NO317348B1

NO317348B1 - Mikropartikler for frigjoring av aktive preparat

Info

Publication number: NO317348B1
Application number: NO19965403A
Authority: NO
Inventors: Ming-Kung Yeh; Allan G A Coombes; Paul G Jenkins; Stanley Stewart Davis
Original assignee: West Pharm Serv Drug Res Ltd
Priority date: 1994-06-18
Filing date: 1996-12-16
Publication date: 2004-10-18
Also published as: AU2743695A; NO965403D0; JPH09510477A; JP2963540B2; FI965068A; NO965403L; CA2193203C; EP0766554B1; CA2193203A1; GB9412273D0; EP0766554A1; FI965068A0; DE69534163D1; WO1995035097A1; ATE293437T1; AU689272B2; US5869103A

Description

Oppfinnelsen angår polymerbaserte mikrokapsler for administrasjon av aktive preparat, og en framgangsmåte for framstilling av slike partikler.

Bakgrunn

Det er mulig å tilføre terapeutiske midler i form av medikament og vaksine til kroppen via en rekke veier, slik som parenteralt og ikke-parenteralt. Produktene fra bioteknikken representerer en spesiell materialklasse. I dag står den farmasøytiske spesialist overfor et problem med å avlevere terapeutisk aktive materialer i form av peptider og proteiner, karbohydrater, oligonukleotider og DNA.

Det råder betydelig interesse for bruken av kolloidale partikler for frigjøring av terapeutisk aktive materialer i form av proteiner og peptider og for framstilling av vaksiner. En har undersøkt ulike biodegraderbare polymerer som terapeutiske bærere, deriblant serumalbumin-kuler, polyakryl-stivelses-mikropartikler, polyakrylamid-mikropartikler, poly(butyl-2-cyanoakrylat)-nanopartikler og polylaktid-ko-glykolid-mikropartikler (Florence et al). I tilfellet med albumin og polyakryl-stivelse, ble det indusert antistoff-respons overfor bærerne og overfor de spesifikke antigener innlemmet i samme. Problemer med giftighet forbundet med polyakrylamid og poly(butyl-2-cyanoakrylat) begrenser bruken av disse polymerer som antigen-avleveringssystem.

Mikropartikler basert på resorberbare kopolymerer av polylaktid og polyglykolid er undersøkt i stort omfang med hensyn til medikament-avlevering (Watts, et al) og finner nå en økende anvendelse for tilførsel av produktene fra bioteknikken (særlig peptider og proteiner) (Kwong, et al og Wang, et al). Disse syntetiske polyestere er godkjent for bruk på mennesker og har en 25 års lang historie med hensyn til sikkerhet. Injiserte mikrokapsler av poly(DL-laktid-ko-glykolid) (PLG) oppviser god bioforenelighet og induserer kun en minimal betennelses-respons. Laktid-kopolymerer slik som PLG er gode kandidater for utviklingen av medikamentsystemer og vaksiner med kontrollert frigjøring eller avlevering. De biodegraderes ved hydrolyse av esterbindinger til å gi kroppens naturlige melkesyre og glykolsyre. Degraderingshastigheten for laktid-kopolymerer kontrolleres av ulike faktorer slik som molvekt, forhold mellom laktid og glykolid samt av polymer-krystallinitet, og kan variere fra flere uker til over ett år. På denne måten vil en ha en potensiell kontroll over tid og hastighet for frigjøring av vaksinen. Bærere kan derfor utformes til å frigjøre innlemmet antigen i visse intervaller etter immunisering når forsterkerdoser administreres normalt.

Det har blitt utviklet en lang rekke mikroinnkapslingsteknikker ved bruk av PLG, slik som filmstøping, formstøping, spraytørking og ekstrudering, mens den vanligste teknikken er løsningsmiddelinndamping (Fong et al., og Bodmeier et al). Selv om teknikken med inndamping av olje-i-vann (o/w)-emulsjon/løsningsmiddel har blitt brukt med hell av flere grupper for å fange hydrofobe substanser slik som progesteron, har en fått dårlig inn-kapslingseffekt for moderat vannløselige og vannløselige medikamenter grunnet separasjon ut i den vandige kontinuerlige fasen (Benita et al.). Dette representerer et sentralt problem innen medikament- og vaksine-frigjøring.

Proteininnkapsling i PLG-mikropartikler har blitt forsøkt tidligere ved bruk av olje-olje (o/o)- og o/w-teknikker der tørket protein først dispergeres i en løsning av PLG (Alonso et al). I o/o-teknikken kan dispersjonen emulgeres i silikonolje med Span 85 som stabilisator. Tilsats av petroleumeter fører deretter til løsningsmiddelekstraksjon og utfelling av mikropartiklene. Selv om proteinandelen er tett opp til det teoretiske maksimum, har partikkel-størrelsen en tendens til å være stor (omlag 500 nm) og partikkelformen er irregulær. Leelarasamee et al har beskrevet en løsningsmiddelaktiv metode med langsom injeksjon av en suspensjon av hydrokortison i en PLA-løsning inn til en strøm av mineralolje. I en beslektet metode av Wada et al ble hydrofile medikamenter innkapslet i melkesyre-oligomer-mikropartikler ved bruk av en acetonitril/vann-blanding for å framstille primæremulsjonen. Denne ble deretter emulgert i bomullsfrøolje og løsningsmidlet ble fjernet ved oppvarming.

I o/w-tilnærmingen blir en suspensjon av protein i polymerløsningen emulgert med en ublandbar vandig tensidløsning, som fører til polymerutfelling og herding av mikrokapslene. Løsningsmidlet fjernes ved inndamping. Mikropartikler mindre enn 10 um kan framstilles, men proteinet er ineffektivt innkapslet i mikrokapslene framstilt i nærvær av vann grunnet separasjon inn i den vandige fasen. En har også registrert en raskere og mindre reproduserbar proteinfrigjøring når proteinet er dispergert som et lyofilisert pulver i polymerløsningen (Alonso et al).

For å fremme andelen av vannløselige forbindelser i PLG-mikropartikler brukte Ogawa et al en vann-i-olje-i-vann-løsningsmiddelinndampingsteknikk (w/o/w) for å innlemme et vannløselig peptid i PLG-mikropartikler. Denne w/o/w-teknikken har siden da blitt en av de mest grunnleggende metoder for innkapsling av proteiner og peptider (Jeffery et al). I denne dobbeltemulsjons-løsningsmiddelinndampings-tilnærmingen blir en vandig løsning av proteinet emulgert med polymerløsningen for å framstille en primær vann-i-olje emulsjon (w/o). Denne blir deretter emulgert med en vandig tensidløsning (w/o/w) for å indusere polymerutfelling og mikropartikkelherding og for å tillate fjerning av løsnings-middel ved fordamping. Denne w/o/w-metoden har blitt brukt til å innkapsle difteri-toxoid i DL.PLA-mikropartikler for kontrollert frigjøring (Singh et al) og tetanus-toxoid i hhv. PLA og DL.PLG (Raghuvanshi) med det formål å framstille enkeltdose-vaksiner som potensielt skal overvinne problemene med avvisning eller vegring hos pasienten, vaksine-administrasjon og lagring.

En nyere publikasjon har beskrevet innarbeiding av ovalbumin i PLG-partikler ved bruk av w/o/w-metoden (Uchida og Goto., Biol. Pharm. Bull., 17(1994), 1272-1276). Partiklene hadde en størrelse i området 1-14 nm. Forfatterne kommenterte den lave ladningseffekt (8-20%). Innholdet av ovalbumin i mikropartiklene ble forventet å utgjøre fra 0.08 til 0.20%.

Tysk patentsøknad DE 3916020 Al beskriver framstillingen, via en smelte og/eller en o/w emulsjons-prosess, av polylaktid, polyglykolid eller PLG mikropartikler som inneholder aktive substanser, samt frigjørings-styrende tilsetningsmidler så som poly(etylen-glykol) (PEG). Europa patentsøknad EP 486959 Al, beskriver mikropartikler omfattende en biodegraderbar polymer, en amfilisk polymer og en aktiv forbindelse. Ingen av disse dokumentene verken omtaler eller antyder mikropartikler som er karakterisert ved at de oppviser en frigjørings-profil for den aktive forbindelsen som er lineær med tid, eller mikropartikler som inneholder en vannløselig polymer som er en blokk-kopolymer (hvor PEG er en av blokkene).

US patent 4,767,628 beskriver farmasøytiske blandinger som omfatter et polylaktid og et farmakologisk aktivt, syrestabilt, polypeptid. Dette dokumentet verken omtaler eller antyder mikropartikler som omfatter en kombinasjon av to polymerer med klart definerte funksjoner.

Mikropartikler som administreres subkutant blir enten tilbake i det subkutane vev eller fagocytoseres avhengig av deres størrelse (Visscher et al). Innkapslingen av antigener i mikropartikler mindre enn 10 nm er av interesse for å målrette mot makrofager (Eldridge et al). Flere studier (Eldridge et al., og Jenkins et al., og Jani et al) har vist at det også eksisterer en betydelig avhengighet av størrelse for absorpsjonen av mikropartiklene gjennom fordøyelseskanalen etter oral administrasjon, der mikrokapsler med størrelse i området 0.5-1.0 nm ble absorbert i størst omfang. Det er følgelig et ønske å kunne regulere partikkelstørrelsen på en enkel måte.

Det er overraskende funnet at mikrokapsler som omfatter en blanding av en biodegraderbar polymer og en vannløselig polymer oppviser en forbedret ladningsandel av aktivt preparat og kan gi en lineær tidsprofil for frigjøringen av det aktive preparat. Dessuten har en funnet at framstilling av polymermikropartikler ved bruk av en emulgerings/løsnings-middelsekstraksjons-metode der en bruker blandbare organiske løsningsmidler vil medføre en betydelig reduksjon av separasjon av det aktive preparat inn i den kontinuerlige fase av sekundæremulsjonen, særlig når det aktive preparat er vannløselig.

Den foreliggende oppfinnelsen framskaffer derfor en mikropartikkel omfattende en blanding av en biodegraderbar polymer og en vannløselig polymer, og et aktivt preparat. Betegnelsen mikropartikkel brukes her for å inkludere nanopartikler. Mikropartiklene har fortrinnsvis en størrelse i området 10 nm til 100 fim. Den vannløselige polymer er fortrinnsvis løselig i både vann og diklormetan (DCM).

Her brukes betegenelsen 'biodegraderbar polymer' til å omfatte polymersystemer som kan degraderes til lavmolekylære forbindelser som er kjent for å ta del i den normale meta-bolske prosess. Betegnelsen brukes også i denne sammenheng til å omfatte polymersystemer som kan være festet i det biologiske miljø slik at systemets integritet, og i noen tilfeller av makromolekylene selv, blir påvirket og gir fragmenter eller andre degraderings-biprodukter som kan flyttes vekk fra deres virkeområde, men ikke nødvendigvis fra kroppen.

Forholdet mellom biodegraderbar polymer og vannløselig polymer er i området 99.9:1.0 til 10:90, særlig 90:10 til 10:90.

Egnede biodegraderbare polymerer for framstilling av mikropartiklene er polyestere, slik som polylaktid, polyglykolid, kopolymerer av laktid og glykolid, polyhydroksybutyrat, polykaprolakton, kopolymerer av melkesyre og lakton, kopolymerer av melkesyre og PEG, kopolymerer av a-hydroksysyrer og a-aminosyrer (polypepsipeptider), polyanhydrider, polyortoestere, polyfosfazener, kopolymerer av hydroksybutyrat og hydroksyvalerat, poly-(etylenkarbonat), kopoly(etylenkarbonat), polyetylentereftalat eller blandinger av disse.

De foretrukne resorberbare/biodegraderbare polymerer er laktid-homopolymerer poly(L-laktid), poly(D.L-laktid) og kopolymerer av laktid og glykolid slik som 50:50 poly(DL-laktid koglykolid) (PLG). PLG har fortrinnsvis en molvekt i området 5-100 kD.

Mens poly(etylenglykol) (PEG) er den foretrukne vannløselige polymer for blanding med den biodegraderbare polymer, kan en anvende andre egnete vannløselige polymerer, slik som poly(oksyetylenoksid) (PEO), poly(oksyetylen)-poly(oksypropylen) [PEO PPO], blokk-kopolymerer slik som tri-blokk PEO-PPO-PEO-kopolymerer (Poloxamers, Pluronic) og tetrafunksjonelle blokk-kopolymerer avledet fra den sekvensielle tilsats av propylen-oksid og etylenoksid til erylendiamin (Poloxamin, Tetronics), kopolymerer av PEG med poly(melkesyre), oligomerer av poly(melkesyre), laktider, kopolymerer av PEG og aminosyrer, konjugater av PEG med polysakkarider for eksempel et konjugat framstilt av 40000 MW dekstran og polyoksyetylen-glykol-monometyleter og andre som beskrevet av Duval et al., i Carbohydrate Polymers, 15, (1991), 233-242, konjugater av PEG med proteiner slik som de beskrevet av Nucci et al., i Advances in Drug DeHvery Review, 6, (1981), 113-151, eller med kollagen som beskrevet av Rhee et al i Poly(ethylene glycol) chemistry, Biotechnical and Biomedical Applications, Ed. J. Milton Harris, Plenum Press (1992) eller konjugater av PEG med kolonistimulerende faktor (Colony Stimulating Factor, CSF-1) som beskrevet av Katre N,V, i The conjugation of proteins with polyethylene glycol and other polymers, Adv. Drug Delivery Reviews, 10,91-114 (1993). Konjugater av PEG med bioaktive midler slik som enzymer, vitaminer, steroider og medikamenter slik som 5 fluor-uracil.

Molvekten av PEG er i området 100-100.000. Molvekten av PEO kan med fordel være fra 100.000 til 500.000.

Oppfinnelsen anviser også en framgangsmåte for framstilling av polymermikropartikler som inneholder et aktivt preparat, ved å: a) framstille en vandig løsning, vann-i-olje (w/o) emulsjon eller en suspensjon av det aktive preparat i et første organisk løsningsmiddel; b) blande den vandige løsning, w/o-emulsjonen eller suspensjonen av det aktive preparat med en polymerløsning framskaffet i et andre organisk løsningsmiddel; c) blande emulsjonen framstilt i trinn b) med en kontinuerlig fase omfattende et tredje organisk løsningsmiddel som er blandbart med det første og andre organiske løsningsmidlet

og som ikke er et løsningsmiddel for polymeren.

Den kontinuerlige fasen forårsaker utfelling av polymeren, ekstraksjon av det første og andre løsningsmidlet og herder mikropartiklene.

Mikropartiklene blir deretter oppsamlet, renset og lagret i henhold til vanlige metoder.

Det første og andre organiske løsningsmidlet kan være like eller ulike, og er fortrinnsvis valgt blant diklormetan (DCM), kloroform, aceton, etylacetat, etylformat eller blandinger av disse.

Det tørre aktive preparat kan tilsettes direkte til løsningen av polymer i det andre organiske løsningsmidlet. Følgelig kan løsningsmidlet som anvendes til framstilling av vann-i-olje-emulsjonen av det aktive preparat allerede inneholde den oppløste polymer.

Det tredje organiske løsningsmidlet er fortrinnsvis en lavere alkohol med 1-6 karbonatomer og er fortrinnsvis metanol eller etanol.

Det første organiske løsningsmidlet inneholder fortrinnsvis en stabilisator. Egnede stabilisatorer er Sorbitan-estere, Span 60 (Sorbitan monostearat), glyceryl-monoestere slik som glyceryl monostearat, og nonylfenoletoksylater eller enhver annen stabilisator som er løselig i det første organiske løsningsmidlet. Den kontinuerlige fasen inneholder fortrinnsvis et tensid slik som polyvinylpyrrolidon (PVP) eller ethvert annet tensid som er løselig i det tredje organiske løsningsmidlet.

Teknikken med emulgering/løsningsmiddelinndamping for framstilling av PLG-mikrokapsler er generelt basert på bruk av ublandbare væsker for å framstille små dråper av polymerløsning i en kontinuerlig fase som deretter herder til å danne mikrokapsler ved polymerutfelling og løsningsmiddelfjerning. Et unntak er nanoutfellingsmetoden av Fessi et al der sfæriske partikler kan framstilles ved tilsats av en løsning av PLG i aceton til vann.

I kontrast til dette anvender framgangsmåten ifølge oppfinnelsen blandbare organiske faser slik som DCM og metanol for å danne mikropartikler. Denne framgangsmåten har vist seg å føre til forbedret innfanging av aktivt preparat og gir en vesentlig reduksjon av separasjon av preparatet inn i den kontinuerlige fase.

Betegnelsen 'aktivt preparat' brukes her til å omfatte ethvert middel som en ønsker å administrere til mennesker eller dyr for ethvert formål, slik som terapeutiske, farma-søytiske, farmakologiske, diagnostiske, kosmetiske og profylaktiske midler. Betegnelsen brukes også til å omfatte ethvert middel som en ønsker å administrere til planter for kontrollert frigjøring, slik som agrokjemikalier i form av herbicider, pesticider og gjødningsstoff.

Det aktive preparat er fortrinnsvis vannløselig, og her defineres vannløselig som et materiale med løsbarhet i vann på minst 1 mg/ml.

Det aktive preparat er fortrinnsvis et polypeptid, peptid eller protein, et karbohydrat eller et oligonukleotid slik som DNA.

Egnede aktive preparat er veksthormon, insulin, interferoner (alfa, beta, gamma), krypto-poietin, kolonistimulerende faktorer, parathyroid hormon, 'leutenizing' hormon-firgjørende hormon, kalcitonin, heparin, somatostatin og ulike analoge av disse.

Det aktive preparat kan også være et antigen for bruk i vaksiner, slik som polypeptider, proteiner, glykoproteiner framskaffet fra bakterielle, virale og parasittiske kilder eller framstilt syntetisk. Her brukes begrepet antigen om ethvert materiale som vil forårsake en antistoff-reaksjon av enhver type ved administrasjon. Slike antigener kan administreres ved injeksjon eller til en rekke slimhinner (nasalt, oralt, vaginalt, rektalt, kolonalt).

Vaksiner for behandling av allergi og for autoimmun-sykdommer er godt beskrevet i den kjente teknikk. For eksempel i autoimmun-sykdommer har det blitt foreslått at den lang-somme administrasjon av essensielle faktorer kan være fordelaktig. Slike faktorer kan omfatte insulin for behandling av diabetes og kollagen for behandling av rheumatiod arthritis.

Mikropartiklene er nyttige for avlevering av et bredt spekter aktive preparater og kan administreres via en rekke veier avhengig av preparatet som skal avleveres. Mikropartiklene kan være tilpasset injeksjon, enten intramuskulært, intravenøst, subkutant, intraartikulært eller intraperitonalt. Mikropartiklene kan være tilpasset administrasjon til hudlaget eller overhudslaget i huden ved injeksjon eller med et nålefritt injeksjonssystem. Mikrokapslene kan også være tilpasset administrasjon til slimhinner slik som i nesen, fordøyelseskanalen, tykktarmen, vagina eller rektum, eller administrasjon til øyet.

Mikropartiklene har fortrinnsvis en størrelse i området 10 nm til 200 um. Den valgte størrelse for en spesiell mikropartikkel vil avhenge av det aktive preparat som skal avleveres og den tiltenkte administrasjonsvei.

For oral avlevering har partiklene med fordel en størrelse i området 0.5-5.0 um. For subkutan avlevering er størrelsen med fordel mindre enn 100 um. Mikropartikler for ekstra-vaskulær avlevering til milten, leveren og benmargen har fortrinnsvis en størrelse mindre enn 100 nm.

Mikropartikler for parenteral tilførsel har med fordel en størrelse mindre enn 200 um, fortrinnsvis mindre enn 150 nm. Mikropartikler tilpasset intra-arteriell kjemo-emboliseringsterapi har fortrinnsvis en størrelse opp til 100 nm, og mikropartikler for målretting av et middel til lungekapillarene har med fordel en størrelse på omlag 7 \ im.

Den ønskete partikkelstørrelsen kan oppnås ved å endre prosessparametrene på måter som er velkjente innen fagområdet. For eksempel vil en endring av den aktuelle polymer-typen som brukes og dens molvekt endre partikkelstørrelsen, og en økning i molvekt vil generelt øke partikkelstørrelsen. En økning av polymerkonsentrasjonen vil også øke partikkelstørrelsen.

Mikropartiklene ifølge oppfinnelsen framskaffer et kontrollert avgivelsessystem som er nyttig for avlevering av et bredt spekter aktive midler. En spesielt viktig fordel er funnet med partikler ifølge oppfinnelsen, dvs. at en kan oppnå en en lineær eller nullte-ordens frigjøringsprofil av det aktive preparat. En slik frigjøringsprofil er særlig fordelaktig for den kontrollerte frigjøring av visse bioaktive midler slik som proteiner.

I tillegg har det vist seg at bruk av blandingen av biodegraderbare og vannløselige polymerer i mikropartiklene ifølge oppfinnelsen tillater en vesentlig økning av mengde aktivt preparat innlemmet i partiklene, mens de samtidig gir en lineær frigjøringsprofil. Denne kombinasjonen av egenskaper har ikke blitt oppnådd med kjente partikler omfattende kun biodegraderbare polymerer.

Proteininnholdet i kjente resorberbare PLG-mikropartikler produsert med konvensjonelle emulgerings/løsningsmiddelfordampnings-teknikker (w/o/w) kan økes ved å øke mengde

protein i primæremulsjonen. Det oppstår imidlertid en betydelig eksplosjonsartet frigjøring av protein i løpet av de første 24 timer med frigjøringsforsøk grunnet overflatelokalisering av protein. I tillegg er frigjøringsmønsteret ofte ikke lineært, og er kjennet ekne t ved en rask frigjøringsfase (utbruddseffekt eller spisseffekt) etterfulgt av en lang fase der det frigjøres lite eller intet protein, etterfulgt av en stabil frigjøringsrate (Cohen et al., i Pharmaceutical Research, 8, 1991,713-720 (1991)). I andre tilfeller viser den kumulative mengde av protein frigjort fra resorberbare mikropartikler et lineært forhold med kvadratet av tiden, som uttrykker en prosess kontrollert ved diffusjonsbetinget frigjøring av protein gjennom et nettverk av vannfylte kanaler (Hora et al. i Pharmaceutical Research, 7,1190-1194 (1990)).

Mikropartiklene ifølge oppfinnelsen lider ikke av noen vesentlig eksplosjonsartet fri-gjøring av det aktive preparat etterfulgt av en forsinkelsesperiode med lite eller ingen frigjøring. I stedet har mikropartiklene ifølge oppfinnelsen redusert dette problemet og har vist seg å gi en lineær frigjøring av det aktive preparat.

Siden PEG er lett løselig i vann vil resorpsjonsraten for PLG:PEG-blandete mikropartikler i den foretrukne utførelsen forventes å bli vesentlig modifisert i forhold til det ublandete PLG-system grunnet PEG-utskilling fra mikropartiklene som etterlater en svært porøs matrise. En kan oppnå en detaljregulering av proteinfrigjøring ved adekvate endringer i PEG-karakteristikk og innhold.

Framgangsmåten ifølge oppfinnelsen har også vist seg å hjelpe til med å oppnå en økt ladningsandel av det aktive preparat i partiklene grunnet det tredje organiske løsnings-middel som anvendes i den kontinuerlige fase. I tillegg har innlemmelsen av en stabilisator slik som Span 60 i det første organiske løsningsmidlet vist seg å bidra til å redusere utbruddseffekten eller spisseffekten for mikropartikler ifølge oppfinnelsen.

I en foretrukket utførelse har det vist seg at mikropartikler som inneholder en blanding av PLG og PEG, framstillt ved en framgangsgmåte ved bruk av metanol som det tredje organiske løsningsmiddel, vil medføre en vesentlig økning av ladningsandelen av det aktive proteinpreparat og oppvise et nullteordens frigjøringsmønster for protein i løpet av 30 dager under en in vitro inkubering ved 37°C.

Foretrukne utførelser av oppfinnelsen er illustrert i de etterfølgende eksempler og med henvisning til vedlagte figurer, der

figur 1 viser de kumulative frigjøringsprofiler av OVA fra PLG-mikropartikler framstilt ved bruk av en PLG:PEG-løsning,

figur 2 viser de kumulative frigjøringsprofiler av OVA fra PLG-mikropartikler framstilt ved bruk av PLG.Pluronic-løsning, og

figur 3 viser de kumulative frigjøringsprofiler av insulin fra PLG-mikropartikler framstilt ved bruk av en PLG:PEG-løsning.

Materialer

50:50 poly(DL-laktid-ko-glykolid) [molvekt 9.000, RG503], 75:25 poly(DL-laktid-ko-glykolid) [molvekt 17.000, RG755], 85:15 poly(DL-laktid-ko-glykolid) [molvekt 54.000, RG858], poly(D,L-laktid):(PLC, molvekt 332.000, R208), skaffet fra Boehringer Ingellheim, Tyskland. Polyvinylalkohol (PVA) [1333-23.000, 87-89% hydrolysen], og poly(vinylpyrrolidon) (PVP) [molvekt 40.000] skaffet fra Aldrich Chemical Co., Inc. Dorset, U.K. Diklormetan (DCM), og metanol (HPLC-kvalitet) skaffet fra Fisons, Loghborough, U.K. Ovalbumin (OVA) (kvalitet V), Insulin, Meutinising hormone releasing hormone' (LHRH), polyetylenglykol [molvekt 8.000] og Span 60 ble skaffet fra Sigma chemical Co., Dorset, U.K. Pluronic polyetylenoksid-polypropylenoksid-blokk-kopolymerer L44, L121, L122, L123 og F127 ble framskaffet fra BASF Co., Parsippany, NJ, USA. Alle materialene ble brukt som levert.

Blandingene beskrevet i de etterfølgende eksemplene ble alle laget ved bruk av 50:50 PLG-kopolymer (RG503) med mindre annet er angitt.

Eksempel 1. Basisformulering av mikropartikler

En løsning av Span 60 i DCM (2 ml, 0.5% vekt/volum) ble emulgert med en vandig ovalbuminløsning (OVA) (1 ml, 30 mg/ml) ved bruk av en Silverson-homogenisator (Silverson machines, Chesam Bucks U.K.) for å framskaffe primæremulsjonen. Emulsjonen ble deretter blandet ved høy hastighet i 2 minutter med 5 ml polymerløsning (6% vekt/ volum PLG i diklormetan) og emulgert i 4 minutter med en kontinuerlig fase, metanol (20 ml) inneholdende 10% vekt/volum PVP som emulgeringsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset ved sentrifugering og resuspendering i destillert vann totalt tre ganger og deretter frysetørket. Sluttproduktet ble lagret i en eksikator under 4°C.

Eksempel 2. Effekt av Span-konsentrasjon i primæremulsjonen

En løsning av Span 60 i DCM (2 ml) (0.1-20.0% vekt/volum) ble emulgert med en vandig OVA-løsning (1 ml, 30 mg/ml) ved bruk av en Silverson-homogenisator for å framskaffe en primæremulsjon. Den resulterende emulsjonen ble deretter emulgert ved høy hastighet med en polymerløsning (6% vekt/volum PLG i DCM) og emulgert med en kontinuerlig fase av metanol med 10% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset, frysetørket og lagret som beskrevet foran.

Bestemmelse av OVA- andel i mikropartikler

3-5 mg nøyaktig innveide frysetørkete mikropartikler ble behandlet med 1.0 ml 0.1 M NaOH inneholdende 5% vekt/volum SDS ved risting over natta på en Ika Vibrax - VXR-rister. Prøven ble sentrifugert og en BCA protein-mikroanalyse ble brukt for å bestemme OVA-konsentrasjonen i supernatanten mot en serie av OVA-standarder framstilt i 0.1M NaOH inneholdende 5% vekt/volum SDS. Hver prøve ble analysert to ganger.

Partikkelstørrelse

Partikkelstørrelsen ble bestemt med laserdifrfaktometri ved bruk av en Malvern 2600D laser. Midlere partikkelstørrelse ble uttrykt som volum midlere diameter (vmd) i um.

Span i mikropartikkelblandingen har vist seg å være effektiv til å redusere spisseffekten eller utbruddseffekten av overflateprotein, og innvirke på partikkelstørrelsen og protein-nyttelast (tabell 1). Når Span 60 ble brukt som stabilisator i primæremulsjonen, økte proteinandelen med økende konsentrasjon av tensid til en maksimalverdi på omlag 16% OVA ved 3% Span-konsentrasjon, og avtok deretter med økende tensidkonsentrasjon fra 3 til 20%. Den midlere partikkelstørrelsen var mellom 10 og 20 um, og de minste partiklene ble oppnådd i fravær av Span 60.

Eksempel 3. Effekten av løsningsforholdet mellom PLG og PEG 8000

En løsning av Span 60 (3.0%, 2 ml) i DCM ble emulgert med en vandig OVA-løsning (1 ml, 30 mg/ml) for å framskaffe primæremulsjonen. Den resulterende w/o-emulsjonen ble deretter emulgert ved høy hastighet med en polymerløsning (6% vekt/volum) bestående av PLG blandet med ulike forhold av PEG 8000 i DCM. Emulsjonen ble deretter blandet med en kontinuerlig fase av metanol inneholdende 10% vekt/volum PVP som emulsjons-stabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset, frysetørket og lagret som beskrevet foran.

Med 3% Span 60 som tensid i primæremulsjonen ble det funnet et klart forhold mellom protein-innlemming og løsningsforhold mellom PLG og PEG 8000 (tabell 2). Løsnings-forholdet 1:3 førte til den høyeste proteinandel (72%). Proteininnlemmingen (% vekt/vekt) økte med økende løsningsforhold fra 0 til 1:3 og avtok deretter med økende løsningsforhold fra 1:4 til 1:5. Den midlere partikkelstørrelse varierte mellom 7 og 18 nm avhenig av løsningsforholdet mellom PLG og PEG, og den minste partikkelstørrelsen (6.6 um) ble oppnådd ved bruk av et løsningsforhold mellom polymerene lik 1:1.

Eksempel 4. Effekt av stabilisatorkonsentrasjon i den kontinuerlige fase

En løsning av Span 60 (0.5%, 2ml) i DCM ble emulgert med en vandig OVA-løsning (1 ml, 30 mg/ml) for å framskaffe primæremulsjonen. Den resulterende emulsjonen ble deretter emulgert ved høy hastighet med en polymerløsning (6% vekt/volum 1/5 PLG PEG 8000 i DCM) og emulgert med en kontinuerlig fase av metanol med innhold av 5-25% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset, frysetørket og lagret som beskrevet foran.

Den midlere partikkelstørrelse varierte mellom 10 og 20 fim (tabell 3). Proteinandelen forble ganske konstant mellom 30 og 36% (tabell 1). Det ble ikke registrert noen vesentlig effekt på PVP-konsentrasjonen mellom 5 og 25% på OVA-innlemming.

Eksempel 5. Effekt av reagensvolum på mikropartikkelkarakteristikk framstilt ved bruk av PLG/PEG-løsninger.

Effekten på mikropartikkelkarakteristikk ved økning av polymerløsningens volum. Volumforholdet mellom OVA, Span, polymerløsning og kontinuerlig fase (1/2/5/20) ble holdt konstant. En løsning av Span 60 (0.5%) i DCM (2,4 og 8 ml) ble emulgert med en vandig OVA-løsning 30 mg/ml, (1,2 og 4 ml). Den resulterende emulsjon ble deretter blandet ved høy hastighet med polymerløsningen (6% vekt/volum PLG/PEG 8000 : 1/5 i DCM) (5, 10, 20 ml) og emulgert med kontinuerlig fase (20,40 og 80 ml) av metanol med innhold av 15% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset, frysetørket og lagret som beskrevet foran.

Effekten på mikropartikkelkarakteristikk ved økning av volumet av polymerløsning (ved konstant volumforhold av OVA/Span/polymerløsning/kontinuerlig løsning/( 1/2/5/20)) er vist i tabell 4. Proteininnlemmingen viste seg å øke med økende volum fra 31.6% vekt/vekt til 47.8 vekt/vekt og partikkelstørrelsen avtok med økende volum fra 16.7 til 2.1 um.

Eksempel 6. Protein-frigjørende mikropartikler

In vitro - frigjøring av ovalbumin fra mikropartikler

En serie av prøverør som hver inneholdt omlag 20 mg frysetørkete mikropartikler (nøyaktig innveide) og dispergert i 2.0 ml PBS, ble holdt i et vannbad ved 37°C med risting nå og da. Mikropartikkelprøvene ble periodisk sentrifugert (3.800 opm i 5 minutter), supernatanten ble fjernet og proteininnholdet i supernatanten ble analysert ved bruk av en BCA proteinanalyse. Frisk PBS ble tilsatt til mikropartiklene og inkubering ble fortsatt. Frigjøringsprofiler ble beregnet både i lys av kumulativ frigjøring (%) mot inkuberingstid og ug O V A/mg mikropartikler mot inkuberingstid.

Proteinfrigjøringskarakteristikk for mikropartikler framstilt ved framgangsmåten ifølge oppfinnelsen er vist i figur 1. Kumulativ frigjort mengde (ug/mg) mot tiden er vist. En kan se at frigjøringsmønsteret føger en nullte-ordens frigjøringsprofil. De blandete PLG/PEG-partiklene framstilt i henhold til oppfinnelsen fører til en minst firedoblet økning av proteinfrigjøring sammenliknet med PLG-mikropartikler, framstilt i henhold til den kjente teknikk (Wang et al.).

Eksempel 7. Mikropartikler framstilt av blandete løsninger av laktid-polymerer og

PEG

OVA-fylte mikropartikler ble framstilt i henhold til framgangsmåten beskrevet i eksempel 3 men ved bruk av polymerer med ulike forhold mellom laktid og glykolid i en . l:2-blanding med PEG. Mikropartikkel-karakteristikken er vist i tabell 5. Den maksimale proteinandel på rundt 40% ble oppnådd ved bruk av poly(D,L-Iaktid)polymer med PEG 8000. Den minste partikkelstørrelsen ble oppnådd ved bruk av 75:25 PLG. En kan følgelig se at bruken av ulike biodegraderbare polymerer i mikropartikkelblandinger som den langsomt resorberende fase kan tillate en variasjon av proteinandel og mikropartikkel-størrelse.

Midlere volumdiameter (vmd); Partikkeldiameter d(90): 90% under dette området; Partikkeldiameter d(10): 10% under dette området.

Eksempel 8. Effekten av løsningssammensetning PLG:Pluronic 127 på mikropartikkelkarakteristikk

En løsning av Span 60 (2 ml, 0.5% vekt/volum) i DCM ble emulgert med en vandig OVA-løsning (1 ml, 30 mg/ml) ved bruk av en Silverson homogenisator for å framstille en primæremulsjon. Den resulterende emulsjonen ble deretter blandet ved høy hastighet med en 6% (vekt/volum) polymerløsning framstilt ved samtidig oppløsing av PLG og Pluronic F127 i DCM i ulike forhold: 3:1,1:1, 1:2 og 1:3. Den resulterende w/o-emulsjonen ble blandet med en kontinuerlig fase av metanol med innhold av 15% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator, og den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt med en magnet-rører i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset, frysetørket og lagret som beskrevet i eksempel 1.

Prøver er i teksten benevnt med hensyn til forholdet mellom PLG og Pluronic i start-polymerløsningen.

Effekten av løsningssammensetningen av PLG:Pluronic F127 på mikropartikkel-karakteristikken er vist i tabell 6. Blanding av Pluronic F127 og PLG fører til en forbedret proteininnfanging eller -andel i forhold til PLG-mikropartkler. Den maksimale innlemming oppnådd lik omlag 30% (1:2 PLG:Pluronic F127) er nesten det dobbelte av det som oppnås med PLG (16%) i mikropartikler av tilsvarende størrelse. Det var intet åpenbart forhold mellom proteininnlemming og forhold mellom PLG:Pluronic F127 (tabell 6). Mikro-partikkelstørrelsen ser ut til å avta med økende forhold mellom Pluronic F127 i utgangs-løsningen fra 17.4 (im (3:1) til 6.4 (im (1:3). Forhold mellom PLG og Pluronic F127 over 1:3 ga intet resultat på mikropartikkeldannelsen.

Midlere volumdiameter (vmd); Partikkeldiameter d(90): 90% under dette området; Partikkeldiameter d(10): 10% under dette området. Resultatene i tabellen tilsvarer 2 separate satser av mikropartikler.

Eksempel 9. Effekt av reagensvolum på mikropartikkelkarakteristikk PLG- Pluronic blandet løsning

Volumforholdet mellom OVA/Span/polymerløsning/kontinuerlig fase (1/2/5/20) ble

holdt konstant. En vandig OVA-løsning (1,2 og 4 ml) ble emulgert med en løsning av Span 60 (0.5% vekt/volum) i DCM (hhv.2,4 og 8 ml). Den resulterende emulsjonen ble deretter blandet ved høy hastighet med en polymerløsning (6% vekt/volum, 1:1 PLG:Pluronic F127 i DCM) (5,10 og 20 ml) og emulgert med en kontinuerlig fase (20,40 og 80 ml) av metanol med innhold av 15% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset, frysetørket og lagret som beskrevet i eksempel 1.

Protein-innlemmingen ble funnet å være upåvirket ved økning av reagensvolumet ved et konstant volumforhold (tabell 7). Mikropartikkelstørrelsen hadde en tendens til å øke med en økning av reagensvolum, og partikkelstørrelsesfordelingen ble forbedret.

De små mikropartiklene med størrelse 3-4 um framstilt ved å øke reagensvolumet er potensielt egnet for intravenøs administrasjon og orale vaksineblandinger. I det sistnevnte tilfellet blir mikropartikkelsamvirke med Peyer's plaster forbundet med lymfevev forbedret dersom partikkelstørrelsen er mindre enn 5 um.

Eksempel 10. Mikropartikler framstilt av blandete løsninger av laktidpolymerer og

Pluronic

Effekt av. laktidpolymertype på mikropartikkelkarakteristikk

OVA-holdige mikropartikler ble framstilt i henhold til framgangsmåten beskrevet i eksempel 8 men ved bruk av polymerer med ulike forhold mellom laktid og glykolid i en 1:1-blanding med Pluronic F127.

Den maksimale ladning på omlag 40% OVA ble oppnådd ved bruk av en 75:25 PLG kopolymer (tabell 8). Mikropartikkelstørrelsen økte med økende laktidinnhold i kopolymeren. Bruken av poly(D,L-laktid) førte ikke til mikropartikkeldannelse.

Eksempel 11. Mikropartikler framstilt fra blandete løsninger av PLG og Pluronic Effekt av Pluronic på mikropartikkelkarakteristikk

Den medvirkende effekt av Pluronic PEO-PPO kopolymerer slik som Pluronic L121 har blitt rapportert av flere arbeidsgrupper (Hunter et al). Flere andre preparater som anvender PEO-PPO kopolymerer med kortere PPO- eller lengre hydrofile PEO-kjeder viste også en medvirkende aktivitet. Mikropartikkelvaksiner framstilt av blandinger av PLG og Pluronic kan derfor føre til forbedret hjelpeeffekt.

OVA-holdige mikropartikler ble framstilt i henhold til framgangsmåten beskrevet i eksempel 8 men ved bruk av ulike typer Pluronic PEO-PPO kopolymerer i en 1:2 blandingsløsning med PLG og en økende polymerkonsentrasjon til 3%.

Effekten av Pluronic på mikropartikkelkarakteristikk er vist i tabell 9. Et OVA-innhold på omlag 40% i tilsvarende store mikropartikler på 3.9-6.2 um ble oppnådd rutinemessig. Det ble ikke funnet noe klart forhold mellom mikropartikkelstørrelse og Pluronic (tabell 9). Den høye OVA-andel kan dels være forårsaket av bruken av et lavere polymerløsnings-innhold (dvs. 3% heller enn 6%).

Eksempel 12. OVA-frigjøring fra mikropartikler framstilt fra PLG:Pluronic-blandete løsninger

Den kumulative frigjøring av OVA fra ulike mikropartikkelformuleringer er vist i figur 2 mot tid. Endringen i frigjøringsmønster og frigjort mengde oppnådd ved å blande PLG med Pluronic F127 i løsning for å framstille bærermatrisen er framtredende. Den kumulative frigjorte mengde for 1:2 og 1:3 PLGrPluronic-mikropartikler etter en måneds inkubering i PBS ved 37°C er tilsvarende og utgjør henholdsvis 100 ug OVA/mg mikropartikler og 110 ug OVA/mg mikropartikler. Resultatene fra kurvetilpasningsprogrammer (PCNONLIN) foreslår at proteinfrigjøring fra systemene 1:2 PLG:Pluronic og 1:3 PLG: Pluronic retter seg etter Higuchi-modellen (frigjort mengde avhenger av kvadratroten av tiden). Diffusjonshastighetskonstanter (D) er henholdvis 19.8 og 20.4 (ug/mg dag0 5).

I tilfellet med PLG:Pluronic-mikropartikler 3:1 og 1:1 er proteinfrigjøringsmønsteret tilsvarende og ser ut til å følge en lineær nullte-ordens frigjøringsprofil med en frigjørings-hastighetskonstant (k„) på henholdsvis 1.3 og 0.97 (ug/mg dag).

Den raske og effektive proteinavgivelse som karakteriserer PLG:Pluronic-mikropartikIer forventes å bli lettere med Pluronic-modifiserte innvendige overflater i bæreren som kan modulere protein/polymer-samvirke. Egenskapene ved mikropartikkelmatrisen slik som tilbøyeligheten til poreutvikling og mønsteret for medikament-frigjøring forventes å være kontrollerbare ved å justere mengden og molekylkarakteristikken hos Pluronic-kopolymeren innlemmet i utgangsløsningen. Proteinfrigjøringshastigheten og den kumulative frigjorte mengde forventes å øke med økende mengder av hydrofile Pluronic-kopolymerer i blandingen og med avtakende molvekt av Pluronic-kopolymerer.

Eksempel 13 Insulin-holdige mikropartikler

Framstilling

En løsning av Span 60 (2 ml, 0.5% vekt/volum) i DCM ble emulgert med en vandig insulinløsning (1 ml, 50 mg/ml) for å framskaffe en primæremulsjon. Den resulterende emulsjonen ble deretter blandet ved høy hastighet med en 5 ml 6% (vekt/volum) polymer-løsning framstilt ved samoppløsing av PLG og PEG 8000 i DCM i et forhold på 1:2. Den resulterende w/o-emulsjon ble blandet med 20 ml kontinuerlig fase av metanol med innhold av 10% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt med en magnetrører i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset ved sentrifugering og resuspendert i destillert vann i alt tre

ganger og deretter frysetørket. Sluttproduktet ble lagret i eksikator under 4°C.

Bestemmelse av insulinandel i mikropartikler med HPLC

Testmetode: Det kromatografiske system besto av en Lichrospher 100 RP-18 5 (im

partikkeldiameter (Merck) (0.46 x 15 cm) kolonne, en LKB 2150 HPLC pumpe for tilførsel av løsningsmiddel, en Gilson-fortynner modell 401 prøveinjektor og en LKB 2152 HPLC-kontroller. Topp-detektering ble utført ved UV-absorbans ved 220 nm ved bruk av en LKB 2151 variabel bølgelengde-detektor. Kvantifisering (av toppareal) og registrering av kromatogram ble utført ved bruk av en HP 3394A integrator.

Den mobile fasen besto av acetonitril:vann i et forhold på 32:68, med 0.06% TFA, som ble gassfriet med helium før bruk. En strømningsrate på 2.0 ml/min ble etablert ved romtemperatur, som førte til en oppholdstid for insulintoppen på 6 minutter. Det injiserte prøvevolumet var satt til 50 ul og prøvene ble analysert i tre paralleller. Den minimale detekterbare konsentrasjon av insulin var 1 ug/ml, og regresjonsforholdet for kalibrerings-kurven for insulintopparealet mot konsentrasjon (mellom 1 og 100 ug(ml) var over 0.997.

Ekstraksjon av insulin fra mikrosfærer:

Insulin ble ekstrahert fra mikropartikler i henhold til følgende framgangsmåte. 10 mg insulin-holdige mikropartikler ble løst i 1 ml N,N-dimetylacetamin : l-metyl-2-pyrrolidon (l:l-forhold) og tilsatt til 1.0 ml acetonitril. Blandingen ble omrørt ved bruk av en mekanisk ristemaskin i 3 minutter. To milliliter 0.1 N fosfatbufferløsning (pH 7.4) ble tilsatt, og rørinnholdet ble sentrifugert ved. 3500 opm i 10 minutter. Supernatanten ble sentrifugert på nytt ved 13.600 opm i 5 minutter hvoretter 50 ul av denne løsningen ble analyserrt med HPLC. Hver prøve ble analysert i tre paralleller og insulinkonsentrasjonen ble bestemt ved å sammenlikne med en kalibreringskurve.

In vitro- frigjøring av insulin fra mikropartikler: En serie prøverør, hver med omlag 20 mg frysetørkete mikropartikler (nøyaktig innveid), ble dispergert i 2.0 ml PBS inneholdende

0.01% metylcellulose, og holdt i et vannbad ved 37°C med tilfeldig røring. Mikropartikkel-prøvene ble sentrifugert periodisk ved 3.600 opm i 5 minutter, og supernatanten ble samlet og sentrifugert ved 13600 opm i 5 minutter. Femti mikroliter av denne løsningen ble injisert på HPLC-kolonna. Frisk PBS ble tilsatt til mikropartiklene og inkubering ble fortsatt. Fri-gjøringsprofiler ble beregnet både i lys av kumulativ frigjøring (% vekt/vekt) med inkuberingstid og kumulativ frigjøring (ug insulin/mg mikropartikler) med inkuberingstid.

Det initielle insulininnhold i mikropartikler, og insulininholdet i mikropartikler etter vasking i PBS-løsning ved romtemperatur i 4 timer for å fjerne overflateinsulin, er vist i tabell 10. Den initielle insulinandel var omlag 17% vekt/vekt, som ble redusert etter vasking til et nivå på omlag 5%. En stor del av insulinet som opprinnelig var forbundet med mikropartiklene er følgelig lokalisert ved overflata.

Den kumulerte frigjorte mengde av insulin fra vaskede mikropartikler etter en måneds inkubering i PBS ved 37°C var omlag 30 ug insulin/mg mikropartikler (figur 3). En betydelig spisseffekt av overflatelokalisert insulin fant sted fra vaskede mikropartikler i løpet av de tre første dagene med frigjørings-tester og utgjorde omlag 47% av insulininnholdet. Etter tre dager skjedde det en jevn frigjøring av insulin ved en frigjøringsrate på 0.6 ug/mg/dag.

I den kjente teknikk er det gjort forsøk på å innlemme insulin i mikropartikler. Kwong et al. beskrev framstilling av insulinholdige polymelkesyrepartikler som hadde en størrelse over 100 (im. Det skjedde en eksplosiv frigjøring i løpet av den første timen ved 0°C på mer enn 50% av insulininnholdet. Det resterende insulinet ble frigjort langsomt. Varigheten av partikkelytelsen kunne variere fra noen få timer til flere dager. Insulininnholdet i disse partiklene beskrevet i den kjente teknikk var mindre enn 5% vekt/vekt før vasking. Denne verdien falt til 2% vekt/vekt eller mindre etter vasking.

Eksempel 14. LHRH-holdige mikropartikler

Framstilling

En løsning av Span 60 (2 ml, 0.5% vekt/volum) i DCM ble emulgert med en vandig LHRH-løsning (1 ml, 50 mg/ml) for å framstille en primæremulsjon. Den resulterende emulsjon ble deretter blandet ved høy hastighet med en 5 ml 6% (vekt/volum) polymer-løsning framstilt ved samtidig oppløsing av PLG og PEG 8000 i DCM i et forhold på 1:2. Den resulterende w/o-emulsjonen ble blandet med 20 ml kontinuerlig fase av metanol med innhold av 10% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt med en magnetrører i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset ved sentrifugering og resupendering i destillert vann i alt tre ganger og deretter frysetørket. Sluttproduktet ble lagret i en e ksi ka tor under 4°C.

Analyseprosedyren som ble brukt til å bestemme LHRH-andelen i mikropartiklene er beskrevet i eksempel 13.

LHRH-innholdet i mikropartiklene og det tilsvarende mikropartikkelstørrelsesornråde er vist i tabell 11.

Eksempel 15 DNA-holdige mikropartikler

En løsning av Span 60 i DCM (2 ml, 0.5% vekt/volum) ble emulgert med 1 ml vandig DNA-løsning (1 mg plasmid PT 7T3,400 ul vann, 200 ul etanol, 400 ul TE (Tris/EDTA) pH 8.5). Emulsjonen ble blandet i 2 minutter med 5 ml polymerløsning i DCM (6% vekt/ volum, 1.1 PLG.PEG) og emulgert i 4 minutter med en kontinuerlig fase av metanol (20 ml) med innhold av 10% vekt/volum PVP som emulsjonsstabilisator. Den resulterende w/o/o-emulsjonen ble omrørt i 3-4 timer under omgivende betingelser for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset ved sentrifugering og resuspendert i destillert vann etterfulgt av frysetørking og lagring i eksikator under 4°C.

En undersøkelse av mikropartiklene ved bruk av scanning elektronmikroskopi avdekket to populasjoner av grovt sett sfæriske mikropartikler, en med diameter i området 10-40 um og den andre med en midlere diameter på omlag 100 um.

Mikropartikler ble behandlet med kloroform/vann for å ekstrahere DNA, og DNA ble detektert ved agarosegel-elektroforese. Nærværet av et bånd på gelen ble avdekket med en UV transluminator som bekreftet nærværet av DNA i mikropaitikkelprøven.

Sammenlignings-eksempel

I det følgende sammenlignes innlemmingen av aktiv stubstans i et PLG-PEG system og et PLG-blokk-kopolymer system.

Framstilling av mikrosfærer ved bruk av PEG 8000 som vannløselig polymer

En løsning av Span 60 sorbitan monostearat (Sigma Chemical, Dorset, UK) (2 ml, 3,0 % w/v) i diklormetan (DCM) ble emulgert med en ovalbuminholdig (OVA) vandig løsning (1 ml, 30 mg/ml) i et 50 ml begerglass i 30 sekund. OVA var av grad V (45 kD) fra Sigma, Chemical, Dorset, UK. Den resulterende emulsjonen ble deretter blandet ved høy hastighet (13600 rpm) i en Silverson homogenisator (Silverson Machine, Chesham, UK) i 2 minutt med 5 ml av en 6 % (w/v) polymerløsning framstilt ved å sam-oppløse 50:50 PLG og PEG DCM. Den resulterende w/o emulsjonen ble blandet i 4 minutt ved høy hastighet, med 20 ml av en metanol-løsning i kontinuerlig fase, inneholdende 10 % w/v polyvinyl pyrollidone (PVP) (MW 40 kD) (Aldrich Chemical Co., Dorset UK) som en emulsjons-stabilisator. Den resulterende w/o/o emulsjonen ble rørt i 3-4 timer ved bruk av en magnetisk rører under omgivende forhold, for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset ved sentrifugering og resuspendert i destillert vann totalt tre ganger, og deretter frysetørket. De endelig produktene ble lagret i et tørkeapparat under 4°C.

Framstilling av mikros/ ærer ved bruk av PEG- blokk- kopolymere som vannløselig polymer. En OVA vandig løsning (1 ml, 30 mg/ml) ble emulgert med en løsning av Span 60 (2 ml, 0,5 w/v) i DCM for å gi den primære emulsjonen. Den resulterende emulsjonen ble deretter blandet ved høy hastighet i 2 minutter med 5 ml av en 6% (w/v) polymerløsning framstilt ved å sam-oppløse PLG og Poloxamer 407 i DCM. Den resulterende w/o emulsjonen ble blandet med 20 ml av metanol-løsning i kontinuerlig fase, inneholdende 15 vekt% PVP som emulsjons-stabilisator i 4 minutter, og den resulterende w/o/o løsningen ble deretter rørt med en magnetisk rører i 3-4 timer under omgivende forhold for å ekstrahere DCM. Mikropartiklene ble renset ved sentrifugering og resuspensjon i destillert vann, totalt tre ganger og deretter frysetørket. Det endelige produktet ble lagret i et tørkeapparat under 4 .

°C.

Bestemmelse av mengde OVA i mikropartikler

En prøve på 8-10 mg frysetørkete mikropartikler, nøyaktig oppveid, ble behandlet med 3,0 ml 0,1 M NaOH inneholdende 5% w/v SDS ved å riste over natta på en Ika Vibrax-VXR rister (Ika-Labortechnik, Tyskland). Prøven ble sentrifugert (2000 g, 5 minutt) og en BCA protein-analyse ble benyttet for å bestemme protein-konsentrasjonen i supernatanten mot en serie av protein-standarder framstilt i 0,1 M NaOH inneholdende 5 % w/v SDS. Kalibrerings-løsningene inneholdt fra 5 til 100 ug/dl OVA og ble benyttet for å lage en kalibrerings-kurve over UV-absorbans-verdi mot prøve-konsentrasjon. Hver prøve ble analysert tre ganger.

Prosentvis OVA innlemming vekt/vekt (% w/w) ble uttrykt ved å relatere mengden analysert protein mot vekten av mikropartikkel-prøven,

Prosentvis innlemmings-effektivitet ble deretter bestemt ved å relatere den totale vekten av innlemmet protein i mikropartikkel-serien, til utgangsvekten av proteinet

Resultatene er vist i tabell 12 nedenfor.

Resultatene viser klart en uventet forbedring i innlemmings-effektiviteten for PEG-blokk kopolymer-systemet.

Litteraturhenvisninger

1. Florence, et al., Controlled release of drug : polymers and aggregate systems,

Morton Rosoff, VCH publishers, N.Y., 1988,163-184.

2. Watts, et al., Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst., 7, (1990) 235-259.

3. Cohen, et al., Pharm. Res., 8 (1991) 713-720

4. Wang, et al., J. Cont. Rel, 17, (1991) 23-32.

5. Fong, et al., J. Cont. Rel, 3, (1986) 119-130.

6. Bodmeier, et al., Pharm. Res., 4, (1987) 465-471.

7. Benita, et al., J. Pharm. Sei., 73. (1984) 1721-1725.

8. Alonso, et al., Pharm. Res. 10 (1993) 945-953.

9. Leelarasamee, et al., J. Microencapsulation. 3. (1988) 147-157.

10. Wada, et al., Pharm. Res., 8, (1991) 1292-1296.

11. Ogawa, et al., Chem. Pharm. Bull., 36, (1988) 1095-1103.

12. Jeffery, et al., Int. J. Pharm, 77, (1991) 169-175.

13. Jeffery, et al., Pharm. Res., 10 (1993) 362-368.

14. Singh, et al., Pharm. Res., 8, (1991) 958-961.

15. Singh, et al., Int. J. Pharm., 85, (1992) R5-R8.

16. Raghuvanshi, et al., Int. J. Pharm., 93, (1993) R1-R5.

17. Visscher, et al., J. Blomedical Material Res., 22, (1988) 733-746.

18. Eldridge, et al., Infer. Immun., 59 (1991) 2978-2983.

19. Eldridge, et al., Curr. Top. Micro. Immunol., 146, (1989) 59-66.

20. Jenkins, et al., Int. J. Pharm, 102, (1994) 261-266.

21. Jani, et al., J. Pharm. Pharmacol., 41, (1989) 809-812.

22. Eldridge, et al., J. Cont. Rel., 11, (1990) 205-209.

23. Hora, et al., Pharm. Res., 7, (1990) 1190-1194.

24. Smith, et al., Anal. Biochem., 150, (1985) 76-82.

25. Fessi, et al., Demande de Brevet D'invention, Republique Francaise, No. 2608900, 1986.

26. Kwong et al., J. Contro. Release 4, (1986) 47-62.

27. Hunter et al., Vaccine, 9 (1991) 250-256.

Claims

1. Mikropartikkel omfattende en blanding av en biodegraderbar polymer, en vannløselig polymer, og en aktiv substans, karakterisert ved at mikropartikkelen oppviser en frigjøringsprofil for den aktive substans som er lineær med tiden.

2. Mikropartikkel ifølge med krav 1, karakterisert ved at den vannløselige polymer er en blokk-kopolymer omfattende PEG som en av blokkene.

3. Mikropartikkel ifølge et av kravene 1 eller 2, karakterisert ved at mikropartiklene har en størrelse i området 10 nm til 200 um.

4. Mikropartikkel ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at den biodegraderbare polymer er en laktid-homo-polymer eller en kopolymer av laktid og glykolid.

5. Mikropartikkel ifølge krav 4, karakterisert ved at den biodegraderbare polymer er poly(laktid-ko-glykolid) med en molvekt i området 5-100 kD.

6. Mikropartikkel ifølge et av de foregående krav, karakterisert den aktive substansen er et peptid, polypeptid eller et protein.

7. Mikropartikkel ifølge et av kravene 1-5, karakterisert ved at den aktive substansen er DNA, en vaksine, et allergen eller et antistoff.

8. Mikropartikkel ifølge krav 6, karakterisert ved at den aktive substansen er insulin, LHRH eller en analog av det, et veksthorom, interferon, kolonistimulerende faktor, somatostatin eller et analog av det.

9. Framgangsmåte for framstilling av mikropartikler i samsvar med krav 1, karakterisert ved å omfatte: a) framstilling av en vandig løsning, vann-i-olje (w/o) -emulsjon eller en suspensjon av den aktive substans i et første organisk løsningsmiddel, b) blanding av den vandige løsning, w/o-emulsjonen eller suspensjonen av den aktive substans med en polymerløsning etablert i et andre organisk løsningsmiddel, c) blanding av emulsjonen fra trinn b) med en kontinuerlig fase omfattende et tredje organisk løsningsmiddel som er blandbar med det første og andre løsningsmidlet og som ikke er løsningsmiddel for polymeren.

10. Framgangsmåte for å framstille en mikropartikkel i samsvar med et av kravene 1-8, omfattende en framgangsmåte i samsvar med krav 9, karakterisert ved at løsningsmidlet som anvendes til framstilling av vann-i-olje emulsjonen eller suspensjonen av den aktive substans inneholder den løste polymer, idet trinn b utelates.

11. Framgangsmåte ifølge krav 9 eller 10, karakterisert ved at det anvendes en polymer-løsning omfattende en blanding av en biodegraderbar polymer og en vannløselig polymer.

12. Framgangsmåte ifølge et av kravene 9 til 11, karakterisert ved at det som nevnte tredje organiske løsningsmiddel anvendes en lavere alkohol med 1-6 karbonatomer.

13. Framgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at det som nevnte tredje organiske løsningsmiddel anvendes metanol.

14. Framgangsmåte ifølge et av kravene 9 til 13, karakterisert ved at det første og andre organiske løsningsmidlet velges lik eller ulik og velges blant gruppen bestående av diklormetan (DCM), kloroform, aceton, etylacetat, etylformat eller blandbare blandinger av disse.

15. Framgangsmåte ifølge et av kravene 9 til 14, karakterisert ved at det første organiske løsningsmidlet som anvendes inneholder en stabilisator.

16. Framgangsmåte ifølge et av kravene 9 til 15, karakterisert ved at det anvendes en kontinuerlig fase inneholdende et tensid.

17. Bruk av en mikropartikkel ifølge et av kravene 1-8, ved administrasjon av en aktiv substans til et dyr eller menneske.

18. Mikropartikkel omfattende en blanding av en biodegraderbar polymer, en vannløselig polymer og en aktiv substans, og som kan oppnås ved en framgansmåte i samsvar med et av kravene 9 til 16, karakterisert ved at mikropartikkelen oppviser en frigjøringsprofil for den aktive substansen, som er lineær med tid.

19. Mikropartikkel omfattende en blanding av en biodegraderbar polymer, en vannløselig polymer og en aktiv substans, og som kan oppnås ved en framgansmåte i samsvar med et av kravene 9 til 16, karakterisert ved at den vannløselige polymeren er en blokk-kopolymer omfattende PEG som en av blokkene.

20. Mikropartikkel som kan oppnås ved framgangsmåten i samsvar med et av kravene 9 til 16.