NO326052B1 - Anvendelse av S-(-)-N-propargyl-1-aminoindamin eller et farmasoytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament (a) for behandling av neurotrauma eller (b) for forbedring av hukommelsen hos en post-CHI-pasient. - Google Patents

Description

Område for oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse omfatter ny terapeutisk anvendelse av S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan og farmasøytisk akseptable salter derav for behandlingen av neurotrauma eller for forbedring av hukommelsen hos en pasient.

Som anvendt heri er begrepet " neurotrauma" ment å referere til skade på det sentrale og/eller perifere nervesystem som resultat av iskemisk skade, som slag, hypoksi eller anoksi, neurodegenerative sykdommer, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, neurotoksisk skade, hodetraumaskade, spinaltraumaskade eller enhver annen form for nerveskade.

Bakgrunn for oppfinnelsen

R(-)-deprenyl (også kjent som L-deprenyl), N,a-dimet.yl-N-2-propenylfenetylamin) er en godt kjent inhibitor av B-formen av monoaminoksidaseenzym (heretter " MAO- B").

Internasjonal PCT-søknad nr. W092/17169 beskriver, aktiviteten til R(-) deprenyl ved opprettholdelse, forebyggelse av tapet av eller gjenvinning av nervevekstfunksjon. Denne publikasjon omfatter .en liste av deprenyllignende derivater som er antatt å ha lignende aktiviteter, selv om ingen underbyggende data er gitt om denne forbindelse. Innbefattet i denne liste er AGN-1135 som er racemisk N-propargyl-l-aminoindan.

I en senere artikkel rapporterer Tatton, W.G. et al., J. Neuros. cience 13 (9) , s. 4042-4053, (1993) at den neurobeskyttende aktivitet til deprenyl er begrenset til R(-)-enan-tiomeren. S(-)-enantiomeren var 2000 ganger mindre aktiv med hensyn til å øke overlevelsen av aksotomiserte, ikke fullt utviklede ansiktsmononeuroner hos rotte. Videre ble det vist .at neurobeskyttende aktivitet kun er forbundet med R-enantiomerene til propargylderivater som har MAO-B-inhibitorisk aktivitet. Davis et al., J. Neurochem. Supplement 1, 64:S60,

(1995) (som viser dataene presentert, av samme forfatter ved det seksogtyvende møte innen the American Society for Neurochemistry, holdt i Santa Monica, California, USA 5.-9. mars 1995) viste at ved ulike modeller av neurobeskyttende aktivitet, var R-enantiomerene til visse alifatiske N-metylpropargylaminer som er selektive inhibitorer av MAO-B, mer effektive for å redde ødelagte neuroner enn de tilsvarende S-enantiomerer.

Utviklingen av arbeidet med deprenyl har ført til antagelsen av at den neurobeskyttende aktivitet ikke omfatter inhibering av MAO-B, ettersom subinhibitoriske nivåer av R(-)-deprenyl har vært observert å forebygge nervecelledød (Tatton, Movement Disorders, B{ 1) :S20-S30, (1993)). Det er foreslått at R(-) deprenyl muligens er avhengig av interaksjon med en undertype av MAO-B som har ekstrem sensitivitet til R(-)-deprenyl.

Yu et al., Neurosci, 63, s. 1820-1827, (1994) har vurdert aktiviteten til R(-)- og S(+)-deprenyl og flere alifatiske propargylaminderivater med hensyn til reversering av noradrenalinreduksjonen hos gnagere indusert ved admini-streringen av N-(2-kloretyl)-N-etyl-2-brombenzylamin (DSP-4). Sluttpunktet målt og beskrevet som en indikasjon på "neurobeskyttende aktivitet" omfatter prosentvis restitusjon av noradrenalin til sammenligning med ubehandlede kontroller. I de beskrevne resultater, viste R(-)-deprenyl og flere av de høyere N-alifatisk substituerte propargylaminer "neurobeskyttende aktivitet". S ( + )-deprenyl ble beskrevet som å virke på en lignende måte som den kjente noradrenalinopptaksinhibi-tor-desipramin, som har en mye lavere "neurobeskyttende aktivitet" sammenlignet med R(-)-deprenyl. For å summere opp viste S(+)-deprenyl seg å være en bedre noradrenalinopptaks-inhibitor sammenlignet med R(-)-deprenyl, og fortsatt mye dårligere med hensyn til det beskrevne mål for "neurobeskyttende aktivitet".

Europeisk patent 4364 92 beskriver R(+)-enantiomeren av N-propargyl-l-aminoindan (heretter referert til som "R(+)PAI") som en selektiv, irreversibel inhibitor av MAO-B. Som følge av denne spesifikke aktivitet har R(+)PAI også blitt foreslått for anvendelse ved behandling av Parkinsons sykdom, hukommelsesforstyrrelser, demens (særlig av Alzheimers type), depresjon og hyperaktivt syndrom hos barn. US patenter 5387612, 5453446 og 5457133 omfattende R(+)PAI og fremgangsmåter for behandling av pasienter som lider av Parkinsons sykdom, omfattende administrering av R(+)PAI til pasienten. I disse US patenter er den forbedrede MAO-B-inhibitoriske aktivitet til R(+)PAI uthevet ved sammenligning av dets antipode, S(-)-enantiomeren av N-propargyl-l-aminoindan (heretter referert til som "S(-)PAI"). Ved in vitro- analyser ble R(+)PAI funnet å være nesten 7000 ganger mer aktiv som en inhibitor av MAO-B enn S(-)PAI. Det ble også funnet i disse analyser at, mens R(+)PAI er mer enn 29 ganger mer selektiv for MAO-B enn MAO-A (A-formen av monoaminoksidaseenzym), viste S(-)PAI ingen preferanse for noen av substratene. Denne virkning ble også observert ved både akutt og kronisk in vivo-administrering.

Internasjonal PCT-søknad. med publikasjonsnummer

WO95/11016 beskriver videre at R(+)PAI er aktiv som et "neurobeskyttende middel". Her beskrives anvendelse av forebyggelsen av NMDA-indusert celledød hos rotte-cerebellumceller i tillegg til redusering, i neurondegenerering ved administrering etter

ødeleggelse av den optiske nerve hos rotten. Det er ikke antydet noe i denne publikasjon med hensyn til mekanismen hvorved R(+)PAI kan gi denne "neurobeskyttende" virkning.

Anvendelsen av MAO-inhibitorer som neuronhjelpemidler ved kliniske situasjoner hvor neuronoverlevelse er kritisk, kan involvere den viktige ulempe på grunn av deres potensielle kardiovaskulære bivirkninger, alene eller etterfulgt av medikament-medikament eller medikament-matinteraksjoner. Disse bivirkninger skyldes delvis eller total inhibering av perifere MAO-A, som fører til store konsentrasjoner av noradrenalin i det kardiovaskulære system (se for eksempel Physicians<1> Desk Reference 48. utg., 1994, Medical Economics Data, Montvale, NJ, under Eldepryl). Selektive MAO-B-inhibitorer, slik som R(-) deprenyl er mindre tilbøyelige til å omfatte det kardiovaskulære system enn de mindre spesifikke midler, slik som pargylin eller clorgylin, mens de første antageligvis er sikrere midler. MAO-undertypeselektiviteten til disse midler, som beregnet under in vitro-betingelser, ser imidlertid ut til å reduseres dramatisk ved bestemmelse in vivo. Graden av in vitro-ICso-verdier til MAO-A/MAO-B med hensyn til R (-)-deprenyl er således rapportert av ulike forfattere som 400, 247, 360 og 16 (fra en samling av W. Paul og I. Szelenyi, i " Inhibitors of Monoamine Oxidase- B", I. Szelenyi red., Birkhauser, Basel, s.

353, 1993),. som foreslår en sikkerhetsfaktor på ca. 100 eller mer. Den anbefalte daglige dose av R(-)-deprenyl hos mennesker er 10 mg, méd 30-40 mg som ansett som dosen hvorved den kardiovaskulære funksjon kan være i fare (Physicians1 Desk Reference supra). Sikkerhetsfaktoren ved medisinsk prakti-sering er således ca. 3 til 4, sammenlignet med ca. 400 i eksperimentelle systemer in vitro.

Det er derfor fortsatt et behov for et "neurobeskyttende middel" som, mens det er effektivt, ikke har de bivirkninger som er forbundet med de hittil kjente neurobe-skyttere av typen MAO-B-inhibitor.

Målsetning med oppfinnelsen

Det er således en målsetning å tilveiebringe en fremgangsmåte og farmasøytiske preparater for behandling av CNS- eller PNS-forstyrrelser, særlig de som er forbundet med neurotrauma, med et middel som har neurobeskyttende aktivitet, men som ikke har de perifere bivirkninger som er forbundet med de kjente MAO-B-inhibitorer.

Oppsummering av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse, anvendelse av S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament (a) for behandling av neurotrauma eller' (b) for forbedring av hukommelsen hos en post-CHI-pasient.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

S(-)-propargyl-l-aminoindan kan fremstilles som beskrevet i US patent 5457133 og preparater kan fremstilles på en lignende måte som. de beskrevet i patentet.

Ved utførelsen av oppfinnelsen foretrekkes det at et farmasøytisk akseptabelt salt av S(-)-N-propargyl-l-aminoindan anvendes. Egnede farmasøytisk akseptable salter omfatter, men er ikke begrenset til, mesylat-, maleat-, fumarat-, tartrat-, hydroklorid-, hydrobromid-, esylat-, p-toluensulfonat-, benzoat-, acetat-, fosfat- og sulfatsalter. Foretrukket er hydroklorid-, mesylat-, esylat- og sulfatsalter av S(-)-N-propargyl-l-aminoindan. Mest foretrukket er det at det farmasøytisk akseptable salt er mesylatsaltet.

For fremstilling av farmasøytisk akseptable syreaddisjonssalter av S(-)PAI, kan den frie base reageres med de ønskede syrer i nærvær av et egnet løsningsmiddel ved hjelp av vanlige fremgangsmåter. Likeledes kan et syreaddisjonssalt omdannes til den frie baseform på en kjent måte.

Som angitt ovenfor beskrives et farmasøytisk preparat omfattende en terapeutisk effektiv mengde S(-)-N-propargyl-l-aminoindan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav og en farmasøytisk akseptabel bærer. Den "terapeutisk effektive mengde" av S(-)-N-propargyl-l-aminoindan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav kan bestemmes ifølge fremgangsmåter, velkjente for fagfolk på området. Disse preparater kan fremstilles som medikamenter som administreres oralt, parenteralt, rektalt eller transdermalt.

De foretrukne doser av den aktive bestanddel, dvs. S(-)PAI, i de ovennevnte preparater er innen følgende områder. For orale eller stikkpilleformuleringer kan 0,1-100 mg pr. doseenhet tas daglig, og fortrinnsvis 1-10 mg pr. doseenhet tas daglig. For injiserbare formuleringer kan 0,1-100 mg/ml pr. doseenhet tas daglig, og fortrinnsvis 1-10 mg/ml pr. doseenhet tas daglig.

Disse preparater kan anvendes alene for å behandle de ovenfor angitte forstyrrelser, eller alternativt, som et tillegg til de vanlige behandlinger.

Egnede former for oral administrering omfatter tabletter, sammenpressede eller belagte piller, drageer, puter, harde eller myke gelatinkapsler, sublinguale tabletter, siruper og suspensjoner.

I én utførelsesform er den farmasøytisk akseptable bærer et faststoff og det farmasøytiske preparat er en

tablett. Den terapeutisk effektive mengde av den aktive bestanddel kan være i form av ca. 0,1 mg til ca. 100 mg, fortrinnsvis fra ca. 1 mg til ca. 10 mg.

Ved en alternativ utførelsesform er den farmasøytisk akseptable bærer en væske og det farmasøytiske preparat er en injiserbar oppløsning. Den terapeutisk effektive mengde av den aktive bestanddel kan være fra ca. 0,1 mg/ml til ca.100 ng/ml, fortrinnsvis fra ca. 1 mg/ml til ca. 10 mg/ml. I én utførel-sesform er dosen i form av en infusjon.

I en ytterligere alternativ utførelsesform er bæreren en gel og det farmasøytiske preparat er en stikkpille.

For parenteral administrering tilveiebringes ampuller som omfatter en vandig eller ikke-vandig oppløsning eller emulsjon av den aktive bestanddel. For.rektal administrering er det tilveiebrakt stikkpiller med hydrofile eller hydrofobe vehikler. For topisk applisering av salver og transdermal overføring er det tilveiebrakt egnede overføringssystemer kjent ifølge teknikkens stand.

Oppfinnelsen vil bli beskrevet i mer detalj i de følgende eksempler.

Eksempler

Kjemiske eksempler

Eksempel 1

Di-( S-(-)- N- propargyl- l- aminoindan- D- tartrat

a) Racemisk N-propargyl-l-aminoindan.

Til en blanding av racemisk 1-aminoindan (64 g) ble

15 % vandig natriumhydroksidoppløsning (141 g), vann (107 ml) og toluen (192 ml) tilsatt propargylbenzensulfonat (94,3 g) i løpet av 20 minutter ved omgivelsestemperatur. Den resulterende blanding ble oppvarmet til 45 °C i 4 timer, på hvilket tidspunkt pH ble bekreftet å være > enn 12 (45 % natriumhydroksid tilsatt hvis nødvendig) og fasene ble separert. Til den organiske fase ble vann (64 ml) tilsatt og pH ble justert til 2 med 33 % vandig svovelsyre. Den vandige fase ble separert, fortynnet med vann og blandet med toluen. pH ble justert til 6 med 25 % vandig natriumhydroksid og fasene ble separert. Den vandige fase ble ekstrahert på ny med toluen for å sikre en pH lik 6. De blandede organiske lag ble konsentrert in vacuo og ga 51 g uren racemisk N-propargyl-l-aminoindan i form av en gul olje.

b) Di-( S-(-)- N- propargyl- l- aminoindan) D- tartrat

Til en oppløsning av uren racemisk N-propargyl-l-aminoindan (46,5 g) i isopropanol (157 ml) ved tilbakestrøm ble tilsatt en oppløsning av D-vinsyre 15,3 g) i vann (28 ml). Etter 1 time med tilbakestrøm ble blandingen langsomt avkjølt til omgivelsestemperatur og den resulterende utfelling ble isolert ved filtrering med sug og vasket med isopropanol. Det urene di-(S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan) D-tartrat ble rekrystallisert fra 1 1 isopropanol inneholdende 15 % vann og ga 26,5 gram av forbindelsen angitt i tittelen til forbindelsen: smeltepkt. 175-177 °C [a]D-34,3° (1,5, H20) ; Anal.

kalkulert for C28H32O6N2; C,.68,26; H, 6,56; N, 5,69;. Funnet:.C, 68,76; H, 6,57; N,5,61.

Eksempel 2

S-(-)- N- propargyl- l- aminoindanmesylat

En oppløsning av di-(S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan) D-tartrat (15 g) fra Eksempel 1 og metansulfonsyre (6 g) i isopropanol (150 ml) ble oppvarmet til tilbakestrøm i 30 minutter. Reaksjonsblandingen ble tillatt å avkjøles til romtemperatur og det resulterende presipitat ble isolert ved hjelp av sugefiltrering for å gi forbindelsen angitt i tittelen (11, lg) med smeltepkt. 157 °C, [a9D -22°. Anal. kalkulert for C13H17NSO; C, 58,43; H, 6,37; N, 5,24; S, 11,98;

Funnet: C..58,70; H, 6,39; N, 5,20; S, 11,82.

Eksempel 3

S-(-)- N- propargyl- l- aminoindanmesylat

Til en blanding av natriumhydroksid (4,8 g) i vann (80 ml) ble tilsatt di-(S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan) D-tartrat fra Eksempel 1 og toluen (80 ml). Etter omrøring i 30 minutter ble blandingen filtrert gjennom Celite med sug, og det organiske lag ble separert og vasket med vann. Den organiske fase ble konsentrert in vacuo, fortynnet med isopropanol (125 ml) og behandlet med metansulfonsyre (11,5

g). Den resulterende blanding ble oppvarmet til tilbakestrøm i 30 minutter, filtrert (Celite) og tillatt å avkjøles til

omgivelsestemperatur. Det resulterende presipitat ble samlet ved hjelp av filtrering og vasket med isopropanol, som ga forbindelsen som angitt i tittelen med identiske fysiske og kjemiske egenskaper som produktet i Eksempel 2.

Eksempel 4

S-(-)- N- propargyl- l- aminoindanmesylat

Fremgangsmåten ifølge Eksempel la ble gjentatt bort-sett fra at S-(-)-1-aminoindan fremstilt ifølge Eksemplene 76-80 i US patentsøknad med serie nr. 08/372064 (innlevert 12. januar 1995) (publikasjonsnr. WO 96/XXXXX) ble anvendt istedenfor racemisk 1-aminoindan. Den resulterende gule olje (30 gram) ble oppløst i 180 ml isopropanol, 17,7 gram metansulfonsyre ble tilsatt og den resulterende blanding ble oppvarmet til refluks og tillatt å avkjøles. Presipitatet ble isolert ved hjelp av filtrering og rekrystallisert fra isopropanol med aktivert aktivt kull for å gi forbindelsen angitt i tittelen med identiske fysiske og kjemiske egenskaper som forbindelsen i Eksempel 2.

Eksempel 5

S-(-)- N- propargyl- l- aminoindanhydroklorid

12,4 g (S-(-)-1-aminoindan og 12,9 g kaliumkarbonat ble tilsatt til 95 ml acetonitril. Den resulterende blanding ble oppvarmet til 60 °C og 5,6 g propargylklorid ble tilsatt dråpevis. Blandingen ble omrørt ved 60 °C i 16 timer, hvoretter det meste av de flyktige stoffer ble fjernet ved destillering in vacuo. Resten ble avdelt mellom 10 % vandig natriumhydroksid og metylenklorid. Den organiske fase ble

tørket og det oppløste stoff ble fjernet in vacuo. Resten ble analysert ved hjelp av "flash"-kromatografi på silikagel, ved eluering med 40 % etylacetat/60 % heksan. Fraksjoner inneholdende den frie base av forbindelsen ifølge tittelen ble kombinert og løsningsmidlet ble erstattet med eter. Eteropp-løsningen ble behandlet med gassformig HC1 og den resulterende utfelling ble isolert ved hjelp av sugefiltrering og omkrys-tallisert fra isopropanol for å gi 6,8 g av forbindelsen ifølge tittelen. Produktet hadde [a]D-30,3° (2 % etanol), smeltepkt. 183-5 °C.

Biologiske eksempler

Eksempel 1

Mangel på inhibering av MAO-aktivitet in vivo ved hjelp

av S(-) PAI- mesylat

Rotter (Spargue-Dawley-avledede hanner) som veide 250 ±20 g ble behandlet med én av enantiomerene eller den racemiske form av PAI ved hjelp av intraperitoneal injeksjon (ip) eller oral "gavage" (po), og halshugget henholdsvis 1 eller 2 timer senere. Grupper på tre rotter ble anvendt for hvert stoffdosenivå og MAO-aktivitet ble målt i hjerne og lever ved anvendelse av den generelle teknikk beskrevet i Eksempel 19 i US patent 5387612. Mengden protein i hver inkubasjon ble bestemt ved anvendelse av Follin-Lowry-fremgangsmåten, og enzymaktivitet ble beregnet som nmol substrat metabolisert pr. time med inkubering for hvert mg protein. Aktivitet til MAO i vev fra dyr behandlet med enantiomerene eller den racemiske form av PAI ble uttrykt som en prosent av enzymaktiviteten i en gruppe med kontrolldyr som hadde administrert bærer (vann for oral administrering, 0,9 % salt for ip-injeksjon).

Resultater

Ingen av dosenivåene anvendt ga noen åpenbare forandringer i oppførsel. Dosene som ga 50 % inhibering av MAO-A og MAO-B (IC5o) ble beregnet fra inhiberingskurvene og er vist i Tabell 1. Disse data gjenga den ekstremt lave aktivitet av S(-)PAI-mesylat for inhibering av MAO-A og MAO-B, sammenlignet med selektiviteten til R(+)PAI-mesylat med hensyn til MAO-B-inhiberihg.

Eksempel 2

Neurobeskyttende effektivitet av S(-)PAI i den hypobare hypoksimodell

Modellen anvendt er analog med den beskrevet av M.

Nakanishi et al., Life Sei. 13:467-476 (1973); og av Y. Oshiro et al., J. Med. Chem. 34:2014-2023 (1991). En gruppe på 4 ICR-hannmus, som hver veide 20-25 g ble plassert i et 2,5 1 glass-bur (A) ved atmosfærisk trykk. Kammer A ble forbundet med et

12 1 kammer (B) gjennom en ventil som i utgangspunktet var lukket. Luften i kammer B ble evakuert til et trykk på

100 mmHg. Ventilen mellom de to kammere ble åpnet raskt, hvoretter trykket i kammer A falt i løpet av 14 sekunder til 200 mmHg. Overlevelsestiden til musene i kammer A ble beregnet til en maksimal hypobar eksponering på 15 minutter. Effek-tiviteten av medikamentforbehandlingen med hensyn til

overlevelse ble beregnet som prosent av overlevelsestiden hos den medikamentbehandlede gruppe sammenlignet med saltvanns-injisert eller vehikkelinjisert gruppe. Kontrollgrupper ble testet to ganger, før og etter hvert forsøk og de besto av 12 til 16 mus,.4 pr. gruppe. Hver testet gruppe besto alltid av 4 mus for å sikre et konstant restvolum av oksygen ved alle tester. Overlevelsestiden til kontrollmus var 108-180 sekunder. Virkningen av hvert dosetestmedikament ble bestemt to ganger, ved anvendelse av totalt 8 mus, 4 pr. gruppe. Alle medikamenter ble administrert i.p. én time før hypoksi. Positive referansemedikamenter var natriumpentobarbital i en dose på 40 mg/kg, eller diazepam i en dose på 10 mg.kg, gitt 0,5 time før hypoksi. Resultater er vist i Tabell 2.

Eksempel 3

Bevegelsesaktivitet og hjerneinfarktstørrelse hos hann-wistarrotter etter middels cerebral arterieokklusjon ( MCA- O) i fravær og tilstedeværelse av PAI- enantiomerer En modifikasjon av prosedyren beskrevet av Tamura et al. ble anvendt (Tamura A, Grahem D, McCulloch J, Teasdale GH

(1981) J. Cereb. Blood Flow og Metab. 1:53-60). Hannwistar-rotter (Olac England-Jerusalem) som hver veide 300-400 g, ble bedøvet med en oppløsning av Equitesin administrert i i.p. i en dose på 3 ml/kg. Equitesin består av 13,5 ml natriumpen-totaloppløsning (60 mg/ml), 3,5 g klorhydrat, 1,75 g MgS04, 33 ml propylenglykol, 8,3 ml absolutt alkohol, fortynnet til 83 ml med destillert vann.

Kirurgi ble utført ved anvendelse av et kraftig forstørrende operasjonsmikroskop, modell SMZ-2B, type 102 (Nikon, Japan). For å eksponere den venstre midtre cerebrale arterie, ble det gjort et kutt i den temporale muskel. Biten av det koronoide fremspring av underkjevebenet ble også fjernet med en liten rongeur. Kranieektomi ble utført med en dental drill i åpningen mellom den midtre vegg og taket av inferotemporal fossa.

Dura mater ble åpnet forsiktig ved anvendelse av en nål med en dimensjon på 27. MCA ble lukket permanent ved hjelp av mikrobipolar koagulering ved lav strømsetting, og begynte 2-3 mm medialt for det olfaktoriske rør mellom dets kortikale forgrening til nesekorteks og de laterale, stripete arterier. Etter koagulering ble MCA utstyrt med mikrosakser og delt for å sikre fullstendig okklusjon. Etter dette ble temporalis muskelen suturert og lagt over kraniektomisetet. Huden ble lukket med en løpende 3-0 silkesutur. En lignende kranie-ektomioperasjon ble utført på en parallell gruppe rotter, men uten kauterisasjon av MCA. Under hele den kirurgiske operasjon (20-25 minutter) for hver gruppe, ble kroppstemperaturen oppretthold ved 37 til 38 °C ved hjelp av en kroppstemperatur-regulator (Kyoristsu, Japan) omfattende en selvregulerende oppvarmingspute forbundet med en rektal termistor. 24 og 28 timer etter kirurgi ble en neurologisk skåring utført for å vurdere alvoret av skaden hos de medikamentbehandlede rotter til sammenligning med de ubehandlede kontroller. Ved 48 timer ble dyrene bedøvet med Equitesin og alvoret av skaden ble visualisert ved hjelp av 2,3,5-trifenyltetrazoliumklorid (TTC)-farging. Volumet av hjernevev med skade som følge av

iskemi, ble bestemt.

Medikamenter ble administrert i form av en i.p. injeksjon i 0,3-0,4 ml destillert vann, ifølge følgende skjema: 3 mg/kg i løpet av 30 min før kirurgi; 2 mg/kg 60 min etter okklusjon; 3 mg/kg i løpet av 20-24 timer etter kirurgi.

Etter 48 timer med iskemi indusert ved hjelp av permanent okklusjon ble morfometrisk måling av infarktvolum utført som følger ved hjelp av TTC-farging. TTC 1 % i salt-løsning ble fremstilt umiddelbart før anvendelse og beskyttet mot eksponering for lys ved hjelp av aluminiumfolieinnpakking. MCA-O-rotter ble bedøvet kraftig og en sommerfuglnål med størrelse 23, med et forlenget rør og en 20 ml sprøyte ble innsatt i ventrikkelen via thoracotomi. Det høyre atrium ble snittet for å tillate utstrøm av saltoppløsning. Heparin 50 i.u. i saltløsning ble overført inntil perfusatet var blod-løst. En sprøyte på 30 ml TTC ble byttet ut med saltopp-løsningssprøyten og TTC ble injisert inn i den venstre ven-trikkel i en hastighet på 5 ml/min. Begge perfusatoppløsninger ble administrert ved 37,5 °C. Hjernene ble fjernet og senket ned i 20 ml 1 % TTC i tett lukkede glassrør. Disse ble videre plassert i 2 timer i vannbad ved 37 °C. TTC-oppløsningen ble dekantert, hjernene fjernet, tørket tørre og plassert i 10 % bufret formalinoppløsning i 3 dager. Seks koronale biter, hver med en tykkelse på 2 mm, 3,5,7,9,11 og 13 mm distalt fra den frontale pol ble erholdt med en hjernematriks (Harvard Apparatus, South Natick, MA) . Infarktområder ble målt med videoavbildning og -analyserer fra begge sider av de koronale biter og uttrykt i mm2. Volumet av infarktområde i mm<3> ble beregnet ved å ta summen av de iskemiske områder fra alle seks biter. Infarktvolumer er vist i Tabell 4 nedenfor.

Neurologisk skåring

De neurologiske skåringer består av den totale sum av en serie graderinger rettet mot utførelsen av spesifikke bevegelsesaktiviteter hos en gitt rotte. Skaleringsrunder fra 0 (fullt ut normale rotter) til 13 (fullt ut funksjonsudyktige rotter). De fleste parametere er beregnet som enten 0 (normal) eller 1 (funksjonsudyktig); andre er gradert. Følgende tester ble anvendt ved det foreliggende studie: Generelle observasjonstester: hypoaktivitet; sedasjon, piloereksjon.

Motorisk refleks. Rotter ble løftet i halen omtrent 15 cm over gulvet. Normale rotter inntok en stilling hvorved de trakk begge forlemmer mot gulvet og spredte baklemmene til sidene på en trapeslignende måte. MCAO, når tilstanden var alvorlig, forårsaker vedvarende fleksjon av det kontralaterale lem.

Motorisk evne. Dette anses som evnen til å gripe en pinne som er 1 cm i diameter med det kontralaterale lem i 5-15 sek når rotten etterlates hengende på pinnen i armhulen.

Motorisk koordinering. Normale rotter har evne til å vandre opp og ned på en stang som er 5 cm brev plassert i moderat skråning. Manglende evne til å vandre på stangen i hver av retningene viser noe motorisk ukoordinering, mangel på balanse og svakhet i lemmer.

Gange. Evne til å bevare normal posisjon på hvert bakkontra-laterale eller forkontralaterale lem ved bevisst flytting mens dyret er på en smal stang.

Balanse. Evne til å gripe og balansere på en smal stang som er 2 cm bred.

Bevegelsesaktivitet. Totale bevegelser over en periode på 15 minutter i et automatisert aktivitetsbur.

Graderinger forbundet med hver av de ovenfor nevnte parametere er gitt i Tabell 3.

Resultater

Den neurologiske alvorlighetsskåring (NSS) og infarktvolumet var begge signifikant lavere hos S(-)PAI-behandlede rotter enn hos saltoppløsningsbehandlede rotter, som vist i Tabell 4.

Tabell 4. Neurologisk alvorlighetsskåring ± SEM og hjernein-farktstørrelse + SEM hos rotter etter permanent, middelcere-bralarterieokklusjon hos rotten.

Under lignende operasjonsbetingelser førte behandling med R(+)PAI til en ca. 20 % forbedring i neurologisk alvorlighetsskåring. Neurobeskyttelsen i denne spesifikke modell omfattende neuronskade var nesten lik med hensyn til både R-og S-enantiomerer som tilsvarende N-propargyl-l-aminoindan.

Eksempel 4

Mangel på virkning av S-(-)-PAI på reserpin-indusert ptosis hos rotter

Reserpin-indusert ptosis og dens reverseringstest. Reserpin forårsaker uttømming av kateicolaminlagrer, særlig noradrenalin- Denne virkning hos det levende dyr manifesteres, blant annet ved ptosis. Medikamentet som kan forebygge eller inhibere reserpin-indusert ptosis virker enten direkte som noradrenalinagonister, eller indirekte ved reduksjon eller forebyggelse av den metabolske eliminering av endogent noradrenalin. MAO-inhibitorer tilhører den siste kategori.

Rotter ble formedisinert med enten saltløsning, R(-)deprenyl eller S(-)PAI i.p. og så, 2 timer senere, fikk de injisert reserpin 5 mg/kg i.p. Graden av ptosis ble skåret på en skala fra 0 til 4, hvor 4 utgjør at øynene er fullstendig åpne og 0 utgjør at øynene er fullstendig lukket. Data vist i Tabell 5 er konsistente med premissene at S(-)-PAI ikke forårsaker økning i endogene noradrenalinkonsentrasjoner.

Tabell 5. Gjennomsnittlig skåring av reserpin-indusert ptosis (5 mg/kg i.p.) med og uten premedisinering med MAO-inhibitorer. Skåringene; tatt 2 timer etter reserpin-administrering

Eksempel 5

Mangel på trykkrespons ved intravenøs S(-)PAI hos den bedøvede katt

Katter ble bedøvet med i.v. nembutal 25 mg/kg. Bedøvelse ble opprettholdt ved ytterligere injeksjoner av nembutal, 5 mg/kg etter behov. Det ble innført kanyle i femoralarterien og denne ble forbundet til en stratham-trykkoverfører for blodtrykksregistreringer på en Grass-multikanalpolygraf. Det ble innført kanyle i femoralvenen for i.v. injeksjon av medikamenter. Resultatene er gitt i Tabell 6 og viser at hverken gjennomsnittlig arterieblodtrykk (MABP) eller hjertesekvens (HR) ble påvirket av intravenøs S(-)PAI gitt i økende doser opp til en kumulativ dose på 1 mg/kg og så lenge som 45-60 minutter etter injeksjon.

Tabell 6. Forandringer i gjennomsnittlig arterieblodtrykk og hjertesekvens hos en katt bedøvet med nembutal i ca. 45-60 minutter etter intravenøs, injeksjon av S(-)PAI

Eksempel 6

Mangel på virkning av S(-)PAI på trykkresponsen med hensyn til katekolaminer hos katten

MAO-inhibitorer. potenserer vanligvis trykkresponsen til katekolaminer på grunn av at de blokkerer deres metabolske eliminering ved hjelp av enzymet MAO, særlig undergruppe A. Katter behandlet med S(-)PAI, som beskrevet i Eksempel 5, ble videre challenged med hver av de følgende trykkmidler: Fenylefrin, tyramin og noradrenalin. I hvert tilfelle var det ingen signifikant potensering av trykkresponsen etter forbehandling med S(-)PAI med 1 mg/kg i.v. Resultater er gitt i Tabell 7.

Tabell 7. Trykkrespons på intravenøse katekolaminer hos den bedøvede katt, før og etter forbehandling med S(-)PAI, gitt i form av en i.v. injeksjon på 1 mg/kg

Eksempel 7.

Mangel på kardiovaskulære virkninger av S(-)PAI hos den bevisste rotte etter akutt oral administrering

Et kronisk tilstedeværende kateter ble innført i den caudal arterie under lett bedøvelse med averteen. Dyrene ble tillatt å restituere og ble testet 24 timer etter implan-teringen. Kateteret ble forbundet med Statham trykkoverfører og blodtrykket ble målt på en Grass multikanalpolygraf. Under denne periode ble rottene holdt i sitt hjemmebur for å mini-malisere handling og unngå manipulasjoner kjent for å virke inn på blodtrykket.

To rottestammer ble anvendt: WKY-rotter og matchende SHR (spontan hypertensive rotter)-rotter. WKY-rotter, fra en lokal stamme, som veide ca. 250 g hver. Hos disse var de maksimale fluktuasjoner til det gjennomsnittlige arterietrykk (MAP) og hjertesekvens (HR) henholdsvis 8 mmHg og 49 slag pr. min i hviletilstand.

SHR-rotter ble tilveiebrakt fra Charles River opp-drettere, England. Dyrene ble tillatt å akklimatisere og komme til hektene fra reisen og ble anvendt i en alder på tre måneder, for å passe inn med WKY-kontrollene. SHR-hypertensjon ble gradvis utviklet fra en alder på én måned til tre måneder. På dette tidspunkt var blodtrykket allerede forhøyet til over normotensive nivåer.

S(-)PAI ble administrert i et volum på 10 ml/kg. Blodtrykk og hjertefrekvens ble så målt i 45-60 minutter. Resultater er gitt i Tabell 8 og viser at akutt oral administrering av S(-)PAI ikke hadde noen virkning på noen av parameterene i rottestammene.

Eksempel 8.

Mangel på virkning av S(-)PAI på systolisk blodtrykk hos SHR-rotter etter kronisk, oral administrering med 2 mg/ kg/ dag

Spontant hypersensitive rotter, tre måneder gamle, ble anvendt. Hver rotte fikk en daglig dose på 2 mg/kg S(-)PAI i kranvann 10 ml/kg. Kontroller mottok et tilsvarende volum kranvann. Behandlingen varte 14 dager. Under denne periode ble systolisk blodtrykk målt på dagene 0, 4, 7 og 11, ved anven-deise av en hale-mansjettprosedyre. På dag 14 ble systolisk blodtrykk bestemt ved anvendelse av den tilstedeværende kateterprosedyre beskrevet i Eksempel 7. Resultatene er gitt i Tabellene 9 og 10. Kronisk, oral behandling med S(-)PAI med 2 mg/kg/dag hadde ingen effekt på den intraindividuelle og interindividuelle profil av systolisk blodtrykk og hjertefrekvens .

Tabell 9. Virkning av S(-)PAI (2 mg/kg p.o.) på systolisk blodtrykk og hjertefrekvens, målt ved hjelp av halemansjett i SHR-rotter over en periode på 2 uker.

Tabell 10. Kardiovaskulær virkning av kronisk, oral behandling med S(-)PAI hos SHR-rotter målt direkte ved hjelp av et innført kateter.

Eksempel 9

Mangel på virkning av S(-)PAI med hensyn til kroppsvekt hos SHR- rotter etter kronisk, oral dosering med 2 mg/ kg/ dag.

Rottene anvendt i Eksempel 8 ovenfor ble i tillegg overvåket med hensyn til vektøkning/tap i form av en ytterligere markør for graden av matfortæring. MAO-inhibitorer forhøyer vanligvis sentrale katekolaminer som kan dempe appetitten. Kronisk behandling med S(-)PAI med 2 mg/kg/dag hadde ingen innvirkning på kroppsvekten i løpet av 14 dager med behandling. Resultatene er gitt i Tabell 11.

Tabell 11. Virkning på SHR-rottekroppsvekt etter 2 uker med kronisk, oral behandling med S(-)PAI.

Oppsummering

Eksempler 4-9 viste at S(-)PAI har minimal eller ingen virkning på flere MAO-formidlede effekter.

Eksempel 10

Virkning av S(-) PAI etter lukket hodeskade ( CHI) hos mus

Prosedyren for lukket hodeskade var som beskrevet for rotter i Shohami et al. (J Neurotrauma (1993) 10(2) 109-119) med forandringer som beskrevet.

Dyr: Sebramushanner (Hebrew University-stamme) som veide 34-40 g ble anvendt. De ble holdt i grupper på 10 pr. bur i en 12 timer:12 timer syklus med lysrmørke. Mat-og vann ble tilveiebrakt ad libitum.

Trauma ble indusert under bedøvelse. Et longitudinalt snitt ble gjort i huden som dekket skallen og huden trakk seg tilbake for å eksponere skallen. Hodet ble fiksert manuelt på det lavere plan av klemmeapparatet. En vekt på 333 g ble over-ført ved hjelp av en elektronisk anordning fra en distanse på 3 cm til venstre hemisfære, 1-2 mm lateralt for midten i det midtre isseplan. S-PAI ble injisert sub-kutant (1 mg/kg) hvert

15 min etter CHI.

Vurdering av motorisk funksjon

Motorisk funksjon og reflekser ble vurdert hos de skadede mus ved ulike tidspunkter etter lukket hodeskade (CHI) ved anvendelse av en neurologisk alvorlighetsskåring (NSS<*>) som vist i Tabell .12, som er modifisert fra den beskrevet for rotter. Ett poeng ble gitt for mangel på en testet refleks eller for mangel på evne til. å utføre oppgavene angitt i tabellen. Maksimal skåring som kan nås ved 1 time etter CHI er 25 poeng og ved kortere tidspunkter 21 poeng. Differansen i NSS ved 1 time og enhver annen tid gjengir den spontane restitusjon og refereres til som A NSS. En skåring på 15-19 ved 1 time viser alvorlig skade, 11-14 viser moderat skade og mindre enn 10 viser lett skade. ;<*>NSS vurdert i dette eksempel er forskjellig fra det i Eksempel 3, både med hensyn til anvendte parametere og skåringssystem.

Vurdering av referansehukommelse

Morris Water Maze Test: vannlabyrinten består av et sirkulært aluminiumbasseng, Imi diameter og 60 cm dypt, fylt med vann til en dybde på 17,5 cm. Den skjulte målplattform er et glasskår (15 cm diameter x 16,5 cm høyt) plassert opp ned i en fiksert plassering i bassenget, 1 cm under vannoverflaten. Vanntemperaturen ble oppretthold ved 24 °C og bassenget var

alltid plassert i samme posisjon i rommet for å tilveiebringe samme holdepunkter utenfor labyrinten. Før CHI ble mus gitt 3 prøver pr. dag i 5 etterfølgende dager for å etablere en grunnlinjeytelse - målt i form av tid det tar å finne platt-formen fra samme startplassering. Ved begynnelse 24 timer etter CHI ble mus testet på ny daglig i 2 uker med 3 forsøk pr. dag.

Vurdering av referansehukommelse

Figur 1 viser reduksjon i tid for mus behandlet med S(-)PAI sammenlignet med saltløsningsbehandlede kontroller etter CHI. Det ser ut til at umiddelbart etter CHI glemte musen lokaliseringen av målet. Hukommelsen forbedres etter behandling med S(-)PAI, sammenlignet med saltløsningsbehand-lede mus.

Claims (9)

1. Anvendelse av S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament (a) for behandling av neurotrauma eller (b) for forbedring av hukommelsen hos en post-CHI-pasient.

2. Anvendelse av S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan ifølge krav 1, hvori medikamentet er tilpasset oral, rektal, intra-venøs, transdermal eller parenteral administrering.

3. Anvendelse av S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan ifølge krav 1, hvori medikamentet administreres i en dose fra 1 mg til 100 mg.

4. Anvendelse ifølge krav 3, hvori dosen er fra 10 mg til 100 mg.

5. Anvendelse ifølge icrav 1, .hvori hydroklorid-, mesylat-, esylat- eller sulfatsaltet til S-(-)-N-propargyl-l-aminoindan anvendes.

6. Anvendelse ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av neurotrauma, omfattende skade på det sentrale eller perifere nervesystem som et resultat av iskemisk skade, slag, hypoksi eller anoksi, neurodegenerativ sykdom, Parkinsons sykdom, Alzheimers sykdom, neurotoksisk skade, hodetraumaskade, spinaltraumaskade eller enhver annen form for nerveskade.

7. Anvendelse ifølge krav 1, hvori medikamentet omfatter S(-)-N-propargyl-l-aminoindan eller et salt derav i en dose på fra 1 mg til 1000 mg.

8. Anvendelse ifølge krav 1, hvori medikamentet er for forebyggelse av nervedød hos en pasient.

9. Anvendelse ifølge krav 1, hvori medikamentet er for behandling av en pasient som er rammet av en hukommelsesforstyrrelse.