KR100348397B1 - 경구관용유도용조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 자가면역 질환을 치료하기 위한 새로운 약제 전달 시스템을 제공하며, 이 시스템은 폴리머와 여기에 분산된 면역학적 관용-유도 물질(immunological tolerance-induction agent)을 함유하는 미세입자(nanoparticles)로 이루어진 조성물로서 지속적으로 면역학적 경구 관용 유도를 일으키게 된다. 이 조성물은 경구 투여시에 장내에 효과적으로 침투하여종래 방법보다 효율적으로 관용-유도를 일으킬 뿐만 아니라, 장내에서 상기 물질을 장기간 서서히 안정적으로 유리시킴으로써 1회 투여만으로도 장기간에 걸쳐 치료효과를 얻을 수 있다

Description

경구 관용 유도용 조성물 {Oral Tolerance Induction}

본 발명은 지속적이고 효과적인 관용 유도(tolerance induction) 치료를 위한 새로운 약물 전달시스템에 관한 것이고, 보다 상세하게는 면역학적 관용 유도 물질을 인캡슐화하여 얻은 미세입자를 함유하는 경구투여용 약리학적 조성물 및 상기 조성물을 경구투여하여 면역학적인 효과를 달성하는 방법에 관한 것이다.

경구 관용 (Oral peripheral tolerance)은 항원을 경구투여하여 항원-특이적면역반응을 억제시키는 기법이며, 1988년부터 항원 특이 관용 유도 (antigen specific tolerance induction) 기법을 여러 가지 자가면역 질환 (autoimmunediseases)을 일으키는 실험동물에서 치료결과를 보고하기 시작하였다. 현재까지 알려진 자가면역 질환 모델로는 다발성경화증 (multiple sclerosis), 홍체염 (uveitis), 당뇨병 그리고 류마티스 관절염 등이 있다.

Weiner 등은 처음으로 다발성 경화증 환자에게 소 미엘린 단백질 (bovine myelin protein)을 경구투여하여 관용유도 치료를 시도하였다. 임상적으로 뚜렷한 치료효과는 관찰되지 않았지만, 환자의 말초 혈액에서 미엘린 염기성 단백질 (Myelinbasic protein; MBP)와 반응하는 T 세포의 감소가 관찰되었으며 MBP에 관한 독성은 관찰되지 않았다 (Howard L. Weineret al., Science 259, 1321 (1993)). 그 후, Trentham 등이 약 60명의 류마티스 관절염 환자에게 관절연골내 주성분인 2형 콜라겐 (type II collagen)을 입으로 3개월간 매일 투여하여 약 50%에서 부분적으로 임상 효과를 관찰하였다 (DavidE. Trentham et al., Science 261, 1727-1729 (1993)). 그 중 4명은 완전 관해(complete resolution)가 있었다고 보고되었다.

질병을 유발시키는 단백질(항원)을 계속적으로 경구 투여하여 그 물질에 대한 면역학적인 무반응(관용, tolerance)을 일으켜 원인 질병을 치료하는 기법에 대한 이론적인 근거는 다음과 같다. 항원을 경구로 투여하면 소장에 흡수되고, 이어소장 림포이드 조직 내에서 조절 T 세포(서프레서 T 세포, 특히 Th2 관련 세포)가 유도된다. 이에 의해 2형 콜라겐 특이적CD4+ T 세포가 아네르기(anergy)상태로 유도되고, TGF-β 또는 IL-4와 같은 서프레서 사이토킨이 방출되어 자가반응성 세포를 불활화시킴으로써 말초 관용(peripheral tolerance)을 유도한다.

류마티스성 관절염을 치료하기 위한 목적으로 2형 콜라겐을 경구 투여하면, 이러한 경구 투여가 일부 환자에게서는 오히려 질병이 악화되거나 치료에 반응이 없는 것으로 보고되어 있어 그 치료효과에 대해 여러 가지 의문을 제시되고 있는 실정이다. MBP 경구 투여에 의한 다발성 경화증 치료도 동물 실험 결과와 실제 환자들에 대한 임상 시험 효과와는 차이가많은 것으로 보고되고 있다. 이런 결과들은 입으로 반복 투여된 항원 단백질, 예를 들어 2형 콜라겐이나 MBP가 얼마나 선택적이고 보다 효과적으로 소장 내에 흡수되어 장내 림프구와 단핵구를 통해 관용유도를 일으키는 지에 대해 여러 가지의문이 생기게 되었다.

최근 이런 문제들을 해결하기 위해 여러 가지 약물 전달 시스템을 이용하여 관용 유도를 시도하는 연구가 행해지고 있다.즉 코로 콜라겐을 흡입시키거나 정맥내 주사함으로써 관용 유도를 촉진시키는 실험동물 연구가 보고되고 있으나, 임상적으로 응용하기에는 그 효과가 미흡하고 약제로 개발하기에도 실용성이 떨어지는 것으로 알려져 있다 (N. A. Staines etal., Clin. Exp. Immunol. 1996, 103:368-375).

그러므로 종래의 투여방법보다 더 효과적이고 투여방법이 번거롭지 않은 새로운 약제 전달 시스템에 의한 경구 관용 유도법의 개발이 요구되고 있다.

본 발명의 목적은 질병원인 단백질을 보다 효과적으로 경구 투여하기 위한 약제 전달 시스템을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 폴리머 매트릭스; 및 이 매트릭스에 분산된 면역학적 관용-유도 물질(immunological tolerance-induction agent)을 함유하는 미세입자(nanoparticles)를 이용한 관용 유도용 조성물을 제공하는 것이다.

1은 본 발명에 따른 콜라겐-PLGA 미세입자의 전자현미경 사진.

도 2는 경구 관용을 유도하는 방법을 보여주는 도식도.

도 3은 대조군, 콜라겐 또는 콜라겐-PLGA 미세입자를 이용한 면역학적 관용-유도의 여부를 평가하기 위한 실험(실시예 3)의 결과를 보여주는 그래프.

도 4는 대조군 쥐와 40㎍ 콜라겐-PLGA 미세입자 투여군 쥐에서의 관절염 발생 여부를 보여주는 사진.

도 5는 BSA-PLGA 미세입자로부터 시험관내에서 BSA가 유리되는 양상을 보여주는 그래프.

본 발명의 경구 관용 유도용 조성물은 폴리머 매트릭스와 그 매트릭스 전반에 걸쳐 분산된 면역학적 관용-유도 물질(immunological tolerance induction agent)을 갖는 미세입자를 함유하고 있다.

미세입자의 매트릭스를 구성하는 폴리머는 생체에 유해하지 않은 수용성의 것이어야 하며, 특히 약물 전달 시스템의 목적으로 개발된 것들을 사용할 수 있다. 구체적으로는 폴리(카프로락톤), 젖산 폴리머, 폴리글리콜 젖산(polylacticglycolic acid 또는 copolymer of lactic acid add glycolic acid) 또는 이들 폴리머의 2종 이상의 혼합물을 예시할 수있다. 특히 폴리글리콜 젖산(PLGA)이 유리하게 사용된다. 그러나 본 발명에서 사용될 수 있는 폴리머의 종류가 상기 예시한 것으로만 한정되는 것은 아니다. 분자내에 에스테르 결합을 갖는 폴리에스테르류는 생체내에서 그 매트릭스에 분산되어 있는 물질을 서서히 유리시키는 효과를 나타낼 수 있으며, 에스테르 결합이외에도 생체 내 환경에서 분해되는 화학결합을 갖는 다른 모든 폴리머에서도 같은 결과를 예상할 수 있고, 이들 폴리머들도 본 발명의 목적 및 효과를 달성할 수있는 한 본 발명의 범주에 속한다.

본 발명의 미세입자의 매트릭스에 분산되는 면역학적 관용-유도 물질은 경구 투여시에 항원-특이적 면역반응을 일으키는물질로서, 예를 들면 생체 내에서 면역학적 관용을 유도하는 단백질, 펩티드, 이들의 면역우성 단편(immnuoprodominantfragment) 또는 생리학적 활성 단편을 포함한다. 구체적으로는 자가면역 질환, 예를 들어 당뇨병에 관한 경우 상기 물질은 취장 베타 세포-특이 효소물질, 다발성 경화증의 경우 미엘린-관련 물질, 특히 미엘린 염기성 단백질(MBP), 홍체염의경우 눈(홍체)-관련 항원, 특히 S-항원, 류마티스성 관절염의 경우 연골내 물질, 특히 제2형 콜라겐, 전신 홍반성 낭창(systemic lupus erythematosus)의 경우 DNA, 중증 근무력증(myasthenia gravis)의 경우 아세틸콜린 수용체 등이 포함된다. 면역 관용-유도 물질의 면역우성 단편으로는 인간 2형 콜라겐의 250-270 단편(Sanjay D. Khare et al., The Journalof Immunology 1995, 155:3653-3659 (1995))을 예시할 수 있고, 생리학적 활성 단편으로는 콜라겐의 서열 중에서 동일하게 반복되거나 또는 보존적으로 치환되어(conservatively substituted) 반복되는 3개 이상의 아미노산 잔기를 갖는, 총길이가 약 26개 이하의 아미노산 잔기로 된 펩티드(USP 5783188)를 들 수 있다.

폴리머 매트릭스에 함유되는 면역학적 관용-유도 물질의 양은 1/5 - 1/50(부피비), 유리하게는 1/10 - 1/20 (부피비)의범위내에 있을 수 있다.

본 발명의 미세입자를 제조하는 방법은 당업계에 주지된 방법을 채택할 수 있다. 예를 들면 폴리머 용액 내에서 관용-유도 물질의 용액을 통상의 장치, 예를 들어 초음파처리기를 이용하여 에멀젼화하여 폴리머 매트릭스와 그 안에 분산된 물질로 이루어진 미세입자를 제조하고, 여과함으로써 원하는 입경을 갖는 미세입자들을 선택할 수 있다. 본 발명의 미세입자의 평균 입경은 약 500nm이하, 바람직하게는 약 300nm이하, 보다 바람직하게는 약 100nm - 300nm의 범위내에 있다. 미세입자의 평균입경이 약 100nm-300nm인 경우 소장(payer's patch)에서 흡수되는 효율이 우수하고, 따라서 장내 림프구를통한 관용 면역반응을 효율적으로 유도할 수 있기 때문이다.

본 발명에 따른 미세입자는 각종 질병을 치료하기 위하여 환자에게 경구 투여될 수 있다. 투여량과 투여회수 등은 질병의종류와 상태, 환자의 상태, 나이 또는 체중 등의 조건에 따라 상이할 수 있으며, 이들 조건에 따른 적정한 투여량과 회수는 전문가에 의해 결정될 수 있다. 일반적으로 예를 들면, 류마티스성 관절염 환자에게 2형 콜라겐-함유 미세입자를 투여하는 경우, 2형 콜라겐 또는 그의 단편으로 환산하여 1일 10㎍ 내지 20㎍의 양을 매일 3개월이상 투여하여야만 치료효과를 얻을 수 있다. 그러나 본 발명에서는 콜라겐-폴리머 미세입자를 콜라겐으로 환산하여 약 40㎍을 단 1회 투여함으로써약 30여일동안 효과가 지속될 것이 기대되며, 이는 종래에 콜라겐을 투여하는 경우에 비해 더 적은 양으로 우수한 치료효과를 얻을 수 있음을 보여주는 것이다.

본 발명에서는 콜라겐-유도 관절염(Collagen-induced arthritis(CIA): 자가면역 다발성관절염을 갖는 실험동물 모델)을갖는 생쥐에게 2형 콜라겐 또는 본 발명에 따른 미세입자를 투여하여 효과를 비교하였다. 그 결과 2형 콜라겐 만을 경구투여했을 때보다 본 발명의 폴리머-2형 콜라겐으로 이루어진 미세입자의 형태로 투여했을 때 뚜렷하고 확실한 관용 유도를 일으킬 수 있다는 것이 확인되었다.

이러한 결과는 지금까지 면역학적 관용-유도 물질을 경구투여하여 자가면역질환을 치료하고자 하는 여러 시도들이 만족할 만한 효과를 거두지 못하였음을 고려하면, 자가면역 질환의 경구 관용 유도치료법에 획기적인 변화를 가져올 수 있다.본 발명의 실시예에는 2형 콜라겐 한 종류에 대해서만 실험결과가 제시되어 있지만, 본 발명의 개념과 특징은 다른 종류의 콜라겐, 즉 1형 및 3형 콜라겐 뿐만 아니라 이들의 면역우성 단편, 생리학적 활성 단편에도 동일하게 적용되며, 그 외에 MBP, S-항원, DNA, 아세틸콜린 수용체 등에도 적용될 수 있다.

이하 각종 예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하지만 본 발명이 이들 예에만 국한되는 것은 아니다.

실시예 1 : 미세입자의 제조

3% 아세트산에 용해시킨 10%(w/v) 소 2형 콜라겐 (용액 A), CH2Cl2에 용해시킨 3%(w/v) PLGA(폴리락타이드-글리코라이드공중합체, 분자내 락타이드와 글리코라이드의 비율은 50:50) (용액 B), 그리고 H2O에 용해시킨 5%(w/v) 폴리비닐 알콜 (용액 C)을 준비하였다.

0.12ml의 용액 A와 4㎖의 용액 B를 이용하여 초음파처리기(40% 파장으로 조정. Aldrich Co. Model GEX 400, USA)로 20초간 에멀젼화하여 유중수형(water-in-oil:w/o) 에멀젼을 얻었다. 동일한 방법에 따라 상기 유중수형 에멀젼을 다시 용액 C중에서 에멀젼화하여 수중유중수형 (water-in-oil-in-water:w/o/w) 에멀젼을 얻었다. 실온에서 밤새 자석교반기를 이용하여 상기 w/o/w 에멀젼을 교반함으로써 CH2Cl2를 증발시켰다. 5,000g에서 5분간 원심분리하고, 밑에 가라앉은 침전물(평균입경 300nm 이상의 마이크로입자 포함)을 버렸다. 100,000g에서 30분간 초원심분리하고 침전물을 수거하여 300nm 이하의입경분포를 갖는 미세입자를 회수하였다.

이렇게 하여 제조한 미세입자는 수세한 후 물에 분산시켜 현탁액을 제조하고 동결건조시켰다. 얻어진 미세입자의 전자현미경 사진을 도 1에 나타내었다.

실시예 2 : DBA/I 생쥐를 이용한 CIA 유도

특이적 병원성물질을 전혀 포함하지 않는 조건에서 DBA/I 생쥐를 키워 생후 8 내지 10주에 실험을 한다. 순수분리한 소 2형 콜라겐 (2mg/ml)의 동결건조품을 4℃, 0.01N 아세트산에 녹여 완전 프로인트 보조제(Complete Freund adjuvant:CFA,Difco)와 1:1(부피비)로 섞는다. 생쥐의 꼬리 피하에 콜라겐-CFA를 100㎕의 양으로 주사한다. 2주후 다시 발바닥에 부스터 주사(booster injection)를 한 후 관절염의 발생 유무를 주사 후 3주부터 8주부터 관찰한다.

관절염의 정도를 다음과 같은 기준에 의해 수치로 표현한다.

0 : 관절염 없음

1 : 앞발이나 뒷발에 홍반 또는 팽윤이 발생

2 : 중증의 팽윤 및/또는 관절부위의 변형

3 : 관절부위의 경직

각 관절에서 관찰된 결과의 수치를 모두 합하여 관절염의 정도와 발생 빈도를 표시한다.

실시예 3 : CIA-유도 생쥐를 이용한 콜라겐 또는 콜라겐-함유 미세입자에 의한 경구 관용 유도

실시예 2에서와 동일한 생쥐(각 실험 군당 27마리씩)에 대해 난 알부민(대조군) 또는 천연 콜라겐을 2일 간격으로 장내튜브(intragastric tube)를 통해 한번에 5㎍ 또는 10㎍을 8회 투여하였다. 그 후 실시예 2의 방법으로 콜라겐을 2회 면역처리하여 관절염 발생을 유도시키고 1차 면역화후 3주부터 8주까지 관절염의 발생 유무를 실시예 2의 기준에 따라 관찰하였다.

한편 실시예 1에서 제조한 콜라겐-PLGA 미세입자를 이용하여 동일한 실험을 행하되, 40㎍ 또는 80㎍의 콜라겐-PLGA 미세입자를 초기 1회만 경구 투여하고 결과를 관찰하였다.

이 실험의 도식적인 절차도 및 결과를 각각 도 2, 및 도 3 내지 도4에 나타내었다. 도 3에서 곡선 -◆-, -■-, -●-, -+-및 -＊-는 각각 대조군, 콜라겐 5㎍ 투여군, 콜라겐 10㎍ 투여군, 콜라겐-PLGA 미세입자 40㎍ 투여군 및 콜라겐-PLGA 미세입자 80㎍ 투여군을 표시한다. 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군에서는 27마리의 시험 동물군 중 16마리에서관절염이 발생하였으며(59%), 5㎍ 콜라겐 투여군에서는 3마리(11%), 10㎍ 콜라겐 투여군에서는 3마리(11%), 40㎍ 콜라겐-PLGA 미세입자 투여군에서는 0마리(0%), 그리고 80㎍ 콜라겐-PLGA 미세입자 투여군에서는 0마리(0%)에서 관절염이 발생하였다. 이러한 결과는 본 발명에 따른 콜라겐-PLGA 미세입자가 단 1회의 경구 투여만으로도 효과적으로 면역학적 관용-유도를 일으킨다는 것을 입증하는 것이며, 각종 자가면역 질환의 치료를 획기적으로 개선활 수 있음을 시사하는 것이다. 이는 종래 보고된 치료방법, 즉 콜라겐을 수회 반복하여 투여하는 경우(5㎍ 콜라겐 투여군 및 10㎍ 콜라겐 투여군)에서 각각 11%의 관절염 발생이 있었음을 고려하면 더욱 명백해진다.

한편, 도 4에 대조군 쥐와 40㎍ 콜라겐-PLGA 미세입자 투여군 쥐의 뒷발을 보여주는 사진을 나타내었는데, 대조군 쥐(나)에서는 관절염이 발병한 반면, 본 발명의 미세입자를 투여한 쥐(가)에서는 전혀 증세가 보이지 않고 건강함을 알 수 있다.

실시예 4 : BSA-PLGA 미세입자로부터의 BSA 유리 시험

본 발명에 따른 면역학적 관용-유도 물질-PLGA 미세입자로부터 물질이 유리되는 양상을 확인하기 위하여, 단백질로서 소혈청 알부민 (Bovine Serum Albumin: BSA)을 이용하여 Niwa 등의 방법(Niwa et al., J. Controlled Release, 25(1993)89-98; Levi et al., Pharmaceutical Research Vol. 13, No. 12, 1838-1845 (1996)) 에 따라 실험을 하였다.

즉, 상기 실시예 1의 방법에 따라 BSA-PLGA 미세입자를 제조한 후, 20mg의 미세입자를 생체 내와 동일한 조건인 pH 7.4,37℃의 인산용액 5 ml에 분산시키고, 30일간 매일 동일한 시각에 초원심분리기를 이용하여 미세입자를 제외한 인산용액에유리된 BSA의 양을 단백질 정량법인 페터슨법으로 정량하였다.

결과를 도 5에 나타내었다. 도 5의 결과로부터, 본 발명에 따른 콜라겐-PLGA 미세입자로부터 콜라겐이 유리되는 양상은,투여후 즉시 유효량이 유리되기 시작하여 큰 폭의 변화없이 약 30여일에 걸쳐 서서히 유리됨을 알 수 있다. 따라서, 40㎍의 콜라겐이 함유된 폴리머 복합체 미세입자를 단 1회 투여함으로써 30 -45일간 그 효과를 지속시킬 수 있는 장점이 있다. 반면 제 2형 콜라겐 만을 8회 경구투여한 군에서는 CIA 동물의 약 3-40%에서만 관절염 발생이 억제될 뿐이다.

이상 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 면역학적 관용-유도 물질 - PLGA 복합체로 된 미세입자는 경구 투여시에 장내에효과적으로 침투하여 종래 방법보다 효율적으로 관용-유도를 일으킬 뿐만 아니라, 장내에서 상기 물질을 장기간 서서히안정적으로 유리시킴으로써 1회 투여만으로도 30-45일에 걸쳐 치료효과를 얻을 수 있다.

Claims (3)

1. 폴리카프로락톤, 젖산 폴리머 및 폴리글리콜 젖산(polylactic glycolic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 또는 2종 이상의 폴리머로 만들어진 매트릭스; 및

   (2) 이 매트릭스에 분산되는 2형 콜라겐의 면역학적 관용-유도물질 (immunological tolerance-induction agent)

   로 구성된 미세입자(nanoparticles)를 유효성분으로 포함하는 2형 콜라겐에 대한 경구관용(oral tolerance) 유도용 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 미세입자는 100nm - 300nm의 평균입경을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물
3. 제 1항에 있어서, 상기 단편은 인간 2형 콜라겐의 250-270 단편 또는 콜라겐의 서열중에서반복되거나 또는 보존적으로 치환되어(conservatively substituted) 반복되는 3개 이상의 아미노산 잔기를 갖는, 총 길이가 약 26개 이하의 아미노산 잔기로 된 펩티드임을 특징으로 하는 조성