NO324902B1

NO324902B1 - Fremgangsmate ved utvinning av faktor VIII/vWF-kompleks ved hjelp av kationebytterkromatografi, faktor VIII/vWF-kompleks saledes fremstilt, samt preparat inneholdende samme og anvendelse derav

Info

Publication number: NO324902B1
Application number: NO19994137A
Authority: NO
Inventors: Friedrich Dorner; Johann Eibl; Bernhard Fischer; Arthur Mitterer; Oyvind L Schonberger; Kathrin Thomas-Urban
Original assignee: Baxter Ag
Priority date: 1997-02-27
Filing date: 1999-08-26
Publication date: 2007-12-27
Also published as: AU744919B2; US6831159B1; US20020058625A1; CA2282841C; JP4250771B2; WO1998038220A1; US20050239171A1; ATE391728T1; AT406373B; NO994137D0; NO994137L; US6953837B2; ES2306471T3; EP0971958A1; EP0971958B1; NO20071357L; AR010121A1; AU6080698A; JP2001517212A; ES2306471T5

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte ved utvinning av faktor VIII/vWF-kompleks fra et biologisk utgangsmateriale ved hjelp av kationebytterkromatografi og trinnvis eluering som angitt i krav 1, samt renset faktor VIII/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer, som angitt i krav 7.

I plasma sirkulerer von Willenbrand-faktor i en konsentrasjon fra 5-10 mg/l, og til største del i form av et ikke-kovalent bundet kompleks med faktor VIII. I kryopresipitatet er faktor VIII/vWF-kompleks sterkt anriket, og kan isoleres derfra eller fra plasma eller plasmafraksjoner ved hjelp av kjente fraksjoneringsfremgangsmåter.

Ved hemofili er blodlevringen forstyrret på grunn av en mangel på bestemte plasmatiske blodlevringsfaktorer. I hemofili A skyldes blødningstendensen en mangel på faktor VIII hhv. vWF (fenotypisk hemofili). Behandling av hemofili A utføres først og fremst ved erstatning av den manglende levringsfaktor med faktorkonsentrater, f. eks. ved infusjon av faktor VIII eller faktor VIII/vWF-kompleks.

For anvendelse ved terapi av pasienter med hemofili A, men også med von Willebrand-syndrom, er det ønskelig med en renset faktor VIII, kompleksert med vWF (Berntorp, 1994, Haemostasis 24: 289-297). Spesielt understrekes stadig at man i preparater som mangler eller kun inneholder lite vWF, observerer en forlenget blødningstid og en lav faktor Vm:C-halveringstid in vivo. En normalisering av vWF in vivo er viktig for å opprettholde en konsentrasjon av faktor VIII i plasma både ved reduksjon av faktor Vlll-elimineringshastigheten og ved å støtte frigivningen av endogen faktor VIII (Lethagen et al., 1992, Ann. Hematol. 65: 253-259).

DE 3,504,385 beskriver gjennomføring av ionebytterkromatografi for rensing av faktor VIII/vWF-kompleks, hvor faktor Vni-komplekset bindes over sulfatgrupper og elueres med citratbuffer, kalsiumklorid og NaCl-gradient. Faktor VIII/vWF-kompleks elueres derved fra bæreren med konsentrasjonen 0,5 M NaCl.

EP 0,416,983 beskriver utvinning av faktor VIII/vWF-kompleks fra humant plasma ved en kombinasjon av bariumklorid- eller aluminiumhydroksid-felning og anionebytterkromatografi på DEAE-fraktogel.

Harrison et al. (Thrombosis Res., 1988, 50, 295-304) beskriver rensing av faktor VIII/vWF-kompleks ved kromatografi på dekstran-sulfat-Sepharose.

EP 0,600,480 beskriver en rensefremgangsmåte for faktor VIII/vWF-kompleks fra helplasma ved hjelp av kombinert anionebytter/kationebytter-kromatografi. Elueringen av FVIII/vWF-komplekset som er adsorbert på kationebytteren, utføres herved ved bruk av en Ca-holdig buffer med 0,3 M NaCl i et pH-område fra 6,6 til 7,0.

WO 96/10584 beskriver en fremgangsmåte ved utvinning av meget rent rekombinant vWF ved hjelp av kombinert anionebytter/heparin-affinitetskromatografi, og EP 0,705,846 beskriver separasjon av høy- og lavmolekylære fraksjoner fra rekombinant vWF ved hjelp av heparin-affinitetskromatografi.

EP-A2-600480 beskriver en fremgangsmåte for ekstrahering av faktor VIII/vWF-kompleks fra totalt humant plasma ved hjelp av trinnløs kationebytterelvering.

Faktor Vm-preparatene som beskrives i teknikkens stand, inneholder riktignok hovedsaklig hele vWF-multimermønstret, men oppviser imidlertid variasjoner i andelen av høymolekylær vWF (HMW-vWF) og lavmolekylær vWF (LMW-vWF), og oppviser også såkalte triplettstrukturer, som tyder på en proteolytisk nedbrytning, spesielt av HMW-vWF. Stabiliteten av disse preparater er derfor ofte begrenset.

Det betones stadig at faktor Vm/vWF-preparater som hovedsaklig inneholder HMW-vWF, eventuelt kunne ha en god innflytelse på blødningstiden fordi de utøver den primære funksjon av vWF, nemlig blodplateagglutinasjon, og har en høyere affinitet med blodplatereceptorene glykoprotein IB og Hb/Ola enn lavmolekylære vWF-multimerer.

Det finnes et behov for et faktor Vm-kompleks som har en tilstrekkelig spesifikk aktivitet av faktor VULC- og vWF-aktivitet. Et problem ved utvinning av et slikt kompleks er spesielt separasjonen av molekyler som inneholder lavmolekylære vWF-multimerer, og en anrikning av komplekser med en høy spesifikk vWF-aktivitet.

Målet med foreliggende oppfinnelse er derfor å tilveiebringe et faktor Vni/vWF-kompleks med en forbedret spesifikk aktivitet og stabilitet.

Det er et ytterligere formål å tilveiebringe en fremgangsmåte ved utvinning av et slikt faktor VIII/vWF-kompleks. Fremgangsmåten bør kunne brukes for rensing av både rekombinant og plasmatisk faktor VIII/vWF-kompleks.

Ifølge oppfinnelsen løses oppgaven ved at det tilveiebringes en fremgangsmåte ved utvinning av faktor VIII/vWF-kompleks, hvor faktor VIII/vWF-komplekset bindes fra en proteinoppløsning på en kationebytter, og faktor VIII-vWF-komplekset utvinnes ved en trinnvis eluering idet faktor Vni-komplekset bindes på en kationebytter ved en saltkonsentrasjon < 250 mM og faktor VIII-vWF-komplekset som inneholder lavmolekylære vWF-multimerer, faktor VIII som mangler blodplateagglutinerende vWF-aktivitet og faktor VIILC elueres og utvinnes ved en konsentrasjon mellom > 250 mM og < 300 mM og hvor faktor VIII/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymo lekylene vWF-multimerer, utvinnes ved en trinnvis fraksjonering ved en saltkonsentrasjon < 300 mM, fortrinnsvis > 350 mM. Utvinningen og anrikningen av faktor Vin/vWF med forbedret aktivitet og stabilitet oppnås spesielt ved at faktor VIII/vWF-komplekset bindes ved en lav saltkonsentrasjon, at fraksjoner som inneholder faktor VIII/vWF-kompleks med lavmolekylære vWF-multimerer, inaktive vWF-spaltningsprodukter og uspesifikke ledsagende proteiner, skilles ut ved en midlere saltkonsentrasjon ved en trinnvis heving av saltkonsentrasjonen, og at fraksjoner som inneholder faktor Vm/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer, utvinnes ved en høyere saltkonsentrasjon.

Faktor VIII/vWF-kompleks renses på grunn av sitt sure isoelektriske punkt (IEP = 5,5 til 6) og den derav resulterende negative nettoladning, vanligvis i et svakt syrlig til basisk miljø over positivt ladede anionebyttere. På grunnlag av de hittil beskrevne fremgangsmåter ved rensing av faktor VE/vWF-kompleks ved hjelp av positivt ladede anionebyttere, kunne man derfor ikke forvente at faktor VIII/vWF-kompleks også ved en pH-verdi som ligger over IEP-verdien for komplekset, og en lav saltkonsentrasjon bindes på en negativt ladet gelmatriks av en kationebytter og kan elueres selektivt fra gelmatriksen ved heving av saltkonsentrasjonen. Man kunne heller ikke forvente at man ved trinnvis eluering ved en saltkonsentrasjon mellom > 250 mM og < 300 mM eluerer uspesifikke ledsagende proteiner, inaktive vWF-spaltningsprodukter, komplekskompo-nenter med lav spesifikk aktivitet, faktor VIII/vWF-kompleks som inneholder lavmolekylære vWF-multimerer, ikke-kompleksert eller kun svakt bundet faktor VIII og fri faktor VHI, og at man ved en saltkonsentrasjon > 300 mM erholder spesielt faktor VIII/vWF-kompleks med høymolekylære vWF-multimerer.

Innen rammen for foreliggende oppfinnelse ble det fastslått at man ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen og utgående fra et urent biologisk materiale, erholder rensede fraksjoner som i hovedsak er frie for forurensende nukleinsyrer. Dermed fjernes ved fremgangsmåten også mukleinsyrer fra proteinpreparater. Denne virkning kan ikke vises med kjente fremgangsmåter som benytter seg av anionebyttere, fordi nukleinsyrene på grunn av sin negative ladning bindes på anionebytteren og ved heving av saltkonsentrasjonen igjen løses fra anionebytteren og havner i eluatet.

Ved rensing av faktor Vffl/vWF-komplekset bør man spesielt ta hensyn til at på grunn av at vWF har en størrelse fra 500.000 til flere millioner, tilveiebringer kun slike bærermaterialer som ikke hindrer faktor Vni/vWF-kompleksets diffusjon og fordeling i de brukte bærermaterialer, en god rensing og et godt utbytte. Ved gjennomføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for rensing av faktor VIII/vWF-kompleks med høy spesifikk aktivitet ved hjelp av en kationebytter, brukes en gelmatriks som ikke bare har en høy ladningskapasitet, er robust ved håndtering og viser en skarp elueringsprofil, men som også lønnsomt kan brukes i industriell skala. På denne måte blir fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen interessant spesielt for utvinning av renset faktor VIII/vWF-kompleks i storteknisk skala.

For utføring av fremgangsmåten kan hvilken som helst kjente kationebyttere benyttes, hvorved man foretrekker kationebyttere med en bærer som er konjugert med sulfopropyl- eller karboksymetylgrupper. Spesielt f.eks. SP-"Sepharose" Fast Flow og CM-"Sepharose" Fast Flow (Pharmacia), "Fractogel" EMD-S03 og "Fractogel" EMD COOH (Merck), "Poros" 10 SP og "Poros" 10 S (Perseptive Biosystems) og "Toyopearl" SP 550 C og "Toyopearl" CM-650 (M) (TosoHaas) har vist seg å være godt egnet.

En storporet gel med tentakkelstruktur av typen "Fractogel" EMD-S03 og "Fractogel" EMD COOH (Merck) har vist seg å være spesielt gunstig for utvinning av renset vWF.

Adsorpsjonen av faktor VIII/vWF-komplekset på kationebytteren skjer fortrinnsvis ved en saltkonsentrasjon i bufferen < 250 mM. Foretrukne adsorpsjonsbuffere oppviser derfor en saltkonsentrasjon fra 50 til 250 mM, spesielt i området fra 150 til 250 mM (f.eks. 150 mM). Ved en trinnvis heving av saltkonsentrasjonen i bufferen kan faktor VIII/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer, selektivt elueres ved en saltkonsentrasjon > 300 mM, fortrinnsvis > 350 mM. Faktor VIII/vWF-kompleks som inneholder lavmolekylære vWF-multimerer og proteolytiske vWF-spaltningsprodukter som foreligger i proteinoppløsningen og som har en lav spesifikk aktivitet med hensyn til vWF-aktiviteten, spesielt til ristocetin-kofaktor-aktiviteten, kollagenbindingsaktiviteten og den spesifikke blodplateagglutinasjonsaktivitet, samt fri faktor Vni:C, elueres fra kationebytteren og utvinnes eventuelt ved en saltkonsentrasjon mellom > 250 mM og < 300 mM, fortrinnsvis ved 300 mM. Denne fraksjon kan brukes for en ytterligere rensing av f. eks. faktor VIILC, som spesielt er fri for blodplateagglutinerende vWF-aktivitet.

Adsorpsjonen og desorpsjonen av faktor VIII/vWF kan utføres i en buffer som inneholder et ett- eller toverdig metallion som salt, hvor man fortrinnsvis anvender NaCl som salt.

I fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes en bufferoppløsning bestående av buffersubstanser, spesielt glycin, fosfatbuffer eller citratbuffer, og salt, som buffersystem for eluering av proteinene som er bundet på kationebytteren.

Elueringsbufferen kan ha en pH-verdi i området mellom 4,5 og 8,5, fortrinnsvis mellom

> 7,0 og < 8,5.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan utføres som batch-metode eller som søylekromatografi.

De optimale parametere, så som saltkonsentrasjon, pH-verdi og temperatur for utføring av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, er imidlertid hver avhengig av kationebyttermaterialet som brukes. Det ligger imidlertid innenfor fagmannens kompetanse å optimere betingelsene for gjennomføring av fremgangsmåten som tilveiebringes innen rammen for foreliggende oppfinnelse, for den bestemte kationebyttertype som skal brukes.

Med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen utvinnes og anrikes spesielt et faktor VIII/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer.

Den erholdte faktor Vni/vWF-kompleksfraksjon er i det vesentlige fri for lavmolekylære vWF-multimerer, vWF-fragmenter med lav spesifikk aktivitet og forurensende nukleinsyrer.

Som utgangsstoff for utvinning av renset faktor Vm/vWF-kompleks med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan hvilken som helst faktor Vlll-kompleks-holdig oppløsning brukes. Utgangsstoffer er spesielt biologiske materialer, såsom plasma, en plasmafraksjon, et kryopresipitat eller en supernatant eller et ekstrakt fra en rekombinant cellekultur.

Faktor Vffl/vWF-kompleks-holdige oppløsninger kan imidlertid også være anrikede proteinoppløsninger som er forhåndsrenset eller anriket ved et tidligere trinn, f. eks. gelfiltrasjon, anionebytterkromatografi, affinitetskromatografi eller en kombinasjon derav.

Ifølge en spesiell utførelsesform av fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen anvendes en faktor Vm/vWF-kompleks-holdig fraksjon som er blitt anriket over en anionebytter, som utgangsstoff. Under den påfølgende kationebytterkromatografi utføres deretter en rensing og separasjon av faktor VIII/vWF-kompleks som inneholder høymolekylære hhv. lavmolekylære vWF-multimerer. Det er imidlertid også mulig med andre kombinasjoner, såsom f. eks. affinitets/kationebytter-kromatografi, anionebytter/- affinitets/kationebytter-kromatografi, for å oppnå en anrikning og selektiv utvinning av faktor Vin/vWF med forbedret spesifikk aktivitet og stabilitet.

Med den ovenfor beskrevne fremgangsmåte ifølge oppfinnelsen blir faktor VIII/vWF med forbedret spesifikk aktivitet anriket flere ganger fra et urent faktor Vm/vWF-holdig materiale.

På grunn av at i prinsippet hvilket som helst biologisk materiale kan være forurenset med smittekimer, blir den utvunne faktor VIII/vWF-holdige fraksjon for fremstilling av et virussikkert preparat behandlet for å inaktivere hhv. utarme vimser. Med denne hensikt kan alle fremgangsmåter som er kjent i teknikkens stand, så som kjemisk/- fysikalske metoder, inaktivering ved kombinasjon av en fotoaktiv substans og lys, eller utarming ved filtrasjon, brukes. For inaktivering av vimser egner seg spesielt en varmebehandling i oppløsning hhv. i fast tilstand, hvilket på sikker måte kan inaktivere både lipidinnkapslede og ikke-lipidinnkapslede viruser. Virusutarming utføres fortrinnsvis ved filtrasjon over nanofilter.

Ifølge et ytterligere aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse renset faktor VIII/vWF-kompleks som angitt i krav 7 og som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer og som kan erholdes fra en faktor VIII/vWF-holdig oppløsning ved kationebytterkromatografi. Faktor VIII/vWF med hevet spesifikk vWF-aktivitet med fortrinnsvis minst 66 U/mg protein og hevet spesifikk faktor Vlll-aktivitet med fortrinnsvis minst 500 U/mg protein anrikes utgående fra et utgangsstoff som bl. a. inneholder faktor Vm/vWF med lav renhet og lav spesifikk aktivitet, og ledsagende proteiner, spesielt ikke bundet eller svakt bundet og dermed fri faktor Vm hhv. faktor Vlll-kompleks med lav vWF-aktivitet, utskilles selektivt. Dermed utvinnes et faktor VIII/vWF-kompleks som inneholder høymolekylære vWF-multimerer og i det vesentlige er fri for faktor Vffl-kompleks med lavmolekylære vWF-multimerer, vWF-spaltningsprodukter, ikke-kompleksdannet faktor VIII og eventuelt faktor Villa. Faktor VIII/vWF-komplekset ifølge oppfinnelsen oppviser på grunn av den selektive anrikning av høymolekylære vWF-multimerer, en forbedret blodplateagglutinasjonsaktivitet og en hevet stabilitet.

Faktor VHI/vWF-komplekset som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer, og som er fremstilt ifølge oppfinnelsen, kan benyttes i et renset preparat som i det vesentlige er fritt for blodplateagglutinerende vWF-aktivitet.

Ved utvinning og fremstilling av preparatet ifølge oppfinnelsen fra et utgangsstoff av plasmatisk eller rekombinant opprinnelse, utføres slik det ble beskrevet ovenfor, eventuelt en virusutarmings- eller inaktiveringsmetode for å fjerne smittende partikler, hvorved en virusinaktivering og/eller virusutarming i prinsippet kan utføres før eller etter hvert rensetrinn utgående fra utgangs stoffet til den produserte farmasøytiske sammensetning. Dermed er preparatet ifølge oppfinnelsen i hvert tilfelle virussikkert og fritt for smittende materiale.

Et ytterligere kriterium for renheten og en lav smitteevne av et produkt er også fraværet av forurensende nukleinsyrer. Preparatet ifølge oppfinnelsen er derfor i det vesentlige fritt for nukleinsyrer. "I det vesentlige" betyr her at innholdet av nukleinsyre er < 0,7 beregnet på forholdet 260/280 nm. Nukleinsyren kan imidlertid også kvantifiseres i henhold til en fremgangsmåte som f.eks. beskrives i EP 0,714,987 og EP 0,714,988.

Ifølge et ytterligere trekk foreligger preparatet ifølge oppfinnelsen i en lagerstabil form. Preparatet som inneholder renset faktor VIII/vWF med forbedret spesifikk vWF-aktivitet, kan tilveiebringes i form av en ferdig oppløsning, et lyofilisat eller dypfrosset. På grunn av preparatets renhet, er det spesielt stabilt. Det har vist seg at preparatet ifølge oppfinnelsen er stabilt i minst 6 måneder ved -20°C, i minst 4 uker ved 4°C i oppløsning, og i minst 1 år som lyofilisat. Det viste seg at faktor VIII/vWF-aktiviteten nedsettes med maksimalt 10% i løpet av de nevnte tidsrom, og at multimermønstret av vWF-multimerene ikke oppviser noen vesentlige endringer.

Formuleringen av preparatet ifølge oppfinnelsen kan utføres på i og for seg kjent og vanlig måte. Den rensede faktor VIII/vWF som foreligger i preparatet ifølge oppfinnelsen, blandes med en buffer som inneholder salter såsom NaCl, trinatriumcitratdihydrat og/eller CaCk, og aminosyrer så som glycin og lysin, ved en pH-verdi i området 6-8, og formuleres som farmasøytisk preparat.

Preparatet kan brukes ved fremstilling av et legemiddel for behandling av pasienter med hemofili, fenotypisk hemofili og vWD.

I henhold til et ytterligere trekk vedrører foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte ved fremstilling av et faktor VIII/vWF-komplekspreparat fra plasma eller en plasmafunksjon, hvilken fremgangsmåte kjennetegnes ved at plasma eller en plasmafraksjon bringes i berøring med en kationebytter, hvorved faktor VIII/vWF-komplekset adsorberes, at kationebytteren som er ladet med faktor VIII/vWF-kompleks, eventuelt vaskes og faktor VIII/vWF-komplekset deretter elueres, hvorved man erholder et eluat med en minst 300-foldig renhet med hensyn til faktor VIII/vWF-komplekset og et utbytte av faktor VIII/vWF-kompleks på minst 50% i forhold til plasma, og at det erholdte eluat til slutt opparbeides til et faktor Vin/vWF-kompleks-preparat.

På overraskende måte oppdaget man innen rammen for foreliggende oppfinnelse at faktor VIII/vWF-komplekset kan tilveiebringes i høy renhet og samtidig med høyt utbytte, ved kationebytterkromatografi utgående fra plasma eller en plasmafraksjon.

Som plasmafraksjon brukes f.eks. et kryopresipitat, eventuelt etter en tidligere adsorpsjonsbehandling for fjerning av protrombin-kompleks, eller en Cohn-fraksjon.

Fremgangsmåten egner seg ypperlig til rensing av faktor Vlll-kompleks fra en plasmafraksjon i industriell skala, fordi den virksomme rensing gjør det unødvendig med et flertall ytterligere rensetrinn, f. eks. ytterligere kromatografiske rensetrinn. Det har på overraskende måte vist seg at faktor Vm-komplekset kan erholdes med en minst 300-ganger større renhet i forhold til plasma, fortrinnsvis minst 400-ganger større renhet, ved den enkle kationebytterkromatografi, med et samtidig høyt utbytte på minst 50%, fortrinnsvis minst 60%, i forhold til plasma. Det foretrekkes derfor å utføre rensemetoden slik at det kun utføres med én eneste kromatografisk rensing, nemlig rensingen på kationebytteren. Denne kromatografiske rensing utføres som regel som endelig rensetrinn før faktor Vlll-komplekset formuleres til et farmasøytisk preparat.

Vanligvis påføres utgangsstoffet på kationebytteren i en kalsiumholdig buffer. Umiddelbart før påføringen lønner det seg også å ta forholdsregler for inaktivering av eventuelt foreliggende viruser, så som humanpatogene viruser, som kan overføres via blod. I denne sammenheng foretrekkes en behandling med en viricid detergens hhv. et organisk løsemiddel og/eller detergens. En behandling med Triton eller Tween i nærvær av TNBP (tri(n-butyl)fosfat) utføres f.eks. i henhold til EP 0,131,740. Under den påfølgende kationebytterkromatografi fjernes det virucide middel effektivt. Hvis det adsorberte kompleks skal vaskes, utføres denne vasking fortrinnsvis med en vaskebuffer hvis ionstyrke er høyere enn ionstyrken av adsorpsjonsbufferen, f. eks. 10-30% høyere. For eluering av faktor VIII/vWF-komplekset heves fortrinnsvis ionstyrken ytterligere. Elueringen av faktor VIII/vWF-komplekset oppnås ved heving av ionstyrken, som fortrinnsvis er minst 50%, mest foretrukket minst 100% høyere enn ionstyrken av utgangsoppløsningen. Elueringsbufferen inneholder fortrinnsvis natriumklorid. For formulering av et farmasøytisk faktor Vm/vWF-kompleks-preparat utføres vanligvis diafiltrasjon og sterilfiltrasjon samt eventuelt lyofilisering.

Aktiviteten av faktor VEI hhv. vWF forstyrres nærmest ikke av kationebytterkromatografien. Det har vist seg at det sikres et utbytte av faktor VIII-komplekset på over 90% beregnet på aktiviteten før kromatografien. Derfor kan man under den kromatografiske rensing også unnvære de vanlige stabilisatorer for faktor VIII, så som f. eks. antitrombin III og/eller heparin.

I motsetning til fremgangsmåter som er kjent innen teknikkens stand, hvor kationebytterkromatografien alltid er blitt tatt i betraktning kun for allerede rensede faktor Vm/vWF-kompleks-preparater (jfr. EP 0,600,480-A2), har det ifølge oppfinnelsen vist seg at kationebytterkromatografi egner seg utmerket til en direkte rensing av faktor VIII/vWF-kompleks fra plasma eller en (rå) plasmafraksjon. Med en slik fremgangsmåte er det ikke engang nødvendig å bruke ytterligere kromatografiske metoder for fremstilling av et faktor Vni/vWF-kompleks-preparat, fordi renheten som oppnås ved kationebytterkromatografi utgående fra plasma eller en plasmafraksjon, allerede oppfyller kravene til kommersielle faktor VIII/vWF-kompleks-preparater.

Oppfinnelsen skal beskrives nærmere ved hjelp av de følgende eksempler og de vedlagte tegninger. Figur 1 viser en vWF-multimer-analyse av faktor VIII/vWF-kompleks fra kryopresipitat før og etter rensing med kationebytter. Figur 2 viser en vWF-multimer-analyse av faktor VIII/vWF-kompleks fra kryopresipitat før og etter rensing ved hjelp av kombinert anione/kationebytterkromatografi. Eksempel 1 beskriver rensingen av plasmatisk faktor Vm/vWF-kompleks ved kationebytterkromatografi og trinnvis eluering; eksempel 2 beskriver rensing av faktor VIII/vWF-kompleks ved kombinasjon av anione/kationebytterkromatografi og trinnvis eluering fra kationebytteren; eksempel 3 beskriver rensing av rvWF/rfaktor VIII-kompleks ved hjelp av kationebytter; og eksempel 4 beskriver isoleringen av faktor VIII/vWF-komplekset ved kationebytte.

Eksempel 1:

Rensing av plasmatisk FVIII-kompleks ved kationebytterkromatografi

Kryopresipitat fra humant plasma ble løst opp i natriumacetatbuffer, pH 7, og det ble satt til 20 enheter heparin pr. ml oppløsning. Pr. 1 g kryopresipitat ble det satt til 0,25 ml 2% Al(OH)3-suspensjon, og det hele ble inkubert i 30 minutter. Deretter ble det hele sentrifugert i 20 minutter ved 10.000 rpm for å gi et kryopresipitat uten sløring.

En kromatografisøyle ble fylt med "Fractogel" EMD-S03 og skylt med buffer (30 mM glycin-NaCl-buffer). Deretter ble oppløst kryopresipitat filtrert gjennom kationebytter-søylen, og i den gjennomstrømmede fraksjon erholdt man slike proteiner som ikke bindes på kationebytteren (fraksjon 1). Uspesifikt bundne proteiner ble fjernet ved skylling av søylen med 0,3 M NaCl i buffer (fraksjon 2). Deretter ble FVm/vWF-kompleks eluert fra kationebyttersøylen ved eluering med 0,4 M hhv. 0,5 M NaCl (fraksjon 3 hhv. fraksjon 4).

Fra tabell 1 er det synlig at både vWF og FVin bindes av kationebytteren. Ved skylling av kationebyttersøylen med 0,3 M NaCl (fraksjon 2), erholdes ingen vWF-aktivitet og kun 10% av FVIII-aktiviteten. Med dette elueringstrinn ble FVIII som ikke forelå i form av et kompleks med funksjonelt aktivt vWF, fjernet. Ved en påfølgende desorpsjon med 0,4 M NaCl (fraksjon 3) erholdt man FVIII/vWF-kompleks som inneholdt ca. 20% av det funksjonelt aktive vWF og ca. 30% av den samlede mengde FVIII. Resten av FVIII - komplekset ble deretter eluert fra kationebytteren med 500 mM NaCl (fraksjon 4). Fraksjon 4 inneholdt faktor Vm/vWF-kompleks som inneholdt 80% av vWF-aktiviteten og 50% av FVIII-aktiviteten som forelå i kryopresipitatet. Ved kationebytterkromatografien oppnådde man en 20-gangers rensing av FVIII (spesifikk aktivitet: 12IU FVIILC pr. mg protein) i forhold til kryopresipitatet, hhv. en 350-gangers rensing av FVIII i forhold til plasma (fraksjon 4). Fra fraksjon 3 kan FVHI utvinnes.

Figur 1 viser vWF-multimeranalysen av faktor VIII/vWF-kompleks før og etter rensing med kationebytter, hvor spor A viser vWF-multimermønstret av kryopresipitatet, spor B av 300 mM NaCl-eluatet (fraksjon 2, tabell 1), spor C av 400 mM NaCl-eluatet (fraksjon 3, tabell 1) og spor D av 500 mM-eluatet (fraksjon 4, tabell 1). Av figur 1 fremgår at kationebytterkromatografi gir et faktor VIII/vWF-kompleks med høymolekylær vWF-multimerstruktur. Faktor VIII/vWF-kompleks som inneholder lavmolekylære vWF-multimerer, bindes enten ikke til kationebytteren (fraksjon 1), eller det fjernes ved elueringen med 0,3 M NaCl (fraksjon 2).

Eksempel 2:

Rensing av plasmatisk FVTQ/vWF-kompleks ved kombinasjon av anione/- kation ebytterkromatografi

Kryopresipitat fra humant plasma ble løst opp i en buffer av 7 mM Tris, 100 mM Na-acetat, 100 mM lysin, 120 mM NaCl ved pH 6,7. Som forhåndsbehandling ble Al(OH)3 rørt inn. Deretter ble felningen fjernet ved sentrifuger ing.

Kryopresipitat som var blitt forhåndsbehandlet på denne måte, ble ført på en "Fractogel" EMD-TMAE-søyle. Ikke bundne proteiner ble erholdt ved å skylle søylen med opp-løsningsbuffer (fraksjon 1). Denne fraksjon 1 inneholdt 60% av vWF-aktiviteten, men kun 10% av FVIII-aktiviteten. Ved eluering av søylen med 400 mM NaCl (fraksjon 2), erholdt man deretter FVIII/vWF-kompleks. Fraksjon 2 inneholdt resten av vWF-aktiviteten og 70% av FVIII-aktiviteten utgående fra kryopresipitatet. FVin/vWF-komplekset i fraksjon 2 ble fortynnet 4-foldig med 20 mM glycin/NaCl-buffer og deretter påført på en "Fractogel" EMD-S03-kationebyttersøyle. Ikke-bundne proteiner ble erholdt i fraksjon 1. Svakt bundne proteiner ble fjernet ved skylling av søylen med 200 mM NaCl (fraksjon 2). Deretter ble det eluert trininvis med 400 mM NaCl (fraksjon 3) og 500 mM NaCl (fraksjon 4). I fraksjonene 3 og 4 fant man 45% av vWF-aktiviteten og 55% hhv. 40% av FVIII-aktiviteten.

Fra tabell 3 fremgår at både vWF og FVIII bindes på kationebytteren. Ved skylling av kationebyttersøylen med 0,2 M NaCl (fraksjon 2), fant man ingen aktiv vWF og ingen FVIII. FVIII/vWF-komplekset ble deretter eluert i fraksjonene 3 og 4.

Mens den spesifikke aktivitet avFVIILC i kryopresipitatet var 0,59 U/mg, er den spesifikke aktivitet avFVIILC i fraksjonene 3 og 4 henholdsvis 500 U/mg protein og 477 U/mg protein. Den spesifikke aktivitet av vWF steg fra kryopresitatet fra 0,6 U/mg protein til 66 U/mg protein og 83 U/mg protein i henholdsvis fraksjon 3 og 4.

Figur 2 viser vWF-multimeranalysen av faktor VIII/vWF-kompleks før og etter rensing med kombinert anione/kationebytterkromatografi, hvor sporene a til c viser kromatografien på anionebytteren, og sporene d til g på kationebytteren. Fig. 2 viser i spor a vWF-multimer-mønstret av kryopresipitatet, spor b av den gjennomstrømmede fraksjon (fraksjon 1, tabell 2), spor c av 400 mM NaCl-eluatet (fraksjon 2, tabell 2), spor d av 400 mM-eluatet (fraksjon 2, tabell 2) før kationebytteren, spor e av 200 mM NaCl-eluatet (fraksjon 2, tabell 3), spor f av 400 mM NaCl-eluatet (fraksjon 3, tabell 3) og spor g av 500 mM NaCl-eluatet (fraksjon 4, tabell 3).

Eksempel 3:

Rensing av et r-vWF/r-FVIII-kompleks ved kationebytterkromatografi

1000 ml av en cellekultursupernatant som inneholdt rekombinant rFVIII/rvWF-kompleks, ble påført på en søyle som var fylt med 20 ml "Fractogel" TSK-S03. Etter vasking av søylen med buffer, pH 7,4, med 250 mM NaCl, ble det bundne rFVIII/rvWF-kompleks eluert med en buffer, pH 7,4, med 600 mM NaCl. I tabell 4 vises resultatene av dette søylegjennomløp.

Eksemplet viser at et kompleks som består av rekombinant FVIII og rekombinant vWF (som vanligvis opptrer under fermentasjon av rekombinant FVIII), bindes på en kationebytter og kan elueres selektivt og adskilt fra ledsagende proteiner ved å heve saltkonsentrasjonen.

I eksemplet erholdt man et rFVIII/rvWF-kompleks med den spesifikke FVIII-aktivitet 130 U/mg protein i et utbytte på 75%. Dette tilsvarer en rensefaktor 28 for dette trinn. Den spesifikke aktivitet av r-vWF er sterkt avhengig av kvaliteten av den eksprimerte r-vWF. I dette tilfelle var den 7 U/mg i eluatet, hvilket tilsvarer rensefaktoren 35.

Ved variasjon av rFVIII/rvWF-forholdet i startvæsken, eller ved å følge opp med et ytterligere kromatografisk skritt, kan den spesifikke aktivitet av FVIII:C forbedres enda ytterligere.

Eksempel 4:

Isolasjon av FVni/vWF-komplekset ved kationebytting

Eksempel 4A:

210 g kryopresipitat løses opp i 950 ml CaCk-heparinholdig citratbuffer og justeres til pH 6,0. Uoppløselige andeler, hovedsaklig fibrinogen, ble fjernet. For inaktivering av eventuelt foreliggende patogene viruser ble den klare oppløsning behandlet med 1% Triton XI00 og 0,3% TNBP (tri(n-butyl)fosfat. 100 ml "Fractogel" EMD-SO3"-650(M) fra firma Merck, Darmstadt (DE), ble brukt for adsorpsjon av det virus-inaktiverte FVIII, som på forhånd var blitt ekvilibrert ved pH 6,0 i en acetatbufret NaCl-oppløsning med ledeevnen 10 mS/cm. FVHTet ble eluert fra gelen ved heving av ionstyrken til 500 mM NaCl; før dette ble det gjennomført en vasking med 500 ml 150 mM NaCl-oppløsning.

Eksempel 4B:

Istedenfor "Fractogel" EMD-SO3" brukte man i dette eksempel Toyopearl SP-550C.

Resultater:

FVIIIc og FvWF ble utvunnet i samme fraksjon.

Claims

1. Fremgangsmåte ved utvinning av faktor VIII/vWF-kompleks, karakterisert ved at faktor VIII/vWF-kompleks fra en proteinoppløsning bindes på en kationebytter, og faktor VIII/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer, utvinnes ved en trinnvis eluering idet faktor VIII/vWF-komplekset bindes på en kationebytter ved en saltkonsentrasjon < 250 mM, og faktor VIII/vWF-komplekset som inneholder lavmolekylære vWF-multimerer, faktor VHI som mangler blodplateagglutinerende vWF-aktivitet, og faktor VIILC elueres og utvinnes ved en konsentrasjon mellom > 250 mM og < 300 mM og hvor faktor VM/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer, utvinnes ved en trinnvis fraksjonering ved en saltkonsentrasjon > 300 mM, fortrinnsvis > 350 mM.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det utvinnes en faktor VIII/vWF-kompleks-holdig fraksjon som spesielt er fri for lavmolekylære vWF-multimerer og vWF-spaltningsprodukter, faktor VEI som er ikke-kompleksdannet eller er svakt bundet til vWF, og forurensende nukleinsyrer.

3. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-2, karakterisert ved atelueringenavpolypeptidenefra kationebytteren utføres i et buffersystem med en pH-verdi i området fra 4,5-8,5, fortrinnsvis > 7,1 og < 8,5.

4. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-3, karakterisert ved at kationebytteren er en sulfopropyl- eller karboksymetyl-gruppe-konjugert bærer.

5. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-4, karakterisert ved at det utvinnes et faktor VIII/vWF-kompleks som spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer.

6. Fremgangsmåte ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at faktor VIII/vWF-kompleks utvinnes fra plasma, en plasmafraksjon, et kryopresipitat, en cellefri supernatant eller et ekstrakt fra en rekombinant cellekultur, eller en anriket proteinfraksjon.

7. Faktor VIII/vWF-kompleks fremstilt ved fremgangsmåten ifølge krav 1-6, karakterisert ved at komplekset spesielt inneholder høymolekylære vWF-multimerer og som kan erholdes fra en faktor VM/vWF-holdig oppløsning ved kationebytterkromatografi, idet den spesifikke vWF-aktiviteten av faktor Vin/vWF-komplekset er minst 66 U/mg protein og den spesifikke faktor Vni-aktiviteten er minst 500 U/mg protein..

8. Faktor VHI/vWF-kompleks ifølge krav 7, karakterisert ved at det spesielt er fritt for lavmolekylære vWF-multimerer, inaktive vWF-spaltningsprodukter og faktor VTfl som er fri for blodplateagglutinerende vWF-aktivitet og for faktor Vllla-aktivitet.

9. Preparat som inneholder faktor VIII/vWF-kompleks ifølge et av krav 7, karakterisert ved at det er virussikkert og fritt for smittende materiale.

10. Preparat ifølge krav 9, karakterisert ved at det foreligger i lagerstabil form.

11. Preparat ifølge et av kravene 9 eller 10, karakterisert ved at det er formulert som farmasøytisk preparat.

12. Anvendelse av et preparat ifølge et av kravene 9 til 11 ved fremstilling av et legemiddel for behandling av pasienter med hemofili A, fenotypisk hemofili og vWD.