NO306380B1 - Vannulöselig bioforlikelig gel - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører vannuløselig bioforlikelig gel som omfatter reaksjonsproduktet av hyaluronsyre (HA), et polyanionisk polysakkarid og et aktiveringsmiddel.

Hyaluronsyre (HA) er et naturlig forekommende mukopolysakkarid som f.eks. finnes i synovialfluid, i glasslegeme, i blodkarvegger og navlestrengen, samt i andre forbindelsesvev. Polysakkaridet består av alternerende N-acetyl-D-glukosamin- og D-glukuronsyrerester sammenføyd ved alternerende £ 1-3-glukuron og £ 1-4-glukosamin bindinger, slik at den repeterende enhet er

- (l-»4) -S-D-GlcA- (l-»3) -E-D-GlcNAc-. I vann oppløses hyaluronsyre og danner et sterkt viskøst fluid. Molekylvekten til hyaluronsyre som er isolert fra naturlige kilder, faller generelt innen området fra 5 x 10 og opp til

1 x IO<7>dalton.

Brukt her betyr betegnelsen HA hyaluronsyre og hvilke som helst av dets hyaluronatsalter, inklusive f.eks. natriumhyaluronat (natriumsaltet), kaliumhyaluronat, magnesiumhya-luronat og kalsiumhyaluronat.

HA, i sin kjemisk modifiserte ("derivatiserte") form, er nyttig som et kirurgisk hjelpemiddel, for å forhindre adhesjoner eller oppsamlinger av kroppsvev under post-operasjonsperioden. Den derivatiserte HA-gel eller -film blir injisert eller inn-lemmet på stedet mellom de vev som skal holdes separat, for å inhibere at de kleber seg gjensidig til hverandre. For å være effektiv må gelen holde seg på plass og forhindre vevkontakt i lang nok tid til at når gelen endelig blir dispergert og vevene virkelig kommer i kontakt med hverandre, vil de ikke lenger ha tendens til å feste seg til hverandre.

Kjemisk modifisert HA kan også være nyttig for legemiddel-utlevering med styrt frigivelse. Balazs et al., 1986, angir i US-patent nr. 4.582.865 at "tverrbundne geler av HA kan nedsette frigjøringen av en substans med lav molekylvekt som er dispergert deri, men ikke kovalent knyttet til den makromoleky-lære gelmatriks." R.V. Sparer et al., 1983, beskriver i kapittel 6, på sidene 107-119 i T.J. Roseman et al.,: Styrt frigjørings-utleveringssystemer, Marcel Dekker, Inc., New York, forlenget frigivelse av kloramfenikol kovalent knyttet til hyaluronsyre via esterbinding, enten direkte eller i et esterkompleks inklusive en alaninbro som intermediær forbindende gruppe.

I. Danishefsky et al., 1971, Carbohydrate Res., vol. 16,

s. 199-205, beskriver modifisering av et mukopolysakkarid ved å omdanne karboksylgruppene i mukopolysakkaridet til substituerte amider ved omsetning av mukopolysakkaridet med en aminosyreester i nærvær av l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid-hydroklorid (EDC) i vandig løsning. De omsatte glycinmetylester med et utvalg av polysakkarider, inklusive HA. De resulterende produkter er vannløselige, d.v.s. at de dispergeres hurtig i vann eller i vandig miljø, f.eks. slikt som påtreffes mellom kroppsvev.

Forslag om å gjøre HA-materialer mindre vannløselige inkluderer tverrbinding av HA. R.V. Sparer et al., 1983, beskriver i kapittel 6, sidene 107-119 i T.J. Roseman et al.,: Styrt frigjørings-utleveringssystemer, Marcel Dekker, Inc.,

New York, modifisering av HA ved å feste cysteinrester til HA via amidbindinger og deretter tverrbinde den cystein-modifiserte HA ved å danne disulfidbindinger mellom de festede cysteinrester. Den cystein-modifiserte HA var selv vannløselig og ble vann-uløselig bare etter tverrbinding ved oksydasjon til disulfidformen.

De Belder et al., PCT-publikasjon nr. WO 86/00912, beskriver en gel som er langsomt nedbrytbar, for å forhindre vev-adhesjoner etter kirurgi, fremstilt ved tverrbinding av et karboksylholdig polysakkarid med et bi- eller polyfunksjonelt epoksyd. Andre reaktive bi- eller polyfunksjonelle reagenser som er blitt foreslått for fremstilling av tverrbundne geler av HA som har redusert vannløselighet inkluderer: 1,2,3,4-diepoksy-butan i alkalisk miljø ved 50°C (T.C. Laurent et al., 1964, Acta Chem. Scand., vol. 18, s. 274); divinylsulfon i alkalisk miljø

(E.A. Balasz et al., US-patent nr. 4.582.865 (1986); og et utvalg av andre reagenser inklusive formaldehyd, dimetylolurea, dimetyloletylenurea, etylenoksyd, et polyaziridin, og et poly-isocyanat (E.A. Balasz et al., U.K.-patent nr. 84 20 560 (1984).

T. Målson et al.'", 1986, PCT-publikasjon nr. WO 86/00079, beskriver fremstilling av tverrbundne geler av HA for anvendelse som glasslegeme-substitutt ved å omsette HA med et bi- eller polyfunksjonelt tverrbindingsreagens, f.eks. et di- eller polyfunksjonelt epoksyd. T. Målson et al., 1986, EP-søknad, publ. nr. 193 510, beskriver fremstilling av en formet gjenstand ved vakuumtørking eller komprimering av en tverrbundet HA-gel.

Foreliggende oppfinnelse vedrører en vannuløselig bioforlikelig gel som er kjennetegnet ved at den er fremstilt fra en reaksjonsblanding som inneholder HA i en konsentrasjon i området mellom 0,4 og 2,6 vekt%, og et oplyanionisk polysakkarid i en konsentrasjon i området mellom 0,0 05 - 0,1M.

Foretrukne polyanioniske polysakkarider inkluderer karboksymetylcellulose (CMC), karboksymetylamylose (CMA), kondroitin-6-sulfat, dermatinsulfat, heparin og heparinsulfat; CMC og CMA er spesielt foretrukket. HA- og det polyanioniske polysakkarid kan tilsettes sammen, fulgt av tilsetning av aktiveringsmiddel, eller det polyanioniske polysakkarid kan kombineres med aktiveringsmidlet, fulgt av HA-tilsetning. En annen valgmulighet er å kombinere aktiveringsmidlet og HA, fulgt av tilsetning av det polyanioniske polysakkarid.

Den foretrukne pH-verdi for å utføre reaksjonen er 4,0-5,0. Den foretrukne konsentrasjon for polysakkaridet er 0,005 - 0,1M, mer foretrukket 0,01 - 0,02M. Molforholdet mellom polysakkarid og aktiveringsmiddel er foretrukket ca. 1:4. Det foretrukne aktiveringsmiddel er karbodiimid, f.eks. l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)-karbodiimid eller l-etyl-3-(3-dimetylaminopropyl)karbodiimidmetj odid.

Gelen kan tilveiebringes i form av et adhesjonsforhindrende materiale, f.eks. i form av en membran eller et materiale som. er egnet for inkorporering i en sprøyte. Den kan også inkludere en farmasøytisk aktiv substans som er dispergert i den. I slike tilfeller er gelen anvendelig som et medisin-utleveringssystem. Egnede substanser inkluderer vekstfaktorer, enzymer, droger, biopolymerer og biologisk forlikelige syntetiske polymerer.

Betegnelsen film som brukes her, betyr en substans dannet ved komprimering av en gel eller ved å tillate eller bevirke en gel å déhydratisere, og enhver gel i henhold til oppfinnelsen kan dannes til en slik film.

En bioforlikelig substans, slik denne betegnelse anvendes her, er én som ikke har noen medisinsk uakseptable toksiske eller skadelige effekter på biologisk funksjon.

Et polyanionisk polysakkarid er et polysakkarid som inneholder mer enn én negativt ladet gruppe, f.eks. karboksylgrupper ved pH-verdier over ca. 4,0.

Vi har oppdaget at ved å behandle HA med et egnet aktiveringsmiddel og et polyanionisk polysakkarid kan det bli laget en gel eller film som har nedsatt vannløselighet, uten anvendelse av noe separat tilsatt bi- eller polyfunksjonelt tverrbindingsreagens.

En vannløselig gel eller film, slik denne betegnelse benyttes her, er én som, dannet ved tørking av en vandig løsning av 1 vekt% (v/v) natriumhyaluronat i vann, med dimensjonene 3 cm x 3 cm x 0,3 mm, når den er anbragt i et begerglass på 50 ml med destillert vann ved 20°C og får henstå uten røring, mister sin strukturelle integritet som film etter 3 min. og blir fullstendig dispergert i løpet av 20 min. En vannuløselig film i henhold til oppfinnelsen, slik denne betegnelse og lignende betegnelser her anvendes, dannet ved anvendelse av en 1% vandig løsning av HA, modifisert i henhold til oppfinnelsen, med de samme dimensjoner og på samme måte tillatt å henstå uten røring i et begerglass med 50 ml destillert vann ved 20°C, er strukturelt intakt etter 20 min.; filmens grenser og kanter er fremdeles til stede etter 24 timer, selv om filmen er svellet.

HA sies å være aktivert, slik denne betegnelse anvendes her, når den er behandlet i en vandig blanding på en måte som gjør karboksylgruppene på HA sårbare for nukleofilt angrep eller for dannelse av en vannuløselig gel med et polyanionisk polysakkarid; og et aktiveringsmiddel er en substans som, i en vandig blanding som inkluderer HA, forårsaker at HA blir slik aktivert.

Fordi gelene og filmene er vannuløselige kan de bli grundig vasket med vann før bruk for fjerning av uomsatte substanser.

Geler i henhold til oppfinnelsen kan også fremstilles i farvet form, ved å inkludere et farvestoff i

reaksjonsblandingen. Slike farvede filmer og geler kan lettere sees når de er på plass eller under plassering, noe som gjør dem lettere å håndtere under kirurgiske prosesser enn farveløse sådanne.

De polysakkaridmodifiserte filmer og geler bevarer sin styrke endog når de er hydratisert. Fordi de fester seg til biologisk vev uten behov for suturer, er de nyttige som post-operative adhesjons-forhindrende membraner. De kan påføres på vev selv i nærvær av blødning.

Andre trekk og fordeler ved oppfinnelsen vil fremgå av den følgende beskrivelse av de foretrukne utførelsesformer av den, og av kravene.

Polyanionisk polysakkarid- modifisert HA

Polyanioniske polysakkaridmodifiserte HA-geler og filmer fremstilles generelt ved å blande HA (som beskrevet ovenfor) med et polyanionisk polysakkarid og et aktiveringsmiddel slik at det dannes et vannuløselig materiale. Utfellingsproduktet kan bli støpt til tynne membraner som er nyttige for postoperativ adhesjonsforhindring. Det kan også bli farvet som beskrevet ovenfor. For å øke styrken til filmer som støpes fra utfellingsproduktet, kan filmene bli underkastet dehydrotermal behandling hvorved de oppvarmes under vakuum (ca. 30 mm Hg) ved tilnærmet 105°C i 24 timer.

Polysakkaridet og HA kan blandes sammen, hvoretter aktiveringsmidlet tilsettes. Alternativt kan polysakkaridet bli omsatt med aktiveringsmidlet, fulgt av tilsetning av HA. En tredje valgmulighet er å kombinere HA med aktiveringsmidlet, fulgt av tilsetning av polysakkaridet. Foretrukne aktiveringsmidler er som beskrevet ovenfor og inkluderer karbodiimidene EDC og ETC. Reaksjonen blir fortrinnsvis utført ved en pH-verdi mellom 4 og 5. Den foretrukne polysakkaridkonsentrasjon varierer fra 0,005 til 0,1M, og er mer foretrukket i området 0,01-0,02M. Det foretrukne molforhold mellom polysakkarid og aktiveringsmiddel er foretrukket ca. 1:4.

Lysin- modifisert HA

Gelene i henhold til oppfinnelsen lages generelt på følgende måte. HA oppløses i vann, og pH-verdien til den resulterende vandige blanding blir justert nedover. Deretter blir den oppløste HA aktivert ved tilblanding av et egnet aktiveringsmiddel, og en passende lysinester blir blandet med den aktiverte HA og tillatt å henstå inntil den ønskede gel har dannet seg. Aktiveringsmidlet og esteren kan blandes i hvilken som helst rekkefølge.

Den foretrukne fremgangsmåte for å lage de lysin-modifiserte geler og filmer i henhold til oppfinnelsen skal nå beskrives mer i detalj.

En prøve av hyaluronsyre eller et salt av hyaluronsyre, f.eks. natriumhyaluronat, oppløses i vann for å lage en vandig blanding. HA fra hvilken som helst av en rekke kilder kan anvendes. Som velkjent kan HA ekstraheres fra animalsk vev eller innhøstes som et produkt av bakteriell fermentering. Hyaluronsyre kan produseres i kommersielle mengder ved bioprosessteknologi, som f.eks. beskrevet i PCT-publikasjon nr. WO 86/04355. Fortrinnsvis er konsentrasjonen av HA i denne første vandige blanding i området mellom 0,4 og 2,5 vekt%. Påfølgende reaksjoner er langsommere og mindre effektive ved signifikant lavere konsentrasjoner, mens signifikant høyere konsentrasjoner er vanskelige å håndtere på grunn av deres høye viskositet.

Den vandige HA-blanding bør være sur, fortrinnsvis med en pH-verdi mellom 4,0 og 5,0, mer foretrukket mellom 4,3 og 4,75. Ved lavere pH-verdier er det foretrukne aktiveringsmiddel, EDC, ustabilt, og ved høyere verdier går reaksjonshastigheten ned. Fortrinnsvis tilsettes saltsyre for å justere pH-verdien, selv om andre kjente syrer kan anvendes.

Så snart pH-verdien til den vandige HA-blanding er justert, innblandes et aktiveringsmiddel. Foretrukne aktiveringsmidler inkluderer karbodiimider, mest foretrukket EDC (i noen referanser betegnes denne substans 1-(3-dimetylaminopropyl)-3 - etyl-karbodiimid eller "DEC") eller ETC (l-etyl-3-(3-dimetyl-aminopropyl) karbodiimidmetjodid).

Deretter innblandes en nukleofil lysinester i den vandige HA-aktiveringsmiddelblanding. Foretrukne estere inkluderer metyl-, etyl- eller t-butylester. Lysinet kan være i form av dilysin, trilysin eller polylysin, eller deres hydroklorid-salter.

Lysinesteren og aktiveringsmidlet kan innblandes i den pH-justerte HA-blanding i enhver rekkefølge, alt på én gang eller gradvis.

Hvis et farvet produkt ønskes, kan en løsning av et farvestoff, f.eks. det blå farvestoff "Brilliant Blue R", også kjent som "CoomassiedBrilliant Blue R-250", som distribueres som "Serva Blue" av Serva, innblandes i reaksjonsblandingen på dette punkt. Det resulterende produkt har en blå farve som kan gi god kontrast til farven på kroppsvev, hvilket gjør filmen eller gelen lett å se mens den håndteres under kirurgi og så snart den er på plass. Så snart reagensene (og farvestoffet, om noe) er blitt innblandet, kan reaksjonsblandingen ganske enkelt bli tillatt å henstå i en tid, eller den kan bli kontinuerlig eller av og til omrørt eller agitert. Etter innblanding av reagensene stiger pH-verdien og kan opprettholdes på ønsket verdi ved tilsetning av syre etterhvert som reaksjonen skrider frem. Vi har imidlertid funnet at filmer og geler med forskjellige ønskede fysikalske egenskaper kan oppnås ved ganske enkelt å tillate pH-verdien å stige etterhvert som reaksjonen skrider frem. Måten å tilsette reagensene på, særlig EDC og lysinesteren er ikke kritisk, men forholdene mellom disse reagenser og HA er viktig. Vi har funnet at de beste resultater oppnås når forholdet HA:EDC:lysinester varierer fra 1:2:1 til 1:4:10. Lavere verdier resulterer typisk i svakere, mindre uløselige produkter, mens høyere verdier typisk resulterer i sterkere, mer uløselige produkter.

Filmdannelse

HA modifisert i henhold til de ovenfor gitte beskrivelser kan støpes som filmer på en grei måte. Typisk helles reaksjonsblandingen inn i et kar som har den ønskede størrelse og fasong og tillates å lufttørke. Generelt har filmer som er dannet ved tørking av blandinger som er hellet ut tykt, slik at de har et lavere overflateareal/volum, større styrke enn filmer som er dannet ved tørking av tynnere blandinger med høyere overflate-areal/volum.

Alternativt kan en film dannes ved å komprimere en gel under betingelser som tillater unnslippelse av vann, som f.eks. ved å komprimere gelen mellom to overflater, hvorav minst én er porøs, som beskrevet f.eks. i EP publ. 193 510.

Om ønsket kan en gel eller film vaskes før bruk ved f.eks. perfusjon med vann eller IM vandig natriumklorid. Alternativt kan reaksjonsblandingen bli dialysert for å fjerne restreagenser før støping som film. Vasking for fjerning av restreagenser eller reagens-avledet materiale, f.eks. substituerte urin-stoffer, er ønskelig hvis filmen eller gelen skal anvendes for terapeutiske formål. Geler eller filmer som er farvet blå med Brilliant Blue R som beskrevet ovenfor, taper ikke sin farve under slik vasking. Fjerning av reagenser eller reaksjons-produkter kan overvåkes ved høytrykks-væskekromatografi.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen Oppfinnelsen skal beskrives mer i detalj i de følgende eksempler. Disse eksempler gis i illustrasjonsøyemed. Oppfinnelsen er nærmere angitt i kravene.

Eksempel 1

Dette eksempel illustrerer fremstilling av CMC-modifisert

HA.

HA (0,4 vekt%, 0,01M) og CMC av Aqualon-type med molekylvekt 250.000 og en substitusjonsgrad i området 0,65-0,90 (0,19 vekt%, 0,01M) ble blandet sammen i vandig løsning ved romtemperatur. Blandingens pH-verdi ble justert til, og holdt ved, 4,7-4,8 ved tilsetning av IM HCl. Til hver 100 ml av denne løsning ble det tilsatt 0,67 g (0,04M) EDC. Under omsetning med EDC ble løsningens pH-verdi holdt på pH 4,7-4,8 ved tilsetning av 0,IM HC1 og reaksjonen tillatt å skride frem i 1 time, i hvilket tidsrom det dannet seg en utfelling. Det uomsatte EDC ble fjernet fra utfellingen ved dialyse mot surgjort vann (pH 4,0) i 24 timer med 2 dialysat-endringer ved 3 og 19 timer. HA/CMC-oppslemmingen ble så støpt inn i flate støpeformer og lufttørket i 24 timer ved romtemperatur.

HA/CMC-membraner viste seg å redusere opptreden av postoperativ adhesjonsdannelse i dyreforsøksmodeller. I forsøk hvor det ble anvendt rotte-cekal-abrasjonsmodellen, ble HA/CMC-membraner anbragt rundt kirurgisk abradert rotte-ceka; tidligere studier hadde vist at adhesjoner lett dannet seg på ceka hos rotter som var blitt abradert på styrt måte. Cekale adhesjoner i dyregrupper som fikk enten HA/CMC-membraner eller ORC-membraner (Interceed TC7-membraner markedsført av Johnson & Johnson for adhesjonsforhindring) ble sammenlignet med adhesjonskontroller hos dyr hvis ceka var abradert, men ikke fikk noen membran. Resultatene fra disse forsøk viste at HA/CMC-membranene gjennomgående reduserte adhesjonsdannelse sammenlignet med kontrolldyr og med dyr som fikk Interceed TC7-fiImen.

Eksempel 2

I dette eksempel ble det fremstilt hydrogeler under anvendelse av EDC som aktiveringsmiddel og leucinmetylesterhydroklorid som nukleofil.

Natriumhyaluronat (400 mg, 1,0 mmol av karboksylgrupper) med molekylvekt mellom 1 x IO6 og 2 x IO<6>ble oppløst i 10 ml destillert vann. pH-verdien for den vandige løsning ble justert til 4,75 ved tilsetning av 0,IN HC1. Deretter ble 314 mg EDC (1,64 mmol) tilsatt, alt på én gang, fulgt av 190 mg (1,64 mmol) L-leucinmetylesterhydroklorid. pH-verdien til reaksjonsblandingen steg da til 6,2 i løpet av 2 timer. Reaksjonsblandingen ble holdt ved romtemperatur i 5 timer, hvoretter den hadde dannet en tykk, uløselig hydrogel. Denne hydrogel kunne vaskes med en IM NaCl-løsning for fjerning av restreagenser uten tap av sine fysikalske egenskaper.

Eksempel 3

I dette eksempel ble forskjellige EDC/leucin:HA-forhold anvendt for sammenligning av geldannelse og egenskaper.

Fremgangsmåten var som i eks. 1, ved anvendelse av natriumhyaluronat (400 mg, 1,0 mmol karboksylgrupper) i 15 ml vann. I separate forsøk ble de følgende mengder av EDC og leucinmetylesterhydroklorid deretter tilsatt: 153 mg EDC

(0,8 mmol)/l82 mg leucinmetylesterhydroklorid (1,0 mmol);

76 mg EDC (0,4 mmol)/90 mg leucinmetylesterhydroklorid

(0,5 mmol); og 38 mg EDC (0,2 mmol)/45 mg

leucinmetylesterhydroklorid (0,25 mmol). Sterke hydrogeler ble oppnådd som i eks. 1 for det høyeste forhold mellom EDC og leucinmetylesterhydroklorid. Ved det laveste forhold mellom reaktanter

(0,2 mmol/0,25 mmol til 1,0 mmol HA-karboksylgrupper) ble det oppnådd en svak gel som klappet sammen til et fluid etter 2 uker.

Eksempel 4

I dette eksempel ble HA-konsentrasjonen redusert med 1/2 for sammenligning av resulterende gelegenskaper.

Fremgangsmåten var som i eks. 1 med unntagelse av at HA (400 mg, 1,0 mmol karboksylgrupper) ble oppløst i 30 ml vann fremfor 15 ml (1-1/3% vekt/vekt HA). Det dannet seg en hydrogel, selv om den var svakere enn den som ble oppnådd i eks. 1.

Eksempel 5

I dette eksempel ble det fremstilt filmer ved anvendelse av EDC som aktiveringsmiddel og leucinmetylesterhydroklorid som nukleofil.

Natriumhyaluronat (400 mg, 1,0 mmol karboksylgrupper) ble oppløst i 40 ml destillert vann. pH-verdien til løsningen ble justert til 4,75 ved tilsetning av 0,1N HC1. Deretter ble EDC

(314 mg, 1,64 mmol) tilsatt i én porsjon, fulgt av 190 mg (1,05 mmol) L-leucinmetylesterhydroklorid. pH-verdien til reaksjonsblandingen steg til 6,2 i løpet av 2 timer, hvoretter løsningen ble hellet ned i en petriskål med areal 6360 mm og tillatt å

tørke til en film i løpet av 2 dager. Filmer produsert på denne måte var sterke og uløselige i vann og IM vandig NaCl. Filmene kunne vaskes med vann eller vandig NaCl som i eks. 1 for fjerning av restreagenser uten tap av sine fysikalske egenskaper. Infrarødspektroskopisk analyse av slike filmer viste ingen karbodiimidabsorpsjon ved ca. 213 0 cm 1 og viste absorpsjoner ved ca. 1740 cm"1, 1700 cm<-1>, 1650 cm-1 og 1550 cm<-1.>

Eksempel 6

I dette eksempel ble det anvendt forskjellige HA-konsentrasjoner ved fremstilling av filmer for sammenligning av resulterende filmegenskaper.

Fremgangsmåten fra eks. 4 ble gjentatt, ved anvendelse av tre forskjellige start HA-konsentrasjoner laget ved å oppløse HA (400 mg, 1,0 mmol karboksylgrupper) i 30 ml, 40 ml eller 100 ml destillert vann. Filmer som ble produsert ved anvendelse av hver av disse startkonsentrasjoner av HA var sterke og uløselige i vann og IM vandig NaCl, hvilket viste at et område av konsentrasjoner av HA kan anvendes. Hver av disse filmer kunne vaskes med vann eller vandig NaCl uten tap av de fysikalske egenskaper.

Eksempel 7

Dette eksempel illustrerer effekten av å dialysere reaksjonsblandingen før støping for å danne en film, sammenlignet med vasking av filmen etter at den er formet.

Natriumhyaluronat (400 mg i 40 ml vann), EDC (314 mg, 1,64 mmol) og L-leucinmetylesterhydroklorid (190 mg, 1,05 mmol) ble tillatt å reagere som i eks. 4. Etter at reaksjonen var ferdig (2 timer) ble reaksjonsblandingen dialysert mot vann, gjennom dialyserør med 12.000 NMW-molekylvektsperre for å fjerne restreagenser. Den dialyserte blanding ble så støpt som en film som i eks. 4. Den således oppnådde film var sterk og uløselig i vann eller IM vandig NaCl.

Eksempel 8

I dette eksempel ble det dannet filmer ved tørking av mer tykthellede reaksjonsblandinger, for å sammenligne egenskapene ved filmer produsert av tørkende blandinger ved varierende overflatearal/volum.

En reaksjonsblanding oppnådd som i eks. 4 (40 ml reaksjons-volum) ble støpt inn i en liten petriskål (areal 3330 mm ). Den således oppnådde film var uløselig i IM vandig NaCl og i vann (100°C; 1 time).

Eksempel 9

I dette eksempel ble det laget filmer ved anvendelse av andre aminosyreestere og HA aktivert med EDC.

En løsning av HA (400 mg i 40 ml H20) ble bragt til pH 4,7 med 0,1N HCl. Så ble EDC (314 mg, 1,6 mmol) tilsatt, alt på én gang, fulgt av 1 mmol av aminosyrederivatet. Reaksjonsblandingen ble hellet ned i en petriskål og fikk tørke. Uløselige filmer ble oppnådd av L-valinmetylesterhydroklorid, L-isoleucinmetylesterhydroklorid, L-prolinmetylesterhydroklorid og L-fenylalaninmetylesterhydroklorid.

Eksempel 10

I dette eksempel ble det laget filmer ved anvendelse av et enkelt primært amin (anilin) som nukleofil.

En løsning av HA (400 mg i 40 ml H20) ble bragt til pH 4,7 med 0,1N HCl. Så ble EDC (314 mg, 1,6 mmol) tilsatt, alt på én gang, fulgt av 1 mmol anilin. Reaksjonsblandingen ble hellet ned i en petriskål og fikk tørke, og det ble oppnådd uløselige filmer.

Eksempel 11

I dette eksempel ble det fremstilt filmer ved anvendelse av andre estere av leucin.

En løsning av HA (400 mg i 40 ml H20) ble bragt til pH 4,7 med 0,1N HCl. Så ble EDC (314 mg, 1,6 mmol) tilsatt, alt på én gang, fulgt av 1 mmol av leucinesteren. Reaksjonsblandingen ble hellet ned i en petriskål og fikk tørke. Det ble oppnådd uløselige filmer av både L-leucinetylester-hydroklorid og L-leucin-t-butylester-hydroklorid.

Eksempel 12

I dette eksempel ble det fremstilt geler ved anvendelse av andre aminosyremetylestere.

En løsning av HA (400 mg i 15 ml H20) ble bragt til pH 4,7, og EDC (314 mg, 1,6 mmol) ble tilsatt, fulgt av aminosyrederivatet (1 mmol). Reaksjonsblandingen dannet en tykk gel i løpet av fra 5 til 24 timer. Vannuløselige geler ble oppnådd med L-valinmetylesterhydroklorid, L-isoleucinmetylesterhydroklorid, L-argininmetylesterhydroklorid, L-prolinmetylesterhydroklorid og L-histidinmetylesterhydro-klorid.

Eksempel 13

I dette eksempel ble det fremstilt filmer under anvendelse av et aminosyreamid (leucinamid) som nukleofil.

En løsning av HA (400 mg i 40 ml H20) ble bragt til pH 4,7 med 0,1N HCl. Så ble EDC (314 mg, 1,6 mmol) tilsatt, alt på én gang, fulgt av 1 mmol av L-leucinamidhydroklorid. Reaksjonsblandingen ble hellet ned i en petriskål og tillatt å tørke, og uløselige filmer ble oppnådd.

Eksempel 14

I dette eksempel ble det fremstilt geler ved hjelp av leucinetylesterhydroklorid.

En løsning av HA (400 mg i 15 ml H20) ble bragt til pH 4,7 og EDC (314 mg, 1,6 mmol) ble tilsatt, fulgt av leucinetylester-hydroklorid (1,0 mmol). Blandingen dannet en tykk, vannuløselig gel i løpet av fra 5 til 24 timer.

Eksempel 15

I dette eksempel ble det fremstilt filmer og geler ved anvendelse av ETC som HA-aktiveringsmiddel.

Natriumhyaluronat (400 mg, 1,0 mmol karboksylgrupper) med molekylvekt i området mellom 1 x IO<6>og 2 x IO<6>dalton ble oppløst i vann (10 ml og 3 0 ml). pH-verdien til hver vandige løsning ble justert til 4,75 ved tilsetning av 0,1N HCl. Deretter ble 475 mg ETC (1,6 mmol) tilsatt, alt på én gang, fulgt av 190 mg (1,05 mmol) L-leucinmetylesterhydroklorid. pH-verdien til denne reaksjonsblanding steg til 6,2 i løpet av de neste 2 timer. Reaksjonsblandingen som inneholdt 10 ml vann dannet en uløselig gel. Reaksjonsblandingen som inneholdt 3 0 ml vann ga en uløselig film etter tørking.

Eksempel 16

Dette eksempel illustrerer fremstilling av en farvet film. En løsning av HA (400 mg i 30 ml H20) ble bragt til pH 4,75 som i eks. 13 og så ble ETC (475 mg, 1,6 mmol) og leucinmetylesterhydroklorid (190 mg, 1,05 mmol) tilsatt. En fortynnet løsning av "Serva Blue" (5 mg/ml) farvestoff i H20 (0,5 ml) ble deretter satt til reaksjonsblandingen. Den resulterende blanding ble hellet ned i en petriskål, og en vannuløselig blå film ble oppnådd etter 16 timer. Blåfarven ble beholdt av filmen da filmen ble vasket med IM NaCl og deretter med H20.

Eksempel 17

Dette eksempel illustrerer vevsbiokompatibilitet av en film av kjemisk modifisert HA.

Fire strimler av filmer fremstilt ved den fremgangsmåte som er beskrevet i eks. 4, og to USP-negative kontrollstrimler ble implantert kirurgisk i den paravertebrale muskel hos White New Zealand-kaniner (to pr. test). Teststedene ble vurdert enten makroskopisk etter 72 timer eller med fullstendig histopatologi etter 7 dager. I overensstemmelse med USP XXI, s. 1237, tilfredsstilte testmaterialet kravene til (USP implantasjonstest for vurdering av plastmaterialer).

Eksempel 18

Dette eksempel illustrerer fremstilling av lysin-modifisert

HA.

En 0,4 vekt% løsning av HA i vann ble laget. pH-verdien til denne løsning ble justert til mellom 4,3 og 4,75 ved tilsetning av syre. Til hver 100 ml av denne løsning ble det tilsatt 0,76 g EDC under røring inntil EDC var oppløst full-stendig. Til hver 100 ml av HA/EDC-løsningen ble det tilsatt 0,20 g lysin- metylester (LME) under røring inntil LME var full-stendig oppløst. Tilsetningen av HA, EDC og LME ble utført ved romtemperatur; så snart den endelige HA/EDC/LME-løsning var blitt dannet, ble den lagret ved 4°C inntil det var bruk for den.

Det LME-modifiserte HA-materiale kan forarbeides til forskjellige fasonger, størrelser og konsistenser avhengig av det endelige bruksområde. Hvis et tynt ark av materialet er ønsket, kan blandingen bli hellet ned på en flat overflate. Dette materiale kan så bli omgjort til et fast stoff ved å tillate vannet å fordampe under omgivende eller forhøyede temperaturer. En alternativ fremgangsmåte for å produsere ark av materialet er å underkaste det frysetørking. Porestørrelsen til sluttproduktet kan reguleres ved å justere den innledende frysetemperatur. Kurvede overflater og andre fasonger kan produseres på lignende måte ved innledningsvis å støpe gelen på en negativ bildeoverflate og deretter forarbeide den som beskrevet. Det tørkede ark kan forarbeides videre, om ønsket, ved å presse det til en bestemt tykkelse i en Carver-laboratoriepresse. Dette er spesielt nyttig for formål som krever å anbringe en tynn film mellom anatomiske strukturer hvor plassen er begrenset.

Mekanisk testing av det frysetørkede materiale, rehydra-tisert i normal saltløsning, resulterte i kraft til brudd-verdier på 170 - 900 g/cm 2. Forlengelse til brudd-verdier for dette materiale var mellom 33 og 62%.

Anvendelse

Geler i henhold til oppfinnelsen kan anvendes som et kirurgisk hjelpemiddel, for å forhindre adhesjoner eller sammenvoksninger av kroppsvev under en postoperativ- eller helingsperiode, idet følgende metoder er kjent på det kirurgiske fagområde, som f.eks. beskrevet i DeBelder et al., PCT-publ. nr. WO 8,6/00912. Under kirurgi blir ett eller flere stykker av gelen eller filmen, etter hva som er aktuelt, innfelt eller injisert mellom eller blant de vev som skal holdes separat. Filmer eller geler i henhold til oppfinnelsen kan også anvendes for forsinket utlevering av droger. Drogen kan utleveres kovalent bundet til gelen eller filmen, som f.eks. beskrevet i R.V. Sparer et al., 1983, kap. 6, s. 107-119, i T.J. Roseman et al., Controlled Release Delivery Systems, Marcel Dekker, Inc., New York; og gelen eller filmen kan deretter bli implantert eller injisert på det sted hvor utlevering ønskes.

Claims (7)

1. Vannuløselig bioforlikelig gel som omfatter reaksjonsproduktet av hyaluronsyre (HA), et polyanionisk polysakkarid og et aktiverings-middel,karakterisert vedat gelen er fremstilt fra en reaksjonsblanding som inneholder HA i en konsentrasjon i området mellom 0,4 og 2,6 vekt%, og et polyanionisk polysakkarid i en konsentrasjon i området mellom 0,005 - 0,1M.

2. Gel som angitt i krav 1,karakterisert vedat det polyanioniske polysakkarid er valgt fra gruppen som består av karboksymetylcellulose, karboksymetylamylose, kondroitin-6-sulfat, dermatinsulfat, heparin og heparinsulfat, fortrinnsvis karboksymetylcellulose eller karboksymetylamylose.

3. Gel som angitt i krav 1,karakterisert vedat det aktiverende middel omfatter et karbodiimid, fortrinnsvis l-etyl-3-(3-dimetylamino-propyl)karbodiimid eller l-etyl-3-(3-di-metylaminopropyl)karbodiimidmetj odid.

4. Gel som angitt i krav 1,karakterisert vedat polyanionisk polysakkarid er til stede i en konsentrasjon av 0,01 - 0,02M.

5. Gel som angitt i krav 1,karakterisert vedat molforholdet mellom det polyanioniske polysakkarid og aktiveringsmidlet er minst 1:4.

6. Gel ifølge kravene 1-5,karakterisert vedat gelen er laget i form av en adhesjons-forhindrende blanding.

7. Gel ifølge kravene 1-6,karakterisert vedat blandingen er laget i form av en membran.