JPH09510477A - 薬剤移送用ポリマーミクロ粒子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物、および活性剤を含有するミクロ粒子を提供する。好ましい生物分解性ポリマーはラクチドホモポリマー、またはラクチドとグリコリドのコポリマーである。好ましい水溶性ポリマーはＰＥＧ（ポリ（エチレングリコール））またはＰＥＧのコポリマーである。粒子は活性剤を線形的に放出するパターンを示す。また、本発明は、ミクロ粒子を作製するための、エマルション／溶媒抽出方法を提供する。第２のエマルションの連続相には第１のエマルション中の有機溶媒と混和性のある有機溶媒が含有されている。

Description

【発明の詳細な説明】 薬剤移送用ポリマーミクロ粒子 本発明は、活性剤を投与するためのポリマーミクロ粒子（polymer microparti cles）およびこのような粒子の製造方法に関する。 背景 非経口的および経口的アクセスを含む種々の経路によって、薬剤およびワクチ ンの形態の治療剤を体に移送することが可能である。バイオテクノロジーによる 生成物は特殊な部類の物質である。今日、製薬学者は、ペプチドおよびタンパク 質、炭水化物、オリゴヌクレオチドおよびＤＮＡの形態の治療活性物質を移送す るという問題に直面している。 ワクチン製剤、およびペプチドおよびタンパク質の形態で、治療活性物質を移 送するためにコロイド粒子を使用することには、かなりの関心が寄せられている 。血清アルブミンビーズ、ポリアクリルデンプンのミクロ粒子、ポリアクリルア ミドのミクロ粒子、ポリ（ブチル−２−シアノクリラート）のナノ粒子（nanopa rticles）、およびポリラクチド−コ−グリコリド(polylactide co-glycolide) のミクロ粒子［フローレンス（Florence）ら］を含む種々の生物分解性ポリマー が治療用キャリアとして研究されている。アルブミンとポリアクリルデンプンの 場合、キャリア並びにそこに捕捉される特定の抗原に抗体反応が誘発されていた 。また、ポリアクリルアミドおよびポリ（ブチル−２−シアノクリラート）は、 毒性の問題から、抗原移送システムとしてこれらのポリマーを使用することは制 限されている。 再吸収可能なポリラクチドとポリグリコリドのコポリマーをベースとしたミク ロ粒子は、薬剤移送用に広く研究されており［ワッツ（watts）ら］、バイオテ クノロジーによる生成物（特に、ペプチド類およびタンパク質類）の移送用とし ての利用が増加しつつある［クオン（Kwong）ら、およびワン（Wang）ら］。こ れらの合成ポリエステル類は、ヒトへの使用が認可されており、２５年間安全で あったという歴史を有する。注入されたポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド ）（ＰＬＧ）のミクロ粒子類は、良好な生物学的適合性を示し、最小の炎症反応 しか 誘発しない。ラクチドのコポリマー類、例えばＰＬＧは、放徐（controlled rel ease）薬剤システムおよびワクチンの開発のための有用な候補である。それらは 、エステル結合の加水分解により生物分解され、正常体の構成要素に乳酸とグリ コール酸をもたらす。ラクチドコポリマーの分解速度は、分子量、ラクチド：グ リコリドの比、およびポリマーの結晶度を含む種々の要因により調節され、数週 間から１年を越えて変化させることが可能であり、よって、ワクチンの放出速度 および時間を調節することは可能である。よって、ブースター投与量を正常に投 与した場合、キャリアは、免疫処置後に、ある間隔で捕捉抗原を放出するように することができる。 ＰＬＧを使用する非常に多くのマイクロカプセル化技術、例えば、被膜鋳造（ film casting）、成形、スプレー乾燥、および押し出し成形が開発されているが 、最も良く知られているものは、溶媒蒸発法［フォング（Fong）ら、およびボド マイアー（Bodmeier）ら］である。水中油型（Ｏ／Ｗ）型エマルション／溶媒蒸 発法は、プロゲステロンのような疎水性物質を捕捉するために、いくつかのグル ープによって用いられて成功しているが、水性連続相内への混入（partition） のため、ゆっくりと水に溶解する薬剤および水に溶解する薬剤に対しては、カプ セル化効率が劣る。これが、薬剤およびワクチン投与の主たる問題である。 ＰＬＧミクロ粒子へのタンパク質のカプセル化は、乾燥タンパク質を先ずＰＬ Ｇ溶液に分散させる油中油型（Ｏ／Ｏ）およびＯ／Ｗ型法を用いて過去に試みが なされている［アロンソ（Alonso）ら］。Ｏ／Ｏ法では、分散液は、安定化剤と してスパン（Span）８５を含有するシリコーン油において乳化される。続いて、 石油エーテルを添加して溶媒を抽出し、ミクロ粒子を沈殿させる。タンパク質の 充填は理論上の最大値に近いが、粒子径は大きくなる（約５００ｐｍ）傾向にあ り、粒子の形状はふぞろいになる。リーララサミー（Leelarasamee）らは、ＰＬ Ａ溶液にヒドロコルチゾンが懸濁した液を鉱物性油流中にゆっくりと注入する溶 媒分離法を開示している。関連した方法として、ワダらは、アセトニトリル／水 の混合物を使用して、乳酸オリゴマーのミクロ粒子に親水性の薬剤をカプセル化 し、第１のエマルションを形成した。続いて、これを綿実油中で乳化し、加熱に より溶媒を除去した。 Ｏ／Ｗ法では、ポリマー溶液中にタンパク質が懸濁した懸濁液を、非混和性の 界面活性剤水溶液で乳化させ、ポリマーを沈殿させ、ミクロ粒子を硬化させる。 溶媒は蒸発により除去される。１０μｍより小さいミクロ粒子が製造され得るが 、水性連続相に分かれるため、タンパク質が、水の存在下で調製されたミクロ粒 子に非効率的にカプセル化される。また、タンパク質がポリマー溶液に親液性化 された粉末として分散している場合、タンパク質の放出は、より早く、再現性に 劣ることが知見されている（アロンソら）。 ＰＬＧミクロ粒子中への水溶性化合物の充填性を改良するために、オガワらは 、水中油中水型（Ｗ／Ｏ／Ｗ）溶媒蒸発法を使用して、ＰＬＧミクロ粒子に水溶 性ペプチドを捕捉させた。以来、Ｗ／Ｏ／Ｗ型法が、タンパク質およびペプチド をカプセル化するための主要方法の一つとなっている［ジェフェリー(Jeffery) ら］。この二重エマルション−溶媒蒸発法では、タンパク質の水溶液をポリマー 溶液と乳化させ、第１の油中水型のエマルション（Ｗ／Ｏ）を形成する。続いて 、これを、界面活性剤水溶液で乳化し（Ｗ／Ｏ／Ｗ）、ポリマーを沈殿させ、ミ クロ粒子を硬化させて、蒸発により溶媒を除去する。Ｗ／Ｏ／Ｗ法は、単一投与 ワクチンをつくって、患者の不従順、ワクチン投与および保管の問題を潜在的に 克服することを目的として、ＤＬ．ＰＬＡ放徐ミクロ粒子にジフテリアトキソイ ドを［シング（Singh）ら］、ＰＬＡおよびＤＬ．ＰＬＡに破傷風トキソイドを ［ラグバンシ（Raghubanshi）ら］、カプセル化するために使用された。 最近の出版物に、Ｗ／Ｏ／Ｗ法を使用してＰＬＧ粒子にオボアルブミンを導入 することが記載されている［ウチダおよびゴトー，Biol．Pharm．Bull．17(1994 )1272-1276］。粒子は、１〜１４μｍの範囲内の大きさである。著者は、充填効 率が低い（８−２０％）と報告している。ミクロ粒子中のオボアルブミンの含有 量は、０．０８〜２０％であると予想された。 皮下に投与されるミクロ粒子は、それらの大きさにより、食菌されるか、また は皮下組織に残存している［ビッシャー（Visscher）ら］。１０μｍ未満のミク ロ粒子に抗原を包含させることは、大食細胞を目標とする場合には、興味がある ものである［エルドリッジ（Eldridge）ら］。いくつかの研究［エルドリッチら 、ジェンキンス（Jenkins）ら、およびジャニ（Jani）ら］には、経口投与後、 胃腸管でのミクロ粒子の吸収は、その大きさにかなり依存し、０．５〜１．０ｐ ｍのミクロ粒子が、もっともよく吸収されることが示されている。よって、粒子 径 を容易に調節する能力が所望されている。 驚くべきことに、生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーとの混合物を含有する ミクロ粒子により、活性剤の充填が大幅に改善され、活性剤に対する放出時間プ ロフィールを直線的なものとすることができることを見いだした。さらに、混和 性のある有機溶媒が使用される乳化／溶媒抽出法を用いてポリマーミクロ粒子を 調製すると、特に活性剤が水溶性の場合、活性剤が第２のエマルションの連続相 内に混入することを著しく低減することが見いだされた。 よって、本発明は、生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーとの混合物、および 活性剤を含有するミクロ粒子を提供するものである。ミクロ粒子という用語は、 ここではナノ粒子（nanoparticles）を含むものとして用いる。ミクロ粒子は、 好ましくは、１０ｎｍ〜２００μｍの範囲の大きさを有する。 水溶性ポリマーは、好ましくは、水とジクロロメタン（ＤＣＭ）の両方に溶解 するものである。 我々は、「生物分解性ポリマー」という用語を、正常に代謝経路に含まれるこ とが知られている低分子量の化合物に分解可能な重合系を含むものとして使用す る。我々はまた、その用語が、系の全体（integrity）およびマクロ分子の場合 はそれ自体が、影響され（affected）、作用場所から移動するが体からは必ずし も排除されない断片（fragments）もしくは他の分解副産物を生じるように生物 学的環境（ミリュー）に存在する（attached）重合系を含むものとして使用する 。 生物分解性ポリマーの水溶性ポリマーに対する比は、９９．９：１．０〜１０ ：９０で、より好ましくは９０：１０〜１０：９０の範囲内である。 ミクロ粒子を製造するのに適切な生物分解性ポリマー類は、ポリエステル類、 例えば、ポリラクチド、ポリグリコリド、ラクチドとグリコリドのコポリマー、 ポリヒドロキシブチラート、ポリカプロラクトン、乳酸とラクトンのコポリマー 、乳酸とＰＥＧのコポリマー、α−ヒドロキシ酸とα−アミノ酸のコポリマー（ ポリデプシペプチド）、ポリ無水物類（polyanhydrides）、ポリオルトエステル 類、ポリホスファゼン類、ヒドロキシブチラートおよびヒドロキシバレアートの コポリマー、ポリ（エチレンカルボナート）、コポリ（エチレンカルボナート） 、ポリエチレンテレフタラート、またはこれらのポリマーの混合物である。 好ましい再吸収可能／生物分解性ポリマーは、ラクチドのホモポリマー類、ポ リ（Ｌ−ラクチド）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）、およびラクチドとグリコリド のコポリマー、例えば５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）（ ＰＬＧ）である。ＰＬＧは、好ましくは、５−１００ｋＤの範囲内の分子量を有 する。 ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）は、生物分解性ポリマーと混合するた めの好ましい水溶性ポリマーであるが、他の適切な水溶性ポリマーとしては、ポ リ（オキシエチレンオキシド）（ＰＥＯ）、ポリ（オキシエチレン）−ポリ（オ キシプロピレン）［ＰＥＯ−ＰＰＯ］のブロックコポリマー、例えば、トリ−ブ ロックＰＥＯ−ＰＰＯ−ＰＥＯコポリマー［ポロキサマー類（Poloxamers）、プ ルロニクス類（Pluronics）］、およびエチレンジアミンにプロピレンオキシド およびエチレンオキシドを連続して付加して誘導されるテトラー官能性ブロック コポリマー［ポロキサミン類（Poloxamines）、テトロニクス類（Tetronics）］ 、ポリ（乳酸）とのＰＥＧのコポリマー、ポリ（乳酸）のオリゴマー類、ラクチ ド類、ＰＥＧとアミノ酸のコポリマー、ＰＥＧの多糖類との共役体類（conjugat es）、例えば４００００ＭＷのデキストランとポリオキシエチレン−グリコール −モノメチル−エーテル等から生成され、デュバル（Duval）らによって、炭水 化物のポリマー（Carbohydrate Polymers）、１５、（１９９１）、２３３−２ ４２に記載されている共役体、ヌーシ（Nucci）らによって薬剤移送レビューの 進歩（Advances in Drug Delivery Review）、６、（１９８１）、１１３−１５ １に記載されているような、タンパク質とのＰＥＧの共役体、またはリー（Rhee ）らによって、ポリ（エチレングリコール）の化学［Poly(ethylene glycol)che mistry]、生物工学および生物医学的適用(Biotechnical and Biomedical Applic ation)、エド．ジェイ．ミルトン．ハリス．（Ed．J．Milton Harris,）プレナ ム（Plenum）出版（１９９２）に記載されているコラーゲンとのＰＥＧの共役体 、もしくは、カトレ エヌ．ブイ．（Katre N．V.）によって、ポリエチレング リコールおよび他のポリマーとタンパク質との共役．薬剤投与の進歩、１０、９ １−１１４（１９９３）に記載されているコロニー性の刺激因子（ＣＳＦ−１） とのＰＥＧの共役体類、生物活性剤類、例えば酵素、ビタミン類、ステロイド類 、および薬剤類、例えば５−フルオロ−ウラシルとＰＥＧの共役体類が含まれる 。 ＰＥＧの分子量は、１００−１００，０００の範囲内である。ＰＥＯの分子量 は、有益には、１００，０００−５００，０００の範囲内である。 さらに、発明は、 ａ． 第１の有機溶媒に、活性剤の懸濁液（suspension）、油中水型（ Ｗ／Ｏ）エマルション、または水溶液を作製し； ｂ． 第２の有機溶媒に形成されたポリマー溶液と、活性剤の懸濁液、 Ｗ／Ｏエマルション、または水溶液を混合し； ｃ． 第１および第２の有機溶媒と混和性があり、ポリマー用の溶媒で はない第３の有機溶媒を含有する連続相と、工程ｂで作製されたエマルションを 混合する； 工程を具備する活性剤含有ポリマーミクロ粒子を形成する方法を提供するもので ある。 連続相により、ポリマーは沈殿し、第１および第２の溶媒が抽出され、ミクロ スフェアが硬化する。 ついで、通常の方法により、ミクロ粒子を収集、洗浄、および貯蔵する。 第１および第２の有機溶媒は、同一でも異なっていてもよく、好ましくは、ジ クロロメタン（ＤＣＭ）、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、ギ酸エチル、 またはそれらの混合物から選択される。 乾燥した活性剤は、第２の有機溶媒中のポリマー溶液に直接添加することがで きる。よって、活性剤の懸濁液または油中水型のエマルションを調製するために 使用される溶媒は、既に、溶解したポリマーを含有している。 第３の有機溶媒は、好ましくは、１〜６の炭素原子を有する低級アルコール であり、より好ましくは、メタノールまたはエタノールである。 第１の有機溶媒は、好ましくは、安定化剤を含有する。適切な安定化剤は、 ソルビタンエステル類、スパン６０（モノステアリン酸ソルビタン）、グルセリ ル−モノエステル類、例えば、モノステアリン酸グリセリル、およびノニル−フ ェノール−エトキシラート類、または第１の有機溶媒に溶解する任意の他の安定 化剤を含むものである。連続相は、好ましくは、界面活性剤、例えば、ポリビニ ル−ピロリドン（ＰＶＰ）、または第３の有機溶媒に溶解する任意の他の界面活 性剤を含むものである。 ＰＬＧミクロ粒子の調製における乳化／溶媒蒸発法は、一般的に、非混和性の 液体を用いて、続いて硬化して、ポリマーの沈殿と溶媒の除去によってミクロ粒 子を形成する連続相中に、ポリマー溶液の液滴を形成することに基づく。例外は 、フェシー（Fessi）らのナノ沈殿（nanoprecipitation）法であり、その方法で は、ＰＬＧのアセトン溶液を水に添加することにより球形粒子を製造する。 しかしながら、これに対して本発明の方法は、混和性のある有機相、例えばＤ ＣＭおよびメタノールを使用して、ミクロ粒子を作製する。この方法により、活 性剤の捕捉度合いが著しく向上し、連続相への活性剤の分配を大きく低減させる ことが見いだされている。 ここでは、「活性剤」なる用語は、治療、製薬、薬理、診断、化粧品、および 予防用の薬剤を含み、任意の目的で、ヒトまたは動物の体に投与されうる任意の 薬剤を含むものとして用いる。また、この用語は、放出を調整して、植物に投与 されうる任意の薬剤、例えば、除草剤、殺虫殺そ剤および肥料を含む農薬などを 含むものとしても使用される。 活性剤は、好ましくは水溶性であり、ここでは、水溶性を、水に可溶で、少な くとも１ｍｇ／ｍｌの溶液となる物質を指すものと定義する。 活性剤は、好ましくは、ポリペプチド、ペプチドまたはタンパク質、炭水化物 、またはオリゴヌクレオチド、例えばＤＮＡである。 適切な活性剤としては、成長ホルモン、インシュリン、インターフェロン類（ アルファ、ベータ、ガンマ）、エリトロポエチン、コロニー性の剌激因子、副甲 状腺ホルモン、黄体形成ホルモン放出ホルモン、カルシトニン、ヘパリン、ソマ トスタチン、および種々のそれらの類似体（analogues）を含むものである。 また、活性剤は、ワクチンに使用される抗原であってもよく、該ワクチンは、 細菌、ウィルス、および寄生虫を源として得られた、または合成方法により製造 された、糖タンパク質、タンパク質、ポリペプチドを含む。我々は、抗原という 用語を、投与すると、あらゆる種類の抗体反応を引き起こすあらゆる物質を含む ものとして使用する。このような抗原は、注射により、または種々の粘膜部位（ 鼻、口、膣、直腸、結腸）に投与することができる。 アレルゲンおよび自己免疫疾患の治療用のワクチンは、従来よりよく開示され ている。例えば、自己免疫疾患においては、必須因子を徐々に投与することが有 益であると提案されている。このような因子には、糖尿病の治療用のインシュリ ン、および慢性関節リウマチの治療用のコラーゲンが含まれる。 ミクロ粒子は、幅広い活性剤を投与するのに有用であり、投与される薬剤に応 じて、様々な経路で投与することができる。ミクロ粒子は、筋内であれ、静脈で あれ、皮下であれ、関節であれ、または腹膜内であれ、注射に適切である。また 、ミクロ粒子は、注射、または針を使用しない注入システムにより、皮膚の真皮 層または表皮層に投与するのにも適切である。さらに、ミクロ粒子は、粘膜、例 えば、鼻、胃腸管、結腸、膣、または直腸への投与にも適しており、あるいは眼 にも投与できる。 ミクロ粒子は、好ましくは、１０ｎｍ〜２００μｍの範囲内の大きさを有する 。特定のミクロ粒子に対して選ばれる大きさは、投与される活性剤、および意図 される投与経路に依存する。 経口投与用の粒子は、０．５〜５．０μｍの範囲内の大きさが好都合である。 皮下投与用の粒子は、１００μｍ未満が適切な大きさである。脾臓、肝臓、およ び骨髄への管外投与用のミクロ粒子は、好ましくは、１００ｎｍ未満の大きさで ある。 非経口投与用のミクロ粒子は、２００μｍ未満、好ましくは１５０μｍ未満の 大きさが好都合である。動脈内の化学的塞栓治療に適切なミクロ粒子は、好まし くは１００μｍまでの大きさであり、肺毛管を目標とする薬剤用のミクロ粒子は 、７μｍの範囲の大きさを有するのが好都合である。 当業者によく知られている方法でプロセスパラメーターを変えることにより、 所望の大きさの粒子を得ることができる。例えば、使用する特定のポリマーの種 類とその分子量を変えると、ポリマーの大きさが変わり、ポリマーの分子量を増 加させれば、一般的に、粒子径も大きくなる。また、ポリマー濃度を増加させれ ば、粒子径も大きくなる。 本発明のミクロ粒子は、幅広い活性剤を移送するのに有用な放徐システムを提 供する。特に顕著な利点として、本発明の粒子は、活性剤の放出プロフィールが 、線形またはゼロオーダーであることが見いだされている。このような放出プロ フィールは、特に、ある生物活性剤、例えばタンパク質の放出をコントロールす るのに有利である。 さらに、本発明のミクロ粒子において、生物分解性および水溶性ポリマーの混 合物を使用することにより、線形放出プロフィールを得ながら、粒子に導入され る活性剤の量を著しく増加させることができることが見いだされた。この特性の 組み合わせは、生物分解性ポリマーのみを含有する従来の粒子では達成できなか つた。 従来の乳化／溶媒蒸発（Ｗ／Ｏ／Ｗ）法により製造された、従来の再吸収可能 なＰＬＧ粒子のタンパク質含有量は、第１のエマルション中のタンパク質の量を 増加させることにより増加させることができる。しかしながら、タンパク質が表 面に位置しているため、放出テストの最初の２４時間でタンパク質の著しい「バ ースト（burst）」放出が生じる。さらに、放出パターンは、しばしば非線形で あり、迅速に放出される相（「バースト効果」）と、それに続くほとんどまたは 全くタンパク質が放出されない遅延相によって特徴づけられる［コーヘン(Cohen )らの製薬的研究(Pharmaceutical Research)、８、１９９１、７１３−７２０（ １９９１）］。他の例として、再吸収可能なミクロ粒子から放出されるタンパク 質の累積量は、時間の平方根に対して線形関係を示し、水分で満たされたチャン ネルの網状構造を通過するタンパク質の拡散放出によってコントロールされるピ プロセスを示している［ホラ（Hora）らの製薬的研究、７、１１９０−１１９４ （１９９０）］。 本発明のミクロ粒子には、活性剤の放出による著しいバースト放出とこれに続 く、放出がほとんどまたは全く見られない遅延期間がない。逆に、本発明のミク ロ粒子は、この問題を低減したばかりか、活性剤の線形的に放出することが見い だされている。 好ましい実施態様において、ＰＥＧは水に即座に溶解するので、ＰＬＧ：ＰＥ Ｇを混合したミクロ粒子の再吸収速度は、ＰＥＧがミクロ粒子から浸出して、非 常に多孔性のマトリックスを残すため、混合されていないＰＬＧ系と比べて、大 幅に変化することが期待される。タンパク質の放出速度の微調節は、ＰＥＧ特性 と含有量を適切に変えることにより可能である。 また、本発明の方法において、連続相に使用される第３の有機溶媒が、粒子内 の活性剤の充填の増加を助長していることが見いだされている。加えて、第１の 有機溶媒に、安定化剤、例えば、スパン６０を含有せしめるとが、本発明のミク ロ粒子での”バースト”効果を減少させる一因となっていることが見いだされて いる。 好ましい実施態様において、第３の有機溶媒としてメタノールを使用する方法 により作製された、ＰＥＧとＰＬＧの混合物を含有するミクロ粒子においては、 活性タンパク質剤の充填が著しく増加すること、in vitroで、３７℃で、３０日 以上インキュベータしても、タンパク質の放出パターンがゼロオーダーであるこ とが見いだされている。 本発明の好ましい実施態様を、以下の実施例において、添付図を参照しながら 例証する。 図１，ＰＬＧ：ＰＥＧ溶液を使用して調製したＰＬＧミクロ粒子からのＯＶＡ の累積放出プロフィールを示す； 図２，ＰＬＧ：プルロニック溶液を使用して調製したＰＬＧミクロ粒子からの ＯＶＡの累積放出プロフィールを示す： 図３，ＰＬＧ：ＰＥＧ溶液を使用して調製したＰＬＧミクロ粒子からのインシ ュリンの累積放出プロフィールを示す。 材料： ５０：５０のポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、（分子量９０００，Ｒ Ｇ５０３）、７５：２５のポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリド）、（分子量 １７０００，ＲＧ７５５）、８５：１５のポリ（ＤＬ−ラクチド−コ−グリコリ ド）、（分子量５４０００，ＲＧ８５８）、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）：（ＰＬ Ｃ、分子量３３２０００，Ｒ２０８）は独国、インゲルハイム（Ingelheim）の ボーエリンガー（Boehringer）インゲルハイム社から供給された。ポリビニルア ルコール（ＰＶＡ）（１３−２３０００，８７−８９％が加水分解）、およびポ リ（ビニルピロリドン）（ＰＶＰ）（分子量４００００）は、英国、ドーセット のアルドリッチ ケミカル（Aldrich Chemical）社から得た。ジクロロメタン（ ＤＣＭ）、およびメタノール（ＨＰＬＣグレード）は、英国、ラフバロウのフィ ソン ズ（Fisons）社から供給された。オボアルブミン（ＯＶＡ）（グレードＶ）、イ ンシュリン、黄体形成ホルモン放出ホルモン（ＬＨＲＨ）、ポリエチレングリコ ール（分子量８０００）、およびスパン６０は、英国、ドーセットのシグマ ケ ミカル（Sigma Chemical）社から得た。プルロニック−ポリエチレンオキシド− ポリプロピレンオキシドのブロックコポリマーのＬ４４、Ｌ１２１、Ｌ１２２、 Ｌ１２３およびＦ１２７は、米国、N.J.のパールシッパニー（Parsippany）のＢ ＡＳＦ社から得た。全の材料は供給状態で使用した。 以下の実施例に記載されている調製物は、特に規定している場合を除いて、全 て５０：５０のＰＬＧコポリマー（ＲＧ５０３）を使用して調製した。 実施例１．ミクロ粒子の基本調製物 シルバーサン（Silverson）ホモジナイザー［英国のチェスハン バックス（Ch esham Bucks）のシルバーサン機］を使用して、スパン６０のＤＣＭ溶液（２ｍ ｌ、０．５％ｗ／ｖ）を、オボアルブミン（ＯＶＡ）水溶液（１ｍｌ、３０ｍｇ ／ｍｌ）と乳化し、第１のエマルションを得た。ついで、このエマルションと、 ５ｍｌのポリマー溶液（ＰＬＧのジクロロメタン溶液 ６％ｗ／ｖ）とを、高速 で２分間混合し、エマルション安定化剤として１０％ｗ／ｖのＰＶＰを含有する メタノール（２０ｍｌ）、連続相溶液と４分間乳化させた。得られたｗ／ｏ／ｏ 型のエマルションを周囲条件下で３−４時間撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ 粒子を、遠心分離および蒸留水への再懸濁を合計で３回行うことによって洗浄し 、ついで、凍結乾燥した。最終生成物を４℃より低い温度でデシケーターにて保 存した。 実施例２．第１のエマルション中のスパンの濃度の効果 シルバーサンホモジナイザーを使用して、スパン６０のＤＣＭ溶液（２ｍｌ） （０．１〜２０．０％ｗ／ｖ）と、ＯＶＡ水溶液（１ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ）と を乳化し、第１のエマルションを得た。ついで、このエマルションと、ポリマー 溶液（ＰＬＧのジクロロメタン溶液 ６％ｗ／ｖ）とを、高速で乳化し、エマル ション安定化剤として１０％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノール、連続相溶液 と乳化させた。得られたＷ／ｏ／ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間 撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ粒子を、上述したように、洗浄、凍結および 貯蔵した。ミクロ粒子のＯＶＡ充愼の定量 ：正確に重量測定した、３−５ｍｇの凍結乾燥し たミクロ粒子を、イカ ヴィブラックス（Ika Vibrax）−ＶＸＲシェーカーで、 一晩中振とうさせて、５％ｗ／ｖのＳＤＳを含有する１．０ｍｌ、０．１ＭのＮ ａＯＨで処理した。サンプルを遠心分離し、ＢＣＡタンパク質のミクロ検定（mi croassay）を使用し、５％ｗ／ｖのＳＤＳを含有する０．１ＭのＮａＯＨ中で調 製した標準ＯＶＡ系列と対比して、上澄み中のＯＶＡ濃度を定量した。各サンプ ルは重複して検定した。粒子径 ：粒子径は、マルバーン（Malvern）２６００Ｄ レーザー寸法測定器を 使用し、レーザー回析により測定した。平均粒子径は容積平均直径（ｖｍｄ）と してμｍで表した。 ミクロ粒子調製物中のスパンは、表層タンパク質のバースト効果を低減させる のに効果的であることが見いだされ、粒子径およびタンパク質の充填量に影響を 及ぼす（表１）。第１のエマルションに、安定化剤としてスパン６０を使用した 場合、捕捉されるタンパク質は、３％のスパン濃度で、約１６％とＯＶＡのピー ク値になるまで、界面活性剤の濃度の増加に伴って増加し、ついで、界面活性剤 濃度が３〜２０％と増加するに伴い減少していった。平均粒子径は、１０〜２０ μｍであり、最も小さな粒子は、スパン６０を含有しない場合に得られた。 実施例３．ＰＬＧ／ＰＥＧ８０００の溶液比の影響 スパン６０のＤＣＭ溶液（３．０％、２ｍｌ）と、ＯＶＡ水溶液（１ｍｌ）３ ０ｍｇ／ｍｌ）とを乳化し、第１のエマルションを得た。ついで、得られたｗ／ ｏ型のエマルションを、ＰＥＧ８０００のＤＣＭ溶液とＰＬＧを異なる比率で混 合したものを含有するポリマー溶液（６％ｗ／ｖ）と、高速で乳化させた。つい で、このエマルションを、エマルション安定化剤として１０％ｗ／ｖのＰＶＰを 含有するメタノール、連続相溶液と混合した。得られたｗ／ｏ／ｏ型のエマルシ ョンを周囲条件下で３−４時間撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ粒子を、上述 したように、洗浄、凍結および貯蔵した。 第１のエマルションに界面活性剤として３％のスパン６０を有するものは、捕 捉されるタンパク質と、ＰＬＧ／ＰＥＧ８０００溶液比との間に、明らかな相関 関係があることが見いだされた（表２）。溶液比１：３の場合に、捕捉されるタ ンパク質が最も多かった（７２％）。捕捉されるタンパク質（％ｗ／ｖ）は，０ 〜１：３においては溶液比の増加に伴い増加するが、溶液比が１：４〜１：５に 増加すると、減少した。平均粒子径は７〜１８μｍの間で、ＰＬＧ：ＰＥＧ溶液 比により変化し、最も小さい粒子径（６．６μｍ）は、ポリマー溶液比が１：１ の場合に得られた。 実施例４．連続相中の安定化剤濃度の影響 スパン６０のＤＣＭ溶液（０．５％、２ｍｌ）を、ＯＶＡ水溶液（１ｍｌ、３ ０ｍｇ／ｍｌ）で乳化し、第１のエマルションを得た。ついで、得られたエマル ションを、ポリマー溶液（６％ｗ／ｖ １／５ ＰＬＧ／ＰＥＧ８０００のＤＣ Ｍ溶液）とともに、高速で乳化し、さらに、エマルション安定化剤として５〜２ ５％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノール、連続相溶液と乳化した。得られたｗ ／ｏ／ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間撹拌し、ＤＣＭを抽出した 。ミクロ粒子を、上述したように、洗浄、凍結および貯蔵した。 平均粒子径は１０〜２０μｍの間で変化した（表３）。タンパク質の充填量は 、３０〜３６％とほぼ一定であった（表１）。捕捉ＯＶＡにおいて、５〜２５％ のＰＶＰ濃度は大きな影響はないことは明らかである。 実施例５．ＰＬＧ／ＰＥＧ溶液を使用して製造されたミクロ粒子の特性における 試薬容量の影響 ポリマー溶液の容量の増加に伴うミクロ粒子の特性における影響。ＯＶＡ／ス パン／ポリマー溶液／連続相の溶液比（１／２／５／２０）を一定に維持した。 スパン６０のＤＣＭ溶液（０．５％）（２、４および８ｍｌ）を、３０ｍｇ／ｍ ｌのＯＶＡ水溶液（１、２および４ｍｌ）で乳化した。ついで、得られたエマル ションを、ポリマー溶液（６％ｗ／ｖ ＰＬＧ／ＰＥＧ８０００：１／５のＤＣ Ｍ溶液）（５、１０、２０ｍｌ）とともに、高速で乳化し、さらに、エマルショ ン安定化剤として１５％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノール、連続相溶液（２ ０、４０、８０ｍ１）と乳化した。得られたｗ／ｏ／ｏ型のエマルションを周囲 条件下で３−４時間撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ粒子を、上述したように 、洗浄、凍結および貯蔵した。 ポリマー溶液［ＯＶＡ／スパン／ポリマー溶液／連続相の溶液比は一定（１／ ２／５／２０）］の容量の増加に伴うミクロ粒子の特性における影響を表４に示 す。捕捉されるタンパク質は、容量の増加に伴い、３１．６％ｗ／ｖから４７． ８％ｗ／ｖへと増加するが、平均粒子径は、容量の増加に伴い、１６．７から２ ．１μｍへと減少した。 実施例６．タンパク質放出ミクロ粒子In-vitroにおけるミクロ粒子からのオボアルブミンの放出 ：各々２．０ｍｌのＰ ＢＳに分散され、およそ２０ｍｇ（正確に重量測定）の凍結乾燥されたミクロ粒 子を含有する一連のチューブを、時折振とうしつつ、３７℃の水槽に保持した。 定期的にミクロ粒子のサンプルを遠心分離（３８００ｒｐｍ、５分間）し、上澄 みを除去して、上澄み中のタンパク質含有量を、ＢＣＡタンパク質検定を使用し て分析した。新鮮なＰＢＳをミクロ粒子に添加し、インキュベートし続けた。放 出パターンは、インキュベート時間に対する累積放出（％）、およびインキュベ ート間に対するミクロ粒子のμｇＯＶＡ／ｍｇの両方について算出した。 本発明の方法で製造されたミクロ粒子からのタンパク質放出特性を図１に示す 。累積放出量（μｇ／ｍｇ）と時間との関係が示されている。放出パターンが、 ゼロオーダーの放出パターンに従っているのがわかる。本発明により調製された 混合ＰＬＧ／ＰＥＧミクロ粒子は、従来技術に記載されている標準的な方法［ワ ン（Wang）ら］で製造されたＰＬＧミクロ粒子と比較して、タンパク質の放出が 、少なくとも４倍に増加する結果となっている。 実施例７．ラクチドポリマーとＰＥＧの混合溶液から調製されたミクロ粒子 ミクロ粒子特性におけるラクチドポリマーの種類の影響 ＰＥＧと混合したラクチド：グリコリド比１：２の異なるポリマーを使用した 以外は、実施例３に記載されている方法により、ＯＶＡ−充填ミクロ粒子を調製 した。ミクロ粒子の特性を表５に示す。タンパク質の充填レベルの最大値は約４ ０％であり、ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド）ポリマーとＰＥＧ８０００を使用した場 合に達成された。最も小さい粒子径は、７５：２５のＰＬＧを使用した場合に得 られた。よって、ミクロ粒子調製物において、遅延再吸収相として、異なる生物 分解性ポリマーを使用することにより、タンパク質充填量およびミクロ粒子径を 変えることができることがわかった。 実施例８．ミクロ粒子の特性に対するＰＬＧ：プルロニック１２７溶液組成の影 響 シルバーサンホモジナイザーを使用して、スパン６０のＤＣＭ溶液（２ｍｌ、 ０．５％ｗ／ｖ）と、ＯＶＡ水溶液（１ｍｌ、３０ｍｇ／ｍｌ）とを乳化し、第 １のエマルションを得た。ついで、得られたエマルションと、ＰＬＧとプルロニ ックＦ１２７を種々の比：３：１、１：１、１：２および１：３でＤＣＭに共溶 解(co-dissolving)させて得られた、６％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液とを、高速 で混合した。さらに、得られたｗ／ｏ型のエマルションを、エマルション安定化 剤として１５％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノール、連続相溶液と乳化させ、 得られたｗ／ｏ／ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間、マグネットス ターラーを使用して撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ粒子を、実施例１に記載 したようにして、洗浄、凍結および貯蔵した。 サンプルは、出発ポリマー溶液におけるＰＬＧのプルロニックに対する比によ って明細書に示している。 ミクロ粒子の特性に対するＰＬＧ：プルロニックＦ１２７溶液組成の影響を表 ６に示す。ＰＬＧにプルロニックＦ１２７を混合した結果、ＰＬＧミクロ粒子に おけるタンパク質の充填量が改善される。最大充填レベルは約３０％に達し（１ ：２ ＰＬＧ：プルロニックＦ１２７）、これは、ＰＬＧから得られた、同様の 大きさのミクロ粒子（１６％）のほぼ２倍である。捕捉されるタンパク質とＰＬ Ｇ：プルロニックＦ１２７比との間には、明確な関係がないことは明らかである （表６）。ミクロ粒子径は出発溶液におけるプルロニックＦ１２７の比が増加す るに伴い、１７．４μｍ（３：１）から６．４μｍ（１：３）へと減少している ことがわかる。１：３を越えるＰＬＧ：プルロニックＦ１２７の比では、ミクロ 粒子調製物にならなかった。 実施例９．ミクロ粒子の特性に対する試薬容量の影響 （ＰＬＧ−プルロニックの混合溶液） ＯＶＡ／スパン／ポリマー溶液／連続相の溶液の容積比（１／２／５／２０） を一定に維持した。スパン６０のＤＣＭ溶液（０．５％（ｗ／ｖ））（２、４ま たは８ｍｌ）と、ＯＶＡ水溶液（１、２または４ｍｌ）とを乳化した。ついで、 得られたエマルションと、ポリマー溶液（６％ｗ／ｖ，１：１ ＰＬＧ：プルロ ニックＦ１２７のＤＣＭ溶液）（５、１０または２０ｍｌ）とを、高速で混合し 、さらに、エマルション安定化剤として１５％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノ ール、連続相溶液（２０、４０または８０ｍｌ）と乳化した。得られたｗ／ｏ／ ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミク ロ粒子を、実施例１に記載しているように、洗浄、凍結および貯蔵した。 捕捉されるタンパク質は、一定の容量比で、試薬の容量の増加による影響を受 けないことがわかった（表７）。ミクロ粒子径は試薬の容量増加に伴い減少する 傾向にあり、粒子径の分布は改善されている。 試薬の容量を増加させて製造した３−４μｍの小さいミクロ粒子は、静脈投与 、および経口用ワクチン調製物に適している。経口用ワクチン調製物の場合、粒 子径が５μｍ未満であるならば、リンパ系組織に連結している腸管のパイエル板 とミクロ粒子との相互作用を高める。 実施例１０．ラクチドポリマーとプルロニックの混合溶液から調製されたミクロ 粒子 ミクロ粒子の特性に対するラクチドポリマーの種類の影響 プルロニックＦ１２７とラクチド：グリコリド比１：２で混合した異なるポリ マーを使用した以外は、実施例８に記載されている方法により、ＯＶＡ−充填ミ クロ粒子を調製した。 タンパク質の充愼レベルの最大値は約４０％であり、７５：２５のＰＬＧコポ リマーを使用して得られることがわかった（表８）。粒子径は、コポリマーのラ クチド含有量の増加に伴い増加することがわかった。ポリ（Ｄ，Ｌ−ラクチド） を使用すると、ミクロ粒子が調製されなかった。 実施例１１．ＰＬＧとプルロニックの混合溶液から調製されたミクロ粒子 ミクロ粒子の特性に対するプルロニックの種類の影響 プルロニック ＰＥＯ−ＰＰＯ コポリマー、例えばプルロニックＬ１２１の アジュバント効果が、ある研究者グループ［ハンター（Hunter）ら］により報告 されている。また、より短いＰＰＯ、またはより長い親水性のＰＥＯ鎖を有する ＰＥＯ−ＰＰＯコポリマーを使用したいくつかの他の調製物がアジュバント活性 を示した。よって、ＰＬＧとプルロニックの混合物から調製されたミクロ粒子ワ クチンにより、アジュバント性（adjuvanticity）が改善されうる。 ＰＬＧと、１：２の混合溶液における異なる種類のプルロニックＰＥＯ−ＰＰ Ｏコポリマーを使用し、ポリマー溶液の濃度を３％まで減少させた以外は、実施 例８に記載されている方法により、ＯＶＡ−充愼ミクロ粒子を調製した。 ミクロ粒子の特性に対するプルロニックの種類の影響を表９に示す。類似した ３．９−６．２μｍの大きさのミクロ粒子におけるＯＶＡの充愼レベルは約４０ ％であり、これは決まって達成された。ミクロ粒子径とプルロニックの種類との 間には明確な関係がないことが明らかになった（表９）。ＯＶＡの高充填は、よ り低いポリマー溶液含有量（すなわち、６％より３％）を使用することで部分的 に得られる。 実施例１２．ＰＬＧ：プルロニックの混合溶液から調製されたミクロ粒子からの ＯＶＡの放出 時間に対する種々のミクロ粒子調製物からのＯＶＡの累積放出量を図３および 図４に表した。キャリアマトリックスの製造のため、ＰＬＧとプルロニックＦ１ ２７との混合溶液により得られた放出量と放出パターンの変化が示されている。 ＰＬＧ：プルロニックが１：２および１：３のミクロ粒子の累積放出量は、３７ ℃で、ＰＢＳにおける、インキュベート１ヶ月後、それぞれ、１００μｇＯＶＡ ／ｍｇミクロ粒子、および１１０μｇＯＶＡ／ｍｇミクロ粒子と、同様の量であ った。曲線整合プログラム（curve fitting programmes）（ＰＣＮＯＮＬＩＮ） の結果、１：２のＰＬＧ：プルロニック、および１：３のＰＬＧ：プルロニック 系からのタンパク質の放出は、ヒグチのモデルに一致している（放出量が時間の 平方根に依存）ことが示唆されている。拡散速度定数（Ｄ）は、それぞれ１９． ８および２０．４（μｇ／ｍｇ．日^0.5）であった。 ３：１および１：１のＰＬＧ：プルロニックのミクロ粒子の場合、タンパク質 の放出パターンは似ており、それぞれ、１．３および０．９７（μｇ／ｍｇ．日 ）の放出速度定数（ｋ₀）で、線形のゼロオーダーの放出パターンに従っている 。 ＰＬＧ：プルロニックのミクロ粒子の特徴である迅速および効率的なタンパク 質の移送は、タンパク質／ポリマーの相互作用を変化させるキャリア内部のプル ロニックにより変性した内表面によって容易になることが期待される。ミクロ粒 子のマトリックスの特性、例えば、多孔性の成長傾向、および薬剤の放出パター ンは、出発溶液に導入されるプルロニックコポリマーの分子特性および量を調節 することによりコントロール可能であること予想される。タンパク質の放出速度 、および放出した累積量は、混合物中の親水性のプルロニックコポリマーの量の 増加、およびプルロニックコポリマーの分子量の減少に伴い、増加すると予想さ れる。 実施例１３．インシュリン充填ミクロ粒子 スパン６０のＤＣＭ溶液（２ｍｌ、０．５％ｗ／ｖ）と、インシュリン水溶液 （１ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ）とを乳化し、第１のエマルションを得た。ついで、 得られたエマルションを、ＰＬＧとＰＥＧ８０００を１：２の比でＤＣＭに共溶 解させて得られた、５ｍｌの６％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液とともに、高速で混 合した。さらに、得られたｗ／ｏ型のエマルションを、エマルション安定化剤と して１０％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノール、連続相溶液２０ｍｌと混合し た。得られたｗ／ｏ／ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間、マグネッ トスターラーを使用して撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ粒子を、遠心分離お よび蒸留水への再懸濁を全部で３回行うことによって洗浄し、ついで、凍結乾燥 した。最終生成物を４℃より低い温度で、デシケーターにて保存した。 ＨＰＬＣによるミクロ粒子に充愼されたインシュリンの定量 定量の手順：リチロスフェア（Lichrospher）１００ ＲＰ−１８ ５μｍの粒 子径［メルク（Merck）］（０．４６×１５ｃｍ）のカラム、ＬＫＢ ２１５０ ＨＰＬＣ 溶媒分配用ポンプ、ギルソン ダィリュター（Gilson dilutor）モ デル４０１サンプルインジェクター、およびＬＫＢ ２１５２ ＨＰＬＣコント ローラーからなるクロマトグラフシステムを使用した。ピークの検出は、ＬＫＢ ２１５１可変波長検出器を使用し、２２０ｎｍでのＵＶの吸光度によった。定量 （ピーク面積）とクロマトグラムの記録は、ＨＰ ３３９４Ａ 積分器を使用し て行つた。 移動相は、使用前にヘリウムで脱気され、０．０６％のＴＦＡを有する、３２ ：６８のアセトニトリル：水である。２．０ｍｌ／ｍｉｎの流量が室温で用いら れ、インシュリンのピーク出現までの保持時間は６分であった。注入するサンプ ルの容量は５０μｌに設定し、同じサンプルで３回定量した。インシュリンの最 小検出可能濃度は、１μｇ／ｍｌであり、インシュリンのピーク面積と濃度（１ 〜１００ｐｇ／ｍｌの間）の検量線に対する回帰関係は０．９９７を越えた。 ミクロ粒子からのインシュリンの抽出：インシュリンを次の方法により、ミクロ 粒子から抽出した。１０ｍｇのインシュリンを充填したミクロ粒子を、１ｍｌの ＮＮ−ジメチルアセトアミド：１，メチル−２−ピロリジノン（比は１：１）に 溶解し、１．０ｍｌのアセトニトリルに添加した。混合物をシェーカー機を使用 し、３分間、機械的に振とうし、２ｍｌの０．１Ｎのリン酸塩バッファー（ｐＨ ７．４）を添加し、チューブの中身を３５００ｒｐｍで１０分間、遠心分離した 。上澄みを、１３６００ｒｐｍで５分間、再度遠心分離し、ついで、この溶液の ５０μｌをＨＰＬＣで分析した。各々の同じサンプルで３回定量し、インシュリ ン濃度を、検量線と比較することにより決定した。 ミクロ粒子からのインシュリンのIn-vltroにおける放出：正確に測定した各々約 ２０ｍｇの凍結乾燥されたミクロ粒子を含有する一連のチューブを、０．０１％ のメチルセルロースを含有する２．０ｍｌのＰＢＳに分散し、時折振とうしつつ 、３７℃の水槽に保った。定期的にミクロ粒子のサンプルを遠心分離（３６００ ｒｐｍ、５分間）し、上澄みを集めて、１３６００ｒｐｍで５分間、再度遠心分 離した。この溶液の５０ｐｌを、ＨＰＬＣカラムに注入した。新鮮なＰＢＳをミ クロ粒子に添加し、インキュベートし続けた。放出パターンは、インキュベート 時間に対する累積放出（％ｗ／ｖ）、およびインキュベート時間に対する累積放 出（μｇインシュリン／ｍｇミクロ粒子）の両方について算出した。 ミクロ粒子中の初期インシュリン含有量と、表面にあるインシュリンを除去す るため、４時間室温にて、ＰＢＳ溶液中で洗浄した後のミクロ粒子中のインシュ リン含有量を表１０に示す。初期のインシュリンの充填レベルは約１７％ｗ／ｖ であるが、洗浄後の充填レベルは約５％に減少していた。このように、最初から ミクロ粒子にある多くのインシュリンは、表面に位置している。 ３７℃でＰＢＳ中にて１ヶ月間インキュベートした後の、洗浄されたミクロ粒 子から放出されたインシュリンの累積量は、約３０μｇインシュリン／ｍｇミク ロ粒子（図３）であった。表面に位置するインシュリンの著しい「バースト効果 」は、放出テストの最初の３日間で、洗浄されたミクロ粒子から生じ、インシュ リン含有量の約４７％に達した。３日後、インシュリンの放出は均一になり、そ の放出速度は、０．６μｇ／ｍｇ／日であった。 従来より、ミクロ粒子中にインシュリンを捕捉する試みがなされている。コン らは、ポリ乳酸粒子に、インシュリンを充填した調製物を記載しており、このも のの大きさは、１００μｍより大きいものであった。バースト放出効果は、０℃ で最初の１時間の間に生じ、インシュリン充填の５０％より多かった。残ってい たインシュリンの放出は遅くなった。粒子の作用の持続時間は、数時間から数日 と色々であった。従来技術において記載されているこれらの粒子のインシュリン の含有量は、洗浄前で、５％ｗ／ｗ未満であった。この値は、洗浄後、２％ｗ／ ｗあるいはそれ以下に落ちた。 実施例１４．ＬＨＲＨ−充填ミクロ粒子 調製 スパン６０のＤＣＭ溶液（２ｍｌ、０．５％ｗ／ｖ）と、ＬＨＲＨ水溶液（１ ｍｌ、５０ｍｇ／ｍｌ）とを乳化し、第１のエマルションを得た。ついで、この ようにして得られたエマルションを、ＰＬＧとＰＥＧ８０００を１：２の比でＤ ＣＭに共溶解させて得られた、５ｍｌの６％（ｗ／ｖ）のポリマー溶液とともに 、高速で混合した。さらに、得られたｗ／ｏ型のエマルションを、エマルション 安定化剤として１０％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノール、連続相溶液２０ｍ ｌと混合した。得られたｗ／ｏ／ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間 、マグネットスターラーを使用して撹拌し、ＤＣＭを抽出した。ミクロ粒子を、 遠心分離および蒸留水への再懸濁を全部で３回行うことによって洗浄し、ついで 、凍結乾燥した。最終生成物を４℃より低い温度で、デシケーターにて保存した 。 実施例１３に記載されている定量手順により、ミクロ粒子に充填されているＬ ＨＲＨを定量した。 ミクロ粒子中のＬＨＲＨ含有量と対応するミクロ粒子の大きさを、表１１に示 す。 実施例１５．ＤＮＡ−充填ミクロ粒子 スパン６０のＤＣＭ溶液（２ｍｌ、０．５％ｗ／ｖ）と、ＤＮＡ水溶液（１ｍ ｇのプラスミド ＰＴ ７Ｔ３、４００μｌの水、２００μｌのエタノール、４ ００μｌのＴＥ（トリス／ＥＤＴＡ）ｐＨ８．５）とを乳化した。このエマルシ ョンを、５ｍｌのポリマーＤＣＭ溶液（６％ｗ／ｖ、１：１のＰＬＧ：ＰＥＧ） と混合し、エマルション安定化剤として１０％ｗ／ｖのＰＶＰを含有するメタノ ール（２０ｍｌ）、連続相溶液（２０ｍｌ）で、４分間乳化した。得られたＷ／ ｏ／ｏ型のエマルションを周囲条件下で３−４時間撹拌し、ＤＣＭを抽出した。 ミクロ粒子を、遠心分離および蒸留水への再懸濁によって洗浄し、ついで、凍結 乾燥し、４℃より低い温度で、デシケーターにて保存した。 走査型電子顕微鏡を使用してミクロ粒子の調査を行ったところ、ほぼ球形のミ クロ粒子の２つの集団が現れ、１つは１０〜４０μｍの範囲内の直径を有するも の、二つ目は、平均直径が約１００μｍのものであった。 ミクロ粒子を、クロロホルム／水で処理し、ＤＮＡを抽出し、ＤＮＡを、アガ ロースゲルを用いた電気泳動により検出した。ＵＶを透過させてゲル上にバンド を現出させ、ミクロ粒子サンプルにＤＮＡが存在することを確認した。

【手続補正書】特許法第１８４条の８ 【提出日】１９９６年７月３１日 【補正内容】 請求の範囲 １． 生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物および活性剤を含有するミ クロ粒子において、時間に対して線形の活性剤放出プロフィールを示すことを特 徴とするミクロ粒子。 ２． 生物分解性ポリマー、水溶性ポリマーおよび活性剤の混合物を含有するミ クロ粒子において、水溶性ポリマーが、ブロックの一つとして、ＰＥＧを含有す るブロックコポリマーであるミクロ粒子。 ３． 水溶性ポリマーが、ブロックの一つとして、ＰＥＧを含有するブロックコ ポリマーである請求項１に記載のミクロ粒子。 ４． ミクロ粒子が１０ｎｍ〜２００μｍの範囲内の粒子径を有する請求項１な いし３のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 ５． 生物分解性ポリマーが、ラクチドホモポリマー、またはラクチドとグリコ リドのコポリマーである請求項１ないし４のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 ６． 生物分解性ポリマーが、５−１００ｋＤの範囲内の分子量を有するポリ（ ラクチド−コ−グリコリド）である請求項５に記載のミクロ粒子。 ７． 活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である請求項１な いし６のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 ８． 活性剤が、ＤＮＡ、ワクチン、アレルゲン、または抗原である請求項１な いし６のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 ９． 活性剤が、インシュリン、ＬＨＲＦ、またはその類似体、成長ホルモン、 インターフェロン、コロニー性の剌激因子、ソマトスタチン、またはその類似体 である請求項７に記載のミクロ粒子。 １０． 水溶性ポリマーに対する生物分解性ポリマーの比が、９９．９：１．０ 〜１０：９０の範囲内にある請求項１ないし９のいずれか１項に記載のミクロ粒 子。 １１． 筋内、静脈、皮下、関節、または腹膜内注射により投与するのに適した 請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 １２． 注射、または針なし注入システムにより、皮膚の真皮層または表皮層に 投与するのに適した請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 １３． 眼、鼻、口腔、胃腸管、または膣腔に投与するのに適した請求項１ない し１０のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 １４． 植物に投与するのに適した請求項１ないし１０のいずれか１項に記載の ミクロ粒子。 １５． ａ． 第１の有機溶媒に、活性剤の懸濁液、油中水型（Ｗ／Ｏ）エマル ション、または水溶液を作製し； ｂ． 第２の有機溶媒に形成されたポリマー溶液と、活性剤の懸濁液、 Ｗ／Ｏエマルション、または水溶液を混合し； ｃ． 第１および第２の有機溶媒と混和性があり、ポリマー用の溶媒で はない第３の有機溶媒を含有する連続相と、工程ｂで作製されたエマルションを 混合する； 工程を具備する、活性剤を含有するポリマーミクロ粒子を形成する方法。 １６． 活性剤の懸濁液または油中水型エマルションを製造するために使用する 溶媒が溶解したポリマーを含有し、工程ｂが省略される請求項１５に記載の方法 。 １７． ポリマー溶液が、生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物を含有 する請求項１５または１６に記載の方法 １８． 第３の有機溶媒が、１−６の炭素原子を有する低級アルコールである請 求項１５ないし１７のいずれか１項に記載の方法。 １９． 第３の有機溶媒がメタノールである請求項１８に記載の方法。 ２０． 第１および第２の有機溶媒が、同一かまたは異なっており、ジクロロメ タン（ＤＣＭ）、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、ギ酸エチル、またはこ れらの混和性のある混合物から選択される請求項１５ないし１９のいずれか１項 に記載の方法。 ２１． 第１の有機溶媒が安定化剤を含有する請求項１５ないし２０のいずれか １項に記載の方法。 ２２． 連続相が界面活性剤を含有する請求項１５ないし２１のいずれか１項に 記載の方法。 ２３． 生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物、および活性剤を含有す るミクロ粒子を非経口的または経口的に投与することを含む、ヒトまたは動物へ の活性剤の投与方法。 ２４． 請求項１５ないし２２のいずれか１項に記載の方法により得られたミク ロ粒子。 ２５． 請求項１５ないし２２のいずれか１項に記載の方法により得ることがで き、時間に対して線形である活性剤放出プロフィールを示す、生物分解性ポリマ ー、水溶性ポリマーおよび活性剤の混合物を含有するミクロ粒子。 ２６． 請求項１５ないし２２のいずれか１項に記載の方法により得ることがで き、水溶性ポリマーが、ブロックの一つとして、ＰＥＧを含有するブロックコポ リマーである、生物分解性ポリマー、水溶性ポリマーおよび活性剤の混合物を含 有するミクロ粒子。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＷＭ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ジェンキンス， ポール ジョージ イギリス国 ＳＫ10 ２ＵＬ マックレス フィールド ティザーリントン プラウマ ンズ ウェイ ９ (72)発明者 デイビス， スタンリー スチュアート イギリス国 ＮＧ７ １ＢＡ ノッティン ガム ザ パーク カヴァンディッシュ クレセント ノース 19

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物、および活性剤を含有するミ クロ粒子。 ２．時間に対して線形である活性剤の放出パターンを示す請求項１に記載のミク ロ粒子。 ３．ミクロ粒子が、１０ｎｍ〜２００μｍの範囲内の粒子径を有する請求項１ま たは２に記載のミクロ粒子。 ４．水溶性ポリマーが、ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、またはブロッ クの一つとしてＰＥＧを含有するブロックコポリマーである請求項１ないし３の いずれか１項に記載のミクロ粒子。 ５．生物分解性ポリマーが、ラクチドホモポリマー、またはラクチドとグリコリ ドのコポリマーである請求項１ないし４のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 ６．生物分解性ポリマーが、５−１００ｋＤの範囲内の分子量を有する、ポリ（ ラクチド−コーグリコリド）である請求項５に記載のミクロ粒子。 ７．ＰＥＧの分子量が、１−１００ｋＤの範囲内にある請求項４に記載のミクロ 粒子。 ８．活性剤が、ペプチド、ポリペプチド、またはタンパク質である請求項１ない し７のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 ９．活性剤が、ＤＮＡ、ワクチン、アレルゲン、または抗原である請求項１ない し７のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 １０．活性剤が、インシュリン、ＬＨＲＦ、またはそれらの類似体、成長ホルモ ン、インターフェロン、コロニー性の刺激要因、ソマトスタチン、またはそれら の類似体である請求項８に記載のミクロ粒子。 １１．水溶性ポリマーに対する生物分解性ポリマーの比が、９９．９：１．０〜 １０：９０の範囲内にある請求項１ないし１０のいずれか１項に記載のミクロ粒 子。 １２．筋内、静脈、皮下、関節、または腹膜内注射により投与するのに適切であ る請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 １３．注射、または針を使用しない注入システムにより、皮膚の真皮層または表 皮層に投与するのに適切である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載のミク ロ粒子。 １４．眼、鼻、口腔、胃腸管、または膣腔に投与するのに適切である請求項１な いし１１のいずれか１項に記載のミクロ粒子。 １５．植物に投与するのに適切である請求項１ないし１１のいずれか１項に記載 のミクロ粒子。 １６． ａ． 第１の有機溶媒に、活性剤の懸濁液、油中水型（Ｗ／Ｏ）のエマ ルション、または水溶液を作製し； ｂ． 第２の有機溶媒に形成されたポリマー溶液と、活性剤の懸濁液、 Ｗ／Ｏエマルション、または水溶液を混合し； ｃ． 第１および第２の有機溶媒と混和性があり、ポリマー用の溶媒で はない第３の有機溶媒を含有する連続相と、工程ｂで作製されたエマルションを 混合する； 工程を具備する活性剤を含有するポリマーミクロ粒子を形成する方法。 １７．活性剤の懸濁液または油中水型のエマルションを製造するために使用する 溶媒が溶解したポリマーを含有し、工程ｂが省略される請求項１６に記載の方法 。 １８．ポリマー溶液が、生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物を含有す る請求項１６または１７に記載の方法 １９．第３の有機溶媒が、１−６の炭素原子を有する低級アルコールである請求 項１６ないし１８のいずれか１項に記載の方法。 ２０．第３の有機溶媒がメタノールである請求項１９に記載の方法。 ２１．第１および第２の有機溶媒が、同一かまたは異なっており、ジクロロメタ ン（ＤＣＭ）、クロロホルム、アセトン、酢酸エチル、ギ酸エチル、またはこれ らの混和性のある混合物から選択される請求項１６ないし２０のいずれか１項に 記載の方法。 ２２．第１の有機溶媒が安定化剤を含有する請求項１６ないし２１のいずれか１ 項に記載の方法。 ２３．連続相が界面活性剤を含有する請求項１６ないし２２のいずれか１項に記 載の方法。 ２４．生物分解性ポリマーと水溶性ポリマーの混合物、および活性剤を含有する ミクロ粒子を非経口的または経口的に投与することからなる、ヒトまたは動物へ の活性剤の投与方法。