CZ20002070A3

CZ20002070A3 - Nové sloučeniny

Info

Publication number: CZ20002070A3
Application number: CZ20002070A
Authority: CZ
Inventors: Olle Karlsson; Marcel Linschoten; Jan-Erik Nyström
Original assignee: Astrazeneca Ab
Priority date: 1998-12-01
Filing date: 1998-12-01
Publication date: 2001-01-17

Abstract

Jsou popsány sloučeniny vzorce I, kde R1, R2, R3, Rx, Y, n a B mají specifické významy, které jsou použitelné jako inhibitory trypsinu-podobných proteáz, jako je trombin, a léčení chorob, při kterých je požadována nebo žádoucí inhibice trombinu (např. trombózy) nebo jako antikoagulanty.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nových farmaceuticky užitečných sloučenin, zejména konkurenčních inhibitorů serinových proteáz podobných trypsinu, speciálně trombinu, jejich použití jako farmaceutických prostředků, farmaceutických kompozic s jejich obsahem a syntetických cest pro jejich výrobu.

Dosavadní stav techniky

Koagulace krve je klíčovým procesem, který se uplatňuje jak při hemostáze (t.j. zabránění ztrátám krve z poškozených krevních cest) tak při trombóze (t.j. při tvorbě krevních sraženin v cévním systému, které někdy vede k oběhovým potížím).

Koagulace je výsledek komplexní série enzymatických reakcí. Jedním z rozhodujících stupňů v této sérii reakcí je konverze proenzymu protrombinu na aktivní enzym trombin.

Trombin je známý tím, že hraje hlavní roli při koagulaci. Aktivuje krevní destičky, což vede k jejich spojování, převádí fibrinogen na fibrinové monomery, které polymerují spontánně na fibrinové polymery, a aktivuje faktor XIII, který zase síťuje polymery a tvoří tím nerozpustný fibrin. Dále, trombin aktivuje faktor V a faktor VIII což vede k pozitivní zpětné vazbě tvorby trombinu z protrombinu.

Lze očekávat, že inhibici spojování krevních destiček a vytvářením a zesíťováním fibrinu mohou inhibitory trombinu projevovat antitrombotickou aktivitu. Kromě toho se dá očekávat, že antitro mbotická

aktivita je podporována účinnou inhibici mechanizmem pozitivní zpětné vazby.

Inhibitory trombinu byly popsány již Claessonem v Blood Coagul. Fibrinol. (1994) 5, 411.

Blomback et al. (v J. Clin. Lab. Invest. 24, suppl. 107, 59, (1969)) popisují inhibitory trombinu založené na aminokyselinových sekvencích situovaných kolem místa štěpení pro fibrinogenový řetězec Aa. Z diskutovaných aminokyselinových sekvencí, které jsou diskutovány, navrhují tito autoři tripeptidové sekvence Phe-Val-Arg (P9-P2-P1, dále označované jako sekvence P3-P2-P1) by mohli být nejůčinnějším inhibitorem.

Inhibitory trombinu na bázi dipeptidylových derivátů s α,ωaminoalkylguanidinem na Pl-pozici jsou známé z US patentu 4,346,078 a WO 93/11152. Byly také popsány podobné, strukturně příbuzné, dipeptidylové deriváty. Tak například WO 94/29336 uvádí sloučeniny, které mají například aminomethylbenzamidiny, cyklické aminoalkylamidiny a cyklické aminoalkylguanidiny na Pl-pozici; EP-A-0 648 780 popisuje sloučeniny, které mají, například, cyklické aminoalkylguanidiny na pozici Pl.

Inhibitory trombinu, založené na peptidylových derivátech, které současně obsahují cyklické aminoalkylguanidiny (např. 3- nebo 4aminomethyl-l-amidinopiperidin) na Pl-pozici jsou známé z EP-A0 468 231, EP-A-0 559 046 a EP-A-0 641 779.

Inhibitory trombinu založené na tripeptidylových derivátech s argininaldehydem na Pl-pozici byly poprvé popsány v EP-A-0 185 390.

Nověji byly popsány peptidylovs deriváty na bázi arginin aldehydu, modifikované na P3-pozic. Tak například WO 93/18060 uvádí hydroxykyseliny, EP-A-0 526 877 des-amino kyseliny a EP-A 0 542 525 popisuje O-methylmandlové kyseliny v P3-pozici.

Jsou také známy inhibitory serinových proteáz (např. trombin) založené na elektrofilních ketonech na Pl-pozici. Tak například EP-A-0 195 212 zveřejňuje peptidyl-a-ketoestery a amidy, EP-A-0 362 002 fluoralkylamidoketony, EP-A-0 364 344 α,β,δ-triketosloučeniny, a EP-A 0 530 167 α-alkoxyketonové deriváty argininu na Pl-pozici.

Z EP-A-0 293 881 jsou známé další, strukturně odlišné, inhibitory serinových proteáz, podobných trypsinu, na bázi derivátů argininu s C-terminální kyselinou boritou a jejich isothiouroniových analogů.

Ještě nověji byly popsány inhibitory trombinu, založené na peptidylových a aminokyselinách, jejichž deriváty byly popsány v EP-A-0 669 317 a mezinárodních patentových přihláškách WO 9 5/35309, WO 95/23609, WO 94/29336, WO 97/02284, WO 97/46577, WO 98/06740 a WO 98/06741

Nicméně, přetrvává potřeba účinných inhibitorů serinových proteáz, podobných trypsinu, jako je trombin. Zejména jsou potřebné sloučeniny, které se dají podávat orálně a současně inhibují selektivně trombin oproti jiným serinovým proteázám. Sloučeniny, které projevují konkurenční inhibiční aktivity vůči trombinu by byly podle očekávání zejména užitečné jako antikoagulanty a tudíž by byly vhodné pro terapii trombózy a příbuzných nemocí.

- 4 Podstata vynálezu

Podle vynálezu je řešením sloučenina vzorce I,

R² R^{3 0} v

*¹° Rx'

O^fJ—(CH₂)_n—B kde

R¹ znamená H, C(O)Rⁿ, SiR¹²R¹³R¹⁴ nebo Ci-6 alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná nebo zakončená jedním nebo více substituenty zvolenými z OR¹⁵ nebo (CH₂)_qR¹⁶);

R¹², R¹³ a R¹⁴ nezávisle znamenají H, fenyl nebo Ci.g alkyl;

R¹⁶ znamená Ci.₄ alkyl, fenyl, OH, C(O)OR¹⁷ nebo C(O)N(H)R¹⁸;

R¹⁸ znamená H, Ci.₄ alkyl nebo CH₂C(O)OR¹⁹;

R a R nezávisle znamenají H, Ci-6 alkyl nebo C7-9 alkylfenyl;

R¹¹ a R¹⁹ nezávisle znamenají H nebo Cj.₄ alkyl; a q znamená 0, 1 nebo 2;

R' a R nezávisle znamenají H, Ci-₄ alkyl, cyklohexyl nebo fenyl;

R_x znamená strukturní fragment vzorce Ha, lib nebo líc,

tía lib

llc kde k, 1 a m nezávisle znamenají O, 1, 2, 3 nebo 4;

R⁴ a R⁵ nezávisle znamenají H, Si(Me)3, 1- nebo 2-naftyl, a polycyklická uhlovodíková skupina, CHR^4IR⁴² nebo C1-4 alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více halogen substituenty), nebo C3.8 cykloalkyl, fenyl, methylendioxyfenyl, benzodioxanyl, benzofuranyl, dihydrobenzofuranyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzimidazolyl, kumaranonyl, kumarinyl nebo dihydrokumarinyl (přičemž posledních jmenovaných dvanáct skupin je popřípadě substituovaných jedním nebo více C1-4 alkyly (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více halogen substituenty), C1.4 alkoxy, halogen, hydroxy, kyano, nitro, SO2NH2, C(O)OH nebo N(H)R⁴³);

R⁴¹ a R⁴² nezávisle znamenají cyklohexyl nebo fenyl;

R a R nezávisle znamenají H, C1.4 alkyl, C3-8 cykloalkyl, fenyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více substituenty, vybranými ze souboru, do kterého patří C1.4 alkyl (popřípadě substituovaný jedním nebo více halogenovými substituenty), C1-4 alkoxy, halogen, hydroxy, kyano, nitro, SO2NH2, C(O)OH nebo N(H)R) nebo společně s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří C3.8 cykloalkylový kruh;

- 6 R⁴³ a R⁴⁴ nezávisle znamenají H nebo C(O)R⁴⁵; a

R⁴⁵ znamená H, C1.4 alkyl nebo C1.4 alkoxy;

Y znamená CH₂, (CH₂)₂, CH=CH, (CH₂)₃, CH₂CH=CH nebo CH=CHCH₂, přičemž poslední jmenované tři skupiny jsou popřípadě substituované C1.4 alkyl, methylen, oxo nebo hydroxyskupinou;

n znamená 0, 1, 2, 3 nebo 4; a

B znamená strukturní fragment vzorce IVa, IVb, IVc nebo IVd, .31 tMNtMN

X^^X²

AWV/WW !L xk^x⁴

XQ X *N'

IVa

IVb

NH-

kde

X¹, X², X³ a X⁴ nezávisle znamenají CH, N nebo N-O;

X⁵ a X⁶ nezávisle znamenají jednoduchou vazbu nebo CH₂; jeden z X⁷, X⁸ a X⁹ znamená S, O nebo NH, a zbývající dva • ·

nezávisle znamenají -CH=, =CH-, -N=, =N~, -N(0)= nebo =N(O)-;

R³¹ znamená, ve všech případech, jeden nebo více popřípadě přítomných substituentů, zvolených ze souboru, do kterého patří halogen, C1.4 alkyl,

C1.4 alkoxy nebo -O-(CH₂)_P C(O)N(R³²)(R³³);

p znamená 0, 1, 2, 3 nebo 4; a

R³² a R³³ nezávisle znamenají H, Ci-e alkyl nebo C3.7 cykloalkyl;

nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin.

Sloučeniny vzorce I mohou projevovat tautomerii. Všechny tautomerní formy a jejich směsi jsou zahrnuty do rozsahu vynálezu.

Sloučeniny vzorce I mohou také obsahovat jeden nebo více asymetrických uhlíkových atomů a mohou tudíž projevovat optickou aktivitu a/nebo diastereoisomeriii. Všechny diastereoisomery mohou být odděleny známými postupy, např. chromatograficky nebo frakční krystalizací. Jednotlivé stereoisomery se dají izolovat z racemické směsi nebo z jiných směsí nebo jiné směsi sloučenin s použitím známých postupů, například frakční krystalizací nebo HPLC technikami. Alternativně se dají optické isomery vyrobit reakcí vhodné opticky aktivních výchozích sloučenin za podmínek při kterých nedochází k racemizaci nebo epimerizaci, nebo přípravou derivátů, například s homochirální kyselinou s následnou separací diastereomerních derivátů obvyklými prostředky (např. HPLC, chromatografii na silikagelu). Všechny stereoisomery jsou zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu.

Alkylové skupiny, které mohou být představovány R¹, R², R³, p 5 n6 n7 -pil p p P^ P P^

IX , IX , XX , IX , K. , IX , -tx , IX , XX , IX , -tx 5 -tx

R¹⁹, R³¹, R³², R³³ a R⁴⁵ a kterými mohou být substituované R⁴, R⁵, R⁶, R⁷ a Y; alkoxy skupiny, které mohou být představovány R³¹ a R⁴⁵, a kterými mohou být substituované R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷; cykloalkyl skupiny které mohou být představovány R², R³, R⁴, R⁵, R⁶, R⁷, R³², R³³, R⁴¹ a R⁴²; a alkylfenyl skupiny, které mohou být představovány R¹⁵ a R¹⁷, mohou být lineární nebo rozvětvené a mohou být nasycené nebo nenasycené. Alkylen skupiny představované -(CH₂)_k-, -(CH₂),-, -(CH₂)_m, -(CH₂)_n, -(CH₂)_P a -(CH₂)_q ve sloučeninách vzorce I mohou být lineární nebo rozvětvené, a mohou být nasycené nebo nenasycené.

Halogenové skupiny, které může představovat skupina R³¹, a kterými mohou být substituovány skupiny R⁴, R⁵, R⁶ a R⁷, a kterými také mohou být substituovány substituenty na R⁴, P?, R⁶ a R⁷, jsou fluor, chlór, brom a jód.

Ve strukturních fragmentech vzorců Ha, lib a líc znamenají tečky atom uhlíku, který je vázán k -C(O)- skupině a k atomu uhlíku, nesoucímu -OR¹, R² a R³ ve sloučenině vzorce I (aby se předešlo nedorozumění, k takto znázorněnému atomu uhlíku není navázán žádný další H atom).

Vlnovka na vazbě k fragmentům IVa, IVb, IVc a IVd označuje polohu vazby na fragmentech. Aby nedošlo k nedorozumění - když jeden nebo více substituent R³¹ je/jsou přítomen/přítomny, pak nahrazuje(jí) jeden nebo více H atom(ů) ze skupin CH, CH₂ a/nebo NH příslušných cyklů.

Odborník v oboru pozná, že ve strukturním fragmentu IVd musí být přítomny v pětičlenném cyklu dvě dvojné vazby v polohách, které jsou závislé na tom, který ze substituentů X⁷, X⁸ a X⁹ znamená S, O nebo NH.

Zkratky, použité v popisu, jsou uvedeny formou přehledu na jeho konci.

- 9 Výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou například ty, ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVa (ve kterém X , X , X³ a X⁴ všechny znamenají CH), strukturní fragment vzorce IVb nebo strukturní fragment vzorce nebo IVc, R³¹ znamená jeden nebo více substituenty zvolenými ze souboru, do kterého patří halogen, C1.4 alkyl, Ci-₄ alkoxy nebo -O-(CH₂)_P C(O)N(R³²)(R³³) (t.j. substituent(y) není(nejsou) fakultativní).

Výhodné sloučeniny podle vynálezu jsou například ty, ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVa.

Sloučeniny vzorce I, ve kterých fragment

má S-konfiguraci, jsou výhodné. Vlnovky u dusíkového a uhlíkového atomu ve vzorci uvedeném shora, který znázorňuje fragment, označují polohu vazby na fragmentu.

Výhodné sloučeniny vzorce I jsou například sloučeniny z příkladů 1 a 2.

Příprava

Vynález také řeší způsob přípravy sloučenin vzorce I, přičemž tento způsob zahrnuje:

9 9 • · · · «4 · 4 9 • · · ·

4 9 9 (a) kopulaci sloučeniny vzorce V, _r2 _R3 O v Q

RO^fý OH kde R¹, R², R³ a R_x mají význam uvedený shora, se sloučeninou vzorce VI, z\

Η— Ν Y

IV

O^N—(CH₂)_n—B kde Y, n a B mají význam uvedený shora, například v přítomnosti kopulačního systému (např. oxalyl chlorid v DMF, EDC, DCC, HBTU nebo TBTU), vhodné báze (např. pyridine, DMAP, TEA nebo DIPEA) a vhodného organického rozpouštědla (např. dichlormethan, acetonitril nebo DMF);

(b) kopulaci sloučeniny vzorce VII,

VII

3 kde R , R , R , R_x a Y mají význam uvedený shora se sloučeninou vzorce VIII,

H₂N-(CH₂)n-B VIII kde n a B mají význam uvedený shora, například v přítomnosti kopulačního systému (např. oxalyl chlorid v DMF, EDC, DCC, HBTU nebo TBTU), φ · φφ φ φ φ φ

- ιι -: : .· φ · φ φφ φφφφ φφφ φφφ φ φ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φ φφ φφ vhodné báze (např. pyridine, DMAP, TEA nebo DIPEA) a vhodného organického rozpouštědla (např. dichlormethanu, acetonitrilu nebo DMF);

(c) pro sloučeniny vzorce I, ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVa, IVb nebo IVc, reakci sloučeniny vzorce IX,

R2 R3 O

R¹O 'R* Ν Ύ

IX

O^-(CH₂)— b¹ kde B¹ znamená strukturní fragment vzorce IVa¹, IVb¹ nebo IVc¹

MW/WW

WMW .31 .31 .31 ^X\

N

HN

OR^y

HN·

OR'

IVa¹

IVb¹

IVc¹ kde R^y znamená Ci.4 alkyl a R¹, R², R³, Rx, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶ a R³¹ mají význam uvedený shora, s plynným amoniakem, například při pokojové teplotě, v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla (např. methanolu nebo ethanolu);

(d) pro sloučeniny vzorce I, ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVa, IVb nebo IVc, redukcí sloučeniny vzorce X, ·♦ 99 * * ·· *· • •4« · · ·· · · · * .12-·· .· _t J ί.ϊίϊί ··· · · ·«·· ·· ···· ··· ··» «· *·

(CH₂)_n—Β² kde Β² znamená strukturní fragment vzorce IVa², IVb² nebo IVc²

MW1

MM

N

HObr NH,

IVa² IVb² IVc² a R¹, R², R³, R_x, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶ a R³¹ mají význam uvedený shora, v přítomnosti vhodného redukčního činidla (například katalytickou hydrogenací za přítomnosti např. Pd/C nebo T1CI3) a vhodného organického rozpouštědla (např. ethanolu); nebo (e) pro sloučeniny vzorce I, kde X¹, X², X³, X⁴, X⁷, X⁸ a/nebo X⁹ znamenají N-O, oxidací odpovídající sloučeniny vzorce I, ve které X¹, X², X³, X⁴, X⁷, X⁸ a/nebo X⁹ (jak je třeba) znamenají N, například za podmínek, které jsou odborníkům v oboru dobře známé.

- 13 *

Sloučeniny vzorce I, ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVd mohou být připraveny analogicky metodám zde popsaným nebo, alternativně, analogicky metodám popsaným v mezinárodních patentových přihláškách WO 95/23609 a WO 98/06741.

Sloučeniny vzorce V jsou komerčně dostupné, jsou dobře známé z literatury, nebo jsou dostupné s použitím známých technik. Například, sloučeniny vzorce V mohou být připraveny hydrolýzou sloučenin vzorce XI,

R² R³ P

XI

R¹O R* OR kde R je Ci.g alkyl nebo C1.3 alkylfenyl a R¹, R², R³ a R_x mají význam uvedený shora, například při pokojové teplotě v přítomnosti vhodné báze (např. lithium hydroxide) a vhodného rozpouštědla (např. THF a/nebo vody).

Sloučeniny vzorce VI mohou být připraveny reakcí sloučeniny vzorce XII, /\

Η—Ν Y

XII

OH kde Y má význam definovaný shora, se sloučeninou vzorce VIII, jak je definována shora, například za podmínek zde popsaných pro syntézu sloučenin vzorce I (kroky (a) a (b) způsobu).

• · « ·

- 14 • · · · • · · ·· ··

Sloučeniny vzorce VII jsou snadno dostupné s použitím známých metod. Například, sloučeniny vzorce VII mohou být připraveny reakcí sloučeniny vzorce V jak je shora definováno se sloučeninou vzorce XII jak je shora definováno; například za podmínek, jak jsou popsány shora syntézu sloučeniny vzorce I (stupně způsobu (a) a (b)).

Sloučeniny vzorce IX mohou být připraveny známými metodami. Například sloučeniny vzorce IX, ve kterých B¹ znamená strukturní fragment vzorce IVa¹ nebo IVcj. mohou být připraveny reakcí sloučeniny vzorce XIII,

R² R^{3 0} v

R’O F<

\/

XIII

3 3 kde B znamená strukturní fragment vzorce IVa nebo IVc ,

IVa³ IVc³ a R¹, R², R³, R_x, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴ a R³¹ mají význam uvedený shora, s HCl(g) a Ci-4 alkylalkoholem, například při pokojové teplotě nebo pod ní.

# · • « • 9

- 15 • » 4 ♦ · ·· Λ » · · · · « 9 · · · • < · ti * • · · · • » · · · · «·

Sloučeniny vzorce X mohou být připraveny známými metodami. Například, sloučeniny vzorce X ve kterých B² znamená strukturní fragment vzorce IVa² nebo IVc², mohou být připraveny reakcí sloučeniny vzorce XIII jak je shora definováno s plynným HCl a methanolem, například při pokojové teplotě nebo pod ní, následovanou reakcí s hydroxylaminem, nebo jeho halogenidem, například při pokojové teplotě nebo kolem pokojové teploty, za přítomnosti vhodné báze (např. TEA) a vhodného rozpouštědla (např. MeOH).

Sloučeniny vzorce XI ve kterých R a R obě znamenají H, mohou být připraveny redukcí sloučenin vzorce XIV,

R² O

XIV

OR kde R, R_x a R² mají význam uvedený shora, například při pokojové teplotě nebo pod ní_; (například mezi -70°C a -5°C) v přítomnosti vhodného redukčního činidla (např. borohydridu sodného) a vhodného organického rozpouštědla (např. MeOH nebo EtOH).

Sloučeniny vzorce XI ve kterých R¹ znamená H a R³ znamená Ci-4 alkyl, cyklohexyl nebo fenyl mohou být připraveny reakcí sloučeniny vzorce XIV jak je shora definováno s organokovovým činidlem vzorce XV

R^3aM XV kde R^3a znamená C].₄ alkyl, cyklohexyl nebo fenyl, M znamená Li nebo MgHal a Hal je Cl, Br nebo I, za podmínek, které jsou odborníkům v oboru dobře známé, v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla (např. THF).

• ·

- 16 • · · · • · · « · · « • · · » ♦ ·· · · ·· ♦ · · · • · · · · ♦ · · · · · * * · · · • · · * · »·

Sloučeniny vzorce XI ve kterých R¹ znamená H mohou také být připraveny reakcí sloučeniny vzorce XVI,

RO-C(O)-R_XH XVI kde R a R_x mají význam uvedený shora se sloučeninou vzorce XVII,

R²-C(O)-R³ XVII kde R² a R³ mají význam uvedený shora za podmínek, které jsou dobře známé odborníkům v oboru.

Sloučeniny vzorce XI ve kterých R , R a R všechny znamenají H, R_x znamená strukturní fragment vzorce Ha, jak je shora definováno, ve kterých ani k, ani 1, neznamená 0, mohou být připraveny redukcí sloučeniny vzorce XVIII,

OH O

XVIII

OR kde R_xa znamená strukturní fragment vzorce Ha, jak je shora definováno, ve kterých ani k ani 1 neznamená 0, a R má význam definovaný shora, v přítomnosti vhodného redukčního činidla (např. boranu) v přítomnosti vhodného organického rozpouštědla (např. THF).

Sloučeniny vzorce XIII mohou být připraveny kopulací sloučeniny vzorce VII, jak je shora definována, na sloučeninu vzorce XIX,

H₂N-(CH₂)_n-B³ XIX kde n a B³ mají význam uvedený shora, například za podmínek, které jsou shora popsány pro syntézu sloučenin vzorce I (kroky (a) a (b) způsobu).

- 17 • · Φ · 9 • · Φ · «Ο · • · » · • · Φ · · • · · · ·· ·»·· ·«· « *♦ · · • « · fc • · · * • · Φ Φ

Φ Φ Φ Φ

Φ Φ β Φ

Sloučeniny vzorce XIV jsou buď známé ze stavu techniky nebo mohou být připraveny analogicky metodám, popsaným v J. Org. Chem., 54, 3831 (1989).

Sloučeniny vzorce XVIII jsou dobře známé z literatury nebo mohou být připraveny s použitím známých technik, například reakcí vhodného derivátu kyseliny malonové s alkylačním činidlem vzorce XX,

R_xaL XX ve kterých L je a odštěpitelná skupina (např. halogen (Cl, Br, I) nebo tosyl) a R_xa má význam definovaný shora, například v přítomnosti vhodné báze (např. hydrid sodný nebo ethoxid sodný) a vhodné organického rozpouštědla.

Sloučeniny vzorce VIII, XII, XV, XVI, XVII, XIX a XX a jejich deriváty jsou buď komerčně dostupné, známé z literatury, nebo mohou být získány analogicky způsobům zde popsaným, nebo obvyklými syntetickými postupy, podle známých způsobů provedení, ze snadno dostupných výchozích materiálů s použitím vhodných činidel a reakčních podmínek.

Substituenty na, mezi jinými, fenylových skupinách, obsažených ve sloučeninách vzorce I, V, VI, VII, VIII, IX, X, XI, XIII, XIV, XVI, XVIII, XIX a XX, mohou být přeměněny na jiné s použitím známých postupů.

Sloučeniny vzorce I mohou být izolovány z jejich reakčních směsí pomocí známých technik.

Odborníkům v oboru je zřejmé, že při procesech popsaných shora může být potřeba chránit funkční skupiny na meziproduktech chránícími skupinami.

- 18 9 · • · · ·

9 9

9 9 « * · • 4 · · · ·

Funkční skupiny, které je potřeba chránit, jsou například hydroxy, amino a karboxy skupina. Vhodnými chránícími skupinami pro hydroxyskupinu jsou například trialkylsily 1 nebo diarylaiky 1 sily 1 skupiny (např. t.butyldimethylsilyl, t.butyldifenylsilyl nebo trimethylsilyl) a tetrahydropyranyl. Vhodné chránící skupiny pro karboxylové skupiny jsou například Ci„6 alkyl nebo benzyl estery. Vhodné chránící skupiny pro amino, amidino a guanidino skupiny jsou například t.butyloxykarbonyl nebo benzyloxykarbonyl. Amidinový a guanidinový dusíkový atom mohou být buď mono- nebo di-chráněné, tedy mohou být chráněné jednou nebo dvěma chránícími skupinami.

Chránění a odstranění chránění z funkčních skupin se také může provádět před nebo po kopulaci.

Například, sloučeniny vzorce I mohou být připraveny způsobem, při kterém se kopuluje N-acylovaná aminokyselina nebo a N-chráněná aminokyselina. Pokud se používá N-chráněná aminokyselina, pak acylová skupina může být připojena po kopulaci a odstranění chránění z dusíkového atomu se pak může provádět běžným způsobem až následně.

Chránící skupiny mohou být odstraněny technikami, které jsou dobře známé odborníkům v oboru a jsou popsány dále.

Použití chránících skupin je plně popsáno v Protective Groups in Organic Chemistry, vydané J W F McOmie, Plenům Press (1973), a Protective Groups in Organic Synthesis, 2nd edition, T W Greene & P G M Wutz, Wiley-Interscience (1991).

Některé chráněné deriváty sloučenin vzorce I, které mohou být vyrobeny před závěrečným odstraněním chránění, po kterém již vznikají sloučeniny vzorce I, jsou nové.

·· ··

Podle dalšího aspektu podle vynálezu byla nalezena sloučenina vzorce la,

R² R^{3 0}

R¹O 'R* Ν y la —(ch₂)„—b‘ kde B^a znamená strukturní fragment vzorce IVe, IVf, IVg nebo IVh .31

D¹N

MMM/W 'N' 'T^^NHD² DW^^^NHD²

X⁶

IVf

IVe

IVg IVh kde D¹ a D² nezávisle znamenají, v každém případě, H, OH, OR^a, OC(O)R^b, OC(O)OR^c, C(O)O^d, C(O)R^e, a R^a, R^b, R^c, R^d a R^e nezávisle znamenají Ci.n alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě přerušena kyslíkem a/nebo substituovaná halogenem), fenyl, naftyl, C1.3 alkylfenyl (přičemž poslední jmenované tři skupiny jsou popřípadě substituované C1-4 alkyl, C1.4 alkoxy, nitro, nebo halogenem) nebo -(C(R^f)(R^g))2OC(O)C(R^h), R^f, R^ga R^h nezávisle znamenají H nebo C1.4 alkyl, a R¹, R², R³, Rx, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹ a R³¹ mají význam uvedený shora, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin,

9 s podmínkou, že D a D neznamenají současně H.

• ·

- 20 • · * » • · 9 • · · · • » · • · · · · β

Alkylové skupiny, které mohou být představovány skupinami R^a, R^b, R^c, R^d, R^e, R^f, R^ě a R^h, a které mohou být substituovány zbytky R^a, R^b, R^c, R^d a R^e, mohou být lineární nebo rozvětvené, mohou být nasycené nebo nenasycené, a mohou být cyklické, acyklické nebo část může být cyklická a část acyklická. Alkoxylové skupiny, kterými mohou být substituované zbytky R^a, R^b, R^c, R^d a R^e, mohou být lineární nebo rozvětvené, mohou být nasycené nebo nenasycené a mohou být cyklické, acyklické nebo část může být cyklická a část acyklická. Alkylová část alkylfenylových skupin, které mohou být představovány skupinami R^a, R^b, R^c, R^d a R^e, může být lineární nebo rozvětvená, a může být nasycená nebo nenasycená.

Halogenové skupiny, kterými mohou být substituovány skupiny R^a, R^b, R^c, R^d a R^e, jsou například fluor, chlor, brom a jód.

Vlnovka na vazbě ve fragmentech IVe, IVf, IVg a IVh označuje konfiguraci vazby fragmentů.

Výhodné sloučeniny vzorce Ia jsou například ty kde D²znamená H a D¹ znamená OH, OCH₃, OC(O)R^b nebo C(O)OR^d, kde R^b a R^dmají význam uvedený shora.

Strukturní preference, zmíněné shora pro sloučeniny vzorce I platí také pro sloučeniny vzorce Ia.

Sloučeniny vzorce Ia mohou také být připraveny přímo ze sloučenin vzorce I technikami, které jsou odborníkům v oboru dobře známé. Například sloučeniny vzorce Ia ve kterých znamená strukturní fragment vzorce IVe, IVf nebo IVg, a ve kterých D¹ nebo D² znamenají OHI, mohou být připraveny jak je popsáno v předchozím textu pro sloučeniny vzorce X, nebo analogickými způsoby.

- 21 • · 99 • · · 9

9 9 • · · *

9 · • 9 9 9 9 9

Alternativně, sloučeniny vzorce la ve kterých B^a znamená strukturní fragment vzorce IVe, IVf nebo IVg, a ve kterých D¹ nebo D²znamenají OH nebo OR^a, kde R^a má význam definovaný shora, mohou být připraveny z sloučeniny vzorce XIII, jak jsou definovány shora, reakcí se sloučeninou vzorce XXI,

H₂NOR^al XXI kde R^al znamená H nebo Ra a Ra má význam definovaný shora, například při teplotě mezi 40 a 60°C, v přítomnosti vhodné báze (např. TEA) a vhodného organického rozpouštědla (např. THF, CH3CN, DMF nebo DMSO).

Sloučeniny vzorce la mohou alternativně být připraveny přes jiné chráněné deriváty vzorce la technikami, které jsou dobře známé odborníkům v oboru. Například sloučeniny vzorce la ve kterých D¹ nebo D²znamená OC(O)OR^c, a R^c má význam definovaný shora, mohou být připraveny reakcí odpovídajících sloučenin vzorce la, ve kterých D¹ nebo D² (jak je potřeba) znamená OH se sloučeninou vzorce XXII,

R^cC(O)-O-C(O)R^c XXII kde R^c má význam definovaný shora, například při pokojové teplotě v přítomnosti vhodné báze (např. TEA, pyridin nebo DMAP) a vhodného organického rozpouštědla. Kromě toho, sloučeniny vzorce la ve kterých D¹nebo D² znamená. OH mohou být připraveny reakcí odpovídajících sloučenin vzorce la, ve kterých D¹ nebo D² (jak je potřeba) znamená COOR^d kde R^d má význam uvedený shora, s hydroxylaminem (nebo jeho hydrohalogenidovou adiční solí) například při 40°C v přítomnosti vhodné báze (např. TEA) a vhodného organického rozpouštědla (např. THF).

Sloučeniny vzorce XXI a XXII jsou komerčně dostupné, jsou dobře známé v z literatury, nebo jsou dostupné pomocí známých technik.

Pro odborníka je také zřejmé, že, ačkoliv tyto chráněné deriváty sloučenin vzorce I (např. sloučenin vzorce la) nemusí mít farmakologickou • · ·· · · · · φ φ ·· ···· ··· ·«· ·· φφ aktivitu, mohou být parenterálně nebo orálně podávány a pak se metabolizují v těle pacienta a tvoří sloučeniny podle vynálezu, které jsou farmakologický aktivní. Tyto deriváty mohou proto být popsány jako prodrogy. Všechny prodrogy sloučenin vzorce I jsou zahrnuty v rozsahu vynálezu.

Chráněné deriváty sloučenin vzorce I, které jsou zejména užitečné jako prodrogy, jsou například sloučeniny vzorce la.

Kromě toho, některé sloučeniny vzorce I mohou působit jako prodrogy jiných sloučenin vzorce I.

Sloučeniny vzorce I, farmaceuticky přijatelné soli, jejich tautomery a stereoisomery, stejně jako jejich prodrogy (včetně sloučenin vzorce la, které jsou prodrogami sloučenin vzorce I), jsou zde uváděny společně jako sloučeniny podle vynálezu.

Osobám zběhlým v oboru je jasné, že pro získání sloučenin podle vynálezu v alternativní a za určitých podmínek vhodných, se dá použít individuálních kroků způsobu, které zde jsou popsány, a které se dají provádět v jiném pořadí a/nebo individuálních reakcí, které mohou být provedeny různé fázi celkové syntézní cesty (t.j. substituenty mohou být navázány na sloučeninu a/nebo se mohou chemicky přeměnit, takže se používají jiné meziprodukty, než jsou zde uváděny a spojeny s určitou konkrétní reakcí). To závisí, mezi jiným, na faktorech jako je povaha jiné funkční skupiny, která je přítomna v určité látce, dostupnost jednotlivých meziproduktů, strategii použití chránících skupin (pokud se nějaké používají), kterou je třeba upravit. Jednoduše, na volbu reakčního činidla má vliv chemická povaha látek, které se používá v uvedených syntetických stupních, potřeba určitého typu chránících skupin a pořadí reakcí, kterými lze dosáhnout dané syntézy.

- 23 Lékařské a farmaceutické použití

Sloučeniny podle vynálezu jsou použitelné, neboť vykazují farmakologickou aktivitu. Jsou proto označovány jako farmaka.

Dalším aspektem vynálezu jsou sloučeniny podle vynálezu pro použití jako farmaceuticky účinných látek.

Konkrétně sloučeniny podle vynálezu jsou potenciální inhibitory trypsinu-podobných proteáz, zejména trombinu, buď jako takové nebo, v případě prodrog, po podání savcům včetně lidí, například jak je demonstrováno v testech, popsaných dále.

Sloučeniny podle vynálezu jsou podle očekávání použitelné u těch stavů, kdy je požadována inhibice trombinu.

Sloučeniny podle vynálezu jsou tudíž indikovány pro léčení nebo prevenci trombózy a hyperkoagulability krve a tkání zvířat včetně lidí.

Je známo, že hyperkoagulabilita může vést k trombo-embolickým chorobám. Stavy, spojené s hyperkoagulabilitou a trombo-embolické choroby, které mohou být v této souvislosti jmenovány, jsou například rezistence k aktivovanému proteinu C, jako je faktor V-mutace (faktor V Leiden), a dědičné nebo získané deficience antitrombinu III, proteinu C, proteinu S či heparinového kofaktoru II. Další stavy, o kterých je známo, že jsou spjaty s hyperkoagulabilitou a trombo-embolickou poruchou jsou například oběhové antifosfolipidové protilátky (Lupus antikoagulant), homocysteinemie, heparinem vyvolaná trombocytopenie a defekty ve fibrinolýze. Sloučeniny podle vynálezu jsou tudíž indikovány při terapeutickém a/nebo profylaktickém ovlivňování těchto stavů.

·· Φ· « · ·

Sloučeniny podle vynálezu jsou dále indikovány pro léčení stavů, kdy je nežádoucí přebytek trombinu bez známek hyperkoagulability, například při neurodegenerativních chorobách jako je Alzheimerova choroba.

Konkrétní chorobné stavy, které mohou být jmenovány, jsou například terapeutické a/nebo profylaktické ošetřování trombózy žil a plicní embolie, arteriální trombózy (např. při infarktu myokardu, nestabilní angíně, mrtvíce vyvolané trombózou a periferní arteriální trombóze) a systemické embolii obvykle vycházející z atria v průběhu arteriální fibrilace nebo z levé srdeční komory po transmurálním infarktu myokardu.

Kromě toho, u sloučenin podle vynálezu lze očekávat použití v profylaxi re-okluze (t.j. trombózy) po trombolýze, perkutánní transluminální angioplastie (PTA) a operativním zavedení koronárního bypasu; prevenci re-trombózy po mikrochir argii a vaskulární chirurgii obecně.

Další indikace jsou například terapeutické a/nebo profylaktické ošetřování roztroušené intravaskulární koagulace způsobené bakteriemi, vícenásobným traumatem, intoxikaci nebo jakýmkoliv jiným mechanismem; léčba antikoagulantem, kdy se krev uvádí do kontaktu s cizím povrchem v těle jako jsou vaskulární štěpy, vaskulární spony, vaskulární katétry, mechanické a biologické protézy chlopní nebo jakákoliv další lékařská zařízení a působení antikoagulantem při situacích, kdy je krev v kontaktu s léčebnými zařízeními mimo tělo v průběhu kardiovaskulární operace pomocí umělého srdce a dýchacího přístroje nebo při hemodialýze.

94 • · « · • 4 4 9

9 4 9

- 25 • · · • 9

9 ·

9944

Kromě těchto vlivů na koagulační proces, je trombin známý jako aktivátor velkého množství buněk (jako jsou neutrofily, fibroblasty, endothelové buňky a buňky hladkého svalstva). Z těchto důvodů mohou sloučeniny podle vynálezu také být užitečné pro terapeutické a/nebo profylaktické ošetřování idiopatického syndromu, respiračního distresového syndromu, pulmonální fibrózy po léčení ozařováním nebo chemoterapií, septického šoku, septicemie, zánětlivých reakcí, kterými jsou například, mezi jinými, edém, akutní nebo chronická arterioskleróza jako je arteriální choroba věnčitých tepen, cerebrální arteriální choroba, periferní arteriální choroba, reperfuzní poranění a restenóza po perkutánní transluminální angioplastii (PTA).

Sloučeniny podle vynálezu, které inhibují trypsin a/nebo trombin mohou také být užitečné při léčení pankreatitidy.

Podle dalšího aspektu vynálezu se řeší způsob ovlivňování stavu, který vyžaduje inhibici trombinu nebo pro který je tato inhibice vhodná, přičemž tento způsob zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle vynálezu, nebo její farmaceuticky přijatelné soli, osobě, která trpí touto chorobou nebo která je k této chorobě náchylná.

Sloučeniny podle vynálezu se obvykle podávají orálně, intravenózně, subkutánně, bukálně, rektálně, dermálně, nasálně, tracheálně, bronchiálně, jakoukoliv další parenterální cestou nebo inhalací, ve formě farmaceutických přípravků obsahujících aktivní sloučeninu buď jako volnou bázi nebo farmaceuticky přijatelnou netoxickou adiční sůl s organickou nebo anorganickou kyselinou ve farmaceuticky přijatelné dávkové formě. Podle poruchy, která má být u pacienta léčena a způsobu podávání, kompozice mohou být podávány v různých dávkách.

φ φ

- 26 • φ φ · ♦ ♦ φ ·· φφ • · · · • · φ · φ • · φ · ···· φφφ φφφ

Sloučeniny podle vynálezu mohou také být kombinovány a/nebo podávány spolu s antitrombotickým prostředkem s jiným mechanismem působení, jako jsou prostředky antagonistické proti krevním destičkám, acetylsalicylová kyselina, ticlopidin, clopidogrel, tromboxanový receptor a/nebo syntetázové inhibitory, antagonisté fibrinogenových receptorů, prostacyklinová mimetika, inhibitory fosfodiesterázy a antagonisté ADPreceptoru (P₂T).

Sloučeniny podle vynálezu se mohou při léčení trombolytických nemocí, zejména infarktu myokardu, dále kombinovat a/nebo společně podávat s trombolytiky jako jsou aktivátory tkáňového plasminogenu (přírodní, rekombinační nebo modifikované), streptokináza, urokináza, prourokináza, anisoylovaný aktivační komplex plasminogen-streptokinázy (APSAC), aktivátory plasminogenu zvířecích slinných žláz a podobně.

Podle dalšího aspektu vynálezu se řeší farmaceutická formulace obsahující sloučeninu podle vynálezu ve směsi s farmaceuticky přijatelným adjuvantem, rozpouštědlem nebo nosičem.

Vhodné denní dávky této sloučeniny podle vynálezu při terapeutickém ošetřování lidí jsou asi 0,001-100 mg/kg tělesné hmotnosti při perorálním podávání a 0,001-50 mg/kg tělesné hmotnosti při parenterálním podávání.

Sloučeniny podle vynálezu mají tu výhodu, že mohou být účinnější, méně toxické, mohou déle působit, mají širší spektrum aktivity, mohou být silnější, mít méně vedlejších příznaků, být snadněji absorbovatelné nebo mohou mít jiné užitečné farmakologické vlastnosti, než sloučeniny známé ze stavu techniky.

9

- 27 ·· ·· « >

• ·· · ·· ·· • · · · · • · · 9 9 9

9 9 9 9 ·♦ ···· ··« ···

Biologické testy

Test A

Stanovení trombinové srážecí doby (TT= Thrombin Clotting Time)

Lidský trombin (T 6769, Sigma Chem. Co.) v roztoku pufru, pH

7.4, 100 pL, a roztoku inhibitoru, 100 pL, byly inkubovány po domu jedné minuty. Pak byla přidána spojená normální citrátovaná lidská plasma, 100 pL, a pomocí automatického zařízení (KC 10, Amelumg) byla měřena srážecí doba.

Srážecí doba v sekundách byla vynesena proti koncentraci inhibitoru a hodnota IC50TT byla stanovena interpolací.

ICsoTT je koncentrace inhibitoru, která při testu zdvojnásobí srážecí dobu.

Test B

Stanovení inhibice trombinu chromogenním. robotickým testem

Síla inhibitoru trombinu se měří metodou chromogenního substrátu, na robotickém mikrodeskovém procesoru Plato 3300 (Rosys AG, CH-8634 Hombrechtikon, Switzerland), s použitím 96-jamkových mikrotitrových destiček s polovičním objemem (Costar, Cambridge, MA, USA; Cat. No. 3690). Zásobní roztoky testované substance v DMSO (72 pL; 1 mmol/L) byly postupně ředěny 1:3 (24 + 48 pL) v DMSO na deset různých koncentrací, které byly při testu analyzovány jako vzorky. 2 pL testovaného vzorku byly zředěny přidáním 124 pL testovacího pufru, 12 pL roztoku chromogenního substrátu (S-2366, Chromogenix, Molndal, Sweden) v testovacím pufru a nakonec 12 pL roztoku α-trombinu (Human a-trombin, • · • · ·· ····

Sigma Chem. Co.), oba v testovacím pufru a vzorky byly promíchány. Koncentrace při posledním testu byly: testovací substance 0,00068 - 13,3 pmol/L, S-2366 0,30 mmol/L, a-trombin 0,020 NIHU/mL. Pro výpočet byl použit lineární nárůst absorbance po 40 minutách inkubace při 37°C, a byla vypočtena procenta inhibice pro každý testovaný vzorek ve srovnání se slepým pokusem bez inhibitoru. Robotem získaná hodnota IC50, odpovídající koncentraci inhibitoru, která způsobí 50% inhibici trombinové aktivity, byla vypočtena z křivky závislosti % inhibice na log dávky.

Test C

Stanovení inhibiční konstanty Ki pro lidský trombin

Stanovení Ki byla prováděna pomocí metody chromogenního substrátu, prováděné při 37°C na odstředivém analyzátoru Cobas Bio (Roche, Basel, Switzerland). Zbytková enzymatická aktivita po inkubaci lidského α-trombinu s různými koncentracemi testované sloučeniny byla stanovena při třech různých koncentracích substrátu a byla měřena jako změna v optické absorbanci při 405 nm.

Testovací roztoky sloučenin (100 pL; normálně v pufru nebo slaném roztoku obsahujícím BSA 10 g/L) byly smíseny s 200 pL lidského α-trombinu (Sigma Chem. Co.) v testovacím pufru (0,05 mol/L Tris-HCl pH

7,4, iontové síly 0.15 nastavené pomocí NaCl) obsahujícím BSA (10 g/L), a analyzovány jako vzorky v Cobas Bio. Vzorek objemu 60 pL, spolu s 20 pL vody, byl vždy přidán do 320 pL substrátu S-2238 (Chromogenix AB, Molndal, Sweden) v testovacím pufru a byla monitorována změna absorbance (ΔΑ/min). Výsledné koncentrace S-2238 byly 16, 24 a 50 pmol/L trombinu 0,125 NIH U/mL.

- 29 tt · • · tt* tt tttt · • · · • · · • · · tttt tttttttt • tt tttt • · · • · · • tt · • tttt · • tt tttt

Ustálený stav reakce byl použit pro sestrojení Dixonových diagramů, t.j. grafů závislosti l/(AA/min) na koncentraci inhibitoru. Pro reversibilní, konkurenční inhibitory poskytují data pro různé koncentrace substrátů typickou podobu křivek, na kterých směrnice rovnoměrného úseku x = -Ki.

Test D

Stanovení srážecí doby aktivovaného parciálního tromboplastinu (APTT)

APTT byla stanovena na spojené normální lidské citrátované plasmě pomocí činidla PTT Automated 5, vyráběného firmou Stago. Do plasmy byly přidány inhibitory (10 pL roztoku inhibitoru na 90 pL plasmy) a poté roztok chloridu vápenatého a ve směsi byla stanovena APTT pomocí analyzátoru koagulace KCiO (Amelumg) v souladu s instrukcemi výrobce činidla. Srážecí doba v sekundách byla vynesena proti koncentraci inhibitoru v plasmě a interpolací byla stanovena IC50APTT.

IC50APTT je definováno jako koncentrace inhibitoru v lidské pl ismě, která zdvojnásobí dobu srážení parciálním aktivovaným tromboplastinem.

Test E

Stanovení trombinové srážecí doby ex vivo

Inhibice trombinu po orálním nebo parenterálním podání sloučenin vzorce I a la, rozpuštěného v rozpouštědle o složení: ethanol:Solutol™:voda (5:5:90), byla testována na neuspaných krysách, které byly jeden nebo dva dny před experimentem vybaveny katetrem pro odebírání vzorků z krční tepny. V den pokusu byly vzorky krve odebírány ve stálých časech od podání sloučeniny do plastových trubic obsahujících 1

- 30 ...... .ί. ·..··,.· díl roztoku citronanu sodného (0,13 mol/1) a 9 dílů krve. Trubičky byly odstředěny aby se získala plasma s nízkým obsahem krevních destiček. Plasma byla použita pro stanovení doby srážení trombinem, jak je popsáno dále.

pL Citrátované krysí plasmy bylo zředěno roztokem soli 0,9 %, 25 pL, a koagulace plasmy byla zahájena přídavkem lidského trombinu (T 6769, Sigma Chem. Co., USA) ve 25 pL roztoku pufru o pH 7,4. Srážení bylo měřeno automatickým zařízením (KClOA-micro, Amelumg, Germany).

Pokud byla podávána sloučenina vzorce la, byly vhodné koncentrace vhodného aktivního inhibitoru trombinu vzorce I v krysí plasmě odhadnuty pomocí standardních křivek trombinové srážecí doby v krysí plasmě od více jedinců, aby se zjistily koncentrace odpovídajícího aktivního inhibitoru trombinu, rozpuštěného ve vodném roztoku soli.

Plocha pod křivkou koncentrace-doba po orálním a/nebo parenterálním podání příslušné sloučeniny vzorce la byla vypočtena na základě odhadnutých koncentracích aktivního trombinového inhibitoru vzorce I (které předpokládají, že prodloužení trombinové srážecí doby je způsobeno zmíněnou sloučeninou) v plasmě krys (AUCpd) pomocí lichoběžníkové integrace extrapolací dat k nekonečnu.

Biologická přístupnost aktivního inhibitoru trombinu vzorce I po orálním nebo parenterálním podání sloučeniny vzorce la byla vypočtena, jak je znázorněno dále:

[(AUCpd/dávka)/(AUCaktivní,parenterální/dávka)] x 100 kde AUCaktivní,parenterální znamená AUC dosažená po parenterálním podání odpovídajícího aktivního inhibitoru trombinu vzorce I neuspaným krysám, jak je popsáno shora.

• 9

Test F

Stanovení trombinové srážecí doby v moči ex vivo

Množství aktivního inhibitoru trombinu vzorce I, které bylo vyloučeno v moči po orálním nebo parenterálním podání sloučeniny podle vynálezu, rozpuštěné v rozpouštědle o složení ethanol:Solutol™:voda (5:5:90), bylo odhadnuto stanovením trombinové srážecí doby v moči ex vivo (přičemž se předpokládá, že prodloužení trombinové srážecí doby je způsobeno zmíněnou sloučeninou).

Neuspané krysy byly umístěny v klecích pro měření metabolismu, které umožňují oddělený odběr moči a výkalů po dobu 24 hodin, s následným orálním podáním sloučeniny podle vynálezu. Trombinová srážecí doba byla stanovena v odebrané moči, jak je popsáno dále.

Normální citrátovaná lidská plasma (100 pL) byla inkubována s koncentrovanou močí krys, nebo s jejími slanými roztoky, po dobu jedné minuty. Poté byla vyvolána koagulace plasmy podáním lidského trombinu (T 6769, Sigma Chem. Co.) v roztoku pufru (pH 7,4; 100 pL). Byla měřena srážecí doba pomocí automatického zařízení (KC 10; Amelumg).

Koncentrace aktivního inhibitoru trombinu vzorce I v moči krys byla odhadnuta pomocí standardních křivek trombinové srážecí doby v normální citrátované lidské plasmě při známých koncentracích shora zmíněného aktivního inhibitoru trombinu rozpuštěného v koncentrované krysí moči (nebo jeho slaných zředěných roztoků). Násobením celkového množství moči vyloučené za 24 hodin odhadnutou střední koncentrací shora zmíněného aktivního inhibitoru v moči se dá vypočítat množství aktivního inhibitoru vyloučeného v moči (MNOŽSTVÍpd).

Biologická přístupnost aktivovaného inhibitoru trombinu vzorce I po orálním nebo parenterálním podání prodrogy byla vypočtena následovně:

[(MNOŽSTVÍpd/dávka)/(MNOŽSTVÍaktivní,parenterální/dávka)] x 100 kde MNOŽSTVÍaktivní,parenterální znamená množství, vyloučené močí po parenterálním podání příslušné aktivního trombinového inhibitoru vzorce I neuspaným krysám, jakje popsáno dále.

Vynález je ilustrován následujícími příklady.

Příklady provedení

Obecné experimentální postupy

Hmotnostní spektrum bylo zaznamenáno na hmotnostním spektrometru Finnigan MAT TSQ 700 triple quadrupole, na hmotnostním spektrometru vybaveném elektrickým rozprašovacím rozhraním (FAB-MS) a VG Platform II hmotnostním spektrometru vybaveném elektrickým rozprašovacím rozhraním (LC-MS). *H NMR a ¹³C NMR měření byla prováděna na zařízení BRUKER ACP 300 a spektromektry Varian UNITY plus 400, 500 a 600, praacující při ^JH frekvencích 300,13, 399,96, 499,82 a 599,94 MHz, a při ¹³C frekvencích 75,4b, 100,58, 125,69 a 150,88 MHz. Preparativní HPLC byla prováděna na kolonách s reversní fází (250 mm, 20 nebo 50 mm; 5 až 7 μΜ fáze Chromasil Cg) s průtoky 10 až 50 ml/min pomocí a UV detektoru (240 až 290 nm).

- 33 Příklad 1 (2,5-diMeO)Ph-(S)- nebo (R)-CHÍCH_zOH)-CO-Pro-Pabí2-Cl) x HOAc (i) 4-Azidomethyl-3-chlorbenzonitril

Směs 8,0 g (0,035 mol) 4-brommethyl-3-chlorbenzonitrilu (J. PPharm. Sci., (1986) 75, 410), 2,7 g (0,042 mol) azidu sodného, 1,2 g (3,4 mmol) hydrogensíranu tetrabutyamonného, 0,30 g (3,4 mmol) hydrogenuhličitanu sodného, 7 ml vody a 20 ml toluenu bylo živě mícháno 3 dny. Fáze byly odděleny a vodná vrstva byla extrahována třikrát etherem. Spojená organická vrstva byla promyta vodou, sušena síranem sodným a odpařena, což poskytlo 6 .7 g ( 100 % ) dílčí titulní sloučeninu.

NMR (300 MHz; CDC1₃): δ 4,60 (s, 2H), 7,57 (d, IH), 7,61 (m, 1 H), 7,70 (d, IH) (ii) 4-Aminomethyl-3-chlorbenzonitril

4-Azidomethyl-3-chlorbenzonitril (1,0 g; 5,2 mmol; ze stupně (i) shora), byla rozpuštěna v 9 ml vody a 1 ml ethanol. Byl přidán trifenylfosfin (1,5 g) a směs byla míchána přes noc. Ethanol byl odpařen a zbytek byl rozdělen mezi 1M HCI a benzen. Vodná vrstva byla extrahována několikrát benzenem a pak při zmrazení sušena. Výtěžek hydrochloridaminu byl 0,54 g (51 % ).

^JH NMR (400 MHz; D²O) HCI sůl: δ 4,42 (s, 2H), 7,69 (d, IH), 7,8 1 (dd, IH), 7,98 (d, IH)

-34-: :

(iii)_(R,S)-3-Hydroxy-2-(2.5-dimethoxyfenyl)_I)ropionová kyselina.

ethylester

K roztoku ethylesteru 3-oxo-2-(2,5-dimethoxyfenyl)_propionové kyseliny (7,6 g; 30 mmol; připraven podle metody popsané v J. Org. Chem. 54, 3831 (1989)) v ethanol byla přidán NaBH₄ (2 ekvivalentů) při -15°C. Po míchání po dobu 2 h při -15°C, a 4 h při -5°C, byla přidána voda, reakční směs byla zahuštěna a extrahována ethylacetátem. Organická vrstva byla promyta solankou, sušena (MgSO₄) a zahuštěna, což poskytlo dílčí titulní sloučeninu. Výtěžek 7,7 g (100%).

(iv) (2.5-diMeO)_I1h-(R,S)CH(CH₁OH)-COOH

Ethylester z stupně (iii) shora (7,4 g; 29 mmol) byl rozpuštěn v rozpouštědle o složení TEtF:voda (1:1). Byl přidán LiOH χ Η₂Ο (2 eq.) a reakční směs byla míchána pro 2 h při pokojové teplotě. Reakční směs byla zahuštěna a extrahována CH2CI2. Vodná vrstva byla okyselena (pH 2) přidáním HCI (2M) a třikrát extrahována CH2CI2. Organické fáze byly spojeny a získaná směs byla sušena (Na2SO₄) a zahuštěna, což poskytlo dílčí titulní sloučeninu. Výtěžek 5,4 g (82 % ).

'HNMR (400 MHz; CDC1₃): 5 6,89 (d, IH); 6,85 (d, IH); 6,78 (dd, IH); 4,86 (široký pás, 2H); 4,14 (dd, IH); 3,98 (dd, IH); 3,78 (s, 3H); 3,72 (s, 3H); 3,67 (dd, IH) (v) (2,5-diMeO)n_h-(R.S)CH(CH2OH)-CO-Pro-OBn,

1,8 ml (9,6 mmol) diisopropylethylaminu bylo přidáno k ledem-chlazené směsi 0,50 g (2,2 mmol) (2,5-diMeO)_ph-(R,S)CH(CH,OH)-COOH (ze stupně

- 35 (iv) shora), 0,58 g (2,4 mmol) H-Pro-OBn a 0,77 g (2,4 mmol) TBTU v 10 ml DMF. Směs byla míchána při pokojové teplotě přes noc, a byla pak nalita do IM HCI a extrahována dvakrát směsí ethylacetát:toluen (1:1). Spojená organická vrstva byla promyta NaHCCU (aq.) a vodou, sušena (Na₂SO4) a odpařena. Produkt byl čistý a byl použit přímo v dalším stupni. Výtěžek: 0,91 g (100 %).

'HNMR (500 MHzjCDCU) diastereomerní směs: δ 1,8-2,3 (m, 4H), 3,0-3,1 (m, 1Η), 3,18 (m, 1H, diastereomer), 3,34 (m, 1Η, diastereomer), 3,46 (m, 1H, diastereomer), 3,65-3,7 (m, 1H), 3,75-3,9 (m, 7H, její 4 singlety při 3,77, 3,80, 3,85 a 3,87 ppm), 3,95-4,05 (m, 1H), 4,39 (m, 1H, diastereomer), 4,46 (m, 1Η, diastereomer), 4,58 (m, 1H, diastereomer), 4,63 (m, 1H, diastereomer), 5,18 (d, 1H, diastereomer), 5,26 (s, 1H, diastereomer), 5,32 (d, 1H, diastereomer), 5,37 (s, 1H, diastereomer), 6,87,0 (m, 3H), 7,2-7,5 (m, 5H) (v ) (2.5-diMeO)nh-(R.S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OH (2,5-diMeO)_ph-(R,S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OBn (0,91 g; 2,2 mmol; ze stupně (v) shora), byla hydrogenována po dobu 2 h při atmosférickém tlaku za přítomnosti 50 mg 10% Pd/C v 25 ml ethanolu. Směs byla filtrována přes celit a odpařena, což poskytlo 0,71 g (100 %) dílčí titulní sloučeniny.

^ΧΗ NMR (500 MHz; CDC1₃) diastereomerní směs: δ 1,8-2,3 (m, 4H), 3,02 (m, 1Η, diastereomer), 3,15 (m, 1Η, diastereomer), 3,47 (m, 1Η, diastereomer), 3,7-3,8 (m, 5Η, její další diastereomery odpovídající 3,47, a dva singlety při 3,74 a 3,76 ppm), 3,83-3,85 (m, 3H), 4,0-4,1 (m, 1H), 4,38 (m, 1H, diastereomer), 4,50 (m, 1H, diastereomer), 4,56 (m, 1H, diastereomer), 4,63 (m, 1Η, diastereomer), 6,8-6,9 (m, 3H) ·» • · · » φ

-36-1 : .·.

v · » • · φφφφ φ (vii) (2,5-diMeO)nh-(R a S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-C1.4-CN)

0,76 ml (4,4 mmol) diisopropylethylamin byl přidán do ledem chlazené směsi 0,35 g (1.1 mmol) (2,5-diMeO)_ph-(R,S)CH(CH₂OH)-COProOH (ze stupně (vi) shora), 0,22 g (1,1 mmol) 4-aminomethyl3chlorbenzonitril (ze stupně (ii) shora) a 0,35 g (1,1 mmol) TBTU v 10 ml DMF. Tato směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu dvou dnů, nalita do 1M HCI a extrahována dvakrát s ethylacetát:toluen (1:1). Spojená organická vrstva byla promyta NaHCO₃ (aq.) a vodou, sušena (Na₂SO4) a odpařena. Surový produkt byla mžikově chromatografován na silikagelu pomocí EtOAc:MeOH (99:1) jako eluentu. Diastereomery byly odděleny. Celkový výtěžek: 0,48 g (94%). První diastereomer (A) byl isolován ve výtěžku 0,22 g.

Diastereomer A

ONMR (400 MHz; CDC1₃): δ 1,7-2,1 (m, 3H), 2,34 (m, IH), 2,90 (m, IH),

3,12 (m, IH), 3,61 (m, IH), 3,73-3,8 (m, 4H, její jeden singlet při 3,75), 3,82 (s, 3H), 4,01 (m, IH), 4,44 (m, IH), 4,56 (m, IH), 4,65 (m, IH), 6,756,85 (m, 3H), 7,53 (d, IH), 7,56 (dd, IH), 7,65 (d, IH), 7,68 (m, IH) (v/ii) (2,5-diMeO)_ph-(R nebo S)CH(CH,OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-Cl-4-C-(NH)OMe) (2,5-diMeO)_ph-(R nebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2C1,4-CN) (0,22 g; 0,47 mmol; diastereomer A ze stupně (vii) shora) byl rozpuštěn v 25 ml methanolu nasyceného plynným chlorovodíkem a uložen na dva dny do lednice. Odpaření poskytlo a surový materiál, který byl použit v dalším stupni bez dalšího čištění.

MS (M + 1)+ 504 (ix) X²,5-diMeO)nh-(R nebo S)CH(CH_zOH)-CO-Pro-Pab(2-Cl) x HOAc

Polovina surového materiálu ze stupně (viii) shora byla rozpuštěna v 25 ml methanolu nasyceného amoniakem a ponechána v klidu při pokojové teplotě pět dní. Rozpouštědlo bylo odpařeno a zbytek byl přečištěn pomocí preparativní HPLC s použitím CH3CN:O,1M NH₄OAc (30:70) jako eluentu. Vymrazovací sušení poskytlo 9 mg (7 % ) požadovaného produktu.

*H NMR (400 MHz; D²O) rotamery: δ 1,8-2,4 (m, 7H, její jeden singlet při 1,93 ppm), 3,35 (m, IH), 3,63 (m, IH), 3,7-3,9 (m, 8H, její singlety při 3,80, 3,81 a 3,86 ppm (rotamery)), 4,05 (m, IH), 4,4-4,65 (m, 3H), 6,82 (d, IH, převládající rotamer), 6,86 (d, IH, menšinový rotamer), 6,957,05 (m, IH), 7,08 (d, IH, převládající rotamer), 7,23 (d, IH, menšinový rotamer),

7,59 (d, IH), 7,63 (dd, IH, menšinový rotamer), 7,73 (dd, IH, převládající rotamer), 7,82 (d, IH, menšinový rotamer), 7,98 (d, IH, převládající rotamer) ¹³C NMR (100 MHz; D²O) karbonylové a amidinové uhlíky: δ 176,2, 174,6,

166,7

Příklad 2 (Z.S-diMeOj^h-fR nebo S)CH(CH7OH)-CO-Pro-Pab(2-Me) x HOAc (i) 3-Methyl-4-vinylbenzonitril

0,75 g (0,65 mmol) tetrakis(trifenylfosfin)_palladium(0) bylo přidáno k roztoku 5,1 g (0,026 mol) 4-brom-3-methylbenzonitrilu a 8,3 g (0,026 mol) vinyltributylcínu v 250 ml toluenu pod argonem, a reakční směs byla zahřívána pod refluxem přes noc. Tato směs byla filtrována přes vrstvu * · • · • · • « ♦ « ·· «« • « · ♦

-38-: : .* • · · • · · · · · celitu a odpařena. Zbytek byl mžikově chromatografován na silikagelu s použitím směsi heptan:EtOAc (1:1) jako eluentu. Výtěžek: 4,0 g (100%).

*H NMR (300 MHz; CDC1₃): δ 2,36 (s, 3H), 5,46 (d, 1H), 5,73 (d, 1H),

6,00 (dd, 1H), 7,4-7,5 (m, 2H), 7,52 (d, 1H) (ii) 4-Hydroxymethyl-3-methylbenzonitril

3-Methy 1-4-viny lbenzonitril (0,40 g; 2,8 mmol; ze stupně (i) shora) bylo rozpuštěno v 50 ml methanolu a ochlazeno na -70°C. Tímto roztokem byl probubláván ozone (2 ekv.) a pak bylo přidáno 0,20 g (5,3 mmol) borohydridu sodného a 5 ml vody a chladící lázeň byla odstraněna. Po 4 h byl methanol odpařen a zbytek byl rozdělen mezi 1M HCI a ether. Vodná vrstva byla extrahována dvakrát s ether a spojená organická vrstva byla promyta vodou, sušena (Na₂SO4) a odpařena na výtěžek 0,37 g (90 % ) požadovaného produktu, který byl použit v dalším stupni bez dalšího čištění.

’HNMR (400 MHz; CDC1₃): δ 2,29 (s, 3H), 3,07 (široký pás, 1H), 4,69 (s, 2H), 7,37 (s, 1H), 7,45 (d, 1H), 7,53 (d, 1H) (iii) 4-Methansulfonyloxy-3-methylbenzonitril

1,2 g (0,010 mol) methylsulfonyl chlorid byl po kapkách přidán k roztoku 1,5 g (0,010 mol) 4-hydroxymethyl-3-methylbenzonitrilu (ze stupně (ii) shora) a 1,0 g (0,010 mol) triethylaminu v 50 ml methylenchloridu při 0°C. Reakční směs byla míchána při pokojové teplotě po dobu 3 h, promyta 1M HCI, vodou, sušena (Na₂SO4) a odpařena. Výtěžek: 2,1 g (91 % ).

« ·	« ·	9	9	9 ·
• ·	9	9	9	« « «
« ·	9 ·	9	•	· « ·
« *	4	9	•	* 4 9
Φ *	99 9 4	9 · 9	< · 9	• «

*H NMR (300 MHz; CDC1₃): δ 2,41 (s, 3H), 3,03 (s, 3H), 5,28 (s, 2H),

7,4-7,6 (m, 3H) (iv) 4-Azidomethyl-3-methylbenzonitril

1,0 g (0,015 mol) azidu sodného a 10 ml vody bylo přidáno k roztoku 2,1 g (9,3 mmol) 4-methansulfonyloxy-3methylbenzonitrilu (ze stupně (iii) shora) v 20 ml DMF. Reakční směs byla míchána pro i .5 h při pokojové teplotě, nalita do 200 ml vody a extrahována třikrát etherem. Spojená organická vrstva byla promyta několikrát vodou, sušena (Na₂SO4) a odpařena. Výtěžek: 1,4 g (87%).

*H NMR (300 MHz; CDC1₃): δ 2,39 (s, 3H), 4,40 (s, 2H), 7,40 (d, ÍH), 7,45-7,55 (m, 2H) (v) 4-Aminomethyl-3-methylbenzonitril

Dílčí titulní sloučenina byla připravena podle metody popsané v příkladu l(ii) shora z 1,4 g (8,1 mmol) 4-azidomethyl-3-methylbenzonitrilu (ze stupně (iv) shora) a 2,3 g (9,0 mmol) trifenylfosfin v 18 ml ethanol a 2 ml vody. Výtěžek: 0,60 g (znečištěný trifenylfosfin oxidem; odhadnutý skutečný výtěžek: 0,36 g (28 % )).

*HNMR (300 MHz; CDC1₃): δ 2,38 (s, 3H), 3,90 (bs, 2H), 7,3-7,4 (m, 3H) překryto trifenylfosfinoxidem.

(vi) (2,5-diMeO)nh-(R a S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-Me.4-CN)

Dílčí titulní sloučenina byla připravena podle metody popsané v příkladu 1 (vii) shora z 0,37 g (1,2 mmol) (2,5-diMeO)_ph(R,5)CH(CH₂OH)-CO-Pro-OH (viz příklad 1 (vi) shora), 0,42 g 4-aminomethyl-3-methylbenzonitril (ze stupně (v) shora; odhadnutý obsah čisté látky: 0,25 g (1,7 mmol)), 0,38 g (1,2 mmol) TBTU a 0,62 g (4,8 mmol) diisopropylethylaminu v 10 ml DMF. Surový produkt byl mžikově chromatografován na silikagelu pomocí směsi EtOAc:aceton (9:1) jako eluantu. Dva diastereomery byly odděleny. Celkový výtěžek: 0,58 g znečištěný trifenylfosfinoxidem; odhadnutý skutečný výtěžek: 0,45 g (87 %). První diastereomer, který se vymýval, byl isolován jako diastereomer A.

Diastereomer A (výtěžek: 0,30 g; znečištěný trifenylfosfinoxidem; odhadnutý skutečný výtěžek: 0,20 g) ‘HNMR (600 MHz; CDCb): δ 1,7-2,1 (m, 3H), 2,3-2,35 (m, 4H, její jeden singlet při 2,32 ppm), 3,1-3,2 (m, IH), 3,65 (m, IH), 3,7-3,8 (m, 4H, její jeden singlet při 3,73 ppm), 3,80 (s, 3H), 3,98 (m, IH), 4,4-4,5 (m, 3H),

4,65 (m, IH), 6,7-b.9 (m, 3H), 7,37 (d, IH), 7,41 (s, IH), Ostatní aromatické signály byly překryty trifenylfosfinoxidem.

(vii) (2,5-diMeO)nh-(R nebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2-Me,4C(NH)OMe) (2,5-diMeO)_ph-(R nebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-NHCH₂-Ph(2Me,4-CN) (0,30 g; odhadnutý obsah čisté látky: 0,20 g (0,44 mmol); diastereomer A ze stupně (vi) shora) byl rozpuštěn v 25 ml methanolu nasyceného plynným chlorovodíkem a ponechán v klidu při pokojové teplotě přes noc. Odpaření poskytlo surový meziprodukt, který byla použit dále bez dalšího čištění. Podle TLC (EtOAc:acetone; 9:1) nebyl v tomto meziproduktu přítomen žádný výchozí materiál.

(viii) (2.5-diMeO)n_h-(R nebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)(OH)

Surový produkt ze stupně (vii) shora byl rozpuštěn 10 ml methanolu a bylo přidáno 0,14 g (2,0 mmol) hydroxylamin hydrochloridu a

- 41 • · · · • · 4

4 4

4 44 9

9 44 44

44 4 · 4 4

4 · · « · • »····· • · · · · » · · 94 4 4 4 4 9

0,40 g (4,0 mmol) triethylaminu. Tato směs byla ponechána v klidu při pokojové teplotě po dobu dvou dnů. Odpaření a mžiková chromatografie na silikagelu s CH₂Cl₂:MeOH (9:1) poskytly 0,13 g (60 %) požadované sloučeniny.

‘HNMR (600 MHz; CDC1₃): δ 1,80 (m, IH), 1,93 (m, IH), 2,08 (m, IH), 2,20 (s, 3H), 2,27 (m, 2H), 3,22 (m, IH), 3,65-3,8 (m, 5H, její jeden singlet při 3,74 ppm), 3,80 (s, 3H), 4,06 (m, IH), 4,32 (dd, IH), 4,38 (dd, IH),

4,51 (m, IH), 4,71 (m, IH), 4,93 (široký pás, 2H), 6,78 (dd, IH), 6,81 (d, IH), 6,85 (d, IH), 7,08 (d, IH), 7,16 (d, IH), 7,20 (s, IH), 7,81 (bt, 1 H) ¹³C NMR (100 MHz; CDC1₃) karbonylové a amidinové uhlíky: δ 174,7, 172,8, 154,9 (ix) (2,5-diMeO)»h-(R nebo.S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me) (2,5-diMeO)_ph-(R nebo S)CH(CH₂OH)-CO-Pro-Pab(2-Me)(OH) (65 mg; 0,13 mmol; ze stupně (viii) shora) byl rozpuštěn v 5 ml ethanolu. HOAc (8 kapek z Pasteurovy pipety) a bylo přidáno 40 mg 10 % Pd/C. Reakční směs byla hydrogenována při atmosférickém tlaku po dobu dvou dní. Reakční směs byla zfiltrována přes celit a odpařena. Zbytek byl rozpuštěn ve vodě, promyt ethylacetátem a mrazově sušen. Výtěžek: 46 mg (65 % ).

^JH NMR (500 MHz; D²O) rotamery: δ 1,8-2,1 (m, 6H, její jeden singlet při 1,92 ppm), 2,2-2,4 (m, 4H, její dva singlety při 2,24 (menšinový rotamer) a 2,38 (převládající rotamer)), 3,35 (m, IH, menšinový rotamer), 3,63,7 (m, IH), 3,75-3,85 (m, 7H, její tři singlety při 3,77, 3,79 a 3,84 ppm (rotamery)), 4,0-4,1 (m, IH), 4,4-4,5 (m, 3H), 4,8 (m, IH částečně překryto HDO pikem), 6,80 (d, IH, převládající rotamer), 6,85 (d, IH, menšinový * ·

9 9«

9 9» · · 9 9 9 9 9

9 9 9

9*9 9 »9 9 9 • 9 9999 999 9 rotamer), 6,9-7,1 (m, 2H), 7,45 (d, IH, převládající rotamer), 7,51 (d, IH, menšinový rotamer), 7,55-7,65 (m, 2H) ¹³C NMR (75 MHz; D²O) karbonylové a amidinové uhlíky: δ 175,4, 174,5 (menšinový), 174,2 (menšinový), 174,1, 167,1

Příklad 3

Titulní sloučeniny z příkladů 1 a 2 byly testovány v Testu A popsaném shora a u obou byla zjištěna hodnota IC50TT menší než 0,3 μΜ.

Použité zkratky:
aq =	vodný
Bn =	benzyl
DCC =	dicyklohexylkarbodiimid
DIPEA =	diisopropylethylamin
DMAP =	Ν,Ν-dimethyl amino pyridin
DMF =	dimethylformamid
DMSO =	dimethylsulfoxid
EDC =	l-(3-dimethylaminopropyl)-3-ethylkarbodiimid hydrochlorid
Et =	ethyl
EtOAc =	ethylacetát
EtOH =	ethanol
h =	hodin
HBTU =	[N,N,N',N'-tetramethyl-O-(benzotriazol-l-yl)uronium hexafluorfosfát]

HOAc = kyselina octová

H-Pab = 4-amidinobenzylamin

H-Pab(Z) = 4-(N-benzyloxykarbonylamidino)benzylamin

H-Pab(2-Cl) = 4-amidino-2-chlor-benzylamin

H-Pab(2-Me) = 4-amidino-2-methyl-benzylamin

HPLC = vysokoúčinná kapalinová chromatografie

Me = methyl

MeOH = methanol

Ph = fenyl

Pr = propyl i-PrOH - i-propanol

TBTU = [N,N,N',N'-tetramethyl-O-(benzotriazol-l-yl)uronium tetrafluorborát]

TEA = triethylamin

THF = tetrahydrofuran

Z = benzyloxy karbonyl

Prefixy n, s, i a t mají obvyklé významy; normální, iso, sec a terciární. Stereochemie aminokyselin je, pokud není uvedeno jinak (S).

- 44 PATENTOVÉ

Φ · · φ · • Φ · 9 9 ·

9 Φ * <9·· · • 99 · • Φ 9 Φ 9 · *♦ ·

Claims

NÁROKY » * · • · · ··

ΖΟΟΟ-^0

1. Sloučenina vzorce I,

R² R³ P

RO' X 'N^Y

O N—(CHJ— B kde

R¹ znamená H, C(O)R^U, SiR¹²R¹³R¹⁴ nebo Ci-6 alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná nebo zakončená jedním nebo více substituenty zvolenými z OR¹⁵ nebo (CH₂)qR¹⁶);

R¹², R¹³ a R¹⁴ nezávisle znamenají H, fenyl nebo Ci.ř alkyl;

R¹⁶ znamená Cj.₄ alkyl, fenyl, OH, C(O)OR¹⁷ nebo C(O)N(H)R¹⁸;

R¹⁸ znamená H, Ci.₄ alkyl nebo CH₂C(O)OR¹⁹;

R¹⁵ a R¹⁷ nezávisle znamenají H, Ci.6 alkyl nebo C7.9 alkylfenyl;

R¹¹ a R¹⁹ nezávisle znamenají H nebo Ci-₄ alkyl; a q znamená 0, 1 nebo 2;

3

R a R nezávisle znamenají H, Ci.₄ alkyl, cyklohexyl nebo fenyl;

R_x znamená strukturní fragment vzorce Ha, lib nebo líc,

- 45 « 4

4 • 4

4 • · 4· ·· • 0 0 · • 9 ·

9 4 · • 4 4

9444

Ha Hb 11c kde k, 1 a m nezávisle znamenají O, 1, 2, 3 nebo 4;

R⁴ a R⁵ nezávisle znamenají H, Si(Me)₃, 1- nebo 2-naftyl, a polycyklická uhlovodíková skupina, CHR⁴¹R⁴² nebo C1.4 alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více halogen substituenty), nebo C3-8 cykloalkyl, fenyl, methylendioxyfenyl, benzodioxanyl, benzofuranyl, dihydrobenzofuranyl, benzothiazolyl, benzoxazolyl, benzimidazolyl, kumaranonyl, kumarinyl nebo dihydrokumarinyl (přičemž posledních jmenovaných dvanáct skupin je popřípadě substituovaných jedním nebo více C1-4 alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více halogen substituenty), C1.4 alkoxy, halogen, hydroxy, kyano, nitro, SO2NH2, C(O)OH nebo N(H)R⁴³);

R⁴¹ a R⁴² nezávisle znamenají cyklohexyl nebo fenyl;

R⁶ a R⁷ nezávisle znamenají H, C1.4 alkyl, C3.8 cykloalkyl, fenyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více C1.4 alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě substituovaná jedním nebo více halogensubstituenty), C1-4 alkoxy, halogen, hydroxy, kyano, nitro, SO2NH2, C(O)OH nebo N(H)R⁴⁴) nebo společně s uhlíkovým atomem, ke kterému jsou připojeny, tvoří C3.8 cykloalkylový kruh;

R⁴³ a R⁴⁴ nezávisle znamenají H nebo C(O)R⁴⁵; a

R⁴⁵ znamená H, C1-4 alkyl nebo C1.4 alkoxy;

44

- 46 4 ·

·· Μ • 4 · <

· ♦

4 ·

4 4 «4 . 4444

4 * ·

4 • 4

Υ znamená CH₂, (CH₂)₂, CH = CH, (CH₂)₃, CH₂CH = CH nebo

CH=CHCH₂, přičemž poslední jmenované tři skupiny jsou popřípadě substituované C1-4, alkylem, methylenem, oxoskupinou nebo hydroxylem;

n znamená 0, 1 2, 3 nebo 4; a

B znamená strukturní fragment vzorce IVa, TVb, IVc nebo IVd,

NM

NM

NM

NM

IVa lVb

HN^ NH.

kde X¹, X², X³ a X⁴ nezávisle znamenají CH, N nebo N-O;

X⁵ a X⁶ nezávisle znamenají jednoduchou vazbu nebo CH₂;

jeden z X⁷, X⁸ a X⁹ znamená S, O nebo NH, a zbývající dva nezávisle znamenají -CH =, = CH-, -Ν =, = N-, -N(O) = nebo = N(O)-; R³¹ znamená, ve všech případech, jeden nebo více popřípadě přítomných substituenty zvolenými z halogen, C1-4 alkyl, C1.4 alkoxy nebo -O-(CH₂)_PC(O)N(R³²)(R³³);

znamenají 0, 1 2, 3 nebo 4; a

Q o Q-2

R^Ji a R^JJ nezávisle znamenají H, C_x.6 alkyl nebo C3-7 cykloalkyl;

♦ nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin.

- 47 99 94 • · · 9

9 9 • · · ·

9 9

9·«·

4 4

9 4

9 9 • 9 9 4

4 49
2. Sloučenina vzorce I, podle nároku 1, kde, pokud B znamená strukturní fragment vzorce IVa (ve kterých X¹, X², X³ a X⁴ všechny znamenají CH), strukturní fragment vzorce IVb nebo strukturní fragment vzorce nebo IVc, R³¹ znamená jeden nebo více substituentů zvolených ze souboru, do něhož patří halogen, C1.4 alkyl, C,-4 alkoxy nebo zbytek -O-(CH₂)_P-C(O)N(R³²)(R³³).
3. Sloučenina vzorce I, podle nároku 1 nebo nároku 2, kde B znamená strukturní fragment vzorce IVa.
4. Sloučenina vzorce I, podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde fragment má S-konfiguraci.
5. Sloučenina vzorce la,

R² R³ °

R’O Rx la

-(CH₂)„—B^! ri

- 48 9 9 99

9 9 9

9 9

9>·* 9 9 9

9999

9 ·

9 9 kde B^a znamená strukturní fragment vzorce IVe, IVf, IVg nebo IVh kde D¹ a D² nezávisle znamenají, v každém případě, H, OH, OR^a, OC(O)R^b, OC(O)OR^c, C(O)OR^d, C(O)R^e, a R^a, R^b, R^c, R^d a R^e nezávisle znamenají Ci.η alkyl (přičemž poslední jmenovaná skupina je popřípadě přerušena kyslíkem a/nebo substituovaná halogenem), fenyl, naftyl, Ci.₃ alkylfenyl (přičemž poslední jmenované tři skupiny jsou popřípadě substituované C1.4 alkyl, C1.4 alkoxy, nitro, nebo halogenem) nebo

-(C(R^f)(R^s))20C(0)C(R^b), přičemž R^f, R^g a R^b nezávisle znamenají H nebo Ci,4 alkyl, a R¹, R², R³, Rx, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶, X⁷, X⁸, X⁹ a R³¹jsou podle nároku I, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin, s podmínkou, že D¹ a D² neznamenají H.
6. Farmaceutická formulace obsahující sloučeninu podle kteréhokoliv z předcházejících nároků nebo její farmaceuticky přijatelnou sůl, ve směsi s farmaceuticky přijatelným adjuvantem, ředidlem nebo nosičem.
7. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin, pro použití jako farmaceutický prostředek.

• · • ·

9

9

9 9

9· 9999 9
8. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin, pro použití při léčení choroby, při které je žádoucí nebo požadovaná inhibice trombinu.
9. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin, pro použití při léčení trombózy.
10. Sloučenina podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin, pro použiti jako antikoagulantu.
11. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelné soli kterékoliv z takto definovaných sloučenin, jako aktivní složky při výrobě farmaceutického prostředku k léčení nemocí, při kterých je žádoucí inhibice trombinu.
12. Použití podle nároku 11, kde nemocí je trombóza.
13. Použití sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelná sůl kterékoliv z takto definovaných sloučenin, jako aktivní složky k výrobě antikoagulantu.
14. Způsob léčení nemoci, při kterém je žádoucí nebo požadována inhibice trombinu, který zahrnuje podávání terapeuticky účinného množství sloučeniny podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, nebo farmaceuticky přijatelné soli kterékoliv z takto definovaných sloučenin, osobě, která trpí takovouto chorobou nebo je k ní náchylná.
15. Způsob podle nároku 14, kde chorobou je trombóza.

«* «φ • ΦΦΦ φ φ φ φ φφφφ φφφ •Φ φφφφ φ « ♦ · · φ φ φ · φ φ φ φ φ φ φ φ φ • · φ φ φ
16. Způsob podle nároku 14, kde chorobou je hyperkoagulabilita v krvi a ve tkáních.
17. Použití sloučeniny podle nároku 5 jako prodrogy.
18. Způsob přípravy sloučeniny vzorce I, který zahrnuje:

(a) kopulaci sloučeniny vzorce V,

R² R³ P

RO Rx OH kde R¹, R², R³ a R_x jsou podle nároku 1 se sloučeninou vzorce VI,

Η—Ν Y \z ví (T^N—(CH₂)„—B kde Y, n a B jsou podle nároku 1;

(b) kopulaci sloučeniny vzorce VII, d3 O

R^Z R . /\ ^R1°' X ^N\z^Y

VII

OH φ φ φφ φ φ φ φ φ φ • φ φ φφφ φ φ φ φ φ • φ

- 5i - :

• φ · φ • φ φ φφ φφφφ φ kde R¹, R², R³, R_x a Υ jsou podle nároku 1 se sloučeninou vzorce VIII,

H₂N-(CH₂)n-B kde n a B jsou podle nároku 1; VIII (c) pro sloučeniny vzorce I ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVa, IVb nebo IVc, reakci sloučeniny vzorce IX,

R² R³ ?’

XÁ A

RO R* Ν Y

IX cA^-n—(CH₂)„—b¹ kde B¹ znamená strukturní fragment vzorce IVa¹, IVb¹ nebo IVc¹ .31

MWMW

X^^X²

MWMW .31 ^>:V

X⁶ 'N'

HhK 'OR⁷ HN^ OR^y HN^^OR⁷

IVa¹

IVb¹

IVc¹ ·· ·« » · · ·

I · · * k · · · k · · · • · · ·

- 52 kde R^y znamená C1.4 alkyl a R¹, R², R³, R_x, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶ a R³¹ jsou podle nároku 1 s plynným amoniakem;

(d) pro sloučeniny vzorce I, ve kterých B znamená strukturní fragment vzorce IVa, IVb nebo IVc, redukci sloučeniny vzorce X

R² R^{3 0} v

RO^X . /\

Ν Y \/

O^-N-(CHj)—B²

0 2 kde B znamená strukturní fragment vzorce IVa , IVb nebo IVc /VM/WW

MW/WW .31 ^χ<.Χ⁴

X⁶ 'N' unuA

HON 'NH₂ HON' 'NH₂ HON nn₂

NH,

IVa²

IVb²

IVc² a R¹, R², R³, R_x, Υ, η, X¹, X², X³, X⁴, X⁵, X⁶ a R³¹ jsou podle nároku 1; nebo (e) pro sloučeniny vzorce I kde X¹, X², X³, X⁴, X⁷, X⁸ a/nebo X⁹ znamenají

N-O, oxidací odpovídající sloučeniny vzorce I, ve kterých X¹, X², X³, X⁴,

X⁷, X⁸ a/nebo X⁹ (jak je třeba) znamenají N.