NO333987B1 - Anvendelse av (1S,2R)-enantiomeren av milnacipran for fremstillingen av et medikament - Google Patents

Description

Den foreliggende oppfinnelsen gjelder anvendelsen av (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran eller dens farmasøytisk akseptable salter, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for forebygging eller behandling depresjon, urininkontinens, generalisert angst, panikkanfall, fobi, tvangslidelser, adferdsforstyrrelser, utmattelse og medfølgende smertelidelser, smerte og medikamentavhengighet i pasienter valgt blant pasienter med lever- eller nyresvikt, pasienter som mottar behandling som medfører toksisitet i lever- eller nyreorgan og eller vev, pasienter som mottar behandling for en hjertesykdom, pasienter som mottar behandling som medfører kardiovaskulære bivirkninger, pasienter som har en sykdomshistorie med kardiovaskulær sykdom og/eller lider av kardiovaskulære forstyrrelser, samtidig som risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser og/eller for organ- og/eller vevstoksisitet begrenses. Nærmere bestemt er enantiomeren i følge oppfinnelsen beregnet for behandling av depresjon, kronisk tretthetssyndrom og urininkontinens.

Milnacipran (Z(+)-2-(aminometyl)-N,N-dietyl-1 -fenylsyklopropankarboksamid), et molekyl som syntetiseres ved PIERRE FABRE MEDICAMENT Research Center (Castres, Frankrike), og som også betegnes TN-912, dalcipran, minalcipran, midalcipran eller midalipran, vites å være en dobbelt hemmer av serotonin (5-HT) og noradrenalin (NA) -gjenopptak. Milnacipran og fremgangsmåten for fremstilling av denne, er beskrevet i US patentskrift nr. 4,478,836. Annen informasjon vedrørende milnacipran finnes i tolvte utgave av Merck Index som post nr. 6 281.

Doble hemmere av serotonin (5-HT) og noradrenalin (NA) -gjenopptak tilsvarer en velkjent klasse av antidepressive midler som selektivt hemmer gjenopptak av både serotonin og noradrenalin. For eksempel er venlafaksin og duloksetin også dobbelthemmere av serotonin og noradrenalin. Undersøkelser har vist at forholdet mellom hemming av noradrenalingjenopptak og serotoningjenopptak ved milnacipram er tilnærmet 2:1 (Moret et al., 1985 Neuropharmacology 24(12): 1211-1219; Palmier et al, 1989, Eur J Clin Pharmacol 37: 235-238).

US patentskrift nr. 4,478,836 beskriver anvendelsen av milnacipran for behandling av lidelser i sentralnervesystemet, nærmere bestemt depresjon. Patentsøknad WOO1/26623 beskriver anvendelsen av milnacipran i forbindelse med fenylalanin og ty rosin ved indikasjoner som behandling av tretthet, syndromer forbundet med smerte, kronisk tretthetssyndrom, fibromyalgi og irritabelt tarmsyndrom. Patentsøknad WOO 1/62236 beskriver en sammensetning som inneholder milnacipran sammen med ett eller flere antimuskarinmidler med et stort antall indikasjoner, innbefattet depresjon. Patentsøknad W097/35574 beskriver en farmasøytisk sammensetning som inneholder milnacipran og idazoksan som et assosiert produkt for anvendelse samtidig, separat eller tidsforskjøvet for behandling av depresjon i sine forskjellige former så vel som lidelser hvorved antidepressive midler anvendes. Milnacipran er også indikert for anvendelse ved behandlingen av urininkontinens (FR 2 759 290).

Milnacipranmolekylet har to asymmetriske karbonatomer, noe som gir to forskjellige romlige konfigurasjoner, (1S,2R) og (1R,2S). Disse romlige konfigurasjonene kan ikke legges over hverandre, milnacipranmolekylet viser derfor optiske isomerisme.

Milnacipranhydroklorid foreligger således i form av to optisk aktive enantiomerer: Den dekstrorotatoriske enantiomeren eller Z-(lS,2R)-2-(aminometyl)-N,N-dietyl-l-fenylsyklopropankarboksamidhydroklorid og den levorotatoriske enantiomeren Z-(lS,2R)-2-(aminometyl)-N,N-dietyl-l-fenylsyklopropankarboksamidhydroklorid. I sin hydrokloridform, markedsføres milnacipran (også betegnet F2207) for tiden (IXEL, PIERRE FABRE MEDICAMENT, Frankrike) i form av en rasemisk blanding som et serotoninerg og noradrenerg antidepressivt middel. F2695 og F2696 betegner den dekstrorotatoriske (1S,2R) henholdsvis levorotatoriske (1R,2S) enantiomeren av milnacipranhydrokloridet (F2207):

Disse to enantiomerene kan separeres og isoleres ved anvendelse av fremgangsmåter som er beskrevet i litteraturen (Bonnaud et al, 1985, Journal of Chromatography, Bind 318: 398-403; Shuto et al, Tetrahedron letters, 1996 Bind 37: 641-644; Grard et al, 2000, Electrophoresis 2000 21: 2038-3034; Doyle og Hu, 2001, AdvancedSynthesis and Catalysis, Bind 343: 299-302).

De foreliggende oppfinnerne har nå utført en farmakokinetisk undersøkelse i mennesker av rasematet og de to enantiomerene av milnacipran ved anvendelse av enantiomerselektive analysefremgangsmåter. De har ved dette vist fraværet av rasemisering av enantiomerene in vivo.

Videre har, selv om rasematet er blitt løst, ingen analyse av de farmakologiske og toksikologiske egenskapene til de enantiomerene blitt utført ved anvendelse av moderne, for tiden tilgjengelige fremgangsmåter, for eksempel så som kardiovaskulære målinger ved telemetri eller genomiske analyser for prediktiv farmakotoksikologi in vitro.

Som for alle andre aktive forbindelser, kan antidepressive midler indusere ugunstige hendelser eller visse toksiske virkninger som i alt vesentlig er avledet fra disse medikamentenes farmakologiske egenskaper, så vel som fra doseringen, fra individuelle variasjoner i pasientene (genetisk polymorfisme, organfunksjonssvikt, kjønn, alder) eller fra medikamentinteraksjoner. Antidepressive midler er således som en produktklasse den tredje mest vanlige årsaken til forgiftning, etter hypnotiske midler og beroligende midler (Nores et al, 1987, Thérapie 42, 555-558). Risikoen ved overdoser av antidepressive midler er alvorlig, ettersom dette kan føre til død. Blant årsakene til akutt forgiftning med antidepressive midler, bør nevnes tilfeldig inntak av barn (desto mer så ettersom visse antidepressive midler anvendes behandling av enurese), selvmordsforsøk, legers tilfeldige overdosering, samtidig tilførte medikamenter hos eldre pasienter, aldersrelaterte fysiologiske og farmakokinetiske endringer (hjerteutilstrekkelighet, leverutilstrekkelighet og/eller nyreutilstrekkelighet...) og redusert metabolsk hastighet, enten av genetiske grunner eller medikamentindusert (enzymhemming). Etter barn, representerer eldre personer derfor den mest utsatte populasjonen blant pasienter som behandles. Eldre personer har høyere plasmakonsentrasjoner, noe som skyldes redusert "clearance" via nyrer og/eller lever, og faren for forgiftning er mer alvorlig (Meadoer-Woodruff et al, 1988 J. Clin. Psychopharmacol 8: 28-32).

De ugunstige bivirkningene, som generelt er godartede, som har blitt observert under behandling med milnacipran, opptrer vanligvis i løpet av behandlingens første uke eller de første to ukene av behandlingen og reduseres deretter, parallelt med en forbedring av den depressive episoden. De vanligste rapporterte ugunstige bivirkningene ved enkeltmedikamentbehandling eller ved behandling sammen med andre psykotrofe midler er svimmelhet, omfattende svetting, angst, hetetokter og dysuri. Visse mindre hyppig rapporterte ugunstige bivirkninger er kvalme, oppkast, tørr munn, forstoppelse, tremor, palpitasjoner, opphisselse og utslett i huden. Det er videre kjent at hos pasienter som har hatt hjerte/karsykdommer tidligere eller som samtidig gis behandling for en hjertetilstand, kan milnacipran forhøye forekomsten av kardiovaskulære ugunstige hendelser (hypertensjon, hypotensjon, ortostatisk hypotensjon, palpitasjoner). Hos pasienter med høyt blodtrykk eller med hjertesykdom, anbefales det derfor å forsterke den medisinske overvåkningen siden milnacipran i form av en rasemisk blanding sannsynligvis vil gi økt hjertefrekvens.

I de sjeldne tilfellene hvor overdoser er observert med milnacipran (i doser på fra 800 mg til 1 g) ved enkeltmedikamentbehandling, er de viktigste observerte symptomene oppkast, respirasjonsforstyrrelser og tachykardi (Vidal Dictionarym 78. utgave, 2002). En annen ugunstig bivirkning som enkelte ganger induseres av milnacipran, er forhøyde transaminasenivåer, noe som kan gjenspeile en viss levertoksisitet.

Risikopopulasjonene som er utsatt for utvikling av et visst antall av ugunstige kliniske manifestasjoner i løpet av eller etter behandling med milnacipran er barn, eldre, pasienter med lever- og/eller nyreutilstrekkelighet, pasienter som mottar behandling som induserer organ- og/eller vevstoksisitet, nærmere bestemt lever-og/eller nyretoksisitet, pasienter som mottar behandling for en hjertetilstand eller som induserer kardiovaskulære bivirkninger, pasienter med tidligere hjerte/karsykdom og/eller med kardiovaskulære lidelser, særlig pasienter med forstyrrelser i hjerterytmen, blodtrykkslidelser (hypo- eller hypertensive pasienter) og pasienter som lider av hjertesykdom.

Med det formålet å i enda større grad forebygge forekomsten av mulige bivirkninger som kan utgjøre en fare, om enn liten, for helsen til pasienter som behandles med milnacipran, har de foreliggende oppfinnerne nå overraskende og uventet oppdaget at (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran, som i alt vesentlig er ansvarlig for den selektive hemmende virkningen på serotonin- og noradrenalingjenopptak, induserte færre bivirkninger av kardiovaskulær natur og mindre organ- og/eller vevstoksistet, særlig levertoksisitet, enn den rasemiske blandingen. Nærmere bestemt har oppfinnerne oppdaget at tilførsel av (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran til hunder fører til mindre økning av hjertefrekvens og blodtrykk, særlig det diastoliske blodtrykket, enn hva som kan induseres ved administrering av den rasemiske blandingen. Videre har oppfinnerne oppdaget at (lS,2R)-enantiomeren av milnacipranhydroklorid (F2695) har en bedre genomisk toksisitetsprofil enn (lS,2R)-enantiomeren av milnacipranhydroklorid (F2696) i en eksperimentell modell som benytter primære rottehepatocytter. Oppfinnerne har også vist at (lS,2R)-enantiomeren (F2696) har en genomisk toksisitetsprofil som tilsvarer den oppnådd med klomipramin som anvendes som et psykotrofisk referanseprodukt og som er kjent for sin relative levertoksisitet.

Formålet med den foreliggende oppfinnelsen er således anvendelsen av enantiomeren av milnacipran (1S,2R), fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, så vel som deres farmasøytisk akseptable salter, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for forebygging eller behandling av depresjon, urininkontinens, generalisert angst, panikkanfall, fobi, tvangslidelser, adferdsforstyrrelser, utmattelse og medfølgende smertelidelser, smerte og medikamentavhengighet i pasienter valgt blant pasienter med lever- eller nyresvikt, pasienter som mottar behandling som medfører toksisitet i lever- eller nyreorgan og eller vev, pasienter som mottar behandling for en hjertesykdom, pasienter som mottar behandling som medfører kardiovaskulære bivirkninger, pasienter som har en sykdomshistorie med kardiovaskulær sykdom og/eller lider av kardiovaskulære forstyrrelser, samtidig som risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser og/eller for organ- og/eller vevstoksisitet begrenses.

Begrepet "kardiovaskulære forstyrrelser" skal forstås å vise til ugunstige kardiovaskulære bivirkninger av medikamentet administrert alene eller i forbindelse med andre aktive forbindelser.

For formålet med den foreliggende oppfinnelsen, skal begrepet "bivirkning" forstås å bety den forutsigbare virkningen av et medikament i et område som er forskjellig fra det området hvor medikamentet administreres, noe som kan være plagsomt eller uønsket dersom det begrenser anvendelsen av medikamentet.

Begrepet "toksisitet" skal forstås å bety evnen til et medikament til å indusere skadelige virkninger på organer eller vev, nærmere bestemt organer eller vev som deltar i metabolismen av milnacipran, fortrinnsvis lever- og/eller nyremetabolismen av milnacipran, nærmere bestemt under første gangs passasje av milnacipran i leveren. Organtoksistet er fortrinnsvis hjertetoksisitet, mens nevnte vevstoksisitet er lever- og/eller nyretoksistet.

For den foreliggende oppfinnelsens formål, skal begrepet "samtidig som risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser reduseres" eller "samtidig som risikoen for toksisitet reduseres", forstås å bety det faktum at slik risiko forhindres i å øke signifikant hos en pasient etter tilførsel av medikamentet.

For den foreliggende oppfinnelsens formål, betegner begrepet "(lS,2R)-enantiomer av milnacipran" (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran så vel som farmasøytisk akseptable salter derav. Dette er fortrinnsvis (lS,2R)-enantiomeren av milnacipranhydroklorid (F2695). "(lR,2S)-enantiomer av milnacipran" betegner (lR,2S)-enantiomeren av milnacipran så vel som farmasøytisk akseptable salter derav, for eksempel hydrokloridet (F2696). "Rasemisk blanding" betegner en 50:50 blanding (vekt/vekt) av (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran og (1R,2S)-enantiomeren av milnacipran så vel som av deres farmasøytisk akseptable salter.

Det finnes også metabolitter av milnacipran som er aktive in vivo og deres farmasøytisk akseptable salter, for eksempel slik som: o hydrokloridet av Z-(+)fenyl-l-aminometyl-2-syklopropankarboksyhlsyre (F1567):

o (±)fenyl-3-metylen-3-4-pyrroli0don-3 (F1612): o hydrokloridet av Z(±)-(para-hydroksyfenyl)-l-dietylaminokarbonyl-l-aminometyl-2-syklopropan (F2782):

o oksalatsyren av Z(±)-feny 1-1 -etylaminokarbonyl-1 -aminometyl-2-syklopropan (F2800): o hydrokloridet av Z(±)-fenyl-l-aminokarbonyl-l-aminometyl-2-syklopropan (F2941):

Disse metabolittene har, på samme måte som milnacipran, to asymmetriske karbonatomer, noe som gir to forskjellige romlige konfigurasjoner (1S,2R) og (1R,2S). Ettersom disse romlige konfigurasjonene ikke kan legges over hverandre, viser disse metabolittene også optisk isomeri. Forholdet mellom de to enantiomerene av metabolitten av milnacipran i blandingen av enantiomerer, er som beskrevet ovenfor for enantiomerer av milnacipran.

Begrepet "aktiv metabolitt" skal forstås å betegne et derivat som dannes ved metabolisering av milnacipran in vitro eller in vivo og som har evnen til å hemme gjenopptak av serotonin og noradrenalin, disse er fortrinnsvis F2782, F2941, F2800, F1612 ogF1567.

"Farmasøytisk akseptabelt salt" betegner alle salter som bibeholder virkningen og egenskapene til en aktiv forbindelse og som ikke gir bivirkninger. Disse er fortrinnsvis farmasøytisk akseptable salter av mineralsyrer eller organiske syrer. For eksempel, men ikke begrenset til disse, kan halohydrater så som for eksempel hydrokloridet og bromhydratet, fumaratet, maleatet, oksalatet, citratet, metansulfonatet, glutamatet, tartratet, mesylatet og disses mulige hydrater nevnes.

Enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, administreres til alle typer av pasienter med behov for slik behandling, uansett om det er for terapeutiske og/eller profylaktiske formål. For terapeutiske formål er målet å fjerne eller forbedre tilstanden som skal behandles og/eller ett eller flere symptomer forbundet med denne. For profylaktiske formål er målet å forhindre forekomsten av tilstanden som skal behandles og/eller av ett eller flere symptomer forbundet med denne. Ikke desto mindre er enantiomeren i henhold til oppfinnelsen tilpasset til populasjoner av spesielt utsatte pasienter, som sannsynligvis vil utvikle visse ugunstige kliniske manifestasjoner under eller etter behandling med milnacipran i rasemisk form. Dette gjelder hovedsakelig for pasienter med lever- og/eller nyreutilstrekkelighet, pasienter som mottar behandling som induserer organ- og/eller vevstoksisitet i lever og/eller nyrer, pasienter som mottar behandling for hjertetilstand, pasienter som mottar behandling som induserer kardiovaskulære bivirkninger, pasienter som tidligere har hatt hjerte/karsykdom (for eksempel myokardialt infarkt) og/eller med kardiovaskulære lidelser så som pasienter med hjerterytmeforstyrrelse (tachykardi, bradykardi, palpitasjoner), pasienter med blodtrykkslidelser (hypo- eller hypertensive pasienter) eller pasienter som lider av hjertesykdom.

Blant de mange lidelsene eller tilstandene som har som symptomer hjerterytmeforstyrrelser og for hvilke den foreliggende oppfinnelsen er spesielt godt tilpasset ved behandlingen av spesielt utsatte pasienter som lider av dem, tachykardi som tilsvarer en økt hjertefrekvens (tachykardi er moderat dersom hjertefrekvensen er fra 80 til 100 slag i minuttet, alvorlig dersom den overstiger 100), palpitasjoner, ekstrasystoler (sporadiske, hyppig forekommende eller under myokardialt infarkt), atrieflimmer, atrieflagring og atrietachysystol, bradikardi, hjerteutilstrekkelighet og myokardialt infarkt bør nevnes.

Blant de mange lidelsene eller tilstandene som har som symptomer blodtrykkslidelser og for hvilke den foreliggende oppfinnelsen er spesielt godt egnet for behandlingen av spesielt utsatte pasienter som lider av dem, bør man nevne arteriehypertensjon, ondartet arteriehypertensjon, pulmonar arteriehypertensjon, portal hypertensjon, paroksysmal essensiell hypertensjon, hypotensjon, ortostatisk hypotensjon og intrakranial hypertensjon.

De kardiovaskulære lidelsene for hvilke risikoen kan begrenses ved administrering av blandingen av enantiomerer i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis ved administrering av den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, er fortrinnsvis som følger: > forhøyet diastolisk og/eller systolisk blodtrykk, målt i millimeter kvikksølv (mmHg); dette er nærmere bestemt en økning av det diastoliske blodtrykket, og/eller

> hjerterytmeforstyrrelser, fortrinnsvis økt hjertefrekvens hos pasienten.

Det systoliske blodtrykket er den maksimale verdien for blodtrykket og tilsvarer det øyeblikket hvor den første hjertelyden høres i overarmsarterien under måling av blodtrykket. Systolen er det tidsintervallet i hjertesyklusen under hvilken hjerterommene trekker seg sammen, noe som presser blodet ut. Det diastoliske blodtrykket er minimumsverdien for blodtrykket og tilsvarer forsvinningen av hjertelyder i overarmsarterien når sfygmomanometerets mansjett blåses opp under måling av blodtrykket. Diastolen er det tidsintervallet i hjertesyklusen under hvilken hjerterommene fylles med blod. Forhøyet systolisk og/eller diastolisk trykk betyr økt blodtrykk, noe som er typisk for systemisk arteriell hypertensjon (og variante former derav), hvor symptomene kan være de følgende: Hodepine, tretthet, milde sanseforstyrrelser så som for eksempel svimmelhet, susing i ørene, palpitasjoner, neseblødning, forvirring eller døsighet, kramper, nummenhet eller prikking i føtter og hender. Systemisk arteriell hypertensjon (og variante former derav) kan føre til alvorlige, faktisk dødelige komplikasjoner: Cerebrale vaskulære hendelser, hjertesvikt forbundet med venstre hjertekammer, nyresvikt, ischemiske hjertesykdommer (myokardialt innfart, angina og varianter derav). Ifølge dagens retningslinjer, anses en pasient for å ha arteriell hypertensjon dersom hans/hennes diastoliske blodtrykk er over 90 mmHg og det systoliske blodtrykket er over 140 mmHg.

Toksisiteten for hvilken risikoen kan begrenses ved administreringen av enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, er fortrinnsvis organtoksisitet, særlig hjertetoksistet og/eller vevstoksisitet, særlig levertoksisitet og/eller nyretoksisitet. Vevstoksisitet kan avsløres ved nærværet av gulsott eller ut fra laboratoriemarkører.

Anvendelsen av enantiomeren i henhold til oppfinnelsen innen veterinærmedisinen for behandling av dyr, spesielt kjæledyr eller avlsdyr som krever slik behandling, faller også innenfor området til den foreliggende oppfinnelsen.

Grunnet deres farmakologiske egenskaper, spesielt som dobbelthemmere av serotonin (5-HT) og noradrenalin (NA) -gjenopptak, er enantiomeren ifølge oppfinnelsen spesielt anvendelig for fremstillingen av medikamenter som er beregnet for forebyggende og/eller helbredende behandling av en rekke lidelser og tilstander (syndromer) som beskrives heri i det etterfølgende, samtidig som risikoen for hjerte/karsykdommer og/eller for organ- og/eller vevstoksisitet, nærmere bestemt hjertetoksisitet, levertoksisitet og/eller nyretoksisitet, reduseres.

Blant disse lidelsene eller tilstandene, bør lidelser i sentralnervesystemet som definert i " The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders - IV ( DSM-IV), 1995 American Psychiatric Association" nevnes. For eksempel, men ikke begrenset til disse, bør følgende lidelser og tilstander nevnes: Depresjon, fortrinnsvis dyp depresjon, kronisk depresjon, depresjon hos eldre, psykotisk depresjon, depresjon indusert ved behandling med interferon, depressive tilstander, manisk-depressivt syndrom, periodiske depressive episoder, depressive episoder forbundet med den generelle helsetilstanden, depressive episoder forbundet med humørendrende forbindelser, bipolar sykdom, schizofreni, generalisert angst, grettenhet og svekkede tilstander, stressforbundne sykdommer, panikkanfall, fobier, fortrinnsvis agorafobi, tvangslidelser, adferdsforstyrrelser, opponensforstyrrelser, posttraumatisk stressforstyrrelser, depresjon av immunsystemet, tretthet og ledsagende smertesyndromer, kronisk tretthetssyndrom, fibromyalgi og andre funksjonelle somatiske forstyrrelser, autisme, forstyrrelser som særpreges ved oppmerksomhetssvikt grunnet den generelle helsetilstanden, oppmerksomhetssvikt grunnet hyperaktivitet, spiseforstyrrelser, nevrotisk bulimi, nevrotisk anoreksi, fedme, psykotiske forstyrrelser, apati, migrene, smerte og da spesielt kronisk smerte, irritabel tarmsyndrom, kardiovaskulære sykdommer og da fortrinnsvis angstdepressivt syndrom ved myokardialt infarkt eller ved hypertensjon, nevrodegenerative sykdommer og tilhørende angstdepressive syndromer (Alzheimers sykdom, Huntingtons chorea, Parkinsons sykdom), urininkontinens, nærmere bestemt urininkontinens forbundet med stress og enurese, medikamentavhengighet, nærmere bestemt angstbetont avhengighet av tobakk, fortrinnsvis avhengighet av nikotin, alkohol, narkotiske stoffer, medikamenter og analgetiske midler som anvendes ved avvenning fra disse avhengighetstilstandene.

Nærmere bestemt gjelder den foreliggende oppfinnelsen anvendelsen av enantiomeren i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for behandling eller forebygging av depresjon eller en depressiv tilstand samtidig som at risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser og/eller organ- og/eller vevstoksisitet, fortrinnsvis levertoksisitet og/eller nyretoksistet, begrenses. I forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen, skal begrepet "depresjon" forstås å vise til en konstellasjon av symptomer som på den ene siden har et psykologisk aspekt som omfatter humørforstyrre Iser med pessimisme, moralsvikt, tanker om død eller selvmord og mental hemming, og på den andre siden, et fysisk aspekt med motorisk svikt, spesielt bestående av en langsommere motorisk aktivitet, appetittforstyrrelser, forstoppelse, søvnforstyrrelser og vektkontrollforstyrrelser. Depresjon tilsvarer derfor en patologisk psykologisk tilstand som kombinerer en smertefull humørendring og redusert mental og motorisk aktivitet. Begrepet "depressiv tilstand" skal forstås å vise til en mental tilstand som særpreges ved en reduksjon i nevropsykologisk tonisitet som manifesterer seg som likegladhet, en tendens til tretthet, mismot og en tendens til pessimisme, noen ganger ledsaget av angst.

Videre gjelder den foreliggende oppfinnelsen mer spesifikt anvendelsen av enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for forebygging eller behandling av fibromyalgi og/eller kronisk tretthetssyndrom, samtidig som risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser og/eller organ- og/eller vevstoksisitet, nærmere bestemt levertoksisitet og/eller nyretoksisitet, begrenses. Fibromyalgisyndrom er et kronisk syndrom som kjennetegnes ved en følelse av smerte og en brennende følelse med morgenstivhet, særlig når det gjelder artikulære og periartikulære fibrøse vev, og ved en følelse av dyp tretthet. Fibromyalgi omfatter en konstellasjon av symptomer. De vanligste er ikke-restituerende søvn, hodepine, fordøyelsesforstyrrelser, depresjonstilstand, muskelspasmer, ansiktssmerter, nummenhet, osv. Kronisk tretthetssyndrom kjennetegnes ved en tilstand av utmattelse eller tretthet. De vanligste symptomene er en tilstand av svakhet, spasmer og/eller muskelsmerter, overdrevet søvnbehov, feber, angina, hukommelsestap og/eller konsentrasjonsproblemer, søvnløshet og depresjon.

I tillegg gjelder den foreliggende oppfinnelsen mer spesifikt anvendelsen av enantiomeren i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for forebygging eller behandling av smerte, fortrinnsvis kronisk smerte, samtidig som at risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser og/eller organ- og/eller vevstoksisitet, fortrinnsvis levertoksisitet og/eller nyretoksisitet, reduseres. Smerte kan være forbundet med forskjellige lidelser og/eller sår. Den kan være akutt eller kronisk. Epidemiologiske undersøkelser har vist sammenhengene mellom kroniske smertetilstander og angst og depresjon. Således kan pasienter som lider av kronisk smerte utvikle emosjonelle problemer som fører til depresjon, og i verste fall til et selvmordsforsøk. En pasient anses for å være i kronisk smerte dersom han eller hun klager på smerter over et tidsrom på mer enn seks måneder. Blant de forskjellige typene av kronisk smerte, bør følgende nevnes som eksempler, selv om begrepet ikke er begrenset til disse: Smerte forbundet med fibromyalgi og/eller som oppstår i fibrøse vev, muskler, sener, ligamenter og andre seter, buksmerter og diaré ved irritabelt tarmsyndrom, så vel som smerter i korsryggen.

I tillegg angår den foreliggende oppfinnelsen mer spesielt anvendelsen av enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for forebygging eller behandling av urininkontinens, nærmere bestemt urininkontinens forbundet med stress og enurese, samtidig som at risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser og/eller organ- og/eller vevstoksisitet, fortrinnsvis levertoksisitet og/eller nyretoksisitet, begrenses.

Profylaktisk og terapeutisk behandling av de ovenfor nevnte lidelsene oppnås ved å administrere til et dyr, fortrinnsvis et menneske, en terapeutisk effektiv mengde av enantiomeren i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, alene eller i forbindelse minst én annen aktiv forbindelse. I de fleste tilfellene dreier det seg om mennesker, behandlingen er imidlertid også tilpasset til dyr, fortrinnsvis avlsdyr (storfe, gnagere, fjærkre, fisk,...) og husdyr (hunder, katter, kaniner, hester, ...).

(lS,2R)-Enantiomeren av milnacipran, så vel som deres farmasøytisk akseptable salter som beskrevet tidligere, administreres fordelaktig til pasienter som samtidig, separat eller forskjøvet i tid mottar minst én annen aktiv forbindelse for behandlingen av de ovenfor nevnte lidelsene.

Fortrinnsvis omfatter den foreliggende oppfinnelsen også, for anvendelse som et medikament: a) (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran, så vel som deres farmasøytisk akseptable salter, og b) minst én aktiv forbindelse utvalgt blant psykotrope midler, fortrinnsvis antidepressive midler og antimuskarinmidler,

som assosierte produkter for anvendelse samtidig, separat eller forskjøvet i tid ved behandlingen eller forebyggingen av depresjon, fortrinnsvis dyp depresjon, kronisk depresjon, depresjon hos eldre, psykotisk depresjon, depresjon indusert ved behandling med interferon, depressive tilstander, manisk-depressivt syndrom, periodiske depressive episoder, depressive episoder forbundet med den generelle helsetilstanden og depressive episoder forbundet med humørendrende forbindelser.

Begrepet "psykotropisk" skal forstås å betegne en forbindelse av naturlig eller kunstig opprinnelse som er i stand til å modifisere mental aktivitet og hvis virkning i alt vesentlig utøves på sentralnervesystemet og den psykologiske tilstanden. Psykotropiske midler kan deles inn i tre grupper: 1) Psykoleptiske midler (hypnotiske midler, nevroleptiske midler og anksiolytiske midler), 2) psykoanaleptiske midler (antidepressive midler og psykotone midler) og 3) psykodysleptiske midler (hallusinogene midler).

Det nevnte psykotropiske middelet er fortrinnsvis et antidepressivt middel. Det antidepressive middelet er for eksempel, men ikke begrenset til, utvalgt blant (i) monoaminoksidasehemmere (MAOPer) så som iproniazid, pargylin og selegin, (ii) 5HTlD-agonister så som sumatriptan, adrenalin og noradrenalin (alfa- og beta-sympatomimetiske midler), (iii) trisykliske antidepressive midler så som imipramin og klomipramin, (iv) selektive serotoningjenopptakshemmere (SSRTer) som fluoksetin, (v) selektive noradrenalingjenopptakshemmere som for eksempel tandamin, fluparoksan, mirtazapin og (vi) serotonin- og noradrenalingjenopptakshemmere så som venlafaksin og duloksetin. Antimuskarinmiddelet er for eksempel valgt fra gruppen bestående av, men er ikke begrenset til, tolterodin, propiverin, oksybutynin, trospium, darifenacin, temiverin og ipratropium.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også fortrinnsvis for anvendelse som et medikament: a) den nevnte (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran, så vel som deres farmasøytisk akseptable salter, og b) minst en annen aktiv forbindelse valgt fra gruppen av aktive forbindelser som induserer organtoksisitet og aktive forbindelser som induserer

vevstoksisitet, fortrinnsvis levertoksisitet og/eller nyretoksisitet, eller en eller flere aktive forbindelser som er beregnet for behandling av lever- eller nyresvikt,

som assosierte produkter for anvendelse samtidig, separat eller forskjøvet i tid for behandlingen eller forebyggingen av tilstander eller lidelser som kan kontrolleres ved dobbelt hemming av serotonin (5-HT) og noradrenalin (NA) -gjenopptak.

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter fortrinnsvis også, for anvendelse som et medikament: a) (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran, så vel som deres farmasøytisk akseptable salter, og b) minst en annen aktiv forbindelse valgt fra gruppen av aktive forbindelser som induserer kardiovaskulære bivirkninger eller forbindelser som tilføres

for behandling av en hjertetilstand,

som assosierte produkter for anvendelse samtidig, separat eller forskjøvet i tid ved behandlingen eller forebyggingen av tilstander eller lidelser som kan kontrolleres ved dobbelt hemming av serotonin (5-HT) og noradrenalin (NA) -gjenopptak.

De kardiovaskulære bivirkningene som induseres er fortrinnsvis de bivirkningene som er nevnt tidligere, nærmere bestemt arteriell hypertensjon, hypotensjon, forstyrrelser i hjerterytmen (tachykardi, bradykardi, palpitasjoner).

Den foreliggende oppfinnelsen omfatter også farmasøytiske sammensetninger som inneholder de assosierte produktene som er beskrevet tidligere.

I forbindelse med den foreliggende oppfinnelsen, administreres enantiomeren i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, fortrinnsvis men ikke begrenset til, oralt, nasalt, transdermalt, rektalt, intestinalt eller parenteralt, ved intramuskulær, subkutan eller intravenøs injeksjon, alene eller sammen med andre aktive forbindelser som beskrevet tidligere.

Ved administrasjon alene, kan enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, administreres alene som sådan eller i form av en farmasøytisk sammensetning hvori enantiomeren eller en av dens farmasøytisk akseptable salter er kombinert med eller blandet med ett eller flere medier, farmasøytisk akseptable eksipienter og/eller fortynningsmidler, fortrinnsvis for å forbedre biotilgjengeligheten.

Når enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, og fortrinnsvis den i alt vesentlig rene (1S,2R) F2695-enantiomeren av milnacipran, administreres i forbindelse med andre aktive forbindelser, kan blandingen og de andre aktive forbindelsene være utformet som en blanding eller separat i en identisk eller forskjellig form. De kan administreres via den samme eller en forskjellig tilførselsvei.

De farmasøytiske sammensetningene i henhold til oppfinnelsen kan utformes på konvensjonell måte som er velkjent blant fagfolk ved anvendelse av ett eller flere fysiologisk akseptable medier innbefattet eksipienter, adjuvanser og tilsetningsstoffer så som for eksempel konserveringsmidler, stabilisatorer, fuktemidler eller emulgeringsmidler. Utformingsfremgangsmåten som velges vil avhenge av den ønskede administrasjonsveien.

Når det gjelder administrering ved injeksjon, anvendes fortrinnsvis en vandig løsning, nærmere bestemt en fysiologisk akseptabel bufferløsning som for eksempel Hanks løsning, Ringers løsning eller en fysiologisk saltløsning. I forbindelse med transdermal administrering eller administrering via slimhinnemembranene, benyttes fortrinnsvis penetrerende midler som er egnet for den slimhinnen som skal krysses. Slike penetrerende midler er velkjente blant fagfolk. I forbindelse med oral administrering, administreres de farmasøytiske sammensetningene i samsvar med oppfinnelsen fortrinnsvis i enhetsdoseform eller flerdoseform i blandinger som inneholder egnede farmasøytiske medier som er kjent blant fagfolk. Egnede enhetsdose administreringsformer omfatter fortrinnsvis tabletter, eventuelt med furer for videre oppdeling, kapsler, pulvere, granulater, orale løsninger eller suspensjoner og aerosoler. Egnede former for flerdoseadministrering omfatter fortrinnsvis dråper, emulsjoner og siruper som kan inntas via munnen.

Ved fremstillingen av tabletter, utformes enantiomeren i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, med et farmasøytisk akseptabelt bærerstoff, nærmere bestemt for eksempel polyvinylpyrrolidon, karbopol, polyetylenglykol, gelatin, talkum, stivelse, laktose, magnesiumstearat, gummi arabikum eller analoger derav. Tabletten inneholder for eksempel følgende eksipienter: Kalsiumhydrogenfosfatdihydrat, kalsiumkarmellose, povidon K30, vannfritt kolloid silisiumdioksid, magnesiumstearat og talkum. Tablettene kan også være belagte, det vil si at de er belagt med flere lag av forskjellige forbindelser så som sakkarose for å lette svelging eller konservering av tabletten. Belegget kan også inneholde fargestoffer som en hjelp for å skille mellom og karakterisere tablettene når det for eksempel gjelder dosestyrken. Tablettene kan også foreligge i mer eller mindre komplekse utforminger som er beregnet for å modifisere frigjøringshastigheten til den aktive forbindelsen. Frigjøring av den aktive forbindelsen i tabletten kan være rask, vedvarende eller forsinket, avhengig av den ønskede absorpsjonen. Enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, kan således være fremstilt i en farmasøytisk form for vedvarende frigjøring, oppnådd i henhold til prosessen som er beskrevet i patentskrift EP 939 626. Denne farmasøytiske formen foreligger i form av multipartikler som inneholder et stort antall mikrokuler og som har en viss frigjøringsprofil in vitro.

Frigjøring av enantiomeren i henhold til oppfinnelsen kan forsinkes og/eller kontrolleres ved anvendelse av et implantat eller ved transdermal tilførsel, fortrinnsvis subkutant eller intramuskulært, ved intramuskulær injeksjon eller via et transdermalt plaster. Enantiomeren utformes nærmere bestemt med egnede hydrofobe eller polymere forbindelser og ionebytteharpikser.

Mengden av enantiomeren i henhold til oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, som skal administreres til pasienten avhenger av tilstanden som skal behandles, den ønskede virkningen, nærmere bestemt en terapeutisk eller profylaktisk virkning, pasientens helsetilstand og alder, nærmere bestemt pasientens medisinske historie når det gjelder hjerte/karsykdom, behandlingsbetingelsene og fremgangsmåten for administrering av medikamentet. Mengdene som må tilføres for effektiv terapeutisk eller profylaktisk anvendelse hos et menneske, kan bestemmes basert på dyremodeller eller på data kjent blant fagfolk og resultater oppnådd under behandling av depresjon hos mennesker, for eksempel ved anvendelse av en rasemisk blanding av milnacipran.

Når det gjelder terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av lidelsene som er nevnt ovenfor, fortrinnsvis depresjon, depressive tilstander, fibromyalgi, kronisk smertesyndrom og smerte, administreres medikamentet ifølge oppfinnelsen fortrinnsvis i doser på fra 0,01 mg til 10 mg/kg kroppsvekt pr dag i en eller flere porsjoner, mer foretrukket i doser på fra 0,05 mg 5 mg/kg kroppsvekt pr dag i en eller flere porsjoner, og enda mer foretrukket i doser på fra 0,1 mg til 1 mg/kg kroppsvekt pr dag i en eller flere porsjoner. I en spesielt fordelaktig utførelse, er tilførselen av det medisinske produktet i dosene som er definert ovenfor oppdelt i to daglige inntak, fortrinnsvis i kapselform. Enantiomeren i samsvar med oppfinnelsen, fortrinnsvis den i alt vesentlig rene F2695-enantiomeren, tilføres for eksempel fordelaktig i form av en kapsel som inneholder tilnærmingsvis 6,75 mg aktiv forbindelse pr kapsel, 12,5 mg/kapsel, 25 mg/kapsel eller 50 mg/kapsel.

Andre egenskaper, mål og fordeler ved den oppfinnelsen vil bli tydeligere ut fra de påfølgende eksemplene. Oppfinnelsen er ikke begrenset til disse spesifikke eksemplene som kun gis som eksempler og som skal leses ved henvisning til følgende figurer:

FIGURER

Figur 1: Forandring i hjertefrekvens etter enkel administrering (deltaverdier)

P < 0,001 sammenlignet med avionisert vann

P < 0,01 sammenlignet med avionisert vann

<*>: P < 0,05 sammenlignet med avionisert vann ;A : P < 0,05 sammenlignet med F2207 ;Figur 2: Forandring i hjertefrekvens etter enkel administrering (absolutte verdier) ;P < 0,001 sammenlignet med avionisert vann ;P < 0,01 sammenlignet med avionisert vann ;<*>: P < 0,05 sammenlignet med avionisert vann A : P < 0,05 sammenlignet med F2207

Figur 3: Virkninger av forskjellige behandlinger på gjennomsnittsverdien for det diastoliske blodtrykket (gjennomsnittsverdier over 6 timer etter siste inntak, etter 5 påfølgende behandlingsdager). Figur 4: Virkninger av forskjellige behandlinger på gjennomsnittsverdien for det systoliske blodtrykket (gjennomsnittsverdier over 6 timer etter siste inntak, etter 5 påfølgende behandlingsdager). Figur 5: Skjematisk fremstilling av fremgangsmåten for beregning av toksisitetsindeksen. Toksisitetsindeksen er summen av alle opp- og nedregulerte gener (beregnet ut fra den brukerdefinerte induksjonsfaktoren). Figurene 6a, 6b, 6c: MTT-analyse på primære rottehepatocytter.

Konsentrasjonene er gitt i^M.

EKSEMPLER

EKSEMPEL NR. 1: Farmakokinetiske undersøkelser av milnacipran og dens enantiomerer

Farmakokinetiske undersøkelser av milnacipranhydroklorid (F2207) og dens enantiomerer (F2695 og F2696) ble utført i forskjellige dyrearter og på mennesker.

Hos dyr ble farmakokinetikkene til hver enantiomer undersøkt etter administrering av rasematet eller av enkelt enantiomer. Plasmakonsentrasjoner av F2695- og F2696-enantiomerene er tilnærmet den samme i de undersøkte dyreartene (ape og rotte).

En farmakokinetisk undersøkelse i mennesker, omfattende 12 friske individer, ble utført ved administrering av rasematet eller en av de to enantiomerene alene. Det ble vist at den farmakokinetiske profilen for hver enantiomer var uavhengig av hvorvidt denne ble utført alene eller i form av rasematet, noe som indikerer fraværet av interaksjon mellom enantiomerene (tabell 1).

Tabell 1: Tabell over de viktigste farmakokinetiske variablene for milnacipranhydroklorid (F2207) og dens to enantiomerer F2695 og F2696.

Cmax: Maksimal plasmakonsentrasjon, beregnet direkte ut fra eksperimentelle verdier.

Tmax: Tid for å nå maksimal plasmakonsentrasjon.

AUCo-»»: Areal under kurven for plasmakonsentrasjoner som funksjon av tiden ekstrapolert til uendelig tid.

T1/2: Terminal halveringstid for reduksjon av plasmakonsentrasjoner.

Disse funnene viser at ingen biotransformasjon av enantiomerene F2695 og F2696 ble påvist i de undersøkte artene.

EKSEMPEL NR. 2: Biokjemiske undersøkelser av milnacipran og dens enantiomerer

De to enantiomerene (F2695 og F2696) av milnacipranhydroklorid (F2207) ble undersøkt in vitro på opptak av noradrenalin og serotonin, så vel som på binding av paroksetin i rottehjernen.

2. 1. MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

2.1.1. Noradrenalinopptak av et homogenat (P2) fra hypotalamus hos rotter Fremstilling av P2

Sprague-Dawley hannrotter med kroppsvekt på fra 200 til 300 g ble bedøvet og halshogd, og hypotalamus ble raskt fjernet. To hypotalami homogeniseres i 4 ml av 0,32 M sukrose i en Potter S homogenisator ved 16 fulle passasjer frem og tilbake ved 800 rpm fulgt av sentrifugering i 10 minutter ved 1000 g for fjerning av cellerester. Supernatanten sentrifugeres i 20 minutter ved 10000 g og den således oppnådde P2gjenvinnes i 4 ml av 0,32 M sukrose og homogeniseres i en Dounce homogenisator.

O pptak

•1H-(1)-NA: 13 Ci/mmol (Amersham) anvendes.

Opptaket finner sted i en fosfatbuffer (inneholdende 8 g NaCl, 1,21 g K2HPO4og 0,34 g KH2PO4pr liter) på forhånd oksygenisert i 30 minutter før bruk med en blanding av 02/C02(95%/5%).

Følgende bestanddeler innføres i 5 ml plastrør plassert i et vannbad ved 37°C:

- 100^1 buffer eller inhibitor,

- 700^1 buffer (inneholdende 25 pargylin),

- 100 ul P2.

Etter temperaturekvilibrering, startes reaksjonen ved tilsetning av 100^1<3>H-NA, 50 nM sluttkonsentrasjon.

Nøyaktig 10 minutter senere stanses reaksjonen ved tilsetning av 2,5 ml avkjølt buffer og filtrering gjennom GF/F-filtere. Røret vaskes så eng gang og filteret en gang med 2,5 ml avkjølt buffer. Filteret innføres så i en Beckman mikroampulle, og etter tilsetning av 3 ml Instagel (Packard) væskescintillator, måles radioaktiviteten i en Tricarb Packard væskescintillasjonsteller.

Ikke-spesifikt opptak (NS) måles i nærværet av IO"<5>M DMI.

Prosent hemming beregnes ved anvendelse av formelen:

IC50bestemmes grafisk ut fra gjennomsnittskurven for prosent hemming (4 analyser) som funksjon av logaritmen til inhibitorkonsentrasjonen.

2.1.2. Serotoninopptak

Fremgangsmåten ble utviklet ved å følge fremgangsmåten til Gray og Whittaker (1962, J. Anat., 96: 79-97). Etter homogenisering av hjernevev i en sukroseløsning, brytes de presynaptiske endene av aksonet og lukkes slik at det dannes synaptosomer som kan gjenvinnes ved subcellulær fraksjonering.

Sprague-Dawley (Janvier) hannrotter med kroppsvekt på 180-200 g ble anvendt. Etter avlivning av dyret ble hypotalamus tatt ut, veid og homogenisert i en Dounce homogenisator i 0,32 M sukrose ved 0°C.

Homogenatet ble sentrifugert i 10 minutter ved 1000 g (2400 rpm - Hettich, Rotenta). Supernatanten ble gjenvunnet og sentrifugert i 20 minutter ved 10000 g (8000 rpm - Beckam, modell J2-21 M: Rotor J14). Restmaterialet (betegnet P2-fraksjonen) ble gjenvunnet i sukrose ved en konsentrasjon på 50 mg/ml.

Følgende ble innkubert i 5 minutter ved 50 mg/ml:

o 350 ul av avkjølt buffer (136 mM NaCl, 2,4 mM KH2P04, 6,9 mM K2HP04, pH

7,2) preoksygenert 30 minutter tidligere,

o 50^1 membraner (5 mg/ml sluttkonsentrasjon),

o 50^1 citalopram (10"<5>M sluttkonsentrasjon) for ikke-spesifikt opptak,

o 50 ul av<3>H-5-HT (50 mM sluttkonsentrasjon) (NEN, Frankrike, 28,4 Ci/mmol).

Nøyaktig 5 minutter etter påbegynt innkubering, ble reaksjonen stanset ved vakuumfiltrering gjennom Whatman GF/F-filtere (etter fortynning med 2,5 ml avkjølt buffer, fulgt av 3 gangers vask med 2,5 ml buffer).

Radioaktiviteten oppsamlet på filteret ble målt (Packard Tricarb 4640) ved væskescintillasjon med Emulsifier-Safe (Packard).

ICso-verdien ble bestemt ved å fremstille prosent hemming som en funksjon av logaritmen av produktkonsentrasjonen (6 konsentrasjoner i duplikat).

2.1.3. Paroksetinbinding

Sprague-Dawley hannrotter (Janvier) med en kroppsvekt på 180-200 g ble anvendt. Hypotalamus ble oppsamlet fra flere rotter og homogenisert i 5 ml avkjølt buffer (50 mM Tris-HCl, 120 mM NaCl, 5 mM KC1, pH 7,5) i en Dounce homogenisator, og homogenatet ble sentrifugert ved 30000 g (27000 rpm - Beckman. L5-50E, rotor T40) i 10 minutter. Det oppnådde restmaterialet ble gjenvunnet i 5 ml buffer og sentrifugert på nytt under de samme betingelsene. Det nye restmaterialet ble gjenvunnet i den samme bufferen og til slutt homogenisert på nytt i en Dounce homogenisator ved en vevskonsentrasjon på 10 mg/ml. Membransuspensjonen (100^1) ble innkubert med 3H-paroksetin (NEN, Frankrike, 28,6 Ci/mmol) ved en sluttkonsentrasjon på 0,1 nM ved 20°C i et sluttvolum på 1 ml i 2 timer. Etter innkubering i 2 timer ble reaksjonen stanset ved vakuumfiltrering gjennom Whatman GF/F-filtere som 30 minutter tidligere var forbehandlet med en 0,05% løsning av polyetylenimin (fortynnet med 4 ml avkjølt buffer, hvoretter røret ble vasket 2 ganger med 4 ml buffer). Radioaktiviteten ble målt ved væskescintillasjonsspektrometri (Packard, Tricarb 4640) ved anvendelse av Emulsifier-Safe (Packard) som scintillasjonsmiddel.

Spesifikk<3>H-paroksetinbinding ble definert som forskjellen mellom den totale bindingen og resten i nærværet av 10 fluoksetin.

ICso-verdien ble bestemt ved å fremstille prosent hemming som en funksjon av logaritmen til produktkonsentrasjonen (6 konsentrasjoner i duplikat).

2.1.4. Anvendte produkter

F2207: Porsjon nr. 10-CTN3, nøkkel Pl 18

F2695: Porsjon nr. PL-I-205

F2695: Porsjon nr. PL-I-204C.

2. 2. RESULTATER

Virkningene av F2207 og dens to enantiomerer på opptak av noradrenalin og serotonin samt på paroksetinbinding, er vist i en kurve med prosent hemming på Y-aksen og konsentrasjonen (M) av F2207, F2695 og F2696 på X-aksen (resultater ikke vist). Verdiene for prosent hemming for hver produktkonsentrasjon, målt i duplikat, er gjennomsnittsverdiene fra fire separate eksperimenter.

IC5o-verdiene for de tre produktene ble bestemt basert på disse kurvene og er gitt i tabell 2.

De tre forbindelsene var aktive i disse tre farmakologiske analysene, imidlertid forelå det forskjeller:

- i noradrenalinopptak:

F2695 var to ganger mer aktivt enn F2207.

F2695 var 25 ganger mer aktivt enn F2696.

- i serotoninopptak:

F2695 var 3 ganger mer aktivt enn F2207.

F2695 var 12 ganger mer aktivt enn F2696.

- i paroksetinopptak:

F2695 var 2 ganger mer aktivt enn F2207.

F2695 var 10 ganger mer aktivt enn F2696.

De tre forbindelsene var aktive i disse tre farmakologiske analysene, imidlertid med en lavere aktivitet for (lR,2S)-formen (F2696) og rasematet (F2207). (1R,2S)-formen av milnacipran (F2695) var 2 til 3 ganger mer aktiv enn F2207. EKSEMPEL NR. 3: Sammenligning av aktiviteten til rasemisk milnacipranhydroklorid ( F2207") og aktiviteten av den aktive ( lS, 2R)- enantiomeren ( F2695). tilført oralt, på hjertefrekvens og blodtrykk hos våken hund.

3. 1. INNLEDNING

Denne undersøkelsen var utformet for å undersøke virkningene av F2207 og F2695 på a) hjertefrekvens etter en enkelt oral administrering (n = 28 hunder) og b) systolisk og diastolisk blodtrykk etter gjentatt oral administrering i 5 dager til hunder (n = 6 hunder).

Denne undersøkelsen ble utført med doser av F2207 og F2695 med samme farmasøytiske aktivitet i hunndyr utstyrt med implantater (Data Sciences International) som tillot oppsamling av data vedrørende hjertefrekvens og blodtrykk ved telemetri. For hver undersøkelse ble dyrene delt inn i 3 behandlingsgrupper:

- gruppe 1 (kontroll) behandlet med avionisert vann,

- gruppe 2 behandlet med F2207 i en dose på 20 mg/kg/dag,

- gruppe 3 behandlet med F2695 i en dose på 10 mg/kg/dag.

3. 2. FREMGANGSMÅTER

Grunnet det lave antallet samtidig utstyrte dyre (maksimalt 8), antallet oppsamlingsspor i det anvendte utstyret (8 spor) og for å oppnå homogene behandlingsgrupper, ble den totale evalueringen utført i fire undersøkelser, hver av dem inndelt i tre serier (behandling av hvert dyr med hvert av de tre produktene), atskilt av et utvaskingstidsrom med reinitialisering av probene. Hver serie utføres i to faser: en første fase hvori alle dyrene behandles med avionisert vann for å venne dem

til innesperringen og til oral behandling med mageinnkubering,

en andre fase hvori dyrene mottar den respektive behandlingen (enkel administrering for hjertefrekvens, undersøkelses nr. 894/926/935/936; gjentatt administrering i fem dager for blodtrykk, undersøkelses nr. 894).

Den fullstendige eksperimentplanen er beskrevet i den etterfølgende tabellen:

Virkningene av de forskjellige behandlingene på hjertefrekvensen ble undersøkt i de fire undersøkelsene etter en gangs administrering. Analysen omfatter følgende 13 dataoppsamlingstidspunkter:

- før engangs administrering,

- hvert 30. minutt over et tidsrom på 6 timer etter tilførselen.

Virkningene av de forskjellige behandlingene på blodtrykket ble analysert i undersøkelse nr. 894 ved "steady state" på D5, D29 og D33 (den siste effektive behandlingsdagen for hver serie). Analysen omfatter følgende datainnsamlingstidspunkter:

- før behandlingen,

- hvert 30 minutt over et tidsrom på 6 timer etter behandling.

3. 3. RESULTATER

3.3.1. Når det gjelder hjertefrekvensen (fire undersøkelser slått sammen), ble en Tukey-analyse utført for de individuelle frekvensendringene for hvert av de 12 etterbehandlingseksperimentene, sammenlignet med verdien før behandling, så vel som for den absolutte hjertefrekvensen ved hvert oppsamlingstidspunkt.

Følgende observasjoner ble gjort, sammenlignet med kontrolldyrene som ble tilført avionisert vann.

# når statistisk analyse av endringene i verdiene (figur 1) utføres:

en signifikant forhøyet hjertefrekvens fra den første halvtimen etter enkel administrering av F2207 (20 mg/kg), en vedvarende økning opptil 5,5 timer etter behandlingen (p < 0,001 for hele oppsamlingstidsrommet, bortsett fra tidspunktene 0,5 og 5,5 timer - p < 0,01 - og for tidspunktet 5,0 timer - p < 0,05 - etter behandling), forhøyet hjertefrekvens etter administrering av F2695, men fortsatt lavere enn økningen oppnådd etter administrering av F2207. Videre er denne forskjellen mellom virkningene av F2207 og F2695 signifikant (p < 0,05) 1 og 4 timer etter administreringen, til fordel for F2695, forhøyet hjertefrekvens over et kortere tidsrom ved behandling med F2695 (1,0 til 4,5 timer) enn ved behandling med F2207 (vedvarer i opptil 5,5 timer etter behandlingen). # når statistisk analyse utføres på absolutte hjertefrekvensverdier, viser den samme undersøkelsen (figur 2): en signifikant forhøyet hjertefrekvens fra den første timen etter en enkelt administrering av F2207 (20 mg/kg), en vedvarende økning opptil 5,5 timer etter behandlingen (p < 0,001 for hele måleperioden fra 1,0 til 4,5 timer, bortsett fra tidspunktene 3,5 timer - p < 0,01; og p < 0,01 for måletidspunktet 5,5 timer etter behandling),

en forhøyet hjertefrekvens etter tilførsel av F2695, som fortsatt forblir lavere enn hva som oppnås etter administrering av F2207. Videre er denne forskjellen mellom virkningene av F2207 og F2695 signifikant (p < 0,05) 1 og 4 timer etter administreringen, til fordel for F2695,

en forhøyet hjertefrekvens som varer i en kortere tid ved behandling med F2695 (1,0 til 4,5 timer) enn ved behandling med F2207 (vedvarer opptil 5,5 timer etter behandlingen).

3.3.2. Når det gjelder blodtrykket (en undersøkelse med gjentatt administrering), ble en gjennomsnittsverdi for det diastoliske blodtrykket (figur 3 og tabell 4) samt en gjennomsnittsverdi for det systoliske blodtrykket (figur 4 og tabell 5) beregnet for hver hund og for de 6 timene etter siste behandling, etter 5 etterfølgende administrasjonsdager. Disse gjennomsnittlige blodtrykksverdiene ble analysert ved hjelp av ANOVA etterfulgt av en Tukey-test dersom ANOVA tillot en slik test (resultater ikke vist).

Følgende ble observert:

- en signifikant økning (p < 0,001) i det diastoliske blodtrykket etter gjentatt administrering av F2207 i 5 dager (20 mg/kg/dag) eller av F2695 (10 mg/kg/dag), sammenlignet med behandling med avionisert vann, - en signifikant forskjell (p < 0,05) i gjennomsnittsverdien for det diastoliske blodtrykket etter gjentatt administrering av F2207 (20 mg/kg/dag) i 5 dager, sammenlignet med gjennomsnittsverdien det diastoliske blodtrykket etter gjentatt tilførsel av F2695 (10 mg/kg/dag), - ingen signifikant forskjell i det systoliske blodtrykket, det bør imidlertid bemerkes at verdiene for sBP etter gjentatt administrering av F2695 i 5 dager er nær verdiene for sBP etter behandling med avionisert vann.

Enkeltresultater for diastolisk og systolisk blodtrykk er vist i tabellen 4 og 5 henholdsvis.

3. 4. KONKLUSJON

Under de eksperimentelle betingelsene for den foreliggende evalueringen, utført i fire påfølgende undersøkelser ved oral administrering til bevisste hunder utstyrt med en telemetrisk anordning: • ved engangs administrering og sammenlignet med kontrollgruppen (n = 28), var økningen i hjertefrekvens klart signifikant og vedvarende med F2207 i en dose på 20 mg/kg/dag; økningen er statistisk og klinisk redusert og mer flytende med F2695 i den tilsvarende farmakologisk aktive dosen på 10 mg/kg/dag, • F2695 i en dose på 10 mg/kg/dag induserte ingen statistisk signifikant forskjell i gjennomsnittlig systolisk blodtrykk i løpet av 6 timer etter siste behandling, ved "steady state" etter gjentatt administrering i 5 dager, • en statistisk signifikant forskjell ble vist for gjennomsnittlig diastolisk blodtrykk i løpet av de 6 timene etter siste behandling, ved "steady state" etter gjentatt administrering i 5 dager, mellom den aktive F2695-enantiomeren (98 + 2 mmHg) og rasematet F2207 i tilsvarende farmasøytisk aktive doser (110 ± 4 mmHg).

Disse forskjellene viste tydelig en større kardiovaskulær tolererbarhet for den aktive F2695-enantiomeren.

EKSEMPEL 4; GENOMISK ANALYSE AV PREDIKTIV TOKSIKOLOGI TN VITRO

4. 1. MATERIALER OG FREMGANGSMÅTER

Forbindelsene F2695 og F2696, enantiomerer av det rasemiske molekylet F2207, så vel som klomipramin, et referanseprodukt (kodet C218 i undersøkelsen) ble undersøkt i den foreliggende undersøkelsen. De to enantiomerene, F2695 og F2696, ble først vurdert i en innledende cytotoksisitetsanalyse (MTT-analyse) på primære rottehepatocytter for å velge de tre konsentrasjonene som skulle anvendes i den endelige analysen.

Etter behandling av de primære rottehepatocyttene i kultur, ble RNA ekstrahert for erholdelse av merkede komplementære DNA-prober som så ble hybridisert til en membran som inneholdt 682 alternativt spleisede fragmenter som er spesifikke for cellestress. En toksisitetsindeks ble oppnådd for hvert av produktene ved å sammenligne hybridiseringsprofilen for de behandlede cellene med profilen til ubehandlede celler.

4. 1. 1. Undersøkelsens formål

Safe-Hit er en genomisk analyse for prediktiv toksikofarmakologi som er følsom, robust, pålitelig, hurtig og sikker, og som tillater sammenligning og rangering av produkter basert på en optimalisert vurdering av deres toksiske potensiale.

Safe-Hit anvender teknologi som tilhører EXONHIT (DATAS™: Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing) og som tillater isolering og påfølgende kloning av spleisehendelser som er en følge av en gitt biologisk tilstand, sammenlignet med en kontrolltilstand. Dette tillater isolering av mRNA-isoformer som uttrykkes differensielt avhengig av de biologiske betingelsene.

Safe-Hit tillater rangering av molekyler i en kjemisk serie ut fra en toksisitetsindeks, bestemt etter følgende basale trinn (systematisk utført i duplikat for hvert produkt): - behandling av cellelinjene med de forskjellige produktene i tre forskjellige konsentrasjoner bestemt ut fra en innledende cytotoksisitetsanalyse (MTT-analyse): En referansekonsentrasjon tilsvarende 80% cellelevedyktighet, en konsentrasjon som er 10 ganger høyere - når mulig - og en konsentrasjon som er 10 ganger lavere, - fremstilling av totalt RNA og de tilsvarende radioaktiv merkede cDNA-probene, - hybridisering av cDNA-probene: Safe-Hit makromatrise inneholdende 682 uavhengige kloner som tilsvarer endringer i genspleising indusert ved overekspresjon av WTp53 (p53 er den vanligst forekommende "formidler" av cellestress og er utvalgt for utvikling av denne metodologien),

erholdelse av resultater og bestemmelse av toksisitetsindeks.

4.1.2. Celler

Cellene som ble anvendt i undersøkelsen (innledende MTT-analyse av cytotoksisitet og hovedanalysen) er frysekonserverte hepatocytter fra Sprague-Dawley-rotter i primær kultur (porsjonene Hepl84005 og Hepl84006 - Biopredic), dyrket under standard betingelser.

4. 1. 2. 1 Dyrkningsmedium

- Opptiningsmedium: Leibovitz 15-medium med glutamaks 1, tilsatt 100 IU/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin og 0,6 M glukose (porsjon MIL 210009 - Biopredic),

Utsåingsmedium: Williams E-medium med glutamaks 1, tilsatt 100 IU/ml penicillin, 100 ug/ml streptomycin, 4^g/ml insulin fra storfe og 10% volum/volum kalvefosterserum (porsjon MIL 260005 - Biopredic), - Innkubasjonsmedium: Williams E-medium med glutamaks 1, tilsatt 100 IU/ml penicillin, 100^g/ml streptomycin, 4^g/ml insulin fra storfe og 50^M hydrokortisonhemisuccinat (porsjon MIL 260009-260007 - Biopredic).

4. 1. 2. 2 Dyrkningsbetingelser

37°C, C02-atmosfære (5%), relativ fuktighet (95%).

4. 1. 2. 3 Dyrkningsfremgangsmåte

4.1.3 Cytotoksisitetsanalyse

Cytotoksisitetsanalysen (MTT-analysen) påviser levende celler ved anvendelse av en kolorimetrisk reaksjon som viser cellerespirasjonens integritet, noe som viser at mitokondriene er aktive. MTT (3-[4,5-dimetyltiazol-2-yl]-2,5-difenyltetrazoliumbromid) som er løselig i vann, omdannes ved spalting grunnet virkningen av et mitokondrie enzym i levende celler til uløselig purpurfarget formazan. Formazan oppløses i et organisk løsemiddel og den oppnådde løsningen kan måles ved spektrofotometri. Den målte absorbansen er proporsjonal med antallet overlevende celler.

Cellene settes i forbindelse med produktet som skal analyseres i 5 forskjellige konsentrasjoner (0 - 1 - 10 - 25 - 50 og 100^M) i 16 timer.

Etter behandlingstiden, tilsettes en MTT-løsning (0,5 mg/ml i innkubasjonsmediet for de primære hepatocyttene) i 3 timer. Etter oppløsning av formazankrystallene, avleses flerbrønnsplatene med et spektrofotometer ved 500 nm for å bestemme prosentandelen av overlevende celler.

4.1.4 Genomisk farmakotoksikologisk hovedanalyse

Hovedanalysen utføres i duplikat ved anvendelse av utsådde kulturer eksponert overfor hvert produkt for å sikre at eksperimentene er konsistente og for å bekrefte de oppnådde resultatene.

4. 1. 4. 1 Utsåing og behandling av celler

Cellene utsås og dyrkes i 16 timer med hvert produkt ved de tre konsentrasjonene som ble valgt basert på den innledende MTT-analysen; to kontroller (ubehandlede celler og løsemiddel alene) inngår i seriene.

4. 1. 4. 2 Total KNA- ekstraksjon og analyse

Etter behandlingen, ekstraheres RNA og analyseres som følger:

- oppsamling av cellene og sentrifugering,

- ekstraksjon med klargjort fenolreagens (Trizol - porsjonene 1106266 og 1121067 - Invitrogen) ifølge produsentens fremgangsmåter,

- oppløsning av RNA i vann,

- RNA-analyse ved spektrofotometri (optisk tett målt ved 260, 280 og 300 nm),

- bekreftelse av RNA-kvaliteten ved anvendelse av Agilent.

4. 1. 4. 3 Fremstilling av cDNA- probene

cDNA-probene fremstilles ved revers transkripsjon med radioaktivt nukleotid (alfa dATP<33>P - Amersham). Det radioaktive cDNA kvantifiseres (Instant Imager - Packard) for å bekrefte at probene er aktive.

4. 1. 4. 4 Hybridisering til Safe- Hit- membranen

De 682 DATAS-klonene (alternative spleisemønstere) plasseres i duplikat på Safe-Hit-membranene, fremstilt av ferdig oppkuttet nylon (Q-BIOgene), med hjelp av et Q-Pix-apparat (GENETIX). DNA-probene hybridiseres til membranene over natten, og membranene vaskes.

4. 1. 4. 5 Fremstilling av cDNA:

- Templat: 5^g av totalt RNA (for hver behandlingsserie og for hver konsentrasjon), - Primer: 100 ng oligo-dTV-oligonukleotid for første og andre hybridisering i rotter (porsjon 12.00, Invitrogen),

- Hovedblanding:

10^1 First Strand 5x Premier buffer (porsjon 1131226 - Invitrogen)

1 ul dCTP + dGTP + dTTP 20 mM (porsjon 1105201 - Invitrogen)

1 nM ATP 120^M (porsjon 1105201 - Invitrogen)

5 ul ditiotreitol (DTT) 0,1 M (porsjon 133609 - Invitrogen)

1^1 Out 40 U RNase (porsjon 1113345 - Invitrogen)

5ul3<3>P dATP 3000 Ci/mmol 10 mCi/^1 (porsjon B0239 - Amersham)

4^1 Superscript II (porsjon 1137806 - Invitrogen)

1^1 glykogen (porsjon 1129328 - Invitrogen)

- Fremgangsmåte:

Innkuber RNA og oligo-dTV ved 70°C i 10 minutter og plasser så blandingen på is. Tilsett 27^1 MasterMix og innkuber ved 43°C i 1 time og så ved 50°C i 15 minutter. Tilsett 20^1 vann, fulgt av 20^1 50 mM EDTA og deretter 4 ^1 10 N NaOH. Innkubert i 20 minutter ved 65°C og plasser deretter på is.

Kvantifisering: Instant Imager, Packard: 1^1 reaksjonsblanding, tilsett 8^1 eddiksyre, 100^1 isopropanol og 1^1 glykogen (20 \ ig/\ il). Innkuber ved -20°C i 20 minutter, sentrifuger i 20 minutter ved 13000 rpm ved 4°C. Resuspender i 200^1 vann.

Kvantifisering: Instant Imager, Packard: 1^1 reaksjonsblanding.

- Medier og buffere

- Prehybridisering:

Tilsett en porsjon på 5 ml prehybridiseringsbuffer i hvert hybridiseringsrør,

tilsett en løsning av laksemelke-DNA til en sluttkonsentrasjon på 100^g/ml,

fukt membranene med 5X SSC,

plasser membranen i prehybridiseringsrøret og prehybridiser i 2 timer ved 65 °C.

- Hybridisering:

Fjern prehybridiseringsbufferen og vask med 10-20 ml 5X SSC,

fjern 5X SSC og erstatt med 5 ml buffer + laksemelke-DNA,

denaturer RT-probene i 5 minutter ved 95°C og plasser dem på is i 1 minutt,

sentrifuger for rekonstituering og overfør et egnet volum av denaturerte RT-prober til røret (100000 til 200000 cpm/ml), innkuber over natten ved 55°C.

Vask:

Vask membranene med 10-20 ml vaskebuffer 1,

fjern bufferen og erstatt den med 50 ml vaskebuffer 2,

innkubert i 30 minutter ved 35°C, fjern deretter vaskebufferen og erstatt den med buffer 4, innkuber i 30 minutter ved 55°C og hell av den endelige vaskebufferen,

fjern membranene fra rørene, plasser dem i en kassett og eksponer i 3 timer.

4. 1. 4. 6 Erholdelse og analyse av bildet

Membranene plasseres på en forsterkerfolie (FX Imaging ScreenK - Bio-rad) i 3 timer. Filmen avleses så ved anvendelse av en Personal Molecular Imager FX (Bio-rad). Bildet analyseres ved anvendelse av programvaren Safe-Hit (COSE).

4. 1. 4. 7 Beregning av toksisitetsindeksen

Alle resultatene overføres til et automatisk beregningsprogram som normaliserer de forskjellige membranene og beregner en toksisitetsindeks som tilsvarer summen av antallet opp- og nedregulerte gener for en gitt forbindelse ved en gitt konsentrasjon, sammenlignet med resultatene fra de ubehandlede kontrollene. Resultatene fra de to Safe-Hit-analysene sammenlignes så og slås sammen for å anslå den mulige toksisiteten av de forskjellige analyserte forbindelsene. To parametere som kan modifiseres av brukeren inngår i beregningen av toksisitetsindeksen: • Baksrunnsterskelen ( BT ) former svake signaler som ligger nær bakgrunnsstøyen og som ikke skyldes signifikant genekspresjon. Denne verdien bestemmer således påvisningsgrensen; • Induksjons faktor en ( 1F ) bere<g>nes som multiplikasjonsfaktoren sammenlignet med kontrollprøvene, for de opp- og nedregulerte klonene. Verdien av denne parameteren er vanligvis 2 eller lavere enn 2 for å oppnå relevante resultater. En gradvis økning av IF-verdien velger ut kloner som er sterkere og sterkere opp- eller nedregulert.

Fremgangsmåten for beregning av toksisitetsindeksen ble utviklet ved å sammenligne referanseprofilene (R: Ubehandlede celler) med en eksperimentell profil (E) og omfatter følgende trinn (se figur 5 for en skjematisk oversikt over fremgangsmåten):

- overføring av alle erholdte verdier til logaritmeverdier,

- beregning av gjennomsnittlige logaritmeverdier for hver av duplikatanalysene (MiR og MiE),

- fremstilling av en matrise med MiR - MiEfor alle signalene (= Di),

- normalisering av de enkelte MiE-verdiene ved å subtrahere fra MiE medianverdien for 14 proksimale D;-verdiene (= NM;E),

sammenligning av de normaliserte verdiene med referanseverdiene (Ci= NM;E-

MiR),

- eksponentiell transformasjon av Q (= F;),

- sammenligning av F, med induksjonsfaktoren som brukeren har valgt:

• dersom F, > IF, anses genet for å være oppregulert,

• dersom 1/IF < F, < IF, anses genet for å være uforandret,

• dersom F i < 1/IF, anses genet for å være nedregulert.

4. 2. RESULTATER FRA MTT- ANALYSEN

Disse analysene ble utført i triplikat på primære rottehepatocytter behandlet i 16 timer.

Klomipramin, her betegnet C218, viste en markant toksisitet ved 100^M, siden ingen overlevende celler ble observert etter behandling av cellene i 16 timer. I kontrast til dette, ble ingen toksisitet observert ved 25^M. Ved 50 var en celleoverlevelse høyere enn 80% fullt ut forenlig med en genomisk farmakotoksikologisk undersøkelse. Forbindelsene F2695 og F2696 viste ingen cytotoksisitet i denne analysen, selv ved en konsentrasjon på 100^M.

For å gjennomføre de genomiske farmakotoksikologiske vurderingene, anvendes 3 konsentrasjoner av samme forbindelse: Konsentrasjonen som tillater 80% celleoverlevelse (C) samt konsentrasjoner som tilsvarer (C)xl0 og (C)/10.

For å sammenligne evne til F2695 og F2696 til å gi en verdi i den utførte analysen, ble de samme konsentrasjonene benyttet i hver analyse: 1^M, 10 og 100^M. Konsentrasjoner på 1^M, 10 og 50 ble anvendt for klomipramin. Se figurene 6a, 6b og 6c.

4. 3 RESULTATER FOR PRIMÆRE ROTTEHEPATOCYTTER

Toksisitetsindeksene (IT) ble beregnet som beskrevet ovenfor. Kun de klonene som ble funnet å være endret sammenlignet med kontrollen ble tatt i betraktning i de to uavhengige eksperimentene, idet kun de kloner hvis signal var to ganger høyere enn bakgrunnsterskelen (BT) ble tatt i betraktning. To separate analyser ble utført ved anvendelse av to differensieringsnivåer (induksjonsfaktor - IF) sammenlignet med de ubehandlede kontrollene: - en faktor på minst 1,7 sammenlignet med de ubehandlede kontrollene. Denne faktoren på 1,7 representerer den svakeste verdien som gjør at en indeks ikke kan erholdes, sammenlignet med de to ubehandlede kontrollene, - en faktor på minst 2, sammenlignet med de ubehandlede kontrollene. Denne faktoren på 2 gjør at de mest robuste signalene tas i betraktning.

De følgende toksisitetsindeksene ble oppnådd:

Følgende rangering kunne således oppnås, fra den mest toksiske til den minst toksiske: C218 (klomipramin) > F2696 »> F2695.

Klomipramin, referansemolekylet, betegnet C218 i den foreliggende undersøkelsen, viste et økende antall signaturer med økende konsentrasjoner: Henholdsvis 9, 15 og 28 signaturer ved konsentrasjoner på henholdsvis 1, 10 og 50 (maksimal konsentrasjon definert i den innledende cytotoksisitetsanalysen). Som man logisk ville forvente, forefinnes alle signaturer som opptrer ved lave og moderate konsentrasjoner også ved høyere konsentrasjoner.

Ved konsentrasjoner på 1 og 10 induserte F2695 ingen av de 682 mulige stressignaturer som ble analysert i den foreliggende undersøkelsen. Ved den høyeste konsentrasjonen, 100^M, ble kun to signaturer påvist, en som var felles med C218 mens hvis signifikans var ukjent.

F2696 viste et økende antall signaturer med økende konsentrasjoner: 2, 5 og 22 signaturer ved konsentrasjoner på henholdsvis 1, 10 og 100^M. Alle signaturer som opptrådte ved lave og middels konsentrasjoner ble også påvist ved den høyeste konsentrasjonen. Ingen av de 22 signaturene forekom med F2695. Signaturene som opptrådte ved lave og middels konsentrasjoner (5 innbefattet de 2 som forelå ved den lave konsentrasjonen) var blant de 5 som utgjorde en del av de 9 signaturene som ble påvist ved klomipramin ved lav dose, 1^M. Ved den høye konsentrasjonen, 100^M, var 10 av de 26 signaturene oppnådd med F2696 blant de 28 signaturene som ble påvist med klomipramin ved 50^M.

Fra et kvalitativt synspunkt, bør virkningen av F2696 og klomipramin på mitokondrielle transkripter, særlig på Coxl og cytokrom b, understrekes. Disse signaturene opptrer ikke med F2695 (posisjonene G05/G09/I01).

De følgende toksisitetsindeksene ble oppnådd:

Ifølge disse parameterne, ble følgende rangering oppnådd, fra den mest toksiske til den minst toksiske: C218 (klomipramin) > F2696 »»> F2695.

Når det gjelder over- og underutrykte kloner ved en faktor på 2, induserte F2695 ingen signaturer, selv ved en konsentrasjon på 100^M.

Konsentrasjonens virkning på forekomsten av signaturer ble bekreftet ut fra det faktum at de svake signaturene med F2696 ved 1^M, som opptrådte i den foregående analysen med induksjons faktor på 1,7, forsvinner.

Fra et kvalitativt synspunkt, ble virkningen av F2696 og klomipramin på Coxl og cytokrom b også bekreftet (posisjonene G05/G09/I01).

F2695, den farmakologiske aktive enantiomeren av F2207, var uten signifikant virkning i denne analysen, mens klomipramin anvendes som referanseprodukt og positiv kontroll.

F2696, den farmakologisk inaktive enantiomeren av F2207, viste derimot en signaturprofil som er kvantitativt og kvalitativt nær profilen til klomipramin, og viste ingen signaturer som var felles med F2695.

Alt dette viser en overlegen toksikogenomisk profil for den aktive F2695-enantiomeren som i denne eksperimentelle modellen hadde en svært signifikant bedre sikkerhetskoeffisient enn F2696.

4. 4 KONKLUSJON

De genomiske farmakotoksikologiske analysene som ble utført på molekylene F2695 og F2696, enantiomerer av F2207 (i konsentrasjoner på 10, 50 og 100^M) og på C218 (klomipramin i konsentrasjoner på 1, 10 og 50^M) ved anvendelse av rottehepatocytter i primær kultur, ga konsentrasjonsavhengige stressignaturer og toksisitetsindekser. Disse undersøkelsene bekrefter den genomiske farmakotoksikologiske analysens evne til å avsløre stressignaturer under behandlingsbetingelser (konsentrasjoner, behandlingens varighet) som ikke gir toksisitet i en klassisk celleoverlevelsesanalyse som for eksempel MTT-analysen.

Denne undersøkelsen bringer frem i lyset flere viktige fakta:

• i den primære rottehepatocyttmodellen var F2695, den farmakologisk aktive enantiomeren av F2207, den eneste forbindelsen som ikke induserte en signifikant toksisitetsindeks; • F2696, den inaktive enantiomeren av F2207 og klomipramin, det psykotropiske referanseproduktet, induserte markante indekser som omfattet svært like eller felles stressignaturer. I dette systemet induserte klomipramin, det positive kontrollreferansemolekylet, det høyeste antallet stressignaturer, og signifikante indekser ble observert ved den laveste konsentrasjonen. I denne forbindelse er det av interesse å bemerke at klomipramin kan indusere et visst antall uønskede bivirkninger hos mennesker, for eksempel tachykardi, ortostatisk hypotensjon, hjertekonduksjon eller rytmeforstyrrelser og fortrinnsvis hepatitt. Når det gjelder utilsiktet overdosering med klomipramin, kan synkope, hematologiske forstyrrelser og alvorlige kardiovaskulære manifestasjoner observeres.

Uten å antyde en felles fysiopatologisk mekanisme, er det av interesse å bemerke at F2696 viste svært like eller felles stressignaturer med signaturene til klomipramin og at denne forbindelsen også induserer uheldige bivirkninger som for eksempel de kardiovaskulære forstyrrelsene som er beskrevet tidligere.

Det er således legitimt å antyde at de observerte signaturene er uavhengige av en gitt antidepressiv eller psyko tropisk profil. Tvert imot bør signaturene faktisk betraktes som "stressignaturer" (F2696 gir spesielt redusert ekspresjon av et gen som deltar i proteinsyntese og av en translasjonsinitieringsfaktor). Alt dette viser en overlegen toksikogenomisk profil for den aktive F2695-enantiomeren, som i denne eksperimentelle modellen hadde svært signifikant bedre sikkerhetskoeffisient enn F2696.

Claims (14)

1. Anvendelse av (1S,2R) enantiomeren av milnacipran (Z(+)-2-(aminometyl)-N,N-dietyl-l-fenylsyklopropankarbokdsmid), eller én av dens farmasøytisk akseptable salter, for fremstillingen av et medikament som er beregnet for behandlingen eller forebyggingen av depresjon, urininkontinens, generalisert angst, panikkanfall, fobi, tvangslidelser, adferdsforstyrrelser, utmattelse og medfølgende smertelidelser, smerte og medikamentavhengighet i pasienter valgt blant pasienter med lever- eller nyresvikt, pasienter som mottar behandling som medfører toksisitet i lever- eller nyreorgan og eller vev, pasienter som mottar behandling for en hjertesykdom, pasienter som mottar behandling som medfører kardiovaskulære bivirkninger, pasienter som har en sykdomshistorie med kardiovaskulær sykdom og/eller lider av kardiovaskulære forstyrrelser, samtidig som risikoen for kardiovaskulære forstyrrelser knyttet til administrasjonen av milnacipran i form av en racemisk blanding begrenses.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvori de kardiovaskulære forstyrrelsene tilsvarer økt blodtrykk og/eller forhøyet hjertefrekvens.

3. Anvendelse ifølge krav 2, hvori økte blodtrykket tilsvarer en økning av det diastoliske blodtrykket.

4. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 3, hvori risikoen for organ- og/eller vevstoksisitet også er begrenset.

5. Anvendelse ifølge krav 4, hvori organtoksisiteten er hjertetoksisitet og vevstoksisiteten er levertoksisitet og/eller nyretoksisitet.

6. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 5, hvori (lS,2R)-enantiomeren av milnacipran er hydrokloridet av Z-(lS,2R)-2-(aminometyl)-N,N-dietyl-l-fenylsyklopropankarboksamid (F2695).

7. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 6, for behandlingen eller forebyggingen av dyp depresjon, resistent depresjon, depresjon hos eldre, psykotisk depresjon, depresjon indusert ved behandling med interferon, en depressiv tilstand, manisk-depressivt syndrom, periodiske depressive episoder, depressive episoder forbundet med den generelle helsetilstanden, eller depressive episoder forbundet med humørendrende forbindelser.

8. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 6, for behandlingen eller forebyggingen av agorafobi, kronisk smerte, kronisk tretthetssyndrom, eller fibromyalgi.

9. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 6, for behandlingen eller forebyggingen av urininkontinens forbundet med stress og enurese.

10. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 6, for behandlingen eller forebyggingen av angstavhengighet av tobakk, alkohol, narkotiske midler, medikamenter og/eller analgetiske midler som anvendes ved avvenning fra disse avhengighetstilstandene.

11. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 10, hvori sykdomshistorien med kardiovaskulær sykdom og/eller kardiovaskulær lidelse er valgt blant myokardialt infarkt, hjerterytmeforstyrrelser (tachykardi, bradykardi, palpitasjoner), blodtrykkslidelser (hypo- eller hypertensive pasienter) og hjertesykdom.

12. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 11, hvori medikamentet omfatter: a) nevnte (lS,2R)-enantiomer av milnacipran eller én av dens farmasøytisk akseptable salter, og b) minst én aktiv forbindelse utvalgt fra psykotropiske midler, spesielt antidepressive midler og antimuskrainmidler, som assosierte produkter for anvendelse samtidig, separat eller forskjøvet i tid for behandlingen eller forebyggingen av depresjon, fortrinnsvis dyp depresjon, resistent depresjon, depresjons hos eldre, psykotisk depresjon, depresjon indusert ved behandling med interferon, depressive tilstander, manisk-depressivt syndrom, periodiske depressive episoder, depressive episoder forbundet med den generelle helsetilstanden og depressive episoder forbundet med humørendrende forbindelser.

13. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 11, hvori medikamentet omfatter: a) nevnte (lS,2R)-enantiomer av milnacipran eller én av dens farmasøytisk akseptable salter, og b) minst én annen aktiv forbindelse utvalgt blant de aktive forbindelsene som induserer organtoksisitet og aktive forbindelser som induserer celletoksisitet, fortrinnsvis i lever og/eller nyrer, som assosierte produkter for anvendelse samtidig, separat eller forskjøvet i tid for behandlingen eller forebyggingen av depresjon, urininkontinens, generalisert angst, utmattelse og medfølgende smertelidelser, smerte og medikamentavhengighet.

14. Anvendelse ifølge ethvert av kravene 1 til 11, hvori medikamentet omfatter: a) nevnte (lS,2R)-enantiomer av milnacipran eller én av dens farmasøytisk akseptable salter, og b) minst én annen aktiv forbindelse utvalgt blant aktive forbindelser som induserer kardiovaskulære bivirkninger, som assosierte produkter for anvendelse samtidig, separat eller forskjøvet i tid for behandlingen eller forebyggingen av depresjon, urininkontinens, generalisert angst, utmattelse og medfølgende smertelidelser, smerte og medikamentavhengighet.