NO318814B1 - Liposomsammensetninger, dehydrerte unilamellaere liposomer og fremgangsmater derav. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot fusogene liposomer og fremgangsmåter for kontrollering av fusjonen til liposomene til andre lipid bilag.

Liposomer er selv-sammenstillende strukturer som omfatter en eller flere bilag av amfipatiske lipidmolekyler som hver inneholder et indre vandig volum. De amfipatiske lipidmolekylene som danner lipid bilagene omfatter en polar (hydrofil) hodegruppe region kovalentlig koblet til en eller to upolare (hydrofobe) acylkjeder. Det antas at den energetiske ugunstige kontakten mellom hydrofobe acylkjeder og den vandige oppløsningen som omgir lipid molekylene forårsaker at de blir rearrangert slik at de polare hodegruppene er orienterte mot den vandige oppløsningen, mens acylkj edene er orientert mot det indre bilaget. Nettoresultatet er en energetisk stabil lipidbilagsstruktur som omfatter to motstående monolag hvor acylkjedene er effektivt beskyttet fra å komme i kontakt med det vandige mediet.

Liposomer kan bli produsert ifølge forskjellige metoder. Metoden til Bangham (J. Mol. Biol. 13:238-252 (1965)) produserer "ordinære" multilamellære liposomer (MLV). "Ordinære" MLV kan ha ulik oppløst produktfordeling blant deres vandige rom og derved osmotisk stress mellom rommene. Lenk et al. (US-PS 4.533.803, 5.030.453 og 5.169.637), Fountain et al. (US-PS 4.588.578) og Cullis et al. (US-PS 4.975.282) beskriver fremgangsmåter for produsering av multilamellære liposomer som har vesentlig lik fordeling av et innesluttet oppløst stoff i hver av deres vandige rom, dvs. vesentlig lik interlamellær oppløst produktfordeling. Det å ha vesentlig lik interlamellær oppløst produktfordeling betyr at det vil være mindre osmotisk stress blant de vandige rommene til disse MLV og vil derfor generelt være mere stabile enn vanlig MLV. Unilamellære liposmer kan bli produsert fra MLV ved sonikering (se Paphadjopolous et al. (1968)) eller ekstrusjon (Cullis et al. (US-PS 5.008.050) og Laughrey et al. (US-PS 5.059.421)).

Liposomer kan bli belastet passivt med bioaktive midler, dvs. ved oppløsning av molekylet i medium hvor liposomene blir dannet, når det gjelder vann-oppløselige midler, eller tilsetning av lipid-oppløselige midler til lipidoppløsningene som liposomene blir dannet fra. Ioniserbare bioaktive midler kan også bli belastet i liposomer ved å etablere en elektrokjemisk potensiell gradient over liposommembranen og deretter tilsette middelet til mediet i det ytre av liposomet (se Bally et al., US-PS 5.077.056).

Medikamenter innesluttet i liposomene kan ha en forsterket terapeutisk indeks ved redusering av toksisiteten, øke effektiviteten eller begge. Liposomer blir som andre partikkelformige materialer i sirkulasjon, tatt opp av fagocytiske celler i det retikuloendoteliske systemet i vev som har sine sinusoidale kapillærer, og er følgelig ofte rettet mot seter med intracellulære infeksjoner.

Fusjon av biologiske membraner er en nøkkelprosess i forskjellige cellulære transportfunksjoner, inkludert endocytose, fertilisering og intracellulær trafikkering av proteiner. Fusjon av liposomene med celler er definert som forening av det ytre bilaget til liposomer med plasmamembranen til cellen (se Huang (1983)). For at fusjonen skal oppstå må lipidene i det ytre lipidbilaget bli blandet med lipidene til cellens plasmamembran. Den foreslåtte mekanismen hvorved fusjonen oppstår mellom lipidmembraner involverer nøytralisering av ladede hodegrupper og resulterer i en effektiv forandring i geometrien til lipidartene som produserer ikke-bilags-foretrukne strukturer. Disse gir igjen opphav til miceller eller andre defekter i bilaget som virker som kjemedannende seter for membranfusjon (Cullis and Hope (1978)).

Studier som anvender liposomer har demonstrert en korrelasjon mellom tendensen som liposomene har til å fusjonere og even som komponentlipidene har til å bli tilpasset ikke-bilags faser, så som heksagonal Htj fasen som fører til antagelsen om at ikke-bilagsstrukturer, inverterte miceller eller andre bilagsdefekter er intermediære strukturer i fusjonsheneldser (se for eksempel Cullis et al. (1978)). Lipidsammensetningen antas å bidra til tendensen som liposomene har til å innta ikke-bilagsstrukturer (se for eksempel Martin and MacDonald (1976); Martin and MacDonald (1976); Weismann et al.

(1977)). Membraner inneholdende negativt ladede fosfolipider (for eksempel fosfatidinsyre (PA), fosfatidylserin (PS), osv.) er blitt vist å fusjonere i nærvær av divalente kationer så som Ca<++> (Hope et al. (1983)). Syntetiske kationiske lipider har blitt vist å gjennomgå fusjon ved anvendelse av høye konsentrasjoner av negativt ladede motioner (Dilzgiines et al. (1989)). Umettede diglycerider antas også å være potente fusogener (Das and Rand (1986)). Uladede lipider antas å lettere kunne bli tilpasset ikke-bilagsstrukturer og følgelig være mer fusogene enn deres ladede former (se for eksempel Gruner et al. (1985)).

Kationiske lipider har vist seg å være nyttige for å øke effektiviteten til pattedyrcelletransfeksjonen (se for eksempel Malone et al. (1989); Konopka et al.

(1991)). Utvidelse av disse anvendelsene til in vivo levering av liposomalt innkapslede materialer har ført til problemer med cellulær toksisitet, hemolyse og aksellererte koaguteringsresponser forårsaket av kationiske lipider (Senior et al. (1991)). Disse effektene ser ut til å oppstå over en terskelverdi med positiv ladning, og ser ikke ut til å være avhengig av naturen til de kationiske artene. Til tross for at de toksiske effektene til kationiske arter er utfordret av syntese av nye kationiske hodegrupper ser ut til at de stort sett ikke er løste. De potensielle anvendelsene av disse lipidene for å målsøke medikamentlevering gjør reduksjon av de toksiske bivirkningene, ved å redusere kationisk konsentrasjon, og evne til å kontrollere den fysogene naturen in vivo til disse forbindelsene, ønskelig.

Fusjonen mellom vesikkel populasjoner som bærer motsatte ladninger er også blitt demonstrert (Stamatatos et al. (1988)). Kontrollert fusjon av liposomer ved anvendelse av indusert lipid asymmetri er tidligere blitt vurdert (Eastman et al. (1991); Eastman et al. (1992); Redelmeier et al. (1990)). Disse referansene er derimot rettet mot anvendelse av anioniske ioniserbare lipider og pH gradienten anvendt for å transportere det anioniske lipidet er motsatt av det for belastning av kationiske medikamenter inn i liposimene (se Bally et al., US-PS 5.077.056). Kontrollert fusjon av disse medikament-belastedede liposomene kan bli bedre oppnådd ved et analogt fusogent kationisk lipid.

Fusjon av liposomer med biologiske membraner kan levere innholdet av liposomene inn i cellene. Injeksjon av det vandige innholdet av liposomene inn i cytoplasma er blitt vist ved fluorescens deavstengning av karboksyfluorescein (Weinstein et al. (1977); Huanget al. (1978). Andre rapporter har vist at biologiske aktive mateiraler (for eksempel cAMP, ricin, aktin og mycin D, Ca<++>, mRNA og vimser og virale genomer) inkorporert inn i liposomene kan bli introdusert inn i det indre av cellene (se for eksempel Paphadjopoulos et al. (1974); Dimitriadis and Butters (1979); Theoharides and Douglas

(1978); Ostro et al. (1978); Dimitriadis (1978); Wilson et al. (1979); Fraley et al.

(1980)) ved fusjon mellom liposomale lipid bilag og cellulære membraner. Andre studier har derimot foreslått at fusjonen ikke er en hovedmekanisme for liposomale interaksjoner med cellene (se for eksempel Szoka et al. (1980); Hagins and Yoshikami

(1982); Pagano and Takeichi (1977)).

Innholdet av ovennevnte publikasjoner er inkorporert heri som referanse. Ingen av disse publikasjonene beskriver en liposomsammensetning inneholdende et liposom som har et ioniserbart, kationisk lipid og en transmembran pH gradient, og beskriver heller ikke anvendelse av en slik gradient for å kontrollere trans bilagsfordelingen og følgelig det fusogene potensialet til det ioniserbare lipidet.

Foreliggende oppfinnelse omfatter en liposomsammensetning omfattende:

a) et unilamillært liposom med:

i) et bilag som omfatter et bilag som danner fosfatidylkolin og

mellom 1 molprosent og 20 molprosent av et ioniserbart lipid valgt fra gruppen bestående av l-N,N-dimetylaminodioleoylprpan (AL-1), ±-1-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymetrisk ±-1,2-diacyl-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-3 - AL-5) og ±-l,2didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6); og

ii) et indre rom som omfatter en vandig løsning med en første pH; og

b) en vandig løsning utenfor liposomet med en andre pH, hvor den første pH er lavere enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget og den andre pH er

høyere enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget, hvorved det er en pH-gradient over bilaget, og hvorved det ioniserbare lipidet akkumuleres i bilagets indre monolag.

Liposomet kan være et unilamellært liposom og det unilamellære liposomet er fortrinnsvis et stort unilamellært liposom. Liposomet kan også være et multilamellært liposom og det multilamellære liposomet omfatter fortrinnsvis et oppløst produkt innesluttet i dets vandige rom, hvori konsentrasjonen av det oppløste produktet i hver av de vandige rommene til det multilamellære liposomet er vesentlig like. Den indre vandige oppløsningen i liposomet er fortrinnsvis en vandig buffer, mere foretrukket en vandig buffer som har en pH på omtrent 4.0. Vandig pH 4,0 buffer er fortrinnsvis en sitratbuffer.

Den fusjonsfremmende effektive mengden av det ioniserbare lipidet er vanligvis en mengde som er tilstrekkelig for å etablere en konsentrasjon av det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget til liposomet på fra omtrent 1 molprosent av ioniserbart lipid til omtrent 20 molprosent; fortrinnsvis innenfor dette området er den foretrukne fusjonsfremmende effektive mengden av det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget i en mengde som er tilstrekkelig for å etablere en konsentrasjon av det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget på fra omtrent 5 molprosent til omtrent 10 molprosent av ioniserbart lipid.

Den vandige oppløsningen i det ytre for liposomet er den vandige buffer som har en pH som er større en pKa til det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget. Når det ioniserbare lipidet er AL-1 er pH til den ytre vandige bufferen omtrent 7,5. Liposomet kan videre omfatte et nøytralt, ikke-bilag-foretrukkende lipid, for eksempel, dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE). Lipsomet kan omfatte et biologisk aktivt middel som vanligvis er en nukleinsyre, et anti-mikrobielt middel, et anticancer middel eller et anti-inflammatorisk middel. Den vandige oppløsningen i det ytre for liposomet kan være en farmasøytisk akseptabel vandig oppløsning, og liposom sammensetningen kan være en farmasøytisk sammensetning.

Opprinnelsen omfatter også et dehydrert unilamellært liposom med et bilag omfattende et bilag-dannende fosfatidylkolin og mellom 1 molprosent og 20 molprosent av et ioniserbart lipid valgt fira gruppen bestående av 1 -N,N-dimetylaminodioleoylpropan (AL-1), ±-l-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymmetrisk-*-1,2-diacyl-3-N, N-dimetylaminopropan (AL-3 - AL-5) og ±-l,2-didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6), der det ioniserbare lipidet akkumuleres i bilagets indre monolag. ;Videre omfatter oppfinnelsen in vitro fremgangsmåte for kontroll av fusjonen av et liposom til et andre lipidlag som omfatter ;(a) å fremstille liposomet med et bilag-dannende fosfatidylkolin, et ioniserbart lipid valgt fra gruppen bestående av 1-N,N-dimetylaminodioleoylpropan (AL-1), ±-l-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymmetrisk-±-l,2-diacyl-3-N,N-dimetylaminopropan (AL3 - AL-5) og ±-1,2-didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6) og en vandig løsning med en pH som er lavere enn det ioniserbare lipidets pKa i bilaget, slik at det ioniserbare lipidet omfatter fra 5 molprosent til 20 molprosent av bilaget og den vandige løsningen er både innvendig og utvendig for det resulterende liposomet; (b) å øke pH til den vandige løsningen utvendig for liposomet over pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget, hvorved der er en pH-gradient over bilaget og hvorved det ioniserbare lipidet akkumuleres i bilagets indre monolag; og (c) å forårsake degradering av pH-gradienten slik at pH til den innvendige vandige løsningen er høyere enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget. ;Liposomet anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte et biologisk aktivt middel som vanligvis er en nukleinsyre, et anti-mikrobielt middel, et anti-cancer middel eller anti-inflammatoriske middel. Det andre lipid bilaget som liposomet er fusjonert til på en kontrollert måte er fortrinnsvis plasmamembranen til en celle, fortrinnsvis plasmamembranen til en pattedyrcelle. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en in vitro fremgangsmåte for å introdusere et biologisk aktivt middel inn i en celle som omfatter fremstilling av et liposom som omfatter middelet i en vandig oppløsning slik at den vandige oppløsningen er i det indre og ytre for liposomet. Liposomet omfatter et ytre lipid bilag som omfatter et nøytralt, bilags-foretrukket lipid og et ioniserbart lipid som har en kationisk hodegruppe og umettede acylkjeder. pH til den indre vandige oppløsningen er mindre enn pKa til det ioniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget. pH til det ytre vandige mediet blir øket over pKa til det ioniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget slik at det er en pH gradient over det ytterste lipid bilaget og det ioniserbare lipidet blir deretter akkumulert i det indre monolaget til det ytterste lipid bilaget. pH til den indre vandige oppløsningen blir øket over pKa til det ioniserbare lipidet i det ytterste lipidbilaget cellen bringes i kontakt med liposomet. Cellen er fortrinnsvis en pattedyrcelle. ;Den foreliggende oppfinnelsen er rettet mot liposomer som fusjonerer lettere med plasmamembraner. Disse liposomene inneholder umettede acylkjede-ioniserbare lipider med 1 til 4 dobbeltbindinger. Det er funnet at disse karakteristika letter fusjonen og kombinasjonen av liposombilaget med plasmamembranen til mammalske celler. Disse liposomene har en uventet fusjonseffektivitet på grunn av ufullkommenheter i dobbeltlaget som følge av den ikke-parallelle strukturen til umettede acylkjeder i dobbeltlaget. Ved å forårsake en mindre tettpakket orientering av molekyler sikrer kjeder at en lavere energimengde er nødvendig for å ødelegge dobbeltlaget med molekyler fra dobbeltlaget til cellemembranen hvor fusjon ønskes (se side 9 i beskrivel-sen). ;I tillegg beskriver den foreliggende søknaden at de liposomer som inneholder lipider med kationiske titrerbare hodegrupper har økt fusjonseffektivitet med andre lipiddobbeltlag. I slike liposomtyper er det mulig å anvende pH for å konsentrere det ønskede kationiske lipid på innsiden av lipiddobbeltlaget for å fremme enkel lading/fylling med kationiske, lipofile biologisk aktive midler. Det er så mulig å endre pH-gradienten (for eksempel ved å gi liposomet til et levende system med pH omkring 6,7) slik at lipidet deprotoneres og distribueres jevnt (omkring 50/50 i hvert monolag av det ytre dobbeltlaget). Dette beskytter liposomet fra mulig opsonisering og gjør det mer fusogent. Det har blitt vist at dette vesentlig øker liposomal fusjon med andre dob-beltlag. ;KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE ;Figur 1. (A) Kalibrering av TNS fluorescens for EPC/Chol liposomer inneholdende 0-10 molprosent Al-1. X-akse: molprosent AL-1; y-akse: fluorescens. Feilkolonner er mindre enn symbolene hvor ikke indikert. (B) Fluorescens spor som viser effekten av en pH gradient og 10 molprosent AL-1 på TNS fluorescensen til EPC/Chol (55:45) liposomer. Liposomene ble dannet med 0 molprosent AL-1 (lavere spor) eller 10 molprosent AL-1 (øvre spor). Indre buffer var enten 300 mM sitrat, pH 4,0 (lavere spor) eller 20 mM HEPES buffer, pH 7,5 (øvre spor), x-akse: tid (sekunder); y-akse: fluorescens. Figur 2. Effekt av pH på fluorescensen til EPC/Chol (55:45) liposomer. Viste data representerer gjennomsnittsverdiene fra duplikate eksperimenter og feilkolonnene er mindre enn symbolene dersom ikke annet er angitt. Stiplet linje er invertert første derivat av titreringskurven og det maksimum indikerer en pKa på 6,7 for AL-1 i lipid bilaget, x-akse; pH; y-akse; <%>^<Å>max-Figur 3. Effekt av 0 og 10 molprosent AL-1 på fusjonen av EPC/Chol (55:45) liposomer og EPC/DOPE/Chol (30:25:55) liposomer ved RET flurescens probefortynning. Data vist er forskjellige spor av kjøringer med, og uten, spredning av pH gradient, hvor ^rnax ^e bestemt ved tilsetning av Triton X-100 til en sluttkonsentrasjon på 0,8 mM. x-akse; tid (sekunder); y-akse: fluroescens. Figur 4. Effekt av AL-1 konsentrasjon (0-20 molprosent) på en fusjon av EPC/Chol (55:45, mol/mol) liposomer ved RET fluroescens probe fortynning, x-akse: tid (sekunder); y-akse:fluorescens. Figur 5. 2ji_nmr spekteret av MLV dannet med 10 molprosent AL- l-d4 i EPC/Chol (55:45) i 100 mM ammoniumacetat ved pH 4,0 og pH 7,5. x-akse: frekvens (kHz). Figur 6. Effekt av DOPE konsentrasjonen på fusjonsratene til liposomene inneholdende AL-1. Fusjonsanalyser ble utført som beskrevet ovenfor, x-akse: tid (sekunder); y-akse, 0/oAF/AFmax-Figur 7. Fusjon av liposomer bestående av 0 og 5 molprosent AL-1 og EPC/Chol/DOPE (35:20:45, mol/mol).x-akse: tid (sekunder); y-akse:: %AF/AFmax-Figur 8. A: <2>H-NMR (x-akse: frekvens (kHz)), B:<31>P-NMR (x-akse: 8/ppm) spekter av fryse-tint MLV dannet med 5 molprosent AL-l-d4 i EPC/DOPE/Chol liposomer, buffret med 20 mM HEPES, 20 mM natriumacetat, 150 mM NaCl, ved pH 4,0 ogpH7,5. Figur 9. Effekt av aminolipid strukturen på fusjon av EPC/Chol/DOPE (35:20:45) liposomer ved RET fluorescens probefortynning. Spor (øverst-nederst), AL-1, AL-5, Al-4, AL-3, AL-6, AL-2 og blank, x-akse: tid (sekunder); y-akse: °</>o<AF/AF>max- ;Figur 10. Syntetiske aminolipidstrukturer. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en liposom sammensetning som omfatter et liposom med: (i) et ytre lipid bilag bestående av et nøytralt, ikke-bilags-foretrukket lipid og en fusjonsfremmende effektiv mengde av et ioniserbart lipid som omfatter en protonerbar, kationisk hodegruppe og en umettet acylkjede; (ii) et rom ved siden av det ytterste lipidbilaget som omfatter en vandig oppløsning ("indre vandig oppløsning") med en første pH. Sammensetningen omfatter også en vandig oppløsning i det ytre for liposomet som har en andre pH. Første pH er mindre enn pKa til det ioniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget og andre pH er større enn pKa til det ioniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget, hvorved det er en pH gradient over det ytterste lipid bilaget, og det ioniserbare lipidet blir akkumulert i det indre monolaget til det ytterste lipid bilaget i respons til pH gradienten. ;Liposomer er selv-sammenstillende strukturer som omfatter en eller flere lipid bilag hvor hver omgir et rom som omfatter en vandig oppløsning. Hvert bilag av liposomet blir dannet ved assosiasjon av amfipatiske lipidmolekyler slik at deres polare, hydrofile hodegrupper er orientert mot den omgivende vandige oppløsningen, mens de hydrofobe acylkjedene er orientert mot det indre av bilaget, og bort fra den omgivende vandige fasen. Lipid bilag har både indre og ytre monolag av lipidmolekyler. ;Unilamellært liposom har et lipidbilag og multilamellære liposomer har mer enn et ;lipidbilag. Liposomet anvendt i liposomsammensetningen ifølge oppfinnelsen kan være et unilamellært liposom, fortrinnsvis et stort unilamellært liposom (LUV). En LUV er et unilamellært liposom som har en diameter som er større enn omtrent 50 nm. Liposomet kan også være et multilamellært liposom (MLV), fortrinnsvis omfatter MLV et oppløst produkt innesluttet i dets vandige rom, hvori konsentrasjonen av det oppløste produktet i hvert av de vandige rommene er vesentlig like. Slike MLV har vesentlig lik interlamellær fordeling av oppløst produkt. Vanligvis har liposomene ifølge oppfinnelsen størrelser, målt ved deres diametre, på omtrent 5000 nm eller mindre. Liposomstørrelsen kan bli bestemt ved hjelp av teknikker, for eksempel, kvasi-elektrisk lysspredning, som er velkjent for fagfolk innenfor dette området og kan lett bli praktisert av disse. ;"Ytre lipid bilag" til et unilamellært liposom er enkelt lipid bilag til liposomet og i et multilamellært liposom er "ytterste lipid bilag" lipid bilaget i kontakt med den vandige oppløsningen utenfor liposomet ("ytre vandige oppløsning"). Liposomene kan bli dannet ifølge forskjellige metoder (se for eksempel Cullis et al. (1978), Bangham et al. (1965), Lenk et al. (US-PS 4.522.803, 5.030.453 og 5.169-637), Fountain et al (US-PS 4.588.578) og Cullis et al. (US-PS 4.975.282). ;Liposomet har et ytre lipid bilag som omfatter et nøytralt, bilags-foretrukket lipid som omfatter en nøytral (uladet, ikke-kationisk/ikke-anionisk, ikke-protonerbar) hodegruppe og bilags-foretrukkede acylkjeder. Disse acylkjedene, som kan være symmetriske eller asymmetriske (med ulik lengde, eller antall karbonatomer), mettede (ingen dobbelt bindinger mellom ved siden av liggende karbonatomer) eller umettede (en eller flere dobbelt bindinger mellom ved siden av liggende karbonatomer), antas å inhibere eller forhindre faseseparasjon av ikke-bilag-foretrukne lipider i bilaget, generelt ved å tilpasse kompatibel acylkjedepakking med acylkjedene til andre lipider inkorporert i bilaget. Bilag-foretrukne lipider kan danne stabile lipid bilag alene, samt i sammenheng med andre bilag-foretrukne lipider og med ikke-bilag-foretrukne lipider. Bilag-foretrukne lipider har generelt en vesentlig likhet mellom overflateområdene til deres hodegrupper og kryss-snitt områdene til deres acylkjeder. Acylkjedene til bilag-foretrukne lipider er generelt i omtrent parallell orientering med hensyn på hverandre i bilagene. Bilag-foretrukne lipider tilpasses generelt bilag-kompatible strukturer og er generelt ikke involvert i å etablere bilagsdefekter. Naturlig bilag-foretrekkende lipid kan være en fosfatidylcholin, så som egg fosfatidylcholin, eller andre nøytrale, bilag-foretrukne lipider. ;Ytterste lipid bilag til liposomet omfatter også en fusjonsfremmende effektiv mengde av et ioniserbart lipid som har en protonerbar, kationisk hodegruppe, dvs. en hodegruppe som kan akseptere et proton, og blir deretter positivt ladet, og som kan gi opp protonet slik at det blir nøytralt. Det ioniserbare lipidet omfatter også en umettet acylkjede, fortrinnsvis to umettede acylkjeder. Den kationiske hodegruppen er fortrinnsvis en aminogruppe så som en dimetylamino eller trimetylamino gruppe, men kan også være andre grupper som kan bli protonert, og positivt ladet, og deprotonert, og nøytralt. ;Den umettede acylkjeden er generelt ikke-bilagsforetrekkende. Ikke-bilags foretrekkende acylkjeder blir generelt ikke tilpasset konformasjoner i bilag hvor kjedene er i parallell orientering. Tversnittsområdene til slike acylkjeder er vanligvis, og til forskjell fra bilag-foretrukne acylkjeder, ikke lik hverandre og hodegruppe overflate området på grunn av deres ikke-parallelle orientering. Bilagsinneholdende ikke-bilagsforetrukne acylkjede-inneholdende lipider utviser generelt en lavere Tm eller temperatur hvorved overgangen fra gel til væske tilstand oppstår, sammenlignet med bilag inneholdende bilag-foretrukne acylkjede lipider med samme lengde (antall karbonatomer). Det antas at innkorporering av ikke-bilag-foretrukkende lipider i bilag generelt øker tendensen som bilagene har til å danne defekter og ha mindre stabilitet enn om bilag-foretrukne lipider ble anvendt. Slike defekter antas generelt å være involvert i fusjonen av lipidbilagene. Uten å være begrenset av noen teori antas det at bilags-destabilisering, og følgelig, fusjon, krever en vesentlig ubalanse mellom størrelsen på hodegruppen til fusogent lipid og størrelsen på området okkupert av dets acylkjeder. ;Umettede acylkjeder er fortrinnsvis oljesyrekjeder som er acylkjeder med 18 karbonkjeder som har en dobbelt binding mellom 9. og 10. karbonatomer. Umettede acylkjeder kan også være andre acylkjeder, så som de som vanligvis er mellom 12 og 24 karbonatomer og 1-4 dobbelt bindinger, for eksempel, palmitoleat (16 karboner/1 dobbelt binding) eller arachidonat (20 karbon atomer/ 4 dobbelt bindinger) kjeder, dersom disse generelt forankrer lipidet i bilaget og er ikke-bilag-foretrekkende. Den kationiske hodegruppen er fortrinnsvis en aminogruppe, den umettede acylkjeden er en oljesyrekjede, det ioniserbare lipidet omfatter to slike kjeder og er 1-N,N-dimetylaminodioleylpropan (AL-1). AL-1 kan være optisk aktiv eller racemisk, dvs. en optisk inaktiv blanding av isomerer, og det er foretrukket at AL-1 er racemisk. ;Andre egnede ioniserbare lipider er de med titraterbar hodegrupper, dvs. hodegrupper som ikke har en permanent positiv ladning, men hodegrupper som kan bli protonert og deprotonert i respons til forandringer i omgivende pH, og ikke-bilags foretrukne acylkjeder. Disse innbefatter, men er ikke begrenset til: ±-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymmetrisk ±-l,2-diacyl-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-3-AL-5) og± l,2-didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6). Den fusogene kapasiteten til hvert av disse lipidene kan for eksempel bli sammenlignet med fremstilling av liposomer med samme mengde av hvert av lipidene og deretter sammenligning av relative fusjonsrater til liposomene. Liposomfusjonen kan bli registrert ved hjelp av et antall metoder, for eksempel, ved fluorescensprobe fortynningseksperimenter (se for eksempel, eksempel 4 nedenfor). Figur 4 presenterer data som sammenligner de relative fusjonsratene til liposomene inneholdende ioniserbare lipider AL-1, AL-2, AL-3, AL-4, AL-5 og AL-6. ;Liposomet har et rom ved siden av dets ytterste lipid bilag som omfatter en vandig oppløsning ("indre vandig oppløsning") med en første pH. Liposomet blir suspendert i en vandig oppløsning ("ytre vandig oppløsning") som har en andre pH. Vanligvis blir liposomet fremstilt i en vandig oppløsning som er både innesluttet av liposomet, og hvori liposomet er suspendert. De indre og ytre vandige oppløsningene har følgelig generelt den samme sammensetningen, og også, samme pH. Deres pH er mindre enn pKa til det ioniserbare lipidet i liposomets ytre lipidbilag. ;pKa til en forbindelse, dvs. dets syredisossiasjonskonstant, er pH hvorved forbindelsen er halv-disossiert, dvs. pH hvor omtrent halvparten av molekylene til forbindelsen som er tilstede i oppløsningen er deprotonert. pKa kan bli definert ved formelen: log ([HA]/[H<+>] [A-]), hvor HA er protonert forbindelse og A" er deprotonert forbindelse. Henderson-Hasselbach ligningen (pH = pKa + log ([A]/HA])) beskriver forholdet mellom pH til en oppløsning og de relative konsentrasjonene til protonerte og deprotonerte former til en forbindelse som er til stede i oppløsningen. Ved en pH høyere enn dets pKa i et lipid bilag vil mer enn halvparten av det ioniserbare lipidet tilstede i bilaget bli deprotonert og følgelig være nøytralt. Bestemmelse av et ioniserbart lipids pKa kan bli oppnådd ved hjelp av velkjente og enkle midler, for eksempel ved TNS fluorescens titreringer. ;Ioniserbart lipid blir vesentlig protonert når pH til både indre og ytre vandige oppløsninger er mindre enn dets pKa i bilaget, og blir generelt omtrent jevnt fordelt mellom indre og ytre monolag til ytterste lipid bilag, dvs. omtrent 50% av det ioniserbare lipidet tilstede er i det indre monolaget, og 50% i det ytre monolaget. ;En pH gradient blir etablert over det ytterste lipid bilaget ved økende pH til den ytre vandige oppløsningen for å oppnå en ytre vandig oppløsning med en andre pH som er større enn første pH, og som er større enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget. Protonert, ladet ioniserbart lipid blir akkumulert i det indre monolaget til det ytterste lipid bilaget i respons til pH gradienten. "Akkumulert" som anvendt heri, betyr at mer enn omtrent 50% av det ioniserbare lipidet tilstede i det ytterste bilaget er i indre monolaget når det er en pH gradient over bilaget; fortrinnsvis, mellom omtrent 75% og omtrent 100%, mere foretrukket mellom omtrent 90% og omtrent 100%, og mest foretrukket, omtrent 100% av protonert ioniserbart lipid er i det indre monolaget i respons til pH gradienten. ;I en foretrukket utførelsesform ifølge oppfinnelsen er det ioniserbare lipidet AL-1. Liposomer kan bli dannet med AL-1 og for eksempel eggfosfatidylcholin (EPC) og kolesterol (Chol), eller EPC, Chol og dioleoylfosfatidylcholin (DOPE). I det EPC, Chol og DOPE er nøytrale lipider er pKa til AL-1 i EPC/Chol eller EPC/Chol/DOPE bilagene omtrent 6,7. Første pH, pH til den indre vandige oppløsningen, er mindre enn 6,7 i sammenheng med AL-l/EPC/Chol eller AL-l/EPC/Chol/DOPE liposomene; og det er foretrukket at første pH i sammenheng med slike AL-1 inneholdende liposomer er omtrent 4,0. Vanligvis er den indre vandige oppløsningen en vandig buffer og det er foretrukket at den vandige bufferen er en sitronsyrebufFer. ;Andre pH, dvs. pH til ytre vandige oppløsning, er større enn 6,7 når liposomet omfatter AL-l/EPC/Chol eller AL-l/EPC/Chol/DOPE. Det er foretrukket at andre pH er omtrent 7,5. Innkorporering av andre lipider inn i AL-l/EPC/Chol eller AL-l/EPC/Chol/DOPE liposom bilagene kan påvirke pKa til AL-1 deri. Ioniserbare lipider forskjellige fra AL-1 kan ha forskjellige pKa enn AL-1. Første og andre pH kan følgelig variere fra foretrukne pH verdier når sammensetningen til liposomet er endret. ;Når første pH er mindre enn det ioniserbare lipidets pKa i det ytterste lipid bilaget er andre pH større enn pKa, og det ioniserbare lipidet blir akkumulert i det indre monolaget til det ytterste lipid bilaget og den positive ladningen til det ioniserbare lipidet er vesentlig fraværende fra det ytre monolaget, og blir beskyttet fra eksponering overfor det ytre miljøet. Når administrert til dyr kan positivt ladet lipid forårsake toksiske bivirkninger og kan fremme opsonisering, binding av plasmaproteiner til liposomets ytre overflate for derved å fremme fjerning av liposomer fra dyrets sirkulasjon. Akkumulering av positiv ladning i det indre monolaget minimaliserer potensialet for toksiske bivirkninger og for opsonisering. ;pH gradienten som induserer det ioniserbare lipidet for å akkumulere i det indre monolaget kan også bli anvendt for å belaste kationiske, lipofile biologiske aktive midler, for eksempel, antracyklin antineoplastisk middel doksorubicin, inn i liposomene (se for eksempel Bally et al. US-PS 5.077.056, og innholdet er inkorporert heri som referanse)). ;Degradering av pH gradienten fører til en økning av indre pH over det ioniserbare lipidets pKa. Dette fører til vesentlig deprotonering av akkumulert ioniserbart lipid. Det vesentlige deprotonerte, nøytrale ioniserbare lipidet blir deretter omtrent jevnt fordelt mellom indre og ytre monolag til det ytterste lipid bilaget. Nøytralt ioniserbart lipid er "fusogent" når eksponert i det ytre monolaget, til andre lipid bilag, dvs. det kan fremme fusjon av liposomet til andre lipid bilag. Ved anvendelse av et ioniserbart lipid som har en pKa i bilaget som er mindre enn omtrent 7 betyr at pH gradienten kan bli degradert ved fysiologisk pH, for eksempel, i et dyr, slik at det ioniserbare lipidet blir vesentlig deprotonert og er fusogent. Indre pH til liposomet behøver ikke nødvendigvis øket over fysiologisk pH for å indusere vesentlig deprotonering av det ioniserbare lipidet. Ioniserbare lipider som har pKa vesentlig over fysiologisk pH behøver ikke å være fusogene når administrert til dyr i det de ikke behøver å bli vesentlig deprotoner i dyret. ;Det ioniserbare lipidet er tilstede i det ytterste lipidbilaget i en "fusjonsfremmende effektiv mengde". Fusjon av liposomer med andre lipid bilag kan bli definert som fusjon av det ytterste lipid bilaget til liposomet med andre lipid bilag, for eksempel, en cellemembran (se for eksempel Huang (1983)). For at fusjonen skal oppstå må lipidene til det ytterste lipid bilaget bli blandet med lipidene til de andre lipid bilagene. Uten å være begrenset av noen teori er det antatt at for at fusjonen skal oppstå må de ladede hodegruppene på lipidene bli nøytralisert og resultere i en effektiv forandring i geometrien til lipidene som gir opphav til ikke-bilagsforetrukne strukturer. ;Ifølge foreliggende oppfinnelse utgjør en "fusjonsfremmende effektiv mengde" av et ioniserbart lipid en mengde av det ioniserbare lipidet som effektivt fremmer fusjonen av liposomet til et annet lipid bilag når det ioniserbare lipidet er deprotonert og nøytralt. Fusjonsfremmende effektive mengder av et ioniserbart lipid er generelt effektive for å danne en tilstrekkelig grad av defekter i et bilag for å fremme fusjon av bilaget til et annet bilag. Vanligvis utgjør "fusjonsrfemmende effektive mengde" av det ioniserbare lipidet en mengde som er tilstrekkelig for å etablere en konsentrasjon av det ioniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget på fra omtrent 1 molprosent til omtrent 20 molprosent. Det er ønskelig at den fusjonsfremmende effektive mengden av det ioniserbare lipidet er en mengde som er tilstrekkelig for å etablere en konsentrasjon av det immuniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget på mellom omtrent 5 molprosent og omtrent 10 molprosent. ;Liposomet kan også omfatte et nøytralt, ikke-bilags-foretrukket lipid. Som anvendt heri betyr et "nøytralt, ikke-bilags-foretrekkende lipid" et amfipatisk lipid som har en ikke-kationisk, ikke-anionisk hodegruppe og ikke-bilags-foretrekkende acylkjeder. Ecke-bilags-foretrekkende acylkjeder blir generelt ikke arrangert i parallell orientering i bilagene, og har generelt ikke lignende områder som blir okkupert av deres hodegruppe overflater og et tverrsnitt av deres acylkjeder. Den mest foretrukne pakkende konformasjonen for slike acylkjeder er generelt i ikke-bilags-strukturer. Bilag inneholdende ikke-bilags-foretrekkende lipider utviser generelt en lavere Tm eller temperatur hvorved overgangen fra gel til fluid tilstand oppstår sammenlignet med bilag inneholdende bilags-foretrukne acylkjedelipider med samme lengde (antall karbonatomer). Ikke-bilags-foretrukne lipider letter generelt en bilagsovergang fra gel til fluid tilstand og aksellererer følgelig generelt fusjonen av bilaget til et annet bilag. I en foretrukket utførelsesform av oppfinnelsen er det nøytrale, ikke-bilags-foretrukne lipidet dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE). ;Liposomet kan også omfatte proteiner og andre lipider, for eksempel, kolesterol og derivater derav, inkorporert i liposomet i mengder, og av grunner, som er velkjente for fagfolk innenfor dette området, eller som lett kan bli bestemt av disse uten unødig eksperimentering. ;Liposomer kan omfatte et biologisk aktivt middel, en betegnelse som innbefatter tradisjonelle farmasøytiske midler, og relaterte biologiske aktive forbindelser eller sammensetninger som har biologisk aktivitet i et dyr eller på dyreceller in vi tro. Bioaktive midler innbefatter, men er ikke begrenset til: antibakterielle midler, anti virale midler, anti sopp midler, anti-parasittiske midler, tumorisidale midler, anti-metabolitter, karbohydrater, polypeptider, peptider, proteiner, toksiner, enzymer, hormoner, neurotransmittere, glykoproteiner, lipoproteiner, immunoglobuliner, immunomodulatorer, vasodilatorer, farvestoffer, radiomarkører, radio-opaque forbindelser, fluorescens forbindelser, polysakkarider, cellereseptor bindende molekyler, anti-inflammatoriske midler, mydriatiske forbindelser, lokale anestesi midler, narkotiske forbindelser, anti-glaukomiske midler, vitaminer, nukleinsyrer, polynukleotider, nukleosider, nukleotider, MRI og radiokontrast midler. ;Liposomsammensetningen kan bli administrert til dyr, fortrinnsvis pattedyr, og mer foretrukket, mennesker, for å levere biologiske aktive midler innesluttet i, eller assosiert med, liposomet til cellene i dyret. Når sammensetningen blir administrert til dyrene er den ytre vandige oppløsningen tolererbar, dvs. vesentlig ikke-toksisk for dyrene. Den ytre vandige oppløsningen er følgelig en farmasøytisk akseptabel oppløsning eller "bærer". Farmasøytiske akseptable bærere blir generelt valgt med hensyn på antatt administreringsvei og standard farmasøytisk praksis. For parenteral administrering gjelder injeksjon via intravenøs, intraperitoneal, intramuskulær, subkutant eller intra-brystveier kan sterile oppløsninger av liposomsammensetningen bli fremstilt og den totale konsentrasjon av oppløst produkt kan bli kontrollert for å gjøre preparatet isotonisk. Vanlige bærere anvendt for parenteral administrering innbefatter, men er ikke begrenset til, vandige dekstroseinneholdende oppløsninger så som D5W (5% vekt ved volum dekstrose i vann) og fysiologiske akseptable saltvannsoppløsninger. Farmasøytiske akseptable bærere kan også innbefatte alkoholer, gummi arabikum, benzyl alkoholer, gelatin, karbohydrater, så som laktose, amylose eller stivelse, magnesium stearat, talk, silinsyre, hydroksymetylcellulose, polyvinyl pyrrolidon og lignende. De kan også inneholde komponenter, for eksempel konserveringsmidler, anti-oksyderingsmidler, og lignende, i mengder, og av årsaker som hører inn under fagområdet til fagfolk. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer også et dehydrert liposom som har et ytre lipid bilag omfattende et nøytralt, ikke-bilag-foretrukket lipid og en fusjonsfremmende effektiv mengde av et ioniserbart lipid som har en protonerbar, kationisk hodegruppe og en umettet acylkjede, hvori det ioniserbare lipidet er akkumulert i det indre monolaget til det ytre lipid bilaget. Liposomdehydrering kan muliggjøre at liposomene blir lagret i lengre tidsperioder og det hydrerte liposomet kan deretter bli rekonstituert etter behov. Liposomene kan bli dehydrert med frysing ved anvendelse av standard frysetørke utstyr eller tilsvarende. Frysetørking blir generelt utført etter innkorporering av en eller flere beskyttende sukkerforbindelser i liposompreparatet i henhold til prosedyrene beskrevet i Schneider et al. (US-PS 4.229.360) og Janoffet al., (US-PS 4.880.635), og innholdet er inkorporert heri som referanse). Beskyttende sukker kan utelates dersom dehydrering blir utført uten frysing og tilstrekkelig vann blir latt være igjen i det liposomale preparatet for å opprettholde integriteten til en vesentlig del av det liposomale bilaget gjennom dehydrerings-rehydreringsprosessen. ;Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en in vitro fremgangsmåte for å kontrollere fusjon av et liposom til et andre lipid bilag som omfatter fremstilling av liposomet i en vandig oppløsning, i det liposomet omfatter et ytre lipid bilag som omfatter et nøytralt, bilags-foretrukket lipid og en fusjonsfremmende effektiv mengde av et ioniserbart lipid som har en protonerbar, kationisk hodegruppe og en umettet acylkjede. Liposomet omfatter også et rom ved siden av det ytre lipidbilaget som omfatter den vandige oppløsningen. pH til den vandige oppløsningen er mindre enn pKa til det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget. pH til den vandige oppløsningen utenfor liposomet blir deretter øket over pKa til det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget slik at det er en pH gradient over det ytterste lipid bilaget og det ioniserbare lipidet blir deretter akkumulert i det indre monolaget til det ytterste lipid bilaget i respons til pH gradienten. pH til det ytre vandige mediet blir øket over pKa til det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget når fusjonen av liposomet til det andre lipid bilaget skal oppstå. Liposomet kan være et unilamellært liposom, fortrinnsvis et stort unilamellært liposom, eller et multilamellært liposom, fortrinnsvis et multilamellært liposom som har vesentlig lik interlamellær oppløst produktfordeling. Det andre lipid bilaget er fortrinnsvis plasmamembran til en celle som er fortrinnsvis en pattedyrcelle. Den andre lipid bilaget kan også være andre lipidbilag, så som liposomale lipid bilag eller cellemembranen til en bakterie. pH til den ytre vandige oppløsningen blir generelt øket ved tilsetning av en tilstrekkelig mengde av en base til den vandige oppløsningen for å oppnå ønsket pH, eller ved å skifte den ytre vandige oppløsningen med en annen vandig oppløsning som har ønsket pH. ;Det ioniserbare lipidet er tilstede i det ytre lipid bilaget i en "fusjonsfremmende effektiv mengde", dvs. en mengde som effektivt fremmer fusjonen av liposomet til det andre lipid bilaget. Vanligvis utgjør "den fusjonsfremmende effektive mengden" av det ioniserbare lipidet en mengde som effektivt etablerer en konsentrasjon av det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget på fra omtrent 1 molprosent til omtrent 20 molprosent. Den fusjonsfremmende effektive mengden av det ioniserbare lipidet er en mengde som er tilstrekkelig for å etablere en konsentrasjon av det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget på fra omtrent 5 molprosent til omtrent 10 molprosent. ;Når fusjon av liposomet til det andre lipid bilaget er ønskelig, blir liposomets indre pH øket over det ioniserbare lipidets pKa i bilaget slik at pH gradienten blir degradert. ;Protonert/ladet ioniserbart lipid akkumulert i det indre monolaget til det ytterste lipid ;bilaget blir vesentlig deprotonert når pH til den indre vandige oppløsningen ved siden av bilaget øker over lipidets pKa i bilaget. Det vesentlige deprotonerte/nøytrale ioniserbare lipidet blir deretter omtrent jevnt fordelt i det ytre lipid bilaget, dvs. omtrent 50% er i det indre monolaget og omtrent 50% er i det ytre monolaget. Det nøytrale lipidet i det ytre monolaget kan fremme fusjon til andre lipid bilag. pH gradienten kan bli degradert ved administrering av liposom sammensetningen til et dyr og å muliggjøre at gradienten gradvis dissipereri dyret når protoner lagret i liposomet lekker inn i det ytre miljøet. Når liposomets indre pH nærmer seg fysiologisk pH, blir ioniserbare lipider med pKa som er mindre enn fysiologisk pH vesentlig deprotonert. pH gradient degradering kan også bli ;oppnådd ved anvendelse av ionoforer, for eksempel, nigericin, som letter transporten av ionene over lipid bilagene, eller ved tilsetning av ioner, for eksempel, ammonium ioner, som kan krysse lipid bilaget i deres nøytrale form. Når indre pH blir øket over dets pKa blir det ladede ioniserbare lipidet vesentlig deprotonert og det nøytrale lipidet blir fordelt omtrent jevnt mellom indre og ytre monolag til ytre lipidbilag. ;Liposomet anvendt i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan omfatte et biologisk aktivt middel. Det andre lipid bilaget hvor fusjonen av liposomet blir kontrollert er fortrinnsvis plasmamembranen til en celle. Det er foretrukket at cellen er en pattedyrcelle. Foretrukket fusjon av liposomet til plasmamembranen av pattedyrcellen oppstår inne i pattedyret, dvs. in vivo. Vanligvis oppstår fusjonen slik at innholdet av liposomet blir levert til cytoplasma i pattedyrcellen. ;Det er også tilveiebragt en in vitre fremgangsmåte for å innføre et biologisk aktivt middel inn i en celle, fortrinnsvis en pattedyrcelle, som omfatter fremstilling av et liposom som omfatter det biologiske aktive middelet i en vandig oppløsning, i det liposomet omfatter et ytre lipid bilag som omfatter et naturlig, bilags-foretrekkende lipid og en fusjonsfremmende effektiv mengde av et ioniserbart lipid som har en protonerbar, kationisk hodegruppe og en umettet acylkjede. Den vandige oppløsningen, som har en pH som er mindre enn pKa til det ioniserbare lipidet i det ytre lipid bilaget, blir både innesluttet av det dannede liposomet, og omgir liposomet. Liposomet omfatter også et rom ved siden av det ytre lipid bilaget som omfatter den vandige oppløsningen. pH til den vandige oppløsningen i det ytre av liposomet blir deretter øket over pKa til det ioniserbare lipidet i det ytterste lipid bilaget slik at det er en pH gradient over det ytterste lipid bilaget og det ioniserbare lipidet blir akkumulert i det indre monolaget til det ytre lipid bilaget i respons til pH gradienten. pH gradienten blir deretter degradert for eksempel ved administrering av liposomet til et dyr eller ved anvendelse av en ionofor når fusjon av liposomet til cellen skal oppstå. Cellen blir deretter kontaktet med liposomet slik at liposomet fusjoneres til cellen og det biologiske aktive middelet blir introdusert inn i cellen. ;Oppfinnelsen vil nå bli forklart ved følgende eksempler. Fagfolk innenfor dette området vet at disse eksemplene bare illustrerer oppfinnelsen som også er definert i kravene. ;EKSEMPLER ;Eksempel 1 ;Lipider op kjemikalier ;Egg fosfatidylcholin (EPC), dioleylfosfatidyletanolamin (DOPE), N-(7-nitro-2,l,3-benzoksydiazol-4-yl)-l,2-dioleyl-sn-fosfatidyletanolamin (MBD-PE) og N-(lissamin rhodamin b sulfonyl)-l,2-dioleyl-sn-fosfatidyletanolamin (Rh-PE) ble oppnådd fra Avanti Polar Lipids (Alabaster, AL). Oljesyre, kolesterol (Chol), nigericin (kalsium 2-p-toluidinylnaftalen-6-sulfonat (TNS), og alle buffere ble oppnådd fra Sigma Chemical Co. (St. Louis, MO). 3-N,N-dimetylamino-l,2-propandiol og oksalylklorid ble oppnådd fra Aldrich Chemical Co. (Milwaukee, WI) og 9,10-d2-oljesyre ble oppnådd fra MSD Isotopes Montreal, PQ). Organiske oppløsningsmidler var alle av HPLC kvalitet og ble anvendt uten redestillasjon. ;Syntese av AL- 1 ;Denne forbindelsen ble fremstilt ifølge fremgangsmåten til Levantis and Silvius (1990). Oleylklorid ble fremstilt ved sakte tilsetning av 3 ml (35 mmol) oksalylklorid til 1,0 g (3,5 mmol) oljesyre løst opp i 10 ml benzen uten omrøring ved romtemperatur i 1 time. Etter fjerning av oppløsningsmiddel og overskudd oksalylklorid under vakuum ble syrekloridet løst opp i 5 ml dietyleter og ytterligere 5 ml eter inneholdende 0,20 g (1,7 mmol) 3,N-dimetylamino-l,2-propandiol og 0,15 g pyridin ble tilsatt. Den resulterende blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 30 minutter før dette ble stoppet med 1 ml metanol. Oppløsningsmidlene ble fjernet under vakuum. Råproduktet ble løst opp i 50 ml heksan og vasket med 2 x 25 ml 0,1 M natriumklorid. Tørking over vannfri natriumsulfat og fjerning av heksan under vakuum ga en svak gul olje. Kolonnekromatografi på silikagel (70-230 mesh), hvor elueringen var med etylacetat ga 0,92 g (84%) rent produkt (TLC, Rf=0,5). 200 MHz 1H-NMR (CDCI3), Sppm fra TNS (J-kobling, integrasjon): 5,3 (dd,4H), 5,1 (m,lH), 4,0 (dd, lh), 2,4 (dd, 2H), 2,2 (s, 6H), 2,0-0,8 (m 62H). Denne prosedyren ble også anvendt for å danne deuterert analog rac-1-N,N-dimetylamino-2,3-bis(9,10-dideuteriooleoyl)propan (AL-l-d4) og ±-1,2-didekanoyl-1 -N,N-dimetylaminopropan (AL-6). ;Syntese av ±- oleoyl- 2- hydroksy- 3- N. N- dimetylaminopropan f AL- 21 og asymmetrisk 1. 2- diacvl- 3- N. N- dimetvlaminopropan f AL- 3- AL- 5) ;Oleoylklorid (3,4 mmol) fremstilt som beskrevet ovenfor, ble løst opp i 5 ml THF og tilsatt til et fem-ganger overskudd av 3-N,N-dimetylamino-l,2-propandiol (2,0 g, 17 mmol) og 0,15 g pyridin 25 ml THF ved 0°C. Rå l-monooleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2) ble isolert og renset ved kolonnekromatografi på siliakgel ved anvendelse av etylacetat/metanol (3:1) som elueringsmiddel (Rf 0,4). Påfølgende acylering med en ekvivalent acetylklorid, butyrylklorid eller dekanoylklorid, med reaksjonsbetingelsene produserte henholdsvis AL-3, AL-4 og AL-5. ;Fremstilling av LUV ;Liposomale liposomer ble dannet ifølge kjente fremgangsmåter ved tørking av kloroform oppløsningene av lipidene under nitrogen, etterfulgt av fjerning av gjenværende oppløsningsmiddel under høyt vakuum i 1 time. De resulterende lipid filmene ble hydrert ved vortex-blanding med hensiktsmessige buffere for å produsere multilamellære liposomer (MLV). Fem fryse-tine sykluser ble anvendt for å oppnå de homogene blandingene. MLV ble ekstrudert 10 ganger gjennom to 100 nm pore-størrelse polykarbonat filtere for å danne store unilamellære liposomer (se for eksempel Bally et al. US-PS 4.885.172; Cullis et al. US-PS 4.975.282; Cullis et al. US-OS 5.008-050; Loughrey et al. US-PS 5.059.421). ;Eksempel 2 ;Bestemmelse av lipid asymmetri ved TNS fluorescens ;Transport av AL-1 til det indre monolaget av liposomene ble demonstrert ved TNS fluorescens ved en anvendelse av en prosedyre tilpasset av Eastman et al. (1991). Fluorescens av TNF som en funksjon av AL-1 konsentrasjonen ble først beregnet ved en anvendelse av LUV inneholdende 0, 2,5, 5,0, 7,5 og 10,0 molprosent AL-1 i EPC/Chol (55:45), 5 mM totallipid, i 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Alikvoter på 90 ul ble tilsatt til 2,9 ml 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 5 uM TNS, 7,5 og fluorescens ble registrert over 5 minutter. Liposomene dannet med 10 molprosent AL-1, indre pH 7,5, som beskrevet ovenfor, ble også anvendt for sammenligning. ;Resultatene er presentert i figur 1. Effekt av en pH gradient på transbilagsfordelingen av AL-1 ble demonstrert ved å registrere overflate ladningen til AL-1-inneholdende liposomer ved TNS fluorescens, etter innstilling av en pH gradient. For at konsentrasjoner på 0-5 molprosent AL-1 fremkom en jevn økning i fluorescens når overflateladningen økte (se figur IA). Ved høyere konsentrasjoner begynner fluorescensen å gå tilbake og begynner å bli redusert. Denne effekten ble ikke observert med liposomer inneholdende AL-1 i EPC uten kolesterol hvor fluorescensen øker lineært opp til 20 molprosent AL-1. Dette var en tidlig indikasjon på at liposomer inneholdende 10 mol % AL-1 i EPC/Chol (55:45) blir aggregert og tilveiebringer reduserte liposomale overflatearealer for TNS interaksjon. ;Effekten av en pH gradient på TNS fluorescens med 10 molprosent AL-1 i EPC/Chol (55:45) er illustrert i figur IB. Kurven på toppen av figuren gir fluorescens som en funksjon av tiden i fravær av en gradient, indre og ytre pH 7,5, med 10 molprosent AL-1. Bunnkurven er for en bærer, indre pH 4 og ytre pH 7,5, men uten AL-1. Den sakte reduksjonen i fluorescens observert i disse kurvene er et resultat av fotobleking av TNS ;i løpet av eksperimentene. Den gjenværende kurven viser at for 10 molprosent AL-1 med en gradient var det vesentlige av den økte overflate ladningen til liposomene, og derfor, AL-1, hurtig tapt fra det ytre monolaget. Etter 4 minutter var fluorescensen lik den til EPC/Chol liposomene som indikerer at nesten alt AL-1 var blitt flyttet til det indre monolaget. Den hurtige bevegelsen av AL-1 over bilaget er fordelaktig for anvendelse ved kontrollering av fusjon. Lignende atferd ble observert for AL-2-AL-6 (se fig. 9). ;Eksempel 3 ;Bestemmelse av ioniserbart lipid pKg ;For å bestemme pH hvor AL-1 i liposomale membraner mister dets ladning ble LUV inneholdende 0 og 10 molprosent AL-1 og EPC/Chol (55:45) dannet i 5 mM HEPES, 5 mM ammoniumacetat ved pH 4,0. Preparatene ble fortynnet til 0,25 mM total lipid i 5 mM HEPES, 5 mM ammonium, 2 uM TNS ved pH varierende fra 3,0 til 10,0. pH over vesikkel membranene ble gjort like ved tilsetning av nigericin til en sluttkonsentrasjon på 0,01 um. TNS fluorescensen ved hver pH verdi ble bestemt under betingelsene angitt ovenfor. ;Resultatene er presentert i figur 2 som viser TNS fluorescens ved forskjellige pH verdier i fråvær av en pH gradient. Dataene viser klart en pKa på 6,7 for konjugatsyren til AL-1. En sammenligning av resultatene oppnådd fra lignende pH titreringskurver for syntetiske aminolipider AL-2-AL-6 er gitt i tabell 1 (se nedenfor). Effektene av den kjemiske strukturen på syre-base karaktertrekkene til aminene som var inkorporert i liposomene er manifistert som forandringer i pKa verdiene som er observert, og i fraksjonen av amino lipid artene som forblir ladede ved pH 7,5. Disse forandringene kan stamme fra dybden av penetreringen av amin hodegruppen inn i lipid bilaget, som påvirket at den relative hydrokarbon kjedelengden og polariteten til hodegruppen. Forbindelse AL-2 som bare har en enkelt oleoylkjede og en usubstituert hydroksygruppe, har en pKa på omtrent 7,57. Forestring av hydroksyl i 2 posisjonen med acetat, for å tilveiebringe AL-3, reduserer pKa til 6,79, og fraksjonen til nøytrale arter ved pH 7,5 er 16%, sammenlignet med 11% for AL-l. De gjenværende forbindelsene, AL-4, AL-5 og AL-6, har også tilstrekkelig hydrokarbon innhold for å oppnå pKa og relative ladninger ved pH 7,5 som er tilnærmet de for AL-1. ;<*> Data ble oppnådd fra TNS fluorescens titreringer. Kurvene for hvert aminolipid ble tilpasset til Henderson-Hasselbach ligningen ved variering av pKa og maksimum og minimum fluorescens.

Eksempel 4

Lipid- blandings fusjonsanalyse

Fusjon ble registrert ved reduksjon i resonans energi overføring (RET) som er et resultat av fluorescensprobefortynning, som beskrevet av Struck et al. (1981). LUV ble dannet av 0 og 10 molprosent AL-1 i EPC/Chol (55:45) og EPC/DOPE/Chol (30:25:45) i 300 mM sitrat pH 4,0. Eksternal buffer var 20 mM HEPES (150 mM NaCl, pH 7,5). Liposomene inneholdende 0,7 molprosent av både NDB-PE og Rh-PE for hver lipid sammensetning, ved hver av AL-1 konsentrasjonene, ble også dannet. Merkede og umerkede liposomer ble blandet i et 1:3 forhold og fortynnet til 0,2 mM total lipid. Ytre buffer ble utvekslet med 300 mM sukrose, 1 mM sitrat, pH 4,0 på Sephadex G-25 kolonner før fortynning av preparatene til 10 mM lipid. For fusjonsanalyser ble 20 ul fluorescensmerkede liposomer og 60 ul umerkede liposomer tilsatt til 3,92 ml 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7.5. Etter 5 min. inkubasjon ved romtemperatur ble en 3 ml alikvot tilsatt til en kuvette og fluorescensen ble registrert over 5 minutter. Ekitasjon og emisjonsbølgelengdene var på henholdsvis 465 og 535 nm og en emisjon 530 nm avspaltningsfilter ble anvendt. For å spre gradienten og indusere fusjon ble ammoniumacetat tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 mM ved 30 sekunder. Prosent forandring i fluorescens (% F/Fmax) ble bestemt ved å innstille null fluorescens (F0) til et spor uten tilsatt ammoniumacetat og Fmax til et spor målt etter tilsetning av 100 ul 25 mMtriton X-100, slik at:

For å studere effektene av å variere AL-1 konsentrasjonen ble (0-20 molprosent) på fusjonsliposomer omfattende EPC/Chol (55:45) dannet med, og uten, 0,5 molprosent av hver av NBD-PE og Rh-PE, ved anvendelse av en indre pH 4,0,300 mM natriumsitratbuffer og en ytre 20 nM HEPES buffer (150 mM NaCl, pH 7,5). Merkede og umerkede liposomer ble blandet i et 1:3 forhold og fortynnet til 0,20 mM total lipid. pH gradienten ble spredt ved tilsetning av ammoniumacetat til en sluttkonsentrasjon på 100 mM ved 30 sekunder.

For å studere effektene av å variere DOPE konsentrasjonen på fusjonsratene av AL-1-inneholdende liposomer ble LUV dannet med EPC/DOPE/Chol 55-X:X.45, X = 0, 5, 10,15,20), 10 molprosent AL-1 med eller uten 0,5 molprosent av hver av NBD-PE og Rh-PE, en indre pH 4,0, 300 mM natriumsitratbuffer og ytre 20 mM HEPES buffer (150 mM NaCk, pH 7,5).

For å studere effekten av aminolipid strukturen på fusjon av EPC/Chol/DOPE liposomene (35:20:45) ble liposomer dannet med 5 molprosent av indikert aminolipid (AL-1-AL-6), en indre pH 4,0, 300 mM natriumsitratbuffer og ytre 20 mM HEPES buffer (150 mM NaCl, pH 7,5). Fusjonsanalyser ble utført som beskrevet ovenfor. Resultatene er presentert i figurene 3,4, 6, 7 og 9. pH gradienten over membranene til liposomene med sure indre deler kan bli dannet av ionoforer, så som nigericin, eller ved tilsetning av ammoniumioner som kan krysse membranen i form av nøytral ammoniakk for å øke indre pH. For LUV hvor AL-1 er eksklusiv på det indre monolaget vil tap av pH gradient være ventet å gi redistribusjon av AL-1 mellom monolagene. Under betingelser hvor AL-1 er deprotonert og bilags-ustabile kan liposomal fusjon oppstå.

Membranfusjonen ble registrert ved et tap i RET mellom fluroescens merkede lipider NBD-PE og Rh-PE. Når liposomer inneholdende begge disse markørene ble fusjonert med umerkede liposomer gir den resulterende fortynningen av fluorescensprobene øket fluorescens for NMD-PE. Betydelig utveksling av disse merkede lipidene med liposomer ser ikke ut til å oppstå selv i aggregerte systemer og fluorescens øker bare ved blanding av membran lipidene.

Anvendelse av fluorescensprobe fortynningsanalyse for å demonstrere fusjon i LUV inneholdende 10 molprosent AL-1 er angitt i figurene 3 og 4. Umerkede og merkede liposomer (3:1) omfattende EPC/Chol (55:45) uten AL-1 viste ingen økning i fluorescens ved spredning av pH gradienten. En liten økning i fluorescens ble observert på grunn av tilsetning av ammonium oppløsningen. Lignende liposomer inneholdende 10 og 20 molprosent AL-1 ga en hurtig økning i fluorescens som ble raskt utjevnet ved en verdi på AF/AFmax nær 3%. Dette representerer bare en begrenset mengde av den totale mulige lipidblandingen som 3:lblandinger av umerkede og merkede liposomer vil gi en AF/AFmax på 80%, bestemt ved dannelse av liposomer med fluorescens markører ved en fjerdedel av den normale konsentrasjonen (0,18 molprosent). Den lave fluorescensøkningen som ble observert indikerer at selv om AL-1 kan indusere pH gradient-kontrollert fusjon i EPC/Chol liposomer er dets evne til å gjøre dette begrenset. For AL-1 konsentrasjoner høyere enn omtrent 20 molprosent i EPC/Chol liposomer ble hurtig og fullstendig liposomaggregasjon observert etter ekstrusjon.

Den fusogene naturen til EPC/Chol liposomene kan bli øket ved å innbefatte dioleoylfosfatidyletanolamin (DOPE) i lipid bilaget. Figur 3 viser fluorescens sporene som demonstrerer effekten av 10 molprosent AL-1 på fusjonen av EPC/DOPE/Chol (30:25:45). Uten aminolipidet var det veldig lite spor av fusjon når pH gradienten ble dannet med ammoniumacetat. Når AL-1 ble innbefattet økte AF/AFmax derimot til nesten 10% over 5 minutter og fortsatte å øke over 15 minutter. Dette resultatet demonstrerer nyttigheten av AL-1 i kontrollert fusjon og illustrerer viktigheten av lipid sammensetningen i grad av fusjonen som blir observert. Resultatene av fusjonsanalyser for EPC/DOPE/Chol liposomer inneholdende 10 molprosent AL-1, hvor økende nivåer av DOPE erstatter EPC, er vist figur 6. Økte fusjonsrater fremkom med økende DOPE konsentrasjoner opp til lipidforhold på 35:20:45 (EPC/DOPE/Chol, mol/mol). Denne formuleringen ga en AF/AFmax som var høyere enn 5% etter 5 minutter. Ved dette DOPE nivået ble derimot en viss aggregasjon av liposomer observert ved lav pH. Høye DOPE nivåer ga hurtig aggregasjon.

De beste fusjonsratene ble observert når AL-1 konsentrasjonen ble redusert til omtrent 5 molprosent i EPC/DOPE/Chol (35:20:45) liposomene er vist i figur 7. Ved pH 4,0 med denne formuleringen ble stabile liposomer dannet og disse forble stabile når ytre pH ble øket til 7,5. Dissipering av pH gradienten resulterer i en nesten lineær økning i AF/A Fmax over de første 5 minuttene til en verdi høyere enn 10%. Til tross for at fusjonsraten reduseres med tiden fortsatte fusjonen i løpet av 15-minutt analysen.

En sammenligning av den fusogene kapasiteten til aminolipidene AL-1 - AL-6 ble utført ved å analysere for fusjon med liposomer inneholdende 5 molprosent av hvert aminolipid i EPC/DOPE/Chol liposomene (35:20:45). Resultatene er vist i figur 9 AL-2 som har en enkelt oleoylkjede og gir liten økning i liposomfusjon sammenlignet med liposomer som ikke inneholder aminolipid. Det antas at mangel på fusogen aktivitet kan være et resultat av relativ høy pKa av AL-2 i slike bilag, og fra et relativt lite areale i bilaget som er okkupert av en enkelt acylkjede av AL-2. Uten å være begrenset til noen teori er det antatt at bilags destabilisering og følgelig fusjonen krever en vesentlig ubalanse mellom størrelsen på hodegruppen til det fusogene lipidet og størrelsen på arealet som blir okkupert av dets acylkjeder. Liposomer inneholdende AL-3 utviser en vesentlig større fusjonsrate og forlengning av AL-3 andre kjede til butyryl (AL-4) eller dekanoyl (AL-%) gir videre økninger i fusjonsrate, med rater som er tilnærmet de som blir oppnådd med AL-1-inneholdende liposomer. Innkorporering av forbindelsen AL-6 med to dekanoylkjeder til liposomer ga bare begrenset blanding til tross for forholdsvis lav pKa.

Eksempel 5

2H- NMR spektroskopi

Fryse-tinet MLV av 10 molprosent AL-1-04 i EPC/Chol (55:45) ble dannet som beskrevet ovenfor i 100 mM ammoniumacetat ved pH 4,0 og pH 7,5 i deuterium-tappet vann. Prøvekonsentrasjonene utgjorde omtrent 150 mM totallipid. Bred linje quadrupole spekteret ble registrert på et bruker MSL200 spektrometer ved 30,7 MHz ved anvendelse av en spinn-ekko sekvens med en 5,3 us 90° puls og en 200 ms repeat delay. Temperaturen ble opprettholdt ved 20°C med et flytende nitrogenstrømningssystem. Fri induksjons decay (FID) signal ble akkumulert over natt (omtrent 280.000 scan) for prøven ved pH 4,0, men sammenlignbare signal-til-bakgrunn med pH 7,0 prøven ble oppnådd med omtrent 770 scan. FID ble transformert ved anvendelse av 100 Hz-linje-utvidelser.

Eksempel 6

2H- NMR og 31P- NMR spektroskopi

Fryse-tint MLV inneholdende 5 molprosent AL-l-d4 i EPC/Chol (55:45) ble dannet i 20 mM HEPES, 20 mM ammoniumacetat, 150 mM NaCl, pH 4,0 og pH 7,5, ved anvendelse av deuterium-tappet vann. Prøvekonsentrasj oner var omtrent 200 mM totallipid. <2>H-NMR bredlinjet spektra ble registrert ved 46,175 MHz, på et hjemmelaget 300 MHz spektrometer ved anvendelse av en 5 us 90° puls, 50 us interpuls spacing, 30,5 us ring-ned forsinkelse og en 300 ms repeteringstid. En quadrupole ekko sekvens med 8-trinns fasesyklisering ble anvendt for å akkumulere 200.000 scan. Den resulterende fri induksjons-decay (FID) ble transformert med 100 Hz linje-utvidning. Høy resolusjons 3 lp spekteret ble registrert ved 81 MHz på et Bruker MSL200 spektrometer ved anvendelse av en 2,8 us puls og 30 s gjentagelse. Temperaturen ble opprettholdt ved 23°C med et flytende nitrogen strømningssystem. FID ble akkumulert over 1000 scan og transformert med 50 Hz linje-utvidelse.

NMR spektroskopi resultater er presentert i figurene 5 og 8. Begrenset grad av fusjon observert med AL-1 i EPC/Chol (55:45) liposomer indikerte at til tross for at den deprotonerte formen av aminolipidet ikke var stabil i bilaget ga denne manglende stabiliteten ikke en permanent ikke-bilagsstruktur i lipidmembran. Dette kan ha vært et resultat av begrenset oppløselighet av det nøytrale aminet i bilaget. Separate krystallinske celler flytende domener til AL-1 kan bli dannet før omfattende fusjon kan oppstå.

Faseatferden til AL-1 ble undersøkt ved syntese av en deuteriumkjedemerket analog, AL-l-d4, som ble inkorporert inn i MLV ved en konsentrasjon på 10 molprosent EPC/Chol (55:45). Anvendelse av MLV i dette eksperimentet fører til unngåelse av hurtig "tumbling" av LUV på NMR tidsskalaen. I figur 4 viser 2H -NMR spekteret ved pH 4,0 quadrupolare splittinger for kjedemerkede posisjoner til AL-l-d4 med ventet størrelse for lipidet i bilaget. Ved pH 7,5 er bilagssignalet ikke lenger tilstede og en sterkt isotropisk topp fremkommer i midten av spekteret. Dette tyder på at AL-1 eksisterer i separate fluiddomener ved pH 7,5. Den begrensede graden av fusjon som blir observert ved nøytralisering og redistribusjon av AL-1 er sannsynligvis et resultat av dannelse av disse domenene.

<2>H spekteret ved pH 4,0 i figur 8 A viser quadrupolare deuterium splittinger i området som er ventet for oleoylkjeder på et lipid inkorporert i et lipid bilag. I prøven dannet ved pH 7,5 er bilaget vedvarende til tross for at det er en reduksjon i quadrupolare spittinger som kan korrelere med mindre bilagsorden. Det er i tillegg et bestemt signal med en splitting på omtrent 12 kHz som antas å skyldes den delen av aminolipidet som er i Hjj fasen. Fremkomst av dette signalet er derfor i samsvar med destabilisering av bilaget som fører til membranfusjonen.

Ledsagende forandringer i fase atferden til fosfolipidene EPC og DOPE fremkommer i <31>p<->NMR spekteret vist i figur 8b. Et typisk bilagssignal, med en topp oppe i feltet og en nede i feltskulder, ble observert for pH 4,0 preparatet. For pH 7,5 preparatet er ned-feltssignalet redusert i en viss grad og Hrj signalet fremkommer som en mer intens ned-felt skulder.

Eksempel 7

Fryse- fraktur elektron mikroskopi

LUV bestående av 10 molprosent i enten EPC/Chol (55:45) eller EPC/DOPE(Chol (30:25:45) ble dannet som ovenfor i 300 mM natriumsitrat ved pH 4,0 med en total lipid konsentrasjon på 150 mM. Ytre buffer ble byttet med 1 mM sitrat, 300 mM sukkrose, pH 4,0 på Sephadex G-25 kolonner. Til 200 ul av hvert av preparatene ble det tilsatt 50 ul 500 mM ammoniumacetat, pH 7,5. Prøvene ble opprettholdt ved romtemperatur i 30 minutter før dannelse av platina/karbon replikaer (se Fisher og Branton (1974)).

Eksempel 8

Frys- fraktur elektronmikroskopi

LUV bestående av 5 molprosent i EPC/DOPE/Chol (30:25:45) liposomer ble dannet som ovenfor i 300 mM natriumsitrat ved pH 4,0 med en total lipidkonsentrasjon på 100 mM. Ytre buffer ble byttet med 1 mM sitrat, 300 mM sukkrose, pH 4,0 på Sephadex G-25 kolonner før fortynning av preparatet til omtrent 10 mM lipid med 20 mM HEPES, 150 mM NaCl, pH 7,5. Etter fjerning av en kontrollprøve ble pH gradienten spredt ved tilsetning av 3 mM ammoniumacetat, pH 7,5, til en sluttkonsentrasjon på 100 mM. Platina/karbonreplikaer ble dannet (se Fisher og Branton (1974)) for prøvene 4,15 og 30 minutter etter spredning av gradienten, samt for en kontroll med tilstedeværende pH gradient.

Claims (17)

1. Liposomsammensetning omfattende: c) et unilamillært liposom med: i) et bilag som omfatter et bilag som danner fosfatidylkolin og mellom 1 molprosent og 20 molprosent av et ioniserbart lipid valgt fra gruppen bestående av l-N,N-dimetylaminodioleoylprpan (AL-1), ±-1-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymetrisk±-l,2-diacyl-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-3 - AL-5) og ±-l,2didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6); og ii) et indre rom som omfatter en vandig løsning med en første pH; og d) en vandig løsning utenfor liposomet med en andre pH, hvor den første pH er lavere enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget og den andre pH er høyere enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget, hvorved det er en pH-gradient over bilaget, og hvorved det ioniserbare lipidet akkumuleres i bilagets indre monolag.

2. Liposom-sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at det unilamellære liposomet er et stort unilamellært liposom.

3. Liposom sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at den vandige oppløsningen som har den første pH er en vandig buffer.

4. Liposom sammensetning ifølge krav 3, karakterisert v e d at den vandige bufferen har en pH på omtrent 4,0.

5. Liposom sammensetning ifølge krav 4, karakterisert v e d at den vandige bufferen er en sitratbuffer.

6. Liposom-sammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at det ioniserbare lipidet omfatter fra 5 molprosent til 10 molprosent av bilaget.

7. Liposomsammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at det ioniserbare lipidet er l-N,N-dimetylaminodioleoylpropan (AL-1).

8. Liposomsammensetning ifølge krav 1, karakterisert v e d at liposomet videre omfatter et nøytralt ikke-bilag-foretrekkende lipid.

9. Liposomsammensetning ifølge krav 8, karakterisert v e d at det nøytrale ikke-bilag-foretrekkende lipidet er dioleoylfosfatidyletanolamin.

10. Liposomsammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at liposomet omfatter et biologisk aktivt middel.

11. Liposomsammensetning ifølge krav 10, karakterisert v e d at det biologisk aktive middelet er en nukleinsyre, et antimikrobielt middel, et anticancermiddel eller et antiinflammatorisk middel.

12. Liposomsammensetning ifølge krav 1, karakterisert ved at den utvendige vandige løsningen er en farmasøytisk akseptabel vandig løsning.

13. Dehydrert unilamellært liposom med et bilager omfattende et bilag-dannende fosfatidylkolin og mellom 1 molprosent og 20 molprosent av et ioniserbart lipid valgt fra gruppen bestående av l-N,N-dimetylaminodioleoylpropan (AL-1), ±-l-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymmetrisk-±-l,2-diacyl-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-3 - AL-5) og ±-l,2-didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6), der det ioniserbare lipidet akkumuleres i bilagets indre monolag.

14. In vitro fremgangsmåte for kontroll av fusjonen av et liposom til et andre lipidlag som omfatter (d) å fremstille liposomet med et bilag-dannende fosfatidylkolin, et ioniserbart lipid valgt fra gruppen bestående av 1-N,N-dimetylaminodioleoylpropan (AL-1), ±-l-oleoyl-2-hydroksy-3-N,N-dimetylaminopropan (AL-2), asymmetrisk-±-l,2-diacyl-3-N,N-dimetylaminopropan (AL3 - AL-5) og ±-l,2-didekanoyl-l-N,N-dimetylaminopropan (AL-6) og en vandig løsning med en pH som er lavere enn det ioniserbare lipidets pKa i bilaget, slik at det ioniserbare lipidet omfatter fra 5 molprosent til 20 molprosent av bilaget og den vandige løsningen er både innvendig og utvendig for det resulterende liposomet; (e) å øke pH til den vandige løsningen utvendig for liposomet over pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget, hvorved der er en pH-gradient over bilaget og hvorved det ioniserbare lipidet akkumuleres i bilagets indre monolag; og (f) å forårsake degradering av pH-gradienten slik at pH til den innvendige vandige løsningen er høyere enn pKa til det ioniserbare lipidet i bilaget.

15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at liposomet omfatter et biologisk aktivt middel.

16. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at det andre lipidbilaget er plasmamembranen til en celle.

17. Fremgangsmåte ifølge krav 16, karakterisert ved at cellen er en mammalsk celle.