 (s,3H), 2,38 (s,3H), 2,81 (t,2H), 4,01 (t,2H), 7,55 (m, 3H), 8,24 (m, 2H); MS (ES): 311,1 (M+l).

Den følgende forbindelse ble oppnådd på lignende måte som den i eksempel 4.

4-(3-aminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 296, 1 (M+l), 279, 1 (M-NH3) .

Eksempel 5

4-(3-hydroksy-3 oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (50,0 mg, 0,161 mmol) ble oppløst i en blanding av N,N-dimetylformamid (0,50 ml), dioksan (0,50 ml) og vann (0,25 ml). Til denne oppløsning ble tilsatt metylamin (0,02 ml, 40 vekt% i vann, 0,242 mmol). Trietylamin (0,085 ml) og N,N,N',N'-tetrametyl uronium tetrafluor-borat (61,2 mg, 0,203 mmol). Etter omrøring ved romtemperatur i 10 minutter ble oppløsningen konsentrert og residuet ble utsatt for preparativ tynnsjikts kromotografi (EtOAc) for å gi 35,0 mg (67%) av 4-(3-N-metyl-3-oksopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,92 (s, 3H), 2,30 (s, 3H) , 2,65 (t,2H), 4,08 (t, 2H), 5,90 (t, 1H), 6,12 (m, 1H), 7,45 (m. 3H), 8,41 (m, 2H), 10,68 (s,lH); MS )ES): 311,1 (M+l).

De følgende forbindelser ble fremstilt på lignende måte som den i eksempel 5.

4-(2-syklopropankarbonylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 352,2 (M+l).

4-(3-propionylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,00-1,08 (t, 3H), 1,71-2,03 (m, 4H), 2,08 (s,3H), 2,37 (s, 3H), 3,26-3,40 (m, 2H), 3,79-3,96 (m, 2H), 5,43-5,62 (m, 1H), Jo,17-6,33 (m, 1H), 7,33-7,57 (m,3H), 8,31-8,39 (m,2H), 9,69 (S,1H); MS (ES): 352,2 (M+l).

4-(2-metylsulfonylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,18 (s, 3H), 2,27 (s, 3H), 2,92 (s,3H), 3,39-3,53 (m, 2H), 2,71-3,88 (m, 2H), 5,31-5,39 (m, 1H), 6,17-6,33 (m, 1H), 7,36-7,43 (m, 3H), 8,20-8,25 (m,2H), 9,52 (s,lH); MS (ES): 360,2 (M+l).

Eksempel 6

En blanding av 4-klor-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]-pyrimidin (0,70 g, 2,72 mmol) og 1,2-diaminoetan (10,0 ml, 150 mmol) ble kokt under tilbakeløp under inert atmosfære i 6 timer. Overskytende amin ble fjernet in vacuo, residuet ble vasket sekvensielt med eter og heksan for å gi 0,75 g(98%) av 4-(2-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES); 282,2 (M+l), 265,1 (M-NH3) .

Eksempel 7

Til en oppløsning av 4-(2-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (70,0 mg, 0,249 mmol) og trietylamin (50,4 mg, 0,498 mmol) i diklormetan (2,0 ml) ble det tilsatt propionylklorid (25,6 mg, 0,024 ml, 0,274 mmol) ved 0°C. Etter 1 time ble blandingen konsentrert in vacuo og residuet ble utsatt for preparativ tynnsjikt kromotografi (EtOAc) for å gi 22,0 mg (26%) av 4-(2-propio-nylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]-pyrimidin. MS (ES): 338,2 (M+l).

De følgende forbindelser ble fremstilt på lignende måte som den i eksempel 7: 4-(2-N'-metylureaetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 2,13 (s, 3H), 2,32 (s, 3H), 3,53 (d,3H), 3,55 (m, 2H), 3,88 (m, 2H), 4,29 (m, 1H), 5,68 (t, 1H), 5,84 (m, 1H), 7,42 (m,3H), 8,36 (dd,2H), 9,52 (S,1H); MS (ES): 339, 3 (M+l).

4-(2-N'-etylureaetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 353,2 (M+l).

Eksempel 8:

Til en oppløsning av 1-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkar-bodiimid hydroklorid (41,1 mg, 0,215 mmol), dimetylamino-pyridin (2,4 mg, 0,020 mmol) og druesyre (18,9 mg, 0,015 ml, 0,215 mmol) i diklormetan (2,0 ml) ble det tilsatt 4-(2-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]-pyrimidin (55,0 mg, 0,196 mmol). Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Vanlig opparbeidelse og kolonne kromotografi (EtOAc) ga så 10,0 mg (15%) av 4-(2'-pyruvyl-amidoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 352,2 (M+l).

Eksempel 9:

Til en oppløsning av 4-(2-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (60,0 mg, 0,213 mmol) i diklormetan (2,0 ml) ble det tilsatt N-trimetylsilyl iso-cyanat (43,3 mg, 0,051 ml, 0,320 mmol). Blandingen ble om-rørt ved romtemperatur i 3 timer fulgt av tilsetning av vandig natrium bikarbonat. Etter filtrering gjennom en liten mengde silikagel, ble filtratet konsentrert in vacuo til tørrhet for å gi 9,8 mg (14%) av 4-(2-ureaetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES): 325,2 (M+l).

De følgende forbindelser ble fremstilt på lignende måte som den i eksempel 9: dl-4-(2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,28-1,32 (d, J=8 Hz, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,96 (s,3H), 2,30 (s, 3H), 3,78-3,83 (m, 2H), 4,10-4,30 (m, 1H), 5,60-5,66 (t, J=6 Hz, 1H), 7,40-7,51 (m, 3H), 8,36-8,43 (m,2H), 10,83 (s,lH); MS (ES): 338,2 (M+l).

(R)-4-(2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,31 (d, 3H), 1,66 (s, 3H), 1,99 (s,3H), 2,31 (s, 3H), 3,78-3,83 (m, 2H), 4,17-4,22 (m, 1H), 5,67 (t, 1H), 7,38-7,5 (m, 3H), 8,39 (m,2H), 10,81 (s,lH); MS (ES): 338,2 (M+l).

(R)-4-(l-metyl-2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,41 (d, 3H), 1,68 (s, 3H), 2,21 (s,3H), 2,34 (s, 3H) , 3, 46-3, 52 (br, m, 2H), 4,73 (m, 1H), 5,22 (d, 1H) , 7,41-7,46 (m, 3H), 8,36-8,40 (m,2H), 8,93 (s,lH); MS (ES): 338,2 (M+l).

(S)-4-(2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,31 (d, 3H), 1,66 (s, 3H), 2,26 (s,3H), 2,35 (s, 3H), 3,78-3,83 (m, 2H), 4,17-4,22 (m, 1H), 5,67 (t, 1H), 7,38-7,5 (m, 3H), 8,39 (m,2H), 8,67 (s,lH); MS (ES): 338,2 (M+l).

(R)-4-(l-metyl-2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,41 (d, 3H), 1,68 (s, 3H), 2,05 (s,3H), 2,32 (s, 3H), 3, 46-3, 52 (m, 2H), 4,73 (m, 1H), 5,22 (d, 1H) , 7,41-7,46 (m, 3H), 8,36-8,40 (m,2H), 10,13 (s,lH); MS (ES): 338,2 (M+l).

Eksempel 10:

Omsetning av 4-klor-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]-pyrimidin ved blandingen av dl-l-amino-2-(1,1-dimetyletok-sy) karbonylamino-propan og dl-2-amino-l-(1,1-dimetyle-toksy) karbonylamino-propan ble foretatt på lignende måte som den i eksempel 1. Reaksjonen ga en blanding av dl-4-(l-metyl-2-(1,1-dimetyletoksy) karbonylamino) etylamino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin og dl-4-(2-metyl-2-(1,1-dimetyletoksy) karbonylamino) etylamino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin som ble separert med kolonne kromatografi (EtOAc:heksaner=l:3). Den første fraksjon var dl-4-(l-metyl-2-(1,1-dimetyletoksy)karbonyl-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,29-1, 38 (m, 12H) , 1,95 (s, 3H), 2,31 (s,3H), 3,34-3,43 (m,2H), 4,62-4,70 (m, 1H), 5, 36-5, 40 (d,J=8 Hz, 1H) , 5,53 (br, 1H) , 7, 37-7,49 (m, 3H) , 8,37-8,44 (m,2H), 10,75 (s,lH); MS 396,3 (M+l). Den andre fraksjonen var dl-4-(2-(1,1-dimetyletoksy)karbonylamino-propyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,26-1,40 (m, 12H), 2,00 (s, 3H), 2,31 (s,3H), 3,60-3,90 (m,2H), 3,95-4,10 (m, 1H), 5,41-5,44 (d,J=6,0 Hz, 1H), 5,65 (br, 1H), 7,40-7,46 (m, 3H), 8,37-8,44 (m,2H), 10,89 (s,lH); MS (ES): 396,2 (M+l).

De følgende forbindelser ble fremstilt på lignende måte som den i eksempel 10: (S,S)-4-(2-acetylaminosykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,43 (m, 4H), 1,60 (s, 3H) , 1,83 (s,2H), 2,18 (s,3H), 2,30 (m, 2H), 2,32 (s, 3H), 3,73 (br, 1H), 4,25 (br, 1H), 5,29 (d,lH), 7,43-7,48 (m,3H), 8,35-8,40 (m,2H), 9,05 (s,lH).

4-(2-metyl-2-acetylaminopropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo [2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,51 (s, 6H) , 1,56 (s, 3H) , 2,07 (s,3H), 2,36 (s,3H), 3,76(d, 2H), 5,78 (t, 1H), 7,41-7,48 (m, 3H), 7,93 (s, 1H), 8,39 (m,2H), 10,07 (S,1H); MS (ES): 352,3 (M+l).

Eksempel 11: dl-4-(l-metyl-2-(1,1-dimetyletoksy)karbonylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (60,6 mg, 0,153 mmol) ble behandlet med trifluoreddiksyre (0,5 ml) i diklormetan (2,0 ml) i 14 timer. Det organiske oppløsnings-middel ble fjernet in vacuo til tørrhet. Residuet ble oppløst i N,N-dimetylformamid (2,0 ml) og trietylamin (2,0 ml). Til oppløsningen ble det tilsatt ved 0°C eddiksyreanhydrid (17,2 mg, 0,016, 0,169 mmol). Den resulterende blanding ble omrørt ved romtemperatur i 4 8 timer og så konsentrert in vacuo til tørrhet. Residuet ble utsatt for preparativ tynnsjiktskromatografi (EtOAc) for å gi 27,0 mg (52%) av dl-4-(l-metyl-2-acetylaminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 6 1,381,42 (d, J=8 Hz, 3H), 1,69 (s, 3H), 2,01 (s,3H), 2,32 (s,3H), 3,38-3,60(m, 2H), 4,65-4,80 (m, 1H), 5,43-5,26 (d, J=8 Hz, 1H), 7,40-7,51 (m, 3H), 8,37-8,43 (m,2H), 10,44 (S,1H); MS (ES): 338,2 (M+l).

Eksempel 12: (R,R)-4- (2-aminocykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin, fremstilt på lignende måte som den i eksempel 1 fra 4-klor-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin (0,15 g, 0,583 mmol) og (IR,2R)-(-)-1,2-diaminosykloheksan (0,63 g, 5,517 mmol), ble behandlet med trietylamin (0,726 g, 7,175 mmol) og eddiksyreanhydrid (0,325 g, 3,18 mmol) i N,N-dimetylformamid (10,0 ml) ved romtemperatur i 2 timer. Etter fjerning av oppløsningsmid-let in vacuo ble etylacetat (10,0 ml) og vann (10,0 ml) tilsatt til residuet. Blandingen ble separert og det vandige lag ble ekstrahert med etylacetat (2 x 10,0 ml). Den kombinerte etylacetatoppløsning ble tørket (MgS04) og filtrert. Filtratet ble konsentrert in vacuo til tørrhet og residuet ble utsatt for kolonne kromatografi (EtOAc; heksan=l:l) for å gi 57,0 mg (26%) av (R,R)-4-(2-acetylamino-sykloheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. <1>R NMR (200 MHz, CDC13) 5_1,43 (m, 4H), 1,60 (s, 3H), 1,84 (m,2H), 2,22 (s,3H), 2,30(m, 2H), 2,33 (s, 3H), 3,72 (br, 1H), 4,24 (br, 1H), 5,29 (d,lH), 7,43-7,48 (m,3H), 8,35-8,39 (m,2H), 8,83 (s,lH); MS (ES): 378,3 (M+l).

Eksempel 13:

Til en oppløsning av 4-(2-hydroksyetyl) amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (40,0 mg, 0,141 mmol) i pyridin (1,0 ml) ble det tilsatt eddiksyreanhydrid (0,108 g, 1,06 mmol) ved 0°C. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer og oppløsningsmidlet ble fjernet in vacuo. Residuet ble utsatt for preparative tynnsjiktskromatografi (EtOAc:heksan=l:1) for å gi 32,2 mg (71%) av 4-(2-acetyloksyetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin. <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 6_1,90 (s, 3H), 2,08 (s, 3H), 2,31 (s,3H), 4,05 (m,2H), 4,45(t, 2H), 5,42 (m, 1H), 7,41-7,49 (m, 3H), 8,42 (m, 2H), 11,23 (s,lH).

Eksempel 14:

En oppløsning av Fmoc-(3-Ala-OH (97,4 mg, 0,313 mmol) og okalylklorid (39,7 mg, 27,3 ^1, 0,313 mmol) i diklormetahn (4,0 ml) med 1 dråpe N,N-dimetylformamid ble omrørt ved 0°C i 1 time fulgt av tilsetning av 4-(2-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (80,0 mg, 0,285 mmol) og trietylamin (57,6 mg, 79,4 ^1, 0,570 mmol) ved 0°C. Etter 3 timer ble blandingen konsentrert in vacuo og residuet ble behandlet med en oppløsning av 20% piperidin i N,N-dimetylformamid (2,0 ml) i 0,5 time. Etter fjerning av oppløsningsmidlet in vacuo ble residuet vasket med dietyl-eter:heksan (1:5) for å gi 3,0 mg (3%) av 4-(6-amino-3-aza-4-oksoheksyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2, 3d]-pyrimidin. MS (ES):353,2 (M+l).

Eksempel 15:

En oppløsning av 4-(2-aminoetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin (70,0 mg, 0,249 mmol) og rav-syreanhydrid (27,0 mg, 0,274 mmol) i diklormetan (4,0 ml) med en dråpe av N, N-dimetylformamid ble omrørt ved romtemperatur i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble ekstrahert med 20% natriumhydroksid (3 x 5,0 ml). Den vandige oppløs-ning ble surgjort med 3 M saltsyre for å gi pH = 7,0. Hele blandingen ble ekstrahert med etylacetat (3 x 10 ml). Den kombinerte organiske oppløsning ble tørket (MgS04) og filtrert. Filtratet ble konsentrert in vacuo til tørrhet for å gi 15,0 mg (16%) av 4-(7-hydroksy-3-3aza-4,7-dioksohep-tyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES: 382,2 (M+l).

Eksempel 16:

Til 10 ml dimetylformamid (DMF) ved romtemperatur ble det tilsatt 700 mg 4-cis-3-hydroksysyklopentyl)amino-2-fenyl-5,6-dimetyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin fulgt av 455 mg N-Boc glysin, 20 mg N,N-dimetylaminopyridin (DMAP), 293 mg hydroksybenzotriasol (HOBT) og 622 mg 1-(3-dimetylamino-propyl)-3-etylkarboiimid hydroklorid (EDC1). Reaksjonsblandingen ble oppbevart under omrøring over natten. DMF ble så fjernet under redusert trykk og reaksjonsblandingen ble fordelt mellom 20 ml etylacetat og 50 ml vann. Den vandige del ble ekstrahert ytterligere med 2 x 20 ml etylacetat og de kombinerte organiske deler ble vasket med saltlake, tørket over vannfri natriumsulfat, filtrert og konsentrert. Opprenskning på silikagel, eluering med etylacetat/heksan ga 410 mg av det ønskede produkt: 4-(cis-2-(N-t-butoksykarbonyl-2-aminoacetoksy)syklopentyl) amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS (ES)

(M+l)=480,2. Esteren ble så behandlet med 5 ml 20% trifluoreddiksyre i diklormetan ved romtemperatur, oppbevart over natten og så konsentrert. Triturering (pulveri-sering) med etylacetat ga 300 mg av et offwhite fast stoff; 4-(cis-3-(2-aminoacetoksy)syklopentyl) amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin trifluoreddiksyre salt, MS (ES) (M+l)=380,l.

Fagpersonen vil forstå at de følgende forbindelser kan bli syntetisert ved metodene beskrevet ovenfor:

4-(cis-3-hydroksycyklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=323,l. 4-(cis-3-(2(aminoacetoksy)syklopentyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin trifluoreddiksyre salt, MS (ES) (M+l)=380,l. 4-(3-acetamid)piperidinyl-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=364,2. 4-2(2-N'-metylureapropyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=353,4. 4-(2-acetamidbutyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo-[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=352,4. 4-(2-N'-metylureabutyl)amino-5,6-dimetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=367,5. 4-(2-aminosyklopropylacetamidetyl)amino-5,6-dimetyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=309,l. 4-(trans-4-hydroksysykloheksyl)amino-2-(3-klorfenyl)- 7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=342,8. 4-(trans-4-hydroksysykloheksyl)amino-2-(3-fluorfenyl)-7H-pyrrolo [2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=327,2. 4-(trans-4-hydroksysykloheksyl)amino-2-(4-pyridyl)-7H-pyr-rolo [2,3d]pyrimidin MS (ES) (M+l)=310,2. Eksempel 17

Pyrrolnitrogenet av (7) (skjema IX) ble beskyttet med di-t-betyldikarbonat under basiske betingelser for å gi det tilsvarende karbamat (22). Radikal brominering av (22) fortsatte regioselektivt for å gi bromid (23). Generelt virket forbindelse (23) som et elektrofilt nøkkelinterme-diat for forskjellige nukleofile koblingspartnere. Erstatning av alkylbromidet med natriumfenolat trihydrat ga forbindelse (24). Etterfølgende erstatning av arylklorid og fjerning av t-betyl karbamat beskyttende gruppe opptrådde i et trinn noe som ga den ønskede forbindelse (25).

Detaljert syntese av forbindelse (22)-(25) i samsvar med skjema IX

Di-t-butyldikarbonat (5,37 g, 24,6 mmol) og dimetylamino-pyridin (1,13 g, 9,2 mmol) ble tilsatt til en oppløsning inneholdende (7) (1,50 g, 6,15 mmol) og pyridin (30 ml). Etter 20 timer ble reaksjonsblandingen konsentrert og residuet ble fordelt mellom CH2CI2 og vann. CH2CI2 laget ble atskilt, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi et sort fast stoff. Flash kromatografi (Si02; 1/9 EtOAc/heksaner, Rf 0,40) ga 1,70 g (80%) av et hvitt fast stoff (22). <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_8,50 (m, 2H, Ar-H), 7,45 (m, 3H,Ar-H), 6,39 (s,1H,pyrrol-H), 2,,66 (s,3H, pyrrol-CH3) , l,76(s, 9H, karbamat-CH3) ,MS, M+l=344,l; Mpt=175-177°C.

N-Bromosuccinimid (508 mg, 2,86 mmol) og AIBN (112 mg, 0,68 mmol) ble tilsatt til en oppløsning inneholdende (22) (935 mg, 2,71 mmol) og CC14 (50 ml). Oppløsningen ble oppvarmet til tilbakeløp. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og konsentrert in vacuo for å gi et hvitt fast stoff. Flash kromatografi (Si02; 1/1 CH2Cl2/heksaner, Rf 0,30) ga 960 mg (84%) av et hvitt fast stoff (23). <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_8,52 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 6,76 (s,1H,pyrrol-H), 4,93 (s,2H, pyrrol-CH2Br) , l,79(s, 9H, karbamat-CH3) ,MS, M+l=423, 9; Mpt=155-157°C.

Natriumfenoksidtrihydrat (173 mg, 1,02 mmol) ble tilsatt i en del til en oppløsning av bromid (23) (410 mg, 0,97 mmol) oppløst i CH2C12 (5 ml) og DMF (10 ml). Etter 2 timer ble reaksjonsoppløsningen fordelt mellom CH2C12 og vann. Vannlaget ble ekstrahert med CH2C12. De kombinerte CH2C12 lag ble vasket med vann, tørket over MgSO-j, filtrert og konsentrert for å gi et gult fast stoff. Flash kromatografi (Si02; 1/6 EtOAc/heksaner, Rf 0,30) ga 210 mg (50%) av et hvitt fast stoff (21). <X>H NMR (200 MHz, CDC13) 5_8,53 (m, 2H, Ar-H), 7,48 (m, 3H, Ar-H), 7,34 (m,2H,Ar-H), 7,03 (s,3H,Ar-H), 6,83 (s, 1H, pyrrol-H), 5,45 (s,2H, ArCH20) , l,76(s, 9H, karbamat-CH3) ,MS, M = 436,2.

En oppløsning inneholdende (25) (85 mg, 0,20 mmol), N-ace-tyletylendiamin (201 mg, 1,95 mmol) og DMSO (3 ml) ble oppvarmet til 100°C. Etter 1 time ble temperaturen hevet til 130°C. Etter 3 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og fordelt mellom EtOAc og vann. Vannlaget ble ekstrahert med EtOAc (2x). De kombinerte EtOAc lag vaskes med vann, tørkes over MgS04, filtreres og konsentreres. Flash kromatografi (Si02; 1/10 EtOH/CHCl3, Rf, 0,25) ga 73 mg (93%) av et hvitt skumaktig fast stoff (25). <1>R NMR (200 MHz, d6-DMSO) 5 11,81 (br s, 1H, N-H), 8,39 (m, 2H, Ar-H), 8,03 (br t, 1H, N-H), 7,57 (br t, 1H, N-H), 7,20-7,50 (m, 5H, Ar-H), 6,89-7,09 (m, 3H, Ar-H), 6,59 (s, 1H, pyrrol-H), 5,12 (s, 2H, ArCH20) , 3,61 (m, 2H, NCH2) , 3,36 (m, 2H, NCH2) , 1,79 (s, 3H, COCH3) ; MS, M + 1 = 402, 6.

De følgende forbindelser ble fremstilt på en måte som lig-ner den i eksempel 17: 4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-fenoksymetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin. smp. 196-197 °C; MS(ES): 401,6 (M"+l).

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(4-fluorfenoksy)metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 420, 1 (M++l) .

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(4-klorfenoksy)metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 436, 1 (M++l) .

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(4-metoksyfenoksy)metyl-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 432,1 (M<+>+l).

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(N-pyridin-2-on)metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 403,1 (M<+>+l).

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(N-fenylamino)metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 400, 9 (M"+l) .

4-(2-acetylaminoetyl)amino-6-(N-metyl-N-fenylamino)metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 414,8 (M"+l).

4-(2-N'-metylureaetyl)amino-6-fenoksymetyl-2-fenyl-7H-pyr-rolo[2,3d]pyrimidin. MS(ES): 416,9 (M"+l).

Eksempel 18: Syntese av adenosin Ai-antagonister Forbindelse 1319 og forbindelse 1320 (tabell 13 nedenfor) kan syntetiseres med de generelle prosedyrer heri.

Forbindelse 1319 (81 %) <1>H NMR (d6-DMSO) 6 1,37 (m, 4H), 1,93 (m, 2H), 2,01 (m, 2H), 4,11 (brs, 1H), 4,61 (d, 1H, J = 4,4 Hz), 6,59 (m, 1H), 7,09 (m, 1H), 7,21 (m, 2H), 7,49 (dd, 1H, J = 8 Hz, 14 Hz), 8,03 (m, 1H), 8,18 (d, 1H, J = 8 Hz), 11,55 (brs, 1H) . MS(ES):327, 0 (M"+l) .

Forbindelse 1320 (31 %) MS(ES):343,1 (M"+l).

Eksempel 19: Syntese av adenosin Ai-antagonist Forbindelse 1321 (tabell 13 nedenfor) kan syntetiseres med de generelle prosedyrer som er gitt nedenfor.

Forbindelse 28 (10,93 g, 50,76 mmol) ble oppløst i DMF (67 ml). 4-amidinopyridinhydroklorid (8,0 g, 50,76 mmol) og DBU (15,4 g, 101,5 mmol) ble tilsatt sekvensielt og reak-sj onsblandingen ble oppvarmet til 85 °C. Etter 22 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og DMF ble fjernet in vacuo. Den mørke olje ble fortynnet med 2M HC1 (80 ml). Reaksjonsblandingen ble tillatt å stå. Etter 2 timer ble oppløsningen avkjølt til 10 °C og filtrert. Det faste stoffet ble vasket med kaldt vann og tørket for å gi 7,40 g av et gult faststoff, forbindelse 29 (69 %). <X>H NMR (200 MHz, d6-DMSO) 6 6,58 (s, 1H) , 7,27 (s, 1H), 8,53 (d, 2H, J = 5,6), 9,00 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 12,53 (brs, 1H). MS(ES):212,8 (M"+l).

Forbindelse 29 (7,4 g, 29,8 mmol) ble fortynnet med POCL3, og oppvarmet til 105°. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og POCl3-materialet ble fjernet in vacuo. Den tykke mørke olje fortynnes med MeOH (75 ml) fulgt av eter (120 ml). Det amorfe røde faste stoffet filtreres og vaskes med eter for å gi 3,82 g av et rødt faststoff. Det urene faststoff er omtrent 80 % rent og benyttes uten yttereligere opprenskning i den neste reaksjon. MS(ES):230,7 (M++l) .

Forbindelse 1321 <1>R NMR (15 %) (200 MHz, d6-DMSO) 5 1,38

(m, 4H) , 1,92 (brs, 2H), 2,02 (brs, 2H), 3,44 (brs, 1H), 4,14 (brs, 1H), 4,56 (d, 1H, J = 4 Hz), 6,63 (m, 1H), 7,15

(m, 1H), 7,32 (d, 1H, J = 6,2 Hz), 8,20 (d, 2H, J = 4,4 Hz), 8,65 (d, 2H, J = 4,4 Hz), 11,67 (brs, 1H). MS(ES):310,2 (M<+>+l).

Forbindelse 1501 (tabell 15 nedenfor) <1>H-NMR (70 %) (200 MHz, CD3OD) 6 1,84 (s, 3H), 3,52 (t, 2H, J = 6,9 Hz), 3,83 (t, 2H, J = 6,0 Hz), 6,51 (d, 1H, J = 3,4 Hz), 7,06 (d, 1H, J = 3,8 Hz), 7,42 (m, 3H), 8,36 (m, 2H) . MS(ES):296,0 (M++l) .

Forbindelse 1502 (tabell 15 nedenfor) MS(ES):345,0 (M~+l) .

Forbindelse 1500 (tabell 15 nedenfor) <1>H-NMR (200 MHz, CDCI3) 6 1,40-1,80 (m, 6H), 1,85-2,10 (m, 2H), 2,18 (s, 3H), 2,33 (s, 3H), 2,50 (d, 3H), 3,90-4,10 (m, 2H) , 4,76 (m, 1H), 5,50 (d, 1H), 6,03 (m, 1H), 7,40 (m, 3H), 8,37 (m, 2H), 9,15 (brs, 1H). MS(ES):393,3 (M~+l) .

Eksempel 20: Syntese av adenosin Ai-antagonist Forbindelse 1504 (tabell 15 nedenfor) kan syntetiseres med de generelle prosedyrer som er gitt nedenfor.

Forbindelse 31 (200 mg, 0,47 mmol) ble oppløst i DCM (4 ml). Trietylamin (51 mg, 0,5 mmol) og tiomorfolin (52 mg, 0,5 mmol) ble tilsatt sekvensielt. Oppløsningen ble blandet i flere minutter og tillatt å stå i 72 timer. Reak-sj onsblandingen ble fortynnet med DCM og H20 og lagene ble avskilt. Det vandige lag ble ekstrahert med DCM. De kombinerte DCM lag ble tørket over MgS04, filtrert og konsentrert. Etyleter ble tilsatt til grovt prøven og det resulterende faste stoff ble filtrert for å gi 100 mg av et hvitt faststoff, 32 (62 %) . <1>H-NMR (200 MHz, CDC13) 5 1,76 (s, 9H), 2,66 (brs, 2H), 2,79 (brs, 2H), 3,86 (s, 2H), 7,46 (m, 3H) , 8,50 (m, 2H) .

Forbindelse 32 ble kombinert med DMSO (3 ml) og trans-4-aminocykloheksanol (144 mg, 1,25 mmol) og ble oppvarmet til 130 °c i 4 timer. Reaksjonsblandingen ble avkjølt til romtemperatur, og fortynnet med EtOAc og H20. Lagene ble avskilt og det vandige lag ble ekstrahert med EtOAc (2 x). De kombinerte organiske lag ble vasket med H20 og saltlake, tørket over MgSO,}, filtrert og konsentrert. Kromatografi (silika, 8:1 CHCl3/EtOH) ga 32 mg av en lys brun olje. Etyleter ble tilsatt og det resulterende faste stoffet ble filtrert for å gi 5 mg av et hvitt faststoff (9 %). OSIC-148265: <1>H-NMR (200 MHz, CD3OD) : 5 1,44 (m, 6H) , 2,03 (brm, 2H), 2,21 (brm, 2H), 2,70 (brm, 8H), 3,63 (m, 4H), 3,92 (m, 1H), 4,26 (brs, 1H), 6,42 (s, 1H), 7,42 (m, 3H), 8,33 (m, 2H) .

Eksempel 21: Syntese av adenosin Ai-antagonist

Forbindelse 1503 (tabell 15 nedenfor) kan syntetiseres med de generelle prosedyrer gitt nedenfor.

Bromidet, forbindelse 31 (220 mg, 0,47 mmol) ble oppløst i 1:1 DMF:diklormetan (5 ml). Til dette ble det tilsatt K2C03 (71 mg, 0,52 mmol) og morfolin (0,047 ml, 0,47 mmol). Blandingen ble tillatt å omrøres ved romtemperatur over natten. Oppløsningsmidler ble fjernet in vacuo og residuet ble fordelt mellom H20 og diklormetan. Det organiske lag ble tørket med MgSO-j, filtrert og konsentrert for å gi et off-white faststoff som ved triturering med eter/heksaner ga 175 mg av et hvitt faststoff, 33 (84 %). <1>H-NMR (200 MHz, CDC13) : 5 1,9 (9H, s), 2,54 (4H, s) , 3,65 (4H, s) , 3,85 (1H, s), 6,59 (1H, s), 7,45 (3H, m), 8,5 (2H, m).

Forbindelse 33 (50 mg, 0,11 mmol) og trans-4-aminocykloheksanol (105 mg, 0,91 mmol) ble tatt opp i DMSO (2 ml). Den resulterende oppløsning ble spydd med N2 og så oppvarmet til 100 °C i et oljebad og omrørt over natten. Grovre-aksjonsblandingen ble helt opp i vann og ekstrahert to ganger med etylacetat (50 ml). De kombinerte organiske lag ble vasket med H20. Etter tørking med MgSC>4 og filtrering, ble det organiske lag konsentrert in vacuo for å gi et oransje faststoff, kromatografi (silika, 10 % CH3OH i CH2C12) ga 15 mg (33 %) . <1>H-NMR (200 MHz, CDC13) : 6 1,24-1,62 (4H, m), 1,85 (2H, m), 2,10 (2H, m), 2,26 (4H, m), 3,53 (4H, m), 4,22 (1H, m), 4,73 (1H, m), 5,85 (1H, d), 6,15 (1H, s), 7,25 (3H, m), 8,42 (2H, M), 10,0 (1H, s). MS(ES):408 (M<+>+l).

Forbindelser 1500, 1501 og 1502 kan syntetiseres ved å bruke lignende fremstillingstrinn fra eksempel 20 ved å behandle forbindelse 32 med et passende substituert amin.

Gjær p-galaktosidase reportergenassays for human adenosin Ai- og A2a-reseptor: Gjærstammer (S. cerevisiae) ble transformert med human adenosin Ai (AiR; CADUS-stamme CY12660) eller human A2a (A2a; CAUDS-stamme CY8362) og tilsetningen av et lacZ ((3-galaktosidase)reportergen for å benyttes om en funksjonell avles-ning. En fullstendig beskrivelse av transformasjonene er opplistet nedenfor (se gjærstammer). NECA (5'-N-etylkar-boksamidoadenosin), som er en kraftig adenosinreseptorago-nist med lignende affinitet for Ai- og A2a-reseptorer, ble benyttet som en ligand for alle assays. Forsøksforbindelser ble undersøkt ved 8 konsentrasjoner (0,1-10,000 nM) for egenskapen å inhibere NECA-indusert (3-galaktosidase aktivitet av CY12660 eller CY8362.

Fremstilling av gjærstamkulturer: Hver av de respektive gjærstammer, CY12660 og CY8362, ble streket på en LT-agar-plate og inkubert ved 30 °C inntil kolonier ble observert. Gjær fra disse kolonier ble tilsatt til LT-medium (pH 6,8) og dyrket over natten ved 30 °C. Hver gjærstamme ble så fortynnet til en OD600 = 1, 0-2, 0 (omtrent 1-2 x IO<7 >celler/ml), som bestemt spektorfotometrisk (Molecular Devices VMAX). For hver 6 ml av flytende gjærkultur ble 4 ml av 40 % glyserol (1:1,5 vol:vol) tilsatt ("gjær/glyse-rolstamoppløsning"). Fra denne gjær/glyserolstamoppløsning, ble ti 1 ml alikvoter fremstilt og lagret ved -80 °C inntil benyttet for assay.

Gjær A]R- og A2aR-assay: En ampulle hver av CY8362 og CY12660 gjær/glyserolstamoppløsning ble tint og benyttet for å inokulere supplementert LT-væskemedium, pH 6,8 (92 ml LT-væske, til hvilken blir tilsettes: 5 ml 40 % glukose, 0,45 ml IM KOH og 2,5 ml Pipes, pH 6,8). Flytende kulturer ble dyrket 16-18 timer (over natten) ved 30 °C. Alikvoter fra overnattningskulturer ble så fortynnet i LT-medium, inneholdende 4U/ml adenosindeaminase (type VI eller VII fra kalvetarmmukose, Sigma), for å oppnå OD60o = 0,15 (1,5 x 10<7 >celler/ml) for CY8362 (A2aR) og OD600 = 0, 50 (5 x IO<6 >celler/ml) for CY12660 (AXR).

Assays ble utført med et sluttvolum på 100 ul i 96-brønners mikrotiterplater, slik at en sluttkonsentrasjon på 2 % DMSO ble oppnådd i alle brønner. For primær utvelgelse, ble 1-2 konsentrasjoner av forsøksforbindelser benyttet (10 ul, 1 uM). For forbindelsesprofilering ble 8 konsentrasjoner undersøkt (10.000, 1.000, 500, 100, 50, 10, 1 og 0,1 nM). Til hver mikrotiterplate, ble 10 ul av 20 % DMSO tilsatt til "kontroll" og "total" brønner mens 10 ul av forsøksforbindelse (i 20 % DMSO) ble tilsatt til "ukjente" brønner. Derpå ble 10 ul NE CA (5 uM for AXR, 1 uM for A2aR) tilsatt til "total" og "ukjent" brønner; 10 ul av PBS ble tilsatt til "kontroll" brønnene. I slutt-tilsetningen ble 80 ul av gjærstamme CY8362 eller CY12660 tilsatt til alle brønner. Alle plater ble så omrørt kort (LabLine orbital shaker 2-3 minutter) og tillatt å inkubere i 4 timer ved 30 °C i en tørr ovn.

P-Galaktosidaseaktivitet kan bli mengdebestemt ved å bruke enten kolorimetriske (for eksempel ONPG, CPRG), luminisente (for eksempel Galacton-Star) eller fluorometriske substra-ter (for eksempel FDG, Resorufin). For tiden er fluore-scenspåvisning foretrukket på basis av overlegen signal:støyforhold relativ frihet fra interferens og lave omkostninger. Fluorescein digalaktopyranosid (FDG, Molecular Probes eller Marker Gene Technologies) som er et fluorescent p-galaktosidasesubstrat ble tilsatt til alle brønner ved 20 ^l/brønn (sluttkonsentrasjonen = 80 ^M). Plater ble ristet i 5-6 sekunder (LabLine orbital shaker) og så inkubert ved 37 °C i 90 minutter (95 % 02/5 % C02 in-kubator) . Ved slutten av den 90 minutters lange inkube-ringsperioden ble p-galaktosidaseaktivitet stoppet ved å bruke 20 ^l/brønn av IM Na2C03 og alle plater ble ristet i 5-6 sekunder. Plater ble så bestemt ved å bruke et fluoro-meter (Tecan Spectrafluor; eksitasjon = 485 nm, emisjon = 535 nm).

Utregninger: Relative fluorescensverdier for "kontroll"-brønner ble tolket som bakgrunn og trukket fra "total"- og "ukjent"-verdiene. Forbindelsesprofiler ble analysert via logaritmisk transformasjon (x-akse: forbindelseskonsentra-sjon) fulgt av på stedet konkurransekurvetilpasning for å regne ut IC50-verdier (GraphPad Prism).

Gjærstammer: Sakkaromyciske cerevisiae stammer CY12660 [farl<*>1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4::trpl::LYS2 ste3<*>1156 gpal(41)-Gai3 lys2 ura3 leu2 trpl: his3; LEU2 PGKp-MfalLeader-hAlR-PH05term 2mu-orig REP3 Ampr] og CY8362 [gpalp-rGasElOK farl<*>1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4::trpl: LYS2 ste3<*>1156 lys2 ura3 leu2 trpl his3; LEU2 PGKp-hA2aR 2muori REP3 Ampr] ble utviklet.

LT-medium: LT (Leu-Trp supplementert) medium består av 100 g DIFCO gjærnitrogenbase, supplementert med det følgende: 1,0 g valin, 1,0 g aspartinsyre, 0,75 g fenylalanin, 0,9 g lysin, 0,45 g tyrosin, 0,45 g isoleucin, 0,3 g metionin, 0. 6 g adenin, 0,4 g uracil, 0,3 g serin, 0,3 g prolin, 0,3 g cystein, 0,3 g arginin, 0,9 g histidin og 1,0 g treonin.

Konstruksjon av gjærstammer som uttrykker Human Ai adenosinreseptor

I dette eksempel blir konstruksjonen av gjærstammer som uttrykker en human Ai adenosinreseptor funksjonelt integrert i gjærferomonsystemveien beskrevet.

1. Ekspresjonsvektorkonstruksjon

For å konstruere en gjærekspresjonsvektor for den humane Ai adenosinreseptor ble Ai adenosinreseptor cDNA fremstilt med revers transkriptase PCR av human hippocampus mRNA ved å bruke primere som er utformet basert på den publiserte sekvens av den humane Ai adenosinreseptoren og standard teknikker. PCR-produktet ble subklonet i Ncol- og Xbal-se-tene av gjærekspresjonsplasmidet pMP15.

pMPl5-plasmidet ble dannet fra pLPXt som følger: Xbal-sete av YEP51 (Broach, J.R. et al. (1983) "Vectors for high-level, inducible expression of cloned genes in yeast" s. 83-117 i M. Inouye (ed.), Experimental Manipulation of Gene Expression. Academic Press, New York) ble fjernet med spaltning, endefylling og religering for å danne Yep51NcoDXba. Et annet Xbal-sete ble dannet ved BamHI-setet ved spaltning ved BamHI, endefylling, linker (New England Biolabs, # 1081) ligering, Xbal-spaltning og re-ligering for å danne YEP51NcoXt. Dette plasmid ble spaltet med Esp31 og Ncol og ligert til Leu2 og PGKp-fragmenter dannet med PCR. Det 2 kb store Leu2 PCR-produkt ble dannet ved amplifikasjon fra YEPSlNco ved å bruke primere inneholdende Esp31 og Bglll-seter. Det 660 basepar store PGKp PCR-produkt ble dannet ved amplifikering fra pPGKas (Kang, Y.-

S. et al. (1990) Mol. Cell. Biol. 10: 2582-2590) med PCR-primere inneholdende Bglll og Ncol-seter. Det resulterende plasmid kalles plPXt. pLPXt ble modifisert ved å sette inn det kodende området for a-faktor pre-pro-lederen i Ncol-setet. Prepro-lederen ble satt inn slik at Ncol-kloningssetet ble opprettholdt ved den 3' ende av lederen, men ikke regenerert ved den 5' ende. På denne måte kan reseptorer bli klonet ved spaltning av plasmidet med Ncol og Xbal. Det resulterende plasmid kalles pMP15.

pMP15-plasmidet inn i hvilket det ble satt inn den humane Ai adenosinreseptor cDNA ble betegnet p5095. I denne vektor er reseptor cDNA fusert til den 3' ende av gjær a-faktor preprolederen. Under proteinutvikling blir prepro peptid-sekvensene spaltet for å danne ferdigutviklet reseptor av full lengde. Dette inntreffer under prosessering av reseptoren via den sekretoriske gjærveien. Dette plasmid blir opprettholdt med Leu-seleksjon (det vil si vekst på medium som mangler leucin). Sekvensen av det klonede området ble bestemt og funnet å være ekvivalent med den i den publiserte litteratur (GenBank tilgangsnummer S45235 og S56143).

II. Gjærstammekonstruksjon

For å danne en gjærstamme som uttrykker den humane Ai adenosinreseptor ble gjærstamme CY7967 benyttet som den parentale utgangstamme. Genotypen til CY7967 er som følger: MATa gpaD1163 gpal(41)Gai3 farlD1442 tbt-1 FUS1-HIS3 canl stel4::trpl::LYS2 ste3D1156 lys2 ura3 leu2 trpl his3

En oversikt over de genetiske markører er gitt nedenfor:

To plasmider ble transformert i stamme CY7967 ved elektro-porering: plasmid p5095 (som koder for human Ai adenosinreseptor beskrevet ovenfor) og plasmid pl584, som er et FUS1-P-galaktosidase reportergenplasmid. Plasmid pl584 var avledet fra plasmid pRS426 (Christianson, T.W. et al.

(1992) Gene 110:119-1122). Plasmid pRS426 inneholder et polylinkersete ved nukleotider 2004-2016. En fusjon mellom FUSl-promoteren og p-galaktosidasegenet ble satt inn ved restriksjonssetene Eagl og Xhol for å danne plasmid pl584. pl584-plasmidet opprettholdes ved Trp-seleksjon (det vil si vekst på medium som mangler leucin).

Den resulterende stamme som bærer p5095 og pl584 referert til som CY12660 uttrykker den humane Ai adenosinreseptoren. Til å dyrke denne stamme i væske eller på agarplater ble minimalt medium som mangler leucin og tryptofan benyttet. For å utføre et vekstassay på plater (for å undersøke FUS1-HIS3) ble platene holdt ved pH 6,8 og inneholdt 0,5-2,5 mM 3-amino-l,2,4-triazol og manglet leucin, tryptofan og histidin. Som en kontroll for spesifisitet ble en sammenlig-ning med en eller flere andre gjærbaserte syv transmembrane reseptorundersøkelser inkludert i alle forsøk.

Konstruksjon av gjærstammer som uttrykker human A2a adenosinreseptor

I dette eksempel er konstruksjonen av gjærstammer som uttrykker en human A2a adenosinreseptor funksjonelt integrert i gjærferomonsystemveien beskrevet.

I. Ekspresjon av vektorkonstruksjon

For å konstruere en gjærekspresjonsvektor for den humane A2a adenosinreseptor ble den humane A2a reseptor cDNA skaffet fra Dr. Phil Murphy (NIH). Ved mottakelse av denne klon ble a2a reseptorinnskuddet sekvensert og funnet å være identisk med den publiserte sekvens (GenBank tilgangsnummer S46950). Reseptor cDNA ble spaltet ut fra plasmidet ved PCR med VENT polymerase og klonet i plasmidet pLPBX, som driver reseptorekspresjon med en konstituitiv Fosfoglycerat Kinase (PGK) promoter i gjær. Sekvensen av hele innskuddet ble igjen sekvensert og funnet å være identisk med den publiserte sekvens. Imidlertid, ut fra kloningsstrategien som var benyttet, fantes det tre aminosyrer lagt til karboksy-terminalen av reseptoren, GlySerVal.

II. Gjærstammekonstruksjon

For å danne en gjærstamme som uttrykker den humane A2a adenosinreseptor ble gjærstamme CY8342 benyttet som den parentale utgangsstamme. Genotypen av CY8342 er som følger: MATa farlD1442 tbtl-1 lys2 ura3 leu2 trpl his3 fusl-HIS3 canl ste3D1156 gpaD1163 stel4::trpl::LYS2 gpalp-rGasE10K (eller gpalp-rGasD229S eller gpalp-rGasE10K+D229S) .

De genetiske markører er som beskrevet i eksempel 1, bortsett fra for G-proteinvariasjonen. For human A2a-reseptorekspresjon ble gjærstammer benyttet hvor det endogene G gjærprotein GPA1 hadde blitt fjernet og erstattet med et pattedyr Gas. Tre Gas rottemutanter ble benyttet. Disse varianter inneholder en eller to punktmutasjoner som omdanner dem til proteiner som kobler effektivt til gjær Py. De blir identifisert som Gas-E10K (hvor glutaminsyren ved posisjon ti er erstattet med lysin), GasD229S (hvor asparaginsyren ved posisjon 229 er erstattet med serin) og GasE10K+D229S (som inneholder begge punktmutasjoner).

Stamme CY8342 (som bærer en av de tre mutante rotte Gas-proteiner) ble transformert med enten den parentale vektor pLPBX (Reseptor") eller med pLPBX-A2a (Reseptor+) . Et plasmid med FUSl-promoteren fusert til p-galaktosidase-kodende sekvenser (beskrevet ovenfor) ble lagt til for å bekrefte aktiveringsgraden av feromonresponsveien.

Funksjonelt assay som bruker gjærstammer som uttrykker human Ai adenosinreseptor

I dette eksemplet er utviklingen av et funksjonelt under-søkende assay i gjær for modulatorer av den humane Ai adenosinreseptor beskrevet.

I. Ligander benyttet i assay

Adenosin som er en naturlig agonist for denne reseptor, så vel som to andre syntetiske agonister, ble benyttet for utvikling av dette assay. Adenosin ble rapportert å ha en EC50 på omtrent 75 nM og (-)-N6-(2-fenylisopropyl)-adenosin (PIA) med en rapportert affinitet på omtrent 50 nM ble benyttet i et subsett av forsøk. 5'-N-etylkarboksamidoadeno-sin (NECA) ble benyttet i alle vekstassays. For å forhindre signalisering grunnet tilstedeværelsen av et adenosin i vekstmediet ble adenosin deaminase (4U/ml) tilsatt til alle assays.

II. Biologisk respons i gjær

Egenskapen til Ai adenosinreseptoren for funksjonelt å koble i et heterologt gjærsystem ble undersøkt ved å inn-føre Ai reseptor ekspresjonsvektoren (p5095, beskrevet ovenfor) i en serie av gjærstammer som uttrykte forskjellige G-protein subenheter. Hoveddelen av disse transformanter uttrykte Ga subenheter av Gai eller Gao subtyper. Ytterligere Ga proteiner ble også undersøkt for mulig iden-tifikasjon av promiskuøs reseptor-Ga proteinkobling. I forskjellige stammer ble en STE18 eller en kimerisk STE18-Gy2 konstruksjon integrert i genomet hos gjæren. Gjærstam-mene inneholdt et defekt HIS3-gen og en integrert kopi av FUS1-HIS3 for derved å tillate utvelgelse i selektivt medium inneholdende 3-amino-l,2,4-triazol (undersøkt ved 0,2, 0,5 og 1,0 mM) og uten histidin. Transformanter ble isolert og monolag ble fremstilt på medium inneholdende 3-amino-1,2,4-triazol, 4 U/ml adenosin deaminase og uten histidin. Fem mikroliter av forskjellige konsentrasjoner av ligand (for eksempel NECA ved 0, 0,1, 1,0 og 10 mM) ble påført. Vekst ble overvåket i 2 dager. Ligandavhengige vekstresponser ble undersøkt på denne måte i forskjellige gjærstammer. Resultatene er oppsummert i tabell 1 nedenfor. Symbolet (-) indikerer at ligandavhengig reseptoraktivering ikke ble påvist mens (+) betegner ligandavhengig respons. Uttrykket "LIRMA" indikerer liganduavhengig reseptormediert aktivering.

Som indikert i tabell 3 ble den kraftigste signalisering funnet å inntreffe i en gjærstamme som uttrykker GPAi (41)-Gai3 kimeraf orbindelse.

III fus1-LacZ-assay

For å karakterisere aktivering av feromonresponsveien mer fullstendig ble syntese av p-galaktosidase via fuslLacZ som respons på agoniststimulering målt. For å utføre p-galato-sidaseassayet ble økende konsentrasjoner av ligand tilsatt til midtlogaritmisk kultur av human Ai adenosinreseptor uttrykt i en gjærstamme som samtidig uttrykker Stel8-Gy2 ki-meraforbindelsen og GPA4i-Gai3. Transformanter ble isolert og dyrket over natten ved nærvær av histidin og 4 u/ml adenosin deaminase. Etter 5 timer inkubering med 4 U/ml adenosin deaminase og ligand ble induksjon av p-galaktosidase målt ved å bruke CPRG som substrat for p-galaktosid. 5 x IO<5> celler ble brukt pr assay.

De oppnådde resultater med NECA-stimulering indikerte at ved en NECA-konsentrasjon på IO<-8> M ble omtrent 2 ganger stimulering av p-galaktosidaseaktivitet oppnådd. Videre ble en stimuleringsindeks på omtrent 10 ganger observert ved en NECA-konsentrasjon på IO"<5> M.

Anvendbarheten av dette assay ble utvidet ved validering av aktiviteten av antagonister på denne stamme. To kjente ade-nosinantagonister, XAC og DPCPX, ble undersøkt for deres egenskap å konkurrere mot NECA (ved 5 mM) for aktivitet i p-galaktosidaseassayet. I disse assays ble p-galaktosidase-induksjonen målt ved å bruke FDG som substrat og 1,6 x IO<5 >celler pr assay. Resultatene indikerte at både XAC og DPCPX virket som kraftige antagonister for gjæruttrykk Ai adenosinreseptor med ICso-verdier på henholdsvis 44 nM og 49 nM.

For å bestemme om denne inhibitoriske effekt var spesifikk for Ai subtypen ble en serie komplementære forsøk utført med de gjærbaserte A2a reseptorassay (beskrevet i eksempel 4). Resultater oppnådd med det A2a gjærbaserte assay indikerte at XAC var en relativt effektiv A2a reseptorantagonist, noe som er konsistent med publiserte rapporter. I motsetning til dette var DPCPX relativt inert ved denne reseptor som forventet fra publiserte rapporter.

IV. Radioligandbinding

Ai adenosinreseptorassayet ble ytterligere karakterisert ved måling av reseptorens radioligandbindende parametere. Utskiftningsbinding av [<3>H]CPX av flere adenosinreseptor referanseforbindelser, XAC, DPCPX og CGS ble analysert ved å bruke membraner preparert fra gjær som uttrykker den humane Ai adenosinreseptor. Resultatene med gjærmembraner som uttrykker den humane A1 adenosinreseptor ble sammenlignet med dem fra gjærmembraner som uttrykker den humane A2a adenosinreseptor eller den humane A3 reseptor for å undersøke bindingsspesifisiteten. For å utføre assayet ble femti mg membraner inkubert med 0,4 nM [<3>H]CPX og økende konsentrasjoner av adenosinreseptorligander. Inkubering var i 50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA, 10 mM MgCl2, 0,25 % BSA og 2 U/ml adenosin deaminase ved nærvær av proteaseinhibitorer i 60 minutter ved romtemperatur. Binding ble avsluttet ved tilsetning av iskald 50 mM Tris-HCl, pH 7,4 pluss 10 mM MgCl2, fulgt av rask filtrering over GF/B-filtere på forhånd mettet med 0,5 % polyetylenemin ved å bruke en Packard 96-brønners innhøster. Data ble analysert med ikke-lineære minste kvadrat kurvetilpasningsprosedyre ved å bruke Prism 2.01 program. ICso-verdiene oppnådd i dette forsøk er oppsummert i tabell 4 nedenfor.

Disse data indikerer at referanseforbindelsene har affini-teter som er konsistente med dem rapportert i litteraturen. Dataene indikerer videre at de gjærbaserte assays er av tilstrekkelig følsomhet for å skjelne reseptortype spesifisitet .

Funksjonelt assay som bruker gjærstammer som uttrykker human A2a adenosinreseptor

I dette eksempel er utviklingen av et funksjonelt undersø-kelsesassay i gjær for modulatorer av den humane Ai adenosinreseptor beskrevet.

I. Ligander benyttet i assay

Den naturlige ligand adenosin, så vel som andre grundig ka-rakteriserte og kommersielt tilgjengelige ligander ble benyttet for studium av den humane A2a reseptor funksjonelt uttrykt i gjær. Tre ligander har blitt brukt ved etable-ringen av dette assay. De innbefatter:

For å forhindre signalisering grunnet tilstedeværelsen av adenosin i vekstmediet ble adenosin deaminase (4U/ml) tilsatt til alle assays.

II. Biologisk respons i gjær

A2a reseptoragonister ble undersøkt for sin kapasitet å stimulere feromonresponsveien i gjær transformert med A2a reseptorekspresjonsplasmid og som uttrykker enten GasE10K, GasD229S eller GasElOK+D229S. Egenskapen hos liganden til å stimulere feromonresponsveien på en reseptoravhengig måte ble indikert ved en endring i gjærfenotypen. Reseptoraktivering modifiserte fenotypen fra histidin auxotrofi til histidin prototrofi (aktivering av fusl-HIS3). Tre uavheng-ige transformanter ble isolert og dyrket over natten ved nærvær av histidin. Celler ble vasket for å fjerne histidin og fortynnet til 2 x IO<6> celler/ml. 5 ul av hver transfor-mant ble utflekket på ikke-selektivt medium (innbefattende histidin) eller selektivt medium (1 mM AT) ved fravær eller nærvær av 4 U/ml adenosin deaminase. Plater ble dyrket ved 30 °C i 24 timer. Ved nærvær av histidin var både reseptor"1"

(R<+>) og reseptor- (R~) stammer i stand til vekst. Imidlertid, ved fravær av histidin vokser kun R<+->celler. Siden ingen ligand hadde blitt tilsatt til disse plater, var to forklaringer mulige for dette resultat. En mulig tolkning var at den reseptorbærende gjær hadde en vekstfordel grunnet liganduavhengig reseptormediert aktivering (LIRMA). Alternativt kunne gjæren ha syntetisert liganden adenosin. For å skjelne mellom disse to muligheter ble et enzym som spalter liganden adenosin deaminase (ADA) tilsatt til den voksende gjær og plater. Ved nærvær av adenosin deaminase vokste R<+->celler ikke lenger ved fravær av histidin, noe som indikerer at gjærorganismene faktisk syntetiserte liganden .

Denne tolkning ble bekreftet med et A2a vekstassay i væske. I dette forsøk ble R<+->gjær (en GasE10K-stamme som uttrykker A2a-reseptoren) inokulert ved tre tettheter (1 x IO<6 >celle/ml; 3 x IO<5> celle/ml eller 1 x IO<5> celle/ml) ved nærvær eller fravær av adenosin deaminase (4 U/ml). Stringen-sen av assayet ble øket med økende konsentrasjoner (0, 0,1, 0,2 eller 0,4 mM) av 3-amino-l,2,4-triazol (AT), som er en kompetitiv antagonist av imidazolglycerol-P dehydrogenase som er proteinproduktet av HIS3-genet. Ved nærvær av adenosin deaminase og 3-amino-l,2,4-triazol vokser gjær mindre kraftig. Imidlertid, ved fravær av 3-amino-l,2,4-triazol, hadde adenosin deaminase liten effekt. Således hadde adenosin deaminase i seg selv ingen direkte effekt på feromonresponsveien.

En alternativ måte å måle vekst og en som kan bli miniaty-risert for høyeffektsundersøkelse er et A2a reseptorligand flekkassay. En GasE10K-stamme som uttrykker A2a-reseptoren (A2aR+) eller som mangler reseptoren (R-) ble dyrket over natten ved nærvær av histidin og 4 U/ml adenosin deaminase. Celler ble vasket for å fjerne histidin og fortynnet til 5 x IO<6> celler/ml. 1 x IO<6> celler ble spredd ut på selektive plater som inneholder 4 U/ml adenosin deaminase og 0,5 eller 1,0 mM 3-amino-l,2,4-triazol (AT) og tillatt å tørke i 1 time. 5 ul av de følgende reagenser ble påført på mono-laget: 10 mM adenosin, 38,7 mM histidin, dimetylsulfoksid (DMSO), 10 mM PIA eller 10 mM NECA. Celler ble dyrket i 24 timer ved 30 °C. Resultatene viste at celler uten reseptor bare kunne vokse når histidin var tilsatt til mediet. I motsetning til dette vokste R<+->celler bare i områder hvor A2a reseptorligandene PIA og NECA hadde blitt påsatt. Siden platene inneholdt adenosin deaminase, bekreftet mangelen på vekst hvor adenosin hadde blitt påsatt at adenosin deaminase var aktiv.

III. fusi LacZ assay

For å mengdebestemme aktivering av gjærparringsveien ble syntese av p-galaktosidase via fuslLacZ målt. Gjærstammer som uttrykker GasE10K, GasD229S eller GasE10K+D229S ble transformert med et plasmid som koder for den humane A2a reseptor (R+) eller med et plasmid som mangler reseptoren (R-). Transformanter ble isolert og dyrket over natten ved nærvær av histidin og 4 U/ml adenosin deaminase. 1 x IO<7 >celler ble fortynnet til 1 x IO<6> celler/ml og eksponert til økende konsentrasjoner av NECA i 4 timer fulgt av bestemmelse av p-galaktosidaseaktiviteten i cellene. Resultatene viste at i hovedsak ingen p-galaktosidaseaktivitet ble påvist i R- stammer, mens økende mengde av p-galaktosidaseaktivitet ble påvist i R+ stammer som uttrykker enten GasE10K, GasD229S eller GasE10K+D229S ettersom konsentrasjo-nen av NECA økte, noe som indikerer en doseavhengig økning i enheter av p-galaktosidase påvist som respons på eksponering til øket ligandkonsentrasjon. Denne doseavhengighet ble kun observert i celler som uttrykker A2a reseptoren. Videre var det kraftigste Gas konstruksjon for A2a-reseptoren GasE10K. GasD229S-konstruksjonen var den nest kraftigste Gas-konstruksjonen for A2a-reseptoren, mens GasE10K+D229S-konstruksjonen var den minst kraftige av de undersøkte tre Gas-konstruksjoner selv om til og med GasElOK+D229S-konstruksjonen lett stimulerte påvisbare mengder av p-galaktosidaseaktivitet .

For en videre beskrivelse av de identifiserte assays, se U. S. søknad, serienr. 09/088985, med tittelen "Functional Expression of Adenosin Receptors in Yeast", innlevert 2. juni 1998 (Fullmektig mappe nr. CPI-093) hvorav hele inn-holdet er inkorporert her pr referanse.

Farmakologisk karakterisering av de humane adenosinreseptor subtyper

Materiale og metoder

Materialer [<3>H]-DPCPX [Cyklopentyl-1,3-dipropylxantin, 8-[dipropyl-2,3-3H(N) ] (120,0 Ci/mmol) [<3>H]-CGS 21680, [kar-boksyetyl-<3>H (N) ] (30 Ci/mmol) og [125<1>] -AB-MECA ([<125>I]-4-aminobenzyl-5'-N-metylkarboksamidoadenosin) (2,200 Ci/mmol) ble innkjøpt fra new England Nuclear (Boston MA). XAC (Xantine amin kongener), NECA (5'-N-etylkarboksamidoadeno-sin) og IB-MECA fra Research Biochemicals International (RBI, Natick, MA). Adenosin deaminasen og fullstendig proteaseinhibitor blandingstabletter ble innkjøpt fra Boehringer Mannheim Corp. (Indianapolis, IN). Membraner fra HEK-293 celler som stabilt uttrykker den humane adenosin 2a [RB-HA2a], adenosin 2b [RB-HA2b] eller adenosin 3 [RB-HA3] reseptor subtypene ble henholdsvis innkjøpt fra Receptor Biology (Beltsville, MD). Cellekulturreagenser var fra Life Technologies (Grand Island, NY) bortsett fra for serum som var fra Hyclone (Logan, UT).

Gjærstammer: Saccharomyces cerevisiae stammer CY12660 [farl<*>1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4::trpl::LYS2 ste3<*>1156 gpal (41)-Gai3 lys2 ura3 leu2 trpl: his3; LEU2 PGKp-MfalLeader-halR-PH05term 2mu-orig REP3 Ampr] og CY8362 [gpalp-rGasElOK farl<*>1442 tbtl-1 fusl-HIS3 canl stel4::trpl: LYS2 ste3<*>1156 lys2 ura3 leu2 trpl his3; LEU2 PGKp-hA2aR 2mu-ori REP3 Ampr] ble utviklet som beskrevet ovenfor.

Gjærkultur: Transformert gjær ble dyrket i Leu-Trp (LT) medium (pH 5,4) supplementert med 2 % glukose. For fremstilling av membraner ble 250 ml av LT-medium inokulert med starttiter på 1-2 x IO<6> celler/ml fra en 30 ml overnat-ningskultur og inkubert ved 30 °C under permanent oksygene-ring ved rotering. Etter 16 timers vekst ble cellene inn-høstet med sentrifugering og membraner ble preparert som beskrevet nedenfor.

Pattedyrvevskultur: HEK-293 celler som stabilt uttrykte det humane adenosin 2a reseptor subtype (Cadus klon # 5) ble dyrket i Dulbeco's minimalt essensielt medium (DMEM) supplementert med 10 % fetalt bovint serum og IX penicil-lin/streptomycin under selektivt trykk ved å bruke 500 mg/ml G418 antibiotikum ved 37 °C i en fuktet 5 % C02 atmosfære .

Gjærcelle membranpreparater: 250 ml kulturer ble innhøstet etter overnattingsinkubering ved sentrifugering ved 2000 x g i en Sorvall RT6000 sentrifuge. Celler ble vasket i is-kaldt vann, sentrifugert ved 4 °C og pelletten ble resuspendert i 10 ml iskald lysisbuffer [5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA og 5 mM EGTA] supplementert med Protease inhibitor blandingstabletter (1 tablett pr 25 ml buffer). Glass-kuler (17 g, Mesh 400-600, Sigma) ble tilsatt til suspen-sjonen og cellene ble brutt med kraftig virvling ved 4 °C i 5 minutter. Homogenatet ble fortynnet med ytterligere 30 ml lysisbuffer pluss proteaseinhibitorer og sentrifugert ved 3000 x g i 5 minutter. Derpå ble membranene pelletert ved 36.000 x g (Sorvall RC5B, type SS34 rotor) i 45 minutter. Den resulterende membranpellet ble resuspendert i 5 ml membranbuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,6 mM EDTA og 5 mM MgCl2] supplementert med protease inhibitor blandingstabletter (1 tablett pr 50 ml buffer) og lagret ved -80 °C for ytterligere forsøk.

Pattedyrcelle membranpreparater: HEK-293 cellemembraner ble fremstilt som beskrevet tidligere (Duzic E et al.: J. Biol. Chem., 267, 9844-9851, 1992). Kort fortalt ble celler vasket med PBS og innhøstet med en gummikølle. Celler ble pelletert ved 4 °C 200 x g i en Sorvall RT6000 sentrifuge. Pelletten ble resuspendert i 5 ml/skå av lysisbuffer ved 4 °C (5 mM Tris-HCl, pH 7,5, 5 mM EDTA, 5 mM EGTA, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 mg/ml pepstatin A og 10 mg/ml aprotinin) og homogenisert i en Dounce homogenisator. Cellelysatet ble så sentrifugert ved 36.000 x g (Sorvall RC5B type SS34 rotor) i 45 minutter og pelletten ble resuspendert i 5 ml membranbuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,5, 0,6 mM EDTA, 5 mM MgCl2, 0,1 mM fenylmetylsulfonylfluorid, 10 mg/ml pepstatin A og 10 mg/ml aprotinin] og lagret ved -80 °C for ytterligere forsøk.

Bio-Rad protein assay sett, basert på Bradford fargebin-dingsprosedyren (Bradford, M.: Anal. Biochem. 72:248

(1976)) ble brukt for å bestemme total proteinkonsentrasjon i gjær og pattedyrmembraner.

Adenosin 1 reseptor subtypemetning og radioligand konkurransebinding: Metning og konkurransebinding på membraner fra gjærceller transformert med human Ai reseptor subtype ble utført ved å bruke antagonist [<3>H] DPCPX som en radioaktiv ligand. Membraner ble fortynnet i bindingsbuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,4, inneholdende 10 mM MgCl2, 1,0 mM EDTA, 0,25 % BSA, 2 U/ml adenosin deaminase og 1 proteaseinhibitor blandingstablett/50 ml] ved konsentrasjoner på 1,0 mg/ml.

I metningsbinding ble membraner (50 ug/brønn) inkubert med økende konsentrasjoner av [<3>H] DPCPX (0,05 - 25 nM) i et sluttvolum på 100 ul av bindingsbuffer ved 25 °C i 1 time ved fravær og nærvær av 10 uM umerket XAC i en 96-brønners mikrotiterplate.

I konkurransebinding ble membraner (50 ug/brønn) inkubert med [<3>H]DPCPX (1,0 nM) i et sluttvolum på 100 ml bindingsbuffer ved 25 °C i en time ved fravær og nærvær av 10 uM umerket XAC eller økende konsentrasjoner av konkurrerende forbindelser i en 96-brønners mikrotiterplate.

Adenosin 2a reseptor subtype konkurrerende radioligandbinding: Konkurrerende binding på membraner fra HE293 celler som stabilt uttrykte den humane A2a reseptor subtype ble utført ved å bruke agonist [<3>H] CGS-21680 som en radioaktiv ligand. Membraner ble fortynnet i bindingsbuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,4, inneholdende 10 mM MgCl2, 1,0 mM EDTA, 0,25 % BSA, 2 U/ml adenosin deaminase og 1 protease inhibitor blandingstablett/50 ml] ved konsentrasjoner på 0,2 mg/ml. Membraner (10 ug/brønn) ble inkubert med [<3>H] CGS-21680 (100 nM) i et sluttvolum på 100 ml bindingsbuffer ved 25 °C i 1 time ved fravær og nærvær av 50 uM umerket NECA eller økende konsentrasjoner av konkurrerende forbindelser

1 en 96-brønners mikrotiterplate.

Adenosin 3 reseptor konkurrerende radioligandbinding: Konkurrerende binding på membraner fra HEK293-celler som stabilt uttrykte den humane A3 reseptor subtype ble utført ved å bruke agonist [12<5>I] AB-MECA som en radioaktiv ligand. Membraner ble fortynnet i bindingsbuffer [50 mM Tris-HCl, pH 7,4, inneholdende 10 mM MgCl2, 1,0 mM EDTA, 0,25 % BSA, 2 U/ml adenosin deaminase og 1 proteaseinhibitor blandingstablett/50 ml] ved konsentrasjoner på 0,2 mg/ml. Membraner (10 ug/brønn) ble inkubert [<125>I] AB-MECA (0,75 nm) i et sluttvolum på 100 ul bindingsbuf f er ved 25 °C i 1 time ved fravær og nærvær av 10 uM umerket IB-MECA eller økende konsentrasjoner av konkurrerende forbindelser i en 96-brønners mikrotiterplate.

Ved slutten av inkuberingen ble Ai, A2a og A3 reseptor subtyper radioligandbindingsassays avsluttet ved tilsetning av iskald 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) buffer supplementert med 10 mM MgCl2, fulgt av rask filtrering over glassfiberfiltere (96-brønners GF/B UniFilters, Packard på forhånd mettet i 0,5 % polyetylenimin i en Filtermate 196 celleinnhøster (Packard). Filterplatene ble tørket belagt med 50 ul/brønn scintilleringsvæske (MicroScint-20, Packard) og opptalt i en TopCount (Packard). Assays ble utført i triplikat. Ikke-spesifikk binding var 5,6 ± 0,5 %, 10,8 ± 1,4 % og 15,1 ± 2,6 % av den totale binding i et henholdsvis AIR-, A2aR- og A3R-bindingsassay.

Adenosin 2b reseptor subtype konkurrerende radioligandbinding: Konkurrerende binding på membraner fra HEK293 celler som stabilt uttrykte den humane A2b reseptor subtype ble utført ved å bruke Ai reseptorantagonist [<3>H] DPCPX som en radioaktiv ligand. Membraner ble fortynnet i bindingsbuffer

[10 mu Hepes-KOH, pH 7,4, inneholdende 1,0 mM EDTA, 0,1 mM Benzamidin og 2 u/ml adenosin deaminase] ved konsentrasjoner på 0,3 mg/ml. Membraner (15 ug/brønn) ble inkubert med [<3>H] DPCPX (15 nM) i et sluttvolum på 100 ul bindingsbuffer ved 25 °C i 1 time ved fravær og nærvær av 10 uM umerket XAC eller økende konsentrasjoner av konkurrerende forbindelser i en 96-brønners mikrotiterplate. Ved slutten av inkuberingen ble assayet avsluttet ved tilsetning av iskald 10 mM Hepes-KOH (pH 7,4) buffer fulgt av rask filtrering over glassfiberfiltre (96-brønner GF/C UniFilters, Packard) på forhånd mettet i 0,5 % polyetylenimin i en Filtermate 196 celleinnhøster (Packard). Filterplatene ble tørket belagt med 50 ul/brønn scintilleringsvæske (MicroScint-20, Packard) og opptelt i en TopCount (Packard). Assays ble ut-ført triplikat. Ikke-spesifikk binding var 14,3 +2,3 % av den totale binding.

Spesifikk binding av [<3>H] DPCPX, [<3>H] CGS-21680 og [125I] AB-MECA ble definert som forskjellen mellom den totale binding og ikke-spesifikk binding. Prosentvis inhibering av forbindelsene ble regnet ut mot total binding. Konkurre-ringsdata ble analysert med iterativ kurvetilpasning til en ensete modell og Ki-verdier ble regnet ut fra ICso-verdier

(Cheng and Prusof, Biochem. Pharmacol. 22, 3099-3109, 1973)

ved å bruke GraphPad Prizm 2.01 programmet.

Resultater

En primær funksjon av visse celleoverflatereseptorer er å gjenkjenne passende ligander. Følgelig bestemte søker li-gandbindingsaffiniteter for å etablere den funksjonelle in-tegritet av Adenosin 1 reseptor subtypen uttrykt i gjær. Grovmembraner fremstilt fra Saccharomyces cerevisiae transformert med human Adenosin 1 reseptor subtypekonstruksjon oppviste spesifikk mettbar binding av [<3>H] DPCPX med en KD på 4,0 + 0,19 nM. KD- og Bmax-verdien ble regnet ut fra met-ningsisotermen og Scatchard-transformasjonen av dataene indikerte en enkel klasse av bindingsseter. Tetthetene av adenosin bindingsseter i gjærmembranpreparatene ble beregnet til 716,8 ± 4 3,4 fmol/mg membranprotein.

De farmakologiske subtypekarakteristika av de rekombinante gjærceller transformert med human Ai reseptor subtype ble undersøkt med subtypeselektive adenosinligander (XAC, DPCPX, CGS-15943, forbindelse 600, forbindelse 1002, NECA, (R)-PIA, IB-MECA og Alloxazin) som konkurrerte med [<3>H] DPCPX i den forventede rangeringsorden. Erstatningskurver nedtegnet med disse forbindelser viser den typiske bratthet med alle ligandene og dataene for hver av ligandene kunne bli modulert med énsetetilpasning. De observerte dissosia-sjonskonstanter beregnet for de enkelte forbindelser fra kurvene (tabell 5) er konsistente med verdien publisert for reseptoren oppnådd fra andre kilder.

Tabell 6 til 12 viser effektiviteten og strukturaktivitets-profilene av deazapuriner ifølge oppfinnelsen. Tabell 13 og 14 viser at selektivitet kan bli oppnådd for humane adeno-sinreseptorseter ved modulering av funksjonaliteten omkring deazapurinstrukturen. Tabell 14 viser også den overraskende oppdagelse at forbindelsene avgitt heri har subnanomolar aktivitet og høyere selektivitet for A2b-reseptoren sammenlignet med forbindelsene i tabell 13.

Forbindelser som er spesifikke for Aia reseptoren Oppsummering.

Foreliggende oppfinnelse er også basert på forbindelser som selektivt binder til adenosin A2a-reseptor for derved å behandle en sykdom assosiert med A2a adenosinreseptor i et individ. Sykdommen som skal behandles er assosiert med for eksempel en lidelse i sentralnervesystemet, en kardiovaskulær lidelse, en nyrelidelse, en inflammatorisk lidelse, en gastrointestinal lidelse, en øyelidelse, en allergisk lidelse eller en respiratorisk lidelse for å inhibere aktiviteten av en A2a adenosinreseptor i en celle som omfatter å sette nevnte celle i kontakt med de ovenfor nevnte forbindelser.

Nevnte A2a adenosinreseptor kan være assosiert med Parkinsons sykdom og sykdommer assosiert med bevegelsesaktivitet, vasodilasjon, blodplateinhibering, nevtrofil superoksiddannelse, kognitiv lidelser eller senil demens.

Lidelser assosiert med adenosin Al-, A2a-, A2b- og A3-reseptorer er beskrevet i WO 99/06053 og WO-09822465, WO-09705138, WO-09511681, WO-09733879, JP-09291089, PCT/US98/16053 og U.S. patentnr. 5,516,894.

Oppfinnelsen blir videre illustrert av de følgende eksempler. Det bør bli forstått at modellene som brukes gjennom eksemplene er aksepterte modeller og at påvisning av effektivitet i disse modeller forutsigende for effektivitet i mennesker.

Foreliggende oppfinnelse blir bedre forstått fra de eksperimentelle detaljer som følger. Imidlertid vil fagpersonen lett forstå at de spesielle metoder og resultater som er diskutert kun er illustratoriske for oppfinnelsen. Eksempel 22: Syntese av adenosin A2a- antagonister, forbindelser 1601, 1602 og 1603.

Forbindelse 26 (10,93 g, 50,76 mmol) ble oppløst i DMF (67 ml). 4-amidinopyridinhydroklorid (8,0 g, 50,76 mmol) og DBU (15,4 g, 101,5 mmol) ble tilsatt sekvensielt og reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 85 °C. Etter 22 timer ble re-aks j onsblandingen avkjølt til romtemperatur og DMF ble fjernet in vacuo. Den mørke olje ble fortynnet med 2M HC1 (80 ml). Reaksjonsblandingen ble tillatt å stå. Etter 2 timer ble oppløsningen avkjølt til 10 °C og filtrert. Det faste stoffet ble vasket med kaldt vann og tørket for å gi 7,40 g av et gult faststoff, forbindelse 27 (69 %). <X>H NMR (200 MHz, d6-DMSO) 5 6,58 (s, 1H) , 7,27 (s, 1H), 8,53 (d, 2H, J = 5,6), 9,00 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 12,35 (brs, 1H). MS(ES):212,8 (M"+l).

Forbindelse 27 (7,4 g, 29,8 mmol) ble fortynnet med P0C13 og oppvarmet til 105 °C. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og POCI3 ble fjernet in vacuo. Den tykke mørke olje fortynnes med MeOH (75 ml) fulgt av eter (120 ml). Det amorfe røde faste stoff filtreres og vaskes med eter for å gi 3,82 g av et rødt faststoff. Det urene faste stoff, forbindelse 28 er omtrent 80 % rent og benyttes uten ytterligere opprenskning i neste reaksjon. <1>R NMR (200 MHz, d6-DMSO) 5 6,58 (s, 1H) , 7,27

(s, 1H) , 8,53 (d, 2H, J = 5,6), 9,00 (d, 2H, J = 5,2 Hz), 12,35 (brs, 1H). MS(ES):212,8 (M"+l).

Forbindelse 1601: DMSO (5 ml) og D-prolinol (500 mg, 4,94 mmol) ble tilsatt til forbindelse 28 (500 mg, 2,17 mmol). Reaksjonsblandingen ble oppvarmet til 120 °C. Etter 18 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og fortynnet med EtOAc og H20. Lagene ble avskilt og det vandige lag ble ekstrahert med EtOAc (2x). De kombinerte organiske lag ble vasket med H20 (2x), saltoppløsning, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi 200 mg av et lys brunt faststoff. Det faste stoffet ble rekrystallisert fra EtOAc for å gi 82 mg av et lys brunt faststoff (13 %). <X>H NMR (200 MHz, d6-DMSO) 5 2,05 (m, 4H), 3,43 (m, 1H), 3,70-4,00 (m, 3H), 4,50 (brs, 1H), 4,92 (brs, 1H), 6,62 (m, 1H), 7,22 (m, 1H), 8,22 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 6,64 (d, 2H, J = 6,2 Hz), MS(ES):296,0 (M"+l), smp. = 210-220 °C (dekomp.).

Forbindelse 1602: Kromatografi (silika, 9:1 CHC13/MeOH) ga 10 mg av et lys brunt faststoff (2 %) . <X>H NMR (d6-DMSO) 5 2,00-2,50 (m, 4H), 4,05 (m, 1H), 4,21 (m, 1H), 6,71 (d, 1H, J = 3,2 Hz), 7,18 (d, 1H, J = 3,2 Hz), 8,37 (d, 2H, J = 4,8 Hz), 8,56 (d, 2H, J = 5,0 Hz). MS(ES):309, 1 (M"+l) .

Forbindelse 1603: Kromatografi (silika, 20:1 heksa-ner/EtOAc) ga 135 mg av et lys brunt faststoff (53 %). <X>H NMR (d6-DMSO) 5 2, 00 (m, 4H) , 3,43 (brs, 1H) , 3,74 (brs, 2H), 3,87 (brs, 1H), 4,49 (brs, 1H), 4,93 (m, 1H), 6,56 (m, 1H), 7,12 (m, 1H), 7,40 (m, 3H), 8,34 (m, 2H), 11,62 (brs, 1H). MS(ES):295,1 (M"+l).

Forbindelse 1605: I 50 ml RBF ble 60 mg 2-(4'-pyridyl)-4-klorpyrimidinopyrrol HCl-salt oppløst i 2 ml vannfritt DMSO. 3-(R)-hydroksy-(D)-prolinol TFA-salt (380 mg) og 500 mg natriumbikarbonat ble tilsatt til dette. Blandingen ble så spydd med nitrogengass i 5 minutter og oppvarmet til 130 °C. Etter 2 timer ble reaksjonsblandingen avkjølt til romtemperatur og DMSO ble fjernet in vacuo. Residuet ble fordelt mellom EtOAc (15 ml) og mettet natriumbikarbonat vandig oppløsning (15 ml). Det organiske lag ble avskilt og vasket med saltlake (15 ml) og tørket over Na2S04. Etter fjerning av oppløsningsmidlet ble råproduktet renset med preparativ TLC (CH2Cl2/MeOH = 95/5) for å gi 35 mg (50 %) . <1>H NMR (200 MHz, CDC13) 2,3-2,5 (1H) , 3,4-3,8 (3H) , 4,4-4,6 (2H), 6,4 (1H); 7,1 (1H); 8,2 (d, 1H) ; 8,7 (d, 2H) ; 11,0 (1H). MS(ES):312 (M"+l).

Eksempel 23: Syntese av adenosin A2a- antagonist, forbindelse 1606

Forbindelse 28 (200 mg) ble behandlet med DMF (30 ml), (-dimetylglysinmetylester) (73 mg HCl-salt i 2 ml vann) og 500 mg natriumbikarbonat. Etter 18 timer ble DMF fjernet in vacuo. Residuet ble fordelt mellom EtOAc (30 ml) og mettet natriumbikarbonat vandig oppløsning (15 ml). Det organiske lag ble vasket med saltlake (15 ml), tørket over natriumsulfat, filtrert og konsentrert. Kromatografi (silika, 10:4 heksaner/EtOAc) ga 150 mg av rent produkt, forbindelse 29 (69 %) . <X>H NMR (200 MHz, CDC13) , 1,4 (s, 6H) , 3,8 (s, 3H) ; 3,9 (s, 2H) , 6,4 (s, 1H) ; 7,4-7,5 (m, 3H) ; 8,4 (m, 2H) ; 9,8 (s, 1H).

Forbindelse 1606:

Prosedyre er den samme som forbindelse 1605 (72 %). <1>H NMR (200 MHz, CDC13), 1,3 (s, 6H) , 1,7-1,9 (m, 2H) ; 2,05-2,30 (m, 2H); 3,6-4,1 (m, 11H); 4,80-4,95 (m, 1H); 6,4 (s, 1H); 7,4-7,6 (m, 3H); 8,3-8,4 (d, J = 8,5 Hz, 2H), 10 (s, 1H). MS(ES):424,0 (M"+l).

De følgende forbindelser kan bli syntetisert på den samme måte.

Forbindelse 1600: (51 %) MS(ES):326,0 (M"+l).

Forbindelse 1607: <X>H NMR (200 MHz, CDC13) , 1, 40-1, 80 (m, 5H), 2, 80-3, 50 (m, 3H) , 4, 60-4, 80 (m, 3H), 6,66 (d, 1H, J = 6,2 Hz), 7,26 (m, 1H), 8,21 (d, 2H, J = 6,3 Hz), 8,65 (d, 2H, J= 5,8 Hz), 11,90 (s, 1H). MS(ES):310,1 (M"+l).

Forbindelse 1608: (64 %) . <X>H NMR (200 MHz, d6-DMSO), 1,75 (s, 3H) , 2,11 (s, 3H), 2,29 (s, 3H), 3,56 (m, 6H), 7,23-7,41 (m, 5H), 8,00 (brs, 1H), 8,23 (d, 2H, J = 6,0 Hz), 8,63 (d, 2H, J = 5,4 Hz), 8,82 (brs, 1H), 11,56 (brs, 1H). MS(ES):444,0 (M"+l).

Forbindelse 1604: <X>H NMR (200 MHz, CD3OD) , 3,40 (m, 4H), 4,29 (m, 4H), 6,99 (s, 1H), 7,5-7,2 (m, 3H), 7,90 (d, 2H), 8,39 (d, 2H), 8,61 (d, 2H). MS(ES):357,0 (M"+l).

Forbindelser som er spesifikke mot A3- reseptoren Oppsummering

Den foreliggende oppfinnelse er også basert på forbindelser som selektivt binder til adenosin A3-reseptor, for derved å behandle en lidelse assosiert med A3-adenosinreseptor i et individ ved å administrere til individet en terapeutisk effektiv mengde av slike forbindelser. Lidelsen skal behandles er assosiert med for eksempel astma, hypersensitivitet, rinitt, høysnue, serumsykdom, allergisk vaskulitt, atopisk dermantitt, dermantitt, psorasis, eksem, idiopatisk pulmo-nær fibrose, eosinofil klorecystitis, kronisk luftvei inflammasjon, hypereosinofile syndromer, eosinofil gastroen-teritt, ødem, urtikaria, eosinofil myokardial sykdom, epi-sodisk angioødem med eosinofilia, inflammatorisk tarmsyk-dom, ulcerativ kolitt, allergisk granulomatosis, karsinoma-tosis, eosinophil granuloma, familial histiocytosis, hypertensjon, mast celledegranulering, kreft, hjertehypoksia, cerebral iskjemi, diurese, nyresvikt, nevrologisk lidelse, mental lidelse, kognitiv lidelse, myokardial iskjemi, bronkokonstriksjon, artritt, autoimmun sykdom, Crohns sykdom, Graves sykdom, diabetisk, multippel sklerose, anemi, psori-asis, fertilitetslidelser, lupus ertymatosus, reperfusjons skade, arteriole diameter i hjerne, frigjøring av aller-giske mediatorer, skleroderma, slag, global iskjemi, lidelse i sentral nervesystemer, kardiovaskulær sykdom, nyre-sykdom, inflammatorisk sykdom, gastrointestinal sykdom, øyesykdom, allergisk sykdom, respiratorisk sykdom, eller immunologisk sykdom.

Forbindelser ifølge oppfinnelsen er aktive overfor A3-adenosinreseptor assosiert med sentral nervesystemlidelse, en kardiovaskulær lidelse, astma, hypersensitivitet, rinitt, høysnue, serumsykdom, allergisk vaskulitt, atopisk dermantitt, dermantitt, psorasis, eksem, idiopatisk pulmo-nær fibrose, eosinofil klorecystitis, kronisk luftveisin-flammasjon, hypereosinofile syndromer, eosinofil gastroen-teritt, ødem, urtikaria, eosinofil myokardial sykdom, epi-sodisk angioødem med eosinofilia, inflammatorisk tarmsyk-dom, ulcerativ kolitt, allergisk granulomatosis, karsinoma-tosis, eosinophil granuloma, familial histiocytosis, hypertensjon, mast celledegranulering, kreft, hjertehypoksia, cerebral iskjemi, diurese, nyresvikt, nevrologisk lidelse, mental lidelse, kognitiv lidelse, myokardial iskjemi, bronkokonstriksjon, artritt, autoimmun sykdom, Crohns sykdom, Graves sykdom, diabetisk, multippel sklerose, anemi, psori-asis, fertilitetslidelser, lupus ertymatosus, reperfusjons skade, arteriole diameter i hjerne, frigjøring av aller-giske mediatorer, skleroderma, slag, global iskjemi, sentral nervesystemlidelse, kardiovaskulær lidelse, nyre lidelse, inflammatorisk lidelse, gastrointestinal lidelse, øye lidelse, allergisk lidelse, respiratorisk sykdom, eller immunologisk sykdom.

Sykdommer assosiert med adenosin Al, A2a, A2b og A3-reseptorer er beskrevet i WO 99/06053 og WO-09822465, WO-09705138, WO-09511681, WO-09733879, JP-09291089, PCT/US98/16053 og US patent nr. 5,516,894.

Som benyttet heri betyr "en forbindelse er A3 selektivt" at en forbindelse har en bindingskonstant til adenosin A3-reseptor for minst ti ganger høyere enn den til adenosin Ai, A2a eller A2b.

Oppfinnelsen blir ytterligere illustrert av de følgende eksempler. Det bør bli forstått at modellene som brukes gjennom eksemplene er aksepterte modeller og at demonstrasjonen av effektivitet i disse modeller er forutsigende for effektivtet i mennesker.

Fagpersonen vil vite at metabolisme av forbindelsene beskrevet heri i et individ danner visse biologisk aktive metabolitter som kan virke som medikamenter.

Foreliggende oppfinnelse vil bli bedre forstått fra de eksperimentelle detaljer som følger. Imidlertid vil fagpersonen lett forstå at de spesielle fremgangsmåter og resultater som er diskutert kun er illustratoriske for oppfinnelsen .

Eksempel 24: Adenosin A3 antagonistforsøk

Forbindelse 1700 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 336,1 (M"+l) .

Forbindelse 1710 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 381,1 (M"+l) .

Forbindelse 1316 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 353,2 (M"+l) .

Forbindelse 1703 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 357,1 (M"+l) .

Forbindelse 1719 (tabell 17 nedenfor): <1>H-NMR (200Mhz, d6-DMSO) (1,75 (m, 2H), 3,11 (m, 2H), 3,35 (s, 3H), 3,59 (m, 2H), 5,72 (m, 1H), 5,96 (m, 1H), 6,55 (s, 1H) , 7,15 (s, 1H), 7,49 (m, 2H), 8,32 (m, 2H).

Forbindelse 1704 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 367,0 (m~+l) .

Forbindelse 1706 (tabell 17 nedenfor): <1>H-NMR (200MHz, CDcl3) d 1,22 (m, 2H) , 1, 60-2, 40 (m, 4H) , 4,53 (m, 1H) , 4,94 (m, 1H), 5,70 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 6,35 (d, 1H, J = 2,8 Hz), 6,97 (d, 1H, J = 2,0 Hz), 7,50 (m, 3H), 8,40 (m, 2H), 10,83 (brs, 1H).

Forbindelse 1707 (tabell 17 nedenfor): MS(ES): 347,0 (M++l) .

Forbindelse 1708 (tabell 17 nedenfor): MS (ES) 399,0 (M"+l) .

Forbindelse 1709 (tabell 17 nedenfor): MS (ES) 385,9 (M"+l) .

Forbindelse 1710 (tabell 17 nedenfor): MS (ES) 434,0

(M~+l) .

Forbindelse 1711 (tabell 17 nedenfor): <1>H-NMR (200 MHz, CD3OD) d 3,95 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 4,23-4,31 (m, 2H) , 4,53 (t, 2H, J = 8,8 Hz), 6,30 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 6,98 (d, 1H, J = 3,0 Hz), 7,45-7,48 (m, 3H), 7,83-8,42 (m, 2H), 9,70 (brs, 1H). MS (ES): 281,1 (M<+>+l).

OSIC-148313 <X>H-NMR (200 MHz, CD3OD) d 3,02 (m, 2H), 3,92

(m, 2H) , 5,09 (2, 2H) , 6,53 (s, 1H), 6, 90-7, 04 (br s, 1H), 6,92 (m, 2H), 7,02 (m, 1H), 7,21 (dd, 1H, J = 8,2 Hz), 7,40 (m, 3H), 7,50-7,80 (br s, 1H), 8,33 (m, 2H), MS (ES): 445,1 (M<+>+l) .

Forbindelse 1713 (tabell 17 nedenfor): <1>H-NMR (200 MHz, CDCI3) d 1,65-1,80 (m, 7H), 1,88-2,00 (m, 1H), 2,10-2,40 (m, 1H), 2,70-3,05 (m, 3H), 3,09-3,14 (m, 2H), 3,16-3,38 (m, 1H) , 3,45 (d, 1H, J = 14 Hz), 3, 53-3, 60 (m, 2H) , 3,84-3,92 (m, 2H), 3,97 (d, 1H, J = 14 Hz), 5,55 (t, 1H, J = 5,8 Hz), 6,17 (s, 1H), 6,55-6,59 (m, 2H), 6,64-6,71 (m, 1H), 7,11-7,19 (m, 2H), 7,43-7,46 (m, 3H), 8,38-8,42 (m, 2H), MS (ES) : 484, 0 (M++l) .

Forbindelse 1714 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 471,0 (M++l) .

Forbindelse 1715 (tabell 17 nedenfor): MS (ES): 505,0 (M++l) .

Forbindelse 1716 (tabell 17 nedenfor): <X>H-NMR (200 MHz, CD3OD) d 1,65 (m, 1H) , 2,18 (m, 1H) , 2,49 (br, 2H, J= 6,2 Hz), 2,64 (m, 1H), 3,38 (m, 1H), 3,69 (s, 3H), 3,72 (m, 1H), 3,93 (m, 1H) , 4,10 (m, 1H) , 5,06 (2, 2H) , 6,58 (s, 1H), 6,92 (m, 2H), 7,02 (m, 1H), 7,23 (dd, 1H, J = 8,1 Hz), 7,39 (m, 3H) , 8,32 (m, 2H) .

MS (ES) : 447, 1 (M"+l) .

Forbindelse 1717 (tabell 17 nedenfor): <1>H-NMR (200 MHz, CD30D) d 1,69 (m, 1H) , 2,26 (m, 1H) , 2,42 (d, 2H, J = 7,4 Hz), 2,72 (m, 1H), 3,53 (m, 1H), 3,83 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 4,14 (dd, 1H, J = 10,6, 7,0 Hz), 5,14 (2, 2H), 6,69 (s, 1H), 6,96 (m, 2H), 7,06 (m, 1H), 7,25 (dd, 1H, J = 8,0 Hz), 7,39 (m, 3H), 8,35 (m, 2H).

MS (ES): 462,2 (M"+l).

Forbindelse 1718 (tabell 17 nedenfor): <1>H-NMR (200 MHz, CD3OD) d 1,40-2,00 (m, 5H), 3,52 (d, 2H, 7,6 Hz), 3,80-4,00 (m, 1H), 4,00-4,20 (m, 3H), 4,50 (m, 2H), 6,36-6,50 (m, 2H), 6,54 (s. 1H), 6,84-6,92 (m, 1H), 7,05 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 7,30 -7,45 (m, 3H), 8,24 (d, 2H, J = 9,8 Hz). MS (ES): 449, 0 (M"+l) .

Tabell 17. Adenosin A3 reseptorselektive forbindelser

<*> minst 10 ganger mer selektive enn andre tre subtyper

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer videre en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer ytterligere en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer ytterligere en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer ytterligere en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse med strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer ytterligere en forbindelse med strukturen:

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen 1505, 1506, 1507, 1508, 1509, 1510, 1511, 1512, 1513, 1514, 1516, 1517, 1518, 1519 eller 1520 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen den/de ovennevnte farmasøytiske sammensetning(er) hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en periokulær, retrobulbar eller intraokulær injeksjonsformulering.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen den/de ovennevnte farmasøytiske sammensetning(er) hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en systemisk formulering .

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen den/de ovennevnte farmasøytiske sammensetning(er) hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en kirurgisk besprøytningsoppløsning.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en pakket farmasøytisk sammensetning for å behandle en sykdom assosiert med Ai adenosinreseptor i et individ omfattende: (a) en beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsene 1505, 1506, 1507, 1508, 1509, 1510, 1511, 1512, 1513, 1514, 1516, 1517, 1518, 1519 eller 1520, og (b) instruksjoner for å bruke nevnte forbindelse for å behandle nevnte sykdom i et individ.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen et farmasøytisk akseptabelt salt av forbindelsen 1505, 1506, 1507, 1508 1509, 1510, 1511, 1512, 1513, 1514, 1516, 1517, 1518, 1519 eller 1520.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen det ovennevnte farmasøytisk akseptable salt, hvor det far-masøytisk akseptable salt av forbindelsen 1509, 1511, 1515, 1518 eller 1519 inneholder et kation valgt fra gruppen bestående av natrium, kalsium og ammonium.

Eksemplifisering

Eksempel 21: Syntese av 1-[6-(4-hydroksy-4-fenyl-piperidin-1-yl-metyl)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]-pyrro-lidin-2-karboksylsyreamid.

Forbindelse 1505 ble syntetisert på en måte som var lik den i eksempel 17 ved å bruke synteseskjema IX med L-prolinamid og 4-fenyl-piperidin-4-ol for å oppnå:

<1>H-NMR (d6-DMS0) d 1,53 (s, 1H), 1,60 (s, 1H), 1,84-2,30

(m, 6H), 2,66 (m, 2H), 3,60 (s, 2H), 3,88 (m, 1H), 4,02 (m, 1H), 4,66 (d, 1H, J = 6,8 Hz), 4,73 (s, 1H) , 6,44 (s, 1H) , 6,94 (s, 1H), 7,12-7,50 (m, 10H), 8,35 (m, 2H), 11,6 (brs, 1H); MS (ES): 305,1 (M"+l), mp = 234-235 °C.

Eksempel 22: Syntese av [N-(2-fenyl-7H-pyrrolo [2,3-3]pyrimidin-4-yl) (L)-prolinamid (1506).

Forbindelse 1506 ble syntetisert ved å bruke synteseskjema VII med L-prolineamid for å oppnås:

<1>H-NMR (DMSO-d6) d 2,05 (m, 4H) , 3,85 (m, 1H) , 4,05 (m, 1H), 4,70 (d, 1H, J= 8,0 Hz), 6,58 (brs, 1H), 6,95 (brs, 1H), 7,15 (d, 1H, J= 3,4 Hz), 7,40 (m, 3H), 7,50 (brs, 1H), 8,40 (m, 2H), 11,6 (brs, 1H); MS (ES): 308,3 (M~+l). mp = 236-238 °C.

Eksempel 23: Syntese av [N-(2-fenyl-6-metoksymetyl-7H-pyr-rolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-(L)-prolinamid (1507) .

Forbindelse 1507 ble syntetisert ved å bruke prekursorforbindelse 23 av synteseskjema IX for å oppnå:

Bromid 23 (4,23 g, 10 mmol) oppløses i vannfri metanol (60 mL) og DCM (120 mL) og behandles med Ag02CCF3 under N2 ved romtemperatur i 1 time. Faststoffet fjernes ved filtrering og vaskes med DCM (2x20 mL). Filtratet konsentreres in vacuo. Residuet gjenoppløses i DCM (80 mL). Den resulterende oppløsning vaskes så med mettet NaHC03 oppløsning og saltlake, tørkes over MgS04, filtreres og konsentreres for å gi 3,71 g (4, 99 %) offwhite faststoff. <1>H-NMR (CDC13 d 1,75 (s, 9H), 3,51 (s, 3H), 4,83 (s, 2H), 6,70 (s, 1H), 7,47 (m, 3H), 8,52 (m, 2H).

Arylklorid 4 (2,448 g, 6,55 mmol), DMSO (15 mL), L-prolinamid (4,0 g, 35,0 mmol) og NaHC03 (2,9 g) kombineres og oppvarmes til 120 °C under nitrogen. Etter 4 timer avkjøles reaksjonsblandingen til romtemperatur og fortynnes med vann (60 ml). Den resulterende oppslemming ekstraheres med DMC (10x). De kombinerte organiske lag vaskes med mettet NaHC03 oppløsning og saltlake, tørkes over MgS04, filtreres og konsentreres for å gi 2,48 g brunt faststoff. Renprodukt (1,86 g, 81 %) oppnås etter flash kolonnekromatografi som et hvitt fast stoff. Hvite krystaller oppnås fra THF/heksan. Smeltepunkt = 213-215 °C. <1>H-NMR (CDC13) d 2,15 (m, 3H), 2,52 (m, 1H), 3,26 (s, 3H), 3,92 (m, 1H), 4,10 (m, 1H), 4,42 (s, 2H), 5,08 (d, 1H, J = 8,2 Hz), 5,49 (brs, 1H), 6,48 (s, 1H), 7,08 (brs, 1H), 7,42 (m, 3H), 8,38 (m, 2H), 9,78 (brs, 1H); MS (ES): 352,2 (M<+>+l).

Eksempel 24: Syntese av 4-hydroksy-l-(2-fenyl-7H-pyrro-lo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]-pyrrolidin-2-karboksylsyreamid

(1508).

Forbindelse 1508 ble oppnådd ved synteseskjema VII ved å bruke cis-hydroksy prolinamid for å danne:

<1>H-NMR (d6-DMSO) d 1,90 (m, 1H), 3,85 (d, 1H, J = 9,2 Hz), 4,08 (m, 1H), 4,37 8s, 1H), 4,67 (dd, 1H, J = 8,8, 4,0 Hz), 5,30 (s, 1H), 6,55 (s, 1H), 7,15 (s, 2H), 7,37 (m, 3H), 7,64 (s, 1H), 8,37 (m, 2H), 11,65 (brs, 1H); MS (ES): 324,2 (M"+l); mp = 268-271 °C.

Eksempel 25: Syntese av 3-[4-((S)-2-karbamoyl-pyrrolodin-l-yl)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-yl]-propionsyre

(1509).

Forbindelse 1509 ble oppnådd ved å bruke prekursorforbindelse 23 fra synteseskjema IX for å oppnå:

Det tert-butoksykarbonylbeskyttede arylbromid 23 (4,0 g, 9,5 mmol), tørr DMSO (25 ml), NaH2P04 (454 mg, 3,79 mmol) og Na2HP04 (1,62 g, 11,4 mmol) ble kombinert og oppvarmet til 50 °C under argon i omtrent 3,5 timer. Blandingen ble så helt opp i vann (200 ml) og ekstrahert med tre 100 ml porsjoner av EtOAc. De kombinerte organiske lag ble grundig vasket med vann, saltlake, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi et gult fast stoff som ble renset ved triturering med etanol for å gi 1,55 g av et lyst, gult, fast stoff (7). Moderluten ble renset med flash kromatografi (10 % EtOAc i heksan) for å gi ytterligere 454 mg (60 %) . <1>H-NMR (CDCL3) d 1,77 (s, 9H) , 7,25 (s, 1H), 7, 48 8m, 3H), 8,52 (m, 2H), 10,39 (s, 1H); Smeltepunkt = 156 °C (dec) .

Aldehyd 7 (600 mg, 1,7 mmol) ble oppløst i tørr THF (20 ml) og avkjølt til 0 °C under argon. Til dette ble det tilsatt en 0 °C oppløsning av (tert-butoksykarbonylmetylen)-trife-nylfosforan (694 mg, 1,8 mmol) i 10 ml tørr THF dråpevis gjennom en kanyle. Etter 3 timer ble blandingen konsentrert og renset ved triturering med etanol for å gi 565 mg (73 %) av et hvitt, fast stoff (8). <1>HNMR (CDC13) d 1,58 (s, 9H) , 1,79 (s, 9H), 6,46 (d, 1H), 6,95 (s, 1H), 7,48 (m, 3H), 8,09 (d, 1H), 8,56 (m, 2H).

En oppløsning av forbindelse 8 (565 mg 1,2 mmol) i 5 ml THF ble fortynnet til 100 ml med EtOAc. Etter tilsetning av 600 mg katalysator (5 vekt% Pd, 50 % H20) og spyling med argon ble blandingen hydrogenert under atmosfærisk trykk. Etter 8 timer ble blandingen filtrert, konsentrert og renset med flash kromatografi (10 % EtOAc i heksan) for å isolere 200 mg (35 %) av 9 som en klar olje som krystalliserte ved lag-ring. <1>HNMR (CDC16) d 1,42 (s, 9H) , 1,75 (s, 9H) , 2,65 (t, 2H), 3,32 (t, 2H) , 6,41 (s, 1H) , 7,45 (m, 3H) , 8,51 (m, 2H) .

Arylklorid 9 (200 mg, 0,44 mmol), DMSO (10 ml) og L-prolinamid (440 mg, 4,4 mmol) ble kombinert og oppvarmet til 85 °C under argon. Etter 14 timer ble blandingen avkjølt til romtemperatur og fordelt mellom vann og etylacetat. Lagene ble atskilt og det vandige lag vasket med EtOAc (3x). De kombinerte organiske lag ble grundig vasket med vann (3x), saltlake, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi 10 som en gul film som ble renset med flash kromatografi (2,5 % MeOH i CH2C12) . 185 mg (97 %) . MS (ES): 435, 8 (M"+l) .

Ester 10 (30 mg, mmol) i 5 ml dioksan ble hydrolysert ved å tilsette 0,5 ml konsentrert HC1. Etter 3 timer ble blandingen konsentrert in vacuo og rekrystallisert i EtOH/EtOAc for å gi 1509 som et hvitt, fast stoff (20 mg, 61 %). MS (ES): 380 (M"+l).

Eksempel 26: Syntese av [N-(2-fenyl-6-aminokarbonyl metok-symetyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-(L)-prolinamid

(1510).

Forbindelse 1510 ble oppnådd ved å bruke prekursorforbindelse 23 fra synteseskjema IX for å danne:

Bromid 23 (1,27 g, 3 mmol) og molekylsikt (5 g) omrøres i vannfri metylglykolat (5,8 g, 60 mmol) og DCM (40 mL). Opp-løsningen behandles med AgOTf under N2 og tillates å bli omrørt i 3 timer. Faststoffet fjernes med filtrering og vaskes med DCM (2x20 mL). Filtratet konsentreres in vacuo. Residuet gjenoppløses i DCM (80 mL). Den resulterende opp-løsning vaskes så med vann, mettet NaHC03 oppløsning, saltlake, tørkes over MgS04, filtreres og konsentreres for å gi 1,35 g (99 %) av et offwhite, fast stoff (12). <X>H-NMR (CDC13 d 175 (s, 9H) , 3,80 (s, 3H), 5,0 (s, 2H), 6,78 (s, 1H), 7,47 (m, 3H), 8,52 (m, 2H).

Arylklorid 12 (177 mg, 0,41 mmol), DMSO (10 mL), L-prolinamid (466 mg, 4 mmol) og NaHC03 (500 mg) kombineres og oppvarmes til 120 °C under nitrogen. Etter 4 timer avkjøles blandingen til romtemperatur og fortynnes med vann (60 ml). Den resulterende oppslemming ekstraheres med DCM (5x30 mL). De kombinerte organiske lag vaskes med mettet NaHC03 opp-løsning og saltlake, tørkes over MgS04, filtreres og konsentreres for å gi et brunt, fast stoff. Renprodukt (154 mg, 92 %) blir oppnådd etter flash kolonne som et hvitt, fast stoff (13). <X>H-NMR (CDCI3) d 2,15 (m, 3H), 2,52 (m, 1H), 3,55 (s, 3H) , 4,58 (s, 2H), 5,08 (s, 1H) ), 5,85 (brs, 1H), 6,48 (s, 1H), 7,08 (brs, 1H), 7,42 (m, 3H), 8,40 (m, 2H), 10,58 (brs, 1H); MS (ES): 410,1 (M"+l).

Metylester 13 (124 mg, 0,3 mmol) oppløses i HOCH3 (15 mL) . Ammoniakk bobles gjennom oppløsningen en halv time. Reak-sj onsblandingen blir så omrørt i ytterligere 3 timer ved romtemperatur. Etter fjerning av oppløsningsmiddelet blir 111 mg av et hvitt, fast stoff (1510, 93 %) dannet. <1>H-NMR (CDC13) d 1,82 (m, 3H) , 2,20 (m, 1H) , 2,80 (m, 1H) , 3,10 (m, 1H) , 3,63 (dd, 2H, Jx = 13,8 Hz, J2 = 19,4 Hz), 3,87 (m, 1H), 4,07 (m, 1H), 4,97 (m, 1H), 5,96 (m, 2H), 6,35 (s, 1H), 6,86 (brs, 1H), 7,11 (brs, 1H), 7,37 (m, 3H), 8,28 (m, 2H), 11,46 (brs, 1H); MS (ES): 394,8 (M"+l).

Eksempel 27: Syntese av [4-(2-carbamoylpyrrolidin-l-yl)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-karboksylsyre] (1511).

Forbindelse 1511 ble syntetisert ved å bruke prekursorforbindelse 15 fra synteseskjema VII for å danne:

Til en suspensjon av natriumhydrid (780 mg av en 60 % olje-suspensjon, 19,5 mmol) i tørr DMF (20 mL), avkjølt med et is-/vannbad under nitrogen tilsettes en oppløsning av pyrrolopyrimidin 15 (2,00 g, 7,52 mmol) i DMF (10 mL) over 5 minutter. Etter 15 minutter tilsettes benzensulfonylklorid (1,2 mL, 9,40 mmol), derpå fjernes kjølebadet. Etter 4 timer helles reaksjonsblandingen opp i en blanding av is og mettet NaHC03-oppløsning, det utfelte, faste stoffet filtreres fra og tritureres med aceton (3) og metanol (2) for å gi 2,37 g av et beige, fast stoff. Dette faste stoffet (16) inneholder omtrent 10 mol-% DMF (basert på dette 83 % utbyttet) og kan bli brukt i neste trinn. En ren prøve kan bli fremstilt ved kromatografi på silikagel ved å bruke aceton som elueringsmiddel. <1>H-NMR (CDCI3) : d 6,70 (d, J = 4,2 Hz, 1H), 7, 47-7, 68 (m, 6H), 7,76 (d, J = 4,2 Hz, 1H) , 8,24-8,32 (m, 2H), 8,48-8,56 (m, 2H); IR (fast): n = 3146 cm"<2>, 1585, 1539, 1506, 1450, 1417, 1386, 1370, 1186, 1176, 1154, lill, 1015, 919, 726, 683, 616, 607; MS (ES): 372/370 MH") ; smeltepunkt = 226-227 °C.

Til en oppløsning av N-sulfonylforbindelsen 16 (337 mg, 0,911 mmol) i tørr THF (34 mL), avkjølt med tørr is/aceton tilsettes LDA-THF (1,0 mL, 1,5 M oppløsning i cykloheksan, 1,5 mmol). Etter 45 minutter bobles karbondioksid inn i oppløsningen i 5 minutter, derpå fjernes kjølebadet. Når oppløsningen har nådd romtemperatur, avdampes oppløsnings-midlene, noe som gir 398 mg av saltet 17, inneholdende 0,5 ekvivalentdeler (iPr)2NC02Li som et gult, fast stoff. Saltet benyttes uten opprenskning i neste trinn. <1>H-NMR (Di-DMSO): d= 6,44 (s, 1H), 7,50-7,75 (m, 6H), 8,33-8,40 (m, 2H), 8,53 (dd, J = 8,0, 1,6 Hz, 2H).

En oppløsning av litiumsaltet 17 (50 mg) og L-prolinamid (122 mg, 1,07 mmol) i DMSO (1,5 mL) oppvarmes under nitrogen til 80 °C i 15,5 time. 4 % vandig eddiksyre (10 mL) tilsettes til den avkjølte oppløsning og blandingen ekstraheres med EtOAc (5x10 mL). De kombinerte, organiske lag vaskes med 4 % vandig eddiksyre (10 mL), vann (10 mL) og saltlake (10 mL) og tørkes over MgS04. Filtrering og konsentrering gir 40 mg 18 som et gulaktig, fast stoff som blir brukt uten opprenskning i det neste trinn. <1>H-NMR (CD3OD) : d= 1, 95-2, 36 (m, 4H) , 3, 85-3, 95 (m, 1H) , 3,95-4,17 (m, 1H), 4,72 (brs, 1H), 7,14 (s, 1H), 7,35-7,45 (m, 3H), 7,45-7,70 (m, 3H), 8,33-8,50 (m, 4H).

En oppløsning av natriumhydroksid i metanol (1,5 mL, 5M, 7,5 mmol) tilsettes til en oppløsning av pyrrolopyrimidin 18 (40 mg, 0,081 mmol) i metanol (2 mL). Etter 2 timer jus-teres pH til 5, det meste av metanolen fordampes, blandingen ekstraheres med EtOAc (5x10 mL), de kombinerte, organiske lag vaskes med saltlake og tørkes over MgS04. Filtrering og konsentrering gir 24 mg av et lyst, gult, fast stoff som blir triturert med toluen/EtOAc/MeOH for å gi 15,6 mg (55 %) av syren 1511 som et lett gulaktig, fast stoff. <1>H-NMR (CD3OD) : d = 2, 05-2,20 (m, 4H) , 3,95-4,10 (m, 1H), 4,15-4,25 (M, lh), 4,85 (BRS, lh), 7,14 (S, lh) , 7,35-7,42 (M, 3h), 8,38-8,45 (M, 2h); IR (fast stoff): n = 3192 cm"<1>, 2964, 2923, 2877, 1682, 1614, 1567, 1531, 1454, 1374, 1352, 1295, 1262, 1190, 974, 754, 700; MS (ES): 352 (M"+l); smeltepunkt = 220 °C (decomp.).

Eksempel 28: Syntese av 1-(6-metyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-(S)-pyrrolidin-2-karboksylsyreamid

(1512).

Forbindelse 1512 ble syntetisert ved de følgende trinn:

Arylklorid 20 (3 g, 10,7 mmol), DMSO (50 ml) og (S)-prolinamid ble kombinert og oppvarmet til 85 °C under argon. Etter omrøring over natten (14 timer) ble blandingen av-kjølt til romtemperatur og helt opp i 800 ml vann. Dette ble ekstrahert med tre 200 ml porsjoner av EtOAc. De kombinerte organiske lag ble grundig vasket med vann (3 x 300 m), saltlake, tørket over MgS04, filtrert og konsentrert for å gi et mørkt brunt, fast stoff. Faststoffet ble rekrystallisert to ganger fra EtOAc for å gi 1,95 g (57 %) av et lyst, brunt fast stoff (1512). "HNMR (DMSO-d6) d 1,82-2,2 (m, 4H) , 2,3 (s, 3H), 3,8 (m, 1H), 4,0 (m, 1H), 4,6 (d, 1H) 6,2 (s, 1H), 6,9 (s, 1H), 7,2 (m, 3H), 7,3 (s, 1H), 8,4 (m, 2H) , 11,5 (s, 1H); MS (ES): 322 (M"+l) .

Eksempel 29: Syntese av 1-[6-(2-hydroksyetoksymetyl)-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]-pyrrolidin-2-karbok-sylsyreamid (1513).

Forbindelse 1513 ble syntetisert på lignende måte som den i eksempel 17 ved å bruke synteseskjema IX med L-prolinamid og etan-1,2-diol for å danne:

MS (ES): 382 (M<+>+l).

Eksempel 30: Syntese av 4-(6-imidazol-l-ylmetyl-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamino)-cykloheksanol (1514).

Forbindelse 1514 ble syntetisert på lignende måte som den i eksempel 17 ved å bruke synteseskjema IX med N-6 amino cykloheksanol og imidazol for å danne:

MS (ES): 389 (M"+l).

Eksempel 31: Syntese av 4-(4-hydroksy-cykloheksylamino)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-karboksylsyre (1515).

Forbindelse 1515 ble syntetisert på lignende måte som den i eksempel 27 ved å bruke synteseskjema IX med N-6 aminocykloheksanol for å danne:

MS (ES): 353 (M"+l).

Eksempel 32: Syntese av 4-[6-(2-hydroksy-etoksymetyl)-2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-ylamino]-cykloheksanol

(1516).

Forbindelse 1516 ble syntetisert på lignende måte som den til forbindelse 1513 ved å bruke synteseskjema IX med N-6 aminocykloheksanol for å danne:

MS (ES) : 383 (rrf+l) .

Eksempel 33: Syntese av 4-(4-hydroksy-cykloheksylamino)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-karboksylsyrernetylester

(1517).

En oppløsning av litiumsaltet 17 (0,13 mmol) i tørr DMF (4 mL) omrøres med metyliodid (0,1 mL, 1,6 mmol) ved 20 °C under argon i 3 timer. DMF inndampes og vandig ammoniumklo-ridoppløsning tilsettes (15 mL). Blandingen ekstraheres med EtOAc (3x15 mL), de kombinerte organiske lag vaskes med vann (2x10 mL) og saltlake (10 mL) og tørkes over MgS04. Filtrering og konsentrering gir 21 mg (38 %) av metylester 22.

En oppløsning av metylesteren 22 (24,5 mg, 0,057 mmol) og 4-trans-aminocykloheksanol (66 mg, 0,57 mmol) i DMSO (1,5 mL) oppvarmes under nitrogen til 80 °C i 5 timer, derpå stoppes oppvarmingen og omrøring ved 20 °C fortsetter i 13,5 time. 4 % vandig eddiksyre (10 mL) tilsettes til den avkjølte oppløsning og blandingen ekstraheres med EtOAc (3x10 mL). De kombinerte organiske lag vaskes med 4 % vandig eddiksyre (10 mL), vann (10 mL), 2N NaOH (10 ml), vann (10 mL) og saltlake (10 mL) og tørkes over MgS04. Til en oppløsning av grovmaterialet oppnådd etter filtrering og konsentrering (1H NMR indikerer omkring 50 % fjerning av benzensulfonylgruppen) i THF (2 mL) tilsettes en oppløsning av NaOH i MeOH (0,5 mL 5M oppløsning, 2,5 mmol) ved romtemperatur. Etter 20 minutter tilsettes vann og mettet NaHC03~ oppløsning (5 mL hver) og blandingen ekstraheres med EtOAc (4x15 mL). De kombinerte organiske lag vaskes med 2N NaOH

(10 mL), vann (10 mL) og saltlake (10 mL) og tørkes over MgS04. Kromatografi av grovmaterialet som ble oppnådd etter filtrering og konsentrering på silikagel, eluering med hek-saner/EtOAc 1:1 ® 1:2 gir 8,6 mg (41 %) av 1517 som et hvitt, fast stoff, smeltepunkt 225-227 °C. <1>H-NMR (CD3OD) : d = 1,38-1,62 (m, 4H), 1,95-2,10 (m, 2H), 2,10-2,25 (m, 2H), 3,55-3,70 (m, lh), 3,91 (s, 3H), 4,20-4,35 (m, 1H), 7,32 (s, 1H), 7,35-7,47 (m, 3H), 8,35-8,42 (m, 2H); IR (fast stoff): n = 3352 cm"<1>, 3064, 2935, 2860, 1701, 1605, 1588, 1574, 1534, 1447, 1386, 1333, 1263, 1206, 1165, 1074, 938, 756, 705; MS (ES) : 367 (MH") .

Eksempel 34: Syntese av [4-(2-karbamoyl-pyrrolidin-l-yl)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-ylmetoksyl]-eddiksyre metylester (1518).

Forbindelse 1518 ble syntetisert på lignende måte som i eksempel 2 6 ved å bruke prekursorforbindelse 12 for å danne:

MS (ES): 410 (m<+>+l).

Eksempel 35: Syntese av [4-(2-karbamoyl-pyrrolidin-l-yl)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6-ylmetoksy]-eddiksyre

(1519).

Forbindelse 1519 ble syntetisert på lignende måte som forbindelse 1515 hvor metylestergruppen ble hydrolysert med en base for å danne:

MS: 396 (M"+l).

Eksempel 36: Syntese av 4-(4-hydroksy-cykloheksylamino)-2-fenyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-6kkarboksylsyreadmid

(1520).

Gassformig ammoniakk kondenseres i en oppløsning av pyrrolopyrimidin 23 (7,8 mg, 0,021 mmol) i metanol (6 mL), av-kjøles med tørris/aceton inntil et totalt volum på 12 mL blir nådd. Etter omrøring i 10 dager ved 20 °C inndampes oppløsningsmidlene og residuet renses med preparativ TLC på silikagel ved eluering med 5 % MeOH i CH2C12. Materialet som således ble dannet tritureres med eter for å gi 6,5 mg (88 %) av amidet 1520 som et hvitt fast stoff, smeltepunkt 210-220 °C (dekomp.). <1>H-NMR (CD3OD) : d = 1, 40-1, 60 (m, 4H) , 2,00-2,15 (nm 2G(m 2ml5.2m25 /nm 2G(m 3m55.3m69 /nm lG(m 4m29.4m35 /nm lG(m 6ml5 /sm lG(m 6m35.6m46 /nm 3G(m 7m34.7m49 /nm 2G(M UR (fast stoff): n = 3358 cm"<1>, 3064, 3025, 2964, 2924, 2853, 1652, 1593, 1539, 1493, 1452, 1374, 1326, 1251, 1197, 1113, 1074, 1028, 751, 699; MS (ES): 352

(MH") .

Aktivitet av forbindelser

Adenosin 1 (Ai) reseptor subtypemetning og konkurrerende radioligandbinding ble utført for forbindelser 1505, 1506,

1507, 1508, 1509, 1510, 1511, 1512, 1513, 1514, 1516, 1517, 1518, 1519 og 1520 som beskrevet heri og bl.a. på side 152-153 av foreliggende beskrivelse. Alle av de ovenfor angitte forbindelser er like eller gikk forbi Ai-reseptorbindings-affiniteten av referanseforbindelser 1318 eller 1319 som beskrevet heri, og bl.a. i tabell 13.

Vannoppløselighetene av de ovennevnte forbindelser opplistet i tabell 18 er ventet å være bedre enn referanseforbindelser 1318 eller 1319 grunnet deres cLogP-verdier som ble utregnet ved å bruke computerprogrammet CS ChemDraw, ChemDraw Ultra ver. 6,0 ©1999 som fremskaffet av CambridgeSoft corporation, 100 Cambridge Park Drive, Cambridge, MA 02140.

Forbindelsene som er spesifikke for Ai-reseptoren opplistet i tabell 18 hadde lavere cLogP-verdier mellom omkring 1,5 til omkring 3,4, sammenlignet med referanseforbindelser 1318 eller 1319 med en cLogP-verdi på omkring 3,8. Det ble ikke forutsagt at de mer polare Ai reseptorforbindelser opplistet i tabell 18 som har lavere cLogP-verdier enn referanseforbindelsene 1318 eller 1319 fremdeles ville opprettholde effekten og A1 reseptorbindende selektivitet i forhold til disse referanseforbindelser.

Ytterligere forbindelser som er spesifikk overfor A2a reseptor

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer en forbindelse som har strukturen:

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse som har strukturen:

Oppfinnelsen fremskaffer også en farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen 1609 eller 1610 samt et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

Oppfinnelsen fremskaffer også den ovennevnte farmasøytiske sammensetning hvor den terapeutiske mengde er effektiv til å behandle Parkinson's sykdom og sykdommer assosiert med bevegelsesaktivitet, vasodilasjon, blodplateinhibering, neutrofil superoksiddannelse, kognitiv lidelse eller senil demens.

Oppfinnelsen fremskaffer også den ovennevnte farmasøytiske sammensetning hvor den farmasøytiske sammensetning er en oftalmisk formulering.

Oppfinnelsen fremskaffer også den ovennevnte farmasøytiske sammensetning hvor den farmasøytiske sammensetning er en periokulær, retrobulbar eller intraokulær injeksjonsformulering.

Oppfinnelsen fremskaffer også den ovennevnte farmasøytiske sammensetning hvor den farmasøytiske sammensetning er en systemisk formulering.

Oppfinnelsen fremskaffer også den ovennevnte farmasøytiske sammensetning hvor den farmasøytiske sammensetning er en kirurgisk besprøytningsoppløsning.

Oppfinnelsen fremskaffer også en pakket farmasøytisk sammensetning for å behandle en sykdom assosiert med A2a adenosinreseptor i et individ, omfattende: (a) en beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen 1609 eller 1610, og (b) instruksjoner for å bruke forbindelsen for å behandle nevnte sykdom i et individ.

Eksemplifisering

Eksempel 41: Syntese av 1-(6-fenyl-2-pyridin-4-yl-7H-pyr-rolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]-pyrrolidin-2-karboksylsyreamid

(1609).

Forbindelse 1609 ble syntetisert ved å omsette L-prolinamid med det passende kloridintermediat beskrevet i synteseskjema II på side 82 for å danne:

<1>H-NMR (de-DMSO) d 1,95-2,15 (m, 4H), 4,00 (brs, 1H), 4,15 (brs, 1H), 4,72 (brs, 1H), 6,90 (brs, 1H), 7,19 (brs, 1H), 7,30 (t, 1H, J = 7,0 Hz), 7,44 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 7,59 (s, 1H), 7,92 (brs, 2H), 8,26 (d, 2H, J = 6,2 Hz), 8,65 (d, 2H, J = 6,2 Hz); MS (ES): 384,9 (M"+l); Smeltepunkt = 280-316 °C (dekomp.).

Eksempel 42: Syntese av 1-[6-(3-metoksyfenyl)-2-pyridin-4-yl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl]-pyrrolidin-2-karboksyl-syreamid (1610) .

Forbindelse 1610 ble syntetisert ved å omsette L-prolinamid med det passende kloridintermediat beskrevet i synteseskjema II på side 82 for å danne:

<1>H-NMR(d6-DMSO) d 2,07 (m, 4H), 3,85 (s, 3H), 4,02 (m, 1H), 4,17 (M, 1H), 4,75 (m, 1H), 6,89 (m, 1H), 7,00 (s, 1H), 7,23 (s, 1H), 7,35 (t, 1H, J = 8,2 Hz), 7,53 (s, 2H) , 7,60 (s, 1H), 8,28 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 8,67 (d, 2H, J = 5,8 Hz), 12,37 (s, 1H); MS (ES): 415,0 (M<+>+l).

Aktivitet av forbindelser

Adenosin 2a (A2a) reseptor subtype konkurrerende radioligandbinding ble utført for forbindelser 1609 og 1610 som beskrevet heri. Forbindelser 1609 og 1610 ble funnet å ha A2a reseptorbindende affinitet og selektivitet.

Side 294- 300 angår ytterligere forbindelser som er spesifikke overfor A3 reseptor

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer også en forbindelse som har strukturen:

Forbindelsen kan brukes til å inhibere aktiviteten av en A3 adenosinreseptor i en celle hvor cellen settes i kontakt med forbindelsen 1720.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen 1720 og et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en pakket farmasøytisk sammensetning for å behandle en sykdom assosiert med A3 adenosinreseptor i et individ, omfattende: (a) en beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen 1720, og (b) instruksjoner for å bruke nevnte forbindelse for å behandle nevnte sykdom i et individ.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremstille en sammensetning som omfatter forbindelsen 1720 hvor fremgangsmåten omfatter å blande forbindelsen 1702 med et passende bæremateriale.

I en ytterligere utførelsesform fremskaffer oppfinnelsen et farmasøytisk akseptabelt salt av forbindelse 1720 hvor det farmasøytisk akseptable salt inneholder et anion valgt fra gruppen omfattende malein, fumar, tartar, acetat, fosfat og mesylat.

Eksemplifisering

Eksempel 43: Syntese av [2-(3H-Imidazol-4-yl)-etyl]-(2-fe-nyl-7H-pyrrolo[2,3-d]pyrimidin-4-yl)-amin (1720) .

Forbindelse 1720 ble syntetisert ved å bruke prekursorforbindelse 1 fra synteseskjema VII for å danne:

Arylklorid 1 (400 mg, 1,50 mmol), DMSO (10 mL) og histamin (1,67 g, 15,0 mmol) kombineres og varmes til 120 °C under nitrogen. Etter 6,5 t avkjøles reaksjonsblandingen til romtemperatur og fordeles mellom EtOAc og vann. Lagene atskil-les og det vandige lag ekstraheres med EtOAc (3x). De kombinerte organiske lag vaskes med saltlake (2x), tørkes over MgS04, filtreres og konsentreres for å gi 494 mg av et brunt fast stoff. Det faste stoffet vaskes med kald MeOH og rekrystalliseres fra MeOH for å gi 197 mg (43 %) av et off-white, fast stoff (1720). <1>H-NMR (CD30D) d 3,05 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 3,94 (t, 2H, J = 7,0 Hz), 6,50 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 6,88 (brs, 1H), 7,04 (d, 1H, J = 3,5 Hz), 7,42 (m, 3H), 7,57 (s, 1H), 8,34 (m, 2H); MS (ES): 305,1 (M"+l); Smeltepunkt = 234-235 °C.

Aktivitet av forbindelser

Adenosin 3 (A3) reseptorkonkurrerende radioligandbinding ble utført for forbindelse 1720 som beskrevet i foreliggende beskrivelse. Forbindelse 1720 ble funnet å ha en A3 reseptorbindende affinitet større enn 10 ganger den til referanseforbindelse 1308 som beskrevet heri og bl.a. i tabell 13.

Foreliggende oppfinnelse fremskaffer videre forbindelser som har formelen:

hvor RiNR2 sammen danner en ring som har strukturen: eller Ri er H og R2 er:

aR;;;;ryrr subsutuert — —— alkyl eller

Claims

1. Forbindelse som har strukturen: hvori R1NR2 sammen danner en ring som har strukturen: eller Ri er H og R2 er: og, når RiNR2 sammen er R5 er H, -CH2 (NC5H8) (OH) (C6H5) , -CH2OCH3, - (CH2) 2C (0) OH, - CH2OCH2C (0)NH2, -C(0)OH, -CH3, -CH20 (CH2) 20H, -CH2OCH2 (0) OCH3 eller -CH2OCH2C (0) OH, eller når RI er H og R2 er er R5 -CH2 (N2C3H3) , -C(0)0H, CH20 (CH2) 20H, -C(0)0CH3 eller - C (0)NH2 eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

3. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

4. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

5. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

6. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

7. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

8. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

9. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

10. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

11. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

12. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

13. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

14. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

15. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

16. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

17. Forbindelse ifølge krav 1 som har strukturen:

18. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for å behandle en sykdom assosiert med Ai adenosinreseptor i et individ.

19. Anvendelse ifølge krav 18 hvor nevnte Ai adenosinreseptor er assosiert med kognitiv sykdom, nyresvikt, hjertearytmi, respiratorisk epitel, transmitterfrigjøring, bedøv-ning, vasokonstriksjon, bradykardia, negativ hjerteinotropi og dromotropi, bronkokonstriksjon, neutrofil chemotaksis, sure oppstøt eller magesårtilstander.

20. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for å inhibere aktiviteten av en Ai adenosinreseptor i en celle.

21. Anvendelse ifølge krav 18 hvor nevnte sykdom er astma, kronisk obstruktiv pulmonar lidelse, allergisk rhinitt eller en lidelse i de øvre luftveier.

22. Farmasøytisk sammensetning omfattende forbindelsen ifølge krav 1, et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel samt minst en av et steroid, £2 agonist, glukokortikoid, luko-trien antagonist eller en anticolinergisk agonist.

23. Farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 1 samt et far-masøytisk akseptabelt bæremiddel.

24. Anvendelse ifølge krav 18 hvor sykdommen er astma, allergisk rhinitt eller kronisk obstruktiv pulmonar lidelse.

25. Pakket farmasøytisk sammensetning for å behandle en sykdom assosiert med Ai adenosinreseptor i et individ omfattende : (a) en beholder som inneholder en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 1, og (b) instruksjoner for å bruke nevnte forbindelse for å behandle nevnte sykdom i et individ.

26. Farmasøytisk akseptabelt salt av forbindelsen ifølge krav 6, 8, 12, 15 eller 16 hvor saltet inneholder et kation valgt fra gruppen bestående av natrium, kalsium og ammonium.

27. Anvendelse ifølge krav 18 hvor Ai adenosinreseptoren er assosiert med kongestiv hjertesvikt.

28. Forbindelse som har strukturen:

29. Forbindelse som har strukturen:

30. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 28 eller 29 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig ved behandling av en sykdom assosiert med A2a-adenosinreseptor i et individ.

31. Anvendelse ifølge krav 18 eller 30 hvor individet er et menneske.

32. Anvendelse ifølge krav 31, hvor nevnte A2a-adenosinreseptor er assosiert med bevegelsesaktivitet, vasodilasjon, blodplateinhibering, nevtrofil superoksid-dannelse, kognitiv lidelse, senil demens eller Parkinsons sykdom.

33. Anvendelse ifølge krav 30, hvor forbindelsen behandler nevnte sykdommer ved å stimulere adenylatcyklase.

34. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 28 eller 29 for fremstilling av et medikament til å inhibere aktiviteten av en A2a-adenosinreseptor i en celle.

35. Farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 28 eller 29 samt et farmasøytisk akseptabelt bærermiddel.

36. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 35, hvor nevnte terapeutisk effektiv mengde er effektivt til å behandle Parkinsons sykdom og sykdommer assosiert med bevegelsesaktivitet, vasodilasjon, blodplateinhibering, nevtrofil superoksid-dannelse, kognitiv lidelse eller senil demens.

37. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 35, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en optalmisk formulering.

38. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 23 eller 35, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en periokulær, retrobulær eller intraokulær injeksjonsformulering.

39. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 23 eller 35, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en systemisk formulering.

40. Farmasøytisk sammensetning ifølge krav 23 eller 35, hvor nevnte farmasøytiske sammensetning er en kirurgisk påsprøytningsoppløsning.

41. Farmasøytisk samensetning omfattende forbindelsene ifølge krav 28 eller 29, et farmasøytisk akseptabelt bæremiddel og ethvert dopamin forsterkende materiale.

42. Pakket farmasøytisk sammensetning for behandling av en sykdom assosiert med A2a-adenosinreseptor i et individ, omfattende : a) en beholder inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 28 eller 29; og b) instruksjoner for bruk av nevnte forbindelse for å behandle nevnte sykdom i et individ.

43. Farmasøytisk akseptabelt salt av forbindelsen ifølge krav 28 eller 29.

44. Forbindelse som har strukturen: eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

45. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 44 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for å inhibere aktiviteten av en A3-adenosinreseptor i en celle.

46. Anvendelse ifølge krav 20, 34 eller 45, hvor cellen er en humancelle.

47. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 44 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for behandling av skade på øyet hos et individ.

48. Anvendelse ifølge krav 47, hvor skaden omfatter retinal eller optisk nervehodeskade.

49. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 44 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig ved behandling av grå stær i et individ.

50. Farmasøytisk sammensetning omfattende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 46 samt et far-masøytisk akseptabelt bærermiddel.

51. Pakket farmasøytisk sammensetning for behandling av en sykdom assosiert med en A3-adenosinreseptor i et individ, omfattende: a) en beholder inneholdende en terapeutisk effektiv mengde av forbindelsen ifølge krav 49; og b) instruksjoner for bruk av nevnte forbindelse for å behandle nevnte sykdom i et individ.

52. Fremgangsmåte ved fremstilling av en sammensetning som omfatter forbindelsen ifølge krav 44, hvor fremgangsmåten omfatter å blande forbindelsen med et passende bærermiddel.

53. Farmasøytisk akseptabelt salt av forbindelsen ifølge krav 28, 29 eller 44, hvor det farmasøytisk akseptable salt inneholder et anion valgt fra gruppen omfattende malein, fumar, tartar, acetat, fosfat og mesylat.

54. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 44 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for behandling av en sykdom assosiert med en A3 adenosinreseptor i et individ i behov for slik behandling hvor sykdommen assosiert med A3 adrenosinreseptoren er astma, bronkitt, kronisk obstruktiv lungesykdom eller bronkokonstriksjon.

55. Fremgangsmåte ved fremstilling av forbindelse ifølge krav 44, omfattende trinnene: (a) å omsette forbindelsen med histamin ved nærvær av dimetylsulfoksid: (b) varme opp reaksjonsblandingen under en inert atmosfære; (c) avkjøle reaksjonsblandingen og adskille det organiske lag fra det vandige lag; (d) vaske det organiske lag med saltlake, tørking og filtrering for å gi forbindelsen.

56. Fremgangsmåte ifølge krav 55 hvor i trinn (b) reaksjonsblandingen oppvarmes under en nitrogenatmosfære.

57. Fremgangsmåte ifølge krav 55 hvor i trinn (d) det organiske lag tørkes med MgS04.

58. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for behandling av en sykdom assosiert med en Ai adenosinreseptor i et individ ved behov for slik behandling hvor sykdommen er antidiuresis, bradycardia, bronkitt, bronkokonstriksjon,, Alzheimers sykdom, hjertearrytmi, hjertehypoksia, hypertensjon, inflammasjon, negativ hjerteinotropi og dromotropi, nyresvikt, bedøvelse eller er assosiert med transmitterfri-gjøring, respiratorisk epitel, samsmentrekning av glatte muskler som ligger under respitarorisk epitel, vasokonstriksjon eller mastceleledegranulering.

59. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 1 for fremstilling av et medikament til økning av hukommelsen hos et individ.

60. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 28 eller 29 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for behandling av en sykdom assosiert med en A2a adenosinreseptor i et individ i behov for slik behandling hvor sykdommen assosiert med A2a adenosinreseptor er Parkinsons sykdom eller glaukom.

61. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 44 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for behandling av en sykdom assosiert med en A3 adenosinreseptor i et individ i behov for slik behandling hvor sykdommen assosiert med A3 adenosinreseptor er myokardialiskemi, bronkitt eller bronkokonstriksjon.

62. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 44 for fremstilling av et medikament som er anvendelig til behandling av inflammasjon i øyet assosiert med en A3 adenosinreseptor hos et individ.

63. Anvendelse av en forbindelse ifølge krav 44 for fremstilling av et medikament som er anvendelig til behandling av en sykdom assosiert med en A3 adenosinreseptor i et individ i behov for slik behandling hvor sykdommen assosiert med A3 adenosinreseptoren er assosiert med mastcecllede-granulering.

64. Anvendelse av forbindelse ifølge krav 44 ved fremstilling av et medikament som er anvendelig for behandling av en sykdom som assosiert med en A3 adenosinreseptor i et individ i behov for slik behandling hvor sykdommen assosiert med A3 adensosinreseptoren er astma, glaukom, retino-pati, okkular iskemi eller makular degenerering.