NO317096B1

NO317096B1 - Nye forbindelser, farmasoytisk formulering inneholdende slike forbindelser, fremgangsmate for deres fremstilling, og anvendelse derav

Info

Publication number: NO317096B1
Application number: NO20002848A
Authority: NO
Inventors: Olle Karlsson; Marcel Linschoten; Jan-Erik Nystrom
Original assignee: Astrazeneca Ab Global Ip
Priority date: 1997-12-05
Filing date: 2000-06-02
Publication date: 2004-08-09
Also published as: EP1036061B1; CN1284063A; DE69818510D1; TR200001554T2; KR20010024676A; IS5511A; ID28008A; PL341047A1; IL136295A; NO20002848D0; BR9813410A; AU748834B2; CA2312431A1; EE200000322A; EP1036061A1; US20010046981A1; AU1791299A; CN100379722C; NO20002848L; WO1999029664A1

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører nye farmasøytisk nyttige forbindelser, spesielt konkurrerende inhibitorer av trypsinlignende serinproteaser, spesielt trombin, deres anvendelse som legemidler, farmasøytiske preparater inneholdende forbindelsene og syntetiske veier for deres fremstilling.

Blodkoagulering er nøkkelprosessen som er involvert i både hemostase (dvs forebyggelse av blodtap fra et skadet kar) og trombose (dvs dannelsen av en blodpropp i et blodkar, hvilket enkelte ganger leder til karobstruksjon).

Koagulering er resultatet av en kompleks serie av enzymatiske reaksjoner. Ett av de siste trinnene i denne serien av reaksjoner er omdannelsen av proenzymet protrombin til det aktive enzymet trombin.

Trombin er kjent for å spille en sentral rolle i koagulasjon. Det aktiverer blodplater, leder til blodplateaggregering, omdanner fibrinogen til fibrinmonomerer, som polymeriserer spontant til fibrinpolymerer, og aktiverer faktor XIII, som videre tverr-binder polymerene til dannelse av uoppløselig fibrin. Videre aktiverer trombin faktor V og faktorVIII hvilket leder til en "positiv feedback"-utvikling av trombin fra protrombin.

Ved inhibering av aggregeringen av blodplater og dannelsen og tverrbindingen av fibrin ville det derfor være forventet at effektive inhibitorer av trombin utviser antitrombotisk aktivitet. Videre ville det være forventet at antitrombotisk aktivitet forøkes ved effektiv inhibering av den positive feedback-mekanismen.

Tidligere teknikk

Den tidlige utviklingen av lavmolekylvektige inhibitorer av trombin er beskrevet av Claesson i Blood Guagul. Fibrinol. (1994) 5, 411.

Blombåck et al (i J. Clin. Lab. Invest. 24, suppl. 107, 59 (1969)) har rapportert trombininhibitorer basert på den aminosyresekvens som befinner seg rundt spaltningssetet for Aa-fibrinogenkjeden. Av de omtalte aminosyresekvenser har disse forfatterene foreslått at tripeptidsekvensen Phe-Val-Arg (P9-P2-P1, i det følgende referert til som P3-P2-P1-sekvensen) ville være den mest effektive inhibitoren.

Trombininhibitorer basert på dipeptylderivater med en a,<o-aminoalkylguanidin i Pl-stillingen er kjent fra US patent 4.346.078 og internasjonal patentsøknad WO 93/11152. Likeledes er strukturelt beslektede dipeptidylderivater også rapportert. Internasjonal patentsøknad WP 94/29336 beskriver f.eks, aminometylbenzamidiner, cykliske aminoalkylamidiner og cykliske aminoalkylguanidiner i Pl-stillingen; EP-patentsøknad 0 648 780 beskriver forbindelser med f.eks cykliske aminoalkylguanidiner i Pl-stillingen.

Trombininhibitorer basert på peptidylderivater, som også har cykliske aminoalkylguanidiner (f.eks enten 3- eller 4-aminometyl-l-aminopiperidin) i Pl-stillingen erkjent fra EP-patentsøknader 0 468 231,0 559 046 og 0 641 779.

Trombininhibitorer basert på tripeptidylderivater med argininaldehyd i Pl-stillingen ble først beskrevet i EP-patentsøknad 0 185 390. 1 den senere tid er argininaldehydbaserte peptidylderivater, modifisert i P3-stillingen, rapportert. For eksempel beskriver internasjonal patentsøknad WO 93/18060 hydroksysyrer, EP-patentsøknad 0 526 877 des-aminosyrer, og EP-patentsøknad 0 542 525 O-metylmandelsyrer i P3-stillingen.

Inhibitorer av serinprotease (f.eks trombin) basert på elektrofile ketoner i Pl-stillingen er også kjent. For eksempel beskriver EP-patentsøknad 0 195 212 peptidyl-a-ketoestere og amider, EP-patentsøknad 0 362 002 fluoralkylamidketoner, EP-patentsøknad 0 364 344 a,P,8-triketoforbindelser, og EP-patentsøknad 0 530 167 a-alkoksyketonderivater av arginin i Pl-stillingen.

Andre, strukturelt forskjellige, inhibitorer av trypsinlignende serinproteaser basert på C-terminale borsyrederivater av arginin og isotiouroniumanaloger derav er kjent fra EP-patentsøknad 0 293 881.

I senere tid har trombininhibitorer basert på peptidyl- og aminosyrederivater blitt beskrevte i EP-patentsøknad 0 669 317 og internasjonale patentsøknader EO 95/35309, EO 95/23609, WO 94/29336, WO 97/02284, WO 97/46577, WO 98/06740 og WO 98/06741.

Det er imidlertid stadig et behov for effektive inhibitorer av trypsinlignende serinproteaser, slik som trombin. Det er et spesielt behov for forbindelser som både er oralt biotilgjengelige og selektive når det gjelder inhibiering av trombin i forhold til andre serinproteaser. Det ville være forventet at forbindelser som utviser konkurrerende inhiberende aktivitet mot trombin er særlig nyttige som antikoaguleringsmidler og derfor i den terapeutiske behandling av trombose og beslektede forstyrrelser.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det tilveiebragt en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formel I,

hvor

R<1> representerer H;

R<2> og R<3> representerer H;

Rx representerer et strukturelt fragment av formel Ila,

hvor

k og 1 representerer 0;

R<4> og R<5> representerer H eller fenyl (hvilken sistnevnte gruppe eventuelt er substituert med én eller flere Cm alkoksy);

Y representerer CH2 eller (CI^;

n representerer 0,1,2,3 eller 4; og

B representerer et strukturelt fragment av formel IVa

hvor

X<1>, X2, X<3> og X<4> representerer CH;

R<31> representerer én eller flere substituenter valgt fra halogen og Cm alkyl;

eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

Forbindelsene av formel I kan utvise tautomerisme. Alle tautomere former og blandinger derav omfattes av foreliggende oppfinnelse.

Forbindelsene av formel I kan også inneholde ett eller flere asymmetriske karbonatomer og kan derfor utvise optisk og/eller diastereoisomerisme. Alle diastereoisomerer kan separeres ved bruk av konvensjonelle teknikker, f.eks kromatografi eller fraksjonert krystallisering. De forskjellige stereoisomerene kan isoleres ved separering av en racemisk eller annen blanding av forbindelsene ved bruk av konvensjonelle, f.eks fraksjonert krystalliserings- eller HPLC-teknikker. De ønskede optiske isomerene kan alternativt fremstilles ved omsetning av de passende optisk aktive utgangsmaterialene under betingelser som ikke vil forårsake racemisering eller epimerisering, eller ved derivatisering, f.eks med en homochiral syre fulgt av separering av de diastereomere derivatene ved hjelp av konvensjonelle metoder (f.eks HPLC, kromatografi over silisiumdioksyd). Alle stereoisomerer-omfattes av foreliggende oppfinnelse.

Halogengrupper som R<31> kan representere innbefatter fluor, klor, brom og iod.

I det strukturelle fragmentet av formel Ila indikerer prikken det karbonatom som er bundet til -C(0)-gruppen og til karbonatomet som bærer -OR<1>, R<2> og R<3> i en forbindelse av formel I (for å unngå tvil så er det intet ytterligere H-atom bundet til det således indikerte karbonatom).

Den bølgeformede linjen på bindingen i fragmentet IVa betegner fragmentets bindingsstilling. For unngåelse av tvil, når én eller flere substituenter R<31> er tilstede, så erstatter den/de ett eller flere H-atomer i CH-, CH2- og/eller NH-gruppene i de passende ringne.

Forkortelser er angitt til slutt i dette skriftet.

Forbindelser av formel I hvor fragmentet

er i S-konfigurasjonen, er foretrukket. De bølgeformede linjene på nitrogen- og karbonatomet i fragmentet ovenfor betegner fragmentets bindingsstilling.

Foretrukne forbindelser av formel I inkluderer forbindelsene i eksemplene 1 og 2.

Fremstilling

Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebragt en fremgangsmåte for fremstilling av forbindelser av formel I, og denne fremgangsmåten er kjennetegnet ved at den innbefatter:

(a) kobling av en forbindelse av formel V,

hvor R<1>, R<2>, R<3> og Rx er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel VI, hvor Y, n og B er som definert ovenfor, f.eks i nærvær av et koblingssystem (f.eks oksalylklorid i DMF, EDC, DCC, HBTU eller TBTU), en passende base (f.eks pyridin, DMAP, TEA eller DIPEA) og et egnte organisk oppløsningsmiddel (f.eks diklormetan, acetonitril eller DMF); (b) kobling av en forbindelse av formel VII hvor R<1>, R<2>, R<3>, Rx og Y er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel VIII,

hvor n og B er som definert ovenfor, f.eks i nærvær av et koblingssystem (f.eks oksalylklorid i DMF, EDC, DCC, HBTU eller TBTU), en passende base (f.eks pyridin, DMAP, TEA eller DIPEA) og et egnet organisk oppløsningsmiddel (f.eks diklormetan, acetonitril eller DMF);

(c) omsetning av en forbindelse av formel DC,

hvor B<1> representerer et strukturelt fragment av formel IVa<1>,

hvor Ry representerer CM alkyl og R<1>, R<2>, R<3>, Rx, Y, n, C<1>, X<2>, X3, X4 og R<31> er som definert ovenfor, med ammoniakkgass, f.eks ved romtemperatur i nærvær av et egnet organisk oppløsningsmiddel (f.eks metanol eller etanol);

(d) reduksjon av en forbindelse av formel X,

t ■ hvor B<2> representerer et strukturelt fragment av formel IVa<2>, og R<1>, R<2>, R<3>, Rx, Y, n, X<1>, X<2>, X<3>, X<4> og R31 er som definert ovenfor, i nærvær av et egnet reduksjonsmiddel (f.eks ved katalytisk hydrogenering i nærvær av f.eks Pd/C eller TiCh) og et passende organisk oppløsriingsmiddel (f.eks etanol); eller (e) for forbindelser av formel I hvor X<1>, X<2>, X<3> og/elleqrepresenterer N-O, oksydasjon av en tilsvarende forbindelse av formel I hvor X<1>, X<2>, X<3> og/eller X<4> (slik det passer) representerer N, f.eks under betingelser som er velkjent for fagfolk innen teknikken. Forbindelser av formel V er kommersielt tilgjengelige, er velkjente i litteraturen, eller er tilgengelige ved anvendelse av kjente teknikker. Forbindelser av formel V kan f.eks fremstiles ved hydrolyse av en forbindelse av formel XI

hvor R er alkyl eller C1.3 alkylfenyl og R<1>, R2, R<3> og Rx er som definert ovenfor, f.eks ved romtemperatur i nærvær av en egnet base (f.eks litiumhydroksyd) og et passende oppløsningsmiddel (f.eks THF og/eller vann).

Forbindelser av formel VI kan fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel

XII

hvor Y er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel VHI som definert ovenfor, f.eks under betingelser slik som de som er beskrevet ovenfor syntese av forbindelser av formel I (fremgangsmåtetrinn (a) og (b)).

Forbindelser av formel VII er lett tilgjengelige ved bruk av kjente teknikker.

For eksempel kan forbindelser av formel VII fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel V som definert ovenfor, med en forbindelse av formel XII som definert ovenfor, f.eks under betingelser slik som de.som er beskrevet ovenfor for syntese av forbindelser av formel I (fremgangsmåtetrinn (a) og (b)).

Forbindelser av formel IX kan fremstilles ved hjelp av kjente teknikker. Forbindelser av ormel IX hvor B<1> representerer et strukturelt fragment av formel IVa<1> kan f. eks fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel XIII hvor B3 representerer et strukturelt fragment av formel IVa<3>,

og R<1>, R<2>, R<3>, Rx, Y, n, X<1>, X<2,> X<3>, X<4> og R31 er som definert ovenfor, med HCl(g) og en Cm alkylalkohol, f.eks ved eller under romtemperatur.

Forbindelser av formel X kan fremstilles ved hjelp av kjente teknikker. Forbindelser av formel X hvor B2 representerer et strukturelt fragment av formel IVa<2> kan f.eks fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel XIII som definert ovenfor, med HCl(g) og metanol, f.eks ved eller under romtemperatur, fulgt av omsetning med hydroksylamin, eller et hydrohalogenidsalt derav, f.eks ved eller omkring romtemperatur i nærvær av en passende base (f.eks TEA) og et egnet oppløsningsmiddel (feksMeOH).

Forbindelser av formel XI hvor R<1> og R<3> begge representerer H, kan fremstilles ved reduksjon av en forbindelse av formel XIV

hvor R, Rx og R<2> er som definert ovenfor, f.eks ved under romtemperatur (f.eks mellom 70 og -5°C) i nærvær av et egnet reduksjonsmiddel (f.eks natriumborhydrid) og et passende organisk oppløsningsmiddel (f.eks MeOH eller EtOH). Forbindelser av formel XI hvor R<1> representerer H kan også fremstilles ved omsetning av en forbindelse av formel XVI, hvor R og R* er som definert ovenfor, med en forbindelse av formel XVII, hvor R<2> og R<3> er som definert ovenfor, under betingelser som er velkjent for fagfolk innen teknikken. Forbindelser av formel XIII kan fremstilles ved kobling av en forbindelse av formel VII som definert ovenfor, til en forbindelse av formel XIX, ;hvor n og B3 er som definert ovenfor, f.eks under betingelser slik som de beskrevet ovenfor for syntese av forbindelser av formel I (prosesstrinn (a) og (b)). ;Forbindelser av formel XIV er enten kjente fra, eller kan fremstilles analogt med, fremgangsmåtene beskrevet i J. Org. Chem., 54, 3831 (1989). ;Forbindelser av formel VII, XII, XVI, XVII og XIX og derivater derav, er enten kommersielt tilgjengelige, er kjente i litteraturen, eller kan oppnås enten ved analogi med fremgangsmåtene beskrevet heri, eller ved hjelp av konvensjonelle syntetiske prosedyrer, ifølge standard teknikker, fra lett tilgjengelige utgangsmaterialer ved bruk av passende reagenser og reaksjonsbetingelser. ;Substituenter på blant annet fenylgrupper inneholdt i forbindelser av formler I, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XIII, XVI og XIX kan inter-omdannes ved bruk av standard-teknikker. ;Forbindelser av formel I kan isoleres fra deres reaksjonsblandinger ved bruk av konvensjonelle teknikker. ;Det vil forstås av fagfolk innen teknikken at i de ovenfor beskrevne fremgangsmåter så kan det være nødvendig at de funksjonelle gruppene i mellomproduktforbindelser beskyttes ved hjelp av beskyttelsesgrupper. ;Funksjonelle grupper som det er ønsket å beskytte inkluderer hydroksy, amino og karboksylsyre. Egnede beskyttelsesgrupper for hydroksy inkluderer trialkylsilyl- eller diarylalkylsilylgrupper (f.eks t-butyldimetylsilyl, t-butyldifenylsilyl eller trimetylsilyl) og tetrahydropyranyl. Egnede beskyttelsesgrupper for karboksylsyre inkluderer Ci^ alkyl- eller benzylestere. Egnede beskyttelsesgrupper for amino, amidino og guanidino inkluderer t-butyloksykarbonyl eller benzyloksykarbonyl. Amidino- og guanidino-nitrogener kan enten mono- eller di-beskyttes. ;Beskyttelsen av og beskyttelsesfjerningen fra funksjonelle grupper kan finne sted før eller etter kobling. ;For eksempel kan forbindelsen av formel I fremstilles ved fremgangsmåter omfattende kobling av en N-acetylert aminosyre eller en N-beskyttet aminosyre. Når en N-beskyttet aminosyre benyttes kan acylgruppen tilsettes etter kobling og beskyttelsesfjeming fra nitrogenatomet kan deretter bevirkes ved bruk av standard fremgangsmåter deretter. ;Beskyttelsesgrupper kan fjernes i overensstemmelse med teknikker som er velkjente for fagfolk innen teknikken og som beskrevet i det nedenstående. ;Bruk av beskyttelsesgrupper er fullt ut beskrevet i "Protective Groups in Organic Chemistry", utgitt av J.W.F. McOmie, Plenum Press (1973), og "Protective Groups in Organic Synthesis, 2. utgave, T.W. Greene & P.G.M. Wutz, Wiley-Interscience (1991). ;Visse beskyttede derivater av forbindelser av formel I, som kan fremstilles før et sluttelig beskyttelsesfjerningstrinn for dannelse av forbindelser av formel I, er nye. ;Ifølge et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er det tilveiebragt en forbindelse som er kjennetegnet ved at den har formel Ia, ;hvor Ba representerer et strukturelt fragment av formel F/e, hvor D<1> og D<2> uavhengig representerer, i hvert tilfelle, H, OH, OR<a>, OC(0)R, OC(0)OR<c>, C(0)OR<d>, C(0)R<e> og Ra, R, R<c>, Rd og Re representerer uavhengig CM2 alkyl (hvilken sistnevnte gruppe eventuelt er avbrutt av oksygen og/eller substituert med halogen), fenyl, naftyl, C1.3 alkylfenyl (hvilke sistnevnte tre grupper eventuelt er substituert med Cm alkyl, Cm alkoksy, nitro eller halogen), eller -(C(R<f>)(R<g>))20C(0)C(R<h>), Rf, R og Rh uavhengig representerer H eller Cm alkyl og R<1>, R<2>, R<3>, Rx> Y, n, X<1>, X<2>, X<3>, X<4> og R<31> som definert ovenfor, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, forutsatt at D<1> og D<2> ikke begge representerer H. ;Alkylgrupper som Ra, R, R<c>, Rd, Re, Rf, R<g> og Rh kan representere, og ved hvilke Ra, R)R<c>,R<d>ogR<e>kan være substituert, kan være lineære eller forgrenede, kan være mettede eller umettede, og kan være cykliske, acykliske eller delvis cykliske/acykliske. Alkoksygrupper med hvilke Ra, R, R<c>, Rd og Re kan være substituert kan være lineære eller forgrenede, kan være mettede eller umettede, og kan være cykliske, acykliske eller delvis cykliske/acykliske. Alkyldelen i alkylfenylgruppene som R<a>,R,R<c>,RdogRekan representere, kan være lineære eller forgrenede, og kan være mettede eller umettede. ;Halogengrupper med hvilke Ra, R, R<c>, Rd og Re kan være substituert inkluderer fluor, klor, brom og iod. ;Den bølgeformede linjen på bindingen i fragmentet IVe betegner fragmentenes bindingsposisjon. ;Foretrukne forbindelser av formel Ia inkluderer de hvor D<2> representerer H og D<1 >representerer OH, OCH3, OC(0)R eller C(0)OR<d>, hvor Rb og Rd er som definert ovenfor. ;Strukturelle preferanser som nevnt i det ovenstående for forbindelser av formel I gjelder også for forbindelser av formel Ia. ;Forbindelser av formel Ia kan også fremstilles direkte fra forbindelser av formel I i overensstemmelse med teknikker som er velkjent for fagfolk innen teknikken. Forbindelser av formel Ia hvor Ba representerer et strukturelt fragment av formel IVe og hvor D<1> eller D2 representerer OH, kan f.eks fremstilles som beskrevet ovenfor for forbindelser av formel X, eller ved analoge fremgangsmåter. ;Alternativt kan forbindelser av formel Ia hvor Ba representerer et strukturelt fragment av formel IVe og hvor D<1> og D2 representerer OH eller OR<a>, hvor Ra er som definert ovenfor, fremstilles fra forbindelser av formel XIII som definert ovenfor, ved omsetning med en forbindelse av formel XXI, ;hvor Rat representerer H eller Ra og Ra er som definert ovenfor, f.eks ved mellom 40 og 60°C, i nærvær av en egnet base (f.eks TEA) og et passende organisk oppløsnings-middel (f.eks THF, CH3CN, DMF eller DMSO). Forbindelser av formel Ia kan alternativt fremstilles via andre beskyttede derivater av formel Ia i overensstemmelse med teknikker som er velkjent for fagfolk innen teknikken. Forbindelser av formel Ia hvor D<1> eller D2 representerer OC(0)OR<c>, og R<c> er som definert ovenfor, kan f.eks fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel Ia hvor D<1> eller D2 (slik det passer) representerer OH, med en forbindelse av formel XXII, ;hvor R<c> er som definert ovenfor, f.eks ved romtemperatur i nærvær av en egnet base (f.eks TEA, pyridin eller DMAP) og et passende organisk oppløsingsmiddel. Forbindelser av formel Ia hvor D<1> eller D2 representerer OH kan dessuten fremstilles ved omsetning av en tilsvarende forbindelse av formel Ia hvor D<1> eller D<2> (slik det passer) representerer COOR<d> og Rd er som definert ovenfor, med hydroksylamin (eller et hydrohalogenidsalt derav), f.eks ved 40°C i nærvær av en egnet base (f.eks TEA) og et passende organisk oppløsningsmiddel (f.eks THF). ;Forbindelser av formler XXI og XXII er kommersielt tilgjengelige, er velkjente i litteraturen, eller er tilgjengelige ved bruk av kjente teknikker. ;Det vil også forstås av fagfolk innen teknikken at selv som slike beskyttede derivater av forbindelser av formel I (f.eks forbindelser av formel Ia) ikke behøver å være i besittelse av farmakologisk aktivitet som sådanne, så kan de administreres parenteralt eller oralt og deretter metaboliseres i kroppen til dannelse av forbindelser ifølge oppfinnelsen som er farmakologisk aktive. Slike derivater kan derfor beskrives som "prodrugs". Alle prodrugs av forbindelser av formel I innbefattes i oppfinnelsens omfang. ;Beskyttede derivater av forbindelser av formel I som hovedsakelig er nyttige som prodrugs inkluderer forbindelser av formel Ia. ;Visse forbindelser av formel I kan dessuten virke som prodrugs av andre forbindelser av formel I. ;Forbindelser av formel I, farmasøytisk akseptable salter, tautomerer og stereoisomerer derav samt prodrugs derav (inkludert forbindelser av formel Ia som er prodrugs av forbindelser av formel I), referes i det følgende til samlet som "forbindelsene ifølge oppfinnelsen". ;Fagfolk innen teknikken vil forstå at for oppnåelse av forbindelser ifølge oppfinnelsen i et alternativ, og, i noen tilfeller på en mer hensiktsmessig, måte, kan de heri nevnte individuelle prosesstrinn utføres i en forskjellig rekkefølge, og/eller de individuelle reaksjonene kan utføres ved et annet trinn i den totale veien (dvs substituenter kan tilsettes til og/eller kjemiske omdannelser foretas på, mellomprodukter som er forskjellig fra de som i det ovenstående er knyttet til en spesiell reaksjon. Dette vil blant annet avhenge av faktorer slik som typen av andre funksjonelle grupper som er tilstede i et spesielt substrat, nøkkelmellomprodukters tilgjengelighet og beskyttelsesgruppe-strategien (hvis noen) som skal anvendes. Typen av kjemi som er involvert vil klart innvirke på valget av reagens som benyttes i nevnte syntetiske trinn, behovet og typen av beskyttelsesgrupper som anvendes, og sekvensen for gjennomføring av syntesen. ;Medisinsk og farmasøytisk anvendelse. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er nyttige fordi de er i besittelse av farmakologisk aktivitet. De er derfor indikert som farmasøytika. ;Ifølge et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er det således tilveiebragt forbindelser ifølge oppfinnelsen for bruk som farmasøytika. ;Spesielt er forbindelsene ifølge oppfinnelsen potente inhibitorer av trypsinlignende proteaser, spesielt trombin, enten som sådanne eller, i tilfellet for prodrugs, etter administrasjon til pattedyr inkludert mennesket, f.eks som vist i de nedenfor beskrevne tester. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen forventes således å være nyttige under de betingelser der inhibering av trombin er nødvendig. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er således indikert i behandling eller profylakse av trombose og hyperkoagulerbarhet i blod og vev hos dyr inkludert mennesket. ;Det er kjent at hyperkoagulerbarhet kan lede til trombo-emboliske sykdommer. Tilstander som er forbundet med hyperkoagulerbarhet og trombo-emboliske sykdommer som kan nevnes inkluderer aktivert protein-C-resistens, slik som faktor V-mutasjon (faktor V Leiden), og arvede eller ervervede underskudd på antitrombin m, protein C, protein S, heparin kofaktor II. Andre tilstander som er kjent for å være knyttet til hyperkoagulerbarhet og trombo-embolisk sykdom inkluderer sirkulerende antifosfolipid-antistoffer (Lupus antikoagulant), homocysteinemi, heparinindusert trombocytopeni og defekter i fibrinolyse. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er således indikert både i det terapeutiske og/eller profylaktiske behandling av disse tilstandene. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen er videre indikert i behandlingen av tilstander hvor det er et uønsket overskudd av trombin uten tegn på hyperkoagulerbarhet, f.eks i neuro-degenerative sykdommer slik som Alzheimers sykdom. ;Spesielle sykdomstilstander som kan nevnes inkluderer terapeutisk og/eller profylaktisk behandling av venøs trombose og pulmonal embolisme, arteriell trombose (f.eks i myokardinfakrt, ustabil angina, trombosebasert slag og perifer arteriell trombose) og systemisk embolisme som vanligvis skriver seg fra atrium under arteriell fibrillering eller fra den venstre ventrikkelen etter transmural myokardinfarkt. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen forventes dessuten å ha nyttevirkning i profylakse av reokklusjon (dvs trombose) etter trombolyse (perkutan transluminal angioplasti (PTA) og koronare bypass-operasjoner; forebyggelse av retrombose etter mikrokirurgi og vaskulær kirurgi generelt. ;Ytterligere indikasjoner inkluderer den terapeutiske og/eller profylaktiske behandling av disseminert intravaskulær koagulasjon forårsaket av bakterier, multiple traumer, intoksikasjon eller enhver annen mekanisme; antikoaguleringsmiddelbehandling når blod er i kontakt med fremmede overflater i kroppen slik som vaskulære implantater, vaskulære stenter, vaskulære katetere, mekaniske og biologiske proteseventiler eller en hvilken som helst annen medisinsk anordning; og antikoagulasjonsmiddelbehandling når blod er i kontakt med medisinske anordninger utenfor kroppen slik som under kardiovaskulær kirurgi ved bruk av hjerte-lungemaskin eller i hemodialyse. ;I tillegg til dets effekter på koagulasjonsprosessen er trombin kjent for å aktivere et stort antall celler (slik som neurrofiler, fibroblaster, endotelceller og glattmuskulaturceller). Forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan derfor også være nyttige for den terapeutiske og/eller profylaktiske behandling av idiopatisk og adult respiratory distress syndrom, pulmonal fibrose etter behandling med stråling eller kjemoterapi, septisk sjokk, septicemi, inflammatoriske responser som inkluderer, men ikke er begrenset til, ødem, akutt eller kronisk aterosclerose slik som koronar arteriell sykdom, cerebral arteriell sykdom, perifer arteriell sykdom, reperfusjonsskade og restenose etter perkutan transluminal angioplasti (PTA). ;Forbindelser ifølge oppfinnelsen som inhiberer trypsin og/eller trombin kan også være nyttige i behandlingen av pankreatitt. ;Ifølge oppfinnelsen er det også tilveiebragt anvendelse av en forbindelse som definert i hvilket som helst av de medfølgende krav 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som aktiv bestanddel i fremstillingen av et legemiddel for behandling av en tilstand hvor inhibering av trombin er nødvendig eller ønsket. Fordelaktige tilstander for behandling er trombose og hyperkoagulerbarhet i blod og vev. ;Det tilveiebringes også anvendelse av en forbindelse som definert i hvilket som helst av de medfølgende krav 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som aktiv bestanddel i fremstillingen av et antikoaguleringsmiddel. ;Videre tilveiebringes anvendelse av en forbindelse som definert i medfølgende krav 3, som en prodrug. ;Forbindelsen ifølge oppfinnelsen vil normalt bli administrert oralt, intravenøst, subkutant, bukalt, rektalt, dermalt, nasalt, trakealt, bronkialt, eller ved en hvilken som helst annen parenteral vei eller via inhalering, i form av farmasøytiske preparater omfattende aktiv forbindelse enten som en fri base, eller et farmasøytisk akseptabelt ikke-toksisk organisk eller uorganisk syreaddisjonssalt, i en farmasøytisk akseptabel doseringsform. Avhengig av forstyrrelsen og pasienten som skal behandles og administrasjonsveien, kan preparatene administreres ved varierende doser. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan også kombineres og/eller ko-administreres med ;et hvilket som helst antitrombotisk middel med en forskjellig virkningsmekanisme, slik som antiblodplatemidlene acetylsalicylsyre, ticlopidin, clopidogrel, tromboksanreseptor og/eller syntetase-inhibitorer, fibrinogenreseptorantagonister, prostacyklin-mimetika og fosfodiesteraseinhibitorer og ADP-reseptor (P2T)-antagonister. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan ytterligere kombineres og/eller koadministreres med trombolytika slik som vevplasminogenaktivator (naturlig, rekombinant eller modifisert), streptokinase, urokinase, prourokinase, anisoylert plasminogen-streptokinase-aktivatorkompleks (APSAC), animalske spyttkjertel-plasminogen-aktivatorer og lignende, i behandlingen av trombotiske sykdommer, spesielt mykard-infarkt. ;Ifølge et ytterligere aspekt ved oppfinnelsen er det således tilveiebragt en farmasøytisk formulering som er kjennetegnet ved at den innbefatter en forbindelse ifølge oppfinnelsen, i blanding med en farmasøytisk akseptabel adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer. ;Egnede daglige doser av forbindelsene ifølge oppfinnelsen i terapeutisk behandling av mennesker er ca 0,001-100 mg/kg kroppsvekt ved peroral administrasjon og 0,001-50 mg/kg kroppsvekt ved parenteral administrasjon. ;Forbindelsene ifølge oppfinnelsen har den fordel at de kan være mer effektive, være mindre toksiske, være lengervirkende, ha et bredere aktivitetsområde, være mer potente, gi færre bivirkninger, bli lettere absorbert enn, eller at de kan ha andre nyttige farmakologiske egenskaper i forhold til, forbindelser som er kjent innen teknikken. ;Biologiske tester ;Test A ;Bestemmelse av trombinlevrinpstid ( TT) ;Human trombin (T 6769, Sigma Chem. Co) i bufferoppløsning, pH 7,4,100 ul og inhibitoroppløsning, 100 ul, ble inkubert i 1 min. Pooled normalt citratbehandlet humant plasma, 100 ul, ble deretter tilsatt og levringstiden målt i en autoklavanordning (KC 10, Amelung). ;Levringstiden i sekunder ble plottet mot inhibitorkonsentrasjonen, og IC50TT ble bestemt ved interpolasjon. ;IC50TT er den konsentrasjon av inhibitor i testen som dobler trombinlevringstiden for humant plasma. ;TestB ;Bestemmelse av trombininhiberin<g> med en kromogen. robotprøve ;Trombininhibitor-virkningsgraden ble målt med en kromogen substratmetode, i en Plato 3300 robot-mikroplateprosessor (Rosys AG, CH-8634 Hombrechtikon, Sveits), ved bruk av 96-brønners, halwolum-mikrotiterplater (Costar, Cambridge, MA, USA; Cat. No. 3690). Forrådsoppløsninger av testsubstans i DMSO (72 ul; 1 mmol/1) ble seriefortynnet 1:3 (24 + 48 ul) med DMSO for oppnåelse av 10 forskjellige konsentrasjoner, som ble analysert som prøver i analysen. 2 ul av testprøve ble fortynnet med 124 ul analysebuffer, 12 ul kromogen substratoppløsning (S-2366, Cromogenix, Molndal, Sverige) i analysebuffer og til slutt 12 ul oc-trombinoppløsning (Human a-thrombin, Sigma Chem. Co.) begge i analysebuffer, ble tilsatt, og prøvene blandet. De sluttelige analysekonsentrasjonene var: testsubstans 0,00068-13,3 umol/1, S-2366 0,30 mmol/1, a-trombin 0,020 NMU/ml. Det lineære absorbansinkrementet under 40 minutters inkubasjon ved 37°C ble benyttet for beregning av prosentvis inhibering for testprøvene, sammenlignet med blindprøver uten inhibitor. IC50-robotverdien, tilsvarende den inhibitorkonsentrasjon som forårsaket 50 % inhibering av trombinaktiviteten, ble beregnet fra en log-dose vs. % inhiberingskurve. ;TestC ;Bestemmelse av inhiberingskonstanten K; for human trombin ;Ki-bestemmelser ble foretatt ved bruk av en kromogen substratmetode, utført ved 37°C på en Cobas Bio-sentrifugal analysator (Roche, Basel, Sveits). Resterende enzymaktivitet etter inkubasjon av human a-trombin med forskjellige konsentrasjoner av testforbindelse ble bestemt ved tre forskjellige substratkonsentrasjoner, og ble målt som endringen i optisk absorbans ved 405 nm. ;Testforbindelseoppløsninger (100 ul; normalt i buffer eller saltoppløsning inneholdende BSA 10 g/l) ble blandet med 200 ul human a-trombin (Sigma Chem. Co.) i analysebuffer (0,05 mol/l Tris-HCl pH 7,4, ionestyrke 0,15 justert med NaCl) inneholdende BSA (10 g/l), og analysert som prøver i Cobas Bio-anordningen. En 60 ul prøve, sammen med 20 ul vann, ble tilsatt til 320 ul av substratet S-2238 (Chromogenix AB, MQlndal, Sverige) i analysebuffer, og absorbansendringen (AA/min) ble overvåket. Sluttkonsentrasjonene av S-2238 var 16,24 og 50 umol/1 og av trombin 0,15 NIH U/ml. Den stabile reaksjonshastigheten ble benyttet for å konstruere Dixon-plottinger, dvs diagrammer av inhibitorkonsentrasjon vs. l/(AA/min). For reversible konkurrerende inhibitorer danner datapunktene for de forskjellige substratkonsentrasjoner typisk rette linjer som avskjærer hverandre ved x = -IQ. ;TestD ;Bestemmelse av aktivert partiell tromboplastintid f AP TD ;APTT ble bestemt i pooled normalt citratbehandlet humanplasma med reagensen PTT Automated 5 produsert av Stago. Inhibitorene ble tilsatt til plasmaet (10 ul inhibitor-oppløsning til 90 ul plasma) fulgt av reagensen og kalsiumkloirdoppløsning og APTT ble bestemt i blandingen ved bruk av koagulasjonsanalysatoren KC10 (Amelung) ifølge instruksjonene til reagensprodusenten. Levringstiden i sekunder ble plottet mot inhibitorkonsentrasjonen i plasma og ICsoAPTT ble bestemt ved interpolasjon. ;ICsoAPTT er definert som den konsentrasjon av inhibitor i humanplasma som dobler den aktiverte partielle tromboplastintiden. ;TestE ;Bestemmelse av trombintid ex vivo ;Inhiberingen av trombin etter oral eller parenteral administrasjon av forbindelsene av formel I og Ia, oppløst i etanol:Solutol™:vann (5:5:90) ble undersøkt i bevisste rotter som, én eller to dager før forsøket, ble forsynt med et kateter for blodprøvetakning fira karotidarterien. På forsøksdagen ble blodprøver tatt ved fastsatte tidspunkt etter administrasjonen av forbindelsen i plastrør inneholdende en del natriumcitratoppløsning (0,13 ml per 1) og 9 deler blod. Rørene ble sentrifugert for oppnåelse av blodplatefattig plasma. Plasmaet ble benyttet for bestemmelse av trombintid som beskrevet nedenfor. ;Det citrattilsatte plasma, 25 ul, ble fortynnet med en saltoppløsning, 0,9 %, 25 ul, og plasmakoagulasjon ble startet ved tilsetning av human trombin (T 6769, Sigma Chem. Co., USA) i en bufferoppløsning, pH 7,4,25 ul. Levringstiden ble målt i et automatisk apparat (KC 10A-mikro, Amelung, Tyskland). ;Da en forbindelse av formel Ia ble administrert ble konsentrasjoner av den passende aktive trombininhibitoren av formel I i rotteplasma beregnet ved bruk av standardkurver ved relatering av trombintiden i pooled citrattilsatt rotteplasma til kjente konsentrasjoner av den tilsvarende "aktive" trombininhibitoren oppløst i saltoppløsning. ;Basert på de estimerte plasmakonsentrasjonene av den aktive trombininhibitoren av formel I (hvilket forutsetter at trombintidforlengelse forårsakes av ovennevnte forbindelse) i rotte, ble arealet under plasmakonsentrasjon-tid-kurven etter oral og/eller parenteral administrasjon av den tilsvarende forbindelse av formel Ia beregnet (AUCpd) ved anvendelse av trapesoidregelen og ekstrapolering av data til uendelig. ;Biotilgjengeligheten for den aktive trombininhibitoren av formel I etter oral eller parenteral administrasjon av forbindelsen av formel Ia ble beregnet som angitt nedenfor: ;hvor AUCaktiv, parenteral representerer AUC oppnådd etter parenteral administrasjon av den tilsvarende aktive trombininhibitoren av formel I til bevisste rotter som beskrevet ovenfor. ;Test F ;Bestemmelse av trombintid i urin ex vivo ;Mengden av den aktive trombininhibitoren av formel I som ble utskilt i urin etter oral eller parenteral administrasjon av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, oppløst i etanol: Solutol™:vann (5:5:90), ble estimert ved bestemmelse av trombintiden i urin ex vivo (under forutsetning av at trombintidforlengelsen forårsakes av ovennevnte forbindelse). ;Bevisste rotter ble plassert i metabolismebur hvorved det ble gitt anledning til separat oppsamling av urin og feces, i 24 timer etter oral administrasjon av forbindelser ifølge oppfinnelsen. Trombintiden ble bestemt på den oppsamlede urinen som beskrevet nedenfor. ;Pooled normalt citrattilsatt humanplasma (100 ul) ble inkubert med konsentrert rotteurin, eller saltoppløsninger derav, i ett minutt. Plasmakoagulasjon ble deretter initiert ved administrasjon av human trombin (T 6769, Sigma Chem. Col) i bufferoppløsning (pH 7,4; 100 ul). Levringstiden ble målt i et automatisk apparat (KC 10; Amelung). ;Konsentrasjonene av den aktive trombininhibitoren av formel I i rotteurin ble estimert ved bruk av standardkurver ved relatering av trombintiden i det pooled normale citrattilsatte humanplasma til kjente konsentrasjoner av ovennevnte aktive trombininhibitor oppløst i konsentrert rotteurin (eller saltoppløsninger derav). Ved å multiplisere den totale rotteurinproduksjonen over 24 timers perioden med den estimerte gjennom-snittlige konsentrasjon av ovennevnte aktive inhibitor i urinen, kunne mengden av den aktive inhibitoren som var utskilt i urinen (MENGDEpd) beregnes. ;Biotilgjengeligheten til den aktive trombininhibitoren av formel I etter oral eller parenteral administrasjon av prodrug-forbindelsen ble beregnet som angitt nedenfor: ;hvor MENGDEaktiv,parenteral representerer mengden utskilt i urinen etter parenteral administrasjon av den tilsvarende aktive trombininhibitoren av formel I til bevisste rotter som beskrevet ovenfor. ;Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av følgende eksempler. ;Eksempler ;Generelle forsøksrosedyrer ;Massespektra ble registrert på et Finnigan MAT TSQ 700 trippel kvadrupol-massespektrometer utstyrt med en elektrospray-grenseflate (FAB-MS) og VG Platform II-massespektrometer utstyrt med en elektrospray-grenseflate (LC-MS). 'H NMR- og <13>C NMR-målinger ble utført på BRUKER ACP 300 og Varian UNITY pluss 400, 500 og 600 spektrometre, som arbeidet ved <]>H frekvenser på henholdsvis 300,13,399,96, 499,82 og 599,94 MHz, og ved <13>C frekvenser på henholdsvis 75,46,100,58, 125,69 og 150,88 MHz. Preparativ HPLC ble utført på reversfasekolonner (250 mm, 20 eller 50 mm; 7 til 5 um fase Chromasil C8) med strømningshastigheter på 10 til 50 ml/min ved anvendelse av en UV-detektor (240 til 290 nm). ;Eksempel 1 ;(2,5-diMeO)Ph-(S)- eller (R)-CH(CH2OH)-CO-Pro-Pab(2-Cl) x HOAc (i) 4-azidometyl-3-klorbenzonitril ;En blanding 8,0 g (0,035 mol) av 4-brommetyl-3-klorbenzonitril (J. Pharm. Sei., (1986) 75,410), 2,7 g, (0,042 mol) natriumazid, 1,2 g (3,4 mmol) tetrabutylammonium-hydrogensulfat, 0,30 g (3,4 mmol) natriumhydrogenkarbonat, 7 ml vann og 20 ml toluen ble sterkt omrørt i 3 dager. Fasene ble separert og det vandige laget ble ekstrahert tre ganger med eter. Den kombinerte organiske fasen ble vasket med vann, tørket over natriumsulfat og inndampet og dette ga 6,7 g (100 %) av undertittelforbindelsen. ;'H-NMR (300 MHz; CDC13): 5 4,60 (s, 2H), 7,57 (d, 1H), 7,61 (m, 1H), 7,70 (d, 1H). ;(ii) 4-aminometyl-3-kIorbenzonitril ;4-azidometyl-3-klorbenzonitril (1,0 g; 5,2 mmol; fra trinn (i) ovenfor) ble oppløst i 9 ml vann og 1 ml etanol. Trifenylfosfin (1,5 g) ble tilsatt og blandingen ble omrørt natten over. Etanolen ble inndampet og resten ble skilt mellom 1 M HC1 og benzen. Det vandige laget ble ekstrahert flere ganger med benzen og deretter frysetørket. Utbytte av aminhydrokloridet var 0,54 g (51 %). ;'H NMR (400 MHz; D20) HC1 salt: 8 4,42 (s, 2H), 7,69 (d, 1H), 7,81 (dd, 1H), 7,98 (d, 1H). ;(ii) (R,S)-3-hydroksy-2-(2,5-dimetoksyfenyl)propionsyreetylester ;Til en oppløsning en av 3-okso-2-(2,5-dimetoksyfenyl)propionsyreetylester (7,6 g; 30 mmol; fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i J. Org. Chem. 54, 3831 (1989)) i etanol ble det tilsatt NaBH» (2 ekvivalenter) ved -15°C. Etter omrøring i 2 timer ved -15°C, og 4 timer ved -5°C, ble vann tilsatt, reaksjonsblandingen ble konsentrert og det resulterende produkt ekstrahert med etylacetat. Den organiske fasen ble vasket med saltoppløsning, tørket (MgSO-O og konsentrert og dette ga undertittelforbindelsen. Utbytte 7,7 g (100%). ;(iii) (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH20H)-COOH ;Etylesteren fra trinn (iii) ovenfor (7,4 g; 29 mmol) ble oppløst i THF:vann (1:1). LiOH x H20 (2 ekv) ble tilsatt og reaksjonsblandingen ble omrørt i 2 timer ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble konsentrert og ekstrahert med CH2CI2. Den vandige fasen ble surgjort (pH 2) med HC1 (2 M) og ekstrahert tre ganger med CH2CI2. De organiske fasene ble kombinert, tørket (NaSCv) og konsentrert og dette ga undertittelforbindelsen. Utbytte 5,4 g (82 %). ;'H NMR (400 MHz; CDCI3): 8 6,89 (d, 1H); 6,85 (d, 1H), 6,78 (dd, 1H); 4,86 (bred, 2H); 4,14 (dd, 1H); 3,89 (dd, 1H); 3,78 (s, 3H); 3,72 (s, 3H); 3,67 (dd, 1H). ;(iv) (2,S-diMeO)Ph-(R,S)CH(CHIOH)-CO-Pro-OBn ;1,8 ml (9,6 mmol) diisopropyletylamin ble tilsatt til en isavkjølt blanding av 0,50 g (2,2 mmol) av (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH2OH)-COOH (fra trinn (iv) ovenfor), 0,58 g (2,4 mmmol) av H-Pro-OBn og 0,77 g (2,4 mmol) av TBTU i 10 ml DMF. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur natten over, og ble deretter helt i 1 M HCI og ekstrahert to ganger med etylacetat:toluen (1:1). Det kombinerte organiske laget ble vasket med NaHCC<3 (vandig) og vann, tørket (Na2SC«4) og inndampet. Produktet var rent og ble benyttet direkte i det neste trinnet. Utbytte: 0,91 g (100 %). ;'H-NMR (500 MHz; CDC13) diastereomer blanding: 5 1,8-2,3 (m, 4H), 3,0-3,1 (m, 1H), 3,18 (m, 1H, diastereomer), 3,34 (m, 1H, diastereomer), 3,46 (m, 1H, diastereomer), 3,65-3,7 (m, 1H), 3,75-3,9 (m, 7H, derav 4 singlets ved 3,77,3,80, 3,85 og 3,87 ppm), 3,95-4,05 (m, 1H), 4,39 (m, 1H, diastereomer), 4,46 (m, 1H, diastereomer), 4,58 (m, 1H, diastereomer), 4,63 (m, 1H, diastereomer), 5,18 (d, 1H, diastereomer), 5,26 (s, 1H, diastereomer), 5,32 (d, 1H, diastereomer), 5,37 (s, 1H, diastereomer), 6,8-7,0 (m, 3H), 7,2-7,5 (m, 5H). ;(v) (2,5-di-MeO)Ph-(R,S)CH(CH2OH)-CO-Pro-OH ;(2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH2OH)-CO-Pro-OBn (0,91 g; 2,2 mmol; fra trinn (v) ovenfor), ble hydrogenert i 2 timer ved atmosfæretrykk over 50 mg av 10 % Pd/C i 25 ml etanol. Blandingen ble filtrert gjennom celitt og inndampet og dette ga 0,71 g (100 %) av undertittelforbindelsen. ;'H-NMR (500 MHz; CDCI3) diastereomer blanding: 5 1,8-2,3 (m, 4H), 3,02 (m, 1H, diastereomer), 3,15 (m, 1H), diastereomer), 3,47 (m, 1H} diastereomer), 3,7-3,8 (m, 5H, derav den andre diastereomeren tilsvarende til 3,47 og to singlets ved 3,74 og 3,76 ppm), 3,83-3,85 (m, 3H), 4,0-4,1 (m, 1H), 4,38 (m, 1H, diastereomer), 4,63 (m, 1H, diastereomer), 6,8-6,9 (m, 3H). ;(vi) (2,5-diMeO)Ph-(R og S)CH(CH2OH)-CO-Pro-NHCHz-Ph(2-Cl,4-CN) ;0,76 ml (4,4 mmol) av diisopropyletylamin ble tilsatt til en isavkjølt blanding av 0,35 g (1,1 mmol) av (2,5-diMeO)Ph-(RS)CH(CH2OH)-CO-Pro-PH (fra trinn (vi) ovenfor), 0,22 g (1,1 mmol) av 4-aminometyl-3-klorbenzonitril (fra trinn (ii) ovenfor) og 0,35 g (1,1 mmol) av TBTU i 10 ml DMF. Blandingen ble omrørt ved romtemperatur i 2 dager, helt i 1 M HC1 og ekstrahert to ganger med etylacetat:toluen (1:1). Det kombinerte organiske laget ble vasket med NaHCOj (vandig) og vann, tørket (Na2S04) og inndampet. Råproduktet ble flashkromatografert på silisiumdioksydgel med EtOAc:MeOH (99:1) som elueringsmiddel. Diastereomerene ble separert. Totalt utbytte: 0,48 g (94 %). Den innledende diastereomeren (A) ble isolert i et utbytte på 0,22 g. ;Diastereomer A ;'H NMR (400 MHz; CDCI3): 8 1,7-2,1 (m, 3H), 2,34 (m, 1H), 2,90 (m, 1H), 3,12 (m, 1H), 3,61 (m, 1H), 3,73-3,8 (m, 4H, derav én singlett ved 3,75), 3,82 (s, 3H), 4,01 (m, 1H), 4,44 (m, 1H), 4,56 (m, 1H), 4,65 (m, 1H), 6,75-6,85 (m, 3H), 7,53 (d, 1H), 7,56 (dd, 1H), 7,65 (d, 1H), 7,68 (m, 1H). ;(vii) (2,5-diMeO)PH-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-NHCH2-Ph(2-Cl,4-C(NH)OMe) ;(2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-NHCH2-Ph(2-Cl,4-CN) (0,22 g; 0,47 mmol; diastereomer A fra trinn (vii) ovenfor) ble oppløst i 25 ml metanol mettet med hydrogenkloridgass og anbragt i kjøleskap i 2 dager. Inndampning ga et råmateriale som ble benyttet i det neste trinnet uten ytterligere rensing. ;MS (M + 1)+ 504 ;(ix) (2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-Pab(2-CI) x HOAc ;Halvparten av råmaterialet fra trinn (viii) ovenfor ble oppløst i 25 ml metanol mettet med ammoniakk og ble hensatt ved romtemperatur i 5 dager. Oppløsningsmidlet ble inndampet og resten ble renset på preparativ HPLC med CH3CN:0,1 M NH4OAC (30:70). Frysetørking fra vann ga 9 mg (7 %) av det ønskede produktet. ;<!>H-NMR (400 MHz; D20) rotamerer: 8 1,8-2,4 (m, 7H, derav én singlett ved 1,93 ppm), 3,35 (m, 1H), 3,63 (m, 1H), 3,7-3,9 (m, 8H, derav singletter ved 3,80, 3,81 og 3,86 ppm (rotamerer)), 4,05 (m, 1H), 4,4-4,65 (m, 3H), 6,82 (d, 1H, major rotamer), 6,86 (d, 1H, minor rotamer), 6,95-7,05 (m, 1H), 7,08 (d, 1H, major rotamer), 7,23 (d, 1H, minor rotamer), 7,59 (d, 1H), 7,63 (dd, 1H, minor rotamer), 7,73 (dd, 1H, major rotamer), 7,82 (d, 1H, minor rotamer), 7,98 (d, 1H, major rotamer) <]3>C-NMR (100 MHz; D20) karbonyl- og amidinkarboner: 8 176,2,174,6,166,7. ;Eksempel 2 ;(2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-Pab(2-Me) x HOAc (i) 3-metyl-4-vinylbenzonitril ;0,75 g (0,65 mmol) av tetrakis(trifenylfosfin)palladium(0) ble tilsatt til en oppløsning av 5,1 g (0,026 mol) av 4-brom-3-metylbenzonitril og 8,3 g (0,026 mol) av vinyltributyl-tinn i 250 ml toluen under argon, og reaksjonsblandingen ble oppvarmet ved tilbakeløp natten over. Blandingen ble filtrert gjennom et lag av celitt og inndampet. Resten ble flashkromatografert på silisiumdioksydgel med heptan:EtOAc (1:1) som elueringsmiddel. Utbytte: 4,0 g (100 %). ;'H-NMR (300 MHz; CDCI3): 5 2,36 (s, 3H), 5,46 (d, 1H); 5,73 (d, 1H), 6,90 (dd, 1H), 7,4-7,5 (m, 2H),7,52(d, 1H). ;(ii) 4-hydroksymetyl-3-metylbenzonitril ;3-metyl-4-vinylbenzonitril (0,40 g; 2,8 mmol; fra trinn (i) ovenfor) ble oppløst i 50 ml metanol og avkjølt til -70°C. Ozon (2 ekv) ble boblet gjennom og deretter ble 0,20 g (5,3 mmol) natriumborhydrid og 5 ml vann tilsatt og avkjølingsbadet ble fjernet. Etter 4 timer ble metanolen inndampet og resten ble skilt mellom 1 M HC1 og eter. Det vandige ;laget ble ekstrahert to ganger med eter og den kombinerte organiske fasen ble vasket med vann, tørket (Na2S04) og inndampet og dette ga 0,37 g (90 %) av det ønskede produktet, som ble benyttet i det neste trinnet uten ytterligere rensing. ;'H NMR (400 MHz; CDC13): 8 2,29 (s, 3H); 3,07 (bred, 1H), 4,69 (s, 2H), 7,37 (s, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,53 (d, 1H). ;(iii) 4-metansulfonyIoksy-3-metylbenzonitril ;1.2 g (0,010 mol) metylsulfonylklorid ble tilsatt dråpevis til en oppløsning av 1,5 g (0,010 mol) av 4-hydroksymetyl-3-metylbenzonitril (fra trinn (ii) ovenfor) og 1,0 g (0,010 mol) av trietylamin i 50 ml metylenklorid ved 0°C. Reaksjonsblandingen ble omrørt ved romtemperatur i 3 timer, vasket med 1 M HC1, vann, tørket (Na2SC*4) og inndampet. Utbytte: 2,1 g (91 %).

'H-NMR (300 MHz; CDCb): 2,41 (s, 3H), 3,03 (s, 3H), 5,28 (s, 2H), 7,4-7,6 (m, 3H).

(iv) 4-azidometyl-3-metylbenzonitril

1,0 g (0,015 mol) natriumazid og 10 ml vann ble tilsatt til en oppløsning av 2,1 g (9,3 mmol) 4-metansulfonyloksyd-3-metylbenzonitril (fra trinn (iii) ovenfor) i 20 ml DMF. Reaksjonsblandingen ble omrørt i 1,5 timer ved romtemperatur, helt i 200 ml vann og ekstrahert tre ganger med eter. Den kombinerte organiske fasen ble vasket flere ganger med vann, tørket (Na2S04) og inndampet. Utbytte: 1,4 g (87 %).

'H NMR (300 MHz; CDC13): 8 2,39 (s, 3H), 4,40 (s, 2H), 7,40 (d, 1H), 7,45-7,55 (m, 2H).

(v) 4-aminometyl-3-metylbenzonitril

Undertittelforbindelsen ble fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i eskempel l(ii) ovenfor fra 1,4 g (8,1 mmol) 4-azidometyl-3-metylbenzonitril (fra trinn (iv) ovenfor) og 2.3 g (9,0 mmol) trifenylfosfin i 18 ml etanol og 2 ml vann. Utbytte: 0,60 g (forurenset av trifenylfosfinoksyd; estimert faktisk utbytte: 0,36 g (28 %)).

'H NMR (300 MHz; CDCI3): 8 2,38 (s, 3H), 3,90 (bs, 2H), 7,3-7,4 (m, 3H) skjult av tri feny 1 fosfi noksyd.

(vi) (2,5-diMeO)Ph-(R og S)CH(CH2OH)-CO-Pro-NHCH2-Ph(2-Me,4-CN)

Undertittelforbindelsen ble fremstilt ifølge fremgangsmåten beskrevet i eksempel 1 (vii) fra 0,37 g (1,2 mmol) av (2,5-diMeO)Ph-(R,S)CH(CH2OH)-CO-Pro-OH (se eksempel l(vi) ovenfor), 0,42 g av 4-aminometyl-3-metylbenzonitril (fra trinn (v) ovenfor; estimert innhold av rent materiale: 0,25 g (1,7 mmol)), 0,38 g (1,2 mmol) TBTU og 0,62 g (4,8 mmol) diisopropyletylamin i 10 ml DMF. Råproduktet ble flashkromatografert på silisiumdioksydgel med EtOAc:aceton (9:1) som elueringsmiddel. De to diastereomerene ble separert. Totalt utbytte: 0,58 g forurenset av trifenylfosfinoksyd; estimert faktisk utbytte: 0,45 g (87 %). Den første diastereomeren som ble eluert ble isolert som diastereomer A.

Diastereomer A (utbytte: 0,30 g; forurenset av trifenylfosfinoksyd; estimert faktisk utbytte: 0,20 g)

<]>H NMR (600 MHz; CDC13): 8 1,7-2,1 (m, 3H)5 2,3-2,35 (m, 4H), derav én singlett ved 2,32 ppm), 3,1-3,2 (m, 1H), 3,65 (m, 1H), 3,7-3,8 (m, 4H, derav én singlett ved 3,73 ppm), 3,80 (s, 3H), 3,98 (m, 1H), 4,4-4,5 (m, 3H), 4,65 (m, 1H), 6,7-6,9 (m, 3H), 7,37 (d, 1H), 7,41 (s, 1H), det gjenværende aromatiske signalet var skjult av trifenylfosfinoksyd.

(vii) (2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-NHCH2-Ph(2-Me,4-C(NH)OMe)

(2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-NHCH2-Ph(2-Me,4-CN) (0,30 g; estimert innhold av rent materiale: 0,20 g (0,44 mmol); diastereomer A fra trinn (vi) ovenfor) ble oppløst i 25 ml metanol mettet med hydrogenkloridgass og hensatt ved romtemperatur natten over. Inndampning ga et råmateriale som ble benyttet uten ytterligere rensing. Ifølge TLC (EtOAc:aceton; 9:1) var intet utgangsmateriale tilbake.

(viii) (2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)(OH)

Råproduktet fra trinn (vii) ovenfor ble oppløst i 10 ml metanol og 0,14 g (2,0 mmol) hydroksylaminhydroklorid og 0,40 g (4,0 mmol) trietylamin ble tilsatt. Blandingen ble hensatt ved romtemperatur i 2 dager. Inndampning og flashkromatografi på silisiumdioksydgel med C02Cl2:MeOH (9:1) ga 0,13 g (60 %) av den ønskede forbindelsen.

'H NMR (600 MHz; CDCI3): 5 1,80 (m, 1H); 1,93 (m, 1H), 2,08 (m, 1H), 2,20 (s, 3H); 2,27 (m, 1H); 3,22 (m, 1H), 3,65-3,8 (m, 5H, derav én singlett ved 3,74 ppm), 3,80 (s, 3H), 4,06 (m, 1H), 4,32 (dd, 1H), 4,38 (dd, 1H), 4,51 (m, 1H), 4,71 (m, 1H), 4,93 (bred, 2H), 6,78 (dd, 1H), 6,81 (d, 1H); 6,85 (d, 1H), 7,08 (d, 1H), 7,16 (d, 1H); 7,20 (s, 1H), 7,81 (bt, 1H).

<13>C-NMR (100 MHz; CDCI3) karbonyl- og amidinkarboner: 8 174,7,172,8, 154,9.

(ix) (2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)

(2,5-diMeO)Ph-(R eller S)CH(CH2OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)(OH) (65 mg; 0,13 mmol; fra trinn (viii) ovenfor) ble oppløst i 5 ml etanol. HOAc (8 dråper fra en Pasteur-pipette) og 40 mg 10 % Pd/C ble tilsatt. Reaksjonsblandingen ble hydrogenert ved atmosfæretrykk i 2 dager. Reaksjonsblandingen ble filtrert gjennom celitt og inndampet. Resten ble oppløst i vann, vasket med etylacetat og frysetørket. Utbytte: 6 mg (65 %).

'H-NMR (500 MHz; D20) rotamerer: 8 1,8-2,1 (m, 6H, derav én singlett ved 1,92 ppm), 2,2-2,4 (m, 4H, derav to singletter ved 2,24 (minor rotamer) og 2,38 (major rotamer)), 3,35 (m, 1H, minor rotamer), 3,6-3,7 (m, 1H), 3,75-3,85 (m, 7H, derav tre singletter ved 3,77, 3,79 og 3,84 ppm (rotamerer)), 4,0-4,1 (m, 1H), 4,4-4,5 (m, 3H), 4,8 (m, 1H delvis skjult av HDO-toppen), 6,80 (d, 1H, major rotamer), 6,85 (d, 1H, minor rotamer), 6,9-7,1 (m, 2H), 7,45 (d, 1H, major rotamer), 7,51 (d, 1H, minor rotamer), 7,55-7,65 (m, 2H).

<13>C-NMR (75 MHz; D20) karbonyl- og amidinkarboner: 8 175,4,174,5 (minor), 174,2 (minor), 174,1,167,1.

Eksempel 3

Tittelforbindelsene i eksemplene 1 og 2 ble testet i test A ovenfor og ble begge funnet å utvise en ICsoTT-verdi på mindre enn 0,3 um.

Forkortelser

aq = vandig

Bn = benzyl

DCC = dicykloheksylkarbodiimid

DIPEA = diisopropyletylamin

DMAP = N,N-dimetylaminopyridin

DMF = dimetylformami d

DMSO = dimetylsulfoksyd

EDC = l-(3-dimetylaminopropyl)-3-etylkarbodiimidhydroklorid Et = etyl

EtOAc = etylacetat

EtOH = etanol

h = timer

HBTU = [N,N,N',N'-tetrametyl-0-(benzorriazol-l-yl)uronium

heksafluorfosfat]

HOAc = eddiksyre

H-Pab = 4-amidinobenzylamin

H-Pab(Z) = 4-(N-benzyloksykarbonylamidino)benzyIamin H-Pab(2-Cl) = 4-amidino-2-klorbenzylamin

H-Pab(2-Me) = 4-amidino-2-metylbenzylamin

HPLC = høyytelse-væskekromatografi

Me = metyl

MeOH = metanol

Ph= fenyl

Pr = propyl

i-PrOH = i-propanol

TBTU = [N,N,N',N'-tetrametyl-0-(benzotriazol-l-yl)uronium

tetrafluorborat]

TEA = trietylamin

THF = tetrahydrofuran

Z = benzyloksykarbonyl

Prefikser n, s, i og t har deres vanlige betydninger: normal, iso, sek og tertiær. Stereo-kjemien for aminosyrene er normalt (S) dersom ikke annet er angitt.

Claims

1. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel I, hvor R<1> representerer H; R2 og R<3> representerer H; Rx representerer et strukturelt fragment av formel Ila, hvor k og 1 representerer 0; R<4> og R<5> representerer H eller fenyl (hvilken sistnevnte gruppe eventuelt er substituert med én eller flere Cm alkoksy); Y representerer CH2 eller (Cr^; n representerer 0,1, 2, 3 eller 4; og B representerer et strukturelt fragment av formel IVa hvor X<1>, X2, X<3> og X4 representerer CH; R<31> representerer én eller flere substituenter valgt fra halogen og Cm alkyl; eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav.

2. Forbindelse av formel I, som definert i krav 1, karakterisert ved at fragmentet er i S-konfigurasjonen.

3. Forbindelse, karakterisert ved at den har formel Ia, hvor Ba representerer et strukturelt fragment av formel IVe hvor D<1> og D<2> uavhengig representerer, i hvert tilfelle, H, OH, 0Ra, OC(0)R, OC(0)OR<c>, C(0)OR<d>, C(0)R<e> og Ra, R, Rc, Rd og Re representerer uavhengig CM2 alkyl (hvilken sistnevnte gruppe eventuelt er avbrutt av oksygen og/eller substituert med halogen), fenyl, naftyl, C1-3 alkylfenyl (hvilke sistnevnte tre grupper eventuelt er substituert med Cm alkyl, Cm alkoksy, nitro eller halogen) eller -(C(R<f>)(R<8>))2OC(0)C(R<h>), Rf, R og Rh representerer uavhengig H eller CM alkyl, og R<1>, R<2>, R<3>, Rx, Y, n, X1, X2, X<3>, X<4> og R<31> er som definert i krav 1, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, forutsatt at D<1> og D2 ikke begge representerer H.

4. Farmasøytisk formulering, karakterisert ved at den innbefatter en forbindelse som definert i hvilket som helst av de foregående krav, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, i blanding med en farmasøytisk akseptabel adjuvans, fortynningsmiddel eller bærer.

5. Forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for bruk som et farmasøytikum.

6. Forbindelse som definert i hvilket som helst av de foregående krav 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for bruk i behandlingen av en tilstand hvor inhibering av trombin er nødvendig eller ønsket.

7. Forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for bruk i behandlingen av trombose.

8. Forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for bruk som et antikoaguleirngsmiddel.

9. Anvendelse av en forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som aktiv bestanddel i fremstillingen av et legemiddel for behandling av en tilstand hvor inhibering av trombin er nødvendig eller ønsket.

10. Anvendelse ifølge krav 9, hvor tilstanden er trombose.

11. Anvendelse ifølge krav 9, hvor tilstanden er hyperkoagulerbarhet i blod og vev.

12. Anvendelse av en forbindelse som definert i hvilket som helst av kravene 1 til 3, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, som aktiv bestanddel i fremstillingen av et antikoaguleringsmiddel .

13. Anvendelse av en forbindelse som definert i krav 3, som en prodrug.

14. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse av formel I, karakterisert ved at den omfatter: (a) kobling av en forbindelse av formel V, hvor R<1>, R<2>, R<3> og Rx er som definert i krav 1, med en forbindelse av formel VI, hvor Y, n og B er som i krav 1; (b) kobling av en forbindelse av formel VII hvor R<1>, R<2>, R<3>, Rx og Y er som definert i krav 1, med en forbindelse av formel VIII, hvor n og B er som definert i krav 1; (c) omsetning av en forbindelse av formel IX, hvor B<1> representerer et strukturelt fragment av formel IVa<1> hvor Ry representerer CM alkyl og R<1>, R<2>, R<3>, Rx, Y, n, C<1>, X<2>, X<3>, X<4> og R<31> er som definert i krav 1, med ammoniakkgass; (d) reduksjon av en forbindelse av formel X, hvor B<2> representerer et strukturelt fragment av formel IVa<2>og R<1>, R2, R<3>, RX, .Y, n, X<1>, X<2>, X<3>, X? og R31 er som definert i krav 1; eller (e) for forbindelser av formel I hvor X<1>, X2, X<3>og/eller X<4> representerer N-O, oksydasjon av en tilsvarende forbindelse av formel I hvor X<1>, X<2>, X<3> og/eller X<4> (slik det passer) representerer N.