NO311083B1 - Nye cykloalkylderivater, fremgangsmåte for fremstilling derav, farmasöytiske preparater inneholdende forbindelsene samtanvendelse av forbindelsene - Google Patents

Description

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er forbindelser med formel I samt deres fysiologisk godtagbare salter og farmasøytiske preparater inneholdende slike forbindelser, deres fremstilling og anvendelse for fremstilling av legemidler, spesielt inhibitorer av benresorpsjonen ved benresorpsjonen ved osteoklaster, som inhibitorer av tumorvekst og tumormetastasering, betennelseshemmere, for behandling eller profylakse av kardiovaskulære sykdommer som arteriosklerose eller restenose, for behandling eller profylakse av nefropatier og retinopatier, som f eks. diabetisk retinopti, samt som vitronektinreseptorantagonister for behandling og profylakse av sykdommer som beror på vekselvirkningen mellom vitronektinreseptorer og deres ligander ved celle-celle- eller celle-matriksinteraksjonsprosesser. Forbindelsene med Formel I samt deres fysiologisk godtagbare salter og farmasøytiske preparater inneholdende slike forbindelser kan anvendes som legemiddel for lindring eller heling av sykdommer som i det minste delvis er betinget ved en uønsket grad av knokkelresorpsjon, angiogenese eller proliferasjon av celler i den glatte karmuskulaturen.

De menneskelige knoklene underligger en stadig dynamisk oppbyggingsprosess som omfatter knokkelresorpsjon og knokkeloppbygning. Disse prosessene styres av for dette formålet spesialiserte celletyper. Knokkeloppbygning beror på avleiringen av knokkelmatriks ved osteoblaster, knokkelresorpsjon beror på nedbrytningen av knokkelmatriks ved osteoklaster. Flertallet av knokkelsykdommene beror på en forstyrret likevekt mellom knokkeldannelse og knokkelresorpsjon. Osteoporose er karakterisert ved et tap av benmatriks. Aktiverte osteoklaster er flerkjernede celler med en diameter på inntil 400 um, som fjerner benmatriks. Aktiverte osteoklaster avleires på overflaten av benmatriksen og avsondrer proteolytiske enzymer og syrer i den såkalte "sealing zone", området mellom cellemembranen og benmatriksen. De sure omgivelsene og proteasene bevirker nedbrytningen av knokkelen.

Forbindelsene med Formel I ifølge oppfinnelsen inhiberer bensorpsjonen ved osteoklaster. Knokkelsykdommer mot hvilke forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan anvendes er fremfor alt osteoporose, hyperkalcemi, osteopeni, f.eks. fremkalt ved metastaser, tannsykdommer, hyperparatyroidisme, periartikulære erosjoner ved reumatoid artritt og Pagetsykdom.

Videre kan forbindelsene med Formel I anvendes for lindring, forebyggelse eller behandling av bensykdommer som er fremkalt ved en glukokortikoid-, steroid- eller korticosteroid-terapi eller ved en mangel på seksualhormon(er). Alle disse sykdommene er kjennetegnet ved bentap, som beror på ulikheten mellom benoppbygning og bennedbrytning.

Studier har vist at tilleiringen av osteoklaster til knoklene styres ved integrin-reseptoren på celleoverflaten av osteoklaster.

Integriner er en superfamilie av reseptorer hvortil blant annet fibrinogenreseptoren 01^3 på blodplatene og vitronektinreseptoren avP3 hører. Vitronektinreseptoren ctvP3 er et membranstående glykoprotein som uttrykkes på celleoverflaten av en rekke celler som endotelceller, celler av den glatte karmuskulaturen, osteoklaster og tumorceller. Vitronektinreseptoren avp3, som uttrykkes på osteoklastmembranen, styrer prosessen med tilleiringer på knoklene og knokkelresorpsjonen og bidrar følgelig til osteoprose.

ctvP3 bindes herved til benmatriksproteiner som osteopontin, knokkelsialoprotein og trombospontin, som inneholder tripeptidmotivet Arg-Gly-Asp (eller RGD).

Horton og medarbeidere beskriver RGD-peptider og et anti-vitronektinreseptor antistoff (23 C6) som inhiberer tannedbrytningen ved osteklaster og vandringen av osteoklaster (Horton et al., Exp. Cell. Res. 1991, 195, 368). Sato et al. beskriver i J. Cell biol. 1990, 111, 1713 Echistatin, et RGD-peptid fra slangegift, som virkningsfull inhibitor av benresorpsjonen i en vevskultur og som hemmestoffet osteoklast-tilheftingen på ben. Fischer et al. (Endocrinology, 1993, 132, 1411) kunne på rotter vise at Echistatin også in vivo hemmer benresorpsjonen.

Viktronektinreseptoren otvp3 på humane celler av den glatte karmuskulatuen av aorta stimulerer vandringen av disse cellene i neointima, hvilket endelig fører til arteriosklerose og restenose etter angioplasti (Brown et al. Cardiovascular Res. 1994, 28, 1815).

Forbindelsene med Formel I kan videre tjene som bærere for virksomme stoffer for målrettet å transportere det virksomme stoffet til virkestedet (= Drug Targeting, se f.eks. Targeted Drug Delivery, R.C. Juliano, "Handbook of Experimental Pharmacology" Vol. 100, redaktør Born, G.V.R. et al., Springer Verlag). Ved virkestoffene dreier det seg om slike som kan anvendes for behandling av de ovenfor nevnte sykdommene.

Brooks et al. (Cell 1994, 79, 1157) viste at antistoffer mot ctvP3 eller avP3-antagonister kan bevirke en krympning av tumorer, ved at de induserer apoptose av blodkarceller under angiogenesen. Chersh et al. (Science 1995, 270, 1500) beskriver anti ocvp3-antistoffer eller avpVantagonister, som inhiberer den bFGF induserte antiogeneseprosessen i rotteøyet, hvilket kan være terapeutisk nyttig ved behandling av retinopatier.

I patentsøknad WO 94/12181 beskrives substituerte aromatiske eller ikke-aromatiske ringsystemer, i WO 94/08577 beskrives substituerte heterocykler som fibrinogenreseptor-antagonister og inhibitorer av plateaggregeringen. Fra EP-A-518 586 og EP-A-528 587 er det kjent aminoalkyl- eller heterocyklyl-substituerte fenylalanin-derivater, fra WO 95/32710 er det kjent arylderivater som hemmestoffer for benresorpsjonen ved osteoklaster. WO 96/00574 beskriver benzodiazepiner, WO 96/00730 beskriver fibrogenreseptorantagonist-templater, spesielt benzodiazepiner, som er knyttet til en nitrogenbærende 5-ring, som vitronektinreseptor-antagonister.

Gjenstand for foreliggende oppfinnelse er cykloalkylderivater med Formel I

hvori:

A betyr -NH-C(O)-;

B betyr (d-C4)-alkandiyl;

D betyr -O- eller en direkte binding;

E betyr fenylen;

F betyr -CH2- eller -C(0)NHCH2-;

G betyr

Y betyr en direkte binding;

R<1> betyr H2N-C(=NH)-,

R<4> betyr R<6>OC(0)NH-;

R<5> betyr H;

R<6> betyr adamantyl-l-(Ci-C3)-alkylen, adamantyl-2-(Ci-C3)-alkylen, 1-adamantyl, 2-adamantyl,

R<9> betyr C(0)R<10>;

R<10> betyr OH;

i alle deres stereoisomere former og blandinger derav i alle forhold, og deres fysiologisk godtagbare salter.

Fysiologisk godtagbare salter av forbindelsene med Formel I er spesielt farmasøytisk anvendbare eller ikke-toksiske salter. Slike salter dannes eksempelvis av forbindelser med Formel I som inneholder sure grupper, f. eks. karboksy, med alkali- eller jordalkalimetaller, som feks. Na, K, Mg og Ca, samt med fysiologisk godtagbare organiske aminer, som feks. trietylamin, etanolamin eller tris-(2-hydroksy-etyl)-amin. Forbindelser med Formel I som inneholder basiske grupper, feks. en aminogruppe, en amidinogruppe eller en guanidinogruppe, danner salter med uorganiske syrer, som feks. saltsyre, svovelsyre eller fosforsyre og med organiske karboksyl- eller sulfonsyrer, som feks. eddiksyre, sitronsyre, benzosyre, maleinsyre, fumarsyre, vinsyre, metansulfonsyre eller p-toluensulfonsyre.

Forbindelser med Formel I ifølge oppfinnelsen kan inneholde optisk aktive karbonatomer, som uavhengig av hverandre kan ha R- eller S-konfigurasjon og dermed foreligge i form av rene enantiomerer eller rene diastereomerer eller i form av enantiomerblandinger eller diastereomerblandinger. Såvel rene enantiomerer og enantiomerblandinger som også diastereomerer og diastereomerblandinger er gjenstand for foreliggende oppfinnelse. Oppfinnelsen omfatter blandinger av to stereoisomerer av mer enn to stereoisomerer med Formel I og alle forhold mellom stereoisomerene i blandingene.

Forbindelsene med Formel I ifølge oppfinnelsen kan dessuten inneholde bevegelige hydrogenatomer, dvs. foreligge i forskjellige tautomere former. Også disse tautomerene er gjenstand for foreliggende oppfinnelse.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre en fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med Formel I som omtalt ovenfor, kjennetegnet ved at man sammenføyer to eller flere fragmenter som retrosyntetisk lar seg avlede fra Formel I.

Forbindelser med Formel I kan, som nevnt, generelt, eksempelvis i forbindelse med en konvergent syntese, fremstilles ved sammenføyning av to eller flere fragmenter, som retrosyntetisk lar seg avlede fra Formel I. Ved fremstillingen av forbindelser med Formel I kan det under syntesen være nødvendig temporært å blokkere funksjonelle grupper, som i aktuelt syntesetrinn ville kunne føre til uønskede reaksjoner eller bireaksjoner, ved en til synteseproblemet tilpasset syntesegruppestrategi, hvilket er kjent for fagmannen. Fremgangsmåten for fragmentsammenføyning er generelt anvendbar for syntesen av forbindelsen med Formel I.

For kondensasjon av to fragmenter under dannelse av en amidbinding anvender man fordelaktig de i og for seg kjente koblingsmetodene fra peptidkjemien (se feks. Houben-Weyl, "Methoden der Organischen Chemie", bind 15/1 og 15/2, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, 1974). Dermed er det som regel nødvendig å beskytte tilstedeværende, ikke reagerende aminogrupper ved hjelp av reversible beskyttelsesgrupper under kondensasjonen. Det samme gjelder for karboksylgrupper som ikke deltar i reaksjonen, som fortrinnsvis anvendes som (Ci-C6)-alkyl-, benzyl- eller tert.-butylester. En aminogruppe-beskyttelse er overflødig når aminogruppen som skal genereres fremdeles foreligger som nitro- eller cyanogrupper og først omdannes etter koblingen ved hydrering. Etter koblingen avspaltes tilstedeværende beskyttelsesgrupper på en egnet måte. Eksempelvis kan N02-grupper (guanidinobeskyttelse), benzyloksykarbonylgrupper og benzylestere avhydreres. Beskyttelsesgruppene av tert.-butyltypen avspaltes surt, mens 9-fluorenylmetyloksykarbonylresten fjernes ved hjelp av sekundære aminer.

Litteraturkjente fremstillingsfremgangsmåter er feks. beskrevet i J.March, "Advanced Organic Chemistry", 3. utgave (John Wiley & Sons, 1985).

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer videre et farmasøytisk preparat, kjennetegnet ved at det inneholder minst en forbindelse med Formel I, som omtalt ovenfor, og/eller dens fysiologisk godtagbare salter ved siden av farmasøytisk godtagbare bærer- og tilsatsstoffer.

Oppfinnelsen omfatter videre anvendelse av en forbindelse med Formel I, som omtalt ovenfor, og/eller dens fysiologisk godtagbare salter for fremstilling av legemidler.

Endelig omfatter oppfinnelsen anvendelse av en forbindelse med Formel I, som omtalt ovenfor, og/eller dens fysiologisk godtagbare salter, for fremstilling av farmasøytiske preparater som virker som inhibitorer av benresorpsjonen ved osteoklaster, som inhibitorer av tumorvekst og tumormetastasering, som betennelseshemmer, for behandling eller profylakse av radiovaskulære sykdommer, for behandling eller profylakse av nefropatier og retinopatier eller som vitronektinreseptor-antagonister for behandling og profylakse av sykdommer, som beror på vekselvirkningen mellom vitronektinreseptorer og deres ligander ved celle-celle- eller celle-matriks-interaksjonsprosesser.

Forbindelsene med Formel I og deres fysiologisk godtagbare salter kan administreres til dyr, fortrinnsvis til pattedyr, og spesielt til mennesker som legemiddel alene, i blanding med hverandre eller i form av farmasøytiske preparater som tillater en enteral eller parenteral anvendelse og som, som aktiv bestanddel, inneholder en virksom dose av minst en forbindelse med Formel I eller et salt derav, ved siden av vanlige farmasøytisk godtagbare bærer- og tilsatsstoffer. Preparatene inneholder normalt ca. 0,5 til 90 vekt-% av den terapeutiske virksomme forbindelsen.

Legemidlene kan administreres oralt, feks. i form av piller, tabletter, lakktabletter, drageer, granulater, hård- og myk gelatinkapsler, oppløsninger, siruper, emulsjoner, suspensjoner eller aerosolblandinger. Administreringen kan imidlertid også foregå rektalt, feks. i form av suppositorier, eller parenteralt, feks. i form av injeksjons- eller infusjonsoppløsninger, mikrokapsler eller staver, perkutant, feks. i form av salter eller tinkturer, eller nasalt, feks. i form av nesespray.

Fremstillingen av de farmasøytiske preparatene foregår på i og for seg kjent måte, hvorved farmasøytisk inerte uorganiske eller organiske bærestoffer anvendes. For fremstilling av piller, tabletter, drageer og hårde gelatinkapsler, kan man feks. anvende laktose, maisstivelse eller derivater derav, talk, stearinsyre eller deres salter osv. Bærestoffer for mykgelatinkapsler og suppositorier er feks. fett, vokser, halvfaste og flytende polyoler, naturlige eller herdede oljer, osv. Som bærestoffer for fremstillingen av oppløsninger og siruper egner seg feks. vann, sakkarose, invert sukker, glukose, polyoler, osv. Som bærestoffer for fremstillingen av injeksjonsoppløsninger egner seg vann, alkoholer, glycerol, polyoler, vegetabilske oljer, osv. Som bærestoffer for mikrokapsler, implantater eller staver, egner seg blandepolymerisater av glykolsyre og melkesyre.

De farmasøytiske preparatene kan ved siden av virke- og bærestoffene også inneholde tilsatsstoffer som feks. fyllstoffer, drøye-, spreng-, binde-, glide-, fukte-, stabiliserings-midler, emulgeringsmidler, konserveringsmidler, søtningsstoffer, fargestoffer, smaks- og aromatiseirngsmidler, fortyknings-, fortynningsmidler, bufferstoffer, videre oppløsningsmidler eller oppløsningsformidlere eller midler for oppnåelse av en depot-effekt, samt salter for forandring av det osmotiske trykket, overtrekksmidler eller antioksydanter. De kan også inneholde to eller flere forbindelser med Formel I eller deres farmakologisk godtagbare salter; videre ved siden av minst en forbindelse med Formel I også et eller flere andre terapeutisk virksomme stoffer.

Dosen kan varieres innenfor vide grenser og må i hvert enkelt tilfelle tilpasses de individuelle faktorene. Ved oral administrering utgjør dagsdosen generelt 0,01 til 50 mg/kg, fortrinnsvis 0,1 til 5 mg/kg, spesielt 0,3 til 0,5 mg/kg kroppsvekt for å oppnå virksomme resultater. Ved intravenøs administrering utgjør dagsdosen generelt ca. 0,01 til 100 mg/kg, fortrinnsvis 0,05 til 10 mg/kg kroppsvekt. Dagsdosen kan, spesielt ved tilførsel av større mengder, oppdeles i flere, feks. 2, 3 eller 4 del-administreringer. Eventuelt kan det, avhengig av individuelle forhold, være påkrevet å avvike fra den angitte dagsdosen, enten oppad eller nedad.

Eksempler

Produktene ble identifisert ved hjelp av massespektre og/eller NMR-spektre.

Eksempel 1

(2S)-2-(l-adamantylmetyloksykarbonylamino)-3-(4-(3-guanidinokarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre (1,5).

Syntesen foregår i henhold til følgende reaksjonssekvens:

1 a) (2 S)-2-benzyloksykarbonylamino-3 -(4-(3 -etoksykarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert. -butylester (1,1)

Det ble tilsatt 21,5 g (57,9 mmol) N-benzyloksykarbonyl-tyrosin-tert.-butylester i 280 ml aceton 8^29 ml (57,9 mmol) 4-brombutansyre-etylester og 28,21 g (86,58 mmol) cesiumkarbonat og det ble oppvarmet under omrøring til tilbakeløp. Etter 2 timer ble det igjen tilsatt 2 ml 4-brombutansyre-etylester og 2 g cesiumkarbonat, etter ytterligere 2 timer ytterligere 2 ml 4-brombutansyre-etylester og 3 g cesiumkarbonat og etter henstand ved romtemperatur over natten ble det igjen tilsatt 9 ml 4-brombutansyreetylester og blandingen ble oppvarmet ytterligere 6 timer til tilbakeløp. Etter avkjøling ble det filtrert, resten ble vasket med aceton og filtratet inndampet. Resten ble opptatt i dietyleter og den organiske fasen ble etter hverandre vasket med 3% sitronsyreoppløsning, 3 x H20 og mettet NaCl oppløsning. Eterfasen ble tørket over MgS04, tørkemiddelet ble frafiltrert og filtratet inndampet i vakuum. Resten ble kromatografert med CH2C12 og CH2Cl2/MeOH (99/1) over kiselgel. Man fikk 31,3 g av en blekgul olje, som ble anvendt uten ytterligere rensing for syntese av (1,2).

lb) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(3-guanidinokarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert.-butylester (1.2).

Det ble tilsatt til en oppløsning av 20 g (41,23 mmol) (1.1) i THF en oppløsning av 3,64 g (61,69 mmol) guanidin i 150 ml tert. butanol og det ble omrørt i 18 timer ved romtemperatur. Deretter ble det tilsatt ytterligere 4,5 g guanidin i 150 ml tert. butanol, det ble omrørt i 7 timer ved romtemperatur, reaksjonsoppløsningen ble inndampet til tilnærmet halvparten og det ble omrørt ytterligere 18 timer ved romtemperatur. Oppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum og resten ble først kromatografert med CH2Cl2MeOH/H20 (95/5/0,5) filtrert over basisk A1203 og deretter kromatografert ved hjelp av MPLC med CH2Cl2/MeOH/eddiksyre (90/10/0,5) over kiselgel. Man fikk 8,6 g (42%) av (1.2).

lc) (2S)-2-amino-3-(4-(3-guanidinokarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-hydroklorid(1.3)

Man tilsatte til 8,6 g (17,3 mmol) (1.2) 30 ml 95% trifluoreddiksyre og lot dette omrøres i 25 minutter ved romtemperatur. Reaksjonsblandingen ble innrotert og deretter inndampet to ganger med toluen. Resten ble opptatt i fortynnet eddiksyre, blandet med vann og frysetørket. Det derved oppnådde fargeløse faststoffet ble renset ved hjelp av MPLC med CH2Cl2/MeOH/eddiksyre (90/10/0,5) over kiselgel. Etter inndampning og frysetørking, fikk man 5,5 g (72%) av et fargeløst faststoff.

400 mg av dette stoffet ble oppløst i 30 ml MeOH og etter tilsats av metanolisk saltsyre ble benzyloksykarbonylbeskyttelsesgruppen spaltet hydrogenolytisk over 10% Pd/C. Det utfelte produktet ble bragt i oppløsning med tilsats av DMF, katalysatoren frafiltrert, filtratet ble inndampet og resten frysetørket. Man fikk 320 mg av (1.3) som fargeløst faststoff.

Id) (1 -adamantylmetyl)-4-nitrofenyl-karbonat (1.4)

Man tilsatte til en oppløsning av 499 mg (3 mmol) 1-hydroksymetyl-adamantan i 7 ml pyridin 605 mg (3 mmol) klormaursyre-4-nitrofenylester og lot dette omrøres over natten ved romtemperatur. Etter inndampning i høyvakuum ble resten anvendt direkte for fremstilling av (1.5).

le) (2 S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(3 -guanidinokarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre (1.5)

Man tilsatte til en oppløsning av 146 mg (0,35 mmol) (1.3) i 2 ml DMF 114,5 mg (1.4) og omrørte over natten ved romtemperatur. Det ble tilsatt 0,059 ml diisopropyletylamin og det ble på nytt omrørt over natten ved romtemperatur. Etter fjernelse av oppløsningsmiddelet i vakuum ble resten fordelt mellom eddikester og vann. Den organiske fasen ble tørket over MgS04, konsentrert og deretter blandet med diisopropyleter. Bunnfallet ble frafiltrert og renset ved hjelp av preparativ tynnsjiktkromatografi med CH2Cl2/MeOH/eddiksyre (100/25/2). Man fikk 10 mg av (1.5).

Eksempel 2

(2S)-2-((2-(l-adamantyl)-etyl)oksykarbonylamino)-3-(4-(3-guanidinokarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre (2.2)

Syntesen foregikk i henhold til følgende reaksjonssekvens:

Syntesen av (1.3) foregikk som beskrevet i Eksempel 1,1c). (2.1) ble fremstilt analogt (1.4) (Eksempel 1, ld)) fra l-(2-hydroksyetyl)adamantan og klormaursyre-4-nitrofenylester og anvendt direkte for syntese av (2.2).

(2S)-2-((2-( 1 -adamantyl)-etyl)oksykarbonylamino)-3 -(4-(3 -guanidinokarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre (2.2)

Man tilsatte til en oppløsning av 146 mg (0,35 mmol) (1.3) i 2 ml DMF 119 mg (2.1) og det ble omrørt over natten ved romtemperatur. Det ble tilsatt 2,3 mg imidazol og 0,3 ml pyridin og det ble på nytt omrørt over natten ved romtemperatur. Oppløsningen ble inndampet, resten ble fordelt mellom vann og eddikester, den organiske fasen ble tørket over MgS04 og etter filtrering ble oppløsningsmiddelet fjernet i vakuum. Resten ble oppdelt ved hjelp av preparative tynnsjiktkromatografi med CH2Cl2/MeOH/eddiksyre (100/25/2). Man fikk 19 mg av (2.2).

Eksempel 3

(2S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(2-( 1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre (g).

Syntesen foregikk i henhold til følgende reaksjonssekvens

a) 4-(2-metoksykarbonylvinyl)benzosyre

18,74 g (0,12 mol) malonsyremonometylester-kaliumsalt ble suspendert i 18 ml pyridin.

Under omrøring ble det ved romtemperatur (RT) tilsatt 15,01 g (0,1 mol) 4-karboksybenzaldehyd og 0,85 g (0,01 mol) piperidin og det ble kokt til avslutning av C02 -utviklingen (ca. 2 timer) under tilbakeløp. Det ble tilsatt ytterligere 60 ml pyridin og deretter omrørt ytterligere i 1 time ved tilbakeløp. Reaksjonsblandingen ble under omrøring blandet med 500 ml is og 110 ml kons. HC1. Etter avsluttet tilsats ble det omrørt ytterligere 20 minutter, produktet ble frasuget, vasket med vann og omkrystallisert fra is og propanol. Utbytte: 12,85 g (62%).

<!>H-NMR (200 MHz, DMSO): 5 = 3,75 (s, 3H, OCH3); 6,76 (d, J = 15 Hz, 1H, CHCOOCH3); 7,73 (d, J=15 Hz, 1H, Ar-CH); 7,84 (d, J=9 Hz, 2H, Ar-H); 7,98 (d, J=9 Hz, 2H, Ar-H); 13,11 (s, bred, 1H, COOH)

MS: Cf, m/e = 207,2 (M+H<+>, 100%)

HPLC: (RP18: Nukleosil 300-5-C18, 250 x 4 mm), Buffer A: H20, 0,1% TF A; Buffer B: Acetonitril (80% v/v); H20 (20% v/v); 0,1% TF A; Gradient: (1) 5 min., 10% Buffer B; (2) i løpet av 20 min. på 90% Buffer B; (3) 5 min. 90% Buffer B; strøm 1 ml/min; Rt= 18.05 min.

b) 4-(2-metoksykarbonyletyl)benzosyre

8 g (38,8 mmol) 4-(2-metoksykarbonylvinyl)benzosyre (Eksempel a) ble suspendert i

250 ml dioksan og hydrert i 7 timer ved RT over Pd/C (10%) med 1 bar H2. Det ble filtrert og oppløsningsmiddelet ble avdampet i vakuum. Utbytte: 8,05 g (100%). <:>H-NMR (200 MHz, DMSO): 6 = 2,67 (t, J = 8 Hz, 2H, CH,-COOMe); 2,93 (t, J = 8 Hz, 2H, Ar-CH2); 3,59 (s, 3H, OCH3); 7,35 (d, 2H, Ar-H); 7,86 (d, J=9 Hz, 2H, Ar-H); 12,80 (s, bred, 1H, COOH)

MS: Cf, m/e = 209,2 (M+H<+>, 100%)

HPLC: (RP18: Nukleosil 300-5-C18, 250 x 4 mm), Buffer A: H20, 0,1% TF A; Buffer B: Acetonitril (80% v/v); H20 (20% v/v); 0,1% TF A; Gradient: (1) 5 min., 10% Buffer B; (2) i løpet av 20 min. på 90% Buffer B; (3) 5 min. 90% Buffer B; strøm 1 ml/min; Rt= 17.03 min.

c) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(2-metoksykarbonyletyl)benzoy propionsyre-tert. -butylester

354 mg (1,7 mmol) 4-(2-metoksykarbonyletyl)benzosyre (Eksempel b) og 500 mg (1,7 mmol) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-amino-propionsyre-tert.-butylester ble oppløst i 3 ml DMF og blandet med 557 mg (1,7 mmol) 0-[(cyano-(etoksykarbonyl)metyliden)amino]-1,1,3,3 -tetrametyluroniumtetralfuorborat (TOTU) og 204 mg (1,7 mmol) diisopropyletylamin (DIPEA) og omrørt 7 timer ved RT. Oppløsningsmiddelet ble avdampet i vakuum, resten ble oppløst i eddiksyreetylester (EE) og vasket tre ganger med hver gang KHS04 og NaHC03-oppløsning til nøytral tilstand, den organiske fasen ble fraskilt, tørket og oppløsningsmiddelet ble avdestillert i vakuum, Utbytte: 770 mg (93%)

MS: ES<+>, m/e = 485,2 (M+H<+>, 100%).

d) (2 S)-2-benzyloksykarbonylamino-3 -(4-(2-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre-tert.-butylester.

1,25 g (9,2 mmol) 2-amino-l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-hydroklorid og 1,03 g (9,2 mmol) kaliumtert.-butylat ble oppløst i 3 ml absolutt DMF og omrørt 30 minutter ved RT. Deretter ble det tilsatt 740 mg (1,53 mmol) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(2-metoksykarbonyletyl)-benzoylamino)-propionsyre-tert.-butylester (Eksempel c) i 1 ml DMF og det ble omrørt i 4 timer ved RT. Det ble med iseddik innstilt på pH 4, oppløsningsmiddelet avdampet i vakuum, resten ble kromatografert over kiselgel (diklor/metan/metanol/iseddik/vann (9/1/0,1/0,1)). Utbytte: 190 mg (38%).

MS: ES<+>, m/e = 552,3 (M+H<+>, 100%).

e) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(2-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre.

190 mg (0,34 mmol) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(2-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre-tert.-butylester (Eksempel d) ble oppløst i 5 ml 95% trifluoreddiksyre og omrørt 1 time ved RT. Trifluoreddiksyren ble avdestillert i vakuum, det ble koevaporert med toluen, resten ble oppløst i iseddik, fortynnet med vann og frysetørket. Utbytte: 170 mg (100%).

MS; ES<+>, m/e - 496,3 (M+H+, 100%).

f) (2S)-2-arruno-3-(4-(2-(l,4,5,6-tetrahydropyTirm^in-2-yl-karbamoy etyl)benzoylamino)-propionsyre.

100 mg (0,2 mmol) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(2-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre (Eksempel e) ble oppløst i 15 ml dioksan, blandet med 0,012 ml iseddik og hydrert over Pd/C (5%) ved RT og 1 bar H2. Det ble tilsatt 15 ml metanol etter 2 timer og det ble hydrert ytterligere 5 timer ved RT og 1 bar H2. Det ble filtrert og oppløsningsmiddelet ble avdampet i vakuum. Utbytte: 67,4 mg (93%).

MS: ES<+>, m/e = 362,2 (M+H<+>, 30%); 173,0 (100). g) (2S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(2-( 1,4,5,6-tetrahydropyrirnidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre.

67,4 mg (0,186 mmol) (2S)-2-amino-3-(4-(2-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-etyl)benzoylamino)-propionsyre (Eksempel f) ble oppløst i 4 ml dioksan. Under omrøring ble det ved RT først tilsatt 4 ml mettet NaHC03 oppløsning, deretter 57 mg karbonsyre-(l-adamantylmetyl)ester-(2,5-diokso-pyrrolidin-l-yl)ester. Det ble omrørt i 24 timer ved RT, med iseddik innstilt på pH 4, oppløsningsmiddelet ble avdampet i vakuum og resten ble kromatografert over RP-18 (Lichrospher C-18) (20%

(v/v) acetonitril i vann, 0,1% trifluoreddiksyre, inntil 40% (v/v)acetonitril). Utbytte: 30 mg (30%).

MS: ES<+>, m/e = 554,4 (M+H<+>, 100%).

Eksempel 4

(2 S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(3 -(1,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-propyloksy)fenyl)-propionsyre.

a) (2 S)-2-amino-3 -(4-(3 -etoksykarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert. - butylester-hydroklorid (4.2)

Det ble oppløst 100 g (0,206 mol) (2S)-2-benzyloksykarbonylamino-3-(4-(3-etoksy-karbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert.-butylester (1.1) fra Eksempel 1 i 1 liter metanol, blandet med metanolisk saltsyre og med 10 g 20% palladiumhydroksyd/kull og det ble i 6 timer innført hydrogen. Deretter ble det frafiltrert fra katalysator, oppløsningen ble inndampet og resten ble blandet med tert.-butyleter. Det dannede bunnfallet ble frasuget. Man fikk 72 g (90%) av et amorft pulver.

b) (2 S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(3 -etoksykarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert. -butylester (4.3)

Man tilsatte til en oppløsning av 830 mg (5 mmol) 1-hydroksymetyl-adamantan i 10 ml tetrahydrofuran 892 mg (5,5 mmol) karbonyldiimidazol (CDI) og lot dette omrøres over natten ved RT. Deretter blandet man med 1 g (2,57 mmol) (2S)-2-amino-3-(4-(3-etoksykarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert.-butylester-hydroklorid og 442 ul (2,57 mmol) diisopropyletylamin (DIPEA) og lot dette omrøres over natten ved 50°C. Etter avkjøling ble det opptatt i etylacetat og den organiske fasen ble vasket etter hverandre med 3% sitronsyreoppløsning, natriumhydrogenkarbonatoppløsning, 3 x H20 og mettet NaCl oppløsning. Den organiske fasen ble tørket med MgS04, tørkemiddelet ble frafiltrert og filtratet inndampet. Resten ble kromatografert med CH2C12/CH30H (99/1) over kiselgel. Man fikk 1,19 g (85%) av en olje som ble anvendt uten ytterligere rensing for syntese av (4.4).

c) (2S)-2-(l-adamantylmetyloksykarbonylamino)-3-(4-(3-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-propoksy)fenyl)- propionsyre-tert. -butylester (4.4)

398 mg (2,94 mmol) 2-amino-l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-hydroklorid ble oppløst i 7 ml metanol og blandet med 330 mg (2,94 mmol) kalium-tert.-butylat. Etter 40 minutter ble det frafiltrert fra utfelte salter og filtratet ble inndampet. Resten ble oppløst i 3 ml

dimetylformamid og tilsatt til en oppløsning av 365 mg (2S)-2-(l-adamantylmetyloksykarbonylamino)-3-(4-(3-etoksykarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert.-butylester (4.3). Det ble oppvarmet i 5 timer til 40°C, oppløsningsmiddelet ble fjernet i vakuum, det ble opptatt i etylacetat og den organiske fasen ble vasket tre ganger med H20 og mettet natriumkloridoppløsning. Den organiske fasen ble inndampet og resten ble kromatografert med CH2Cl2/CH3OH/etylacetat/H20

(90:10:0,5:0,5) over kiselgel. Man fikk 100 mg av et amorft pulver, som uten ytterligere rensing ble anvendt for syntese av (4.5).

d) (2S)-2-(l-adamantylmetyloksykarbonylamino)-3-(4-(3-(l,4,5,6-tetrahydropyrimidin-2-yl-karbamoyl)-propyloksy)-propionsyre (4.5)

100 mg tert-butylesteren fra Eksempel 4.4 ble oppløst i 10 ml trifiuoreddiksyre/H20 (95:5). Etter 30 minutter ble reaksjonsoppløsningen inndampet og resten ble digerert med diisopropyleter. Etter etterfølgende frysetørking fikk man 85 mg (4.5).

Eksempel 5

(2 S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(3 -(4,5-dihydroimidazol-2-yl-karbamoyl)-propyloksy)fenyl)-propionsyre (5.2)

Fremstillingen foregikk analogt Eksempel 4.

a) (2S)-2-(l-adamantylmetyloksykarbonylamino)-3-(4-(3-(4,5-dihydroimidazol-2-yl-karbamoyl)-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert. -butylester (5.1)

436 mg (0,8 mmol) (2S)-2-(l-adamantylmetyloksykarbonylamino)-3-(4-(3-etoksykarbonyl-propyloksy)fenyl)-propionsyre-tert.-butylester ble tilsatt til en oppløsning av 388 mg (3,2 mmol) 2-amino-4,5-dihydroimidazol-hydroklorid og 359 mg (3,2 mmol) kalium-tert.-butylat i 10 ml DMF. Det fikk omrøres over natten. Etter avslutning av reaksjonen ble det opparbeidet analogt Eksempel 4c og med den samme elueringsmiddel-blandingen kromatografert over kiselgel. Man fikk 188 mg (0,32 mmol) (5.1).

b) (2 S)-2-( 1 -adamantylmetyloksykarbonylamino)-3 -(4-(3 -(4,5 -dihydroimidazol-2-yl-karbamoyl)-propyloksy)fenyl)-propionsyre (5.2)

188 mg (0,32 mmol) (5.1) ble oppløst i 10 ml trifluoreddiksyre/H20 (95:5). Etter 30 minutter ble oppløsningsmiddelet fjernet i vakuum og resten ble digerert med diisopropyleter. Etter frysetørking fikk man 168 mg av et amorft pulver av (5.2).

Farmakologiske undersøkelser

Hemmingen av benresorpsjonen ved hjelp av forbindelsen ifølge oppfinnelsen kan eksempelvis bestemmes ved hjelp av en osteoklast-Resorpsjonstest ("PIT ASSAY") eksempelvis analogt WO 95/32710.

Den inhibitoriske virkningen av forbindelsen ifølge oppfinnelsen og for vitronectinreseptoren a VP3 kan feks. bestemmes som beskrevet i det følgende.

Test for måling av inhiberingen av bindingen av 293 celler til humant vitronektin (ved forsøksresultatene forkortet med Vn/293 Celletest).

1. Rensing av humant vitronektin

Humant viktronektin isoleres fra menneskelig plasma og renses ved affinitetskromatografi ved fremgangsmåten ifølge Yatohyo et al., Cell Structure and Function, 1988, 23, 281-292.

2. Celletest

293 celler, en human embryonal nyrecellelinje, som var kotransfisert med DNA sekvenser for a v og p3 underenheter av vitronektrinreseptoren selekteres ved FACS fremgangsmåten under synspunktet en høy ekspresjonsrate (> 500000 a VP3 reseptorer/celler). De utvalgte cellene dyrkes og utsorteres på nytt ved hjelp av FACS for å oppnå en stabil cellelinje (15 D) med ekspresjonsrater > 1000000 kopier av a vp3 pr. celle.

En linbro 96 brønns vevkulturplate med flat bunn belegges med humant vitronektin (0,01 mg/ml, 0,05 ml/brønn) i fosfat-bufret koksaltoppløsning (PBS) over natten ved 4°C og blokkeres deretter med 0,5% BSA. Man fremstiller oppløsninger av forsøksstoffene på 10'<10->2 x IO'<3> mol/l i glykoseholdig DMEM medium og tilsetter i hvert tilfelle 0,05 ml/brønn av oppløsningen på platen. Cellene som uttrykker høyt nivå av a VP3 (feks. 15 D) suspenderes i glukoseholdig DMEM medium og suspensjonen innstilles på et innhold på 25000 celler/0,05 ml medium. 0,05 ml av denne cellesuspensjonen tilsettes i hver brønn og platen inkuberes ved 37°C i 90 minutter. Platen vaskes tre ganger med varmt PBS for å fjerne ikke-bundede celler. De bundede cellene glyceres i sitratbuffer (25 mmol, pH 5,0) som inneholder 0,25% "Triton X-100". Deretter tilsettes heksoseamidase-substratet p-nitrofenyl-N-acetyl-P-D-glukosaminid og platen inkuberes i 90 minutter ved 37°C. Reaksjonen stoppes med en glycin (50 mmolVEDTA (5 mmol)-buffer (pH 10,4) og absorpsjonen av hver brønn måles ved 405-650 nm. Dataene bedømmes i henhold til standardfremgangsmåter.

Det ble oppnådd følgende forsøksresultater:

Claims (7)

1. Forbindelse, karakterisert ved Formel I hvor: A betyr -NH-C(O)-; B betyr (CrC4)-alkandiyl; D betyr -O- eller en direkte binding; E betyT fenylen; F betyr -CH2- eller -C(0)NHCH2-; G betyr Y betyr en direkte binding; R<1> betyr H2N-C(=NH)-, R<4> betyr R<6>OC(0)NH-; R<5> betyr H; R<6> betyr adamantyl-l-(Ci-C3)-alkylen, adamantyl-2-(Ci-C3)-alkylen, 1-adamantyl, 2- adamantyl, R<9> betyr C(0)R<10>; R<10> betyr OH; i alle deres stereoisomere former og blandinger derav i alle forhold, og deres fysiologisk godtagbare salter.

2. Fremgangsmåte for fremstilling av en forbindelse med Formel I ifølge krav 1, karakterisert ved at man sammenføyer to eller flere fragmenter som retrosyntetisk lar seg avlede fra Formel I.

3. Forbindelse med Formel I ifølge krav 1 og/eller dens fysiologisk godtagbare salter for anvendelse som legemiddel.

4. Forbindelse med Formel I ifølge krav 1 og/eller dens fysiologisk godtagbare salter som inhibitorer av benresporpsjonen ved osteoklaster, som inhibitorer av tumorvekst og tumormetastasering, som betennelseshemmere, for behandling eller profylakse av kardiovaskulære sykdommer, for behandling eller profylakse av nefropatier og retinopatier eller som vitronektinreseptorantagonister for behandling og profylakse av sykdommer som beror på vekselvirkningen mellom vitronektinreseptorer og deres ligander ved celle-celle- eller celle-matriks-interaksjonsprosesser.

5. Farmasøytisk preparat, karakterisert ved at det inneholder minst en forbindelse med Formel I ifølge krav 1 og/eller dens fysiologisk godtagbare salter ved siden av farmasøytisk godtagbare bærer- og tilsatsstoffer.

6. Anvendelse av en forbindelse med Formel I ifølge krav 1 og/eller dens fysiologisk godtagbare salter for fremstilling av legemidler.

7. Anvendelse av en forbindelse med Formel I ifølge krav 1 og/eller dens fysiologisk godtagbare salter for fremstilling av farmasøytiske preparater som virker som inhibitorer av benresorpsjonen ved osteoklaster, som inhibitorer av tumorvekst og tumormetastasering, som betennelseshemmer, for behandling eller profylakse av radiovaskulære sykdommer, for behandling eller profylakse av nefropatier og retinopatier eller som vitronektinreseptor-antagonister for behandling og profylakse av sykdommer, som beror på vekselvirkningen mellom vitronektinreseptorer og deres ligander ved celle-celle- eller celle-matriks-interaksjonsprosesser.