JP5431136B2 - 薬剤を製造するためのミルナシプランの（１ｓ，２ｒ）エナンチオマーの使用 - Google Patents

Description

発明の背景

本発明は、ミルナシプラン（milnacipran）および／または少なくとも１つのその代謝産物のエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、空間配置（１Ｓ，２Ｒ）のエナンチオマー含量の高いエナンチオマー混合物、の使用であって、セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害によって治療可能な障害を、心血管障害ならびに／または器官および／もしくは組織毒性の危険性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用に関する。より詳しくは、本発明のエナンチオマー混合物は、鬱病、慢性疲労症候群および尿失禁を治療することを目的とするものである。

ミルナシプラン（Ｚ（±）−２−（アミノメチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１−フェニルシクロプロパンカルボキサミド）（PIERRE FABRE MEDICAMENT Research Centre(Castres, France)で合成された分子）は、ＴＮ−９１２、ダルシプラン、ミナルシプラン、ミダルシプランまたはミダリプランとも呼ばれ、セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害剤であることが知られている。ミルナシプランおよびその合成方法は、米国特許第４，４７８，８３６号に記載されている。ミルナシプランに関するその他の情報は、Merck Index，第１２版に、Ｎｏ．６２８１として記載されている。

セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害剤とは、セロトニンおよびノルアドレナリン両方の再取り込みを選択的に阻害する、よく知られている抗鬱薬群に相当する。一例として、ベンラファクシンおよびデュロキセチンもセロトニンおよびノルアドレナリンの二重阻害剤である。ミルナシプランによるノルアドレナリン再取り込み阻害とセロトニン再取り込み阻害との比率が約２：１であることが研究により示されている(Moret et al., 1985 Neuropharmacology 24(12): 1211-1219; Palmier et al., 1989, Eur J Clin Pharmacol 37: 235-238)。

米国特許第４，４７８，８３６号は、中枢神経系の障害、特に、鬱病の治療のためのミルナシプランの使用を記載している。特許出願ＷＯ０１／２６６２３は、疲労、痛みを伴う症候群、慢性疲労症候群、線維筋痛、および過敏性大腸症候群の治療などの適応における、フェニルアラニンおよびチロシンと組み合わせたミルナシプランの使用を記載している。特許出願ＷＯ０１／６２２３６は、鬱病をはじめとする多数の適応症における、ミルナシプランを１種類または数種類の抗ムスカリン作用薬と組み合わせて含有する組成物を記載している。出願ＷＯ９７／３５５７４は、鬱病およびその種々の形態、ならびに抗鬱薬が使用される障害を治療するために、同時に、別々に、あるいは時間をずらして使用する組合せ製品としての、ミルナシプランおよびイダゾキサンを含有する医薬組成物を記載している。ミルナシプランは尿失禁の治療にも使用される（ＦＲ２７５９２９０）。

ミルナシプラン分子は、２個の不斉炭素を有しており、これらにより２つの異なる空間配置（１Ｓ，２Ｒ）および（１Ｒ，２Ｓ）が存在している。これらの空間配置は重ね合わせることができないことから、ミルナシプラン分子には光学異性が存在する。

従って、塩酸ミルナシプランは、２つの光学活性エナンチオマー：右旋性エナンチオマー、すなわち、Ｚ−（１Ｓ，２Ｒ）−２−（アミノメチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１−フェニルシクロプロパンカルボキサミド塩酸塩および左旋性エナンチオマー、Ｚ−（１Ｒ，２Ｓ）−２−（アミノメチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１−フェニルシクロプロパンカルボキサミド塩酸塩として存在する。ミルナシプランの塩酸塩（別名Ｆ２２０７）は、現在、セロトニン作動性ノルアドレナリン作動性抗鬱薬として、ラセミ混合物形態で市販されている(IXEL, PIERRE FABRE MEDICAMENT, France)。Ｆ２６９５およびＦ２６９６はそれぞれ、塩酸ミルナシプラン（Ｆ２２０７）の右旋性（１Ｓ，２Ｒ）および左旋性（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーを示している：

これらの２つのエナンチオマーは、文献に記載されている手順を用いて分割し、単離することができる(Bonnaud et al., 1985, Journal of Chromatography, Vol. 318 : 398- 403 ; Shuto et al., Tetrahedron letters, 1996 Vol. 37 : 641-644 ; Grard et al., 2000,Electrophoresis 2000 21 : 3028-3034 ;Doyle and Hu, 2001, Advanced Synthesis and Catalysis, Vol. 343 : 299-302)。

本発明者らは、今般、エナンチオマー選択的アッセイ法を用いて、ラセミ化合物およびミルナシプランの２つのエナンチオマーについてのヒト薬物動態研究を行った。こうして、彼らは、in vivoではエナンチオマーのラセミ化が起こらないことを立証した。

さらに、ラセミ化合物を分割したが、２つのエナンチオマーの薬理学的特性および毒物学的特性の解析を、遠隔測定法による心血管測定、またはin vitroにおける予測薬理毒物学についてのゲノム解析などの現在利用可能な最新の方法を用いて行わなかった。

どんな活性物質でもそうであるが、抗鬱薬はこれらの薬剤の薬理学的特性、ならびに投薬量、患者の個体差（遺伝子多型、器官機能不全、性、年齢）または薬物相互作用に本質的に由来する有害事象または特定の毒作用を引き起こす可能性がある。よって、抗鬱薬は、中毒の原因として、催眠薬および精神安定薬に続いて３番目に多い製品群である(Nores et al., 1987 Therapie 42: 555-558)。抗鬱薬を過剰投与する危険性は、死に至ることもあるため、深刻である。抗鬱薬による急性中毒の原因では、子供の誤飲（特定の抗鬱薬が遺尿症の治療に用いられることからもそう言える）、自殺行為、医師による過量投与事故、高齢患者における薬の併用、年齢に伴う生理学的変化および薬物動態変化（心不全、肝および／または腎不全など）ならびに代謝の衰え（本来遺伝的なものであるか、薬物によるものかには関わらない）（酵素阻害）が挙げられよう。従って、治療される患者の中では、子供に続いて、高齢者が２番目に潜在的に危険な状態にある集団である。高齢者は腎および／または肝クリアランスの低下に関連して血漿濃度が高く、中毒の危険性がより深刻なものとなる(Meadoer-Woodruff et al., 1988 J. Clim. Psychopharmacol. 8: 28-32)。

ミルナシプランでの治療期間中に観察された副作用（一般には良性である）は、通常、治療の最初の１週間または最初の２週間以内に起こり、その後、鬱症状の改善とともに減少する。単一薬物療法においてまたは他の向精神薬との併用において最も報告の多い有害事象は、めまい、過剰発汗、不安、顔面紅潮および排尿障害である。それほど報告は多くはない有害事象であるが、悪心、嘔吐、口渇、便秘、振戦、心悸亢進、心的動揺および皮膚発疹もある。さらに、心血管疾患の病歴のある患者または心臓病の治療を同時に受けている患者では、ミルナシプランにより心血管有害事象（高血圧症、低血圧症、起立性低血圧症、心悸亢進）の発生率が増加し得ることが分かっている。ラセミ混合物のミルナシプランは心拍数を高める可能性が高いため、高血圧である患者または心臓病を有する患者では、それゆえ、医学的な監督指導を強化することが推奨される。単一薬物療法においてミルナシプランを用いて観察される過剰投与（８００ｍｇ〜１ｇの用量にて）のまれなケースでは、観察される主な症状が嘔吐、呼吸障害および頻脈であることもある(The Vidal Dictionary 78th edition, 2002)。ミルナシプランによって時折生じるもう１つの有害事象として、肝毒性を反映するトランスアミナーゼ値の上昇がある。

ミルナシプランによる治療期間中または治療後に一定数の有害な臨床症状を発現する可能性がある、潜在的に危険な状態にある集団が、子供、高齢者、肝および／または腎不全を有する患者、器官および／または組織毒性、特に、肝および／または腎毒性を引き起こす治療を受けている患者、心臓病の治療または心血管副作用を引き起こす治療を受けている患者、心血管疾患の病歴のある患者および／または、特に、心調律異常、血圧異常（低血圧または高血圧患者）に関する心血管障害を有する患者ならびに心臓病に罹患している患者である。

本発明者らは、小さなものであるが、ミルナシプランにより治療される患者の健康にとって危険である、起こり得る副作用の発生をいっそう高い程度で予防しようと努め、そこで、セロトニンおよびノルアドレナリン再取り込みの選択的阻害活性に本質的に関与するミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーでは、驚くべきことに、そして予想外にも、そのラセミ混合物よりも生じる心血管状態の副作用が少なく、器官および／または組織毒性、特に、肝毒性も低いことを発見した。特に、本発明者らは、イヌにおいて、ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーの投与によって起こる心拍数および血圧、特に、弛緩期血圧の上昇がラセミ混合物の投与によって起こり得るものよりも少ないことを見出した。さらに、本発明者らは、ラット一次肝細胞を用いた実験モデルにおいて、塩酸ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー（Ｆ２６９５）が塩酸ミルナシプランの（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマー（Ｆ２６９６）よりも優れたゲノム毒性プロフィールを有していることを発見した。本発明者らはまた、（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマー（Ｆ２６９６）が、その相対肝毒性で知られる、向精神薬参照製品として使用されるクロミプラミンで得られるゲノム毒性プロフィールに類似したプロフィールを有していることも立証した。

したがって、本発明の対象は、ミルナシプランのエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高い混合物、好ましくは、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの使用であって、セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）取り込みの二重阻害によって治療可能な障害または症状を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／または器官および／もしくは組織毒性の危険性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用である。

発明の具体的説明

「心血管障害」(cardiovascular disturbance)とは、単独でまたは他の活性物質と組み合わせて投与される薬剤の有害な心血管副作用を指す語であると理解される。

本発明において、「副作用」とは、薬剤を投与する領域以外の領域における薬剤の予測可能な活性であり、それが薬剤の使用を制限する場合には厄介であるかまたは望ましくない活性を意味する語であると理解される。

「毒性」とは、器官または組織、特に、ミルナシプランの代謝に関与する器官または組織、特に、ミルナシプランの肝臓および／または腎臓代謝に対して、より詳しくは、肝臓におけるミルナシプランの初回通過時に、有害な影響を及ぼす薬剤の特性を意味する語であると理解される。優先的には、器官毒性が心毒性であり、かつ、前記組織毒性が肝および／または腎毒性である。

本発明において、「心血管障害の危険性を制限しながら」または「毒性の危険性を制限しながら」とは、薬剤の投与後に患者においてこれらの危険性が有意に高まらないようにするという事実を意味する句であると理解される。

本発明において、「ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー」とは、ミルナシプラン、ならびにその薬学上許容される塩の（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーを示す語である。優先的には、これが塩酸ミルナシプラン（Ｆ２６９５）の（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーである。「ミルナシプランの（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマー」とは、ミルナシプラン、ならびにその薬学上許容される塩、例えば、塩酸塩（Ｆ２６９６）の（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーを示す。「ラセミ混合物」とは、ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーとミルナシプランの（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーの重量５０：５０混合物、ならびにそれらの薬学上許容される塩の（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーと（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーの重量５０：５０混合物を示す。

本発明において、「（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いミルナシプランのエナンチオマー混合物」とは、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー対（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーの質量／質量比が１：１より大きい、ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーと（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーとの混合物を意味する。（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いミルナシプランのエナンチオマー混合物において、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー対（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーの質量／質量比は、有利には、５５：４５以上、より有利には、６０：４０より大きく、さらに有利には、６５：３５より大きく、さらに有利には、７０：３０より大きく、さらに有利には、７５：２５より大きく、さらに有利には、８０：２０より大きい。特に有利なモードで作製された、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー対（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーの質量／質量比は、８２：１８より大きく、より有利には、８４：１６より大きく、さらに有利には、８６：１４より大きく、さらに有利には、８８：１２より大きく、さらに有利には、９０：１０より大きい。好ましいモードで作製された、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー対（１Ｒ，２Ｓ）エナンチオマーの質量／質量比は、９１：９より大きく、より好ましくは、９２：８より大きく、さらに好ましくは、９３：７より大きく、さらに好ましくは、９４：６より大きく、さらに好ましくは、９５：５より大きく、さらに好ましくは、９６：４より大きく、さらに好ましくは、９７：３より大きく、さらに好ましくは、９８：２より大きく、さらに好ましくは、９９：１より大きく、さらに好ましくは、９９．５：０．５より大きい。（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いミルナシプランのエナンチオマー混合物が実質的に純粋である、すなわち、およそ１００重量％（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーを含有するものであることが特に好ましい。

代謝産物の使用もまた、本発明の範囲に入り、優先的には、in vivoにて活性のあるミルナシプランの代謝産物、およびそれらの薬学上許容される塩の使用が含まれる、例えば：
Ｚ−（±）フェニル−１−アミノメチル−２−シクロプロパン−カルボン酸の塩酸塩（Ｆ１５６７）：

分子量：２７７．７
特徴：白色結晶
融点：２３０℃
プレートクロマトグラフィー：媒体：シリカ
溶媒：ブタノール/エタノール/水（６/２/２）
顕色剤：紫外線およびニンヒドリン
Ｒｆ：０．６
（±）フェニル−３ メチレン−３−４ ピロリドン−３（Ｆ１６１２）：

分子量：１７３．２
特徴：白色結晶
融点：７０℃
プレートクロマトグラフィー：媒体：シリカ
溶媒：ベンゼン/ジオキサン/エタノール（９０/２５/４）
顕色剤：紫外線およびヨウ素
Ｒｆ：０．４６
Ｚ（±）−（パラ−ヒドロキシフェニル）−１−ジエチルアミノカルボニル−１−アミノメチル−２−シクロプロパンの塩酸塩（Ｆ２７８２）：

分子量：２９８．８２
特徴：白色結晶
融点：２５０℃
プレートクロマトグラフィー：媒体：シリカ
溶媒：ブタノール/エタノール/水（６/２/２）
顕色剤：紫外線およびヨウ素−ニンヒドリン
Ｒｆ：０．４２
Ｚ（±）−フェニル−１−エチルアミノカルボニル−１−アミノメチル−２−シクロプロパンのシュウ酸塩（Ｆ２８００）：

分子量：３０８．３３
特徴：白色結晶
融点：１５０℃
プレートクロマトグラフィー：媒体：シリカ
溶媒：ＣＨＣｌ_３/メタノール/ＮＨ_４ＯＨ（９０/９/１）
顕色剤：紫外線およびニンヒドリン
Ｒｆ：０．４０
Ｚ（±）−フェニル−１−アミノカルボニル−１−アミノメチル−２−シクロプロパンの塩酸塩（Ｆ２９４１）

分子量：２２６．７４
特徴：白色結晶
融点：２４５℃
プレートクロマトグラフィー：媒体：シリカ
溶媒：ＣＨＣｌ_３/メタノール/ＮＨ_４ＯＨ（８０/１８/２）
顕色剤：紫外線およびニンヒドリン
Ｒｆ：０．３０

これらの代謝産物は、ミルナシプランがそうであるとおり、２個の不斉炭素を有しており、これらにより２つの異なる空間配置（１Ｓ，２Ｒ）および（１Ｒ，２Ｓ）が存在している。これらの空間配置は重ね合わせることができないことから、これらの代謝産物にも光学異性が存在する。エナンチオマー混合物におけるミルナシプラン代謝産物の２つのエナンチオマーの割合は、ミルナシプランのエナンチオマーに関して以上で記載したとおりである。

よって、本発明は、鬱病、疼痛、線維筋痛および尿失禁などの本願にて記載した障害の治療における薬剤としてのそれらの使用に加えて、これらの活性代謝産物、それらのエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩も包含する。本発明の代謝産物は、ラセミ化合物形態であるか、または、優先的には、最も活性の高い（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いエナンチオマー混合物形態である。好ましくは、使用される活性代謝産物はＦ２６９５エナンチオマー由来のものであり、活性代謝産物の（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーである。より好ましくは、これがＺ−（パラ−ヒドロキシフェニル）−１−ジエチルアミノカルボニル−１−アミノメチル−２−シクロプロパン（Ｆ２７８２）の（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーの塩酸塩である。「活性代謝産物」とは、in vitroまたはin vivoでのミルナシプランの代謝によって生じる、セロトニンおよびノルアドレナリンの再取り込みを阻害する能力を有する誘導体を示す語であると理解される；優先的には、これらがＦ２７８２、Ｆ２９４１、Ｆ２８００、Ｆ１６１２およびＦ１５６７である。

よって、本発明の対象は、ミルナシプランの少なくとも１つの代謝産物のエナンチオマー（優先的には、Ｆ２７８２、Ｆ２９４１、Ｆ２８００、Ｆ１６１２およびＦ１５６７の中から選択される）、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、優先的には（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いエナンチオマー混合物、の使用であって、セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害によって治療可能な障害または症状を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／または器官および／もしくは組織毒性、特に、心、肝および／もしくは腎毒性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用である。

（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いミルナシプランのエナンチオマー（優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマー）および、優先的には、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高い少なくとも１つのその代謝産物（好ましくは、Ｆ２７８２、Ｆ２９４１、Ｆ２８００、Ｆ１６１２およびＦ１５６７の中から選択される）のエナンチオマーの混合物の使用であって、セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害によって治療可能な障害または症状を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／または器官および／もしくは組織毒性、特に、心、肝および腎毒性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用もまた、本発明の範囲に入る。

「薬学上許容される塩」とは、活性物質の有効性および特性を保持し、かつ、副作用を引き起こさない全ての塩を示す。優先的には、これらが無機酸または有機酸の薬学上許容される塩である。一例として、これらに限定されるものではないが、塩酸塩および臭素水和物などのハロゲン水和物、フマル酸塩、マレイン酸塩、シュウ酸塩、クエン酸塩、メタンスルホン酸塩、グルタミン酸塩、酒石酸塩、メシル酸塩、ならびにそれらの水和物が挙げられる。

本発明において、「エナンチオマー混合物」とは、ミルナシプランのエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高い混合物および／またはミルナシプランの少なくとも１つの代謝産物のエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、優先的には、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高い混合物を意味する語である。

本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーは、治療および／または予防目的に関わらず、このような治療を必要としているあらゆるタイプの患者に投与される。治療目的では、その目標は治療すべき症状および／または１以上の関連した症状を根絶することまたは改善することである。予防目的では、その目標は治療すべき症状および／または１以上の関連した症状の発現を予防することである。それにもかかわらず、本発明のエナンチオマー混合物は、ラセミ体ミルナシプランによる治療期間中または治療後に特定の有害な臨床症状を発現する可能性のある、潜在的に危険な状態にある患者集団に特に適応する。これらの集団は、主として、子供、高齢者、肝および／または腎不全を有する患者、肝臓および／もしくは腎臓ならびに／または組織毒性を引き起こす治療を受けている患者、心臓病の治療を受けている患者、心血管副作用を引き起こす治療を受けている患者、心血管疾患（例えば、心筋梗塞）の病歴のある患者および／または心血管障害を有する患者、例えば、心調律異常（頻脈、徐脈、心悸亢進）のある患者、血圧異常のある患者（低血圧または高血圧患者）もしくは心臓病に罹患している患者である。

それらの症状として心調律異常があり、それらに罹患している潜在的に危険な状態にある患者の治療において本発明が特にうまく適応する数多くの障害または症状のうち、心拍リズムの加速に相当する頻脈（心拍数が１分間当たり８０〜１００回である場合、頻脈は中等度であり、それが１００回を超える場合は重度である）、心悸亢進、期外収縮（散発性、頻発性または心筋梗塞中）、心房細動、粗動および心房急速収縮、徐脈、心不全、ならびに心筋梗塞が挙げられる。

それらの症状として血圧異常があり、それらに罹患している潜在的に危険な状態にある患者の治療において本発明が特にうまく適応する数多くの障害または症状のうち、動脈性高血圧症、悪性動脈性高血圧症、肺動脈性高血圧症、門脈圧亢進症、発作性本態性高血圧症、低血圧症、起立性低血圧症および頭蓋内圧亢進症が挙げられる。

有利には、本発明のエナンチオマー混合物の投与によって、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの投与によってその危険性が制限される心血管障害は以下のとおりである：

− 弛緩期および／または収縮期血圧の上昇（水銀ミリメートル（ｍｍＨｇ）で測定）；より詳しくは、これが弛緩期血圧の上昇である、および／または、
− 心調律異常、特に、患者の心拍数の上昇。

収縮期血圧は血圧の最大値であり、血圧測定時に上腕動脈で最初の心音が聞こえたときの瞬間に相当する。収縮期は、心腔が収縮して血液を送り出す心臓周期の期間である。弛緩期血圧は血圧の最小値であり、血圧測定時に血圧計の加圧帯をすぼませるときに上腕動脈で心音が聞こえなくなることに相当する。拡張期は、心腔に血液が満たされる心臓周期の期間である。収縮期および／または弛緩期血圧の上昇は、全身動脈性高血圧症（およびその異型）の特徴である血圧の上昇を意味する、全身動脈性高血圧症の症状としては以下がある：頭痛、疲労、軽度の感覚障害（例えば、めまい、耳鳴り、心悸亢進、鼻血、錯乱もしくは傾眠）、痙攣、しびれまたは手足の刺痛。全身動脈性高血圧症（およびその異型）は、重度の、実際には致命的な合併症：脳血管障害、左心室不全、腎不全、虚血性心疾患（心筋梗塞、苦悶およびそれらの異型）を引き起こす可能性がある。現行の指針によれば、患者の弛緩期血圧が９０ｍｍＨｇを超えており、かつその患者の収縮期血圧が１４０ｍｍＨｇを超えている場合、その患者は動脈性高血圧症を有していると考えられる。

本発明のエナンチオマー混合物の投与によってその危険性が制限される毒性は、有利には、器官毒性、特に、心毒性、ならびに／または組織毒性、特に、肝および／または腎毒性である。組織毒性は、黄疸の出現によるか、または実験マーカーによって分かる。

動物、特に、このような治療を必要とする家庭のペット類または繁殖動物の治療用獣医薬における本発明のエナンチオマー混合物の使用もまた本発明の範囲に入る。

エナンチオマー混合物は、特に、セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害剤としてのそれらの薬理学的特性から、後述する多くの障害および症状（症候群）を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／あるいは器官ならびに／または組織毒性、特に、心、肝および／もしくは腎毒性を制限しながら、予防的および／または治癒的治療を行うことを目的とする薬剤の製造において特に有用である。

これらの障害または症状のうち、"The Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders-IV (DSM-IV), 1995 American Psychiatric Association"にて定義されているように、中枢神経系の障害が挙げられる。一例として、これらに限定されるものではないが、以下の障害および症状が挙げられる：
鬱病、特に、深い抑鬱状態、難治性鬱病、高齢者の鬱病、心因性鬱病、インターフェロン治療により誘発される鬱病、抑鬱状態、躁鬱症候群、季節性鬱症状、全般的な健康状態に関連する鬱症状、向精神薬に関連する鬱症状、双極性障害、精神分裂症、全般性不安、不機嫌および衰弱状態、ストレス関連疾患、パニック発作、恐怖症、特に、広場恐怖症、強迫性障害、行動障害、反抗性障害、心的外傷後ストレス障害、免疫系の低下、疲労および随伴疼痛症候群、慢性疲労症候群、線維筋痛、ならびにその他の身体機能障害、自閉症、全般的な健康状態による注意欠陥障害、注意欠陥多動障害、摂食障害、神経性過食症、神経性食欲不振、肥満、精神病性障害、アパシー、片頭痛、疼痛、特に、慢性疼痛、過敏性大腸症候群、心血管疾患、特に、心筋梗塞または高血圧症における不安性抑鬱症候群、神経変性疾患および関連不安性抑鬱症候群（アルツハイマー病、ハンチントン舞踏病、パーキンソン病）、尿失禁、特に、ストレスおよび遺尿に関連する尿失禁、薬物嗜癖、特に、タバコ（特に、ニコチン）、アルコール、麻薬、薬物、これらの中毒状態から脱するのに使用される鎮痛薬への不安性依存症。

より詳しくは、本発明の対象は、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの使用であって、鬱病または抑鬱状態を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／あるいは器官ならびに／または組織毒性、特に、肝および／もしくは腎毒性を制限しながら、治療または予防することを目的とする薬剤を製造するための使用に関する。本発明において、「鬱病」とは、一方では、悲観、苦悶感、希死または自殺観念、精神的抑圧などの気分障害からなる心理学的側面を、もう一方では、運動の欠如、特に、運動活動の低下、食欲障害、便秘、睡眠障害および体重管理障害からなる身体的側面を有する一連の症状を指す語であると理解される。それゆえ、鬱病は、苦しい気分の変容と精神および運動活動の減少とが組み合わさった病理的精神状態と言える。「抑鬱状態」とは、倦怠感、疲労傾向、落胆および不安を伴うこともある悲観傾向として発現する神経心理学的緊張の低下を特徴とする精神状態を指す語であると理解される。

さらに、本発明の対象は、より詳しくは、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの使用であって、線維筋痛および／または慢性疲労症候群を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／あるいは器官ならびに／または組織毒性、特に、肝および／もしくは腎毒性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用に関する。線維筋痛症候群は、主として、関節および関節周囲線維組織に影響を及ぼす朝のこわばりによる痛みおよび灼熱痛、ならびに深い疲労感を特徴とする慢性症候群である。線維筋痛は一連の症状を含む。最も多く見られる症状は、体力の回復がみられない睡眠、頭痛、消化障害、抑鬱状態、筋痙攣、顔面痛、しびれなどである。慢性疲労症候群は、疲労困憊または疲労状態を特徴とするものである。最も一般的な症状は、衰弱状態、痙攣および／または筋肉痛、過度の睡眠要求、発熱、アンギナ(angina)、記憶喪失および／または集中力の欠如、不眠症、鬱病である。

さらに、本発明の対象は、より詳しくは、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの使用であって、疼痛、特に、慢性疼痛を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／あるいは器官ならびに／または組織毒性、特に、肝および／もしくは腎毒性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用に関する。疼痛は種々の障害および／または創傷に関連する。それが急性の場合も慢性の場合もある。疫学研究により、慢性疼痛状態と不安および鬱病との関係が立証されている。このように、慢性疼痛に苦しんでいる患者は情緒障害を発現する可能性があり、鬱病を引き起こしたり、より悪い事例では自殺未遂を起こしたりする。患者が６ヶ月より長い期間苦しみを訴えている場合、その患者は慢性疼痛状態にあると考えられる。慢性疼痛の異型のうち、一例として、これらに限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：線維筋痛に伴い、および／または線維組織、筋肉、腱、靭帯およびその他の部位に生じる疼痛、過敏性大腸症候群における腹痛および下痢、ならびに腰痛。

さらに、本発明の対象は、より詳しくは、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの使用であって、尿失禁、特に、ストレスおよび遺尿に関連する尿失禁を、心血管障害の危険性を制限しながら、かつ／あるいは器官ならびに／または組織毒性、特に、肝および／もしくは腎毒性を制限しながら、予防または治療することを目的とする薬剤を製造するための使用に関する。

上記障害の予防上および治療上の処置は、動物、好ましくは、ヒトに、治療上有効な量の本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーを単独でまたは少なくとも１つの他の活性物質と組み合わせて投与することにより果たされる。これは、ほとんどの場合、ヒトに関するものであるが、その処置は、動物、特に、繁殖動物（家畜、齧歯類、家禽、魚など）および食用家畜（イヌ、ネコ、ウサギ、ウマなど）にも適応する。

ミルナシプランおよび／または少なくとも１つのその代謝産物のエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いエナンチオマー混合物は、これまでに記載したように、有利には、上記障害の治療において、少なくとも１つの他の活性化合物を受けている患者に、同時に、別々に、または時間をずらして投与される。

優先的には、本発明の対象は、薬剤として使用するために：
鬱病、特に、深い抑鬱状態、難治性鬱病、高齢者の鬱病、心因性鬱病、インターフェロン治療により誘発される鬱病、抑鬱状態、躁鬱症候群、季節性鬱症状、全般的な健康状態に関連する鬱症状、向精神薬に関連する鬱症状の治療または予防において、同時に、別々に、または時間をずらして使用する組合せ製品として、
ａ）ミルナシプランおよび／または少なくとも１つのその代謝産物のエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高いエナンチオマー混合物、ならびに
b）向精神薬、特に、抗鬱薬および抗ムスカリン作用薬の中から選択される少なくとも１つの活性化合物
も含む。

「向精神薬」とは、精神活動を変えることが可能であり、かつその作用が本質的に中枢神経系および精神状態に影響を及ぼす天然起源または人工起源の物質を示す語であると理解される。向精神薬は３つの群に分類される：１）精神安定薬（催眠薬、神経弛緩薬および抗不安薬）、２）精神刺激薬（抗鬱薬および精神強壮薬）ならびに３）精神異常発現薬（幻覚誘発薬）。

優先的には、前記向精神薬が抗鬱薬である。一例として、これらに限定されるものではないが、抗鬱薬は、（ｉ）イプロニアジド、パルギリン、セレギンなどのモノアミンオキシダーゼ阻害薬（ＭＡＯＩ）、（ii）スマトリプタン、アドレナリンおよびノルアドレナリン（αおよびβ交感神経刺激薬）などの５ＨＴ１Ｄ−作動薬、（iii）イミプラミン、クロミプラミンなどの三環系抗鬱薬、（iv）フルオキセチンなどの選択的セロトニン再取り込み阻害薬（ＳＳＲＩ）、（ｖ）例えば、タンダミン、フルパロキサン、ミルタザピンなどの選択的ノルアドレナリン再取り込み阻害薬（vi）ベンラファクシンおよびデュロキセチンなどのセロトニンノルアドレナリン再取り込み阻害薬の中から選択される。一例として、これらに限定されるものではないが、抗ムスカリン作用薬はトルテロジン、プロピベリン、オキシブチニン、トロスピウム、ダリフェナシン、テミベリン、イプラトロピウムの中から選択される。

好ましくは、本発明の対象はまた、薬剤として使用するために：
セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害によって治療可能な症状または障害の治療または予防において、同時に、別々に、または時間をずらして使用する組合せ製品として、
ａ）ミルナシプランおよび／または少なくとも１つのその代謝産物のエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高い前記エナンチオマー混合物、ならびに
ｂ）器官毒性を引き起こす活性化合物、ならびに組織毒性、特に、肝および／または腎毒性を引き起こす活性化合物の中から選択される少なくとも１つの他の活性物質（あるいは肝または腎不全の治療を目的とする１以上の活性物質を含む）
も含む。

好ましくは、本発明の対象はまた、薬剤として使用するために：
セロトニン（５−ＨＴ）およびノルアドレナリン（ＮＡ）再取り込みの二重阻害によって治療可能な症状または障害の治療または予防において、同時に、別々に、または時間をずらして使用する組合せ製品として、
ａ）ミルナシプランおよび／または少なくとも１つのその代謝産物のエナンチオマー、ならびにそれらの薬学上許容される塩の、（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー含量の高い前記エナンチオマー混合物、ならびに
ｂ）心血管副作用を引き起こす活性化合物または心臓病を治療するために与えられる化合物の中から選択される少なくとも１つの他の活性物質
も含む。

有利には、起こる心血管副作用は以上で記載したものであり、より詳しくは、動脈性高血圧症、低血圧症、心調律異常（頻脈、徐脈、心悸亢進）である。

本発明の対象はまた、以上で記載した関連製品を含む医薬組成物も含む。

本発明においては、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーは、有利には、その方法に限定されるものではないが、経口経路、経鼻経路、経皮、直腸、腸または非経口経路を介して、筋肉、皮下または静脈注射により、以上で記載したとおり単独でまたは他の活性物質と組み合わせて投与される。

単独で投与する場合、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマー自体を投与してもよいし、あるいはエナンチオマーまたはそれらの薬学上許容される塩の前記混合物を１種類または数種類の媒質、薬学上許容される賦形剤および／もしくは希釈剤、特に、バイオアベイラビリティを高めるためのものと組み合わせたかまたは混合した医薬組成物として投与してもよい。

本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）Ｆ２６９５エナンチオマーを他の活性物質と組み合わせて投与する場合、前記混合物と他の活性物質を混合物として調剤してもよいし、あるいは個別に、同じまたは異なる形状に調剤してもよい。それらは同じまたは異なる経路を介して投与され得る。

本発明の医薬組成物は、当業者には周知の従来の方法により、賦形剤、補助剤、および、例えば、防腐剤、安定剤、湿潤剤または乳化剤などの添加剤をはじめとする１種類以上の生理学上許容される媒質を用いて調剤し得る。調剤方法は、所望の投与経路に応じて選択される。

注射による投与においては、有利には、水溶液、特に、ハンクス溶液、リンガー溶液または生理食塩水などの生理学上許容される緩衝溶液を使用する。経皮投与または経粘膜投与においては、有利には、粘膜を通過させるのに適した浸透剤を使用する。このような浸透剤は、当業者にはよく知られている。経口投与においては、有利には、本発明の医薬組成物を当業者には公知の好適な医薬媒質を含有する混合物として単回投与または複数回投与様式で投与する。好適な単回投与様式としては、特に、錠剤、場合によって、分割錠、カプセル剤、散剤、顆粒剤、経口液剤または懸濁液剤、およびエアゾール剤が挙げられる。好適な複数回投与様式としては、特に、内服滴剤、エマルション剤およびシロップ剤が挙げられる。

錠剤の調製において、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーを、薬学上許容されるビヒクル、例えば、特に、ポリビニルピロリドン、カルボポールガル、ポリエチレングリコール、ゼラチン、タルク、デンプン、ラクトース、ステアリン酸マグネシウム、アラビアガムまたはそれらの類似物とともに調剤する。一例として、錠剤は以下の賦形剤：リン酸水素カルシウム二水和物、カルメロースカルシウム、ポビドンＫ３０、無水コロイド状二酸化ケイ素、ステアリン酸マグネシウム、タルクを含有している。錠剤をさらに、嚥下または保存を容易にするために、コーティングしてもよい、すなわち、サッカロースなどの種々の物質の層で被覆してもよい。コーティング剤はさらに、錠剤を、例えば、それらの用量強度に関して識別し、特徴付けるために、色素または着色剤も含有していてもよい。錠剤はまた、活性物質の放出速度を変えることを目的とした、程度の差はあるが、複合した製剤として与えてもよい。前記錠剤の活性物質の放出は、所望の吸収に応じて、迅速、持続または遅延放出である。よって、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーは、特許ＥＰ９３９６２６で記載されている方法に従って得られる持続放出用医薬製剤に調製し得る。この医薬製剤は、多数の小型顆粒を含有する多粒子形態で与えられ、in vitroにて特定の放出プロフィールを有する。

本発明のエナンチオマー混合物の放出は、インプラントを使用することによるか、または経皮送達、特に、皮下もしくは筋肉内送達により（筋肉注射によるか、あるいは経皮パッチにより）遅延させ、および／または制御し得る。そのため、前記混合物を、特に、好適な疎水性または高分子物質およびイオン交換樹脂を用いて調剤する。

患者に投与する本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーの量は、治療すべき症状、所望効果、特に、治療または予防効果、患者の健康状態および年齢、特に、患者の心血管疾患の病歴、治療状況ならびに薬剤の投与方法に応じて異なる。ヒト患者における有効な治療的または予防的使用のために投与されるべき量は、ヒトにおける鬱病の治療期間中に、例えば、ミルナシプランのラセミ混合物を用いて得られる当業者には公知の動物モデルまたはデータに基づいて決定される。

上記の障害、特に、鬱病、抑鬱状態、線維筋痛、慢性疲労症候群、疼痛の治療的および／または予防的処置においては、本発明の薬剤を、有利には、１回以上の摂取により１日当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重用量で、より有利には、１回以上の摂取により１日当たり０．０５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重用量で、さらに有利には、１回以上の摂取により１日当たり０．１ｍｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重用量で投与する。特に有利には、前記医薬品の上記で定義したような用量での投与を、１日２回の、優先的には、カプセル剤での服用にする。一例として、本発明のエナンチオマー混合物、優先的には、実質的に純粋なＦ２６９５エナンチオマーは、有利には、１カプセル当たり約６．７５ｍｇの活性物質、１２．５ｍｇ／カプセル、２５ｍｇ／カプセル、５０ｍｇ／カプセルを含有するカプセル剤として投与する。

本発明のその他の特徴、目的および利点は次の実施例で明らかになるであろう。本発明はこれらの特定の実施例に限定されるものではなく、これらの実施例は一例として示したものであり、以下の図面と比較しながら読む必要がある：

実施例１：ミルナシプランおよびそのエナンチオマーについての薬物動態研究
塩酸ミルナシプラン（Ｆ２２０７）およびそのエナンチオマー（Ｆ２６９５およびＦ２６９６）についての薬物動態研究を、種々の動物種およびヒトで行った。
動物において、ラセミ化合物の投与後または単一エナンチオマーの投与後に各エナンチオマーの薬物動態を調査した。Ｆ２６９５およびＦ２６９６エナンチオマーの血漿濃度は調べた動物種(サルおよびラット)においてはほぼ同じである。

ヒトにおける薬物動態研究は、１２人の健康な被験体で、ラセミ化合物または２つのエナンチオマーのうち一方だけを投与することにより行った。各エナンチオマーの薬物動態プロフィールは、別々に投与するか、ラセミ化合物として投与するかには関係ないことが示され、エナンチオマー間には相互作用がないことが示唆された（表１）。

これらの結果は、調べた種において、Ｆ２６９５またはＦ２６９６エナンチオマーの生体内変換が検出されなかったことを示している。

実施例２：ミルナシプランおよびそのエナンチオマーについての生化学研究
塩酸ミルナシプラン（Ｆ２２０７）の２つのエナンチオマー（Ｆ２６９５およびＦ２６９６）を、ラット脳におけるノルアドレナリンおよびセロトニンの取り込み、ならびにパロキセチン（paroxetine）結合についてin vitroにて調査した。

２．１．材料および方法
２．１．１．ラット視床下部のホモジネート（Ｐ _２ ）によるノルアドレナリン取り込み
Ｐ２の調製
２００〜３００ｇの雄Sprague-Dawleyラットを気絶させ、断頭し、視床下部を手早く摘出した。２つの視床下部を４ｍｌのスクロース０．３２Ｍ中、Potter Sにて、８００ｒｐｍで１６回往復することでホモジナイズした後、１０００ｇにて１０分間遠心分離し、細胞残屑を除去する。上清を１００００ｇにて２０分間遠心分離し、このようにして得られたＰ_２を４ｍｌのスクロース０．３２Ｍ中に回収し、Dounceにてホモジナイズする。

取り込み
^３Ｈ−（１）−ＮＡ：１３Ｃｉ／ｍｍｏｌ(Amersham)を使用する。
使用する３０分前にＯ_２／ＣＯ_２（９５％／５％）の混合物で事前酸素処理したリン酸バッファー（１リットル当たり８ｇのＮａＣｌ、１．２１ｇのＫ_２ＨＰＯ_４および０．３４ｇのＫＨ_２ＰＯ_４を含有）中に取り込みを行う。

３７℃の水浴に入れた５ｍｌプラスチック試験管内に以下のものを導入する：
１００μｌのバッファーまたは阻害剤、
７００μｌのバッファー（２５μＭのパルギリン含有）、
１００μｌのＰ_２。
温度が平衡状態に達したら、１００μｌの^３Ｈ−ＮＡ、最終濃度５０ｎＭの添加により反応を開始する。

正確に１０分後、２．５ｍｌの冷却バッファーを添加し、ＧＦ／Ｆフィルターで濾過することにより反応を停止させる。その後、試験管を２．５ｍｌの冷却バッファーで１回すすぎ、フィルターを１回すすぐ。次いで、そのフィルターをBeckmanミニバイアルに導入し、３ｍｌのInstagel(Packard)液体シンチレーターを添加した後、Tricarb Packard液体シンチレーションカウンターで放射能を測定する。

非特異的な取り込み（NS）をＤＭＩ１０^−５Ｍの存在として測定する。
阻害率は、式：
｛(全取り込み−NS)−(阻害剤の存在下での取り込み−NS)｝／(全取り込み−NS)
を用いて算出する。
ＩＣ_５０は、阻害剤濃度の対数に対する阻害率の平均曲線（４回のアッセイ）のグラフから決定する。

２．１．２．セロトニン取り込み
方法は、Gray and Whittaker(1962, J. Anat., 96: 79-97)のものに従って構築した。脳組織をスクロース溶液中でホモジナイズした後には、シナプス前末端は軸索から分かれ、閉鎖し、細胞下分画により得られるシナプトソームを形成している。

重量１８０〜２００ｇの雄Sprague-Dawley(Janvier)ラットを使用した。動物を犠牲にした後、視床下部を摘出し、重量を測り、０．３２Ｍスクロース中、Dounceにて０℃でホモジナイズした。

このホモジネートを１０００ｇにて１０分間遠心分離した（２４００ｒｐｍ−Hettich, Rotenta）。上清を回収し、１００００ｇにて２０分間遠心分離した（８０００ｒｐｍ−Beckam, 型Ｊ２−２１ Ｍ：ローター Ｊ１４）。残渣（Ｐ_２画分と呼ぶ）をスクロース中、濃度５０ｍｇ／ｍｌに回収した。

以下のものを３７℃にて５分間インキュベートした：
・ ３５０μｌの３０分前に事前酸素処理した冷却バッファー（ＮａＣｌ １３６ｍＭ、ＫＨ_２ＰＯ_４ ２．４ｍＭ、Ｋ_２ＨＰＯ_４ ６．９ｍＭ、ｐＨ ７．２）、
・ ５０μｌの膜（最終的には５ｍｇ／ｍｌ）、
・ 非特異的な取り込み用の５０μｌのシタロプラム（最終的には１０^−５Ｍ）、
・ ５０μｌの^３Ｈ−５−ＨＴ（最終的には５０ｎＭ）（NEN, France, ２８．４Ｃｉ／ｍｍｏｌ）。

インキュベーションを開始して正確に５分後、（２．５ｍｌの冷却バッファーで希釈調製した後、３回２．５ｍｌですすいだ）Whatman ＧＦ／Ｆフィルターでの真空濾過により反応を停止させた。
フィルターで収集した放射能を、Emulsifier-Safe(Packard)を用いる液体シンチレーションにより測定した(Packard Tricarb 4640)。
ＩＣ_５０は、阻害率を製品濃度の対数に対するグラフに置き換えて決定した（６濃度２試験）。

２．１．３．パロキセチン結合
重量１８０〜２００ｇの雄Sprague-Dawleyラット(Janvier)を使用した。数匹のラットの視床下部を集め、５ｍｌの冷却バッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、１２０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、ｐＨ ７．５）中、Dounceにてホモジナイズし、そのホモジネートを３００００ｇにて１０分間遠心分離した（２７０００ｒｐｍ−Beckman. Ｌ５−５０Ｅ、ローター Ｔ４０）。得られた残渣を５ｍｌのバッファー中に回収し、同じ条件下で再び遠心分離した。新しい残渣を同じバッファー中に回収し、最後に、Dounceにて組織濃度１０ｍｇ／ｍｌに再びホモジナイズした。膜懸濁液（１００μｌ）を濃度(最終)０．１ｎＭの３Ｈ−パロキセチン（NEN, France, ２８．６Ｃｉ／ｍｍｏｌ）とともにに、最終量１ｍｌ中、２０℃にて２時間インキュベートした。インキュベーションの２時間後、３０分前に０．０５％ポリエチレンイミン溶液で前処理した（４ｍｌの冷却バッファーで希釈調製した後、その試験管を２回４ｍｌですすいだ）Whatman ＧＦ／Ｆフィルターでの真空濾過により反応を停止させた。放射能を、シンチレーション液としてEmulsifier-Safe(Packard)を用いる液体シンチレーション分光測定(Packard、Tricarb 4640)により測定した。

特異的^３Ｈ−パロキセチン結合を、全結合と１０μＭのフルオキセチンの存在下で残存するものの相違として定義した。
ＩＣ_５０は、阻害率を製品濃度の対数に対するグラフに置き換えて決定した（６濃度２試験）。

２．１．４．使用製品
Ｆ２２０７：バッチ番号１０−ＣＴＮ３ Ｋｅｙ Ｐ１１８
Ｆ２６９５：バッチ番号ＰＬ−Ｉ−２０５
Ｆ２６９６：バッチ番号ＰＬ−Ｉ−２０４Ｃ。

２．２．結果
Ｆ２２０７およびその２つのエナンチオマーのノルアドレナリンおよびセロトニン取り込みならびにパロキセチン結合への影響を、Ｆ２２０７、Ｆ２６９５およびＦ２６９６の濃度（Ｍ）を横座標に、対する阻害率（％）を縦座標にしたグラフで示す（データは示していない）。２回調べた、各製品濃度に対する阻害率の値は、４回の独立試験の平均結果である。

これらの曲線に基づいて３製品のＩＣ_５０値を決定し、それらを表２に示している。

３化合物はこれら３種類の薬理学的アッセイにおいて活性を示したが、以下の相違があった：

ノルアドレナリン取り込みにおいて：
Ｆ２６９５はＦ２２０７より２倍活性が高かった。
Ｆ２６９５はＦ２６９６より２５倍活性が高かった。
セロトニン取り込みにおいて：
Ｆ２６９５はＦ２２０７より３倍活性が高かった。
Ｆ２６９５はＦ２６９６より１２倍活性が高かった。
パロキセチン結合において：
Ｆ２６９５はＦ２２０７より２倍活性が高かった。
Ｆ２６９５はＦ２６９６より１０倍活性が高かった。

三化合物はこれらの薬理学的アッセイにおいて活性を示したが、（１Ｒ，２Ｓ）形（Ｆ２６９６）とラセミ化合物（Ｆ２２０７）の活性はより低かった。（１Ｓ，２Ｒ）形ミルナシプラン（Ｆ２６９５）はＦ２２０７より２〜３倍活性が高かった。

実施例３：覚醒イヌにおける経口経路によるラセミ型塩酸ミルナシプラン（Ｆ２２０７）とその活性ある（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマー（Ｆ２６９５）の心拍数および血圧に対する活性の比較
３．１．緒論
以上のことから、Ｆ２２０７およびＦ２６９５のａ）経口経路により単回投与した後の心拍数（ｎ＝２８ イヌ）への影響、ならびにｂ）イヌにおいて経口経路により５日間連続投与した後の収縮期および弛緩期血圧（ｎ＝６ イヌ）への影響を調べるために調査を設計した。

この調査は、心拍数および血圧パラメーターについてのデータを遠隔測定法により収集可能にするインプラント(Data Sciences International)が埋め込まれた雌動物において、Ｆ２２０７およびＦ２６９５の同等に薬学上有効な量にて実施した。各調査では、動物を３処置群に割り当てた：
− 脱イオン水で処置する群１（対照）、
− Ｆ２２０７で２０ｍｇ／ｋｇ／日の用量にて処置する群２、
− Ｆ２６９５で１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量にて処置する群３。

３．２．方法
同時に埋め込まれる動物が少数であること（最大８）、使用する装置の記録レーン数（８レーン）をかんがみて、かつ、同質的な処置群を構成するために、４調査により総括的評価を行った。各調査は、３シリーズに分け（３製品各々での各動物の処置）、プローブの再初期設定を含むウォッシュアウト期間によって区切りをつけた。各シリーズ自体は２段階で実施する：
− 全ての動物を封じ込めおよび胃挿管による経口処置に適合させるためにそれらを脱イオン水で処置する第１段階、
− 動物が各処置を受ける第２段階（心拍数については単回投与、調査番号８９４／９２６／９３５／９３６；血圧については５日間連続投与、調査番号８９４）。

試験全体計画を以下の表に記載する：

種々の処置の心拍数への影響は、単回投与後、４調査により解析した。この解析は以下の１３のデータ収集時間に関するものである：
− 単回投与前、
− 単回処置後６時間にわたって３０分おき。

種々の処置の血圧への影響は、Ｄ５、Ｄ２９およびＤ３３（各シリーズの処置の最終有効日）に、定常状態にて、調査番号８９４により解析した。この解析は以下のデータ収集時間に関する：
− 処置前、
− 処置後６時間にわたって３０分おき。

３．３．結果
３．３．１． 心拍数（４調査統合）に関しては、個々の回数の変化について、処置前の値に対する処置試験後の１２回の値各々について、ならびに各記録時間における絶対心拍数値についてテューキー検定を実施した。

脱イオン水を受けた対照動物との比較により、以下の観察がなされた：
＃変化値について統計分析を行った場合には（図１）：
− Ｆ２２０７（２０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与後最初の１／２時間からの心拍数の有意な上昇、処置後最大５．５時間持続的に上昇（処置後の時点０．５および５．５時間−ｐ≦０．０１−ならびに時点５．０時間−ｐ≦０．０５−を除いて、全収集時間についてｐ≦０．００１）、
− Ｆ２６９５の投与後の心拍数の上昇がＦ２２０７の投与後に得られたものよりも小さいこと。さらに、投与から１および４時間の時点でのこのＦ２２０７とＦ２６９５との効果の差は有意であり（ｐ＜０．０５）、Ｆ２６９５に有利であること、
− Ｆ２６９５を受けた場合の心拍数の上昇はＦ２２０７を受けた場合よりも持続時間が短い（１．０〜４．５時間）（処置後最大５．５時間持続する）こと。

＃絶対心拍数値について統計分析を行った場合には、この同じ調査により以下のことが示される（図２）：
− Ｆ２２０７（２０ｍｇ／ｋｇ）の単回投与後最初の１時間からの心拍数の有意な上昇、処置後最大５．５時間持続的に上昇（処置後の時点３．５時間−ｐ≦０．０１を除いて、１．０〜４．５時間の全収集時間についてｐ≦０．００１；ならびに収集時間 処置後５．５時間についてｐ≦０．０１）、
− Ｆ２６９５の投与後の心拍数の上昇がＦ２２０７の投与後に得られたものよりも小さいこと。さらに、投与から１および４時間の時点でのこのＦ２２０７とＦ２６９５との効果の差は有意であり（ｐ＜０．０５）、Ｆ２６９５に有利であること、
− Ｆ２６９５を受けた場合の心拍数の上昇はＦ２２０７を受けた場合よりも持続時間が短い（１．０〜４．５時間）（処置後最大５．５時間持続する）こと。

３．３．２． 血圧に関しては(連続投与についての１調査)、弛緩期血圧の平均値（図３および表４）、ならびに収縮期血圧の平均値（図４および表５）を、各イヌについて、さらに、連続５日間の投与後の最終処置後６時間について算出した。これらの平均血圧値を、ＡＮＯＶＡ、続いて、テューキー検定（ＡＮＯＶＡによりこのような検定が可能となった場合（データは示していない））により解析した。

以下のことが観察された：
− 脱イオン水による処置に対し、Ｆ２２０７（２０ｍｇ／ｋｇ／日）またはＦ２６９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）の５日間連続投与後においての弛緩期血圧の有意な上昇（ｐ≦０．００１）、
− Ｆ２２０７（２０ｍｇ／ｋｇ／日）の５日間連続投与後の平均弛緩期血圧値とＦ２６９５（１０ｍｇ／ｋｇ／日）の連続投与後の平均弛緩期血圧値において有意な差（ｐ≦０．０５）、
− 収縮期血圧に対して有意な影響を及ぼさないこと；従って、注目すべきはＦ２６９５の５日間連続投与後のｓＢＰ値が脱イオン水による処置後のｓＢＰ値に近いことである。

各弛緩期および収縮期血圧データを、それぞれ、表４および５に示す。

３．４．結論
遠隔測定装置が埋め込まれた覚醒イヌにおける経口投与による一連の４調査において実施した本評価の試験条件下では：
単回投与の場合、対照群（ｎ＝２８）に対して、心拍数の上昇が明らかに有意であり、２０ｍｇ／ｋｇ／日の用量のＦ２２０７では持続していた；同等に薬理学的に有効な用量１０ｍｇ／ｋｇ／日のＦ２６９５では、その上昇が統計上および臨床上少なく、より一時的なものであった。

・ Ｆ２６９５、１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量では、５日間連続投与した後の定常状態にて、最終処置後６時間にわたる平均収縮期血圧において統計的に有意な変化は起こらなかった。

・ ５日間連続投与した後の定常状態にて、最終処置後６時間にわたる平均弛緩期血圧において、活性Ｆ２６９５エナンチオマー（９８±２ｍｍＨｇ）と同等に薬学上有効な用量のＦ２２０７ラセミ化合物（１１０±４ｍｍＨｇ）との間に統計的に有意な差が認められた。

これらの差異によって、活性Ｆ２６９５エナンチオマーの心血管忍容性がより高いことがはっきりと示される。

実施例４：in vitroにおける予測毒性についてのゲノム試験
４．１．材料および方法
Ｆ２６９５およびＦ２６９６化合物、ラセミ化合物分子Ｆ２２０７のエナンチオマー、ならびにクロミプラミン、参照製品、（調査ではＣ２１８と符号化した）を本調査で評価した。最終試験に使用する３種類の濃度を選択するために、まず、２つのエナンチオマー、Ｆ２６９５およびＦ２６９６を初代ラット肝細胞での予備細胞毒性試験（ＭＴＴアッセイ）により評価した。

初代ラット肝細胞培養物の処置後、ＲＮＡを抽出して、標識相補的ＤＮＡプローブを作製し、次いで、それらを細胞ストレスに特異的な、選択的スプライシングによる６８２断片を含有するメンブレンとハイブリダイズさせた。処置細胞のハイブリダイゼーションプロフィールを非処置細胞のものと比較することにより、各製品についての毒性指数を得た。

４．１．１．調査の目的および目標
Safe-Hitは、予測毒性薬理学についてのゲノム試験であり、製品をそれらの毒性の最適評価に基づいて比較し、順位付けすることが可能な、感度が高く、厳格で、信頼性があり、迅速かつ確実な試験である。

Safe-Hitは、対照条件と比べて、単離、ひいては、特定の生物学的状態より生じるスプライシング事象のクローニングを可能にする技術、ＥＸＯＮＨＩＴ（ＤＡＴＡＳ（商標）：Differential Analysis of Transcripts with Alternative Splicing）の特性を利用するものである。これにより、生物学的条件に応じて示差的に発現されるｍＲＮＡアイソフォームの単離が可能になる。

Safe-Hitでは、以下の基本的工程（各製品に対して２回、系統的に実施する）によって決定される毒性指数に従って、１化学系統内の分子を順位付けすることが可能となる：
− 種々の製品を、予備細胞毒性試験（ＭＴＴアッセイ）により推定した３種類の異なる濃度で用いての細胞系統の処置：８０％細胞生存に相当する参照濃度、可能であれば、１０倍高い濃度および１０倍低い濃度、
− 全ＲＮＡとその対応する放射性同位元素標識ｃＤＮＡプローブの調製、
− ｃＤＮＡプローブのハイブリダイゼーション：ＷＴｐ５３の過剰発現（ｐ５３はこの方法論の進行から選択される最も遍在する細胞ストレスの「メディエーター」である）により誘導される遺伝子スプライシングの変化に対応する６８２種類の独立クローンを含有するSafe-Hitマクロアレイ、
− 毒性指数の取得および決定。

４．１．２．細胞
調査（細胞毒性についての予備ＭＴＴアッセイおよび本試験）に使用する細胞は、標準条件下で培養した、Sprague-Dawleyラットの凍結保存肝細胞初代培養物（バッチ Ｈｅｐ １８４００５およびＨｅｐ １８４００６−Biopredic）である。

４．１．２．１ 培養培地
− 融解培地： １００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシンおよび０．６Ｍのグルコースを添加したグルタマックス１含有Leibovitz １５培地（バッチ ＭＩＬ ２１０００９−Biopredic）、
− 播種培地： １００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび１０％ｖ／ｖウシ胎児血清を添加したグルタマックス１含有ウィリアムズＥ培地（バッチ ＭＩＬ ２６０００５）−Biopredic）、
− インキュベーション培地： １００ＩＵ／ｍｌのペニシリン、１００μｇ／ｍｌのストレプトマイシン、４μｇ／ｍｌのウシインスリンおよび５０μＭのヘミコハク酸ヒドロコルチゾンを添加したグルタマックス１含有ウィリアムズＥ培地（バッチ ＭＩＬ ２６０００９〜２６０００７−Biopredic）。

４．１．２．２ 培養条件
３７℃、ＣＯ_２雰囲気（５％）、相対湿度（９５％）。

４．１．２．３ 培養方法

４．１．３．細胞毒性試験
細胞毒性試験（ＭＴＴアッセイ）は、ミトコンドリアの活性を示す細胞呼吸の完全性を明示する比色反応を利用して生細胞を検出する試験である。水溶性のＭＴＴ（臭化３−［４，５−ジメチルチアゾール−２−イル］−２，５−ジフェニルテトラゾリウム）は、生細胞のミトコンドリア内酵素の影響下での分解により紫色の不溶性ホルマザンに変化する。ホルマザンを有機溶媒に可溶化し、得られた溶液を分光光度法により測定する。吸光度測定値は生存細胞数に比例する。

細胞を、５種類の異なる濃度（０−１−１０−２５−５０および１００μＭ）の試験製品と１６時間接触させる。
このように曝露させた後、ＭＴＴ溶液（初代肝細胞のインキュベーション培地中０．５ｍｇ／ｍｌ）を３時間添加する。ホルマザン結晶を可溶化した後、マルチウェルプレートを分光光度計により５００ｎｍにて読み取り、細胞生存率を決定する。

４．１．４ 本ゲノム薬物毒性試験
本調査は、試験間の一貫性を高め、得られた結果の正当性を立証するために、各製品に曝露した播種培養物を用いて２回実施する。

４．１．４．１ 細胞播種および処置
細胞を播種し、予備ＭＴＴアッセイに基づいて選択される３種類の濃度の各製品とともに１６時間培養する；２つの対照（非処置細胞および溶媒単独）を一連のものに加える。

４．１．４．２ 全ＲＮＡ抽出およびアッセイ
処置後、ＲＮＡを抽出し、以下のように解析する：
− 細胞の収集および遠心分離、
− 抽出、製造業者のプロトコールに従い、調製済フェノール試薬（トリゾール−バッチ １１０６２６６および１１２１０６７−Invitrogen）を用いて実施、
− ＲＮＡの水への可溶化、
− 分光光度法によるＲＮＡアッセイ（２６０、２８０および３００ｎｍにて光学密度を測定）、
− Agilentの使用によるＲＮＡの質の検証。

４．１．４．３ ｃＤＮＡプローブの調製
ｃＤＮＡプローブを放射性逆転写（α ｄＡＴＰ^３３Ｐ−Amersham）により調製する。プローブが確実に放射能を有するように放射性ｃＤＮＡを定量する（インスタントイメージャー−Packard）。

４．１．４．４ Safe-Hitメンブレンとのハイブリダイゼーション
６８２種のＤＡＴＡＳクローン（選択的スプライシングによるパターン）をQ-Pix装置(GENETIX)を用いてプレカットナイロン(Q-BIOgene)で作製されたSafe-Hitメンブレン上に置く（２組）。ＤＮＡプローブをメンブレンと一晩ハイブリダイズさせ、メンブレンを洗浄する。

４．１．４．５．ｃＤＮＡの調製：
− マトリックス： ５μｇの全ＲＮＡ（各処置系列に関して、そして、各濃度に関して）、
− プライマー： ラットでの第１回および第２回ハイブリダイゼーションに関して、１００ｎｇのオリゴ−ｄＴＶオリゴヌクレオチド（バッチ １２．００，Invitrogen)、
− 主要混合物：
１０μｌの第１鎖５×プレミアバッファー（バッチ １１３１２２６−Invitrogen）
１μｌのｄＣＴＰ＋ｄＧＴＰ＋ｄＴＴＰ ２０ｍＭ（バッチ １１０５２０１−Invitrogen）
１μＭのＡＴＰ １２０μＭ（バッチ １１０５２０１−Invitrogen）
５μｌのジチオスレイトール（ＤＴＴ） ０．１Ｍ（バッチ １３３６０９−Invitrogen）
１μｌのＯｕｔ ４０Ｕ ＲＮアーゼ（バッチ １１１３３４５−Invitrogen）
５μｌの^３３ｐｄＡＴＰ ３ ０００Ｃｉ／ｍｍｏｌ １０ｍＣｉ／μｌ（バッチ Ｂ０２３９−Amersham）
４μｌのスーパースクリプト II（バッチ １１３７８０６−Invitrogen）
１μｌのグリコーゲン（バッチ １１２９３２８−Invitrogen）

手順：
ＲＮＡとオリゴ−ｄＴＶを７０℃にて１０分間インキュベートし、その後、氷上に置く。２７μｌのマスターミックスを添加し、４３℃にて１時間、次いで、５０℃にて１５分間インキュベートする。２０μｌの水の後、２０μｌのＥＤＴＡ ５０ｍＭ、次いで、４μｌのＮａＯＨ １０Ｎを添加する。６５℃にて２０分間インキュベートし、その後、氷上に置く。

定量：インスタントイメージャー，Packard：１μｌの反応混合物、
８μｌの酢酸、１００μｌのイソプロパノールおよび１μｌのグリコーゲン（２０μｇ／μｌ）を添加する。−２０℃にて２０分間インキュベートし、４℃にて、１３０００ｒｐｍにて２０分間遠心分離する。２００μｌの水で懸濁液として再構成する、定量：インスタントイメージャー，Packard：１μｌの反応混合物。

培地およびバッファー：

プレハイブリダイゼーション：
５ｍｌのプレハイブリダイゼーションバッファーをハイブリダイゼーションチューブに等分し、
対応する量のサケ精子ＤＮＡを最終濃度１００μｇ／ｍｌまで添加し、
メンブレンを５×ＳＳＣに浸漬し、
メンブレンをハイブリダイゼーションチューブに入れ、６５℃にて２時間プレハイブリダイズする。

ハイブリダイゼーション：
プレハイブリダイゼーションバッファーを除去し、１０〜２０ｍｌの５×ＳＳＣで洗い流し、
５×ＳＳＣを除去し、５ｍｌのバッファー＋サケ精子ＤＮＡに取り替え、
ＲＴプローブを９５℃にて５分間変性させた後、氷上に１分間置き、
チューブ内で再構成した後、適当量の変性ＲＴプローブを回収するために遠心分離し（１０００００〜２０００００ｃｐｍ／ｍｌ）、５５℃にて一晩インキュベートする。

洗浄：
メンブレンを１０〜２０ｍｌの洗浄バッファー１で洗い流し、
そのバッファーを除去し、それを５０ｍｌの洗浄バッファー２に取り替え、
３５℃にて３０分間インキュベートした後、バッファー４で洗浄しながら除去し、置き換え、５５℃にて３０分間インキュベートし、その後、最終洗浄バッファーを捨て、
メンブレンをチューブから取り出し、それらをカセット上に置き、取得を３時間継続する。

４．１．４．６ 画像の取得および解析
メンブレンをスクリーン（ＦＸ イメージングスクリーンＫ−Bio-rad）上に３時間置く。その後、パーソナルモレキュラーイメージャー ＦＸ(Bio-rad)を用いてフィルムを読み取る。画像は、Safe-Hitリーダーソフトウェア(COSE)を使用して解析する。

４．１．４．７ 毒性指数の算出
全データを、種々のメンブレンを正規化し、任意濃度の特定化合物に関し、非処置の対照の結果と比べて、アップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子数の合計に相当する毒性指数を算出する自動計算プログラムに移す。次いで、２つのSafe-Hit解析結果を比較し、組み合わせて、種々の試験化合物の潜在毒性を評価する。ユーザーによって変更可能な２パラメーターが毒性指数の算出に関係する：
バックグラウンド閾値（ＢＴ）により、バックグラウンドノイズに近く、かつ、重要な遺伝子発現に帰することのない弱いシグナルを除く。従って、これにより検出閾値が決定される；
誘導係数（ＩＦ）は、対照サンプルに対する、アップレギュレートまたはダウンレギュレートされるであろうクローンの増倍率として決定される。適切な結果を得るためのこのパラメーターの値は、通常、２以下である。段階的に上昇するＩＦ値はさらに強くアップレギュレートまたはダウンレギュレートされるクローンを選択する値である。

毒性指数の算出方法は、参照プロフィール（Ｒ：非処置細胞）を試験プロフィール（Ｅ）と比較することにより作成されたものであり、以下の工程を踏む（方法の図式的概観に関する図５を参照）：
− 得られた全ての値のｌｏｇ値への変換、
− 二重アッセイでの各平均ｌｏｇ値の算出（Ｍ_ｉＲおよびＭ_ｉＥ）、
− 全てのシグナルについてのＭ_ｉＲ−Ｍ_ｉＥ（＝Ｄ_ｉ）に関するマトリックスの作成、
− Ｍ_ｉＥからＤ_ｉの隣接した１４個の値の中央値を引くことによる各Ｍ_ｉＥ値の正規化（＝ＮＭ_ｉＥ）、
− 正規化値の参照値との比較（Ｃ_ｉ＝ＮＭ_ｉＥ−Ｍ_ｉＲ）、
− Ｃ_ｉの指数変換（＝Ｆ_ｉ）、
− Ｆ_ｉのユーザーによって選択された誘導係数との比較：
− Ｆ_ｉ＞ＩＦの場合には、その遺伝子がアップレギュレートされていると考えられ、
− １／ＩＦ＜Ｆ_ｉ＜ＩＦの場合には、その遺伝子には変化がないと考えられ、
− Ｆ_ｉ＜１／ＩＦの場合には、その遺伝子ダウンレギュレートされていると考えられる。

４．２．ＭＴＴアッセイの結果
これらのアッセイを１６時間曝露した初代ラット肝細胞について３回実施した。
クロミプラミン（Ｃ２１８と記す）では、細胞を１６時間曝露した後に細胞生存が認められなかったため、１００μＭにて著しい毒性が示された。逆に、２５μＭでは毒性は認められなかった。５０μＭでの８０％を超える細胞生存は、ゲノム薬物毒性研究と完全に一致している。Ｆ２６９５およびＦ２６９６化合物は、このアッセイにおいて、１００μＭの濃度でさえも細胞毒性がないことが示される。

ゲノム薬物毒性評価を行うため、同じ化合物について３種類の濃度を使用する： ８０％細胞生存を得ることが可能な濃度（Ｃ）、ならびに（Ｃ）×１０および（Ｃ）／１０に相当する濃度。
実施するアッセイにおけるＦ２６９５およびＦ２６９６の評点獲得能力を比較するため、各試験で同じ濃度を使用した：１μＭ、１０μＭおよび１００μＭ。クロミプラミンについては、１μＭ、１０μＭおよび５０μＭの濃度を使用した。図６ａ、６ｂおよび６ｃを参照。

４．３ ラット一次肝細胞についての結果
毒性指数（ＩＴ）を上記のように決定した。シグナルがバックグラウンド閾値（ＢＴ）より２倍高かったクローンだけを考慮に入れ、対照と比べて変化したことが認められるクローンだけを２つの独立した試験で検討した。２つの独立した解析を非処置の対照に対する２つの分化水準（誘導係数−ＩＦ）を用いて行った：
− 非処置の対照に対する係数少なくとも１．７。 １．７倍のこの係数は最小値であり、２つの非処置の対照との比較では指数が得られない。
− 非処置の対照に対する係数少なくとも２。 ２倍のこの係数では、最も強いシグナルが考慮される。

４．３．１．非処置の対照に対する誘導係数１．７（表６）

以下の毒性指数を得た：

よって、以下の順位付けを示すことができる、毒性最大〜最小：Ｃ２１８（クロミプラミン）＞Ｆ２６９６＞＞＞Ｆ２６９５。

参照分子であるクロミプラミン（本調査ではＣ２１８と表示）では、調べた濃度に対応してサイン数が増加することが示された：濃度１、１０および５０μＭ（予備細胞毒性試験で定義した最大濃度）において、それぞれ、９、１５および２８サイン。論理的に推察できるとおり、低濃度および中濃度において生じた全てのサインはより高い濃度においても認められる。

Ｆ２６９５では、濃度１および１０μＭにおいて、本調査で調べた可能性ある６８２のストレスサインがいずれも現れなかった。最大濃度１００μＭにおいては、たった２つのサインしか検出されなかった。そのうちの１つのサインはＣ２１８に共通したものであるが、それが何を意味するのかは分からなかった。

Ｆ２６９６では、調べた濃度に対応してサイン数が増加することが示された：濃度１、１０および１００μＭにおいて、それぞれ、２、５および２２サイン。低濃度および中濃度において生じたサインの全てがより高い濃度においても検出された。２２サインではＦ２６９５と共有されるものはなかった。逆に、低濃度および中濃度において現れたサイン（低濃度にて現れた２サインを含む５サイン）は、低用量１μＭで始めた場合にクロミプラミンで検出された９サインに含まれる５サインに共通していた。高濃度１００μＭにおいては、Ｆ２６９６の２６サインのうちの１０サインが、５０μＭのクロミプラミンで確認された２８サイン中でも検出された。

定性的観点から、Ｆ２６９６およびクロミプラミンのミトコンドリア転写産物、特に、Ｃｏｘ１およびシトクロムｂに及ぼす影響について強く主張すべきである。これらのサインはＦ２６９５では現れない（Ｇ０５／Ｇ０９／Ｉ０１位置）。

４．３．２．非処置の対照に対する誘導係数２（表７）

以下の毒性指数を得た：

これらのパラメーターに従って、以下の順位付けを提示することができる、毒性最大〜最小：Ｃ２１８（クロミプラミン）＞Ｆ２６９６＞＞＞＞＞Ｆ２６９５。
係数２にて過剰発現および過少発現したクローンに関し、Ｆ２６９５では、１００μＭの濃度でさえ、いかなるサインも現れなかった。

誘導係数１．７を用いた前述の解析では現れた、１μＭのＦ２６９６での弱いサインが消失しているという事実により、サイン発現に及ぼす濃度の影響が確認された。

定性的観点から、Ｆ２６９６およびクロミプラミンのＣｏｘ１およびシトクロムｂに及ぼす影響についても確認した（Ｇ０５／Ｇ０９／Ｉ０１位置）。
Ｆ２２０７の薬理学的に有効なエナンチオマーであるＦ２６９５は、この試験において重大な影響を及ぼすものではなかったが、クロミプラミンは正の対照とする参照製品として使用される。

逆に、Ｆ２２０７の薬理学的に不活性なエナンチオマーであるＦ２６９６は、クロミプラミンのものと定量的にも定性的にも近いサインプロフィールを示したが、Ｆ２６９５に共通したサインは全く示していない。
こうしたあらゆる点が、この実験モデルにおいて、Ｆ２６９６よりも安全係数が極めて有意に良好である、活性Ｆ２６９５エナンチオマーについての優れた毒性ゲノムプロフィールを示す証拠となる。

４．４ 結論
ラット肝細胞初代培養物を用いて、Ｆ２２０７のエナンチオマーであるＦ２６９５およびＦ２６９６分子（濃度１０、５０および１００μＭにて）、ならびにＣ２１８（クロミプラミン、濃度１、１０および５０μＭにて）で実施したゲノム薬物毒性調査では、濃度依存性ストレスサインと毒性指数を得た。これらの調査により、ＭＴＴアッセイのような古典的細胞生死判別アッセイにおいていかなる毒性も引き起こさない処置条件（濃度、処置期間）下でストレスサインを明示するゲノム薬物毒性試験の性能が確認される。

この調査ではいくつかの重要な事実が明らかにされる：
− 初代ラット肝細胞モデルでは、Ｆ２２０７の薬理学的に有効なエナンチオマーであるＦ２６９５だけが有意な毒性指数を与えなかった；
− Ｆ２２０７の不活性エナンチオマーであるＦ２６９６と参照向精神薬製品であるクロミプラミンは顕著な指数を与え、非常に類似したまたは共通のストレスサインが認められた。この系では、正の対照となる参照分子のクロミプラミンでは、最小濃度で始めた場合に、最大数のストレスサイン、有意な指数がもたらされることが観察された。この件に関し、興味深いことには、クロミプラミンによって、ヒトにおいて、頻脈、起立性低血圧症、心伝導系または心調律異常、例外的に、肝炎などの一定数の有害事象が引き起こされ得る。クロミプラミンを誤って過量投与した場合には、失神、血液異常および重篤な心血管症状が認められることもある。

興味深いことには、一般的な生理病理学的機構を推測することなく、Ｆ２６９６はクロミプラミンのものと非常に類似したまたは共通のストレスサインを示しており、以上で記載した心血管障害などの有害事象もまた引き起こすのである。

よって、観察されたサインが抗鬱薬プロフィール、またはより広くは向精神薬プロフィールとも無関係であることを示唆するのは当然であるが、それらのサインは、まさに「ストレスのサイン」であると考えるべきである（Ｆ２６９６は、特に、タンパク質合成に関連する遺伝子や翻訳開始因子の発現の低下を引き起こす）。こうしたあらゆる点が、この実験モデルにおいて、Ｆ２６９６よりも安全係数が極めて有意に良好である、活性Ｆ２６９５エナンチオマーについての優れた毒性ゲノムプロフィールを示す証拠となる。

単回投与後の心拍数の変化（Δ値）。＊＊＊：ｐ≦０．００１ 対脱イオン水＊＊ ：ｐ≦０．０１ 対脱イオン水 ＊ ：ｐ≦０．０５ 対脱イオン水 Δ ：ｐ≦０．０５ 対Ｆ２２０７ 単回投与後の心拍数の変化（絶対値）。＊＊＊：ｐ≦０．００１ 対脱イオン水＊＊ ：ｐ≦０．０１ 対脱イオン水 ＊ ：ｐ≦０．０５ 対脱イオン水 Δ ：ｐ≦０．０５ 対Ｆ２２０７ 種々の処置の弛緩期血圧平均値への影響（連続５日間の処置後の最終摂取後６時間にわたる平均値）。 種々の処置の収縮期血圧平均値への影響（連続５日間の処置後の最終摂取後６時間にわたる平均値）。 毒性指数算出方法の模式図。毒性指数はアップレギュレートおよびダウンレギュレートされた遺伝子全ての総数である（ユーザーによって定義された誘導係数に関する）。 ラット一次肝細胞でのＭＴＴアッセイ。濃度はμＭで示す。

Claims (13)

1. 心血管疾患の病歴のある患者および／または心血管障害に羅漢している患者における、鬱病、抑鬱状態、線維筋痛、慢性疲労症候群、または疼痛を予防または治療するための、１回以上の摂取により１日当たり０．０１ｍｇ〜１０ｍｇ／ｋｇ体重用量で投与される、ミルナシプラン（Ｚ（±）−２−（アミノメチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１−フェニルシクロプロパンカルボキサミド）の（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーまたはその薬学上許容される塩を含んでなる、医薬組成物。
2. 投与用量が、１回以上の摂取により１日当たり０．０５ｍｇ〜５ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１に記載の医薬組成物。
3. 投与用量が、１回以上の摂取により１日当たり０．１ｍｇ〜１ｍｇ／ｋｇ体重である、請求項１または２に記載の医薬組成物。
4. 心血管障害が動脈血圧の上昇および／または心拍数の上昇である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の医薬組成物。
5. 動脈血圧の上昇が弛緩期動脈血圧の上昇である、請求項４に記載の医薬組成物。
6. 器官および／または組織毒性の危険性も制限する、請求項１〜５のいずれか一項に記載の医薬組成物。
7. ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーが、Ｚ−（１Ｓ，２Ｒ）−２−（アミノメチル）−Ｎ，Ｎ−ジエチル−１−フェニルシクロプロパンカルボキサミド（Ｆ２６９５）の塩酸塩である、請求項１〜６のいずれか一項に記載の医薬組成物。
8. 深い抑鬱状態、難治性鬱病、高齢者の鬱病、心因性鬱病、インターフェロン治療により誘発される鬱病、抑鬱状態、躁鬱症候群、季節性鬱症状、全般的な健康状態に関連する鬱症状、または向精神薬に関連する鬱病を治療または予防するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
9. 慢性疼痛を治療または予防するための、請求項１〜７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
10. 心血管障害の病歴が、心筋梗塞、心調律異常（頻脈、徐脈、心悸亢進）、動脈血圧異常（低血圧または高血圧患者）および心臓病の中から選択されることを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一項に記載の医薬組成物。
11. 薬剤が、鬱病の治療または予防のために、同時に、別々に、あるいは時間をずらして使用する組合せ製品として、
    ａ） ミルナシプランの（１Ｓ，２Ｒ）エナンチオマーまたはその薬学上許容される塩、および
    ｂ） 向精神薬から選択される少なくとも１つの活性化合物
    を含む、請求項１〜１０のいずれか一項に記載の医薬組成物。
12. 向精神薬が抗鬱薬または抗ムスカリン作用薬である、請求項１１に記載の医薬組成物。
13. 鬱病が、深い抑鬱状態、難治性鬱病、高齢者の鬱病、心因性鬱病、インターフェロン治療により誘発される鬱病、抑鬱状態、躁鬱症候群、季節性鬱症状、全般的な健康状態に関連する鬱症状、または向精神薬に関連する鬱症状である、請求項１１または１２に記載の医薬組成物。

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