NO20092448L - IL-17A/F-heterologe polypeptider og terapeutiske anvendelser derav - Google Patents

IL-17A/F-heterologe polypeptider og terapeutiske anvendelser derav

Info

Publication number
NO20092448L
NO20092448L NO20092448A NO20092448A NO20092448L NO 20092448 L NO20092448 L NO 20092448L NO 20092448 A NO20092448 A NO 20092448A NO 20092448 A NO20092448 A NO 20092448A NO 20092448 L NO20092448 L NO 20092448L
Authority
NO
Norway
Prior art keywords
disease
seq
antibody
polypeptide
immune
Prior art date
Application number
NO20092448A
Other languages
English (en)
Inventor
Yan Wu
Mercedesz Balazs
Sarah Hymowitz
David P Arnott
Nico Ghilardi
Austin L Gurney
Philip E Hass
James M Lee
Wenjun Ouyang
Melissa A Starovasnik
Original Assignee
Genentech Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=39468626&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=NO20092448(L) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Application filed by Genentech Inc filed Critical Genentech Inc
Publication of NO20092448L publication Critical patent/NO20092448L/no

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/24—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against cytokines, lymphokines or interferons
    • C07K16/244—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/19—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • A61K38/20—Interleukins [IL]
    • A61K38/2073—IL-11
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/04—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for ulcers, gastritis or reflux esophagitis, e.g. antacids, inhibitors of acid secretion, mucosal protectants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
    • A61P1/16—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for liver or gallbladder disorders, e.g. hepatoprotective agents, cholagogues, litholytics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/02—Nasal agents, e.g. decongestants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A61P11/06—Antiasthmatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/04—Antipruritics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/06—Antipsoriatics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
    • A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P21/00—Drugs for disorders of the muscular or neuromuscular system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/12—Antivirals
    • A61P31/14—Antivirals for RNA viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/08—Antiallergic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
    • A61P5/14—Drugs for disorders of the endocrine system of the thyroid hormones, e.g. T3, T4
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/02—Antithrombotic agents; Anticoagulants; Platelet aggregation inhibitors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/06—Antianaemics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
    • C07K14/54—Interleukins [IL]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/31—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency multispecific
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/30—Non-immunoglobulin-derived peptide or protein having an immunoglobulin constant or Fc region, or a fragment thereof, attached thereto
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2500/00—Screening for compounds of potential therapeutic value
    • G01N2500/10—Screening for compounds of potential therapeutic value involving cells
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Abstract

Foreliggende oppfinnelse er rettet mot et nytt, naturlig forekommende humant cytokin som består av en heterodimer av interleukin 17 og interleukin 17F, heri betegnet interleukin 17A/F (IL-17A/F). Videre tilveiebringes heri vektorer og vertsceller som omfatter disse nukleinsyresekvensene, kimæriske polypeptidmolekyler som omfatter polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse fusjonert til heterologe polypeptidsekvenser, spesifikke antistoffer som bindes til polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse og fremgangsmåter for fremstilling av polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse. Videre tilveiebringes heri fremgangsmåter for behandling av degenerative bruskforstyrrelser og andre betennelsessykdommer.

Description

IL-17A/F heterologe polypeptidcr og terapeutiske anvendelser derav
Oppfinnelsens område
Foreliggende oppfinnelse gjelder generelt påvisning og isolering av et nytt humant cytokin som heri betegnes interleukin-17A/F (IL-17A/F).
Oppfinnelsens bakgrunn
Ekstracellulære proteiner spiller viktige roller i blant annet dannelse, differensering og opprettholdelse av multicellulære organismer. Mange enkeltcellers skjebner, for eksempel proliferasjon, migrering, differensiering eller interaksjon med andre celler, styres typisk av informasjon som mottas fra andre celler og/eller nærmiljøet. Denne informasjonen overføres ofte ved hjelp av utskilte polypeptider (for eksempel mitogene faktorer, overlevelsesfaktorer, cytotoksiske faktorer, differensieringsfaktorer, neuropeptider og hormoner), som i sin tur mottas og tolkes av forskjellige cellereseptorer eller membranbundne proteiner. Disse utskilte polypeptidene eller signalmolekylene passerer normalt gjennom cellenes sekretoriske reaksjonsvei for å nå sitt virkesete i det ekstracellulære miljø.
Utskilte proteiner har forskjellige industrielle anvendelser, innbefattet som farmasøytiske midler, diagnostiske midler, biosensorer og bioreaktorer. De fleste proteinmedikamenter som er tilgjengelige i dag, for eksempel trombolytiske midler, interferoner, interleukiner, erytropoetiner, kolonistimulerende faktorer og forskjellige andre cytokiner, er sekretoriske proteiner. Deres reseptorer, som er membranproteiner, har også potensial som terapeutiske eller diagnostiske midler.
Membranbundne proteiner og reseptorer kan spille viktige roller i blant annet dannelsen, differensieringen og opprettholdelsen av multicellulære organismer. Mange enkeltcellers skjebne, for eksempel proliferasjon, migrering, differensiering eller interaksjon med andre celler, styres typisk av informasjon som mottas fra andre celler og/eller nærmiljøet. Denne informasjonen overføres ofte av utskilte polypeptider (for eksempel mitogene faktorer, overlevelsesfaktorer, cytotoksiske faktorer, differensieringsfaktorer, neuropeptider og hormoner), som i sin tur mottas og tolkes av forskjellige cellereseptorer eller membranbundne proteiner. Slike membranbundne proteiner og cellereseptorer omfatter, men er ikke begrenset til, cytokinreseptorer, reseptor-kinaser, reseptor-fosfataser, reseptorer som deltar i celle-celle interaksjoner og cellulære adhesinmolekyler, for eksempel selektiner og integriner. For eksempel reguleres overføring av signaler som regulerer cellevekst og celledifferensering delvis ved fosforylering av forskjellige cellulære proteiner. Protein-tyrosinkinaser, enzymer som katalyserer denne prosessen, kan også virke som vekstfaktorreseptorer. Eksempler omfatter fibroblast vekstfaktorreseptor og nervevekstfaktorreseptor.
I likhet med utskilte proteiner, har membranbundne proteiner og reseptormolekyler forskjellige industrielle anvendelser, innbefatter som farmasøytiske og diagnostiske midler. For eksempel kan reseptor-immunadhesiner benyttes som terapeutiske midler for blokkering av reseptor-ligand interaksjoner. De membranbundne proteinene kan også benyttes for søk etter mulige peptidinhibitorer eller lav-molekylære inhibitorer av den relevante reseptor/ligandinteraksjon.
Både industrien og universitetene prøver å påvise nye, native utskilte proteiner og native reseptorproteiner, eller membranbundne proteiner. Mange anstrengelser er fokusert på gjennomsøking av rekombinante DNA-biblioteker fra pattedyr for påvisning av de kodede sekvensene for nye, utskilte proteiner. Eksempler på gjennomsøkings-fremgangsmåter og -teknikker er beskrevet i litteraturen (se for eksempel Klein et al., Proe. Nati. Acad. Sei., 93:7108-7113 (1996), US patentskrift nr. 5 536 637)).
I denne sammenheng gjelder foreliggende oppfinnelse påvisning av nye, utskilte polypeptider fra interleukin-17 (IL-17)-familien, som har blitt vist å være forbundet med immunformidlet sykdom og betennelsessykdom. Immunrelaterte sykdommer og betennelsessykdommer er manifestasjoner eller følger av temmelig komplekse, ofte flere sammenkoblede, biologiske reaksjonsveier som i den normale fysiologi er avgjørende for responsen på angrep eller skader, for utløsning av reparasjon etter angrep eller skader, og for å igangsette det iboende eller ervervede forsvarssystem mot fremmede organismer. Sykdom eller patologiske tilstander opptrer dersom disse normale fysiologiske reaksjonsveiene fører til ytterligere angrep eller skade, enten direkte som en følge av responsens intensitet, som en følge av unormal regulering eller overdreven stimulering, som en reaksjon mot "selv" eller som en kombinasjon av disse.'
Selv om utløsningen av disse sykdommene ofte omfatter flertrinns-reaksjonsveier og ofte flere forskjellige biologiske systemer/reaksjonsveier, kan en intervensjon på kritiske punkter i en eller flere av disse reaksjonsveiene ha en lindrende eller terapeutisk virkning. Terapeutisk intervensjon kan opptre enten ved antagomisme av en skadelig prosess/reaksjonsvei, eller ved stimulering av en gunstig prosess/reaksj onsvei.
Mange immunrelaterte sykdommer er kjente og har blitt omfattende undersøkt. Slike sykdommer omfatter immunformidlede betennelsessykdommer (for eksempel reumatoid artritt, immunmediert nyresykdom, lever-gallesykdommer, inflammatorisk tarmsykdom (IBD), psoriasis og astma), ikke-immunmedierte betennelsessykdommer, infeksjonssykdommer, immunsviktsykdommer, neoplasi osv.
T-lymfocyttene (T-cellene) utgjør en viktig bestanddel av en immunrespons i pattedyr. T-cellene gjenkjenner antigener som er assosiert med et cellemolekyl som kodes av gener i vevstypekomplekset (MHC). Antigenet kan fremvises sammen med
MHC-molekyler på overflaten av antigenpresenterende celler, virusinfiserte celler,
kreftceller, transplantater osv. T-cellesystemet fjernes disse endrede cellene, som utgjør en helsetrussel for vertspattedyret. T-cellene omfatter hjelper-T-celler og cytotoksiske T-celler. Hjelper-T-cellene prolifererer i omfattende grad etter gjenkjenning av et antigen-MHC-kompleks på en antigenpresenterende celle. Hjelper-T-cellene utskiller også en rekke forskjellige cytokiner, dvs. lymfokiner, som spiller en sentral rolle i aktiveringen av B-celler, cytotoksiske T-celler og en rekke andre celler som deltar i immunresponsen.
En sentral begivenhet i både humorale og celleformidlede immunresponser er aktiveringen og den klonale ekspansjon av hjelper-T-celler. Hjelper-T-celleaktiveringen utløses ved interaksjonen mellom T-cellereseptoren (TCR)-CD3-komplekset og et antigen-MHC-kompleks på overflaten av en antigenpresenterende celle. Denne interaksjonen utløser en kaskade av biokjemiske begivenheter som induserer den hvilende hjelper-T-cellen til å gå inn i cellesyklus (GO til Gl-transisjonen) og fører til ekspresjon av en høyaffinitetsreseptor for IL-2, og noen ganger IL-4. Den aktiverte T-cellen går gjennom cellesyklus, prolifererer og differensieres til hukommelsessceller eller effektorceller.
I tillegg til signalene som formidles via TCR, omfatter aktivering av T-celler en ytterligere ko-stimulering som induseres av cytokiner som frigjøres fra den antigenpresenterende cellen, eller via interaksjoner med membranbundne proteiner på den antigenpresenterende celle og T-cellen. Cytokinene IL-1 og IL-6 har blitt vist å tilveiebringe et ko-stimulerende signal. Videre fører interaksjonen mellom B7-molekylet, som uttrykkes på overflaten av en antigenpresenterende celle og CD28- og CTLA-4-molekyler som uttrykkes på T-celleoverflaten til T-celleaktivering. Aktiverte T-celler uttrykker et forhøyet antall av cellulære adhesjonsmolekyler, for eksempel ICAM-1, integriner, VLA-4, LFA-1, CD56 osv. • T-celleproliferasjon i en blandet lymfocyttkultur eller en blandet lymfocyttreaksjon (MLR) er en godt etablert indikasjon på en forbindelses evne til å stimulere immunsystemet. I mange immunresponser infiltrerer inflammatoriske celler skade- eller infeksjonssetet. De migrerende cellene kan være neutrofile, eosinofile, monocytiske eller lymfocytiske, noe som kan fastslås ved en histologisk undersøkelse av de rammede vev. Current Protocols in Immunology, red. John E. Coligan, 1994, John Wiley & Sons, Inc.
Immunrelaterte sykdommer kan behandles ved å undertrykke immunresponsen. Anvendelse av neutraliserende antistoffer som inhiberer molekyler med immunstimulerende aktivitet vil være gunstig ved behandling av immun-medierte sykdommer og betennelsessykdommer. Molekyler som inhiberer immunresponsen kan benyttes (proteiner direkte eller via anvendelse av antistoff agonister) for inhibering av immunresponsen, og følgelig for lindring av immunrelatert sykdom.
Interleukin-17 (IL-17) er et T-celleavledet pro-inflammatorisk molekyl som stimulerer epitelceller, endotelceller og fibroblaster til å danne andre inflammatoriske cytokiner og kjemokiner, innbefattet IL-6, IL-8, G-CSF og MCP-1 (se Yao, Z. et al, J. Immunol.. 122( 12^:5483-5486 (1995); Yao, Z. et al, Immunitv. 3£6):811-821 (1995); Fossiez, F., et al., J. Exp. Med., 183(6): 2593-2603 (1996); Kennedy, J., et al., I Interferon Cvtokine Res.. 16(8):611-7 (1996); Cai, X. Y., et al.. Immunol. Lett, 62(0:51-8 (1998); Jovanovic, D.V., et al., J. Immunol.. 160(7^:3513-21 (1998); Laan, M, et al., J. Immunol.. 162(4):2347-52 (1999); Linden, A., et al., Eur Respir J. J5(5):973-7 (2000); og Aggarwal, S. og Gurney, A.L., J Leukoc Biol. 7_i(l):l-8 (2002)]. IL-17 er også synergistisk med andre cytokiner inkludert TNF-ct og IL-1(3 for ytterligere å indusere kjemokinekspresjon (Chaubaud, M., et al., J. Immunol.. 161(D:409-14 (1998)). Interleukin-17 (IL-17) viser pleiotropiske, biologiske aktiviteter i forskjellige celletyper. IL-17 har også evnen til å indusere overflateekspresjon av ICAM-1, proliferasjon av T-celler og vekst og differensiering av humane CD34<+->forløperceller til neutrofiler. IL-17 har også blitt vist å delta i benmetabolisme, og har blitt foreslått å spille en viktig rolle i patologiske tilstander som særpreges ved nærvær av aktiverte T-celler og dannelse av TNF-a, for eksempel reumatoid artritt og løsning av benimplantater (Van Bezooijen et al., J. Bone Miner. Res., 14: 1513-1521 (1999)). Aktiverte T-celler i synovialt vev erholdt fra pasienter med reumatoid artritt ble funnet å utskille høyere mengder av IL-17 enn celler avledet fra normale individer eller pasienter med osteoartritt (Chabaud et al., Arthritis Rheum.. 42: 963-970 (1999)). Det ble foreslått at dette proinflammatoriske cytokin aktivt bidrar til leddvæskebetennelse ved reumatoid artritt. I tillegg til den proinflammatoriske rollen, ser IL-17 ut til å bidra til sykdomsforløpet for reumatoid artritt via ytterligere en mekanisme. For eksempel har IL-17 blitt vist å indusere ekspresjonen av osteoklastdifferensierende faktor (ODF)-mRNA i osteoblaster (Kotake et al., J. Clin. Invest.. 103: 1345-1352 (1999)). ODF stimulerer differensieringen av forløperceller til osteoklaster, cellene som deltar i benresorpsjonen. Siden IL-17-nivået er signifikant forhøyet i leddvæske fra pasienter med reumatoid artritt ser det ut til at IL-17-indusert osteoklastdannelse spiller en avgjørende rolle i beinresorpsjonen ved reumatoid artritt. IL-17 antas også å spille en nøkkelrolle i visse andre autoimmune forstyrrelser, for eksempel multippel sklerose (Matusevicius et al, Mult. Seler., 5: 101-104 (1999); Kurasawa, K., et al., Arthritis Rheu.. 43(11):2455-63 (2000)) og psoriasis (Teunissen, M.B., et al.. J Invest DermatoL 111(4):645-9 (1998); Albanesi, C, et al., J Invest Dermatol.. 115(1^:81-7 (2000); og Homey, B., et al.. J. Immunol.. 164(12:6621-32
(2000)).
IL-17 har videre blitt vist ved intracellulær signalisering og stimulere Ca<2+->instrømmingen og redusere (cAMP)ji humane makrofager (Jovanovic et al., J. Immunol., 160: 3513 (1998)). Fibroblaster behandlet med IL-17 induserer aktivering av NF-kB, (Yao et al., Immunity. 3: 811 (1995), Jovanovic et al., supra), mens makrofager som behandles med cytokinet aktiverer NF-kB og mitogenaktiverte proteinkinaser (Shalom-Barek et al., J. Biol. Chem.. 273: 37467 (1998)). I tillegg har IL-17 også sekvenslikhet med cytokinlignende faktor 7 fra pattedyr, som deltar i vekst av bein og brusk. Andre proteiner som IL-17-polypeptider viser sekvenslikhet med er interleukinrelatert faktor avledet fra humane fostere (EDIRF) og interleukin-20.
I samsvar med de omfattende virkningene av IL-17 har celleoverflatereseptoren for IL-17 blitt funnet å ha en bred ekspresjon i mange vev og celletyper (Yao et al., Cvtokine, 9: 794 (1997)). Mens aminosyresekvensen til den humane IL-17-reseptor (IL-R) (866 aminosyrer) forutsier et protein med et enkelt transmembrandomene, og et langt intracellulært domene på 525 aminosyrer, er reseptorsekvensen unik og ligner ikke sekvensen til noen av de andre reseptorene fra cytokin/vekstfaktorreseptorfamilien. Dette viser, sammen med den manglede likhet mellom IL-17 selv og andre kjente proteiner, at IL-17 og den tilhørende reseptor kan utgjøre en del av en ny familie av signalproteiner og reseptorer. Det har blitt vist at IL-17-aktivitet formidles via binding til den unike celleoverflatereseptoren (heri betegnet human IL-17R), hvor tidligere undersøkelser har vist at å sette T-celler i forbindelse med en løselig form av IL-17-reseptorpolypeptidet, inhiberte den T-celleproliferasjon og IL-2-produksjon som induseres av PHA, konkanavalin A og monoklonalt anti-TCR-antistoff (Yao et al., J. Immunol., 155: 5483-5486 (1995)). Det er følgelig en vesentlig interesse for å påvise og karakterisere nye polypeptider med homologi med de kjente cytokinreseptorene, særlig IL-17-reseptorer.
Interleukin-17 er nå anerkjent som et prototypisk medlem av en stadig voksende familie av cytokiner. Sekvensering i stor skala av det humane genom og andre vertebrate genomer har vist nærvær av andre gener som koder for proteiner som åpenbart er beslektet med IL-17, slik at en ny familie av cytokiner kan defineres. Det er minst 6 medlemmer av IL-17-familien i mennesker og mus, innbefattet IL-17B, IL-17C, IL-17D, IL-17E og IL-17F, så vel som nye reseptorer, IL-17RH1, IL-17RH2, IL-17RH3 og IL-17RH4 (se WO 01/46420, offentliggjort 28. juni, 2001). Et slikt IL-17-medlem (betegnet IL-17F) har blitt vist å bindes til den humane IL-17-reseptor (IL-17R) (Yao et al., Cvtokine, 9(11):794-800 (1997)). En innledende karakterisering tyder på at flere av disse nyidentifiserte molekylene i likhet med IL-17 har evnen til å modulere immunfunksjonen. De kraftige inflammatoriske virkningene som har blitt påvist for flere av disse faktorene, og de stadig nye assosiasjonene med viktige sykdommer i mennesket tyder på at disse proteinene kan ha signifikante roller i betennelsesprosesser og kan by på muligheter for terapeutisk intervensjon.
Genet som koder for humant IL-17F ligger i nabostilling til IL-17 (Hymowitz, S.G. et al., Embo J.. 20(19):5332-41 (2001)). IL-17 og IL-17F har 44% aminosyre-identitet, mens de andre medlemmene av IL-17-familien har en mer begrenset aminosyre-identitet på 15-27%, noe som tyder på at IL-17 og IL-17F utgjør en klar undergruppe innen IL-17-familien (Starnes, T. et al., J. Immunol. 167(8^:4137-40 (2001); Aggarwal, S. og Gurney, A.L., J. LeukocBiol., 71(11:1-8 (2002)). IL-17F ser ut til å ha biologiske virkninger som ligner virkningene av IL-17 og kan fremme dannelsen av IL-6, IL-8 og G-CSF fra et bredt utvalg av celler. I likhet med IL-17 kan IL-17F indusere frigjøring av luftmasse og inhibere syntesen av ny bruskmasse (se US patentsøknad nr. 2002-0177188-Al, offentliggjort 28. november, 2002). I likhet med IL-17 kan IL-17F muligens bidra til patologien forbundet med betennelsesforstyrrelser. Disse forfattere har nylig observert at både IL-17 og IL-17F induseres i T-celler via virkningen av interleukin 23 (11-23)
(Aggarwal, S., et al., J. Biol. Chem., 278(3V.1910-4 (2003)). Den observasjon av IL-17 og IL-17F ligger nær hverandre på kromomsomet og har en signifikant sekvenslikhet, så vel som den observasjon at IL-17 og IL-17F ser ut til å induseres i samme cellepopulasjon som respons på et spesifikt stimulus, har ført til påvisningen av et nytt, humant cytokin som består av en kovalent heterodimer av IL-17 og IL-17F (heri betegnet IL-17A/F). Humant IL-17A/F er et klart nytt cytokin som er forskjellig fra humant IL-17 og IL-17F både når det gjelder proteinstruktur og de cellebaserte aktivitetsanalyser. Ved anvendelse av renset, rekombinant humant IL-17A/F som standard, har det blitt utviklet en ELISA spesifikk for humant IL-17A/F. Ved anvendelse av denne spesifikke ELISA ble den induserte ekspresjon av humant IL-17A/F påvist, noe som bekrefter at IL-17A/F dannes naturlig fra aktiverte, humant T-celler i kultur. Følgelig er IL-17A/F et klart nytt cytokin som kan påvises som et naturlig produkt fra isolerte, aktiverte humant T-celler, og hvis rekombinante form har blittkarakterisert, både når det gjelder proteinstruktur og i cellebaserte analyser, til å være forskjellig og skjelnelig fra beslektede cytokiner. Disse undersøkelsene tilveiebringer og identifiserer således et nytt immunstimulerende middel (dvs. IL-17A/F) som kan forsterke immunsystemets respons på et gitt antigen som ikke nødvendigvis var immunologisk aktivt på forhånd. Følgelig har det nyidentifiserte, immunstimmulerende middel viktige kliniske anvendelser. Dette nye IL-17A/F-cytokin eller antagonister derav vil følgelig finne praktisk anvendelse som et immunstimulerende middel, mens molekyler som inhiberer IL-17A/F-aktivitet (antagonister) vil forventes å finne praktisk anvendbarhet dersom det er ønskelig med en inhibering av immunresponsen, for eksempel i autoimmune sykdommer. Nærmere bestemt vil antistoffer mot dette nye cytokin som enten etterligner (agonistiske antistoffer) eller inhiberer (antagonistiske antistoffer) vil de immunologiske aktivitetene av IL-17A/F ha terapeutiske kvaliteter. Små molekyler som virker ved å inhibere aktiviteten av dette nye cytokin vil også ha mulige terapeutiske anvendelser.
Oppsummering av oppfinnelsen
A. Utførelser
Foreliggende oppfinnelse gjelder preparater og fremgangsmåter som er anvendbare for diagnose og behandling av immunrelatert sykdom i pattedyr, innbefattet mennesker. Foreliggende oppfinnelse bygger på påvisningen av proteiner (innbefattet agonistiske og antagonistiske antistoffer) som enten stimulerer eller inhiberer immunresponsen i pattedyr. Immunrelaterte sykdommer kan behandles ved å undertrykke eller fremme immunresponsen. Molekyler som fremmer immunresponsen stimulerer eller forsterker immunresponsen mot et antigen. Molekyler som stimulerer immunresponsen kan anvendes terapeutisk dersom en forsterkning av immunresponsen ville være gunstig. Alternativt kan molekyler som undertrykker immunresponsen og svekker eller reduserer immunresponsen mot et antigen (for eksempel nøytraliserende antistoffer) anvendes terapeutisk dersom en svekking av immunresponsen ville være gunstig (for eksempel betennelse). Følgelig er IL-17A/F-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse og agonister og antagonister derav også anvendbare for fremstilling av medisiner og medikamenter for behandling av immunrelaterte sykdommer og betennelsessykdommer. I et spesifikt aspekt omfatter slike medisiner og medikamenter en terapeutisk effektiv mengde av et IL-17A/F-polypeptid eller en agonist eller antagonist derav sammen med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Blandingen er fortrinnsvis steril.
I en videre utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for identifisering av agonister eller antagonister mot et IL-17A/F-polypeptid som omfatter å sette IL-17 A/F - polypeptidet i forbindelse med et kandidatmolekyl og måle en biologisk aktivitet som formidles av IL-17A/F-polypeptidet. IL-17A/F-polypeptidet er fortrinnsvis et IL-17A/F-polypeptid med nativ sekvens. I et spesifikt aspekt er IL-17A/F-agonisten eller - antagonisten et anti-IL-17A/F-antistoff.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en sammensetning som omfatter et IL-17A/F-polypeptid eller et agonistisk eller antagonistisk antistoff som binder polypeptidet i blanding med et fargestoff eller en eksipiens. I et aspekt omfatter sammensetningen en terapeutisk effektiv mengde av polypeptidet eller antistoffet. I et annet aspekt er, dersom sammensetningen omfatter et immunstimulerende molekyl, sammensetningen anvendbar for: (a) å fremme infiltrasjonen av inflammatoriske celler i et vev i et pattedyr med behov for dette, (b) å stimulere eller forsterke en immunrespons i et pattedyr med behov for dette, (c) å øke proliferasjonen av T-lymfocytter i et pattedyr med behov for dette som respons på et antigen, (d) å stimulere aktiviteten av T-lymfocytter, eller (e) å øke karpermeabiliteten. I et videre aspekt er, dersom sammensetningen omfatter et immun-inhiberende molekyl, sammensetningen anvendbar for: (a) å redusere infiltrasjonen av inflammatoriske celler i et vev i et pattedyr med behov for dette, (b) å inhibere eller redusere en immunrespons i et pattedyr med behov for dette, (c) å redusere aktiviteten av T-lymfocytter eller (d) å redusere proliferasjonen av T-lymfocytter i et pattedyr med behov for dette som respons på et antigen. I et annet aspekt omfatter sammensetningen ytterligere en aktiv bestanddel som for eksempel kan være et annet antistoff eller et cytotoksisk eller kjemoterapeutisk middel. Sammensetningen er fortrinnsvis steril.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette som omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et IL-17A/F-polypeptid eller en agonist eller antagonist derav. I et foretrukket aspekt er den immunrelaterte forstyrrelse utvalgt fra gruppen som består av systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, spondyloartropatier, systemisk sklerose, idiopatiske inflammatoriske myopatier, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetisk mellitus, immunmediert nyresykdom, demyelinerende sykdommer i sentralnerve systemet og det perifere nervesystem, for eksempel multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barré syndrom, og kronisk inflammatorisk demyelinerende polyneuropati, lever-galle sykdommer, for eksempel infeksiøs, autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt og skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati og Whipples sykdom, autoimmune eller immunmedierte hudsykdommer, innbefattet buløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, psoriasis, allergiske sykdommer som astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat og urtikaria, immunologiske sykdommer i lungen, for eksempel eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose og hypersensitivtets pneumonitt og transplantasjonsassosierte sykdommer, innbefattet transplantatawisning og graft-versus-host-sykdom.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som spesifikt bindes til hvilket som helst av polypeptidene som beskrives ovenfor eller nedenfor. Om ønskelig er antistoffet et monoklonalt antistoff, et humanisert antistoff, et antistoff-fragment eller et enkeltkjedet antistoff. I et aspekt gjelder foreliggende oppfinnelse et isolert antistoff som binder et IL-17A/F-polypeptid. I et annet aspekt etterligner antistoffet aktiviteten av et IL-17A/F-polypeptid (et agonistisk antistoff) eller omvendt, antistoffet inhiberer eller nøytraliserer aktiviteten av et IL-17A/F-polypeptid (et antagonistisk antistoff). I et annet aspekt er antistoffet et monoklonalt antistoff, som fortrinnsvis har ikke-humane aminosyrerester i de komplementaritetsbestemmende områder (CDR) og humane aminosyrerester i rammeverkområdet (FR). Antistoffet kan være merket og kan være immobilisert til et fasts støttemiddel. I et videre aspekt er antistoffet et antistoffragment, et monoklonalt antistoff, et enkeltkjedet antistoff eller et anti-idiotypisk antistoff. I et annet aspekt omfatter antistoffragmentet eller det enkeltkjedede antistoff et Fab-fragment som er utvalgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene som vises i Figur 6 som SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 og SEKV ID NR: 42, hvori Fab-fragmentet videre omfatter tre variable tungkjedeområder som inneholder CDR-H1 bestående av aminosyrerestene 7-16 i SEKV ID NR: 9-42, CDR-H2 bestående av aminosyrerestene 30-46 i SEKV ID NR: 9-42 og CDR-H3 bestående av aminosyrerest 78 til minst aminosyrerest 96 i SEKV ID NR: 9-42, hvori Fab-fragmentet kan binde IL-17A/F. I et annet aspekt omfatter antistoffragmentet eller det enkeltkjedede antistoffet Fab-fragment som er utvalgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene som vises i Figur 6 som SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 og SEKV ID NR: 42, hvori Fab-fragmentet videre omfatter i det minste et variabelt tungkjedeområde som inneholder CDR-H1 bestående av aminosyrerestene 7-16 i SEKV ID NR: 9-42 og CDR-H2 bestående av aminosyrerestene 30-46 i SEKV ID NR: 9-42, hvori Fab-fragmentet kan binde IL-17A/F. I et annet aspekt omfatter antistoffragmentet eller det enkeltkjedede antistoff et Fab-fragment som er utvalgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene som vises i Figur 6 som SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 og SEKV ID NR: 42, hvori Fab-fragmentet videre omfatter i det minste variable tungkjedeområder som inneholder CDR-H1 bestående av aminosyrerestene 7-16 i SEKV ID NR: 9-42 og CDR-H3 bestående av aminosyrerest 78 til minst aminosyrerest 96 i SEKV ID NR: 9-42, hvori Fab-fragmentet kan binde IL-17A/F. I et annet aspekt omfatter antistoffragmentet eller det enkeltkjedede antistoffet Fab-fragment som er utvalgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene som vises i Figur 6 som SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 og SEKV ID NR: 42, hvori Fab-fragmentet videre omfatter i det minste variable tungkjedeområder som inneholder CDR-H2 bestående av aminosyrerestene 30 til 46 i SEKV ID NR: 9-42, og CDR-H3 bestående av aminosyrerest 78 til minst aminosyrerest 96 i SEKV ID NR: 9-42, hvori Fab-fragmentet kan binde IL-17A-F. I et annet aspekt omfatter antistoffragmentet eller det enkeltkjedede antistoff et Fab-fragment som er utvalgt fra gruppen som består av aminosyresekvensene som vises i Figur 6 som SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 og SEKV ID NR: 42, hvori Fab-fragmenet videre omfatter minst et variabelt tungkjedeområde som inneholder CDR-H1 bestående av aminosyrerestene 7-16 i SEKV ID NR: 9-42, CDR-H2 bestående av aminosyrerestene 30 til 46 i SEKV ID NR: 9-42 eller CDR-H3 bestående av aminosyrerest 78 til minst aminosyrerest 96 i SEKV ID NR: 9-42, hvori Fab-fragmentet kan binde IL-17A/F. I et annet aspekt omfatter CDR-H1-området i SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 eller SEKV ID NR: 42 i det minste aminosyrerestene 7-10, som tilsvarerer aminosyresekvensen GFTI (heri betegnet SEKV ID NR: 77), hvori SEKV ID NR: 77 kan binde IL-17A/L. I et annet aspekt omfatter CDR-H2-området i SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 eller SEKV ID NR: 42 i det minste aminosyrerestene 41-46, som tilsvarerer aminosyresekvensen YADSVK (heri betegnet SEKV ID NR: 78), hvori SEKV ID NR: 78 kan binde IL-17A/F.
I ytterligere en utførelse gjelder oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som er utvalgt fra gruppen som består av nukleotidsekvensene ifølge SEKV ID NR: 43, SEKV ID NR: 44, SEKV ID NR: 45, SEKV ID NR: 46, SEKV ID NR: 47, SEKV ID NR: 48, SEKV ID NR: 49, SEKV ID NR: 50, SEKV ID NR: 51, SEKV ID NR: 52, SEKV ID NR: 53, SEKV ID NR: 54, SEKV ID NR: 55, SEKV ID NR: 56, SEKV ID NR: 57, SEKV ID NR: 58, SEKV ID NR: 59, SEKV ID NR: 60, SEKV ID NR: 61, SEKV ID NR: 62, SEKV ID NR: 63, SEKV ID NR: 64, SEKV ID NR: 65, SEKV ID NR: 66, SEKV ID NR: 67, SEKV ID NR: 68, SEKV ID NR: 69, SEKV ID NR: 70, SEKV ID NR: 71, SEKV ID NR: 72, SEKV ID NR: 73, SEKV ID NR: 74, SEKV ID NR: 75 og SEKV ID NR: 76, hvori nukleinsyremolekylet koder for Fab-fragmentet som er vist som SEKV ID NR: 9, SEKV ID NR: 10; SEKV ID NR: 11, SEKV ID NR: 12, SEKV ID NR: 13, SEKV ID NR: 14, SEKV ID NR: 15, SEKV ID NR: 16, SEKV ID NR: 17, SEKV ID NR: 18, SEKV ID NR: 19, SEKV ID NR: 20, SEKV ID NR: 21, SEKV ID NR: 22, SEKV ID NR: 23, SEKV ID NR: 24, SEKV ID NR: 25, SEKV ID NR: 26, SEKV ID NR: 27, SEKV ID NR: 28, SEKV ID NR: 29, SEKV ID NR: 30, SEKV ID NR: 31, SEKV ID NR: 32, SEKV ID NR: 33, SEKV ID NR: 34, SEKV ID NR: 35, SEKV ID NR: 36, SEKV ID NR: 37, SEKV ID NR: 38, SEKV ID NR: 39, SEKV ID NR: 40, SEKV ID NR: 41 eller SEKV ID NR: 42, hvori Fab-fragmentet kan bindes til IL-17A/F.
I et annet aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert Fab-fragment som kan binde IL-17A/F og som kodes av en nukleotidsekvens som koder for en slik aminosyresekvens som er beskrevet heri ovenfor. Fremgangsmåter for fremstilling av dette beskrives også heri, hvori fremgangsmåtene omfatter å dyrke en vertscelle som omfatter en vektor som omfatter det tilsvarende, kodende nukleinsyremolekyl under betingelser som er egnet for ekspresjon av Fab-fragmentet, og gjenvinning av Fab-fragmentet fra cellekulturen.
I nok en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse et preparat som omfatter et anti-IL-17A/F-antistoff i blanding med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. I et aspekt omfatter preparatet en terapeutisk effektiv mengde av antistoffet. Preparatet er fortrinnsvis sterilt. Preparatet kan tilføres i form av en flytende, farmasøytisk utforming, som kan være konservert for å oppnå forlenget stabilitet ved lagring. Alternativt er antistoffet et monoklonalt antistoff, et antistoffragment, et humanisert antistoff eller et enkeltkjedet antistoff.
I en videre utførelse gjelder oppfinnelsen en fremstilt gjenstand som omfatter: (a) en sammensetning som omfatter et IL-17A/F-polypeptid eller en agnoist eller antagonist derav, eller et antistoff som spesifikt bindes til dette polypeptidet,
(b) en beholder som inneholder sammensetningen, og
(c) en merkelapp som er festet til beholderen eller et pakkevedlegg som inngår i beholderen, og som viser til anvendelse av IL-17A/F-polypeptidet, eller agonisten eller antagonisten derav for behandling av en immunrelatert sykdom. Sammensetningen kan omfatte en terapeutisk effektiv mengde av IL-17A/F-polypeptidet eller agonisten eller antagonisten derav.
I ytterligere en utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for diagnose av en immunrelatert sykdom i et pattedyr som omfatter å påvise ekspresjonsnivået av et gen som koder for et IL-17A/F-polypeptid (a) i en analyseprøve av vevsceller erholdt fra pattedyret og (b) i en kontrollprøve med kjente, normale vevsceller av samme celletype, hvori et høyere eller lavere ekspresjonsnivå i analyseprøven sammenlignet med kontrollprøven viser nærvær av en immunrelatert sykdom i pattedyret som analysevevs-prøvene ble erholdt fra.
I en annen utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for diagnose av en immunsykdom i et pattedyr som omfatter (a) å sette et anti-IL-17A/F-antistoff i forbindelse med en analyseprøve av vevsceller erholdt fra pattedyret og (b) å påvise dannelsen av et kompleks mellom antistoffet og et IL-17A/F-polypeptid i analyse-prøven, hvori dannelsen av komplekset viser nærvær eller fravær av sykdommen. Påvisningen kan være kvalitativ eller kvantitativ og kan utføres ved å sammenligne med kompleksdannelsen i en kontrollprøve med kjente, normale vevsprøver av samme celletype. En større mengde av komplekser dannet i analyseprøven viser nærvær eller fravær av en immunsykdom i pattedyret som analysevevscellene ble erholdt fra. Antistoffet bærer fortrinnsvis en påvisbar merkingsgruppe. Kompleksdannelsen kan for eksempel måles ved lysmikroskopi, væskestrømscytometri, fluorimetri eller andre teknikker som er kjente innen faget. Analyseprøven er vanligvis erholdt fra et individ som mistenkes for å ha en svikt eller unormalitet i immunsystemet.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å påvise nærvær av et IL-17A/F-poIypeptid i en prøve som omfatter å sette en analyseprøve av celler som mistenkes å inneholde IL-17A/F-polypeptidet i forbindelse med et anti-IL-17A/F-antistoff, og påvise binding av antistoffet til celleprøven. I et spesifikt aspekt omfatter prøven en celle som mistenkes å inneholde IL-17A/F-polypeptidet, og antistoffet bindes til cellen. Antistoffet er fortrinnsvis påvisbart merket og/eller bundet til et fasts støttemiddel.
I en annen utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse et sett for diagnose av en immunrelatert sykdom som omfatter et anti-IL-17A/F-antistoff og et bærestoff pakket på en egnet måte. Settet inneholder fortrinnsvis instruksjoner for anvendelse av antistoffet for påvisning av nærvær av IL-17A/F-polypeptidet. Bærestoffet er fortrinnsvis farmasøytisk aksepterbart.
I en annen utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse et diagnostisk sett som inneholder et anti-IL-17A/F-antistoff pakket på egnet måte. Settet inneholder fortrinnsvis instruksjoner for anvendelse av antistoffet for påvisning av IL-17A/F-polypeptidet.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for diagnose
av en immunrelatert sykdom i et pattedyr som omfatter å påvise nærvær eller fravær av et IL-17A/F-polypeptid i en analyseprøve av vevsceller erholdt fra pattedyret, hvori nærvær eller fravær av IL-17A/F-polypeptidet i analyseprøven viser nærvær av en immunrelatert sykdom i pattedyret.
I en annen utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for identifisering av en agonist av et IL-17A/F-polypeptid som omfatter: (a) å sette cellene i forbindelse med en forbindelse som skal analyseres under betingelser som er egnet for induksjon av en cellulær respons som normalt induseres av et IL-17A/F-polypeptid, og (b) å bestemme induksjonen av den cellulære respons for å avgjøre hvorvidt analyseforbindelsen er en effektiv agonist, hvori induksjonen av den cellulære respons viser at analyseforbindelsen er en effektiv agonist.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for påvisning av en forbindelse som kan inhibere aktiviteten av et IL-17A/F-polypeptid som omfatter å sette en kandidatforbindelse i forbindelse med et IL-17A/F-polypeptid under betingelser og over et tidsrom som er tilstrekkelig til at de to bestanddelene interagerer med hverandre, og fastslå hvorvidt aktiviteten av IL-17A/F-polypeptidet er inhibert. I et spesifikt aspekt er enten kandidatforbindelsen eller IL-17A/F-polypeptidet immobilisert til et fast støttemiddel. I et annet aspekt bærer den ikke-immobiliserte bestanddel en påvisbar merkingsgruppe. I et foretrukket aspekt omfatter fremgangsmåten trinnene: (a) å sette cellene i forbindelsene med en forbindelse som skal analyseres i nærvær av et IL-17A/F-polypeptid under betingelser som er egnet for induksjon av en cellulær respons som normal induseres av et IL-17A/F-polypeptid, og (b) å påvise induksjonen av den cellulære respons for å fastslå hvorvidt analyseforbindelsen er en effektiv antagonist.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for påvisning av en forbindelse som inhiberer ekspresjonen av et IL-17A/F-polypeptid i celler som normalt uttrykker polypeptidet, hvori fremgangsmåten omfatter å sette cellene i forbindelse med en analyseforbindelse og fastslå hvorvidt ekspresjonen av IL-17A/F-polypeptidet inhiberes. I et foretrukket aspekt omfatter denne fremgangsmåten trinnene: (a) å sette cellene i forbindelse med en forbindelse som skal analyseres under betingelser som er egnet for ekspresjon av IL-17A/F-polypeptidet, og (b) å bestemme inhiberingen av ekspresjonen av polypeptidet.
I ytterligere en utførelse gjelder foreliggende oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr som lider av denne som omfatter å tilføre til pattedyret et nukleinsyremolekyl som koder for enten: (a) et IL-17A/F-polypeptid, (b) en agonist av et IL-17A/F-polypeptid eller (c) en antagonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori agonisten eller antagonisten kan være et anti-IL-17A/F-antistoff. I en foretrukket utførelse er pattedyret et menneske. I en annen foretrukket utførelse tilføres nukleinsyren ved hjelp av ex v/vo-genterapi. I en videre foretrukket utførelse foreligger nukleinsyren i en vektor, mer foretrukket en adenovirusvektor, en adeno-assosiert virusvektor, en lentivirus vektor eller en retrovirus vektor.
I ytterligere et aspekt tilveiebringer oppfinnelsen en rekombinant viruspartikkel som omfatter en virusvektor som i det vesentlige består av en promoter, nukleinsyre som koder for (a) et IL-17A/F-polypeptid, (b) et agonistisk polypeptid for et IL-17A/F-polypeptid, eller (c) et antagonistisk polypeptid for et IL-17A/F-polypeptid, og en signalsekvens for cellulær sekresjon av polypeptidet, hvori virusvektoren foreligger i assoiasjon med virale, strukturelle proteiner. Signalsekvensen er fortrinnsvis fra et pattdyr, for eksempel fra et nativt IL-17A/F-polypeptid.
I ytterligere i en utførelse gjelder oppfinnelsen en ex v/vo-produsentcelle som omfatter en nukleinsyrekonstruksjon som uttrykker retrovirale, strukturelle proteiner, og som også omfatter en retrovirus vektor som i det vesentlige består av en promoter, nukleinsyre som koder for (a) et IL-17A/F-polypeptid, (b) et agonistisk polypeptid for et IL-17A/F-polypeptid eller (c) et antagonistisk polypeptid for et IL-17A/F-polypeptid, og en signalsekvens for cellulær sekresjon av polypeptidet, hvori produsentcellen pakker retrovirus vektoren i assosiasjon med de strukturelle proteinene for dannelse av rekombinante retroviruspartikler.
I nok en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å fremme infiltrasjonen av inflammatoriske celler fra karsystemet til et vev i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av (a) et IL-17 A/F-polypeptid eller (b) en agonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori infiltrasjonen av inflammatoriske celler fra karsystemet i pattedyret fremmes.
I ytterligere en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å redusere infiltrasjonen av inflammatoriske celler fra karsystemet til et vev i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av (a) et IL-17A/F-polypeptid eller (b) en antagonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori infiltrasjonen av inflammatoriske celler fra karsystemet i pattedyret reduseres.
I ytterligere en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å forhøye aktiviteten av T-lymfocytter i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av (a) et IL-17A/F-polypeptid eller (b) en agonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori aktiviteten av T-lymfocytter i pattedyret forhøyes.
I ytterligere en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å redusere aktiviteten av T-lymfocytter i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av (a) et IL-17A/F-polypeptid eller (b) en antagonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori aktiviteten av T-lymfocytter i pattedyret reduseres.
I ytterligere en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å øke proliferasjonen av T-lymfocytter i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av et IL-17A/F-polypeptid eller (b) en agonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori proliferasjonen av T-lymfocytter i pattedyret økes.
I ytterligere en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen en fremgangsmåte for å redusere proliferasjonen av T-lymfocytter i et pattedyr som omfatter tilførsel til pattedyret av (a) et IL-17A/F-polypeptid eller (b) en antagonist av et IL-17A/F-polypeptid, hvori proliferasjonen av T-lymfocytter i pattedyret reduseres.
I ytterligere en utførelse gjelder oppfinnelsen anvendelse av et IL-17A/F-polypeptid, en agonist eller antagonist derav, som beskrevet heri ovenfor, eller et anti-IL-17A/F-antistoff for fremstilling av et medikament som er anvendbart ved behandling av en tilstand som responderer på IL-17A/F-polypeptidet eller en agonist eller antagonist derav (for eksempel anti-IL-17A/F). I et spesielt aspekt gjelder oppfinnelsen anvendelse av et IL-17A/F-polypeptid eller en agonist eller antagonist derav i en fremgangsmåte for behandling av en degenerativ bruskforstyrrelse.
I ytterligere en utførelse gjelder oppfinnelse en fremgangsmåte for behandling av en degenerativ bruskforstyrrelse i et pattedyr som omfatter tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av et IL-17A/F-polypeptid eller en agonist eller antagonist derav til pattedyret som lider av forstyrrelsen.
I ytterligere en utførelse gjelder oppfinnelsen et sett som omfatter et preparat som omfatter et IL-17A/F-polypeptid, eller en agonist eller antagonist derav i blanding med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, en beholder som inneholder preparatet og en merkelapp som er festet til beholderen og som viser til anvendelsen av preparatet ved behandling av en degenerativ bruskforstyrrelse.
I et annet aspekt gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette som omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av en eller flere antagonister som kan inhibere både IL-17A (SEKV ID NR: 3) og IL-17F (SEKV ID NR: 4) i et IL-17A/F-polypeptid. I en foretrukket utførelse er pattedyret et menneske.
I en utførelse omfatter denne fremgangsmåten tilførsel av en terapeutisk effektiv mengde av en IL-17A-antagonist og en IL-17F-antagonist.
I en annen utførelse er IL-17A-antagonisten et antistoff som spesifikt binder IL-17A (SEKV ID NR: 3), eller et fragment derav.
I ytterligere en utførelse er IL-17F-antagonisten et antistoff som spesifikt binder IL-17F (SEKV ID NR: 4) eller et fragment derav.
I en videre utførelse er IL-17A-antagonisten et antistoff som spesifikt binder IL-17A (SEKV ID NR: 3) eller et fragment derav, og IL-17F-antagonisten er et antistoff som spesifikt binder IL-17F (SEKV ID NR: 4) eller et fragment derav.
I ytterligere en utførelse er antagonisten et antistoff som spesifikt bindes til både IL-17A (SEKV ID NR: 3) og IL-17F (SEKV ID NR: 4) i et IL-17A/F-polypeptid, eller et fragment derav. I en forskjellig utførelse er antistoffet et kryss-reagerende antistoff som gjenkjenner identiske eller lignende epitoper som foreligger i både IL-17A (SEKV ID
NR. 3) og IL-17F (SEKV ID NR: 4).
I en videre utførelse er antistoffet er bispesifikt antistoff med IL-17 A- og IL-17F-spesifisitet, eller et fragment derav.
I alle utførelser kan antistoffet være et monoklonalt antistoff som kan være et kimert, humanisert eller humant antistoff.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette som omfatter samtidig virkning på IL-17A og IL-17F i pattedyret, hvori fremgangsmåten omfatter samtidig tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av to forskjellige antistoffer, hvori et antistoff spesifikt bindes til IL-17A og det andre antistoff spesifikt bindes til IL-17F. Den immunrelaterte forstyrrelse kan være systemisk lupus erytematosus, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immunmediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjons-assosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med et behov for dette som omfatter samtidig virkning på IL-17A og IL-17F i pattedyret, hvori fremgangsmåten omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et kryssreagerende antistoff, hvori antistoffet gjenkjenner identiske eller lignende epitoper som foreligger i både IL-17A, et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 3 og IL-17F, et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 4. Den immunrelaterte forstyrrelsen kan være systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immunmediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjons-assosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette som omfatter samtidig virkning på IL-17A og IL-17F i pattedyret, hvori fremgangsmåten omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et bispesifikt antsitoff, hvori antistoffet består av to armer, hvori en arm i antistoffet gjenkjenner IL-17A og den andre arm i antistoffet gjenkjenner IL-17F. Den immunrelaterte forstyrrelse kan omfatte systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immun-mediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjons-assosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette som omfatter samtidig dyrkning på IL-17A og IL-17F i pattedyret, hvori fremgangsmåten omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et bispesifikt antistoff, hvori antistoffet består av en tungkjede som gjenkjenner TL-17A og en lettkjede som gjenkjenner IL-17F. Den immunrelaterte forstyrrelse kan omfatte systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immunmediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjons-assosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
I en annen utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette som omfatter samtidig virkning på IL-17 A og IL-17F i pattedyret, hvori fremgangsmåten omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et bispesifikt antistoff, hvori antistoffet består av en tungkjede som gjenkjenner IL-17F og en lettkjede som gjenkjenner IL-17A. Den immunrelaterte forstyrrelse kan omfatte systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immunmediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjons-assosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
B. Ytterligere utførelser
I andre utførelser av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et IL-17A/F-polypeptid.
I et aspekt omfatter det isolerte nukleinsyremolekyl en nukleotidsekvens som
viser minst tilnærmet 80% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst til nærmet 81% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91 % nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98% nukleinsyresekvensidentitet og alternativt minst tilnærmet 99% nukleinsyresekvensidentitet med (a) et DNA-molekyl som koder for et IL-17A/F-polypeptid med en fullengde aminosyresekvens som beskrevet heri, en aminosyresekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri, eller hvilket som helst annet spesifikt definert fragment av den fullengde aminosyresekvens som beskrives heri, eller (b) den komplementære sekvens til DNA-molekylet ifølge (a).
I andre aspekter omfatter det isolerte nukleinsyremolekyl en nukleotidsekvens som viser minst tilnærmet 80% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst til nærmet 81% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98% nukleinsyresekvensidentitet og alternativt minst tilnærmet 99% nukleinsyresekvens identitet med (a) et DNA-molekyl som omfatter den kodende sekvens for et fullengde IL-17 A/F-polypeptid-cDNA som beskrevet heri, den kodende sekvens for et IL-17A/F-polypeptid som mangler signalpeptidet som beskrevet heri, eller den kodende sekvens for hvilket som helst annet spesifikt definert fragment av fullengde-aminosyresekvensen som beskrives heri, eller (b) den komplementære sekvens til DNA-molekylet ifølge (a).
I et videre aspekt gjelder oppfinnelsen et isolert nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleotidsekevens som viser minst tilnærmet 80% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst til nærmet 81%) nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84%» nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85%) nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88%) nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98% nukleinsyresekvensidentitet og alternativt minst tilnærmet 99% nukleinsyresekvensidentitet med (a) et DNA-molekyl som koder for det samme modne polypeptid som kodes av hvilket som helst av de cDNA for humane proteiner som er deponert hos ATCC som beskrevet heri, eller (b) den komplementære sekvens til DNA-molekylet ifølge (a).
En annen utførelse er rettet mot fragmenter av en IL-17A/F-polypeptidkodende sekvens eller den komplementære sekvens som for eksempel kan anvendes som hybridiseringsprober, for koding av fragmenter av et IL-17A/F-polypeptid og som om ønskelig kan kode for et polypeptid som omfatter et bindingssete for et anti-IL-17A/F-antistoff, eller som "antisense"-oligonukleotidprober. Slike nukleinsyrefragmenter er vanligvis minst tilnærmet 20 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 30 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 40 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 50 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 60 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 70 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 80 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 90 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 100 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 110 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 120 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 130 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 140 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 150 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 160 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 170 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 180 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 190 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 200 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 250 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 300 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 350 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 400 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 450 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 500 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 600 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 700 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 800 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 900 nukleotider lange og alternativt minst tilnærmet 1000 nukleotider lange, hvori begrepet "tilnærmet", i denne sammenheng, betyr den angitte nukleotidsekvenslengde pluss eller minus 10% av den angitte lengde. Det skal bemerkes at fragmenter av et IL-17A/F-polypeptidkodende nukleotidsekvens kan bestemmes på en rutinemessig måte ved å sammenstille den IL-17A/F-polypeptidkodende nukleotidsekvens med andre kjente nukleotidsekvenser ved anvendelse av hvilket som helst av en rekke velkjente programmer for sekvenssammenstiIling, og fastsette hvilket eller hvilke av de polypeptidkodende nukleotidsekvensfragmentene som er nye. Alle slike polypeptidkodende nukleotidsekvenser omfattes heri. Videre omfattes polypeptidfragmentene som kodes av disse nukleotidmolekylfragmentene, fortrinnsvis de IL-17A/F-polypeptidfragmenter som omfatter et bindingssete for et anti-IL-17A/F-antistoff.
I en annen utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et isolert IL-17A/F-polypeptid som kodes av hvilken som helst av de isolerte nukleinsyresekvensene som er identifisert heri ovenfor.
I et vist aspekt hjelper oppfinnelsen et isolert IL-17A/F-polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som viser minst tilnærmet 80% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 81% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98% aminosyresekvensidentitet og alternativt minst tilnærmet 99% aminosyresekvensidentitet med et ILI-17A/F-polypeptid med en fullengde aminosyresekvens som beskrevet heri, en aminosyresekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri eller hvilket som helst annet spesifikt definert fragment av fullengde-aminosyresekvensen som beskrives heri.
I et videre aspekt gjelder oppfinnelsen et isolert IL-17A/F-polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som viser minst tilnærmet 80% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 81% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86%) aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98% aminosyresekvensidentitet med en aminosyresekvens som kodes av hvilket som helst av de cDNA for humane proteiner som er deponert hos ATCC som beskrevet heri.
I et videre aspekt gjelder oppfinnelsen et isolert IL-17A/F-polypeptid som omfatter en aminosyresekvens som viser minst tilnærmet 80% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 81% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 82% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 83% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 84% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 85% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 86% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 87% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 88% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 89% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 90% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 91% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 92% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 93% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 94% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 95% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 96% positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 97%» positive aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 98% positive aminosyrer og alternativt minst tilnærmet 99% positive aminosyrer ved sammenligning med aminosyresekvensen til et IL-17A/F-polypeptid med en fullengde aminosyresekvens som beskrevet heri, en aminosyresekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri, eller hvilket som helst annet spesifikt definert fragment av fullengde-aminosyresekvensen som beskrives heri.
I et spesifikt aspekt tilveiebringer oppfinnelsen et isolert IL-17A/F-polypeptid uten den N-terminale signalsekvens og/eller det innledende metionin som kodes av en nukleotidsekvens som koder for en slik aminosyresekvens som er beskrevet heri ovenfor. Fremgangsmåter for fremstilling av dette beskrives også heri, hvor fremgangsmåtene omfatter dyrking av en vertscelle som omfatter en vektor som omfatter det tilsvarende kodende nukleinsyremolekyl under betingelser som er egnet for ekspresjon av IL-17A/F-polypeptidet, og gjenvinning av IL-17A/F-polypeptidet fra cellekulturen.
I ytterligere en utførelse gjelder oppfinnelsen agonister og antagonister av et nativt IL-17A/F-polypeptid som definert heri. I en spesiell utførelse er agonisten eller antagonisten et anti-IL-17A/F-antistoff eller et lite molekyl.
I en videre utførelse gjelder oppfinnelsen en fremgangsmåte for påvisning av agonister eller antagonister av et IL-17A/F-polypeptid som omfatter å sette IL-17A/F-polypeptidet i forbindelse med et kandidatmolekyl og måle en biologisk aktivitet som formidles av IL-17A/F-polypeptidet. IL-17A/F-polypeptidet er fortrinnsvis et nativt IL-17 A/F-polypeptid.
I ytterligere en utførelse gjelder oppfinnelsen en sammensetning som omfatter et IL-17A/F-polypeptid, en agonist eller antagonist av et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri, eller et anti-IL-17A/F-antistoff i kombinasjon med et bærestoff. Bærestoffet er om ønskelig et farmasøytisk aksepterbart bærestoff.
En annen utførelse av foreliggende oppfinnelse er rettet mot anvendelse av et IL-17A/F-polypeptid, en agonist eller antagonist derav som beskrevet heri ovenfor eller et anti-IL-17A/F-antistoff for fremstilling av et medikament som er anvendbart ved behandling av en tilstand som responderer på IL-17A/F-polypeptidet, en agonist eller antagonist derav eller et anti-IL-17A/F-antistoff.
I ytterligere utførelser av den foreliggende oppfinnelse tilveiebringer oppfinnelsen vektorer som omfatter DNA som koder for alle de heri beskrevne polypeptider. En vertscelle som omfatter hvilken som helst slik vektor tilveiebringes også. Vertscellene kan for eksempel være CHO-celler, E. co/z-celler, gjærceller eller Baculovirusinfiserte insektsceller. En fremgangsmåte for fremstilling av hvilke som helst av de her beskrevne polypeptider tilveiebringes videre og omfatter dyrking av vertsceller under betingelser som er egnet for ekspresjon av det ønskede polypeptid, og gjenvinning av det ønskede polypeptid fra cellekulturen.
I andre utførelser tilveiebringer oppfinnelsen kimere molekyler som omfatter hvilke som helst av de heri beskrevne polypeptider fusjonert til et heterologt polypeptid eller en heterolog aminosyresekvens. Eksempler på slike kimere molekyler omfatter hvilke som helst av de heri beskrevne polypeptider fusjonert til en epitop-merkelapp-sekvens eller et Fc-område fra et immunglobulin.
I ytterligere en utførelse tilveiebringer oppfinnelsen et antistoff som spesifikt bindes til hvilke som helst av de ovenfor eller nedenfor beskrevne polypeptider. Antistoffet er om ønskelig et monoklonalt antistoff, et humanisert antistoff, et antistoff-fragment eller et enkeltkjedet antistoff.
I nok andre utførelser tilveiebringer oppfinnelsen oligonukleotidprober som er anvendbare for isolering av genomiske nukleotidsekvenser og cDNA-nukleotidsekvenser, eller som "antisense"-prober, hvori probene kan være avledet fra hvilke som helst av de ovenfor eller nedenfor beskrevne nukleotidsekvenser.
Kort beskrivelse av figurene
Figur 1 viser resultatene vedrørende ekspresjon og isolering av et nytt, humant cytokin betegnet IL-17A/F. Humane 293-nyreceller ble transfektert med cDNA-ekspresjonsvektorer som koder for humant IL-17 og IL-17F alene eller i kombinasjon, som angitt i Figur IA og IB. Kondisjonert medium fra transfekterte celler ble immunutfelt (IP) ved benyttelse av antistoffer som gjenkjenner IL-17 (spor 1-5) eller ILI-17F (spor 6-10), som angitt i Figur IA og Figur IB. Det vises en Western-blot-analyse som viser nærvær av et dimer IL-17A/F-kompleks i spor 8 i Figur IA og i spor 3 i Figur IB. Det dimere IL-17A/F-kompleks har en størrelse som er i samsvar med et kovalent heterodimert molekyl som består av en IL-17-polypeptidkjede og en IL-17F-polypeptidkjede. Figur 2 viser rensingen av rekombinant IL-17A/F. Figur 2A viser resultatene oppnådd ved sølvfarging av SDS-PAGE av proteinfraksjoner fra den innledende fraksjonering av IL-17A/F på en S-Sepharose-kolonne. Fraksjon 31 og 32 inneholder et protein med en tilsynelatende molekylvekt på tilnærmet 33 kD, som er i samsvar med IL-17A/F. Figur 2B viser resultatene oppnådd ved videre rensing av IL-17A/F ved benyttelse av Vydac C4-kolonnekromatografi. Kromatogrammet av eluerte proteiner målt ved 214 nm og 280 nm vises. Figur 2C viser at rensede IL-17A/F-proteinfraksjoner fra Vydac C4-rensingskolonnen induserer dannelse av IL-8 i TK-10-celler. Figur 3 viser resultatene fra aminosyresekvensanalyse av IL-17A/F. Figur 3A viser ikke-reduserende SDS-PAGE-analyse av renset IL-17A/F. Det fraksjonerte protein ble overført til en PVDF-membran og farget med proteinfargestoffet Coomassie blue. Molekylvektmarkørers posisjoner er angitt på høyre side. Figur 3B viser resultatene fra N-terminal sekvensanalyse av isolert IL-17A/F (aminosyrerester påvist fra en N-terminal sekvensanalyse av båndet som vises i Figur 3A). Sekvensanalysen viser to N-terminale sekvenser (Sekvens 1 betegnes SEKV ID NR: 1 og Sekvens 2 betegnes SEKV ID NR: 2). Figur 3C viser aminosyresekvensen til humant IL-17 (vist i både Figur 3C og Figur 8, betegnet SEKV ID NR: 3) og aminosyresekvensen til humant IL-17F (vist både i Figur 3c og Figur 10, betegnet SEKV ID NR: 4). Signalsekvensene i IL-17 og IL-17F er understreket. Sekvensene som er identiske med to N-terminale peptidsekvenser (SEKV ID NR: 1 og SEKV ID NR: 2) som foreligger i IL-17A/F er vist med uthevet skrift for de viser IL-17 og IL-17F-polypeptidsekvenser. Figur 4 viser massespektrometrisk analyse av IL-17A/F. Figur 4A viser skjematisk aminosyresekvensen med interkjede- og intrakjede-disulfidbindinger i den modne IL-17A/F-heterodimer (SEKV ID NR: 77). Cysteinrestene som deltar i disulfidbindinger er angitt med prikker (•) og aminosyrerest nummeret. Disulfidbindingene er angitt med sorte streker som sammenbinder cysteinrestene som inngår i bindingen. De disulfidbindinger som danner interkjede-disulfidbindinger er angitt med fete, sorte streker. Figur 4B viser skjematisk IL-17A/F-peptidfragmentene 1 og 2, som inneholder de disulfidbindinger mellom IL-17-kjeden og IL-17F-kjeden som ville forventes å dannes ved kløyving av IL-17A/F med trypsin (IL-17A/F-disulfidbindingsfragment nr. 1 er betegnet SEKV ID NR: 7, IL-17A/F-disulfidbindingsfragment nr. 2 er betegnet SEKV ID NR: 8). Aminosyrene som inngår i disse fragmentene er angitt og nummerert relativt til den innledende metioninrest i hver kjede. Også vist er den beregnede, tilnærmede molekylmasse av disse fragmentene som ville forventes å observeres ved massespektrometri. Figur 4C viser peptidkartet for IL-17A/F oppnådd ved matriksaffisert laserdesorpsjon/ionisering-"time of flighf-massespektrometri (MALDI-TOF). Det resulterende peptidkart inneholder topper med [M+H]+ = 2420,12 Da og 3410,60 Da, i samsvar med de disulfidsammenbundne peptider. Figur 4D viser videre en karakterisering av ikke-reduserte prøver av IL-17A/F ved væskekromatografi-elektrospray ionisering-ionefelle-massespektrometri (LC-ESI-MS). Ionekromatogrammene representerer (ovenfra og nedover) det totale ionekromatogram, det rekonstruerte ionekromatografm (RIC) for IL-17A/F-disulfidbindingsfragment nr. 2 [M+2H]2+ogIL-17A/F-disulfidbindingsfragmentnr. 1 [M+2FTJ3+. Det ble observert topper som var i samsvar med de to heterodimerene, mens ingen andre topper over den kjemiske bagrunnsstøy ble observert ved de forventede masser for homodimere peptider. Figur 5A viser dose-responskurvene med sammenligning av den proinflammatoriske respons indusert med IL-17A/F, IL-17 og IL-17-F. IL-17A/F, IL-17 og IL-17F ble innkubert med TK-10-celler i de angitte konsentrasjoner i 24 timer. IL-17A/F ble vist å ha en kraftig IL-8-induserende aktivitet, med vesentlig aktivitet observert ved konsentrasjoner under en nM. Figur 5B viser dose-responskurvene erholdt ved sammenligning av IL-6-induksjonen oppnådd med IL-17A/F, IL-17 og IL-17F. IL-17 A/F, IL-17 og IL-17F ble inkubert med TK-10-celler i de angitte konsentrasjoner i 24 timer. TK-10-kondisjonert medium ble oppsamlet og analysert ved IL-6-ELISA. Figur 6 viser aminosyresekvensen i det området av tungkjedens variable område som inneholder CDR H1-H3 fra Fab som binder IL-17A/F. Det vises en sammenstilling av et område av den utledede aminosyresekvens for trettifire (34) kloner (SEKV ID NR: 9 til SEKV ID NR: 42) som koder for forskjellige antistoff tungkjedesekvenser som kan bindes til IL-17A/F. De tre tungkjede-CDR-områdene (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3) er skravert. Figur 7 viser en nukleotidsekvens (SEKV ID NR: 5) fra et IL-17-cDNA med nativ sekvens. Figur 8 viser aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 3) som er utledet fra den kodende sekvens i SEKV ID NR: 5, vist i Figur 7. Figur 9 viser en nukleotidsekvens (SEKV ID NR: 6) fra et IL-17F-cDNA med nativ sekvens. Figur 10 viser aminosyresekvensen (SEKV ID NR: 4) som er utledet fra den kodende sekvens i SEKV ID NR. 6, vist i Figur 9. Figur 11 viser IL-17A/F-ELISA-målinger av IL-17A/F dannet fra anti-CD3/anti-CD28-aktiverte, humant T-celler. Figur 12 viser spesifisiteten til IL-17 A/F -ELIS A, hvori tre fraksjoner, nr. 31-33 som ble analysert i parallell, ble vist å inneholde nesten ekvivalente mengder av IL-17A/F (IL-17A og IL-17F ble anvendt som kontroller). Figur 13 viser det forhøyede produksjonsnivå av både IL-17A og IL-17F ved induksjon av t-celler med IL-6 og TGFp. Figur 14 viser IL-17-familien av cytokiner og det kompliserte mønster for over-lappende reseptor-ligandspesifitet. Fra venstre til høyre viser Figur 14 at IL-17-ligand bindes til IL-17-reseptoren (IL-17R, heri betegnet PROl), IL-17B-ligand (PRO1031) bindes til IL-17RH1-reseptoren (PRO5801), IL-17E-ligand (PRO 10272) bindes til IL-17RH1-reseptoren (PRO5801), IL-17F-ligand (PRO20110) bindes til både IL-17-reseptoren (IL-17R, heri betegnet PROl) og IL-17RH2-reseptoren (PRO20040), mens IL-17C-ligand (PROl 122) og IL-17D-ligand (PR021175) ikke interagerer med reseptorene IL-17R, IL-17RH1 og IL-17RH2. Figur 15 viser strukturen til IL-17F. Figur 15A viser aminosyreryggraden til IL-17F-monomeren som et bånd. Trådene er merket. Disulfidbindinger vises som kuler-pinner med gulfargede svovelatomer. Den tilnærmede posisjonen til de andre cysteinrestene er vist som oransjefargede kuler. Innskuddet viser en tegning av den kanoniske knute. Figur 15B viser peptidryggraden til IL-17F-dimeren som et bånd farget rødt og blått. Disulfidbindinger er vist som i Figur 15A. Figur 15C viser strukturen til NGF fraNGF-TrkA-komplekset (Weismann et al., Nature, 401:184-188 (1999)). En ustrukturert løkke sammenbinder tråd 2 og 3. Figur 16 viser en sekvenssammenstilling mellom IL-17F og andre medlemmer av IL-17-familien. Områder med identitet og sekvenser som er konservert mellom IL-17 og IL-17F er fremhevet i grønt, henholdsvis gult. Dersom andre familiemedlemmer også har konserverte eller identiske aminosyrerester i disse områdene, er de farget på tilsvarende måte. Cysteinrester er angitt i oransje. De konserverte serinrestene som erstatter cysteinrestene i den kanoniske knute er fremhevet med hvite bokstaver. Disulfidbinder som forventes å være konservert i alle IL-17 er angitt med en sort strek som sammenbinder cysteinrestene som inngår i bindingen. De to cysteinrestene som danner interkjede-disulfidbindingen i IL-17F er angitt med en stjerne. Sekundære strukturelementer i IL-17F er vist over sekvensene som blå piler (P-tråder) eller sylindere (ct-heliks). Nummereringen av aminosyrerester er fra starten av de modne sekvensene. Figur 17 viser en sammenligning mellom molekylstrukturen til IL-17F (PRO20110) og IL-17. To ortogonale bilder av "siden" (A) og "fronten" (B) av molekyloverflaten til IL-17F, farges ifølge sekvenskonservasjonen mellom IL-17 og IL-17F, som vist i Figur 16. Overflaten av aminosyrerester som er identiske mellom de to proteinene er farget grønn, homologe aminosyrerester er farget gul, mens aminosyrerester som er signifikant forskjellige er farget hvit. Bildet i (B) er orientert tilnærmet 15° rotert fra bildet i Figur 15B). Aminosyrerester som danner hulrommet er merket. Figur 17C er et "gjennomskåret" bilde av overflaten i Figur 17B som viser hvordan de store hulrommene på hver side av IL-17F trenger dypt inn i dimerlegemet. Figur 18 viser en sammenligning mellom IL-17F-overflaten og TrkA-bindingssetet i NGF. Figur 18A og 18B viser molekylstrukturen til IL-17F, orientert som i Figue 17. IL-17F er farget ut fra det elektrostatiske overflatepotensial: rødt: -5 kT, hvitt: 0 kT og blått: +5 kT. Hulrommenes posisjon er angitt med sirkler. Figur 18C viser molekylstrukturer til NGF i samme orientering som IL-17F i felt (B); domene 5 i TrkA er vist som et grønt bånd (Weismann et al., Nature, 401:184-188 (1999); pdb-kode 1WWW). Figur 19 og 20 viser virkningen av anti-IL-17A/F-antistoffer i en musemodell for kollagenindusert artritt (CIA).
Detaljert beskrivelse av de foretrukne utførelser
I. Definisjoner
Et "IL-17A/F-polypeptid med nativ sekvens" omfatter et polypeptid med den samme aminosyresekvens som det tilsvarende IL-17A/F-polypeptid avledet fra naturen. Slike IL-17A/F-polypeptider med nativ sekvens kan isoleres fra naturen, eller fremstilles ved rekombinante eller syntetiske midler. Begrepet "IL-17A/F-polypeptid med nativ sekvens" omfatter spesifikt naturlig forekommende avkortede eller utskilte former av det spesifikke IL-17A/F-polypeptid (for eksempel en ekstracellulær domenesekvens), naturlig forekommende variantformer (for eksempel alternativt spleisede former) og naturlig forekommende alleliske varianter av polypeptidet. I forskjellige utførelser av oppfinnelsen er IL-17A/F-polypeptidene med nativ sekvens som beskrives heri modne eller fullengde polypeptider med nativ sekvens som omfatter fullengde-aminosyrese-sekvensene som vises i vedlagte figurer. Start- og stoppkodoner er vist med uthevet skrift og understreket i figurene. Mens IL-17A/F-polypeptidene som beskrives i de vedlagte figurer vises å begynne med metioninrester som heri betegnes som aminosyreposisjon 1 i figurene er det imidlertid tenkelig og mulig at andre metioninrester som ligger enten oppstrøms eller nedstrøms for aminosyreposisjon 1 i figurene kan benyttes som start aminosyreresten for IL-17A/F-polypeptidene.
Den tilnærmede plassering av "signalpeptidene" i de forskjellige IL-17A/F-polypeptidene som beskrives heri er vist i den foreliggende beskrivelse og/eller i de vedlagte figurer. Det skal imidlertid bemerkes at den C-terminale grense for et signalpeptid kan varierer, men sannsynligvis ikke med mer enn tilnærmet 5 aminosyrer på hver side av den C-terminale grense for signalpeptidet som opprinnelig identifisert heri, hvori den C-terminale grense for signalpeptidet kan identifiseres ifølge kriterier som rutinemessig benyttet innen faget for identifisering av denne type av aminosyresekvenselement (se for eksempel Nielsen et al., Prot. Eng., 10:1-6 (1997) og von Heijne et al., Nucl. Acids. Res., 14:4683-4690 (1986)). Det skal videre vises at kløyvingen av en signalsekvens fra et utskilt polypeptid i noen tilfeller ikke er fullt ut enhetlig, noe som fører til at det dannes mer enn en utskilt molekyltype. Disse modne polypeptidene, hvori signalpeptidet er avkløyvet innenfor ikke mer enn tilnærmet 5 aminosyrer på hver side av den C-terminale grense for signalpeptidet som identifisert heri og poloynukleotidene som koder for dem omfattes av den foreliggende oppfinnelse.
"IL-17A/F-polypeptidvariant" betyr et aktivt IL-17A/F-polypeptid som definert ovenfor, eller nedenfor med minst tilnærmet 80% aminosyresekvensidentitet med en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens med nativsekvens som beskrevet heri, en IL-17A/F-polypeptidsekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri, eller hvilket som helst annet fragment av en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens som beskrevet heri. Slike IL-17A/F-polypeptidvarianter omfatter for eksempel IL-17A/F-polypeptider i hvilke en eller flere aminosyrerester er addert til eller deletert fra N-eeller C-enden av den native fullengde-aminosyresekvens. Vanligvis vil en IL-17A/F-polypeptidvariant ha minst tilnærmet 80% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 81% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83 % aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85%) aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87%) aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97% aminosyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98%) aminosyresekvensidentitet og alternativt minst tilnærmet 99% aminosyresekvensidentitet med en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens med nativ sekvens som beskrevet heri, en IL-
17A/F-polypeptidsekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri, eller hvilket som helst annet spesifikt definert fragment av en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens som beskrevet heri. Vanligvis er IL-17A/F-polypeptidvarianter minst tilnærmet 10 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 20 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 30 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 40 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 50 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 60 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 70 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 80 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 90 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 100 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 150 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 200 aminosyrer lange, alternativt minst tilnærmet 300 aminosyrer lange eller mer.
"Prosent (%) aminosyresekvensidentitet" når det gjelder IL-17A/F-polypeptidsekvensene som er identifisert heri, er definert som den prosentandel av aminosyrerestene i en kandidatsekvens som er identisk med aminosyrerestene i den spesifikke IL-17A/F-polypeptidsekvens etter sammenstilling av sekvensene og om nødvendig innføring av gap for å oppnå maksimal prosent sekvensidentitet, idet eventuelle konservative substitusjoner ikke regnes som en del av sekvensidentiteten. Sammenstilling med det formål å bestemme prosent aminosyresekvensidentitet kan oppnås på forskjellige måter som ligger innen teknikkens stand, for eksempel ved anvendelse av offentlig tilgjengelig datamaskin programvare som BLAST-, BLAST-2, ÅLING eller Megaling (DNASTAR). Fagfolk kan fastsette egnede parametere for måling av sammenstilling, innbefattet
eventuelle algoritmer som er nødvendige for å oppnå maksimal sammenstilling over den fulle lengde av sekvensene som sammenlignes. For formålene heri er imidlertid verdiene for %-aminosyresekvensidentitet frembrakt ved anvendelse av datamaskin programmet for sekvenssammenligning ALING-2, hvori den komplette kildekode for programmet ALIGN-2 gis i Tabell 1 nedenfor. Datamaskinprogrammet ALIGN-2 for sekvenssammenligning ble skrevet av Genentech, Inc., og kildekoden som vises i Tabell 1 nedenfor har blitt arkivert med brukerdokumentasjon hos US Copyright Office, Washington D.C., 20559, hvor den er registrert under US Copyright registreringsnr. TXU510087. Programmet ALIGN-2 er offentlig tilgjengelig via Genentech, Inc., South San Francisco, California, eller det kan komplieres fra kildekoden som gis i Tabell 1 nedenfor. Programmet ALIGN-2 bør kompileres for anvendelse i et UNIX-operativsystem, fortrinnsvis digital UNIX V4.0D. Alle parametere for sekvenssammenligningen settes av programmet ALIGN-2 og varierer ikke.
I situasjoner hvor ALING-2 benyttes for sammenligning av aminosyresekvenser, beregnes %-aminosyresekvensidentitet for en gitt aminosyresekvens A til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B (noe som alternativt kan uttrykkes som en gitt aminosyresekvens A som har eller omfatter en viss % aminosyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B) som følger:
100 ganger brøken X/Y
hvor X er antall aminosyrerester som angis som identiske treff av sekvenssammestillings-programmet ALIGN-2 i programmets sammenstilling av A og B, og hvor Y er det totale antall aminosyrerester i B. Man vil forstå at dersom lengden av aminosyresekvens A ikke er lik lengden av aminosyresekvens B, vil %-aminosyresekvens for A mot B ikke være lik %aminosyresekvenslikhet for B mot A. Som eksempler på bereninger av %-aminosyresekvensidentitet ved anvendelse av denne fremgangsmåten viser Tabellene 2 og 3 hvordan %-aminosyresekvensidentitet kan beregnes for aminosyresekvensen betegnet "Sammenlignet protein" mot aminosyresekvensen til et hypotetisk polypeptid av interesse, hvor "Sammenlignet protein" representerer aminosyresekvensen til et polypeptid som polypeptidet av interesse sammenlignes med, og "X", "Y" og "Z" alle står for forskjellige hypotetiske aminosyrerester.
Med mindre annet spesifikt er angitt, er alle verdier for %-aminosyresekvensidentitet som anvendes heri erholdt som beskrevet i avsnittet umiddelbart ovenfor ved anvendelse av datamaskinprogrammet ALIGN-2. Verdier for %-aminosyresekvensr identitet kan imidlertid også erholdes som beskrevet nedenfor ved anvendelse av datamaskinprogrammet WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). De fleste av søkeparameterne for WU-BLAST-2 settes til standardverdiene. De parametere som ikke settes til standardverdier, dvs. de justerbare parameterne, innstilles med følgende verdier: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 og poengmatrise = BLOSUM62. Dersom WU-BLAST-2 benyttes, bestemmes en verdi for %-aminosyresekvensidentitet ved å dividere (a) antall identiske aminosyrerester i aminosyresekvensen til polypeptidet av interesse med en sekvens avledet fra det native polypeptid og den sammenlignede aminosyresekvens av interesse (dvs. sekvensen som polypeptidet av interesse sammenlignes med, som kan være en IL-17A/F-polypeptidvariant), bestemt av WU-BLAST-2 med (b) det totale antall aminosyrerester i polypeptidet av interesse. I for eksempel uttalelsen "et polypeptid som omfatter en aminosyresekvens A som har eller viser minst 80% aminosyresekvensidentitet med aminosyresekvens B" er aminosyresekvens A den sammenlignede aminosyresekvens til "Sammenlignet protein" av interesse, mens aminosyresekvens B er aminosyresekvensen til polypeptidet av interesse.
Prosent aminosyresekvensidentitet kan også bestemmes ved anvendelse av sekvenssammenligningsprogrammet NCBI-BLAST2 (Altchul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). SekvenssammenligningsprogrammetNCBI-BLAST2 kan nedlastes fra http:// www. ncbi. nlm. nih. gov eller erholdes på annet vis fra National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 anvender flere søkeparametere, hvori alle søkeparametere settes til standardverdier, innbefattet for eksempel unmaks = ja, strand = alle, forventet forekomst = 10, minimal lav-kompleksitet lengde = 15/5, multi pass e-verdi = 0,01, konstant for multi-plass = 25, "dropoff-verdi for den endelige sammenstilling med gap = 25 og poengmatrise = BLOSUM62.
I situasjoner hvor NCBI-BLAST2 benyttes for aminosyresekvenssammen-ligninger beregnes %-aminosyresekvensidentitet for en gitt aminosyresekvens A til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B (noe som alternativt kan uttrykkes som en gitt aminosyresekvens A som har eller omfatter en viss %-aminosyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt aminosyresekvens B) som følger:
100 ganger brøken X/Y
hvor X er antall aminosyrerester som vurderes som identiske treff av sekvenssammen-stillingsprogrammet NCBI-BLAST2 i programmets sammenstilling av A og B, og hvor Y er det totale antall aminosyrerester i B. Det vil forstås at dersom lengden av aminosyresekvens A ikke er lik lengden av aminosyresekvens B, vil %-aminosyresekvensidentitet for A mog B ikke være lik %-aminosyresekvensidentitet for B mot A.
"IL-17 A/F-polynukleotidvariant" el ler "IL-17 A/F-nukleinsyresekvens variant" betyr et nukleinsyremolekyl som koder for et aktivt IL-17A/F-polypeptid som definert nedenfor, og som har minst tilnærmet 80% nukleinsyresekvensidentitet med en nukleinsyresekvens som koder for en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens med nativ sekvens som beskrevet heri, en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens med nativ sekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri, eller hvilket som helst annet fragment av en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens som beskrevet heri. Vanligvis vil en IL-17A/F-polynukleotidvariant ha minst tilnærmet 80% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 81% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 82% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 83%) nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 84% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 85% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 86% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 87% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 88% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 89%) nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 90% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 91%) nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 92% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 93% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 94% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 95% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 96% nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 97%» nukleinsyresekvensidentitet, alternativt minst tilnærmet 98% nukleinsyresekvensidentitet eller alternativt minst tilnærmet 99% nukleinsyresekvensidentitet med en nukleinsyresekvens som koder for en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens med nativ sekvens som beskrevet heri, en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens med nativ sekvens som mangler signalpeptidet som beskrevet heri,
eller hvilket som helst annet fragment av en fullengde IL-17A/F-polypeptidsekvens som beskrevet heri. Varianter omfatter ikke den native nukleotidsekvens.
Vanligvis er IL-17A/F-polynukleotidvarianter minst tilnærmet 30 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 60 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 90 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 120 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 150 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 180 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 210 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 240 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 270 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 300 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 450 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 600 nukleotider lange, alternativt minst tilnærmet 900 nukleotider lange eller mer.
"Prosent (%) nukleinsyresekvensidentitet" når det gjelder IL-17A/F-kodende nukleinsyresekvenser som er identifisert heri, er definert som prosentandelen av nukleotider i en kandidatsekvens som er identiske med nukleotidene i IL-17A/F-nukleinsyresekvensen av interesse etter sammenstilling av sekvensene og om nødvendig innføring av gap for oppnå maksimal prosent sekvensidentitet. Sammenstilling med det formål å bestemme prosent nukleinsyresekvensidentitet kan oppnås på forskjellige måter som ligger innen teknikkens stand, for eksempel ved anvendelse av offentlig tilgjengelig datamaskin programvare som BLAST, BLAST-2, ALIGN eller Megaling (DNASTAR). For formålene heri, frembringes imidlertid verdier for %-nukleinsyresekvensidentitet ved anvendelse av datamaskinprogrammet for sekvenssammenligning ALIGN-2, hvori den
komplette kildekode for programmet ALIGN-2 gis i Tabell 1 nedenfor. Datamaskinprogrammet for sekvenssammenligning ALIGN-2 ble skrevet av Genentech, Inc., og kildekoden som vises i Tabell 1 nedenfor har blitt arkivert med brukerdokumentasjon hos US Copyright Office, Washington D.C., 20559, hvor den er registrert under US Copyright-registreringsnr. TXU510087. Programmet ALIGN-2 er offentlig tilgjengelig via Genentech, Inc., South San Francisco, California, eller det kan komplieres fra kildekoden som gis i Tabell 1 nedenfor. Programmet ALIGN-2 bør kompileres for anvendelse i et UNIX-operativsystem, fortrinnsvis diginal UNIX V4.0D. Alle parametere for sekvenssammenligningen settes av programmet ALIGN-2 og varierer ikke.
I situasjoner hvor ALIGN-2 benyttes for nukleinsyresekvenssammenligninger beregnes %-nukleinsyresekvensidentitet for en gitt nukleinsyresekvens C til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D (noe som alternativt kan uttrykkes som en gitt nukleinsyresekvens D som har eller omfatter en viss %-nukleinsyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D) som følger:
100 ganger brøken W/Z
hvor W er antall nukleotider som vurderes som identiske treff av sekvenssammen-stillingsprogrammet ALIGN-2 i programmets sammenstilling av C og D, og hvor Z er det totale antall nukleotider i D. Det vil forstås at dersom lengden av nukleinsyresekvens C ikke er lik lengden av nukleinsyresekvens D, vil %-nukleinsyresekvensidentitet for C mot D ikke være lik %-nukleinsyresekvensidentitet for D mot C. Som eksempler på beregning av %-nukleinsyresekvensidentitet viser Tabellene 4 og 5 hvordan %-nukleinsyresekvensidentitet kan beregnes for nukleinsyresekvensen betegnet "sammenlignet DNA" mot nukleinsyresekvensen betegnet "IL-17A/F-DNA", hvori "IL-17A/F-DNA" representerer en hypotetisk IL-17A/F-kodende nukleinsyresekvens av interesse. "Sammenlignet DNA" representerer nukleotidsekvensen til et nukleinsyremolekyl som "IL-17A/F-DNA"-nukleinsyremolekylet av interesse sammenlignes med, og "N", "L" og "V" alle står for forskjellige hypotetiske nukleotider.
Med mindre annet spesifikt er angitt er alle verdier for %-nukleinsyresekvensidentitet som anvendes heri erholdt som beskrevet i avsnittet umiddelbart ovenfor ved anvendelse av datamaskinprogrammet ALIGN-2. Verdier for %-nukleinsyresekvensidentitet kan imidlertid også erholdes som beskrevet nedenfor ved anvendelse av datamaskinprogrammet WU-BLAST-2 (Altschul et al., Methods in Enzymology, 266:460-480 (1996)). De fleste av søkeparameterne for WU-BLAST-2 settes til standardverdier. De parametere som ikke settes til standardverdier, dvs. de justerbare parameterne, innstilles med følgende verdier: overlap span = 1, overlap fraction = 0,125, word threshold (T) = 11 og poengmatrise = BLOSUM62. Dersom WU-BLAST-2 benyttes, bestemmes en verdi for %-nukleinsyresekvensidentitet ved å dividere (a) antall identiske nukleotider i nukleotidsekvensen til det IL-17A/F-polypeptidkodende nukleinsyremolekyl av interesse med en sekvens avledet fra den IL-17A/F-polypeptidkodende nukleinsyre med nativ sekvens og det sammenlignende nukleinsyremolekyl av interesse (dvs. sekvensen som det IL-17A/F-polypeptidkodende nukleinsyremolekyl av interesse sammenlignes med, som kan være en IL-17A/F-polynukleotidvariant), som bestemt av WU-BLAST-2 med (b) det totale antall nukleotider i det IL-17A/F-polypeptidkodende nukleinsyremolekyl av interesse. I for eksempel uttalelsen "et isolert nukleinsyremolekyl som omfatter en nukleinsyresekvens A som har eller omfatter minst 80% nukleinsyresekvensidentitet med nukleinsyresekvens B" er nukleinsyresekvens A det sammenlignede nukleinsyremolekyl av interesse, mens nukleinsyresekvens B er nukleinsyresekvensen til det IL-17A/F-polypeptidkodende nukleinsyremolekyl av interesse.
Prosent nukleinsyresekvensidentitet kan også bestemmes ved anvendelse av sekvenssammenligningsprogrammetNCBI-BLAST2 (Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25:3389-3402 (1997)). SekvenssammenligningsprogrammetNCBI-BLAST2 kan nedlastes fra http:// wvvw. ncbi. nlm. nih. gov eller erholdes på annet vis fra National Institute of Health, Bethesda, MD. NCBI-BLAST2 anvender flere søkeparametere, hvori alle søkeparametere settes til standardverdier, innbefattet for eksempel unmask = ja, strand = alle, forventede forekomster = 10, minimal lav-kompleksitetslengde = 15/5, multipass e-verdi = 0,01, konstant for multipass = 25, "dropoff'-verdi for den endelige sammenstilling med gap = 25 og poengmatrise = BLOSUM62.
I situasjoner hvor NCBI-BLAST2 benyttes for sekvenssammenligning, beregnes %-nukleinsyresekvensidentitet for en gitt nukleinsyresekvens C til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D (noe som alternativt kan uttrykkes som en gitt nukleinsyresekvens C som har eller omfatter en viss %-nukleinsyresekvensidentitet til, med eller mot en gitt nukleinsyresekvens D) som følger:
100 ganger brøken W/Z
hvor W er antall nukleotider som vurderes som identiske treff av sekvenssammen-stillingsprogrammet NCBI-BLAST2 i programmets sammenstilling av C og D, og hvor Z er det totale antall nukleotider i D. Det vil forstås at dersom lengden av nukleinsyresekvens C ikke er lik lengden av nukleinsyresekvens D, vil %-nukleinsyresekvensidentitet for C mot D ikke være lik %-nukleinsyresekvensidentitet for D mot C.
I andre utførelser er IL-17A/F-polynukleotidvarianter nukleinsyremolekyler som koder for et aktivt IL-17A/F-polypeptid og som kan hybridisere, fortrinnsvis under stringente hybridiserings- og vaskebetingelser, til nukleotidsekvenser som koder for et fullengde IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. IL-17A/F-polypeptidvarianter kan være polypeptider som kodes av en IL-17A/F-polynukleotidvariant.
"Isolert" anvendt ved beskrivelse av de forskjellige polypeptidene som beskrives heri, betyr et polypeptid som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en bestanddel av dets naturlige miljø. Kontaminerende bestanddeler av det naturlige miljø er materialer som typisk vil interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av polypeptidet, og kan omfatte enzymer, hormoner og andre oppløste proteiner eller ikke-proteiner. I foretrukne utførelser vil polypeptidet være renset (1) i en grad som er tilstrekkelig for erholdelse av minst 15 aminosyrerester med N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av et "spinning-cup"-sekvenseringsinstrument eller (2) til homogenitet vurdert ved SDS-PAGE under ikke-reduserende eller reduserende betingelser ved anvendelse av Coomassie blue eller fortrinnsvis sølvfarging. Isolert polypeptid omfatter polypeptid in situ i rekombinante celler, siden minst en bestanddel av IL-17A/F-polypeptidets naturlige miljø ikke vil foreligge. Vanligvis vil imidlertid isolert polypeptid være fremstilt ved minst et rensetrinn.
En "isolert" IL-17A/F-polypeptidkodende nukleinsyre eller en annen polypeptidkodende nukleinsyre er et nukleinsyremolekyl som er identifisert og separert fra minst et kontaminerende nukleinsyremolekyl med hvilket det vanligvis er forbundet i den naturlige kilde for den polypeptidkodende nukleinsyre. Et isolert polypeptidkodende nukleinsyremolekyl er forskjellig i form eller sammenheng fra molekylet som det forefinnes i naturen. Isolerte, polypeptidkodende nukleinsyremolekyler skiller seg følgelig fra det spesifikke polypeptidkodende nukleinsyremolekyl som det foreligger i naturlige celler. Et isolert polypeptidkodende nukleinsyremolekyl omfatter imidlertid polypeptidkodende nukleinsyremolekyler som foreligger i celler som vanligvis uttrykker polypeptidet dersom for eksempel nukleinsyremolekylet foreligger i en annen kromosomal lokalitet enn i naturlige celler.
Begrepet "kontrollsekvenser" viser til DNA-sekvenser som er nødvendige for ekspresjonen av en operativt tilkoblet kodende sekvens i en gitt vertsorganisme. Kontrollsekvensene som er egnet for prokaryoter omfatter for eksempel en promoter, om ønskelig en operatorsekvens og et ribosombindingssete. Eukaryote celler vites å benytte promotere, polyadenyleringssignaler og enhancere.
En nukleinsyre er "operativt tilkoblet" når den er plassert i en funksjonell sammenheng med en annen nukleinsyresekvens. For eksempel er DNA for en presekvens eller sekretorisk ledersekvens operativt koblet til DNA for et polypeptid dersom det uttrykkes som et preprotein som deltar i sekresjonen av polypeptidet, en promoter eller enhancer er operativt koblet til en kodende sekvens dersom den påvirker sekvensens transkripsjon; eller et ribosombindingssete er operativt koblet til en kodende sekvens dersom det er plassert slik at translasjonen fremmes. Generelt betyr "operativt koblet" at de sammenkoblede DNA-sekvensene er kontinuerlige, og når det gjelder en sekretorisk ledersekvens, kontinuerlige og i samme leseramme. Enhancere må imidlertid ikke nødvendigvis ikke være kontinuerlige. Sammenkoblingen oppnås ved ligering i egnede restriksjonsseter. Dersom slike seter ikke foreligger, anvendes syntetiske oligonukleotidadaptere eller linkere i samsvar med konvensjonell praksis.
"Stringensen" for hybridiseringsreaksjoner kan lett bestemmes av en gjennomsnitts fagperson og er generelt en empirisk beregning som avhenger av probelengden, vasketemperaturen og saltkonsentrasjonen. Generelt krever lengre prober høyere temperatur for korrekt hybridisering, mens kortere prober trenger lavere temperatur. Hybridisering avhenger generelt av evnen til denaturert DNA til å rehybridisere dersom komplementære tråder foreligger i et miljø under smeltetemperaturen. Jo høyere grad av ønsket homologi mellom proben og den hybridiserbare sekvens, jo høyere er den relative temperatur som kan anvendes. Som et resultat følger det at høyere relative temperaturer vil gjøre reaksjonsbetingelsene mer stringente, mens lavere temperaturer gjør dem mindre stringente. For ytterligere detaljer og en forklaring av stringensen i hybridiseringsreaksjoner, se Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Wiley Interscience Publishers (1995).
"Stringente betingelser" eller "betingelser med høy stringens" kan som begrepene er definert heri, identifiseres som betingelser som: (1) benytter lav ionestyrke og høy temperatur for vask, for eksempel 0,015 M natriumklorid/0,0015 M natriumcitrat/
0,1% natriumdodecylsulfat ved 50°C, (2) under hybridiseringen benytter et denatureringsmiddel, for eksempel formamid, for eksempel 50% (v/v) formamid med 0,1%) bovint serumalbumin/0,1% Ficoll/0,1% polyvinylpyrrolidon/50 mM natriumfosfat-buffer ved pH 6,5 med 750 mM natriumklorid, 75 mM natriumcitrat ved 42°C, eller (3) benytte 50% formamid, 5 x SSC (0,75 M NaCl, 0,075 M natriumciatrat), 50 mM natriumfosfat (pH 6,8), 0,1 % natriumpyrofosfat, 5 x Denhards løsning, ultralydbehandlet laksemelke-DNA (50 ug/ml), 0,1% SDS og 10% dekstransulfat ved 42°C, med vask ved 42°C i 0,2 x SSC (natriumklorid/natriumcitrat) og 50% formamid ved 55°C, fulgt av en høy-stringent vask bestående av 0,1 X SSC tilsatt EDTA ved 55°C.
"Betingelser med modrat stringens" kan identifiseres som beskrevet av Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Press, 1989, og omfatter anvendelse av en vaskeløsning og hybridiserings-betingelser (for eksempel temperatur, ionestyrke og %SDS) som er mindre stringente enn dem beskrevet ovenfor. Et eksempel på betingelser med moderat stringens er innkubering over natten ved 37°C i en løsning som omfatter: 20% formamid, 5 x SSC (150 mM NaCl, 15 mM trinatriumcitrat), 50 mM natriumfosfat (pH 7,6, 5 x Denhardts løsning, 10% dekstransulfat og 20 mg/ml denaturert, fragmenter laksemelke-DNA, fulgt av vask av filtrene i 1 x SSC ved tilnærmet 37-50°C. Fagpersonen vil vite hvordan temperatur, ionestyrke osv. kan justeres etter behov for tilpasning til faktorer som probe-lengde og lignende.
Begrepet "epitopmerket" viser når det anvendes heri til et kimert polypeptid som omfatter et IL-17A/F-polypeptid fusjonert til et "merkingspolypeptid". Merkingspolypeptidet har et tilstrekkelig antall aminosyrerester til å tilveiebringe en epitop som et antistoff kan fremstilles mot, men er likevel tilstrekkelig kort til at det ikke interfererer med aktiviteten til polypeptidet som det er fusjonert til. Merkingspolypeptidet er fortrinnsvis også temmelig unikt, slik at antistoffet ikke i vesentlig grad kryssreagerer med andre epitoper. Egnede merkingspolypeptider har generelt minst seks aminosyrerester, og vanligvis mellom tilnærmet 8 og 50 aminosyrerester (fortrinnsvis mellom tilnærmet 10 og 20 aminosyrerester).
Som anvendt heri betegner begrepet "immunadhesin" antistofflignende molekyler som kombinerer bindingsspesifisiteten til et heterologt protein (et "adhesin") med effektorfunksj onene til immunglobuliners konstante domener. Strukturelt omfatter immunadhesinene en fusjon mellom en aminosyresekvens med den ønskede bindingsspesifisitet som er forskjellig fra et antistoffs antigengjenkjennings- og bindingssete (dvs. at den er "heterolog"), og en konstant immunglobulindomenesekvens. Adhesindelen av et immunadhesinmolekyl er typisk en kontinuerlig aminosyresekvens som i det minste omfatter bindingssetet fra en reseptor eller en ligand. Den konstante immunglobulin-domenesekvensen i immunadhesinet kan være erholdt fra hvilket som helst immunglobulin, for eksempel av undertype IgG-1, IgG-2, IgG-3 eller IgG-4, IgA (innbefattet IgA-1 og IgA-2), IgE, IgD eller IgM.
Begrepet "antagonist" anvendes i sin bredeste betydning og omfatter ethvert molekyl som delvis eller fult ut blokkerer, inhiberer eller nøytraliserer en biologisk aktivitet forbundet med et nativt IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. På tilsvarende måte anvendes begrepet "agonist" i sin bredeste betydning og omfatter ethvert molekyl som etterligner en biologisk aktivitet forbundet med et nativt IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. Egnede agonist- eller antagonistmolekyler omfatter spesifikt agonistiske eller antagonistiske antistoffer eller antistoffragmenter, fragmenter eller aminosyresekvens varianter av native IL-17A/F-polypeptider, peptider, "antisense"-oligonukleotider, små organiske molekyler osv. Fremgangsmåter for identifisering av agonister eller antagonister av et IL-17A/F-polypeptid kan omfatte å sette et IL-17A/F-polypeptid i forbindelse med en kandidat for et agonistisk eller antagonistisk molekyl og måle en påvisbar endring i en eller flere biologiske aktiviteter som normalt er forbundet med IL-17A/F-polypeptidet.
"Behandling" viser til både terapeutisk behandling og profylaktisk eller forebyggende tiltak, hvori formålet er å forhindre eller retardere (redusere) den ønskede patologiske tilstand eller forstyrrelse. Individer med behov for behandling omfatter individer som allerede har forstyrrelsen, så vel som individer som er utsatt for å få forstyrrelsen, eller individer i hvilke forstyrrelsen skal forhindres.
"Kronisk" tilførsel viser til tilførsel av middelet eller midlene på en kontinuerlig måte, i motsetning til en akutt måte, slik at den innledende, terapeutiske virkning (aktivitet) bevares over et forlenget tidsrom. "Intermitterende" tilførsel er behandling som ikke utføres sammenhengende uten avbrudd, men som snarere er syklisk av natur.
"Pattedyr" viser for behandlingsformål til hvilket som helst dyr som er klassifisert som et pattedyr, innbefattet mennesker, husdyr og gårdsdyr og dyr i zoologiske hager, sportsdyr eller kjæledyr, for eksempel hunder, katter, storfe, hester, sauer, griser, geiter, kaniner osv. Pattedyret er fortrinnsvis et menneske.
Tilførsel "i kombinasjon med" et eller flere andre terapeutiske midler omfatter samtidig (parallell) og påhverandre følgende tilførsel i hvilken som helst rekkefølge.
"Bærestoffer" omfattes som anvendt heri farmasøytisk aksepterbare bærestoffer, eksipienter eller stabilisatorer som er ikke-toksiske for cellen eller pattedyret som eksponeres ovenfor den i de benyttede doser og konsentrasjoner. Det fysiologisk aksepterbare bærestoff er ofte en vandig, pH-bufret løsning. Eksempler på fysiologisk aksepterbare bærestoffer omfatter buffere som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter, innbefattet askorbinsyre, lavmolekylære polypeptider (med færre enn tilnærmet 10 aminosyrerester), proteiner, for eksempel serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer, for eksempel polyvinylpyrrolidon, aminosyrer som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og
andre karbohydrater, innbefattet glukose, mannose eller dekstriner, chelateringsmidler, for eksempel EDTA, sukkeralkoholer som mannitol eller sorbitol, saltdannende motioner, for eksempel natrium, og/eller ikke-ioniske surfaktanter som TWEEN, polyetylenglykol
(PEG) og PLURONICS.
Begrepet "antistoff anvendes i sin bredeste betydning og dekker spesifikt for eksempel enkeltvise monoklonale anti-IL 17A/F-antistoffer (innbefattet agonistiske, antagonistiske og nøytraliserende antistoffer), anti-IL-17A/F-antistoffpreparater med polyepitopisk spesifisitet (for eksempel bispesifikke antistoffer, så lenge som de viser den ønskede biologiske aktivitet), polyklonale antistoffer, enkeltkjedede anti-IL- 17A/F-antistoffer og fragmenter av anti-IL-17A/F-antistoffer (se nedenfor), så lenge som de viser den ønskede biologiske eller immunologiske aktivitet. Begrepet "immunglobulin"
(lg) anvendes om hverandre med antistoff heri.
Et "isolert antistoff er et antistoff som har blitt identifisert og separert og/eller gjenvunnet fra en bestanddel av sitt naturlige miljø. Kontaminerende bestanddeler av det naturlige miljø er materialer som vil interferere med diagnostiske eller terapeutiske anvendelser av antistoffet, og kan omfatte enzymer, hormoner og andre oppløste proteiner eller ikke-proteiner. I foretrukne utførelser vil antistoffet være renset (1) til mer enn 95% (vekt/vekt) antistoff, bestemt ved Lovvry-fremgangsmåten, og mest foretrukket mer enn 99% (vekt/vekt), (2) i en grad som er tilstrekkelig for erholdelse av minst 15 aminosyrerester med N-terminal eller intern aminosyresekvens ved anvendelse av et
"spinning-cup"-sekvenseringsinstrument, eller (3) til homogenitet ved SDS-PAGE under reduserende eller ikke-reduserende betingelser ved anvendelse av Coomassie bluoe eller fortrinnsvis sølvfarging. Isolert antistoff omfatter antistoffet in situ i rekombinante celler, siden minst en bestanddel av antistoffets naturlige miljø ikke vil foreligge. Vanligvis vil imidlertid isolert antistoff være fremstilt ved minst et rensetrinn.
Den basale antistoffenheten med 4 kjeder er et heterotetramert glykoprotein som består av to identiske lettkjeder (L-kjeder) og to identiske tungkjeder (H-kjeder) (et IgM-antistoff består av 5 av den basale heterotetramerenhet sammen med ytterligere et polypeptid som betegnes J-kjeden og inneholder følgelig 10 antigenbindende seter, mens utskilte IgA-antistoffer kan polymerisere og danne polyvalente sammensetninger som omfatter 2-5 av den basale enhet med 4 kjeder sammen med J-kjede). Når det gjelder IgG er enheten på 4 kjeder generelt på tilnærmet 150 000 dalton. Hver L-kjede er koblet til en H-kjede via en kovalent disulfidbinding, mens de to H-kj edene er koblet til hverandre via en eller flere disulfidbindinger avhengig av H-kjedens isotype. Hver H- og L-kjede har også intrakjede-disulfidbroer med en regelmessig avstand mellom seg. Hver H-kjede har i N-enden et variabelt domene (VH), fulgt av tre konstante domener (CH) for a- og y-kjeder og fire CH-domener for u- og e-isotypene. Hver L-kjede har i N-enden et variabelt domene (VL), fulgt av et konstant domene (CL) i den andre enden. VLsammenstilles med VH og CLsammenstilles med det første konstante domenet i tungkjeden (CH1). Spesielle aminosyrerester antas å danne en grenseflate mellom lettkjedens og tungkjedens variable domene. Paringen av et VH-domene og et VL-domene fører til dannelse av et enkelt antigenbindende sete. For de forskjellige antistoff-klassenes struktur og egenskaper, se for eksempel Basic and Clinical Immunology, 8. utgave, Daniel P. Stites, Abba I. Terr og Tristram G. Parslow (red)., Appleton & Lange, Norwalk, CT, 1994, s. 71 og kapitel 6. L-kjeden fra hvilken som helst vertebrat art kan tilskrives en av to klart forskjellige typer betegnet kappa og lambda, basert på aminosyresekvensene i de konstante domener. Avhengig av aminosyresekvensen i det konstante domenet i tungkjedene (CH), kan immunglubliner tilskrives forskjellige klasser eller isotyper. Det finnes fem klasser av immunglobuliner: IgA, IgD, IgE, IgG og TgM, som har tungkjeder betegnet a, 8, e, y henholdsvis \ i. y- og a-klassen er videre oppdelt i underklasser basert på relativt små forskjeller i CH-sekvens og -funksjon, for eksempel uttrykker mennesker følgende underklasser: IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgAl og IgA2.
Begrepet "variabelt" viser til det faktum at disse segmenter i de variable domenene har svært forskjellig sekvens i forskjellige antistoffer. V-domenet formidler antigenbindingen og definerer et gitt antistoffs spesifisitet for sitt tilhørende antigen. Variabiliteten er imidlertid ikke jevnt fordelt over de 110 aminosyrene som foreligger i de variable domenene. I stedet består V-områdene av relativt lite variable strekk på 15-30 aminosyrer som betegnes rammeverkområder (FR), separert av kortere områder med ekstrem variabilitet betegnet "hypervariable områder", hvert med en lengde på 9-12 aminosyrer. De variable domenene i native tungkjeder og lettkjeder omfatter alle fire FR, som stort sett inntar en p-platekonfigurasjon, sammenbundet av tre hypervariable områder som danner løkker som sammenbinder og i noen tilfeller utgjør en del av p-platestrukturen. De hypervariable områdene i hver kjede holdes nær hverandre av FR og bidrar sammen med de hypervariable områdene fra den andre kjeden til dannelsen av antistoffets antigenbindende sete (se Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991)). De konstante domenene deltar ikke direkte i bindingen av et antistoff til et antigen, men fremviser forskjellige effektorfunksjoner, for eksempel deltagelse av antistoffet i antigenavhengig, cellulær cytotoksisitet (ADCC).
Begrepet "hypervariabelt område" viser, når det anvendes heri, til de aminosyrerester i et antistoff som er ansvarlige for antigenbindingen. Det hypervariable området omfatter generelt aminosyrerester fra et "komplementaritetsbestemmende område" eller "CDR" (for eksempel tilnærmet aminosyrerestene 24-34 (LI), 50-56 (L2) og 89-97 (L3) i VL, og tilnærmet 1-35 (Hl), 50-65 (H2) og 95-102 (H3) i VH, Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5. utgave, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991) og/eller aminosyrerestene fra en "hypervariabel løkke" (for eksempel aminosyrerestene 26-32 (LI), 50-52 (L2) og 91-96
(L3) i VLog 26-32 (Hl), 53-55 (H2) og 96-101 (H3) i VH, Chothia og Lesk, J. Mol. Biol., 196:901-917(1987)).
Begrepet "monoklonalt antistoff viser, som anvendt heri, til et antistoff som er erholdt fra en populasjon av i det vesentlige homogene antistoffer, dvs. at de enkelte antistoffene som utgjør populasjonen er identiske, bortsett fra mulige naturlig forekommende mutasjoner som kan foreligge i mindre mengder. Monoklonale antistoffer er svært spesifikke og er rettet mot et enkelt antigensete. I motsetning til polyklonale antistoffpreparater, som omfatter forskjellige antistoffer som er rettet mot forskjellige determinanter (epitoper), er videre hvert monoklonale antistoff rettet mot en enkelt determinant på antigenet. I tillegg til spesifisiteten er de monoklonale antistoffene fordelaktige ved at de kan syntetiseres uten å være kontaminert med andre antistoffer. Adjektivetet "monoklonalt" skal ikke omfattes til å kreve at antistoffet er fremstilt ved en gitt fremgangsmåte. For eksempel kan de monoklonale antistoffene som er anvendbare i den foreliggende oppfinnelse være fremstilt ved hybridommetodologien, først beskrevet av Kohler et al., Nature, 256:495 (1975), eller de kan være fremstilt ved anvendelse av rekombinante DNA-fremgangsmåter i bakterieceller, eukaryote dyreceller eller planteceller (se for eksempel US Patentskrift nr. 4 816 567). De "monoklonale antistoffene" kan også være isolert fra antistoff-bakteriofagbiblioteker ved anvendelse av teknikkene som for eksempel beskrives i Clackson et al., Nature, 352:624-628 (1991) og Marks et al., J. Mol. Biol., 222:581-597 (1991).
De monoklonale antistoffene heri omfatter "kimere" antistoffer i hvilke en del av tungkjeden og/eller lettkjeden er identisk eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra en gitt art eller tilhørende en gitt antistoffklasse eller -underklasse, mens resten av kjeden eller kjedene er identisk eller homolog med tilsvarende sekvenser i antistoffer avledet fra en annen art eller tilhørende en annen antistoffklasse eller - underklasse, så vel som fragmenter av slike antistoffer, så lenge som de viser den ønskede, biologiske aktivitet (se US patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:6851-6855 (1984)). Kimere antistoffer av interesse heri omfatter "primatiserte" antistoffer som omfatter antigenbindende sekvenser i de variable domenene som er avledet fra en ikke-menneskelig primat (for eksempel "hesfape, ape osv.) og humane konstante områdesekvenser.
Et "intakt" antistoff er et antistoff som omfatter et antigenbindende sete så vel som et Cfdomene og i det minste de konstante tungkjededomenene, CH1, CH2 og CH3. De konstante domenene kan være konstante domener med nativ sekvens (for eksempel humane, konstante domener med nativsekvens) eller aminosyresekvensvarianter derav. Det intakte antistoff har fortrinnsvis en eller flere effektorfunksjoner.
"Antistoffragmenter" omfatter en del av et intakt antistoff, fortrinnsvis det intakte antistoff antigenbindende eller variable område. Eksempler på antistoffragmenter omfatter Fab, Fab', F(ab')2og Fv-fragmenter, diastoffer, lineære antistoffer (se US
patentskrift nr. 5 641 870, Eksempel 2, Zapata et al., Protein Eng., 8(10): 1057-1062
(1995)), enkeltkjedede antistoffmolekyler og multispesifikke antistoffer dannet av antistoffragmenter.
Papainkløyving av antistoffer fører til dannelse av to identiske antigenbindende fragmenter som betegnes "Fab"-fragmenter, og et gjenværende "Fc"-fragment, en betegnelse som gjenspeiler evnen til lett å krystallisere. Fab-fragmentet består av en hel L-kjede, sammen med H-kjedens variable domene (VH), og det første, konstante domenet fra en tungkjede (CH1). Hvert Fab-fragment er monovalent når det gjelder antigenbinding, dvs. at det har et enkelt antigenbindende sete. Pepsinbehandling av et antistoff gir et enkelt, stort F(ab')2-fragment som grovt sett tilsvarerer to disulfidsammenbundne Fab-fragmenter som har divalent antigenbindende aktivitet og som fortsatt kan kryssbinde antigen. Fab'-fragmenter skiller seg fra Fab-fragmenter ved at de har noen få ekstra aminosyrerester i karboskyenden av CH1-domenet, innbefattet en eller flere cysteinrester fra antistoffets hengselområde. Fab'-SH er betegnelsen heri for Fab' i hvilket cysteinresten eller -restene i de konstante domener bærer en fri tiolgruppe. F(ab')2-antistoffragmenter ble opprinnelig fremstilt som par av Fab'-fragmenter med hengselcysteiner mellom seg. Andre former for kjemisk sammenkobling av antistoff-fragmenter er også kjente.
Fc-fragmentet omfatter de to H-kjedenes karboksyterminale deler sammenholdt ved hjelp av disulfidbroer. Antistoffenes effektorfunksjoner bestemmes av sekvenser i Fc-området, og dette området er også den del som gjenkjennes av Fc-reseptorer (FcR), som forefinnes på visse celletyper.
"Fv" er det minimale antistoffragment som inneholder et fullstendig antigenkjenkjennings- og -bindingssete. Dette fragmentet består av en dimer av et variabelt tungkjededomene og et variabelt lettkjededomene i tett, ikke-kovalent assosiasjon. Ved foldingen av disse to domenene fremkommer seks hypervariable løkker (3 løkker fra H-kjeden og 3 fra L-kjeden) som bidrar med aminosyrerester for antigenbinding og som gir antistoffet dets antigenbindende spesifisitet. Imidlertid har selv et enkelt, variabelt domene (eller halvparten av et Fv, som kun omfatter tre CDR som er spesifikke for et antigen) evnen til å gjenkjenne og binde antigen, om enn med lavere affinitet enn det intakte bindingssetet.
"Enkeltkjedet Fv", også forkortet "sFv" eller "scFv", er antistoffragmenter som omfatter antistoffet VH- og VL-domenet sammenbundet i en enkelt polypeptidkjede. sFv-polypeptidet omfatter fortrinnsvis videre en polypeptidlinker mellom VH- og VL-domenet som gjør det mulig for sFv å danne den ønskede struktur for antigenbinding. For en oversikt over scFv, se Pluckthun i The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, bind 113, Rosenburg og Moore, red., Springer-Verlag, New York, s. 269-315 (1994), Borrebaeck 1995, infra.
Begrepet "diastoffer" viser til små antistoffragmenter som er fremstilt ved å konstruere sFv-fragmenter (se avsnittet ovenfor) med kortere linkere (tilnærmet 5-10 aminosyrerester) mellom VH- og VL-domenet, slik at det oppnås interkjedeparing, men ikke intrakjede paring mellom V-domenene, noe som fører til et bivalent fragment, dvs. et fragment med to antigenbindende seter. Bispesifikke diastoffer er heterodimerer av to "overkrysnings"-sFv-fragmenter i hvilke VH- og VL-domenet fra de to antistoffene foreligger på forskjellige polypeptidkjeder. Diastoffer beskrives mer fullstendig i for eksempel EP 404 097, WO 93/11161; og Hollinger et al., Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 90:6444-6448 (1993).
"Humaniserte" former av ikke-humane antistoffer (for eksempel fra gnagere) er kimere antistoffer som inneholder minimal sekvens avledet fra det ikke-humane antistoff. Stort sett er humaniserte antistoffer humane immunglobuliner (mottakerantistoff) i hvilke aminosyrerester fra et hypervariabelt område i mottakeren er erstattet med aminosyrerester fra et hypervariabelt område fra en ikke-mennskelig art (et donorantistoff), for eksempel mus, rotte, kanin eller ikke-menneskelig primat, med den ønskede antistoff-spesifisitet, affinitet og kapabilitet. I noen tilfeller er rammeverk (FR)-aminosyrerester i det humane immunglobulin erstattet med tilsvarende ikke-humane aminosyrerester. Videre kan humaniserte antistoffer omfatte aminosyrerester som verken forefinnes i mottakerantistoffet eller i donorantistoffet. Disse modifikasjonene innføres for ytterligere å forfine antistoffets yteevne. Generelt vil det humaniserte antistoff omfatte i det vesentlige hele av minst et og typisk to variable domener, i hvilke alle eller i det vesentlige alle de hypervariable løkkene tilsvarer løkker fra et ikke-humant immunglobulin og alle eller i det vesentlige alle FR er FR fra en human immunglobulinsekvens. Det humaniserte antistoff vil også om ønskelig omfatte i det minste en del av et konstant immunglobulinområde (Fc), typisk fra et humant immunglobulin. For ytterligere detaljer, se Jones et al., Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann et al., Nature, 332:323-329 (1998) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol., 2:593-596 (1992).
Et "artsavhengig antistoff, for eksempel et anti-humant IgE-antistoff fra et pattedyr, er et antistoff som har høyere bindingsaffinitet for et antigen fra en første pattedyrsart enn for en homolog av antigenet fra en andre pattedyrsart. Normalt vil det artsavhengige antistoff "bindes spesifikt" til et humant antigen (dvs. at det har en bindingsaffinitetsverdi (Kd) på ikke mer enn tilnærmet 1x10" M, fortrinnsvis ikke mer enn tilnærmet 1x10" og mest foretrukket ikke mer enn tilnærmet 1x10" M), men har en bindingsaffinitet for en homolog av antigenet fra en andre, ikke-menneskelig pattedyrsart som er minst tilnærmet 50 ganger, minst tilnærmet 500 ganger, eller minst tilnærmet 1000 ganger svakere enn bindingsaffinitetenfor det humane antigen. Det artsavhengige antistoff kan være av hvilken som helst av de forskjellige antistofftypene som er definert ovenfor, men er fortrinnsvis et humanisert eller humant antistoff.
Et "IL-17A/F-bindende oligopeptid" er et peptid som bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. IL-17A/F-bindende oligopeptider kan syntetiseres kjemisk ved anvendelse av kjent metodologi for oligopeptidsyntese, eller fremstilles og renses ved anvendelse av rekombinant teknologi. IL-17A/F-bindende oligopeptider har vanligvis en lengde på minst tilnærmet 5 aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19,
20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39,40, 41,42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69,70, 71, 72, 73,74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 aminsyrer eller mer, hvori slike oligopeptider kan bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. IL-17A/F-bindende oligopeptider kan identifiseres uten omfattende eksperimentering eller anvendelse av velkjente teknikker. I denne sammenheng skal det bemerkes at teknikker for gjennomsøking av oligopeptidbiblioteker etter oligopeptider som spesifikt kan bindes til et polypeptidmål, er velkjente innen faget (se for eksempel US patentskrift nr. 5 556 762, 5 750 373, 4 708 871, 4 833 092, 5 223 409, 5 403 484, 5 571 689, 5 663 143, PCT-publikasjonene WO 84/03506 og WO84/03564, Geysen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A.. 81:3998-4002 (1984); Geysen et al., Proe. Nati. Acad. Sei. U. S. A.. 82:178-182
(1985); Geysen et al., i Svnthetic Peptides as Antigens.130-149 (1986); Geysen et al, L Immunol. Meth.. 102:259-274 (1987); Schoofs et al, J. Immunol.. 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al. (1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 87:6378; Lowman, H.B. et al.
(1991) Biochemistrv. 30:10832; Clackson, T. et al. (1991) Nature. 352: 624; Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol.. 222:581; Kang, A.S. et al. (1991) Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 88:8363 og Smith, G. P. (1991) Current Opin. Biotechnol.. 2:668).
Et "IL-17A/F-bindende organisk molekyl" er et organisk molekyl som ikke er et oligopeptid eller antistoff som definert heri, og som bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. IL-17A/F-bindende organiske molekyler kan påvises og syntetiseres kjemisk ved anvendelse av kjent metodologi (se for eksempel PCT-publikasjonene WO 00/00823 og WO 00/39585). IL-17A/F-bindende, organiske molekyler har vanligvis en størrelse på mindre enn tilnærmet 2000 dalton, alternativt mindre enn tilnærmet 1500, 750, 500, 250 eller 200 dalton, hvor slike organiske molekyler som kan bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri, kan identifiseres uten omfattende eksperimentering ved anvendelse av velkjente teknikker. I denne sammenheng skal det bemerkes at teknikker for gjennomsøking av biblioteker av organiske molekyler eller molekyler som kan bindes til et polypeptidmål er velkjente innen faget (se for eksempel PCT-publikasj onene WO 00/00823 og WO 00/39585).
Et antistoff, oligopeptid eller annet organiske molekyl som "binder" et antigen av interesse, for eksempel et tumorassosiert polypeptidantigenmål, er et molekyl som binder antigenet med en tilstrekkelig affinitet til at antistoffet, oligopeptidet eller det andre organiske molekyl er anvendbart som et diagnostisk og/eller terapeutisk middel rettet mot en celle eller et vev som uttrykker antigenet og ikke i vesentlig grad kryssreagerer med andre proteiner. I slike utførelser vil graden av binding av antistoffet, oligopeptidet eller det andre organiske molekyl til et "ikke-målprotein" være lavere enn tilnærmet 10% av bindingen av antistoffet, oligopeptidet eller det andre organiske molekyl til sitt tilhørende målprotein, bestemt ved fluorescensaktivert cellesortering (FACS)-analyse eller radio-immunutfelling (RIA). Når det gjelder binding av et antistoff, oligopeptid eller et annet organisk molekyl til et målmolekyl, betyr begrepet "spesifikk binding", "bindes spesifikt til " eller er "spesifikt for" et gitt polypeptid eller en epitop på et gitt polypeptidmål en binding som målbart er forskjellig fra en uspesifikk interaksjon. Spesifikk binding kan for eksempel måles ved å bestemme bindingen av et molekyl sammenlignet med bindingen av et kontrollmolekyl, som generelt er et molekyl med lignende struktur som ikke har bindingsaktivitet. For eksempel kan spesifikk binding bestemmes ved konkurranse med et kontrollmolekyl som ligner målmolekylet, for eksempel et overskudd av umerket mål. I dette tilfellet vises spesifikk binding dersom bindingen av det merkede målmolekyl til en probe inhiberes kompetitivt av et overskudd av umerket målmolekyl. Begrepet "spesifikk binding", "bindes spesifikt til" eller er "spesifikt for" et gitt polypeptid, eller en epitop på et gitt polypeptidmål som anvendt heri kan for eksempel fremvises av et molekyl med en Kd for målmolekylet på minst tilnærmet IO"<4>M, alternativt minst tilnærmet IO"<5>M, alternativt minst tilnærmet IO"<6>M, alternativt minst tilnærmet 10" V M, alternativt minst tilnærmet 10" fl M, alternativt minst tilnærmet 10" Q M, alternativt minst tilnærmet 10"<10>M, alternativt minst tilnærmet 10"<11>M, alternativt minst tilnærmet 10" 12 M eller mer. I en utførelse viser begrepet "spesifikk binding" til binding hvor et molekyl bindes til et gitt polypeptid eller en epitop på et gitt polypeptid uten i vesentlig grad å bindes til et annet polypeptid eller en annen polypeptidepitop.
Et antistoff, et oligopeptid eller et annet organisk molekyl som "inhiberer veksten av tumorceller som uttrykker et IL-17A/F-polypeptid" eller et "vekstinhiberende" antistoff, oligopeptid eller annet organisk molekyl er et molekyl som fører til en målbar inhibering av veksten av kreftceller som uttrykker eller overuttrykker det angjeldende IL-17 A/F-polypeptid. Foretrukne vekstinhiberende anti-IL-17A/F-antistoffer, oligopeptider eller organiske molekyler inhiberer veksten av IL-17A/F-uttrykkende tumorceller med mer enn 20%, fortrinnsvis fra tilnærmet 20% til tilnærmet 50%, og enda mer foretrukket med mer enn 50% (for eksempel fra tilnærmet 50% til tilnærmet 100%), sammenlignet med en egnet kontroll, hvor kontrollen typisk er tumorceller som ikke er behandlet med antistoffet, oligopeptidet eller det andre organiske molekylet som skal analyseres. I en utførelse kan vekstinhibering måles ved en antistoffkonsentrasjon på fra tilnærmet 0,1 til 30 ug/ml eller fra tilnærmet 0,5 nM til 200 nM i cellekultur, hvor vekstinhiberingen måles 1-10 dager etter at tumorcellene har blitt disponert ovenfor antistoffet. Vekstinhibering av tumorceller in vivo kan måles på forskjellige måter. Atistoffet er vekstinhiberende in vivo dersom tilførsel av anti-IL-17A/F-antistoffet i en dose på fra tilnærmet 1 ug/kg til tilnærmet 100 mg/kg kroppsvekt fører til en reduksjon av tumorstørrelsen eller tumorcelleproliferasjonen i løpet av fra tilnærmet 5 dager til 3 måneder etter første gangs tilførsel av antistoffet, fortrinnsvis i løpet av tilnærmet 5 til 30 dager.
Et antistoff, oligopeptid eller annet organisk molekyl som "induserer apoptose" er et molekyl som induserer programmert celledød, bestemt ved binding av anneksin V, fragmentering av DNA, krymping av cellen, fortynning av det endoplasmatiske retikulum, cellefragmentering og/eller dannelse av membranvesikler (betegnet apoptose legemer). Cellen er vanligvis en celle som overuttrykker et IL-17A/F-polypeptid. Cellen er fortrinnsvis en tumorcelle, for eksempel en prostatacelle, brystcelle, ovariecelle, magecelle, endometrium celle, lungecelle, nyrecelle, koloncelle eller urinblærecelle. Forskjellige fremgangsmåter er tilgjengelige for evaluering av de cellulære begivenheter som er forbundet med apoptose. For eksempel kan translokalisering av fosfatidylserin (PS) måles ved anneksinbinding, DNA-fragmentering kan evalueres med DNA-stigedannelse og kjernekondensering/kromatinkondensering sammen med DNA-fragmentering kan evalueres ved en økning av hypodiploide celler. Antistoffet, oligopeptidet eller det andre organiske molekyl som induserer apoptose er fortrinnsvis et molekyl som fører til fra tilnærmet 2-50 ganger, fortrinnsvis fra tilnærmet 5 til 50 ganger, og mest foretrukket fra tilnærmet 10 til 50 gangers induksjon av anneksinbinding, sammenlignet med ubehandlede celler i en anneksinbindingsanalyse.
Antistoffers "effektorfunksjoner" viser til de biologiske aktiviteter som kan tilskrives Fc-området (et Fc-område med nativ sekvens eller et Fc-område med en aminosyresekvensvariant) i et antistoff og varierer med antistoffets isotype. Eksempler på antistoffers effektorfunksjoner omfatter: Clq-binding og komplementavhengig cytotoksisitet, Fc-reseptorbinding, antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet (ADCC), fagocytose, nedregulering av celleoverflatereseptorer (for eksempel B-cellereseptor) og B-celleaktivering. "Antistoffavhengig celleformidlet cytotoksisitet" eller "ADCC" viser til en form for cytotoksisitet i hvilken utskilt lg bundet til Fc-reseptorer (FcR), som foreligger på visse cytotoksiske celler (for eksempel naturlige dreperceller (NK-celler), neutrofile celler og makrofager) gjør det mulig for disse cytotoksiske effektorcellene å bindes spesifikt til en antigenbærende målcelle, og deretter drepe målcellen med cytotoksiner. Antistoffene "bevæpner" de cytotoksiske cellene og er absolutt nødvendige for slik dreping. Primærcellene for formidling av ADCC, NK-cellene, uttrykker kun FcyRIII, mens monocytter uttrykker FcyRI, FcyRII og FcyRIII. FcR-ekspresjonen på hematopoietiske celler er oppsummert i Tabell 3 på side 464 i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-92 (1991). For måling av ADCC-aktiviteten til et molekyl av interesse, kan en in v/Yro-ADCC-analyse, for eksempel analysen som beskrives i US patentskrift nr. 5 500 362 eller 5 821 337, utføres. Anvendbare effektorceller for slike analyser omfatter mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) og naturlige dreperceller (NK-celler). Alternativt eller i tillegg kan ADCC-aktiviteten av molekylet av interesse vurderes in vivo, for eksempel i en dyremodell, for eksempel modellen som beskrives i Clynes et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA; 95:652-656 (1998). "Fc-reseptor" eller "FcR" beskriver en reseptor som bindes til et antistoff Fc-område. Den foretrukne FcR er en human FcR med nativ sekvens. Videre er en foretrukket FcR en FcR som binder et IgG-antistoff (en gamma-reseptor) og omfatter reseptorer fra underklassene FcyRI, FcyRII og FcyRIII, innbefattet alleliske varianter og alternativt spleisede former av disse reseptorene. FcyRII-reseptorene omfatter FcyRIIA
(en "aktiverende reseptor") og FcyRIIB (en "inhiberende reseptor"), som har aminosyresekvenser som ligner hverandre, og som hovedsakelig er forskjellige i de cytoplasmatiske domener. Den aktiverende reseptor FcyRIIA inneholder et tyrosinbasert immunreseptor-aktiveringsmotiv (ITAM) i sitt cytoplasmatiske domene. Den inhiberende reseptor FcyRIIB inneholder et tyrosinbasert immunreseptorinhiberingsmotiv (ITIM) i sitt cytoplasmatiske domene, (se oversikt M i Daeron, Annu. Rev. Immunol, 15:203-234
(1997)). En oversikt over FcR gis i Ravetch og Kinet, Annu. Rev. Immunol, 9:457-492
(1991), Capel et al, Immunomethods, 4:25-34 (1994), og de Haas et al, J. Lab. Clin. Med, 126:330-41 (1995). Andre FcR, innbefattet slike som vil bli påvist i fremtiden, omfattes av begrepet "FcR" heri. Begrepet omfatter også den neonatale reseptor, FcRn, som er ansvarlig for overføringen av maternelle IgG til fosteret (Guyer et al, J. Immunol, 117:587 (1976) og Kim et al, J. Immunol, 24:249 (1994)). "Humane effektorceller" er leukocytter som uttrykker en eller flere FcR og utfører effektorfunksjoner. Cellene utrykker fortrinnsvis i det minste FcyRIII og utfører ADCC-effektorfunksjonen. Eksempler på humane leukocytter som formidler ADCC omfatter mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), naturlige dreperceller (NK-celler) monocytter, cytotoksiske T-celler og neutrofile celler, hvor PBMC og NK-celler foretrekkes. Effektorcellene kan isoleres fra en nativ kilde, for eksempel fra blod. "Komplementavhengig cytotoksisitet" eller "CDC" viser til lysering av en målcelle i nærvær av komplement. Aktiveringen av den klassiske komplement-reaksjonsvei utløses ved binding av en første bestanddel av komplementsystemet (Clq) til antistoffer (fra en egnet underklasse) som er bundet til sitt tilhørende antigen. For måling av komplementaktivering kan en CDC-analyse utføres, for eksempel som beskrevet i Gazzano-Santoro et al, J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).
Begrepet "merkingsgruppe" viser, når det anvendes heri, til en påvisbar forbindelse eller sammensetning som direkte eller indirekte er konjugert til antistoffet, slik at det dannes et "merket" antistoff. Merkingsgruppen kan være påvisbar i seg selv (for eksempel radioaktive isotoper eller fluorescerende merkingsgrupper) eller, når det gjelder en enzymatisk merkingsgruppe, kunne katalysere en kjemisk endring av en substansforbindelse eller en substratsammensetning som er påvisbar.
Med "fast fase" menes et ikke-vandig støttemiddel som antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan festes til. Eksempler på faste faser som omfattes heri omfatter faste faser som delvis eller fullstendig er dannet av glass (for eksempel glass med kontrollert porestørrelse), polysakkarider (for eksempel agarose), polyakrylamider, polystyren, polyvinylalkohol og silikoner. I visse utførelser kan, avhengig av sammenhengen, den faste fase omfatte en brønn i en analyseplate, i andre er den en rensingskolonne (for eksempel en affinitetskromatografikolonne). Begrepet omfatter også en diskontinuerlig fastfase bestående av adskilte partikler, for eksempel partiklene som beskrives i US patentskrift nr. 4 275 149.
Et "liposom" er en liten vesikkel som er sammensatt av forskjellige typer av lipider, fosfolipider og/eller surfaktanter og som er anvendbar for tilførsel av medikament (for eksempel et IL-17A/F-polypeptid eller et antistoff mot dette) til et pattedyr. Liposomets bestanddeler er vanligvis arrangert i en dobbeltsjikt formasjon som ligner lipidarrangementet i biologiske membraner.
Et "lite molekyl" er heri definert til å ha en molekylvekt som er under tilnærmet 500 dalton.
Begrepet "modulere" betyr å påvirke (for eksempel enten å oppregulere, nedregulere eller på annet vist kontrollere) nivået av en signalvei. Cellulære prosesser som kontrolleres ved signaloverføring omfatter, men er ikke begrenset til, transkripsjonen av spesifikke gener, normale cellulære funksjoner, for eksempel metabolisme, proliferasjon, differensiering, adhesjon, apoptose og overlevelse, så vel som unormale prosesser som transformasjon, blokkering av differensiering og metastase. "Aktiv" eller "aktivitet" viser for formålene heri til en eller flere fonner av et IL-17 A/F-polypeptid som har bevart en biologisk og/eller immunologisk aktivitet forbundet med native eller naturlig forekommende IL-17A/F-polypeptider, hvori "biologisk" aktivitet viser til en biologisk funksjon (enten inhiberende eller stimulerende) som forårsakes av et nativt eller naturlig forekommende IL-17A/F-polypeptid, bortsett fra evnen til å indusere dannelsen av et antistoff mot en antigen epitop som foreligger i et nativt eller naturlig forekommende IL-17A/F-polypeptid, mens en "immunologisk" aktivitet viser til evnen til å indusere dannelsen av et antistoff mot en antigen epitop som foreligger i et nativt eller naturlig forekommende IL-17 A/F-polypeptid. En foretrukket biologisk aktivitet omfatter induksjon av aktivering av NF-kB og stimulering av dannelsen av de proinflammatoriske kjemokinenen IL-8 og IL-6. En annen foretrukket biologisk aktivitet omfatter stimulering av proliferasjonen av T-lymfocytter. En annen foretrukket biologisk aktivitet omfatter for eksempel frigjøringen av TNF-a fra THP1-celler. En annen aktivitet omfatter en økning av matrikssyntesen i leddbrusk. Alternativt omfatter en annen aktivitet en fremming av nedbrytningen av bruskmatriks i ledd, så vel som en inhibering av matrikssyntesen. En annen foretrukket biologisk aktivitet omfatter en modulering av nivået av interleukin- 17-signalveien under milde til alvorlige stadier av inflammatorisk tarmsykdom, eller under slag.
En "immunologisk" aktivitet viser kun til evnen til å indusere dannelsen av et antistoff mot en antigen epitop som foreligger i et nativt eller naturlig forekommende IL-17 A/F-polypeptid. "Degenerativ bruskforstyrrelse" beskriver en rekke forskjellige forstyrrelser som hovedsakelig særpreges ved at bruskmatriks ødelegges. Andre patologiske funn omfatter dannelse av nitrogenoksid og forhøyet nedbrytning av proteoglykaner. Eksempler på forstyrrelser som omfattes av denne definisjonen innbefatter for eksempel artritt (for eksempel osteoartritt, reumatoid artritt, psoriatrisk artritt).
Begrepet "immunrelatert sykdom" betyr en sykdom i hvilken en bestanddel av et pattedyrs immunsystem fører til, formidler eller på annet vis bidrar til en sykdomstilstand i pattedyret. Også omfattet er sykdommer i hvilke en stimulering eller intervensjon av immunresponsen har en lindrende virkning på sykdomsforløpet. Innbefattet i dette begrepet er immunmedierte betennelsessykdommer, ikke-immunmedierte betennelsessykdommer, infeksjonssykdommer, immunsvikt sykdommer, neoplasi osv.
Begrepet "T-cellemediert sykdom" betyr en sykdom i hvilken T-celler direkte eller indirekte formidler eller på annet vis bidrar til en sykdomstilstand i et pattedyr. Den T-cellemedierte sykdom kan være forbundet med cellemedierte virkninger, lymfokin-medierte virkninger osv, og til og med virkninger forbundet med B-celler, dersom B-cellene for eksempel stimuleres av lymfokinene som utskilles av T-cellene.
Eksempler på immunrelaterte sykdommer og betennelsessykdommer, av hvilke noen er immunmedierte eller T-cellemedierte, som kan behandles ifølge oppfinnelsen omfatter systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, juvenil kronisk artritt, spondyloartropatier, systemisk sklerose (skleroderma), idiopatiske inflammatoriske myopatier (dermatomyositt, polymyositt), Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi (immun pancytopeni, paroksysmal nokturnal hemoglobinuri), autoimmun trombocytopeni (idiopatisk trombocytopenisk pupura, immunmediert trombocytopeni), tyroiditt (Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocytt tyroiditt, atrofisk tyroiditt), diabetes mellitus, immunmediert nyresykdom (glomerulonefritt, tubulointerstitiell nefritt), demyelinerende sykdommer i sentralnerve systemet og det perifere nervesystem, for eksempel multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barré syndrom, og kronisk, inflammatorisk demyelinerende polyneuropati, lever-gallesykdommer, for eksempel infeksiøs hepatitt (hepatitt A, B, C, D, E og andre ikke-hepatotrope virus), autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt og skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom (ulcerøs kolitt, Crohns sykdom), glutensensitiv enteropati og Whippels sykdom, autoimmune eller immunmedierte hudsykdommer, innbefattet bulløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, psorasis, allergiske sykdommer som astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivtet ovenfor mat og urtikaria, immunologiske sykdommer i lungen, for eksempel eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose og hypersensitivitetspneumonitt, og transplantasjonsassosierte sykdommer, innbefattet transplantatawisning og graft-versus-host-sykdom. Infeksjonssykdommer omfatter virussykdommer som AIDS (HIV-infeksjon), hepatitt A, B, C, D og E, herpes osv, bakterielle infeksjoner, soppinfeksjoner, protozo infeksjoner og parasittinfeksjoner. Begrepet "effektiv mengde" er en konsentrasjon eller mengde av et IL-17A/F-polypeptid og/eller en agonist/antagonist derav som fører til at det oppnås et spesifikt angitt formål. En "effektiv mengde" av et IL-17A/F-polypeptid eller en agonist eller antagonist derav kan fastsettes empirisk. Videre er en "terapeutisk effektiv mengde" en konsentrasjon eller mengde av et IL-17A/F-polypeptid og/eller en agonist/antagonist derav som effektivt gir en angitt terapeutisk virkning. Denne mengden kan også fastsettes empirisk.
Begrepet "cytotoksisk middel" viser som anvendt heri til en forbindelse som inhiberer eller forhindrer funksjonen av celler og/eller som fører til ødeleggelse av celler. Begrepet er ment å omfatte radioaktive isotoper (for eksempel I131, 1125, 190 og Re<186>), kjemoterapeutiske midler og toksiner, for eksempel enzymatisk aktive toksiner med opphav i bakterier, sopp, planter eller dyr, eller fragmenter derav.
Et "kjemoterapeutisk middel" er en kjemisk forbindelse som er anvendbar ved behandling av kreft. Eksempler på kjemoterapeutiske midler omfatter adriamycin, doksorubicin, epirubicin, 5-fluoruracil, cytosinarabinosid ("Ara-C"), syklofosfamid, tiotepa, busulfan, cytoksin, taksoider, for eksempel paklitaksel (Taxol, Bristol-Myers Squibb Oncology, Princeton, NJ) og doksetaksel (Tacotere, Rhone-Poulenc Rorer, Antony, Frankrike), toksotere, metotreksat, cisplatin, melfalan, vinblastin, bleomycin, etoposid, ifosfamid, mitomycin C, mitoksantron, vinkristin, vinorelbin, karboplatin, teniposid, daunomycin, karminomycin, aminopterin, daktinomycin, mitomyciner, esperamiciner (se US patentskrift nr. 4 675 187), melfalan og andre beslektede nitrogenmustarder. Også omfattet av denne definisjonen er hormonelle midler som bidrar til å regulere eller inhibere virkninger av hormoner på tumorer, for eksempel tamoksifen og onapriston.
Et "vekstinhiberende middel" viser, når det anvendes heri, til en forbindelse eller en sammensetning som inhiberer veksten av en celle, fortrinnsvis en kreftcelle som overuttrykker hvilke som helst av genene som er identifisert heri, enten in vitro eller in vivo. Det vekstinhiberende middel er således et middel som i signifikant grad reduserer prosentandelen av celler som overuttrykker slike gener i S-fasen. Eksempler på vekstinhiberende midler omfatter midler som blokkerer gangen gjennom cellesyklus (i en posisjon forskjellig fra S-fasen), for eksempel midler som induserer Gl-arrest og M-fasearrest. Klassiske M-faseblokkere omfatter vinkaene (vinkristin og vinblastin), taksol og topo-II-inhibitorer som doksorubicin, epirubicin, daunorubicin, etoposid og bleomycin. Midler som fører GI-arrest gir også S-fasearrest, for eksempel DNA-alkylerende midler som tamoksifen, prednison, dakarbazin, mekloretamin, cisplatin, metotreksat, 5-fluoruracil og ara-C. Ytterligere informasjon kan finnes i The Molecular Basis of Cancer, Mendelsohn og Israel, red, kapitel 1 med tittelen "Cell cycle regulation, oncogens, and antineoplastic drugs" av Murakami et al. (WB Saunders: Philadelphia, 1995), særlig s. 13.
Begrepet "cytokin" er en generisk betegnelse på proteiner som frigjøres av en cellepopulasjon og som virker på en annen celle som intercellulære formidlere. Eksempler på slike cytokiner er lymfokiner, monokiner og tradisjonelle polypeptidhormoner. Innbefattet blant cytokinenene er veksthormon, for eksempel humant veksthormon, N-metionyl-humant veksthormon og bovint veksthormon, paratyroid hormon, tyroksin, insulin, proinsulin, relaksin, prorelaksin, glykoprotein-hormoner som follikelstimulerende hormon (FSH), tyroidstimulerende hormon (TSH) og luteiniserende hormon (LH), levervekstfaktor, fibroblast vekstfaktor, prolaktin, placentalt laktogen, tumornekrosefaktor-a og -p, "mullerian-inhibiting substance", gonadotropin-assosiert peptid fra mus, inhibitin, aktivin, vaskulær endotelvekstfaktor, integrin, trombo-poietin (TPO), nervevekstfaktorer, for eksempel NGF-P, blodplate vekstfaktor, transformerende vekstfaktorer (TGF), for eksempel TGF-ct og TGF-P, insulinlignende vekstfaktor-I og -II, erytropoietin (EPO), osteoinduktive faktorer, interferoner, for eksempel interferon-ct, -P og -y, kolonistimulerende faktorer (CSF), for eksempel makrofag-CSF (M-CSF), granulocytt-makrofag-CSF (GM-CSF), og granulocytt-CSF (G-CSF), interleukiner (IL), for eksempel IL-1, IL-la, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12 eller IL-17, en tumornekrosefaktor for eksempel TNF-a eller -P, og andre polypeptid innbefattet leukemi-inhiberende faktor (LIF) og kit-ligand (KL). Som anvendt heri omfatter begrepet cytokin proteiner fra naturlige kilder eller fra rekombinant cellekultur og biologisk aktive ekvivalenter fra cytokiner med nativ sekvens.
%aminosyresekvensidentitet =
(antall identiske aminosyrerester i de to polypeptidsekvensene bestemt ved hjelp av ALIGN-2) dividert med (det totale antall aminosyrerester i IL-17A/F-proteinet) =
5 dividert med 15 = 33,3%.
%aminosyresekvensidentitet =
(antall identiske aminosyrerester i de to polypeptidsekvensene bestemt ved hjelp av ALIGN-2) dividert med (det totale antall aminosyrerester i IL-17A/F-proteinet) =
5 dividert med 10 = 50%.
%nukleinsyresekvensidentitet=
(antall identiske nukleotider i de to nukleinsyresekvensene bestemt ved hjelp av ALIGN-2) dividert med (det totale antall nukleotider i IL-17A/F-DNA-nukleinsyresekvensen)=
6 dividert med 14 = 42,9%.
%nukleinsyresekvensidentitet=
(antall identiske nukleotider i de to nukleinsyresekvensene bestemt ved hjelp av ALIGN-2) dividert med (det totale antall nukleotider i IL-17A/F-DNA-nukleinsyresekvensen)=
4 dividert med 12 = 33,3%.
II. Preparater og fremgangsmåter ifølge oppfinnelsen
A. Fullengde IL- 17A/ F- polypeptider
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer nylig identifiserte og isolerte nukleotidsekvenser somk oder for polypeptider som i den foreliggende patentsøknad betegnes IL-17A/F-polypeptider. Nærmere bestemt har cDNA som koder for forskjellige IL-17A/F-polypeptider blitt identifisert og isolert, som beskrevet i mer detalj i eksemplene nedenfor.
B. IL- 17 A/ F- polypeptidvarianter
I tillegg til fullengde-IL-17A/F-polypeptidene med nativ sekvens som beskrives heri omfattes det at det kan fremstilles IL-17A/F-varianter. IL-17A/F-varianter kan fremstilles ved å innføre egnede nukleotidendringer i IL-17A/F-DNA og/eller ved syntese av det ønskede IL-17A/F-polypeptidet. Fagfolk vil forstå at aminosyreendringer kan endre post-translasjonelle prosesser med IL-17A/F, for eksempel ved endring av antall glykosyleringsseter eller deres posisjon eller en endring av membranforankrings egenskapene.
Variasjoner i fullengde IL-17A/F med nativ sekvens eller i forskjellige domener i IL-17A/F som beskrevet heri kan for eksempel innføres ved anvendelse av hvilke som helst av teknikkene og retningslinjene for konservative og ikke-konservative mutasjoner som for eksempel beskrives i US patentskrift nr. 5 364 934. Variasjonene kan være en substitusjon, delesjon eller insersjon av et eller flere kodoner i sekvensen som koder for IL-17A/F som fører til en endring av aminosyresekvensen til IL-17A/F sammenlignet med IL-17A/F med nativ sekvens. Om ønskelig tilføres variasjonen ved å substituere minst en aminosyre med en hvilken som helst annen aminosyre i et eller flere av domenene i IL-17A/F. Retningslinjer for bestemmelse av hvilken aminosyrerest som kan innsettes, substitueres eller deleteres uten på uheldig måte å påvirke den ønskede aktivitet kan finnes ved å sammenligne sekvensen til IL-17A/F med sekvensen til homologe, kjente proteinmolekyler og minimalisere antall aminosyresekvensendringer innført i området med høy homologi. Aminosyresubstitusjoner kan være en følge av at en aminosyre erstattes med en annen aminosyre med lignende strukturelle og/eller kjemiske egenskaper, for eksempel erstatning av leucin med serin, dvs. konservative aminosyreerstatninger. Insersjoner eller delesjoner kan om ønskelig skje i området fra tilnærmet 1 til 5 aminosyrer. Den tillate variasjon kan fastsettes ved systemisk å innføre insersjoner, delesjoner eller substiusjoner av aminosyrer i sekvensen og analysere de resulterende variantene for aktivitet som fremvises av den native fullengdesekvens eller den native, modne sekvens. IL-17A/F-polypeptidfragmenter tilveiebringes heri. Slike fragmenter kan for eksempel være avkortet i N-enden eller C-enden, eller mangle interne aminosyrerester sammenlignet med et nativt protein med full lengde. Visse fragmenter mangler aminosyrerester som ikke er essensielle for en ønsket biologisk aktivitet forbundet med IL-17A/F-polypeptidet. IL-17A/F-fragmenter kan fremstilles ved hjelp av hvilken som helst av en rekke konvensjonelle teknikker. Ønskede peptidfragmenter kan syntetiseres kjemisk. En alternativ tilnærming omfatter fremføring av IL-17A/F-fragmenter ved enzymatisk kløyving, for eksempel ved å behandle proteinet med et enzym som vises å kløyve proteiner i seter definert ved visse aminosyrerester, eller ved å kutte DNA med egnede restriksjonsenzymer og isolere det ønskede fragment. Nok en egnet teknikk omfatter isolering og amplifisering av et DNA-fragment som koder for et ønsket polypeptidfragment ved hjelp av polymerase-kjedereaksjonen (PCR). Oligonukleotider som definerer DNA-fragmenters ønskede ende benyttes som 5' og 3' primer i PCR. Fortrinnsvis har IL-17A/F-polypeptidfragmenter minst en biologisk og/eller en immunologisk aktivitet felles med det native IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri.
I spesielle utførelser er konservative substitusjoner av interesse vist i Tabell 6 under overskriften foretrukne substitusjoner. Dersom slike substitusjoner fører til endret biologisk aktivitet og mer omfattende endringer, betegnet eksempler på substitusjoner i Tabell 6, eller som beskrevet videre nedenfor med henvisning til aminosyreklasser, innføres og produktene analyseres.
Vesentlige modifikasjoner av IL-17A/F-polypeptidets funksjon eller immunologiske identitet oppnås ved å utvelge substitusjoner som har signifikant
forskjellig virkning når det gjelder (a) opprettholdelse av polypeptidryggradens struktur i substitusjonsområdet, for eksempel som en plate- eller helikskonformasjon, (b) opprettholdelse av molekylets ladning eller hydrofobisitet i målsetet eller (c) opprettholdelse av sidekjedens volum. Naturlig forekommende aminosyrerester kan oppdeles i grupper basert på felles sidekj ede egenskaper:
(1) hydrofobe: norleucin, met, ala, val, leu, ile,
(2) nøytrale hy dro file: cys, ser, thr,
(3) sure: asp, glu,
(4) basiske: asn, gin, his, lys, arg,
(5) aminosyrerester som påviser kjedeorienteringen: gly, pro og
(6) aromatiske: trp, tyr, phe.
Ikke-konservative substitusjoner vil omfatte og utbytte et medlem av en av disse klassene med et medlem av en annen klasse. Slike substituerte aminosyrerester kan også innføres i de konservative substitusjonssetene, eller mer foretrukket, i de gjenværende (ikke-konserverte) setene.
Variasjonene kan innføres ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen faget, for eksempel oligonukleotidformidlet (seterettet) mutagenese, alaninskannin og PCR-mutagenese. Seterettet mutagenese (Carter et al, Nucl. Acids Res, 13:4331
(1986), Zoller et al, Nucl. Acids Res, 10:6487 (1987)), kassettmutagenese (Wells et al, Gene, 34:315 (1985)), restriksjons-seleksjonsmutagenese (Wells et al. Philos. Trans. R. Soc. London SerA, 317:415 (1986)) eller andre kjente teknikker kan utføres på det klonede DNA for fremstilling av IL-17A/F-DNA-varianten.
Skannende aminosyreanalyse kan også benyttes for identifisering av en eller flere aminosyrer i en kontinuerlig sekvens. Blant de foretrukne skannende aminosyrene er relativt små, nøytrale aminosyrer. Slike aminosyrer omfatter alanin, glysin, serin og cystein. Alanin er typisk en foretrukket skannende aminosyre i denne gruppen, siden den mangler sidekjeden utenfor beta-karbonatomet, og mindre sannsynlig vil endre variantens konformasjon av hovedkjeden (Cunningham og Wells, Science, 244: 1081-1085 (1989)). Alanin foretrekkes også typisk siden dette er den vanligste aminosyren. Videre forefinnes alanin hyppig i både begravde og eksponerte posisjoner (Creighton, The Proteins, (W.H. Freeman & Co, N.Y.), Chothia, J. Mol. Biol, 150:1 (1976)). Dersom alaninsubstitusjon ikke gir tilstrekkelige mengder av variant, kan en isoterisk aminosyre anvendes.
C. Modifikasjoner av IL- 17A/ F
Kovalente modifikasjoner av IL-17A/F omfattes av den foreliggende oppfinnelse. En type av kovalent modifisering omfatter reaksjon mellom ønskede aminosyrrester i et IL-17A/F-polypeptid, og et organisk derivatiseringsmiddel som kan reagere med de utvalgte sidekjeder eller de N- eller C-terminale aminosyrerestene i IL-17A/F. Derivatisering med bifunksjonelle midler er for eksempel anvendbart for kryssbinding av IL-17A/F til et vannuløselig støttemiddel eller en overflate for anvendelse i fremagngsmåten for rensing av anti-IL-17A/F-antistoffer, og omvendt. Hyppig anvendte kryssbindingsmidler omfatter for eksempel l,l-bis(diazoacetyl)-2-fenyletan, glutaraldehyd, N-hydroksysuksinimidestere, for eksempel estere med 4-azido-salicylsyre, homobifunksjonelle imidoestere, innbefattet disuksinimidylestere, for eksempel 3,3'-ditiobis(suksinimidylpropionaf), bifunksjonelle maleimider, for eksempel bis-N-maleimido-l,8-oktan, og midler som metyl-3-[(p-azidofenyl)ditio]propioimidat.
Andre modifikasjoner omfatter deamidering av glutaminyl- og asparaginylrester for dannelse av det tilsvarende glutamyl- henholdsvis aspartylrester, hydroksylering av prolin og lysin, fosforylering av hydroksylgrupper i seryl- eller treonylrester, metylering av oc-aminogrupper i sidekjeden i lysin, arginin og histidin (T.E. Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co, San Francisco, s. 79-86
(1983)), acetylering av den N-terminale aminogruppe og amidering av en eventuelt C-terminal karboksylgruppe.
En annen type av kovalent modifisering av IL-17A/F-polypeptidet som omfattes av den foreliggende oppfinnelse omfatter en endring av polypeptidets native glykosyleringsmønster. "Endring av det naturlige glykosyleringsmønster" er for formålene heri ment å skulle bety en delesjon av en eller flere karbohydratgrupper som forefinnes i IL-17A/F med nativ sekvens (enten ved å fjerne det underliggende glykosyl-eringssetet eller ved å fjerne glykosyleringen ved kjemiske og/eller enzymatiske midler) og/eller å addere et eller flere glykosyleringsseter som ikke foreligger i IL-17A/F med nativ sekvens. I tillegg omfatter uttrykket kvalitative endringer i glykosyleringen av de native proteinene, innbefattet en endring av de forskjellige karbohydratgruppenes egenskaper og mengdeforholdet mellom dem.
Addisjon av glykosyleringsseter til IL-17A/F-polypeptidet kan oppnås ved å endre aminosyresekvensen. Endringen kan for eksempel innføres ved å addere eller substituere en eller flere serin- eller treoninrester til IL-17A/F med nativsekvens (for seter for O-koblet glykosylering). IL-17A/F-aminosyresekvensen kan om ønskelig endres ved endring på DNA-nivå, nærmere bestemt ved å mutere DNA som koder for IL-17A/F-polypeptidet i på forhånd valgte baser, slik at det dannes kodoner som vil translateres til de ønskede aminosyrer.
En annen måte som antall karbohydratgrupper på IL-17A/F-polypeptidet kan økes på, er ved kjemisk eller enzymatisk kobling av glykosider til polypeptidet. Slike fremgangsmåter er beskrevet innen faget, for eksempel i WO 87/05330, offentliggjort 11. september, 1987, og i Aplin og Wriston, CRC Crit. Rev. Biochem, s. 259-306 (1981).
En fjerning av karbohydratgrupper som foreligger på IL-17A/F-polypeptidet kan oppnås kjemisk eller enzymatisk eller ved mutasjonssubstitusjon av kodoner som koder for aminosyrerester som fungerer som glykosyleringsmål. Kjemiske deglykosylerings-teknikker er kjente innen faget og beskrives for eksempel av Hakimuddin et al, ARch. Biochm. Biophys, 259:52 (1987) og Edge et al. Anal. Biochem, 118:131 (1981). Enzymatisk avspalting av karbohydratgrupper fra polypeptider kan oppnås ved anvendelse av en rekke forskjellige endo- og ekso-glukosidaser som beskrevet av Thotakura et al, Meth. Enzymol, 138:350 (1987).
En annen type av kovalent modifisering av IL-17A/F omfatter kobling av IL-17 A/F-polypeptidet til en av et utvalg av ikke-proteinpolymerer, for eksempel polyetylenglykol (PEG), polypropylenglykol eller polyoksyalkylener, på den måte som beskrives i US patentskrift nr. 4 640 835, 4 496 689, 4 301 144,4 670 417,4 791 192 og 4 179 337. IL-17A/F, ifølge foreliggende oppfinnelse, kan også modifiseres ved at det dannes et kimert molekyl som omfatter IL-17A/F fusjonert til et annet, heterologt polypeptid eller en annen aminosyresekvens.
I en utførelse omfatter et slikt kimert molekyl en fusjon mellom IL-17A/F og et merkingspolypeptid som tilveiebringer en epitop som et anti-merkingsantistoff selektivt kan bindes til. Epitopmerkelappen plasseres generelt i amino- eller karboksylenden av IL-17A/F. Nærvær av slike epitopmerkede former av IL-17A/F kan påvises ved anvendelse av et antistoff mot merkingspolypeptidet. Nærvær av epitopmerkelappen gjør det også mulig å enkelt rense IL-17A/F ved affinitetsrensing ved anvendelse av et anti-merkingsantistoff eller en annen type av affinintetsstøttemiddel som bindes til epitopmerkelappen. Forskjellige merkingspolypeptider og tilhørende antistoffer er velkjente innen faget. Eksempler omfatter poly-histidin (poly-his)- eller poly-histidin-glysin (poly-his-gly)-merkelapper, HA-merkingspolypeptider fra influensavirus og det tilhørende antistoff 12CA5 (Field et al, Mol. Cell. Biol, 8:2159-2165 (1988)), c-myc-merkelappen og antistoffene 8F9, 3C7, 6E10, G4, B7 og 9E10 rettet mot denne (Evan et al, Molecular and Cellular Biology, 5:3610-3616 (1985)), og glykoprotien D (gD)-merkelappen fra Herpes Simplex-virus og det tilhørende antistoff (Paborsky et al. Protein Engineering, 3(6):547-553 (1990)). Andre merkingspolypeptider omfatter Flag-peptidet (Hopp et al, BioTechnology, 6:1204-1210 (1988)), KT3-epitoppeptidet (Martin et al. Science, 255:192-194 (1992)), et a-tubulinepitoppeptid (Skinner et al, J. Biol. Chem, 266:15163-15166 (1991)), og gen 10-proteinpeptidmerkelappen fra T7 (Lutz-Freyermuth et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6393-6397 (1990)).
I en alternativ utførelse kan det kimere molekyl omfatte en fusjon mellom IL-17A/F og et immunglobulin eller et gitt område i et immunglobulin. For en bivalent form av det kimere molekyl (også betegnet et "immunadhesin"), kan en slik fusjon være til et Fc-området fra et IgG-molekyl. Ig-fusjonene omfatter fortrinnsvis en substitusjon av en løselig (med deletert eller inaktivert transmembrandomene) form av et IL-17A/F-polypeptid i stedet for minst et variabelt område i et Ig-molekyl. I en spesielt foretrukket utførelse omfatter immunglobulinfusjonen hengselområdet, CH2-området og CH3-området, eller hengselområdet CH1-området, CH2-området og CH3-området fra et IgGl-molekyl. For fremstilling av immunglobulinfusjoner se også US patentskrift nr. 5 428 130, tildelt 27. juni, 1995.
I ytterligere en utførelse kan IL-17A/F-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse også modifiseres slik at det dannes et kimert molekyl som omfatter et IL-17A/F-polypeptid fusjonert til en leucin-"zipper". Forskjellige leucin-"zipper"-polypeptider er beskrevet innen faget. Se for eksempel Landschulz et al. Science, 240:1759 (1988), WO 94/10308, Hoppe et al, FEBS Letters, 344:1991 (1994), Maniatis et al. Nature, 341:24 (1989). Det antas at anvendelse av en leucin-"zipper" fusjonert til et IL-17A/F-polypeptid kan være ønskelig som en hjelp for dimerisering eller trimerisering av løselig IL-17A/F-polypeptid i løsning. Fagfolk vil forstå at leucin-"zipperen" kan være fusjonert til enten N- eller C-enden av IL-17A/F-molekylet.
D. Fremstilling av IL- 17A/ F
Beskrivelsen nedenfor gjelder primært fremstilling av IL-17A/F ved dyrking av celler som er transformert eller transfektert med en vektor som inneholder IL-17A/F-nukleinsyre. Det omfattes naturligvis at alternative fremgangsmåter som er velkjente innen faget kan benyttes for fremstilling av IL-17A/F. For eksempel kan IL-17A/F-sekvensen, eller deler av denne, fremstilles direkte ved peptidsyntese ved anvendelse av fastfase-teknikker (se for eksempel Stewart et al, Solid-Phase Peptide Synthesis, W.H. Freeman Co, San Francisco, CA (1969), Merrifield, J. Am. Chem. Soc, 85:2149-2154
(1963)). In vftro-proteinsyntese kan utføres ved anvendelse av manuelle teknikker eller ved automatisering. Automatisert syntese kan for eksempel oppnås ved anvendelse av et Applied Biosystems peptidsyntese instrument (Foster city, CA) ved anvendelse av produsentens instruksjoner. Forskjellige deler av IL-17A/F kan syntetiseres kjemisk separat og kombineres ved anvendelse av kjemiske eller enzymatiske fremgangsmåter for dannelse av fullengde IL-17A/F.
1. Isolering av DNA som koder for TL- 17A/ F
DNA som koder for IL-17A/F kan erholdes fra et cDNA-bibliotek som er fremstilt fra vev som antas å inneholde IL-17A/F-mRNA og uttrykke dette i et påvisbart nivå. Følgelig kan humant IL-17A/F-DNA enkelt erholdes fra et cDNA-bibliotek, fremstilt fra humant vev, som beskrevet i eksemplene. Det IL-17A/F-kodende gen kan også erholdes fra et genomisk bibliotek eller ved kjente syntesefremgangsmåter (for eksempel automatisert nukleinsyresyntese).
Biblioteker kan gjennomsøkes med prober (for eksempel antistoffer mot IL-17A/F eller oligonukleotider med en lengde på minst tilnærmet 20-80 baser) utformet for påvisning av genet av interesse eller proteinet som kodes av det. Gjennomsøking av cDNA-biblioteket eller det genomiske bibliotek med den valgte probe kan utføres ved anvendelse av standard fremgangsmåter, for eksempel som beskrevet i Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual (New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989). En alternativ måte å isolere genet som koder for IL-17A/F på er å anvende PCR-metodologi (Sambrook et al, supra, Diffenbach et al, PCR Primer: A Laboratory Manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995)).
Eksemplene nedenfor beskriver teknikker for gjennomsøking av et cDNA-bibliotek. Oligonukleotidsekvensene som velges som prober bør ha en tilstrekkelig lengde og være tilstrekkelig utvetydige til at falske positiver minimaliseres. Oligonukleotidet er fortrinnsvis merket slik at det kan påvises etter hybridisering til DNA i biblioteket som gjennomsøkes. Merkingsfremgangsmåter er velkjente innen faget og omfatter anvendelse av radioaktiv merking, for eksempel P-merket ATP, biotinylering eller enzymmerking. Hybridiseringsbetingelsene, innbefattet betingelser med moderat stringens og høy stringens, gis i Sambrook et al, supra.
Sekvenser som påvises i slike fremgangsmåter for gjennomsøking av biblioteker kan sammenlignes og stammenstilles med andre kjente sekvenser som er deponert og tilgjengelige i offentlige databaser, for eksempel GenBank, eller i andre private sekvens-databaser. Sekvensidentiteten (på enten aminosyrenivå eller nukleotidnivå) innen definerte områder i molekylet eller over fullengdesekvensen kan bestemmes ved anvendelse av fremgangsmåter som er kjente innen faget, og som beskrevet heri.
Nukleinsyre med proteinkodende sekvens kan erholdes ved å gjennomsøke utvalgte cDNA-biblioteker eller genomiske biblioteker ved anvendelse av den utledede aminosyresekvens som heri beskrives for første gang, og om nødvendig, ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter for primerforlengelse som beskrevet i Sambrook et al, supra, for påvisning av forløpere for og prosesseringsintermediater av mRNA som ikke har blitt reverstranskribert til cDNA.
2. Utvelgelse og transformasjon av vertsceller
Vertsceller transfekteres eller transformeres med eksprejsons- eller kloningsvektorer som beskrives heri for IL-17A/F-fremstilling, og dyrkes i konvensjonelle næringsmedier modifisert etter behov for induksjon av promotere, seleksjon av transformanter eller amplifisering av genene som koder for de ønskede sekvenser. Dyrkningsbetingelsene når det gjelder medium, temperatur, pH og lignende kan velges av den erfarne fagperson uten omfattende eksperimentering. Generelt kan prinsipper, fremgangsmåter og praktiske teknikker for maksimalisering av cellekulturers produktivitet finnes i Mammalian Cell Biotechnology: a Practical Approach, M. Butler, red. (IRL Press, 1991) og Sambrook et al, supra.
Fremgangsmåter for transfeksjon av eukaryote celler og transformasjon av prokaryote celler er kjente blant gjennomsnittsfagfolk, for eksempel CaCl2, CaP04, liposomformidlet og med elektroporering. Avhengig av den anvendte vertscelle utføres transformasjonen ved anvendelse av standardteknikker som er egnede for slike celler. Kalsiumbehandling ved benyttelse av kalsiumklorid som beskrevet i Sambrook et al, supra, eller elektroporering anvendes generelt for prokaryoter. Infeksjon med Agrobacterium tumefaciens anvendes for transformasjon av visse planteceller, som beskrevet av Shaw et al. Gene, 23:3158 (1983) og WO 89/05859, offenliggjort 29. juni, 1989. For pattedyrsceller uten slike cellevegger kan kalsiumfosfatutfellings-fremgangsmåten til Graham og van der Eb, Virology, 52:456-457 (1978) benyttes. Generelle aspekter forbundet med transfeksjon av pattedyrs cellesystemer beskrives i US patentskrift nr. 4 399 216. Transformasjon av gjærceller utføres typisk ifølge fremgangsmåten til Van Soligen et al, J. Bact, 130:946 (1977) og Hsiao et al. Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 76:3829 (1979). Andre fremgangsmåter for innføring i DNA I celler, for eksempel ved mikroinjeksjon i cellekjernen, elektroporering, bakterieprotoplast fusjon med intakte celler eller polykationer, for eksempel polybren eller polyornitin, kan imidlertid også anvendes. For forskjellige teknikker for transformasjon av pattedyrceller, se Keown et al, Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990) og Mansour et al. Nature, 336:348-352(1988).
Egnede vertsceller for kloning eller ekspresjon av DNA i vektorene heri omfatter prokaryote celler, gjærceller eller høyere eukaryote celler. Egnede prokaryoter omfatter, men er ikke begrenset til, eubacteria, for eksempel Gram-negative eller Gram-positive organismer, for eksempel Enter- obacteriaceae, for eksempel E. coli. Forskjellige E. coli-stammer er offentlig tilgjengelige, for eksempel E. coli Kl2-stamme MM294 (ATCC 31 446), E. coli XI776 (ATCC 31 537), E. co/i-stamme W3110 (ATCC 27 325) ig K5 772 (ATCC 53 635). Andre egnede prokaryote vertsceller omfatter Enterobacteriaceae, for eksempel Escherichia, for eksempel E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, for eksempel Salmonella typhimurium, Serratia, for eksempel Serratia marcescans og Shigella, så vel som Bacilli, for eksempel B. subtilis og B. licheniformis (for eksempel B. licheniformis 41P, beskrevet i DD 266 710, offentliggjort 12. april, 1989), Pseudomonas, for eksempel P. aeruginosa og Streptomyces. Disse eksemplene er illustrerende snarere enn begrensende. Stamme W3110 er en spesielt foretrukket vertscelle eller utgangs vertscelle, siden dette er en alminnelig vertsstamme for fremstilling av rekombinant IL-17A/F ved fermentering. Vertscellen utskiller fortrinnsvis minimale mengder av proteolytiske enzymer. For eksempel kan stamme W3110 modifiseres, slik at det oppnås en genetisk mutasjon i genene som koder for proteiner som er endogene for verten, hvor eksempler på slike verter omfatter E. coli W3110-stamme 1A2, som har den komplette genotype tonA, E. coli W3110-stamme 9E4, som har den komplette genotype tonA ptr3, E. coli W3110 stamme 27C7 (ATCC 55 244), som har den komplette genotypen tonA ptr3 phoA El5 ( argF- lac) 169 degP ompTkan<r>, E. coli W3110 stamme 37D6, som har den komplette genotype tonA ptr3phoA El5 ( argF- lac) 169 degP ompT rbs7 ilvG kan\ E. coli W3110 stamme 40B4, som er stamme 37D6 med en ikke-kanamycinresisten degP delsjonsmutasjon, og en E. cø/i-stamme med mutant periplasmatisk protease, beskrevet i US patentskrift nr. 4 946 783, tildelt 7. august, 1990. Alternativt er in vitro-fremgangsmåter for kloning, for eksempel PCR og andre nukleinsyre polymerase-reaksjoner egnede.
I tillegg til prokaryoter er eukaryote mikrober, for eksempel filamentøs sopp eller gjær, egnede klonings- eller ekspresjonsverter for IL-17 A/F-kodende vektorer. Saccharomyces cerevisiae er en alminnelig anvendt lavere eukaryot vertsorganisme. Andre omfatter Schizosaccharomycespombe (Beach og Nurse, Nature, 290: 140 (1981); EP 139 383, offentliggjort 2. mai, 1985), Kluyveromyces- verter (US patentskrift nr.
4 943 529, Fleer et al, Bio/Technology, 9:968-975 (1991)) slik som for eksempel K. lactis (MW98-8C, CBS683, CBS4574, Louvencourt et al, J. Bacteriol, 154(2):737-742
(1983)), Kfragilis (ATCC 12 424), K. bulgaricus (ATCC 16 045), K. wickeramii (ATCC 24 178), K. waltii (ATCC 56 500), K. drosophilarum (ATCC 36 906, Van den Berg et al, Bio/Technology, 8:135 (1990)), K. thermotolerans og K. marxianus, yarrowia (EP 402 226); Pichiapastoris (EP 183 070, Sreekrishna et al, J. Basic Microbiol, 28:265-278 (1988)), Candida, Trichoderma rees ia (EP 244 234), Neurospora crassa (Case et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 76:5259-5263 (1979)), Schwanniomyces, for eksempel Schwanniomyces occidentalis (EP 394 538, offentliggjort 31. oktober, 1990) og filamentøs sopp, for eksempel Neurospora, Penicillium, Tolypocladium (WO 91/00357, offentliggjort 10. januar, 1991) og A spergillus- verter, for eksempelt, nidulans (Ballance et al, Biochem. Biophys. Res. Commun, 112:284-289 (1983), Tilburn et al. Gene, 26:205-221 (1983), Yelton et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:1470-1474 (1984] og A. niger (Kelly og Hynes, EMBO J, 4:475-479 (1985)). Metylotrope gjærarter er egnede heri og omfatter, men er ikke begrenset til, gjær som kan dyrke på metanol, utvalgt fra slektene som består av Hansenula, Candida, Kloeckera, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis og Rhodotorula. En liste over spesifikke arter som er eksempler på denne klassen av gjærarter kan finnes i C. Anthony, The Biochemistry of Methylotrophs, 269 (1982).
Egnede vertsceller for ekspresjon av glykosylert IL-17A/F er avledet fra multicellulære organismer. Eksempler på invertebratceller omfatter insektsceller, for eksempel Drosophila S2-celler og Spodoptera Sf9-celler eller Spodoptera High 5-celler, så vel som planteceller. Eksempler på egnede pattedyr vertscellelinjer omfatter kinahamster ovarieceller (CHO-celler) og COS-celler. Mer spesifikke eksempler omfatter apenyre cellelinjen CV1 transformert med SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651), en human embryonal nyrecellelinje (293 eller 293-celler subklonet for vekst i suspensjons-kultur, Graham et al, J. Gen. Virol, 36:59 (1977)), kinahamster ovarieceller/-DHFR (CHO, Urlaub og Chasin, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980)), sertoliceller fra mus (TM4, Mather, Biol. Reprod, 23:243-251 (1980)), humane lungeceller (W138, ATCC CCL 75), humane leverceller (Hep G3, HB 8065) og muse-brysttumorceller (MMT 060562, ATCC CCL51). Utvelgelse av en egnet vertscelle anses å ligge innen teknikkens stand.
3. Utvelgelse og anvendelse av en replikerbar vektor
Nukleinsyren (for eksempel cDNA eller genomisk DNA) som koder for IL-17A/F kan innsettes i en replikerbar vektor for kloning (amplifisering av DNA) eller for ekspresjon. Forskjellige vektorer er offentlig tilgjengelige. Vektoren kan for eksempel foreligge i form av et plasmid, et kosmid, en viruspartikkel eller en bakteriofag. Den ønskede nukleinsyresekvensen kan innsettes i vektoren ved hjelp av en rekke forskjellige fremgangsmåter. Generelt innsettes DNA i et eller flere egnede restriksjons-endonukleaseseter ved anvendelse av teknikker som er kjente innen faget. Vektorens bestanddeler omfatter generelt, men er ikke begrenset til, en eller flere av en signalsekvens, et replikasjonsorigo, et eller flere markørgener, et enhancerelement, en promoter og en transkripsjonstermineringssekvens. I konstruksjonen av egnede vektorer som inneholder en eller flere av disse bestanddelene benyttes standard ligeringsteknikker som er kjente blant fagfolk.
IL-17A/F kan fremstilles rekombinant, ikke bare direkte, men også som et fusjonspolypeptid med et heterologt polypeptid, som kan være en signalsekvens eller et annet polypeptid med et spesifikt kløyvingssete i N-enden av det modne protein eller polypeptid. Generelt kan signalsekvensen være en bestanddel av vektoren, eller en del av det IL-17A/F-kodende DNA som innsettes i vektoren. Signalsekvensen kan være en prokaryot signalsekvens, for eksempel utvalgt fra gruppen som består av ledersekvensen for alkalisk fosfatase, penicillinase, lpp eller varmestabilt enterotoksin-II. For sekresjon i gjær kan signalsekvensen for eksempel være ledersekvensen fra gjærinvertase, alfa-faktorledersekvensen (innbefattet alfa-faktorledersekvenser fra Saccharomyces og
Kluyveromyces, hvor den siste er beskrevet i US patentskrift nr. 5 010 182), eller ledersekvensen fra sur fosfatase, glukoamylase-ledersekvensen fra C. albicans (EP
362 179, offentliggjort 4. april, 1990), eller signalsekvensen som beskrives i WO 90/13646, offentliggjort 15. november, 1990. For ekspresjon i pattedyrceller kan signalsekvenser fra pattedyr anvendes for å styre sekresjonen av proteinet, for eksempel signalsekvenser fra utskilte polypeptider fra samme art eller en beslektet art, så vel som virale sekretoriske ledersekvenser.
Både ekspresjonsvektorer og kloningsvektorer inneholder en nukleinsyresekvens som gjør det mulig for vektoren å replikeres i en eller flere valgte vertsceller. Slike sekvenser er velkjente for en rekke forskjellige bakterier, gjær og virus. Replikasjonsorigo fra plasmid pBR322 er egnet for de fleste Gram-negative bakterier, 2 ii-plasmidorigo er egnet for gjær og forskjellige virale origi (SV40, polyoma, adenovirus, VSV eller BPV) er egnede for kloningsvektorer i pattedyrsceller.
Ekspresjons- og kloningsvektorer vil typisk inneholde et seleksjonsgen, også betegnet en seleksjonsmarkør. Typiske seleksjonsgener koder for proteiner som (a) gir resistens ovenfor antibiotika eller andre toksiner, for eksempel ampicillin, neomycin, metotreksat eller tetracyklin, (b) komplementerer auxotrofe mangler eller (c) tilfører nødvendige næringsstoffer som ikke er tilgjengelige fra kompliserte medier, for eksempel genet som koder for D-alanin racemase for Bacilli.
Et eksempel på egnede seleksjonsmarkører for pattedyrceller er markører som muliggjør en påvisning av celler som er kompetente til opptak av den IL-17A/F-kodende nukleinsyre, for eksempel DHFR eller tymidinkinase. En egnet vertscelle dersom villtype-DHFR benyttes, er CHO-cellelinjen som mangler DHFR-aktivitet, fremstilt og oppformert som beskrevet av Urlaub et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4216 (1980). Et egnet seleksjonsgen for anvendelse i gjær erfrpl-genet som foreligger i gjærplasmid YRp7 (Stinchcomb et al. Nature, 282:39 (1979, Kingsman et al. Gene, 7:141 (1979), Tschemper et al. Gene, 10:157 (1980)). /r/?I-genet tilveiebringer en seleksjonsmarkør for en mutant gjærstamme som mangler evnen til å vokse i tryptofan, for eksempel ATCC nr. 44076 eller PEP4-1 (Jones, Genetics, 85:12 (1977)).
Ekspresjons- og kloningsvektorer inneholder vanligvis en promoter som er operativt koblet til den IL-17A/F-kodende nukleinsyresekvens for styring av mRNA-syntesen. Promotere som gjenkjennes av en rekke mulige vertsceller er velkjente. Promotere som er egnet for anvendelse med prokaryote verter omfatter promotersystemet fra p-kaltamase og laktose (Chang et al. Nature, 275:615 (1978), Goeddel et al. Nature, 281:544 (1979)), alkalisk fosfatase, et tryptofan (trp)-promotersystem (Goeddel, Nucleic Acids Res, 8:4057 (1980), EP 36 776) og hybride promotere, for eksempel tac-promoteren (deBoer et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:21-25 (1983)). Promotere for anvendelse i bakteriesystemer vil også inneholde en Shine-Dalgarno (S.D.)-sekvens som er operativt koblet til DNA som koder for IL-17A/F.
Eksempler på egnede promotersekvenser for anvendelse med gjærverter omfatter promoterne for 3-fosfoglyceratkinase (Hitzeman et al, J. Biol. Chem, 255:2073 (1980)) eller andre glykolyseenzymer (Hess et al, J. Adv. Enzyme Reg, 7:149 (1968), Holland, Biochemistry, 17:4900 (1978)), for eksempel enolase, glyseraldehyd-3-fosfat-dehydro-genase, heksokinase, pyruvatdekarboksylase, fosfofruktokinase, glukose-6-fosfat-isomerase, 3-fosfoglyseratmutase, pyruvatkinase, triosefosfatisomerase, fosfoglukose-isomerase og glukokinase.
Adnre gjærpromotere, som er induserbare promotere som byr på den ekstra fordel at transkripsjonen kontrolleres av vekstbetingelsene, er promoterområdene for alkoholdehydrogenase 2, isocytokrom C, sur fosfatase, degraderende enzymer forbundet med nitrogenmetabolismen, metallotionein, glyseraldehyd-3-fosfatdehydrogenase og enzymer som er ansvarlige for utnyttelsen av maltose og galaktose. Egnede vektorer og promotere for anvendelse ved ekspresjon i gjær beskrives videre i EP 73 657. IL-17A/F-transkripsjonen fra vektorer i pattedyrs vertsceller kontrolleres for eksempel av promotere erholdt fra genomene til virus, for eksempel polyomavirus, fugle-koppevirus (UK 2 211 504, offentliggjort 5. juli, 1989), adenovirus (for eksempel adenovirus 2), bovint papillomavirus, fuglesarkom virus, cytomegalovirus, et retrovirus, hepatitt B-virus og apevirus 40 (SV40), fra heterologe pattedyrspromotere, for eksempel aktinpromoteren eller en immunglobulin promoter, og fra varmesjokk promotere, forutsatt at slike promotere er forenelige med vertscellesystemene.
Transkripsjonen av et DNA som koder for IL-17A/F i høyere eukaryoter kan økes ved å innsette en enhancersekvens i vektoren. Enhancere er cis-virkende DNA-elementer, typisk på fra tilnærmet 10 til 300 bp, som virker på en promoter og forsterker dens transkripsjon. Mange enhancersekvenser er nå kjente fra pattedyrsgener (globin, elastase, albumin, a-fetoprotein og insulin). Typisk vil man imidlertid anvende en enhancer fra et virus som angriper eukaryote celler. Eksempler omfatter SV40-enhanceren på den sene side av replikasjonsorigo (bp 100-270), den tidligere promoterenhancer fra cytomegalovirus, polyoma-enhanceren på den sene side av replikasjonsorigo og adenovirus-enhancere. Enhanceren kan spleises inn i vektoren i en posisjon som ligger 5' eller 3' for den IL-17A/F-kodende sekvens, men plasseres fortrinnsvis i et sete som ligger 5' for promoteren.
Ekspresjonsvektorer som anvendes i eukaryote vertsceller (gjær, sopp, insektsceller, planteceller, dyreceller, menneskeceller eller celler med kjerne fra andre multicellulære organismer) vil også inneholde sekvenser som er nødvendige for terminering av transkripsjonen og for stabilisering av mRNA. Slike sekvenser er hyppig tilgjengelige fra det 5'-ikke-translaterte området, og av og til det 3'-ikke-translaterte området i eukaryote eller virale DNA eller cDNA. Disse områdene inneholder nukleotidsegmenter som transkriberes som polyadenylerte fragmenter i den ikke-translaterte del av mRNA som koder for IL-17A/F.
Andre fremgangsmåter, vektorer og vertsceller som er egnet for tilpasning til syntese av IL-17A/F i rekombinant vertebratcellekultur beskrives i Gething et al. Nature, 293:620-625 (1981), Mantei et al. Nature, 281:40-46 (1979), EP 117 060 og EP 117 058.
4. Påvisning av genamplifisering/- ekspresjon
Genamplifisering og/eller -ekspresjon kan måles i en prøve direkte, for eksempel ved konvensjonell Southern-blotting, Northern-blotting for kvantifisering av transkripsjonen av mRNA (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)), dot-blotting (DNA-analyse) eller in siYw-hybridisering ved anvendelse av en på egnet vis merket probe basert på sekvensene som tilveiebringes heri. Alternativt kan det benyttes antistoffer som kan gjenkjenne spesifikke duplekser, innbefattet DNA-duplekser, RNA-duplekser og DNA-RNA-hybridduplekser eller DNA-proteinduplekser. Antistoffene kan i sin tur være merkede, og analysen kan utføres mens dupleksen er bundet til en overflate, slik at nærvær av antistoff bundet til dupleksen kan påvises etter dannelse av dupleks på overflaten.
Genekspresjon kan alternativt måles ved immunologiske fremgangsmåter, for eksempel immunhistokjemisk farging av celler eller vevssnitt og analyse av cellekultur eller kroppsvæsker for direkte kvantifisering av ekspresjonen av genproduktet. Antistoffer som er egnet for immunhistokjemisk farging og/eller analyse av væskeprøver kan enten være monoklonale eller polyklonale og kan være fremstilt i hvilket som helst pattedyr. Antistoffene kan med fordel fremstilles mot et IL-17A/F-polypeptid med nativ sekvens eller mot et syntetisk peptid basert på DNA-sekvensene som tilveiebringes heri, eller mot en eksogen sekvens fusjonert til IL-17A/F-DNA som koder for en spesifikk antistoffepitop.
i
5. Rensing av polypeptid
Il-17A/F-former kan gjenvinnes fra dyrkningsmediet eller fra vertscellelysater. Dersom proteinet er membranbundet kan det frigjøres fra membranen ved anvendelse av en egnet detergentløsning (for eksempel Triton-X 100) eller ved enzymatisk spalting. Celler som benyttes for ekspresjon av IL-17A/F kan oppbrytes ved hjelp av forskjellige fysiske eller kjemiske midler, for eksempel gjentatt frysing og tining, ultralydbehandling, mekanisk oppbryting eller ved hjelp av cellelyserende midler.
Det kan være ønskelig å rense IL-17A/F fra proteiner eller polypeptider fra den rekombinante cellen. De påfølgende fremgangsmåtene er eksempler på egnede rense-fremgangsmåter: ved fraksjonering på en ionebytterkolonne, etanolutfelling, revers fase-HPLC, kromatografi på kiselgel eller et kationbytterresin, for eksempel DEAE, kromato-fokusering, SDS-PAGE, ammoniumsulfatutfelling, gelfiltrering ved anvendelse av for eksempel Sephadex G-75, protein A-Sepharose-kolonner for fjerning av kontaminanter, for eksempel IgG, og metallchelaterende kolonner for binding av epitopmerkede former av IL-17A/F. Forskjellige fremgangsmåter for proteinrensing kan benyttes, og slike fremgangsmåter er kjente innen faget og beskrives for eksempel i Deutscher, Methods in Enzymology, 182 (1990), Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, Springer-Verlag, New York (1982). De eller de valgte rensetrinn vil for eksempel avhenge av fremstillingsprosessens egenskaper og det angjeldende IL-17A/F som dannes.
E. Anvendelser av IL- 17A/ F
Nukleotidsekvenser (eller de komplementære sekvenser) som koder for IL-17A/F har forskjellige anvendelser innen faget molekylærbiologi, innbefattet anvendelser som hybridiseringsprober, for kromosomkartlegging og genkartlegging og for fremstilling av "antisense"-RNA og -DNA. IL-17A/F-nukleinsyre vil også være anvendbar for fremstilling av IL-17A/F-polypeptider ved de rekombinante teknikkene som er beskrevet heri.
Fullengde-IL-17A/F-genet med nativsekvens eller deler av dette kan anvendes som hybridiseringsprober for et cDNA-bibliotek for isolering av fullengde-IL-17A/F-cDNA, eller for isolering av andre cDNA (for eksempel cDNA som koder for naturlig forekommende varianter av IL-17A/F eller IL-17A/F fra andre arter) som har en ønsket sekvensidentitet med den native IL-17A/F-sekvens som beskrives heri. Om ønskelig kan probens lengde være fra tilnærmet 20 til tilnærmet 50 baser. Hybridiseringsprobene kan være avledet fra i det minste delvis nye områder i den native nukleotidsekvens med full lengde, hvori disse områdene kan identifiseres uten omfattende eksperimentering, eller fra genomiske sekvenser som omfatter promotere, enhancerelementer og introner i IL-17A/F med nativ sekvens. For eksempel kan en gjennomsøkingsfremgangsmåte omfatte isolering av det kodende området i IL-17A/F-genet ved anvendelse av den kjente DNA-sekvens for syntese av en utvalgt probe på tilnærmet 40 baser. Hybridiseringsprober kan merkes ved hjelp av en rekke forskjellige merkingsgrupper, innbefattet radioaktive isotoper som<32>P eller<35>S, eller ved enzymatisk merking, for eksempel alkalisk fosfatase koblet til proben via avidin/biotin-koblingssystemer. Merkede prober med en sekvens som er komplementær til sekvensen til IL-17A/F-genet ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for gjennomsøking av biblioteker av humant cDNA, genomisk DNA eller mRNA for å fastslå hvilke medlemmer av slike biblioteker proben hybridiserer til. Hybridiseringsteknikker beskrives i ytterligere detalj i eksemplene nedenfor.
Alle EST-sekvenser som beskrives i den foreliggende patentsøknad kan på tilsvarende måte benyttes som prober ved anvendelse av fremgangsmåtene som beskrives heri.
Andre anvendbare fragmenter av IL-17A/F-nukleinsyrene omfatter "antisense"-eller "sense"-oligonukleotider som omfatter en enkelttrådet nukleinsyresekvens (enten RNA eller DNA) som kan bindes til Il-17A/F-mRNA ("sense")- eller IL-17A/F-DNA ("antisense")-målsekvenser. "Antisense"- eller "sense"-oligonukleotider omfatter ifølge foreliggende oppfinnelse et fragment av det kodende området i IL-17A/F-DNA. Et slikt fragment omfatter generelt minst tilnærmet 14 nukleotider, fortrinnsvis fra tilnærmet 14 til 30 nukleotider. Evnen til å utlede et "antisense" eller "sense"-oligonukleotid basert på en cDNA-sekvens som koder for et gitt protein, beskrives for eksempel i Stein og Cohen (Cancer Res, 48:2659 (1988)) og van der Krol et al. (BioTechniques, 6:958, (1988)).
Binding av "antisense"- eller "sense"-oligonukleotider til målnukleinsyresekvensen fører til dannelse av duplekser som blokkerer transkripsjonen eller translasjonen av målsekvensen på en av flere mulige måter, innbefattet forhøyet nedbrytning av dupleksene, prematur terminering av transkripsjonen eller translasjonen, eller ved andre midler. "Antisense"-oligonukleotidene kan følgelig anvendes for å blokkere ekspresjonen av IL-17A/F-proteiner. "Antisense"- eller "sense"-oligonukleotider omfatter videre oligonukleotider med modifisert sukker-fosfodiester-ryggrad (eller andre sukkerbindinger, for eksempel bindingene beskrevet i WO 91/06629), og hvori slike sukkerbindinger er resistente ovenfor endogene nukleaser. Slike oligonukleotider med resistente sukkerbindinger er stabile in vivo (dvs. i stand til å motstå enzymatisk degradering), men bevarer sekvensspesifisiteten, slik at de kan bindes til målnukleotidsekvenser.
Andre eksempler på "sense"- eller "antisense"-oligonukleotider omfatter oligonukleotider som er kovalent bundet til organiske grupper, for eksempel gruppene som beskrives i WO 90/10048, og andre grupper som øker oligonukleotidets affinintet for en målnukleinsyresekvens, for eksempel poly-(L-lysin). Videre kan interkalerende midler, for eksempel ellipticin, og alkylerende midler eller metallkomplekser kobles til "sense"- eller "antisense"-oligonukleotider for å modifisere "antisense"- eller "sense"-oligonukleotidets bindingspesifisitet for målnukleotidsekvensen.
"Antisense"- eller "sense"-oligonukleotider kan innføres i en celle som inneholder målnukleinsyresekvensen ved hjelp av hvilken som helst fremgangsmåte for genoverføring, innbefattet for eksempel CaP04-formidlet DNA-transfeksjon, elektroporering eller ved anvendelse av genoverføringsvektorer som Epstein-Barr-virus.
I en foretrukket fremgangsmåte innsettes et "antisense"- eller "sense"-oligonukleotid i en egnet retrovirus vektor. En celle som inneholder målnukleinsyresekvensen settes i forbindelse med den rekombinante retrovirusvektor, enten in vivo eller ex vivo. Egnede retrovirusvektorer omfatter, men er ikke begrenset til vektorer avledet fra muse-retrovirus M-MuLV, N2 (et retrovirus avledet fra M-MuLV) eller dobbeltkopi vektorene som betegnes DCT5A, DCT5B og DCT5C (se WO 91/13641).
"Sense"- eller "antisense"-oligonukleotider kan også innføres i en celle som inneholder mål-nukleotidsekvensen ved dannelse av et konjugat med et ligandbindende molekyl som beskrevet i WO 91/04753. Egnede ligandbindende molekyler omfatter, men er ikke begrenset til, celleoverflatereseptorer, vekstfaktorer, andre cytokiner eller andre ligander som bindes til celleoverflatereseptorer. Konjugasjonen til det
ligandbindende molekyl interfererer fortrinnsvis ikke i vesentlig grad med det ligandbindende molekyls evne til å bindes til sitt tilsvarende molekyl eller sin tilsvarende reseptor, eller blokkere inngangen av "sense"- eller "antisense"-oligonukleotidet eller dets konjugerte versjon i cellen.
Alternativt kan et "sense"- eller "antisense"-oligonukleotid innføres i en celle som inneholder målnukleinsyresekvensen ved dannelse av et oligonukleotid-lipidkompleks som beskrevet i WO 90/10448. "Sense"- eller "antisense"-oligonukleotid-lipidkomplekset dissosieres fortrinnsvis i cellen ved hjelp av en endogen lipase.
"Antisense"- eller "sense"-RNA- eller -DNA-molekyler har fortrinnsvis en lengde på minst tilnærmet 5 baser, tilnærmet 10 baser, tilnærmet 15 baser, tilnærmet 20 baser, tilnærmet 25 baser, tilnærmet 30 baser, tilnærmet 35 baser, tilnærmet 40 baser, tilnærmet 45 baser, tilnærmet 50 baser, tilnærmet 55 baser, tilnærmet 60 baser, tilnærmet 65 baser, tilnærmet 70 baser, tilnærmet 75 baser, tilnærmet 80 baser, tilnærmet 85 baser, tilnærmet 90 baser, tilnærmet 95 baser, tilnærmet 100 baser eller mer.
Probene kan også benyttes i PCR-teknikker for fremstilling av en blanding av sekvenser for påvisning av nært beslektede IL-17A/F-kodende sekvenser.
Nukleotidsekvenser som koder for et IL-17A/F kan også anvendes for konstruksjon av hybridiseringsprober for kartlegging av genet som koder for det angjeldende IL-17A/F og for genetisk analyse av individer med genetiske forstyrrelser. Nukleotidsekvensene som tilveiebringes heri kan kartlegges til et kromosom og spesifikke områder i et kromosom ved anvendelse av kjente teknikker, for eksempel in szYw-hybridisering, koblingsanalyse mot kjente kromosommarkører og hybridiserings-gjennomsøking av biblioteker.
Dersom de kodende sekvenser for IL-17 A/F koder for et protein som bindes til et annet protein (hvor proteinet for eksempel er en reseptor) kan proteinet anvendes i analyser for påvisning av de andre proteinene eller molekylene som deltar i bindingsinteraksjonen. Ved hjelp av slike fremgangsmåter kan inhibitorer av reseptor/ligand-bindingsinteraksjonen påvises. Proteiner som deltar i slike bindingsinteraksjoner kan også anvendes for søk etter peptider eller lavmolekylære inhibitorer eller agonister av bindingsinteraksjonen. Videre kan reseptorproteinet anvendes for isolering av en eller flere tilhørende ligander. Det kan utformes gjennomsøkingsanalyser for å finne utgangsforbindelser som etterligner den biologiske aktivitet av et nativt IL-17A/F eller en reseptor for IL-17A/F. Slike gjennomsøkingsanalyser vil omfatte analyser som kan tilpasses gjennomsøking av kjemiske biblioteker med høy kapasitet, noe som gjør den spesielt godt egnet for påvisning av lavmolekylære medikamentkandidater. Små molekyler som omfattes omfatter syntetiske, organiske eller uorganiske forbindelser. Analysene kan utføres i en rekke forskjellige formater, innbefattet protein-protein-bindingsanalyser, biokjemiske analyser, immunanalyser og cellebaserte analyser, som alle er godtkarakterisertinnen faget.
Nukleinsyrer som koder for IL-17A/F eller dets modifiserte former kan også anvendes for fremstilling av enten transgene dyr eller "knock-out"-dyr, som i sin tur er anvendbare for utvikling og analyse av terapeutisk anvendbare reagenser. Et transgent dyr (for eksempel en mus eller rotte) er et dyr som har celler som inneholder et transgen, hvor transgenet ble innført i dyret eller et av dyrets stamfedre i et prenatalt stadium, for eksempel et embryonalt stadium. Et transgen er et DNA som er integrert i genomet til en celle som et transgent dyr utvikles fra. I en utførelse kan DNA som koder for IL-17A/F anvendes for kloning av genomisk DNA som koder for IL-17A/F i samsvar med etablerte teknikker, og de genomiske sekvenser anvendes for fremstilling av transgene dyr som inneholder celler som uttrykker DNA som koder for IL-17A/F. Fremgangsmåter for fremstilling av transgene dyr, særlig dyr som mus eller rotter, har blitt konvensjonelle innen faget og beskrives for eksempel i US patentskrift nr. 4 736 866 og 4 870 009. Typisk vil spesielle celler være målet for innføring av IL-17A/F-transgen med vevsspesifikke enhancere. Transgene dyr som omfatter en kopi av et transgen som koder for IL-17A/F innført i dyrets kjønnscellelinje i embryonalt stadium kan anvendes for å undersøke virkningen av forhøyet ekspresjon av DNA som koder for IL-17A/F. Slike dyr kan anvendes som forsøksdyr for reagenser som antas å gi beskyttelse mot for eksempel patologiske tilstander forbundet med overekspresjon av genet. I samsvar med dette aspekt av oppfinnelsen, behandles et dyr med reagenset, og en redusert forekomst av den patologiske tilstand sammenlignet med ubehandlede dyr som bærer transgenet vil vise en mulig terapeutisk intervensjon for den patologiske tilstand.
Alternativt kan ikke-humane homologer av IL-17A/F anvendes for fremstilling av et IL-17A/F-"knockout"-dyr med et defekt eller endret IL-17A/F-kodende gen som en følge av homolog rekombinasjon mellom det endogene IL-17A/F-kodende gen og endret genomisk DNA som koder for IL-17A/F innført i en embryonal stamcelle i dyret. For eksempel kan cDNA som koder for IL-17A/F anvendes for kloning av genomisk DNA som koder for IL-17A/F i samsvar med etablerte teknikker. En del av det genomiske DNA som koder for IL-17A/F kan deleteres eller erstattes med et annet gen, for eksempel et gen som koder for en seleksjonsmarkør som kan anvendes for å følge integrasjonen. Typisk inngår flere kilobaser med uendret flankerende DNA (både i den 5' og 3' ende) i vektoren (se for eksempel Thomas og Capecchi, Cell, 51:503 (1987) for en beskrivelse av vektorer for homolog rekombinasjon). Vektoren innføres i en embryonal stamcellelinje (for eksempel ved elektroporering), og celler i hvilke det innførte DNA har rekombinert homologt med det endogene DNA utvelges (se for eksempel Li et al, Cell, 69:915 (1992)). De utvalgte cellene injiseres så i en dyreblastocyst (for eksempel en mus eller rotte) for dannelse av aggregasjonskimerer (se for eksempel Bradley i Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, E. J. Robertson, red. (IRL, Oxford, 1987), s. 113-152). Et kimert embryo kan så implanteres i et egnet, pseudodrektig fostermor dyr og embryoet fremføres til fødsel for dannelse av et "knockout"-dyr. Avkom som bærer det homologt rekombinerte DNA i sine kjønnsceller kan identifiseres ved standardteknikker og anvendes for avling av dyr i hvilke alle dyrets celler inneholder det homologt rekombinerte DNA. "Knockout"-dyr kan for eksempel karakteriseres ut fra evnen til beskyttelse mot visse patologiske tilstander og for utvikling av patologiske tilstander grunnet fravær av IL-17 A/F - polypeptidet.
Nukleinsyre som koder for IL-17A/F-polypeptidene kan også anvendes i genterapi. I genterapianvendelser innføres gener i celler for å oppnå in v/vo-syntese av et terapeutisk effektivt genetisk produkt, for eksempel for å erstatte et defekt gen. "Genterapi" omfatter både konvensjonell genterapi, hvor en varig virkning oppnås etter en enkelt behandling, og tilførsel av genterapeutiske midler, noe som omfatter en gangs eller gjentatt tilførsel av et terapeutisk effektivt DNA eller mRNA. "Antisense"-RNA og - DNA kan anvendes som terapeutiske midler for blokkering av ekspresjonen av visse gener in vivo. Det har allerede blitt vist at korte "antisense"-oligonukleotider kan innføres i celler, hvor de virker som inhibitorer, trass i den lave intracellulære konsentrasjon som skyldes det begrensede opptak gjennom cellemembranen (Zamecnik et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 83:4143-4146 (1986)). Oligonukleotidene kan modifiseres for å fremme opptak, for eksempel ved å erstatte de negativt ladde fosfodiestergruppene med uladde grupper.
En rekke forskjellige teknikker er tilgjengelige for innføring av nukleinsyrer i levende celler. Teknikkene varierer avhengig av hvorvidt nukleinsyren overføres til dyrkede celler in vitro, eller in vivo i cellene i den påtenkte vert. Teknikker som er egnede for innføring av nukleinsyrer i pattedyrceller in vitro omfatter anvendelse av liposomer, elektroporering, mikroinjeksjon, cellefusjon, DEAE-dekstran, kalsiumfosfat-utfellingsfremgangsmåten osv. De i dag foretrukne in v/vo-genoverføringsteknikkene omfatter transfeksjon med virusvektorer (typisk retrovirus vektorer) og viralt kappeprotein-liposomformidlet transfeksjon (Dzau et al. Trends in Biotechnology, 11: 205-210 (1993)). I noen situasjoner er det ønskelig å tilveiebringe nukleinsyrekilden sammen med et middel som styrer nukleinsyren til målcellene, for eksempel et antistoff som er spesifikt for et celleoverflatemembranprotein på målcellen, en ligand for en reseptor på målcellen osv. Dersom liposomene benyttes, kan proteinet som bindes til et celleoverflatemembranprotein som er assosiert med encocytose anvendes for målstyring og/eller for å fremme opptaket, for eksempel kapsidproteiner eller fragmenter derav som er topiske for en gitt celletype, antistoffer mot proteiner som gjennomgår internalisering i syklus og proteiner som fører til intracellulær lokalisering og gir forlenget intracellulær halveringstid. Teknikken for reseptorformidlet endocytose beskrives for eksempel av Wu et al, J. Biol. Chem, 262: 4429-4432 (1987) og Wagner et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87: 3410-3414 (1990). For en oversikt over genmerkings- og genterapi-fremgangsmåter, se Anderson et al. Science, 256:808-813 (1992). IL-17A/F-polypeptidene som beskrives heri kan også benyttes som molekylvekt markører for proteinelektroforeseformål, og de isolerte nukleinsyresekvensene kan anvendes for rekombinant ekspresjon av disse markørene.
Nukleinsyremolekylene som koder for IL-17A/F-polypeptidene eller
>fragmentene derav som beskrives heri, er anvendbare for kromosom identifisering. I
denne sammenheng foreligger det et stadig behov for påvisning av nye kromosom-markører, siden relativt få krosom-markørreagenser som bygger på faktiske sekvensdata i dag er tilgjengelige. Alle IL-17A/F-nukleinsyremolekyler ifølge foreliggende
oppfinnelse kan anvendes som kromosommarkører.
IL-17A/F-polypeptidene og -nukleinsyremolekylene ifølge foreliggende oppfinnelse kan også anvendes diagnostisk for vevstypin, hvori IL-17A/F-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan uttrykkes differensielt i et vev sammenlignet med et annet, fortrinnsvis i et sykt vev sammenlignet med et normalt vev av samme vevstype. IL-17A/F-nukleinsyremolekyIer vil finne anvendelse for fremstilling av prober for PCR, Northern-analyse, Southern-analyse og Western-analyse. IL-17A/F-polypeptidene som beskrives heri kan også benyttes som terapeutiske midler. Il-17A/F-polypeptidene ifølge foreliggende oppfinnelse kan utformes ifølge kjente fremgangsmåter for fremstilling av farmasøytisk anvendbare preparater, hvori IL- 17A/F-produktet som beskrives heri kombineres med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Terapeutiske utforminger fremstilles for lagring ved å sammenblande den aktive bestanddel med den ønskede renhetsgrad med om ønskelig fysiologisk aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol, A. red. (1980)) i form av frysetørkede utforminger eller vandige løsninger. Aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottakeren i de benyttede doser og konsentrasjoner, og omfatter buffere som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter, innbefattet askorbinsyre, lavmolekylære polypeptider (med færre enn tilnærmet 10 aminosyrerester), proteiner, for eksempel serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer, for eksempel polyvinylpyrrolidon, aminosyrer som glysin, glutamin, asparagin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater, innbefattet glukose, mannose eller dekstriner, chelateringsmidler, for eksempel EDTA, sukkeralkoholer, for eksempel mannitol eller sorbitol, saltdannende motioner, for eksempel natrium, og/eller ikke-ioniske surfaktanter som TWEEN, PLURONICS eller PEG.
Utforminger som skal anvendes for in vzvø-tilførsel må være sterile. Dette oppnås lett ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner før eller etter frysetørking og rekonstituering.
Terapeutiske preparater heri er generelt plassert i en beholder som har en steril adkomståpning, for eksempel en pose for intravenøse løsninger eller en medisinflaske med en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm kanyle.
Tilførselsveien er i samsvar med kjente fremgangsmåter, for eksempel intravenøs, intraperitoneal, intracerebral, intramuskulær, intraokkulær, intraartiell eller intralesjonal injeksjon eller infusjon, topisk tilførsel eller ved hjelp av systemer for vedvarende frigjøring.
Dosene og de ønskede medikamentkonsentrasjoner av farmasøytiske preparater ifølge foreliggende oppfinnelse kan variere avhengig av den spesielle anvendelse man tenker seg. Fastsettelse av en egnet dose eller tilførselsvei ligger godt innenfor kunnskapsnivået til en alminnelig lege. Dyreforsøk gir pålitelige retningslinjer for fastsettelse av effektive doser for behandling av mennesker. Skalering av effektive doser mellom artene kan utføres ifølge prinsippene som er fremsatt av MOrdenti, J. og Chappell, W, "The use of interspecies scaling in toxicokinetics" i Toxicokinetics aand New Drug Development, Yacobi et al, red, Pergamon Press, New York, 1989, s. 42-96.
Dersom in v/vo-tilførsel av et IL-17A/F-polypeptid eller en agonist eller antagonist derav benyttes, kan normale dosemengder variere fra tilnærmet 10 ng/kg opp til 100 mg/kg kroppsvekt eller mer per dag, fortrinnsvis fra tilnærmet 1 ug/kg/dag til 10 mg/kg/dag, avhengig av tilførselsveien. Retningslinjer når det gjelder spesielle doser og tilførselsfremgangsmåter gis i litteraturen, se for eksempel US patentskrift nr. 4 657 760, 5 206 344 og 5 225 212. Man forventer av forskjellige utforminger vil være effektive for forskjellige behandlingsforbindelser og forskjellige forstyrrelser, og at for eksempel tilførsel rettet mot et organ eller vev kan nødvendiggjøre tilførsel på en måte som er forskjellig fra tilførselen til et annet organ eller vev.
Dersom det er ønskelig med tilførsel med vedvarende frigjøring av et IL-17A/F-polypeptid for en utforming med frigjøringsegenskaper som er egnet for behandling av hvilken som helst sykdom eller forstyrrelse som krever tilførsel av IL-17A/F-polypeptidet, tenker man seg mikroinnkapsling av IL-17A/F-polypeptidet. Mikroinnkapsling av rekombinante proteiner for vedvarende frigjøring har med hell blitt utført med humant veksthormon (rhGH), interferon- (rhIFN-), interleukin-2 og MN rgpl20. Johnson et al, Nat. Med, 2:795-799 (1996), Yasuda, Biomed. Ther, 27:1221-1223 (1993), Hora et al, Bio/Technology, 8:755-758 (1990), Cleland, "Design and Production of Single Immunization Vaccines Using Polylactide Polyglycolide Microsphere Systems" i Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach, Powell og Newman, red, (Plenum Press: New York, 1995), s. 439-462, WO 97/03692, WO 96/40072, WO 96/07399 og US patentskrift nr. 5 654 010.
Utformingene for vedvarende frigjøring av disse proteinene ble utviklet ved anvendelse av polymelkesyre-polyglykolsyre (PLGA)-kopolymer, grunnet biotilgjengeligheten og det brede omfang av biodegraderbare egenskaper. Degraderingsproduktene av PLGA, melkesyre og glykolsyre, kan hurtig fjernes fra menneskekroppen. Videre kan denne polymerens degraderbarhet justeres fra måneder til år, avhengig av molekylvekten og sammensetningen. Lewis, "Controlled release of bioactive agents from lactide/glycolide polymer" i: M. Chasin og R. Langer (red.), Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems (Marcel Dekker: New York, 1990), s. 1-41.
Foreliggende oppfinnelse omfatter fremgangsmåter for analyse av forbindelser for påvisning av forbindelser som etterligner IL-17A/F-polypeptidet (agonister) eller som forhindrer virkningen av IL-17A/F-polypeptidet (antagonister). Analyser for søk etter antagonistiske medikamentkandiater er utformet for påvisning av forbindelser som bindes til eller danner komplekser med IL-17A/F-polypeptidene som kodes av genene som identifiseres heri, eller som på annet vis interfererer med interaksjonen mellom de kodede polypeptidene og andre cellulære proteiner. Slike gjennomsøkingsanalyser vil omfatte analyser som kan tilpasses gjennomsøking med høy kapasitet av kjemiske biblioteker, noe som gjør dem spesielt godt egnet for påvisning av lavmolekylære medikamentkandidater.
Analysene kan utføres i en rekke forskjellige formater, innbefattet protein-proteinbindingsanalyser, biokjemiske analyser, immunanalyser og cellebaserte analyser, som alle er velkarakteriserte innen faget.
Alle analyser for antagonister har til felles at de krever at medikamentkandidaten settes i forbindelse med et IL-17A/F-polypeptid som kodes av en nukleinsyre som er identifisert heri under betingelser og over et tidsrom som er tilstrekkelig for at de to komponentene kan interagere.
I bindingsanalyser er interaksjonen binding, og komplekser som dannes kan isoleres eller påvises i reaksjonsblandingen. I en spesiell utførelse er IL-17A/F-polypeptidet som kodes av genet som er identifisert heri, eller medikamentkandidaten immobilisert til en fast fase, for eksempel til en mikrotiterplate, ved kovalent eller ikke-kovalent tilkobling. Ikke-kovalent tilkobling oppnås generelt ved å belegge den faste overflaten med en løsning av IL-17A/F-polypeptidet og tørke overflaten. Alternativt kan et immobilisert antistoff, for eksempel et monoklonalt antistoff, som er spesifikt for IL-17A/F-polypeptidet som skal immobiliseres anvendes for å forankre det til en fast overflate. Analysen utføres ved å tilsette den ikke-immobiliserte komponent, som kan være merket med en påvisbar merking, til den immobiliserte komponent, for eksempel den belagte overflate som inneholder den forankrede komponent. Når reaksjonen er fullstendig fjernes de ikke-reagerte komponentene, for eksempel ved vask, og komplekser som er forankret til den faste overflate påvises. Dersom den i utgangspunktet ikke immobiliserte komponent bærer en påvisbar merking, viser påvisning av merking immobilisert til overflaten at kompleksdannelse har skjedd. Dersom den i utgangspunktet ikke-immobiliserte bestanddel ikke er merket, kan kompleksdannelse for eksempel påvises ved anvendelse av et merket antistoff som spesifikt binder det immobiliserte kompleks.
Dersom en kandidatforbindelse interagerer med, men ikke bindes til et gitt IL-17A/F-polypeptid som kodes av et gen som er identifisert heri, kan interaksjonen med polypeptidet analyseres ved fremgangsmåter som er velkjente for påvisning av protein-protein interaksjoner. Slike analyser omfatter tradisjonelle tilnærminger, for eksempel kryssbinding, ko-immunutfelling og ko-rensing gjennom gradienter eller kromatografikolonner. I tillegg kan protein-protein-interaksjoner måles ved anvendelse av et gjærbasert genetisk system som beskrives av Fields og medarbeidere (Fields og Song, Nature (London), 340:245-246 (1989)), Chien et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:9578-9582 (1991)) som beskrevet av Chevray og Nathans, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:5789-5793 (1991). Mange transkripsjonsaktivatorer, for eksempel GAL4 fra gjær, består av to fysisk adskilte, modulære domener, et som virker som det DNA-bindende domenet og et som fungerer som transkripsjonsaktiveringsdomenet. Gjær-ekspresjonssystemet som er beskrevet i publikasjonene ovenfor (generelt betegnet "to-hybrid systemet") drar fordel av denne egenskapen og benytter to hybride proteiner, et i hvilket målproteinet er fusjonert til det DNA-bindende domenet fra GAL4 og et annet i hvilket mulige aktiverende proteiner er fusjonert til aktiveringsdomenet. Ekspresjonen av et GALl-/acZ-rapportørgen under kontroll av en GAL4-aktivert promoter avhenger av en rekonstituering av GAL4-aktivitet via protein-protein interaksjoner. Kolonier som inneholder interagerende polypeptider påvises ved hjelp av et kromogent substrat for P-galaktosidase. Et fullstendig sett (MATCHMAKER) for påvisning av protein-protein interaksjoner mellom to spesifikke proteiner ved anvendelse av to-hybrid teknikken er kommersielt tilgjengelig fra Clontech. Dette systemet kan også utvides for kartlegging av proteindomener som inngår i spesifikke proteininteraksjoner, så vel som for identifisering av aminosyrerester som er avgjørende for disse interaksjonene.
Forbindelser som interfererer med interaksjonen mellom et gen som koder for et IL-17A/F-polypeptid som er identifisert heri og andre intracellulære eller ekstracellulære komponenter kan analyseres som følger: vanligvis fremstilles en reaksjonsblanding som inneholder genproduktet og den intra- eller ekstracellulære komponent under betingelser og over et tidsrom som tillater interaksjon og binding mellom de to produktene. For å analysere en kandidatforbindelses evne til å inhibere bindingen, utføres reaksjonen i fravær og nærvær av analyseforbindelsen. I tillegg kan en placebo tilsettes til en tredje reaksjonsblanding for å fungere som en positiv kontroll. Bindingen (kompleksdannelsen) mellom analyseforbindelsen og den intra- eller ekstracellulære komponent som foreligger i blandingen, måles som beskrevet heri ovenfor. Dannelsen av et kompleks i kontrollreaksjonen eller kontrollreaksj onene, men ikke i reaksjonsblandingen som inneholder analyseforbindelsen, viser at analyseforbindelsen interfererer med interaksjonen mellom analyseforbindelsen og reaksjonspartneren.
For søk etter antagonister kan IL-17A/F-polypeptidet tilsettes til en celle sammen med forbindelsen som skal analyseres for en gitt aktivitet, og forbindelsens evne til å inhibere aktiviteten av interesse i nærvær av IL-17A/F-polypeptidet viser at forbindelsen er en antagonist av IL-17A/F-polypeptidet. Alternativt kan antagonister påvises ved å blande IL-17A/F-polypeptidet og en mulig antagonist med membranbundne IL-17A/F-polypeptidreseptorer eller rekombinante reseptorer under egnede betingelser for en kompetivit inhiberingsanalyse. IL-17A/F-polypeptidet kan være merket, for eksempel med radioaktivitet, slik at antall IL-17A/F-polypeptidmolekyler som er bundet til reseptoren kan anvendes for å fastsette den mulige antagonists effektivitet. Genet som koder for reseptoren kan påvises ved en rekke forskjellige fremgangsmåter som er kjente blant fagfolk, for eksempel ligandsortering og FACS-sortering Coligan et al, Current Protocols in Immun, 1(2): Kapitel 5 (1991). Fortrinnsvis anvendes ekspresjonskloning, hvori polyadenylert RNA fremstilles fra en celle som responderer på IL-17A/F-polypeptidet og et cDNA-bibliotek fremstilt av dette RNA oppdeles i porsjoner og anvendes for transfeksjon av COS-celler eller andre celler som ikke responderer på IL-17 A/F-polypeptidet. Transfekterte celler dyrket på objektglass eksponeres ovenfor merket IL-17A/F-polypeptid. IL-17A/F-polypeptidet kan merkes på en rekke forskjellige måter, innbefattet jodering eller innføring av et gjenkjenningssete for en setespesifikk proteinkinase. Etter fiksering og inkubering analyseres objektglassene ved autoradiografi. Positive blandinger identifiseres og underblandinger fremstilles og transfekteres på ny ved anvendelse av en interaktiv prosess for blanding og analyse, noe som til slutt fører til en enkelt klon som koder for den antatte reseptor.
Som en alternativ tilnærming for reseptoridentifisering kan merket IL-17A/F-polypeptid fotoaffinitetskobles til cellemembran eller ekstraktpreparater som uttrykker reseptormolekylet. Kryssbundet materiale fraksjoneres ved PAGE og eksponeres ovenfor røntgenfilm. Det merkede kompleks som inneholder reseptoren kan utkuttes, fraksjoneres i peptidfragmenter og analyseres ved protein-mikrosekvensering. Aminosyresekvensen som erholdes ved mikrosekvensering kan anvendes for utforming av et sett av degenererte oligonukleotidprober for gjennomsøking av et cDNA-bibliotek for påvisning av genet som koder for den antatte reseptor.
I en annen antagonistanalyse vil pattedyrsceller eller et memebranpreparat som uttrykker reseptoren innkuberes med merket IL-17A/F-polypeptid i nærvær av kandidatforbindelsen. Forbindelsens evne til å forsterke eller blokkere denne interaksjonen kan så måles.
Mer spesifikke eksempler på mulige antagonister omfatter et oligonukleotid som bindes til fusjoner mellom et immunglobulin og IL-17A/F-polypeptid, nærmere bestemt til antistoffet som omfatter, men ikke er begrenset til, poly- og monoklonale antistoffer og antistoffragmenter, enkeltkjedede antistoffer, anti-idiotypiske antistoffer og kimere eller humaniserte versjoner av slike antistoffer eller fragmenter, så vel som humane antistoffer og humane antistoffragmenter. Alternativt kan en mulig antagonist være et nært beslektet protein, for eksempel en mutert form av IL-17A/F-polypeptidet som gjenkjenner reseptoren, men som ikke har noen virkning, slik at virkningen av IL-17A/F-polypeptidet inhiberes kompetitivt.
En annen mulig IL-17A/F-polypeptidantagonist er en "antisense"-RNA- eller - DNA-konstruksjon fremstilt ved anvendelse av "antisense"-teknologi, hvor for eksempel et "antisense"-RNA- eller -DNA-molekyl virker ved direkte å blokkere translasjonen av mRNA ved å hybridisere til det ønskede mRNA og forhindre proteintranslasjon. "Antisense"-teknologi kan anvendes for å kontrollere genekspresjonen via trippel-heliks dannelse eller "antisense"-DNA eller -RNA, hvor begge fremgangsmåter bygger på binding av et polynukleotid til DNA eller RNA. For eksempel kan den 5'-kodende del av polynukleotidsekvensen som koder for de modne IL-17A/F-polypeptidene heri anvendes for utforming av et "antisense"-RNA-oligonukleotid med en lengde på fra tilnærmet 10 til 40 basebar. Et DNA-oligonukleotid utformes til å være komplementært til et område av genet som deltar i transkripsjonen (trippel heliks - se Lee et al, Nucl. Acids Res, 6:3073 (1979), Cooney et al. Science, 241:456 (1988), Dervan et al. Science, 251:1360
(1991)), slik at transkripsjonen og dannelsen av IL-17A/F-polypeptidet forhindres. "Antisense"-RNA-oligonukleotidet hybridiserer til mRNA in vivo og blokkerer translasjonen av mRNA-molekylet til IL-17A/F-polypeptid ("antisense" - Okano, Neurochem, 56:560 (1991), Oligodeoxynucleotides as Antisense Inhibitors of Gene Expression (CRC Press: Boca Raton, FL, 1988). Oligonukleotidene som er beskrevet ovenfor kan også tilføres til celler, slik at "antisense"-RNA eller -DNA kan uttrykkes in vivo og inhibere dannelsen av IL-17A/F-polypeptidet. Dersom "antisense"-DNA anvendes, foretrekkes oligodeoksyribonukleotider som er avledet fra translasjonsinitieringssetet, for eksempel mellom tilnærmet -10 - og +10-posisjonen i målgen nukleotidsekvensen.
Mulige antagonister omfatter små molekyler som bindes til det aktive setet,
reseptorbindingssetet eller vekstfaktor bindingssetet eller et annet relevant bindingssete i IL-17A/F-polypeptidet, slik at den normale biologiske aktivitet til IL-17A/F-polypeptidet blokkeres. Eksempler på små molekyler omfatter, men er ikke begrenset til, små peptider eller peptidlignende molekyler, fortrinnsvis løselige peptider, og syntetiske, ikke-peptidbaserte organiske eller uorganiske forbindelser.
Ribozymer er enzymatiske RNA-molekyler som kan katalysere spesifikk kløyving av RNA. Ribozymer virker ved sekvensspesifikk hybridisering til det komplementære mål-RNA, fulgt av endonukleolytisk kløyving. Spesifikke ribozym-kløyvingsseter i et mulig RNA-mål kan påvises ved hjelp av kjente teknikker. For ytterligere detaljer, se for eksempel Rossi, Current Biology, 4:469-471 (1994) og PCT-publikasjon WO 97/33551 (offentliggjort 18. september, 1997).
Nukleinsyremolekyler i trippelheliks dannelse som anvendes for inhibering av transkripsjon bør være enkelttrådede og bestå av deoksynukleotider. Basesammen-setningen til disse oligonukleotidene er utformet slik at den fremmer trippelheliks dannelse via Hoogsteen-reglene for baseparing, noe som generelt krever strekk av puriner eller pyrimidiner med en viss størrelse på en tråd i en dupleks. For ytterligere detaljer, se for eksempel PCT-publikasj on WO 97/33551, supra.
Disse små molekylene kan påvises ved hjelp av en eller flere av gjennomsøkings-analysene som er diskutert heri ovenfor og/eller ved hjelp av hvilke som helst andre analyseteknikker som er velkjente blant fagfolk.
Diagnostiske og terapeutiske anvendelse av de heri beskrevne molekyler kan også bygges på de positive funksjonelle analysetreff som er beskrevet nedenfor.
F. Vevsfordeling
Lokaliteten til vev som uttrykker IL-17A/F kan påvises ved å måle mRNA-ekspresjonen i forskjellige humane vev. Lokaliseringen av slike gener gir informasjon om hvilke vev som sannsynligvis vil påvirkes av IL-17A/F-polypeptidenes stimulerende og inhiberende aktiviteter. Lokaliseringen av et gen i et spesifikt vev tilveiebringer også vevsprøver for aktivitetsblokkeringsanalysene som diskuteres nedenfor.
Som bemerket tidligere, kan genekspresjonen i forskjellige vev måles ved konvensjonell Southern-blotting, Northern-blotting for kvantifisering av mRNA-transkripsjonen (Thomas, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:5201-5205 (1980)), dot-blotting (DNA-analyse) eller in s/fw-hybridisering ved anvendelse av en på egnet vis merket probe, basert på sekvensene som tilveiebringes heri. Alternativt kan det benyttes antistoffer som kan gjenkjenne spesifikke duplekser, innbefattet DNA-duplekser, RNA-duplekser og DNA-RNA-hybridduplekser eller DNA-proteinduplekser.
Genekspresjonen i forskjellige vev kan alternativt måles ved immunologiske fremgangsmåter, for eksempel immunhistokjkemisk farging av vevssnitt og analyse av cellekulturer eller kroppsvæsker for direkte kvantifisering av ekspresjonen av genproduktet. Antistoffer som er anvendbare for immunhistokjemisk farging og/eller analyse av væskeprøver kan enten være monoklonale eller polyklonale og kan være fremstilt i hvilket som helst pattedyr. Antistoffene kan med fordel fremstilles mot et IL-17 A/F-polypeptid med nativ sekvens, eller mot et syntetisk peptid basert på DNA-sekvensene som koder for IL-17A/F-polypeptider, eller mot en eksogen sekvens som er fusjonert til et DNA som koder for et IL-17A/F-polypeptid og som koder for en spesifikk antistoff epitop. Generelle teknikker for fremstilling av antistoffer og spesielle fremgangsmåter for Northern-blotting og in5//w-hybridisering gis nedenfor.
G. Antistoffbindingsundersøkelser
Aktiviteten av IL-17A/F-polypeptidene kan videre bekreftes ved antistoff-bindingsundersøkelser, i hvilke anti-IL-17A/F-antistoffers evne til å inhibere virkningen av IL-17A/F-polypeptidene på vevsceller analyseres. Eksempler på antistoffer omfatter polyklonale, monoklonale, humaniserte, bispesifikke og heterokonjugerte antistoffer, hvis fremstilling vil beskrives heri nedenfor.
Antistoffbindingsundersøkelser kan utføres i hvilken som helst kjent analyse-fremgangsmåte, for eksempel kompetitive bindingsanalyser, direkte og indirekte "sandwich"-analyser og immunutfellingsanalyser. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, s. 147-158 (CRC Press, Inc, 1987).
Kompetitive bindingsanalyser bygger på en market standards evne til å konkurrere med analytten i analyseprøven om binding til en begrenset antistoffmengde. Mengden av målprotein i analyseprøven er invers proporsjonal med mengden av standard som bindes til antistoffene. For å forenkle bestemmelsen av mengden av standard som bindes, gjøres antistoffene fortrinnsvis uløselige før eller etter konkurransen, slik at standarden og analytten som er bundet til antistoffene enkelt kan separeres fra standard og analytt som fortsatt er ubundet.
"Sandwich"-analyser omfatter anvendelse av to antistoffer som bindes til hver sin immunogene del eller epitop i proteinet som skal påvises. I en "sandwich"-analyse bindes analytten i analyseprøven av et første antistoff som er immobilisert til et fast støttemiddel, hvoretter et andre antistoff bindes til analytten, slik at det dannes et uløselig kompleks av tre deler. Se for eksempel US patentskrift nr. 4 376 110. Det andre antistoff kan selv være merket med en påvisbar gruppe (direkte "sandwich"-analyser) eller måles ved anvendelse av et anti-immunglobulin antistoff som er merket med en påvisbar gruppe (indirekte "sandwich"-analyser). For eksempel er en type av "sandwich"-analyse en ELISA-analyse, i hvilket tilfellet den påvisbare gruppe er et enzym. For immunhistokjemisk analyse kan vevsprøven være fersk eller nedfrosset, eller den kan være innstøpt i parafin og fiksert med et konserveringsmiddel, for eksempel formalin.
H. Cellebaserte analyser
Cellebaserte analyser og dyremodeller for immunrelaterte sykdommer kan anvendes for en ytterligere forståelse av sammenhengen mellom genene og polypeptidene som er identifisert heri, og utvikling og patogenese av immunrelatert sykdom.
I en annen tilnærming, transfekteres celler av en celletype som vites å inngå i en gitt immunrelatert sykdom med de cDNA som er beskrevet heri, og evnen til disse cDNA til å stimulere eller inhibere immunfunksjonen analyseres. Egnede celler kan transfekteres med det ønskede gen, og analyseres for immunfunksjonsaktivitet. Slike transfekterte cellelinjer kan så anvendes for å analysere poly- eller monoklonale antistoffers eller antistoffpreparaters evne til å inhibere eller stimulere immunfunksjon, for eksempel til å modulere T-celleproliferasjon eller infiltrasjon av inflammatoriske celler. Celler som er transfektert med de kodende sekvensene i genene som er identifisert heri, kan videre anvendes for påvisning av medikamentkandidater for behandling av immunrelaterte sykdommer.
I tillegg kan primærkulturer avledet fra transgene dyr (som beskrevet nedenfor) anvendes i de cellebaserte analysene heri, selv om stabile cellelinjer foretrekkes. Teknikker for avledning av kontinuerlige cellelinjer fra transgene dyr er velkjente innen faget (se for eksempel Small et al., Mol. Cell. Biol., 5: 642-648 (1985)).
En egnet cellebasert analyse er den blandede lymfocyttreaksjon (MLR). Current Protocols in Immunology, enhet 3.12, redigert av J E Coligan, A M Kruisbeek, D H Marglies, E M Shevach, W Strober, National Institutes of Health, publisert av John Wiley & Sons, Inc. I denne analysen analyseres en analyseforbindelses evne til å stimulere eller inhibere proliferasjonen av aktiverte T-celler. En suspensjon av responder-T-celler dyrkes med allogeneiske stimulatorceller, og T-cellenes proliferasjon måles ved opptak av tritiert tymidin. Denne analysen er et generelt mål på T-cellenes reaktivitet. Siden hovedandelen av T-celler responderer på og danner IL-2 etter aktivering, gjenspeiler forskjeller i responsitivitet i denne analysen delvis forskjeller i IL-2-produksjon mellom de responderende cellene. MLR-resultatene kan bekreftes ved en standard lymfokin (IL-2)-påvisningsanalyse. Current Protocols in Immunology, ovenfor, 3.15, 6.3.
En proliferativ T-cellerespons i en MLR-analyse kan skyldes et analysert molekyls direkte mitogene egenskaper, eller aktivering indusert av et ytre antigen. En ytterligere bekreftelse av IL-17A/F-polypeptidenes T-cellestimulerende aktivitet kan erholdes ved hjelp av en ko-stimuleringsanalyse. T-celleaktivering krever et antigenspesifikt signal som formidles via T-cellereseptoren (CCR) og ko-stimulerende signal formidlet via en andre ligandbindingsinteraksjon, for eksempel B7 (CD80, CD86)/CD28-bindingsinteraksjonen. CD28-kryssbinding gir forhøyet lymfokinsekresjon fra aktiverte T-celler. T-celleaktivering har både negative og positive kontroller via binding av ligander med negativ eller positiv virkning. CD28 og CTLA-4 er beslektede glyko-proteiner i Ig-superfamilien som bindes til B7. Binding av CD28 til B7 har en positiv ko-stimulerende virkning på T-celleaktiveringen, omvendt har binding av CTLA-4 til B7 en negativ, T-celledeaktiverende virkning. Chambers, C. A. og Allison, J. P, Curr. Opin. Immunol, (1997) 9:396. Schwartz, R. H, Cell (1992) 71:1065, Linsley, P. S. og Ledbetter, J. A, Annu. Rev. Immunol, (1993) 11:191, June, C. H. et al, Immunol. Today, (1994), 15:321, Jenkins, M. K, Immunity, (1994) 1:405. I en ko-stimuleringsanalyse analyseres IL-17A/F-polypeptidene for T-celle-ko-stimulerende eller-inhiberende aktivitet.
IL-17A/F-polypeptider samt andre forbindelser ifølge oppfinnelsen som er stimulatorer (ko-stimulatorer) av T-celleproliferasjon og agonister av disse, for eksempel agonistiske antistoffer, bestemt ved MLR og ko-stimuleringsanalyser er for eksempel anvendbare for behandling av immunrelaterte sykdommer som særpreges ved svak, sub-optimal eller utilstrekkelig immunfunksjon. Disse sykdommene behandles ved å stimulere T-cellenes proliferasjon og aktivering (og den T-celleformidlede immunitet) og forsterker immunresponsen i et pattedyr ved tilførsel av en stimulerende forbindelse, for eksempel de stimulerende IL-17A/F-polypeptidene. Det stimulerende polypeptid kan for eksempel være et IL-17 A/F-polypeptid eller et agonistisk antistoff mot dette.
En direkte anvendelse av en stimulerende forbindelse ifølge oppfinnelsen har blitt bekreftet i eksperimenter med 4-lBB-glykoprotein, et medlem av tumornekrose-faktorreseptorfamilien, som bindes til en ligand (4-1BBL) som uttrykkes på klargjorte T-celler og signaliserer T-celleaktivering og-vekst. Alderson, M.E. et al, J. Immunol, 24:2219(1994).
Anvendelsen av en agonistisk, stimulerende forbindelse har også blitt bekreftet eksperimentelt. Aktivering av 4-1BB ved behandling med et agonistisk anti-4-lBB-antistoff, gir forbedret fjerning av tumorer. Hellstrøm, I. og Hellstrøm, K.E, Crit. Rev. Immunol, 18:1 (1998). Immunadjuvansbehandling for behandling av tumorer, beskrevet i mer detalj nedenfor, er et annet eksempel på anvendelse av de stimulerende forbindelsene ifølge oppfinnelsen. En immunstimulerende eller immunforsterkende virkning kan også oppnås ved å antagonisere eller blokkere aktiviteten av et IL-17A/F som har blitt funnet å være inhiberende i MLR-analysen. En motvirkning av forbindelsens inhiberende aktivitet gir en netto stimulerende virkning. Egnede antagonister/blokkerende forbindelser er antistoffer eller fragmenter derav som gjenkjenner og bindes til det inhiberende protein, slik at proteinets effektive interaksjon med sin reseptor blokkeres og signaliseringen via reseptoren inhiberes. Denne virkningen har blitt bekreftet i eksperimenter ved anvendelse av anti-CTLA-4-antistoffer som fremmer T-celleproliferasjonen, formodentlig ved å fjerne det inhiberende signal som skyldes CTLA-4-binding. Walunas, T.L. et al, Immunity, 1:405 (1994).
Alternativt kan en immunstimulerende eller immunforsterkende virkning også oppnås ved tilførsel av et IL-17A/F-polypeptid som har forsterkende virkninger på karpermeabiliteten. En forsterket karpermeabilitet vil være gunstig for forstyrrelser som kan svekkes ved lokal infiltrasjon av immunceller (for eksempel monocytter, eosinofile celler, PMN) og betennelse.
På den annen side, kan IL-17A/F-polypeptider samt andre forbindelser ifølge oppfinnelsen som er direkte inhibitorer av T-celleproliferasjon/-aktivering, lymfokinsekresjon og/eller karpermeabilitet anvendes direkte for å undertrykke immunresponsen. Disse forbindelsene er anvendbare for å redusere graden av immunrespons og for behandling av immunrelaterte sykdommer som særpreges ved en hyperaktiv, superoptimal eller autoimmun respons. Denne anvendelsen av forbindelsene ifølge oppfinnelsen har blitt bekreftet ved eksperimentene beskrevet ovenfor, i hvilke binding av CTLA-4 til reseptoren B7 deaktiverer T-celler. De direkte inhiberende forbindelsene ifølge oppfinnelsen fungerer på en analog måte. Anvendelsen av en forbindelse som undertrykker karpermeabiliteten vil forventes å redusere betennelse. Slike anvendelser vil være gunstige for behandling av tilstander som er forbundet med omfattende betennelse.
Alternativt gir forbindelser, for eksempel antistoffer, som bindes til stimulerende IL-17A/F-polypeptider og blokkerer den stimulerende virkningen av disse molekylene en netto inhiberende virkning og kan anvendes for å undertrykke den T-celleformidlede immunrespons ved å inhibere T-celleproliferasjon/-aktivering og/eller lymfokinsekresjon. En blokkering av polypeptidenes stimulerende virkning undertrykker immunresponsen i pattedyret. Denne anvendelsen har blitt bekreftet i eksperimenter ved anvendelse av et anti-IL2-antistoff. I disse eksperimentene bindes antistoffet til ILI og blokkerer bindingen av IL2 til reseptoren, slik at det oppnås en T-celleinhiberende virkning.
I. Dyremodeller
Resultatene fra de cellebaserte in vrtrø-analysene kan videre bekreftes ved anvendelse av in v/vø-dyremodeller og analyser av T-cellefunksjon. En rekke velkjente dyremodeller kan anvendes for en ytterligere forståelse av rollen til genene som er identifisert heri i utviklingen og patogenesen av immunrelatert sykdom, og for å analysere virkningen av kandidater for terapeutiske midler, innbefattet antistoffer og andre antagonister av de native polypeptidene, innbefattet lavmolekylære antagonister. Slike modellers in v/vo-egenskaper gjør dem prediktive for responser i humane pasienter. Dyremodeller for immunrelaterte sykdommer omfatter både ikke-rekombinante og rekombinante (transgene) dyr. Ikke-rekombinante dyremodeller omfatter for eksempel gnagermodeller, for eksempel musemodeller. Slike modeller kan fremstilles ved å innføre celler i syngeneiske mus ved anvendelse av standard teknikker, for eksempel subkutan injeksjon, injeksjon i halevenen, milt-implantasjon, intraperitoneal implantasjon, implantering under nyrekapselen osv.
Graft-versus-host-sykdom opptrer når immunkompetente celler transplanteres til immunsupprimerte eller tolerante pasienter. Donorcellene gjenkjenner vertsantigener og responderer på dem. Responsen kan variere fra livstruende, alvorlig betennelse til milde tilfeller av diaré og vekttap. Modeller for graft-versus-host-sykdom tilveiebringer et middel for analyse av T-cellereaktiviteten mot MHC-antigener og mindre transplantasjonsantigener. En egnet fremgangsmåte beskrives i detalj i Current Protocols in Immunology, ovenfor, enhet 4.3.
En dyremodell for avvisning av hudallotransplantat er et middel for å analysere T-cellenes evne til å formidle vevsødeleggelse in vivo, og et mål på deres rolle i transplantatawisning. De vanligste og mest aksepterte modellene anvender halehud transplantater i mus. Gjentatte eksperimenter har vist at awisning av allotransplantater av hud formidles av T-celler, hjelper-T-celler og dreper-effektor-T-celler, og ikke av antistoffer. Auchincloss, H. Jr. og Sachs, D.H, Fundamental Immunology, 2. utgave, W.E. Paul, red. Raven Press, NY, 889-992 (1989). En egnet fremgangsmåte beskrives i detalj i Current Protocols in Immunology, ovenfor, enhet 4.4. Andre modeller for transplantatawisning som kan anvendes for analyse av forbindelsene ifølge oppfinnelsen, er de allogeneiske hjertetransplantasjonsmodellene som beskrives av Tanabe, M. et al, Transplantation, 58:23 (1994) og Tinubu, S.A. et al, J. Immunol, 4330-4338 (1994).
Dyremodeller for hypersensitivitet av forsinket type tilveiebringer også en
analyse av celleformidlet immunfunksjon. Hypersensitivitetsreaksjoner av forsinket type er en T-celleformidlet in v/vø-immunrespons som særpreges ved en betennelse som ikke når en topp før etter at det har gått en viss tid etter eksponering ovenfor et antigen. Disse reaksjonene opptrer også i vevsspesifikke, autoimmune sykdommer, for eksempel
multippel sklerose (MS) og eksperimentell autoimmun encefalomyelitt (EAE, en modell for MS). En egnet fremgangsmåte beskrives i detalj i Current Protocols in Immunology, ovenfor, enhet 4.5.
EAE er en T-celleformidlet autoimmun sykdom som særpreges ved inflammasjon av T-celler og mononukleære celler og påfølgende demyelinering av aksoner i sentralnervesystemet. EAE anses generelt å være en relevant dyremodell for MS i mennesker. Bolton, C, Multiple Sclerosis, 1:143 (1995). Både akutte modeller og relakserende-remitterende modeller har blitt utviklet. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan analyseres for T-cellestimulerende eller -inhiberende aktivitet mot immunmediert, demyelinerende sykdom ved anvendelse av fremgangsmåten som beskrives i Current Protocols in Immunology, ovenfor, enhetene 15.1 og 15.2. Se også modellene for myelinsykdom i hvilke oligodendrocytter eller Schwann-celler transplanteres inn i sentral nervesystemet som beskrevet i Duncan, I.D. et al, Molec. Med. Today, 554-561 (1997).
Kontakthypersensitivitet er en enkel in v/vø-analyse av hypersensitivitet av forsinket type med celleformidlet immunfunksjon. I denne fremgangsmåten fører kutanøs eksponering ovenfor eksogene haptener til en hypersensitivitetsreaksjon av forsinket type, som måles og kvantifiseres. Kontaktsensitivitet omfatter en innledende sensitiviseringsfase, fulgt av en utløsningsfase. Utløsningsfasen opptrer når T-lymfocyttene møter et antigen som de tidligere har vært i kontakt med. Svelling og betennelse opptrer, noe som gjør dette til en utmerket modell for allergisk kontaktdermatitt i mennesker. En egnet fremgangsmåte beskrives i detalj i Current Protocols in Immunology, red, J.E. Cologan, A.M. Kruisbeek, D.H. Margulies, E.M. Shevach og W. Strober, John Wiley & Sons, Inc, enhet 4.2 (1994). Se også Grabbe, S. og Schwarz, T, Immun. Today, 19(l):37-44 (1998).
En dyremodell for artritt er kollagenindusert artritt. Denne modellen har kliniske, histologiske og immunologiske egenskaper felles med autoimmun rematoid artritt i mennesket, og er en akseptert modell for human autoimmun artritt. Muse- og rottemodeller særpreges ved synovitt, og erosjon av brusk og subkondralbeinet. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan analyseres for aktivitet mot autoimmun artritt ved anvendelse av fremgangsmåtene som beskrives i Current Protocols in Immunology, ovenfor, enhet 15.5. Se også modellen som anvender et monoklonalt antistoff mot CD 18 og VLA-4-integriner som beskrives i Issekutz, A.C. et al, Immunology, 88:569 (1996).
En modell for astma har blitt beskrevet, i hvilken antigenindusert hyper-reaktivitet i luftveiene, pulmonal eosinofili og betennelse induseres ved å sensitivisere et dyr med ovalbumin og så utsette dyret for det samme protein tilført som en aerosol. Flere dyremodeller (marsvin, rotte, ikke-menneskelig primat) viser symptomer som ligner på atopisk astma i mennesker etter eksponering ovenfor antigener i en aerosol. Musemodellene har mange av egenskapene forbundet med astma i mennesket. Egnede fremgangsmåter for analyse av forbindelsene ifølge oppfinnelsen for aktivitet og effektivitet ved behandling av astma, beskrives av Wolyniec, W. W. et al. Am. J. Respir. Cell Mol. Biol, 18:777 (1998) og referansene som siteres i denne.
I tillegg kan forbindelsene ifølge oppfinnelsen analyseres i dyremodeller for psoriasis-lignende sykdommer. Det foreligger materiale som tyder på en T-cellebasert patogenese for psoriasis. Forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan analyseres i scid/scid-musemodellen som beskrives av Schon, M.P. et al, Nat. Med, 3:183 (1997), i hvilken musene viser histopatologiske hudlesjoner som ligner psoriasis. En annen egnet modell er menneskehud/scid-musekimeren, fremstilt som beskrevet av Nickoloff, B.J. et al. Am. J. Path, 146:580 (1995).
Rekombinante (transgene) dyremodeller kan fremstilles ved å innføre den kodende del av genene som er identifisert heri i genomet til dyr av interesse, eller anvendelse av standardteknikker for fremstilling av transgene dyr. Dyr som kan fungere som mål for transgen manipulering omfatter, men er ikke begrenset til, mus, rotter, kaniner, marsvin, sauer, geiter, griser og ikke-menneskelige primater, for eksempel bavianer, sjimpanser og apekatter. Teknikker som er kjente innen faget for innføring av et transgen i slike dyr omfatter pronukleær mikroinjeksjon (Hoppe og Wanger, US patentskrift nr. 4 873 191), retrovirusformidlet genoverføring til kjønscellelinjer (se for eksempel Van der Putten et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82, 6148-615 (1985)), genstyring i embryonale stamceller (Thompson et al, Cell, 56, 313-321 (1989)), elektroporering av fosteret (Lo, Mol. Cel. Biol, 3, 1803-1814 (1983)) og sædcelleformidlet genoverføring (Lavitrano et al, Cell, 57, 717-73 (1989)). For en oversikt, se for eksempel US patentskrift nr. 4 736 866.
For foreliggende oppfinnelses formål omfatter transgene dyr, dyr som bærer transgenet i kuri en del av cellene ("mosaikkdyr"). Transgenet kan være integrert enten som et enkelt transgen eller i konkatamerer, for eksempel hode-hode- eller hode-hale-tandemer. En selektiv innføring av et transgen i en gitt celletype er også mulig ved å for eksempel følge teknikken til Lasko et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89, 6232-636
(1992).
Ekspresjonen av transgenet i transgene dyr kan måles ved standardteknikker. For eksempel kan Southern-blott analyse eller PCR-amplifisering anvendes for å bekrefte integrasjonen av transgenet. mRNA-ekspresjonsnivået kan så analyseres ved teknikker som in j/tø-hybridisering, Northern-blott analyse, PCR eller immuncytokjemisk analyse.
Dyrene kan videre undersøkes for tegn på patologisk immunsykdom, for eksempel ved en histologisk undersøkelse for å påvise infiltrasjon av immunceller i spesifikke vev. Det kan også utføres blokkerende eksperimenter, i hvilke de transgene dyr behandles med forbindelsene ifølge oppfinnelsen for å bestemme graden av forbindelsenes stimulerende eller inhiberende virkning på T-celleproliferasjon. I disse eksperimentene tilføres blokkerende antistoffer som bindes til IL-17A/F-polypeptidet, fremstile som beskrevet ovenfor, til dyret, og virkningen på immunfunksjonen bestemmes.
Alternativt kan det konstrueres "knockout"-dyr som har et defekt eller endret gen som koder for et polypeptid som er identifisert heri som en følge av homolog rekombinasjon mellom det endogene polypeptidkodende gen og et endret genomisk DNA som koder for det samme polypeptid som er innført i en embryonal celle i dyret. For eksempel kan cDNA som koder for et gitt polypeptid anvendes for kloning av genomisk DNA som koder for polypeptidet i samsvar med etablerte teknikker. En del av det genomiske DNA som koder for et gitt polypeptid, kan deleteres eller erstattes med et annet gen, for eksempel et gen som koder for en seleksjonsmarkør som kan anvendes for å måle integrasjonen. Typisk inngår flere kilobaser med uendret, flankerende DNA (både i den 5' og 3' ende) i vektoren (se for eksempel Thomas og Capecchi, Cell, 51:503
(1987) for en beskrivelse av vektorer for homolog rekombinasjon). Vektoren innføres i en embryonal stamcellelinje (for eksempel ved elektroporering), og celler i hvilket det innførte DNA har rekombinert homologt med det endogene DNA utvelges (se for eksempel Li et al, Cell, 69:915 (1992)). De utvalgte cellene injiseres så i en nyreblastocyst (for eksempel en mus eller rotte) for dannelse av aggregasjonskimerer (se for eksempel Bradley i Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Pratical Approach, EJ. Robertson, red. (RIL, Oxford, 1987), s. 113-152). Et kimert embryo kan så implanteres i en egnet, pseudodrektig fostermor og fosteret frembringes til fødsel for fremstilling av et "knockout"-dyr. Avkom som bærer det homologt rekombinerte DNA i sine kjønnsceller kan identifiseres ved standardteknikker og anvendes for fremavl av dyr i hvilke alle dyrets celler inneholder det homologt rekombinerte DNA. "Knockout"-dyr kan for eksempel karakteriseres når det gjelder evnen til å forsvare seg mot visse patologiske tilstander og for utvikling av patologiske tilstander grunnet fravær av polypeptidet.
J. Immunadiuvans terapi
I en utførelse kan de immunstimulerende forbindelsene ifølge oppfinnelsen anvendes i immunadjuvansterapi for behandling av tumorer (kreft). Det er nå godt etablert at T-celler gjenkjenner humane tumorspesifikke antigener. En gruppe av tumorantigener som kodes av genfamiliene MAGE, BAGE og GAGE uttrykkes i noe voksent, normalt vev, men uttrykkes i signifikante mengder i tumorer, for eksempel melanomer, lungetumorer, tumorer i hode og hals og urinblære karsinomer. DeSmet, C. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93:7149 (1996). Det har blitt vist at kostimulering av T-celler induserer tumorregresjon og en antitumorrespons, både in vitro og in vivo. Melero, I. et al. Nature MEdicine, 3:682 (1997), Kwon, E.D. et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 94: 8099 (1997), Lynch, D.H. et al. Nature Medicine, 3:625 (1997), Finn, O.J. og Lotze, M.T, J. Immunol, 21:114 (1998). De stimulerende forbindelsene ifølge oppfinnelsen kan tilføres som adjuvanser, alene eller sammen med et vekstregulerende middel, et cytotoksisk middel eller et kjemoterapeutisk middel, for stimulering av T-celleproliferasjon/-aktivering og en antitumorrespons mot tumorantigener. Det vekstregulerende, cytotoksiske eller kjemoterapeutiske middel kan tilføres i konvensjonelle mengder ved anvendelse av kjente tilførselsmåter. Den immunstimulerende aktivitet av forbindelsene ifølge oppfinnelsen tillater reduserte mengder av de vekstregulerende, cytotoksiske eller kjemoterapeutiske midlene, slik at de kan redusere toksisiteten for pasienten.
K. Analyser for søk etter medikamentkandidater
Analyser for søk etter medikamentkandidater er utformet for påvisning av forbindelser som bindes til eller danner komplekser med polypeptidene som kodes av genene som er identifisert heri, eller et biologisk aktivt fragment derav, eller som på annet vis interfererer med interaksjonen mellom de kodede polypeptidene og andre cellulære proteiner. Slike gjennomsøkingsanalyser vil omfatte analyser som kan tilpasses gjennomsøking av kjemiske biblioteker med høy kapasitet, noe som gjør dem spesielt godt egnet for påvirkning av lavmolekylære medikamentkandidater. Små molekyler som omfattes innbefatter syntetiske, organiske eller uorganiske forbindelser, innbefattet peptider, fortrinnsvis løselige peptider, (poly)peptid-immunglobulinfusjoner og særlig antistoffer, innbefattet, men ikke begrenset til, poly- og monoklonale antistoffer og antistoffragmenter, enkeltkjedede antistoffer, anti-idiotypiske antistoffer og kimere eller humaniserte versjoner av slike antistoffer eller antistoffragmenter, så vel som humane antistoffer og humane antistoffragmenter. Analysene kan utføres i en rekke forskjellige formater, innbefattet protein-protein-bindingsanalyser, biokjemiske analyser, immunanalyser og cellebaserte analyser, som alle er godt karakteriserte innen faget. Alle analyser har til felles at de krever at medikamentkandidaten settes i forbindelse med et polypeptid som kodes av en nukleinsyre som er identifisert heri under betingelser, og over et tidsrom som er tilstrekkelig til at de to komponentene kan interagere.
I bindingsanalyser er interaksjonen binding, og det dannede kompleks kan isoleres eller påvises i reaksjonsblandingen. I en spesiell utførelse er polypeptidet som kodes av genet som er identifisert heri, eller medikamentkandidaten immobilisert til en fast fase, for eksempel til en mikrotiter plate, ved kovalent eller ikke-kovalent tilkobling. Ikke-kovalent tilkobling oppnås generelt ved å belegge den faste overflaten med en løsning av polypeptidet og tørke overflaten. Alternativt kan et immobilisert antistoff, for eksempel et monoklonalt antistoff, som er spesifikt for polypeptidet som skal immobiliseres anvendes for å forankre det til en fast overflate. Analysen utføres ved å tilsette den ikke-immobiliserte komponent, som kan være merket med en påvisbar merkingsgruppe, til den immobiliserte komponent, for eksempel den belagte overflate som inneholder den forankrede komponent. Når reaksjonen er fullstendig, fjernes de ikke-reagerte komponentene, for eksempel ved vask, og komplekser som er forankret til den faste overflate påvises. Dersom den i utgangspunktet ikke-immobiliserte komponent bærer en påvisbar merking, viser påvisning av merking immobilisert til overflaten at kompleksdannelse har skjedd. Dersom den i utgangspunktet ikke-immobiliserte komponent ikke er merket, kan kompleksdannelsen for eksempel påvises ved anvendelse av et merket antistoff som spesifikt binder det immobiliserte kompleks.
Dersom kandidatforbindelsen interagerer med, men ikke bindes til, et gitt protein som kodes av et gen som er identifisert heri, kan interaksjonen med proteinet analyseres ved fremgangsmåter som er velkjente for påvisning av protein-protein-interaksjoner. Slike analyser omfatter tradisjonelle tilnærminger, for eksempel kryssbinding, ko-immunutfelling og ko-rensing gjennom gradienter eller kromatografikolonner. I tillegg kan protein-protein-interaksjoner måles ved anvendelse av et gjærbasert genetisk system som er beskrevet av Fields og medarbeidere (Fields og Song, Nature (London), 340,. 245-246 (1989, Chien et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88, 9578-9582 (1991)), som beskrevet av Chevray ogNathans, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89, 5789-579 (1991). Mange transkripsjonsaktivatorer, f.eks. GAL4 fra gjær, består av to fysisk adskilte, modulære domener, et som virker som det DNA-bindende domenet, mens det andre fungerer som transkripsjonsaktiveringsdomenet. Gjærekspresjonssysteinet som er beskrevet i publikasjonene ovenfor (generelt betegnet "to-hybrid systemet") drar fordel av denne egenskapen og benytter to hybride proteiner, et i hvilket målproteinet er fusjonert til det DNA-bindende domenet fra GAL4 og et annet i hvilket kandidater for aktiverende proteiner er fusjonert til aktiveringsdomenet. Ekspresjonen av et GAL1-lacZ-raportørgen under kontroll av en GAL4-aktivert promoter avhenger av en rekonstituering av GAL4-aktivitet via protein-protein interaksjon. Kolonier som inneholder interagerende polypeptider påvises med et kromogent substrat for |3-galaktosidase. Et fullstendig sett (MATCHMAKER) for påvisning av protein-protein interaksjoner mellom to spesifikke proteiner ved anvendelse av to-hybrid teknikken er kommersielt tilgjengelig. Dette systemet kan også utvides for kartlegging av proteindomener som deltar i spesifikke proteininteraksjoner, så vel som for identifisering av aminosyrerester som er avgjørende for disse interaksjonene.
For å finne forbindelser som interfererer med interaksjon mellom et gen som er identifisert heri og andre intra- eller ekstracellulære komponenter, fremstilles vanligvis en reaksjonsblanding som inneholder genproduktet og den intra- eller ekstracellulære komponent under betingelser og over et tidsrom som tillater interaksjonen og bindingen mellom de to produktene. For å analysere en forbindelses evne til å inhibere bindingen, utføres reaksjonen i fravær og nærvær av analyseforbindelsen. I tillegg kan en placebo tilsettes til en tredje reaksjonsblanding for å fungere som en positiv kontroll. Bindingen (kompleksdannelsen) mellom analyseforbindelsen og den intra- eller ekstracellulære komponent som foreligger i blandingen måles som beskrevet ovenfor. Dannelsen av et kompleks i kontrollreaksjonen eller kontrollreaksjonene, men ikke i reaksjonsblandingen som inneholder analyseforbindelsen, viser at analyseforbindelsen interfererer med interaksjonen mellom analyseforbindelsen og reaksjonspartneren.
L. Preparater og fremgangsmåter for behandling av immunrelaterte sykdommer
Preparatene som er anvendbare for behandling av immunrelaterte sykdommer omfatter, men er ikke begrenset til, proteiner, antistoffer, små organiske molekyler, peptider, fosfopeptider, "antisense"- og ribozymmolekyler, trippelheliks molekyler osv. som inhiberer eller stimulerer en immunfunksjon, for eksempel T-celleproliferasjon/ aktivering, lymfokinfrigjøring eller immuncelleinfiltrasjon.
For eksempel virker "antisense"-RNA og RNA-molekyler ved direkte å blokkere transflasjonen av mRNA ved å hybridisere til mål-mRNA og forhindre proteintranslasjon. Dersom "antisense"-DNA anvendes, foretrekkes oligodeoksyribonukleotider som er avledet fra translasjonsinitieringssetet, for eksempel mellom tilnærmet posisjon - 10 og posisjon +10 i målgen nukleotidsekvensen.
Ribozymer er enzymatiske RNA-molekyler som kan katalysere spesifikk kløyving av RNA. Ribozymer virker ved en sekvensspesifikk hybridisering til det komplementære mål-RNA, fulgt av endonukleolytisk kløyving. Spesifikke ribozym-kløyvingsseter i et mulig RNA-mål kan påvises ved kjente teknikker. For ytterligere detaljer, se for eksempel Rossi, Current Biology, 4, 469-471 (1994) og PCR-publikasjon WO 97/33551 (offentliggjort 18. september 1997).
Nukleinsyremolekyler i trippelheliks formasjon som anvendes for inhibering av transkripsjon bør være enkelttrådede og bestå av deoksynukleotider. Basesammen-setningen til disse oligonukleotidene er utformet slik at den fremmer trippelheliks dannelse via Hoogsteen-reglene for baseparing, noe som generelt krever strekk av en viss størrelse av puriner eller pyrimidiner i en tråd i en dupleks. For ytterligere detaljer, se for eksempel PCT-publikasj on WO 97/33551, supra.
Disse molekylene kan påvises ved hvilken som helst kombinasjon av gjennom-søkingsanalysene som er diskutert ovenfor og/eller ved hjelp av hvilke som helst andre gjennomsøkingsteknikker som er velkjente blant fagfolk.
M. Anti- IL- 17 A/ F- antistoffer
I en utførelse tilveiebringer foreliggende oppfinnelse anti-IL-17A/F-antistoffer som kan finne anvendelse heri som terapeutiske og/eller diagnostiske midler. Eksempler på antistoffer omfatter polyklonale, monoklonale, humaniserte, bispesifikke og heterokonjugerte antistoffer.
1. Polyklonale antistoffer
Polyklonale antistoffer frembringes fortrinnsvis i dyr ved flere gangers subkutan (sc) eller intraperitoneal (ip) injeksjon av det relevante antigen og en adjuvans. Det kan være nyttig å konjugere det relevante antigen til et protein som er immunogent i arten som skal immuniseres (særlig dersom det anvendes syntetiske peptider). For eksempel kan antigenet konjugeres til hemocyanin fra albueskjell (KLH), serumalbumin, bovint tyroglobulin eller trypsininhibitor fra soyabønne ved anvendelse av et bifunksjonelt middel eller derivatiseringsmiddel, for eksempel maleimidobenzoylsulfosuksinimidester (konjugering via cysteinrester), N-hydroksysuksinimid (via lysinrester), glutaraldehyd, ravsyreanhydrid, SOCl2eller R<1>N=C=NR, hvor R og R<1>er forskjellige alkylgrupper.
Dyr immuniseres mot antigenet, de immunogene konjugatene eller derivatene ved å sammenblande for eksempel 100 u.g eller 5 |ig av proteinet eller konjugatet (for kaniner henholdsvis mus) med tre volumet Freunds komplette adjuvans og injisere løsningen intradermalt i flere seter. En måned senere gir dyrene en forsterkinjeksjon med 1/5 til 1/10 av den opprinnelige mengde av peptid eller konjugat i Freunds komplette adjuvans ved subkutan injeksjon i flere seter. 7 til 14 dager senere tappes blod fra dyrene, og serum analyseres for antistofftiter. Dyrene gis forsterkede injeksjoner inntil titeret plater ut. Konjugater kan også fremstilles i rekombinant cellekultur som proteinfusjoner. Videre kan aggregeringsmidler, for eksempel alum, med fordel anvendes for å forsterke immunresponsen.
2. Monoklonale antistoffer
Monoklonale antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av hybridomfremgangsmåten, først beskrevet av Kohler et al. Nature, 256:495 (1975), eller de kan fremstilles ved rekombinante DNA-fremgangsmåter (US patentskrift nr. 4 816 567).
I hybridomfremgangsmåten immuniseres en mus eller et annet egnet vertsdyr, for eksempel en hamster, som beskrevet ovenfor for fremkalling av lymfocytter som danner eller kan danne antistoffer som vil bindes spesifikt til proteinet som anvendes for immunisering. Alternativt kan lymfocytter immuniseres in vitro. Etter immuniseringen isoleres lymfocytter og fusjoneres så til en myelomcellelinje ved anvendelse av et egnet fusjonsmiddel, for eksempel polyetylenglykol, slik at det dannes en hybridomcelle (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)).
De således fremstilte hybridomcellene utsås og dyrkes i et egnet dyrkningsmedium, hvor mediet fortrinnsvis inneholder en eller flere forbindelser som inhiberer vekst eller overlevelse av de ikke-fusjonerte utgangsmyelomcellene (også betegnet fusjonspartner). Dersom for eksempel utgangsmyelomcellene mangler enzymet hypoxantinguanin fosforibosyltransferase (HGPRT eller HPRT), vil det selektive dyrkningsmedium for hybridomene typisk omfatte hypoxantin, aminopterin og tymidin (HAT-medium), hvor disse forbindelsene forhindrer veksten av celler som mangler
HGPRT.
Foretrukne myelomceller som fusjonspartnere er celler som fusjonerer effektivt, som understøtter en stabil produksjon i høyt nivå av antistoff fra de valgte antistoffproduserende cellene og som er sensitive ovenfor et selektivt medium som selekterer mot de ikke-fusjonerte utgangscellene. Foretrukne myelomcellelinjer er muse-myelomcellelinjer, for eksempel cellelinjene avledet fra musetumorene MOPC-21 og MPC-11, som er tilgjengelige fra Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, California, USA, og SP-2 og derivater derav, for eksempel X63-Ag8-653-celler, som er tilgjengelige fra American Type Culture Collection, Manassas, Virginia, USA. Humane myelomcellelinjer og mus-menneske-heteromyelomcellelinjer har også blitt beskrevet for fremstilling av humane monoklonale antistoffer (Kozbor, J. Immunol, 133:3001 (1984) og Brodeur et al, Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, s. 51-63 (Marcel Dekker, Inc, New York, 1987)).
Dyrkningsmediet som hybridomcellene vokser i, analyseres for dannelse av monoklonale antistoffer rettet mot antigenet. Fortrinnsvis bestemmes bindingsspesifisiteten for monoklonale antistoffer som dannet fra hybridomceller ved immunutfelling eller en in v#ro-bindingsanalyse, for eksempel en radioimmun analyse (RIA) eller enzymkoblet immunabsorpsjonsanalyse (ELISA).
Det monoklonale antistoffs bindingsaffinitet kan for eksempel bestemmes ved Scatchard-analysen som beskrives i Munson et al. Anal. Biochem, 107:220 (1980).
Når først hybridomceller som danner antistoffer med den ønskede spesifisitet, affinitet og/eller aktivitet har blitt påvist, kan klonene subklones ved grensefotrynnings-fremgangsmåter og dyrkes ved standard fremgangsmåter (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, s. 59-103 (Academic Press, 1986)). Egnede dyrkningsmedier for dette formål omfatter for eksempel D-MEM- eller RPMI-1640-medium. I tillegg kan hybridomcellene dyrkes in vivo som ascites tumorer i et dyr, for eksempel ved i.p.-injeksjon av cellene i mus.
De monoklonale antistoffene som utskilles fra subklonene separeres på egnet vis fra dyrkningsmediet, ascites væsken eller serum ved konvensjonelle fremgangsmåter for antistoffrensing, for eksempel affinitetskromatografi (for eksempel ved anvendelse av protein A- eller protein G-Sepharose) eller ionebytter kromatografi, hydroksylapatitt kromatografi, gelelektroforese, dialyse osv.
DNA som koder for de monoklonale antistoffene kan lett isoleres og sekvenseres ved anvendelse av konvensjonelle fremgangsmåter (for eksempel ved anvendelse av oligonukleotidprober som kan bindes spesifikt til gener som koder for museantistoffers tungkjede og lettkjede). Hybridomcellene fungerer som en foretrukket kilde for slikt DNA. Etter isoleringen kan DNA plasseres i ekspresjonsvektorer, som så transfekteres inn i vertsceller, for eksempel E. cø/z'-celler, COS-apeceller, Kinahamster ovarieceller (CHO-celler) eller myelomceller som ellers ikke danner antistoffprotein, for å oppnå syntese av monoklonale antistoffer i de rekombinante vertscellene. Oversiktsartikler vedrørende rekombinant ekspresjon i bakterie av DNA som koder for antistoffet omfatter Skerra et al, Curr. Opinion in Immunol, 5:256-262 (1993) og Pliikthun, Immunol Revs, 130:151-188 (1992).
I en videre utførelse kan monoklonale antistoffer eller antistoffragmenter isoleres fra bakteriofagbaserte antistoffbiblioteker fremstilt ved anvendelse av teknikkene som beskrives i McCafferty et al. Nature, 348:552-554 (1990). Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) og Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597 (1991) beskriver isolering av museantistoffer, henholdsvis humane antistoffer ved anvendelse av bakteriofagbiblioteker. Senere publikasjoner beskriver fremstillingen av humane antistoffer med høy affinintet (i nM-området) ved kjedestokking (Marks et al, Bio/Technology), 10:779-783 (1992)), så vel som ved kombinatorisk infeksjon og in v/vo-rekombinasjon som en strategi for konstruksjon av svært store bakteriofagbiblioteker (Waterhouse et al, Nuc. Acids. Res, 21:2265-2266 (1993)). Disse teknikkene er følgelig levedyktige alternativer til tradisjonelle hybridomteknikker for isolering av monoklonale antistoffer.
Det DNA som koder for antistoffet kan modifiseres, slik at det dannes kimere antistoff polypeptider eller fusjonsantistoff polypeptider, for eksempel ved å innføre humane konstant tungkjede- og lettkjede (CH og CL)-sekvenser i stedet for de homologe musesekvensene (US patentskrift nr. 4 816 567 og Morrison et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:6851 (1984)), eller ved å fusjonere den immunglobulinkodende sekvens til hele eller en del av den kodende sekvens for et ikke-immunglobulin polypeptid (et heterologt polypeptid). Ikke-immunglobulin polypeptidsekvensene kan erstatte de konstante domenene i et antistoff eller erstatte de variable domenene i et antigenbindende sete i et antistoff, slik at det dannes et kimert, bivalent antistoff som omfatter et antigenbindende sete med spesifisitet for et antigen, og et annet antigenbindende sete med spesifisitet for et annet antigen.
3. Humane og humaniserte antistoffer
Anti-IL-17A/F-antistoffene ifølge oppfinnelsen kan videre omfatte humaniserte antistoffer eller humane antistoffer. Humaniserte former av ikke-humane antistoffer (for eksempel fra mus) er kimere immunglobuliner, immunglobulinkjeder eller fragmenter derav (for eksempel Fv, Fab, Fab', F(ab')2eller andre antigenbindende undersekvenser fra antistoffer) som inneholder minimal sekvens avledet fra ikke-humant immunglobulin. Humaniserte antistoffer omfatter humane immunglobuliner (mottakerantistoff) i hvilke aminosyrerester i et komplementaritetsbestemmende område (CDR) i mottakerantistoffet er erstattet med aminosyrerester fra et CDR fra en ikke-menneskelig art (et donorantistoff), for eksempel mus, rotte eller kanin, med den ønskede spesifisitet, affinitet og kapasitet. I noen tilfeller erstattes Fv-rammeverkrester i det humane immunglobulin med tilsvarende ikke-humane aminosyrerester. Humaniserte antistoffer kan også omfatte aminosyrerester som verken forefinnes i mottakerantistoffet eller de importerte CDR- eller rammeverksekvenser. Generelt vil det humaniserte antistoff omfatte i det vesentlige hele av minst et og typisk to variable domener, i hvilke alle eller i det vesentlige alle CDR-områder tilsvarer CDR-områdene i et ikke-humant immunglobulin, og alle eller i det vesentlige alle FR-områder er FR-området fra en human immunglobulin-konsensus-sekvens. Det humaniserte antistoff vil også om ønskelig omfatte i det minste en del av et konstant immunglobulinområde (Fe), typisk fra et humant immunglobulin (Jones et al. Nature, 321:522-525 (1986), Riechmann et al. Nature, 332:323-329 (1988) og Presta, Curr. Op. Struct. Biol, 2:593-596 (1992)).
Fremgangsmåter for humanisering av ikke-humane antistoffer er velkjente innen faget. Generelt har et humanisert antistoff fått innført en eller flere aminosyrerester fra en ikke-mennskelig kilde. Disse ikke-humane aminosyrerestene betegnes ofte "import"-aminosyrerester og er typisk tatt fra et variabelt "import"-domene. Humanisering kan i det vesentlige utføres ifølge fremgangsmåten til Winter og medarbeidere (Jones et al. Nature. 321:522-525 (1986), riechmann et al. Nature, 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science, 239:1534-1536 (1988), ved å innføre CDR eller CDR-sekvenser fra gnagere, i stedet for de tilsvarende sekvenser i et humant antistoff. Slike "humaniserte" antistoffer er følgelig kimere antistoffer (US patetnskrift nr. 4 816 567) i hvilke i det vesentlige mindre enn et intakt, humant variabelt domene har blitt erstattet med den tilsvarende sekvens fra en ikke-mennskelig art. I praksis er humaniserte antistoffer typisk humane antistoffer i hvilke noen CDR-aminosyrerester og muligens noen FR-aminosyrerester er erstattet med aminosyrerester fra analoge seter i gnagerantistoffer.
Valget av humane, variable domener, både i lettkjeden og tungkjeden, som skal anvendes for fremstilling av de humaniserte antistoffene er svært viktig for å redusere antigenisiteten og HAMA-responsen (humant anti-museantistoff) dersom antistoffet er beregnet for terapeutisk anvendelse i mennesker. Ifølge den såkalte "beste tilpasning"-fremgangsmåte, sammenlignes sekvensen i det variable domene i et gnagerantistoff med det fullstendige bilbiotek av kjente humane variabelt domene-sekvenser. Den humane V-domenesekvens som ligger nærmest gnagersekvensen påvises, og det humane rammeverkområdet (FR) i denne aksepteres for det humaniserte antistoff (Sims et al, J. Immunol, 151:2296 (1993), Chothia et al, J. Mol. Biol, 196:901 (1987)). En annen fremgangsmåte anvender et bestemt rammeverkområde avledet fra konsensussekvensen for alle humane antistoffer fra en gitt under gruppe av lettkjeder eller tungkjeder. Det samme rammeverk kan anvendes for flere forskjellige humaniserte antistoffer (Carter et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 89:4285 (1992), Presta et al, J. Immunol, 151:2623
(1993)).
Det er videre viktig at antistoffer humaniseres på en slik måte at man bevarer den høye bindingsaffinintet for antigenet og andre fordelaktige, biologiske egenskaper. For å oppnå dette mål, fremstilles ifølge en foretrukket fremgangsmåten, humaniserte antistoffer ved en prosess som omfatter analyse av utgangssekvensene og forskjellige tenkte, humaniserte produkter ved anvendelse av tredimensjonale modeller av utgangssekvensene og de humaniserte sekvensene. Tredimensjonale immunglobulinmodeller er alminnelig tilgjengelige og velkjente blant fagfolk. Datamaskinprogrammer som illustrerer og fremviser sannsynlige tredimensjonale konformasjonsstrukturer for utvalgte immunglobulinsekvenskandidater er tilgjengelige. En undersøkelse av de fremviste strukturene muliggjør en analyse av aminosyrerestenes sannsynlige rolle i funksjonen av immunglobulin sekvenskandidaten, dvs. en analyse av aminosyrerester som påvirker immunglobulinkandidatens evne til å binde sitt antigen. På denne måten kan FR-aminosyrerester utvelges og kombineres fra mottakersekvensene og importsekvensene, slik at den ønskede antistoffegenskap, for eksempel forhøyet affinitet for målantigenet eller målantigenene oppnås. Generelt deltar aminosyrerestene i det hypervariable området mest direkte og omfattende i påvirkning av antigenbindingen.
Forskjellige former av et humanisert anti-IL-17A/F-antistoff omfattes. Det humaniserte antistoff kan for eksempel være et antistoffragment, for eksempel et Fab-fragment, som om ønskelig er konjugert til et eller flere cytotoksiske midler, slik at det dannes et immunkonjugat. Alternativt kan det humaniserte antistoff være et intakt antistoff, for eksempel et intakt IgGl-antistoff.
Som et alternativ til humanisering kan det fremstilles humane antistoffer. Det er for eksempel nå mulig å fremstille transgene dyr (for eksempel mus) som etter immunisering kan danne et fult repertoar av humane antistoffer i fravær av endogen immunglobulinproduksjon. Det har for eksempel blitt beskrevet at homozygot delesjon av genet for antistoffets tungkjede koblingsområde (JH) i kimere og kjønnscellemutante mus fører til en fullstendig inhibering av den endogene antistoffproduksjon. En overføring av den humane immunglobulin genansamling fra kjønnsceller til slike kjønnscellemutante mus vil føre til dannelse av humane antistoffer etter eksponering ovenfor antigen. Se for eksempel Jakobovits et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:2551
(1993), Jakobovits et al. Nature, 362:255-258 (1993), Bruggemann et al. Year in Immuno, 7:33 (1993), US patentskrift nr. 5 545 806, 5 569 825, 5 591 669 (alle fra GenPharm), 5 545 807 og WO 97/17852.
Alternativt kan bakteroifagfremvisningsteknologi (McCafferty et al. Nature, 348:552-553 (1990)) anvendes for fremstilling av humane antistoffer og antistoff-fragmenter in vitro fra repertoarer av variable (V) immunglobulindomenegener fra ikke-immuniserte donorer. Ifølge denne teknikken klones antistoff-V-domenegener med opprettholdt leseramme inn i genet for enten et hyppig eller mindre hyppig forekommende kappeprotein i en filamentøs bakteroifag, for eksempel Ml3 eller fd, og fremvises som funksjonelle antistoffragmenter på overflaten av bakteriofagpartikkelen. Siden den filamentøse partikkelen inneholder en enkelttrådet DNA-kopi av bakteriofag-genomet, vil seleksjoner basert på antistoffets funksjonelle egenskaper også føre til seleksjon av genet som koder for antistoffet som viser disse egenskapene. Bakteriofagen etterligner således noen av egenskapene til B-cellen. Bakteriofagfremvisning kan utføres i en rekke forskjellige formater, og en oversikt gis for eksempel i Johnson, Kevin S. og Chiswell, David J, Current Opinion in Structural Biology, 3:564-571 (1993). Flere V-gensegmentkilder kan anvendes for bakteroifagfremvisning. Clackson et al. Nature, 352:624-628 (1991) isolerte en sammensatt ansamling av anti-oksazolonantistoffer fra et lite, tilfeldig kombinatorisk bibliotek av V-gener erholdt fra milt fra immuniserte mus. Et repertoar av V-gener fra ikke-immuniserte, humane donorer kan konstrueres, og antistoffer mot et bredt utvalg av antigener (innbefattet selv-antigener) kan isoleres, i det vesentlige ifølge teknikkene som beskrives av Marks et al, J. Mol. Biol, 222:581-597
(1991) eller Griffith et al, EMBO J, 12:725-734 (1993). Se også US patentskrift nr. 5 565 322 og 5 573 905.
Som diskutert ovenfor kan humane antistoffer også fremstilles fra in vitro-aktiverte B-celler (se US patentskrift nr. 5 567 610 og 5 229 275).
4. Antistoffragmenter
Under visse omstendigheter er det fordeler forbundet med anvendelse av antistoffragmenter snarere enn intakte antistoffer. Fragmentenes mindre størrelse muliggjør en hurtig clearance og kan føre til forbedret tilgang til faste tumorer.
Forskjellige teknikker har blitt utviklet for fremstilling av antistoffragmenter. Tradisjonelt ble disse fragmentene erholdt ved proteolytisk spalting av intakte antistoffer (se for eksempel Moritmoto et al. Journal of Biochemical and Biophysical Methods, 24:107-117 (1992) og Brennan et al. Science, 229:81 (1985)). Disse fragmentene kan imidlertid nå fremstilles direkte fra rekombinante vertsceller. Fab-, Fv- og ScFv-antistoffragmenter kan alle uttrykkes i og utskilles fra E. coli, noe som muliggjør enkel fremstilling av store mengder av disse fragmentene. Antistoffragmenter kan isoleres fra antistoff-bakteriofagbibliotekene som er diskutert ovenfor. Alternativt kan Fab'-SH- fragmenter gjenvinnes direkte fra E. coli og sammenkobles kjemisk for dannelse av F(ab')2-fragmenter (Carter et al, Bio/Technology, 10:163-167 (1992)). Ifølge en annen tilnærming kan F(ab')2-fragmenter isoleres direkte fra en rekombinant vertscellekultur. Fab- og F(ab')2-fragment med forlenget halveringstid in vivo som omfatter aminosyrerester fra en "salvage"-reseptorbindende epitop beskrives i US patentskrift nr. 5 869 046. Andre teknikker for fremstilling av antistoffragmenter vil være åpenbare for fagpersonen. I noen utførelser er det valgte antistoff et enkeltkjedet Fv-fragment (scFv). Se WO 93/16185, US patentskrift nr. 5 571 894 og US patentskrift nr. 5 587 458. Fv og sFv er de eneste molekyler med intakte bindingsseter som mangler konstante områder, disse er følgelig egnet for redusert uspesifikk binding ved in v/vo-anvendelse. sFv-fusjonsproteiner kan fremstilles slik at effektorprotein er fusjonert til enten aminoenden eller karboksyenden av et sFv. Se Antibody Engineering, red, Borrebæck, supra. Antistoffragmentet kan også være et "lineært antistoff, for eksempel som beskrevet i US patentskrift nr. 5 641 870. Slike lineære antistoffragmenter kan være monospesifikke eller bispesifikke.
5. Bispesifikke antistoffer
Bispesifikke antistoffer er antistoffer som har bindingsspesifisitet for minst to forskjellige epitoper. Eksempler på bispesifikke antistoffer kan bindes til to forskjellige epitoper på et IL-17A/F-protein som beskrevet heri. Andre slike antistoffer kan kombinere et IL-17A/F-bindende sete med et bindingssete for et annet protein. Alternativt kan en anti-IL-17A/F-arm kombineres med en arm som bindes til et utløsermolekyl på en leukocytt, for eksempel et T-cellereseptormolekyl (for eksempel CD3), eller Fc-reseptorer for IgG (FcyR), for eksempel FcyRI (CD64), FcyRII (CD32) og FcyRIII (CD 16), slik at cellulære forsvarsmekanismer fokuseres og lokaliseres til den IL-17A/F-uttrykkende celle. Bispesifikke antistoffer kan også anvendes for å lokalisere cytotoksiske midler til celler som uttrykker IL-17A/F. Disse antistoffene besitter en IL-17A/F-bindende arm, og en arm som binder det cytotoksiske middel (for eksempel saporin, anti-interferon-a, vinca alkaloid, ricin-A-kjede, metotreksat eller en radioaktiv isotop). Bispesifikke antistoffer kan fremstilles som fullengde antistoffer eller antistoff-fragmenter (for eksempel bispesifikke F(ab')2-antistoffer).
WO 96/16673 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-FcyRIII-antistoff, mens US patentskrift nr. 5 837 234 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-FcyRI-antistoff. Et bispesifikt anti-ErbB2/Fca-antistoff vises i WO 98/02463. US patentskrift nr. 5 821 337 beskriver et bispesifikt anti-ErbB2/anti-CD3-antistoff.
Fremgangsmåter for fremstilling av bispesifikke antistoffer er kjente innen faget. Tradisjonell fremstilling av fullengde bispesifikke antistoffer bygger på samtidig ekspresjon av to immunglobulin tungkjede-lettkjedepar, hvor de to kjedene har forskjellig spesifisitet (Millstein et al. Nature, 305:537-539 (1983)). Grunnet den tilfeldige sorteringen av immunglobulintungkjeder og-lettkjeder, danner disse hybridomene (kvadromene) en mulig blanding av 10 forskjellige antistoffmolekyler, av hvilke kun et har den korrekte bispesifikke struktur. Rensing av det korrekte molekyl, noe som vanligvis utføres ved affinitetskromatografitrinn er temmelig arbeidskrevende og produktutbyttet er lavt. Lignende fremgangsmåter beskrives i WO 93/08829 og i Traunecker et al, EMBO J, 10:3655-3659 (1991).
Ifølge en annen tilnærming fusjoneres variable antistoffdomener med de ønskede bindingsspesifisiteter (antistoff-antigenbindende seter) til konstante immunglobulin domenesekvenser. Fusjonen er fortrinnsvis til et konstant Ig-tungkjededomene som omfatter i det minste en del av hengselområdet, CH2-området og CH3-området. Det foretrekkes at det første konstante tungkjedeområdet (CH1), som inneholder setet som er nødvendig for binding av lettkjeden, foreligger i minst en av fusjonene. DNA som koder for immunglobulin tungkjedefusjonene og, om ønskelig immunglobulinlettkjeden, innsettes i separate ekspresjonsvektorer og ko-transfekteres inn i en egnet vertscelle. Dette gir større fleksibilitet når det gjelder justering av forholdet mellom de tre polypeptidfragmentene i utførelser hvor et ulikt forhold mellom de tre polypeptidkj edene som anvendes i konstruksjonen gis det optimale utbyttet av det ønskede bispesifikke antistoff. Det er imidlertid mulig å innsette de kodende sekvensene for to av polypeptidkjedene eller alle tre i en enkelt ekspresjonsvektorer dersom ekspresjon av minst to polypeptidkjeder gis samme mengde fører til høyt utbytte, eller dersom forholdet mellom polypeptidkjedene ikke på signifikant måte påvirker utbyttet av den ønskede kjede-kombinasjon.
I en foretrukket utførelse av denne tilnærmingen består de bispesifikke antistoffene av en hybrid immunglobulintungkjede med en første bindingsspesifisitet i en arm, og et hybrid immunglobulintungkjede-lettkjedepar (som tilveiebringer en andre bindingsspesifisitet) i den andre armen. Det ble funnet at denne asymmetriske strukturen forenkler separasjonen av den ønskede bispesifikke forbindelse fra uønskede immun-globulinkjedekombinasjoner, siden nærvær av en immunglobulinlettkjede i kun halvparten av det bispesifikke molekyl muliggjør en enkel separasjonsmåte. Denne tilnærmingen beskrives i WO 94/04690. For ytterligere detaljer vedrørende fremstilling av bispesifikke antistoffer, se for eksempel Suresh et al, Methods in Enzymology, 121:210(1986).
Ifølge en annen tilnærming som beskrives i US patentskrift nr. 5 731 168, kan grenseflaten mellom et par av antistoffmolekyler modifiseres slik at prosentandelen av heterodimerer som gjenvinnes fra rekombinant cellekultur maksimaliseres. Den foretrukne grenseflate omfatter i det minste en del av CH3-domenet. I denne fremgangsmåten erstattes en eller flere så aminosyresidekjeder i grenseflaten i det første antistoffmolekyl med større sidekjeder (for eksempel tyrosin eller tryptofan). Kompenserende "hulrom" med en størrelse som er identisk med eller tilsvarer størrelsen av den eller de store sidekj edene, dannes på grenseflaten i det andre antistoffmolekyl ved å erstatte store aminosyresidekjeder med mindre (for eksempel alanin eller treonin). Dette tilveiebringer en mekanisme for så å øke utbyttet av heterodimeren fremfor andre, uønskede sluttprodukter, for eksempel homodimerer.
Bispesifikke antistoffer omfatter kryssbundne celler eller "heterokonjugerte" antistoffer. For eksempel kan et av antistoffene i heterokonjugatet være koblet til avidin og det andre til biotin. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått for å styre immunsystemceller til uønskede celler (US patentskrift nr. 4 676 980) og for behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360, WO 92/200373 og EP 03089). Heterkonjugerte antistoffer kan fremstilles ved anvendelse av hvilke som helst egnede kryssbindings-fremgangsmåter. Egnede kryssbindingsmidler er velkjente innen faget og beskrives i US patentskrift nr. 4 676 980 sammen med en rekke kryssbindingsteknikker.
Teknikker for fremstilling av bispesifikke antistoffer fra antistoffragmenter er også beskrevet i litteraturen. For eksempel kan bispesifikke antistoffer fremstilles ved anvendelse av kjemisk sammenkobling. Brennan et al. Science, 220:81 (1985) beskriver en fremgangsmåte i hvilken intakte antistoffer spaltes proteolytisk for dannelse av F(ab')2-fragmenter. Disse fragmentene reduseres i nærvær av ditiolkompleksbindings-middelet natriumarsenitt for stabilisering av vicinale ditiolgrupper og for forhindre intermolekylær disulfiddannelse. De dannede Fab'-fragmenter omdannes så til tionitrobenzoat (TNB)-derivater. Et av Fab'-TNB-derivatene tilbakeføres så til Fab'-tiol ved reduksjon med merkaptoetylamin og sammenblandes med en ekvimolar mengde av det andre Fab'-TNB-derivat for dannelse av det bispesifikke antistoff. De bispesifikke antistoffene som dannes kan anvendes som midler for selektiv immobilisering av enzymer.
Nyere fremskritt har forenklet direkte gjenvinning av Fab'-SH-fragmenter fra E. coli, hvor disse kan sammenkobles kjemisk for dannelse av bispesifikke antistoffer. Shalaby et al, J. Exp. Med, 175:217-225 (1992) beskriver fremstillingen av fullt ut humanisert, bispesifikt F(ab'^-antistoffmolekyl. Hvert av Fab'-fragmentene ble separert utskilt fra E. coli og behandlet ved styrt, kjemisk kobling in vitro for dannelse av det bispesifikke antistoff. Det således dannede bispesifikke antistoff kunne bindes til celler som overuttrykte ErbB2-reseptoren, og til normale, humane T-celler, samt utløse den lytiske aktivitet av humane, cytotoksiske lymfocytter mot humane brystumor målceller. Forskjellige teknikker for fremstilling og isolering av bispesifikke antistoffragmenter direkte fra rekombinant cellekultur er også beskrevet. For eksempel har bispesifikke antistoffer blitt fremstilt ved anvendelse av leucin-"zippere". Kostelny et al, J. Immunol, 148(5): 1547-1553 (1992). Leuzin-"zipper"-peptidene fra proteinene Fos og Jun ble koblet til Fab'-delen av to forskjellige antistoffer ved genfusjon. Antistoff-homodimerene ble redusert i hengselområdet for dannelse av monomerer og så reoksidert for dannelse av antistoff-heterodimerene. Denne fremgangsmåten kan også benyttes for fremstilling av antistoff-homodimerer. "Diastoff '-teknologien som beskrives av Hollinger et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:6444-6448 (1993) tilveiebringer en alterantiv mekanisme for fremstilling av bispesifikke antistoffragmenter. Fragmentene omfatter et VH-domene bundet til et VL-domene via en linker som er for kort til at de to domenene i samme kjede kan danne et par. Følgelig tvinges VH og VL-domenet i et fragment til å danne par med de komplementære VLog VH-domenene i et annet fragment, slik at det dannes to antigenbindende seter. En annen strategi for fremstilling av bispesifikke antistoffragmenter ved anvendelse av enkeltkjedet Fv (sFv)-dimerer har også blitt rapportert. Se Gruber et al, J. Immunol, 152:5368 (1994).
Antistoffer med flere en to valenser omfattes. Man kan for eksempel fremstille trispesifikke antistoffer. Tutt et al, J. Immunol, 147:60 (1991).
6. Heterokonjugerte antistoffer
Heterokonjugerte antistoffer omfattes også av den foreliggende oppfinnelse. Heterokonjugerte antistoffer består av to kovalent sammenbundne antistoffer. Slike antistoffer har for eksempel blitt foreslått for å styre immunsystemceller til uønskede celler (US patentskrift nr. 4 676 980), og for behandling av HIV-infeksjon (WO 91/00360, WO 92/200373, EP 03089). Man tenker seg at antistoffene kan fremstilles in vitro ved anvendelse av kjente fremgangsmåter innen syntetisk proteinkjemi, innbefattet fremgangsmåter som omfatter kryssbindingsmidler. For eksempel kan immuntoksiner fremstilles ved anvendelse av en disulfldutbyttingsreaksjon eller ved dannelse av en tioeterbinding. Eksempler på egnede reagenser for dette formå omfatter iminotiolat og metyl-4-merkaptobutyrimidat, og reagensene som for eksempel beskrives i US patentskrift nr. 4 676 980.
7. Multivalente antistoffer
Et multivalent antistoff kan internaliseres (og/eller kataboliseres) hurtigere enn et bivalent antistoff av en celle som uttrykker et antigen som antistoffene bindes til. Antistoffene ifølge foreliggende oppfinnelse kan være multivalente antistoffer (som er forskjellige fra antistoffene i IgM-klassen) med tre eller flere antigenbindende seter (for eksempel tetravalente antistoffer), som lett kan fremstilles ved rekombinant ekspresjon av nukleinsyre som koder for antistoffets polypeptidkjeder. Det multivalente antistoff kan omfatte et dimeriseringsdomene og tre eller flere antigenbindende seter. Det foretrukne dimeriseringsdomenet omfatter (eller består av) et Fc-område eller et hengselområde. I dette scenario vil antistoffet omfatte et Fc-område og tre eller flere antigenbindende seter som ligger aminoterminalt for Fc-området. Det foretrukne multivalente antistoff heri omfatter (eller består av) fra 3 til tilnærmet 8, fortrinnsvis 4 antigenbindende seter. Det multivalente antistoff omfatter minst en polypeptidkjede (og fortrinnsvis to polypeptidkjeder), hvori polypeptidkjeden eller -kjedene omfatter to eller flere variable domener. Polypeptidkjeden eller -kjedene kan for eksempel omfatte VDl-(Xl)n-VD2-(X2)n-Fc, hvori VD1 er et første variabelt domene, VD2 er et andre variabelt domene, Fc er en polypeptidkjede fra et Fc-område, XI og X2 står for en aminosyre eller et polypeptid, og n er 0 eller 1. Polypeptidkjeden eller -kjedene kan for eksempel omfatte VH-CH1 -fleksibel linker-VH-CH1 -Fc-område eller VH-CH1-VH-CH1-Fc-område. Det multivalente antistoff heri omfatter fortrinnsvis videre minst to (og fortrinnsvis fire) polypeptider fra lettkjedens variable domene. Det multivalente antistoff heri kan for eksempel omfatte fra tilnærmet 2 til tilnærmet 8 polypeptider fra lettkjedens variable domene. Polypeptidene fra lettkjedens variable domene som omfattes heri, omfatter et variabelt lettkjededomene og om ønskelig videre et CL-domene.
8. Modifisering av effektorfunksjoner
Det kan være ønskelig å modifisere antistoffet ifølge oppfinnelsen når det gjelder effektorfunksjon, for eksempel for å forsterke antistoffets antigenavhengige celleformidlede cytotoksisitet (ADCC) og/eller komplementavhengig cytotoksisitet (CDC). Dette kan oppnås ved å innføre en eller flere aminosyresubstitusjoner i antistoffets Fc-område. Alternativt eller i tillegg kan en eller flere cysteinrester innføres i Fc-området, slik at dannelse av interkjede-disulfidbindinger tillates i dette området. Det således fremstilte homodimere antistoff kan ha forbedret internaliseringsevne og/eller forhøyet komplementfonnidlet celledreping og antistoffavhengig cellulær cytotoksisitet (ADCC). Se Caron et al., J. Exp Med., 176:1191-1195 (1992) og Shopes, B., J. Immunol, 148:2918-2922 (1992). Homodimere antistoffer med forhøyet anti-tumoraktivitet kan også fremstilles ved anvendelse av heterobifunksjonelle kryssbindere som beskrevet i Wolff et al. Cancer Research, 53:2560-2565 (1993). Alternativt kan det fremstilles et antistoff som har to Fc-områder, og følgelig kan ha forhøyet komplementlysering og ADCC-evne. Se Stevenson et al, Anti-Cancer Drug Design, 3:219-230 (1989). For å forlenge antistoffets halveringstid i serium kan man innføre en "salvage"-reseptorbindende epitop i antistoffet (fortrinnsvis et antistoffragment), som for eksempel beskrevet i US patentskrift nr. 5 739 277. Som anvendt heri viser begrepet "salvage-reseptorbindende epitop" til en epitop fra Fc-området i et IgG-moIekyl (for eksempel IgG), IgG2, IgG3eller IgG4) som er ansvarlig for å forlenge IgG-molekyler in vivo-halveringstid i serum.
9. Immunkonjugater
Oppfinnelsen gjelder også immunkonjugater som omfatter et antistoff konjugert til et cytotoksisk middel, for eksempel et kjemoterapeutisk middel, et vekstinhiberende middel, et toksin (for eksempel et enzymatisk aktivt toksin med opphav i bakterier, sopp, planter eller dyr eller fragmenter derav) eller en radioaktiv isotop (dvs. et radiokonjugat).
Kjemoterapeutiske midler som er anvendbare for fremstilling av slike immunkonjugater er beskrevet ovenfor. Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav som kan anvendes omfatter difteri-A-kjede, ikke-bindende, aktive fragmenter av difteritoksin, eksotoksin-A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosd), ricin A-kjede, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede, alfa-sarcin, Aleurites fordii- proteintr, diantinproteiner, Phytolaca americana-<p>rotemer (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia-inhibitor, kurcin, krotin, saponaria officinalis-inhibitor, gelonin, mitogellin, restriktocin, fenomycin, enomycin og trikotecenene. En rekke forskjellige radioaktive isotoper er tilgjengelige for fremstilling av radiokonjugerte antistoffer. Eksempler omfatter<212>Bi,1311,13<1>In,<90>Y og<186>Re. Konjugater mellom antistoffet og det cytotoksiske middel fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige bifunksjonelle proteinsmmen-koblingsmidler, for eksempel N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditiol)propionat (SPDP), iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (for eksempel dimetyladipimidat-HCl), aktive estere (for eksempel disuksinimidylsuberat), aldehyder (for eksempel glutaraldehyd), bis-azidoforbindelser (for eksempel bis(p-azidobenzoyl)heksandiamin), bis-diazoniumderivater (for eksempel bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (for eksempel tolyen-2,6-diisocyanat) og bis-aktivt fluorforbindelser (for eksempel l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). For eksempel kan et ricinimmuntoksin fremstilles som beskrevet i Vitetta et al. Science, 238: 1098 (1987). Karbon- 14-merket l-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylentriaminpenta-eddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på et chelateringsmiddel for konjugering av en radioaktiv isotop til antistoffet. Se WO 94/11026.
Konjugater mellom et antistoff og et eller flere lavmolekylære toksiner, for eksempel et kalicheamicin, maytansionider, et trikoten og CC 1065, og derivater av disse toksinene med toksinaktivitet omfattes også heri.
Maytansin og maytansinoider
I en foretrukket utførelse er et anti-IL-17 A/F-antistoff (fullengde eller fragment) ifølge oppfinnelsen konjugert til et eller flere maytansinoidmolekyler.
Maytansinoider er mitoseinhibitorer som virker ved å inhibere tubulinpoly-merisering. Maytansin ble først isolert fra den øst-afrikanske busken Maytenus serrata (US patentskrift nr. 3 896 111). Senere ble det oppdaget at visse mikrober også danner maytansionider, for eksempel maytansinol og C-3-maytansinolestere (US patentskrift nr. 4 151 042). Syntetisk maytansinol og derivater og analoger derav beskrives for eksempel i US patentskrift nr. 4 137 230, 4 248 870, 4 256 746, 4 260 608, 4 265 814, 4 294 757, 4 307 016, 4 308 268, 4 308 269, 4 309 428, 4 313 946, 4 315 929, 4 317 821, 4 322 348,4 331 598,4 361 650, 4 364 866, 4 424 219, 4 450 254, 4 362 663 og 4 371 533, hvis beskrivelser inkorporeres heri ved referanse.
Maytansinoid-antistoffkonjugater
I et forsøk på å forbedre den terapeutiske indeks har maytansin og maytansinoider blitt konjugert til antistoffet som spesifikt bindes til tumorcelle antigener. Immunkonjugater som inneholder maytansinoider og terapeutisk anvendelse av dem beskrives for eksempel i US patentskrift nr. 5 208 020 og 5 416 064 og i europeisk patentskrift EP 0 425 235 Bl, hvis beskrivelser inkorporeres heri ved referanse. Liu et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 93:8618-8623 (1996) beskrev immunkonjugater som omfatte et maytansinoid betegnet DM1 koblet til det monoklonale antistoff C242, som er rettet mot human, kolorektal kreft. Konjugatet ble funnet å være svært cytotoksisk ovenfor dyrkede kolonkreftceller og viste antitumoraktivitet i en in v/vo-tumorvekst analyse. Chari et al. Cancer Research, 52:127-131 (1992) beskriver immunkonjugater i hvilke et maytansinoid var konjugert via en disulfidlinker til museantistoff A7, som bindes til et antigen på humane kolonkreftcellelinjer, eller til et annet monoklonalt museantistoff, TA.l, som binder onkogenet HER- 2/ neu. Cytotoksisiteten av TA.l-maytansinoidkonjugatet ble analysert in vitro mot den humane brystkreftcellelinjen SK-BR-3, som uttrykker 3 x IO<5>HER-2-overflateantigener per celle. Medikamentkonjugatet oppnådde en grad av cytotoksisitet som tilsvarte det frie maytansinoidmedikament, og cytotoksisiteten kunne økes ved å øke antall maytansinoidmolekyler per antistoffmolekyl. A7-maytansinoidkonjugatet viste lav systemisk cytotoksisitet i mus.
Anti-IL-17A/F-polypeptidantistoff-maytansinoidkonjugater (immunkonjugater)
Anti-IL-17A/F-antistoff-maytansinoidkonjugater fremstilles ved kjemisk kobling av et anti-IL-17A/F-antistoff til et maytansinoidmolekyl uten i signifikant grad å redusere den biologiske aktivitet av verken antistoffet eller maytansinoidmolekylet. Gjennomsnittlig 3-4 maytansinoidmolekyler konjugert per antistoffmolekyl har vist virkning når det gjelder forhøyet cytotoksisitet ovenfor målcellene uten negativ virkning på antistoffets funksjon eller løselighet, selv om selv et molekyl toksin/antistoff vil forventes å ha høyere cytotoksisitet enn det nakne antistoff. Maytansinoider er velkjente innen faget og kan syntetiseres ved kjente teknikker eller isoleres fra naturlige kilder. Egnede maytansinoider beskrives for eksempel i US patentskrift nr. 5 208 020 og i de andre patentskrifter og ikke-patentpublikasjoner som det vises til heri ovenfor. Foretrukne maytansinoider er maytansinol og maytansinblanaloger som er modifisert i den aromatiske ringen eller i andre posisjoner i maytansinolmolekylet, for eksempel forskjellige maytansinolestere.
Mange linkergrupper er kjente innen faget for fremstilling av antistoff-maytansinoidkonjugater, innbefattet for eksempel dem som beskrives i US patentskrift nr. 5 208 020 eller i EP patentskrift nr. 0 425 235 Bl og Chari et al. Cancer Research, 52:127-131 (1992). Linkergruppene omfatter disulfidgrupper, tioetergrupper, syrelabile grupper, lyslabile grupper, peptidaselabile grupper eller esteraselabile grupper, som beskrevet i de ovenfor angitte patentskrifter, hvor disulfidgrupper og tioetergrupper foretrekkes.
Konjugater mellom antistoffet og maytansinoid kan fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige bifunksjonelle proteinsammenkoblingsmidler, for eksempel N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)-sykloheksan-l-karboksylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (for eksempel dimetyladipimidat-HCl), aktive estere (for eksempel disuksinimidylsuberat), aldehyder (for eksempel glutaraldehyd), bis-azidoforbindelser (for eksempel bis(p-azidobenzoyl)-heksandiamin), bis-diazoniumderivater (for eksempel bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanat (for eksempel toluen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (for eksempel l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). Spesielt foretrukne koblingsmidler omfatter N-suksinimidyl-3-(2-pyridylditio)propionat (SPDP)
(Carsson et al, Biochem. J, 173:723-737 (1978)) og N-suksinimidyl-4-(2-pyridyltio)pentanoat (SPP) for innføring av en disulfidbinding.
Linkeren kan festes til maytansinoidmolekylet i forskjellige posisjoner, avhengig av typen binding. For eksempel kan en esterbinding dannes ved reaksjon med en hydroksylgruppe ved anvendelse av konvensjonelle koblingsteknikker. Reaksjonen kan skje i C-3-posisjon med en hydroksylgruppe, C-14-posisjon modifisert med en hydroksymetylgruppe, C-15-posisjon modifisert med en hydroksylgruppe og C-20-posisjon med en hydroksylgruppe. I en foretrukket utførelse dannes bindingen i Op-posisjon i maytansinol eller en maytansinolanalog.
Kalicheamicin
Et annet immunkonjugat av interesse omfatter et anti-IL-17A/F-antistoff konjugert til et eller flere kalicheamicin-molekyler. Kalicheamicinfamilien av antibiotika kan danne dobbelttrådede DNA-brudd i sub-pikomolare konsentrasjoner. For fremstilling av konjugater av kalicheamicinfamilien, se US patentskrift nr. 5 712 374,
5 714 586, 5 739 116, 5 767 285, 5 770 701, 5 770 710, 5 773 001, 5 877 296 (alle tilhørende American Cyanamid Company). Strukturanaloger av kalicheamicin som kan anvendes omfatter, men er ikke begrenset til, v/, a2',CI3<1>, N-acetyl-yj<1>, PSAG og Ø<1>!
(Hinman et al. Cancer Research, 53:3336-3342 (1993), Lode et al. Cancer Research, 58:2925-2928 (1998) og de ovenfor nevnte US patentskrifter tilhørende American Cyanamid). Et annet antitumor medikament som antistoffet kan konjugeres til, er QFA, som er antifolat. Både kalicheamicin og QFA har intracellulære virkeseter og krysser ikke lett plasmamembranen. Cellulært opptak av disse midlene via antistofformidlet internalisering vil følgelig i stor grad forhøye deres cytotoksiske virkninger.
Andre cytotoksiske midler
Andre antitumor midler som kan konjugeres til anti-IL-17A/F-antistoffene ifølge oppfinnelsen omfatter BCNU, streotpzoicin, vinkristin og 5-fluoruracil, familien av midler som under et betegnes LL-E33288-kompleks, beskrevet i US patentskrift nr. 5 053 394 og 5 770 710, så vel som esperamicinene (US patentskrift nr. 5 877 296).
Enzymatisk aktive toksiner og fragmenter derav som kan anvendes omfatter difteri-A-kjede, ikke-bindende, aktive fragmenter av difteritoksin, eksotoksin A-kjede (fra Pseudomonas aeruginosa), ricin-A-kjede, abrin-A-kjede, modeccin-A-kjede, alfa-sarcin, Aleurites fordii- proteiner, diantinproteiner, Phytolaca americana-<p>rotemer (PAPI, PAPII og PAP-S), momordica charantia-inhibitor, kurcin, krotin, sapaonaria officinalis-inhibitor, gelonin, mitogellin, restrictocin, fenomycin, enomycin og trikotecenene. Se for eksempel WO 93/21232, offentliggjort 28. oktober, 1993.
Foreliggende oppfinnelse omfatter videre et immunkonjugat dannet mellom et antistoff og en forbindelse med nukleolytisk aktivitet (for eksempel en ribonuklease eller DNA-endonuklease, for eksempel en deoksyribonuklease, DNase).
For selektiv ødeleggelse av tumoren kan antistoffet omfatte et høy-radioaktivt atom. En rekke forskjellige radioaktive isotoper er tilgjengelige for fremstilling av radiokonjugerte anti-IL- 17A/F-antistoffer. Eksempler omfatter At<21>1,1131,1125,Y<90>, Re<186>,Re1<88>, Sm153,Bi2<12>, P<32>, Pb<212>og radioaktive isotoper er Lu. Dersom konjugatet anvendes for diagnose, kan det omfatte et radioaktivt atom for scintigrafisk undersøkelse, for eksempel tc9<9m>eller I<123>, eller spin-merking for kjernemagnetisk resonans (NMR)-bilde-dannelse (også betegnet magnetisk resonanstomografi, mri), for eksempel igjen jod-123, jod-131, indium-111, fluor-19, karb-13, nitrogen-15, oksygen-17, gadolinium, mangan eller jern.
Den radioaktive merkingen eller andre merkingsgrupper kan innføres i konjugatet på kjente måter. For eksempel kan peptidet biosyntetiseres eller syntetiseres ved kjemisk aminosyresyntese ved anvendelse av egnede aminosyreforløpere som for eksempel inneholder fluor-19 i stedet for hydrogen. Merkingsgrupper som tc<99m>eller I<123>,Re1<86>, Re188 og In111 kan tilkobles via en cysteinrest i peptidet. Yttrium-90 kan tilkobles via en lysinrest. JODOGEN-fremgangsmåten (Fraker et al. (1978), Biochem. Biophys. Res. Commun, 80: 49-57 kan anvendes for innføring av jod-123. "Monoclonal Antibodies in Immunoscintigraphy" (Chatal, CRC Press, 1989) beskrives andre fremgangsmåter i detalj.
Konjugater mellom antistoffet og det cytotoksiske middel kan fremstilles ved anvendelse av en rekke forskjellige bifunksjonelle proteinsammenkoblingsmidler, for eksempel N-suksinimidyl-3-(2-pyridyltitio)propionat (SPDP), suksinimidyl-4-(N-maleimidometyl)sykloheksan-l-karboksylat, iminotiolan (IT), bifunksjonelle derivater av imidoestere (for eksempel dimetyladipimidat-HCl), aktive estere (for eksempel disuksinimidylsuberat), aldehyder (for eksempel glutaraldehyd), bis-azidoforbindelser
(for eksempel bis(p-azidobenzoyl)-heksandiamin), bis-diazoniumderivater (for eksempel bis-(p-diazoniumbenzoyl)-etylendiamin), diisocyanater (for eksempel tolyen-2,6-diisocyanat) og bis-aktive fluorforbindelser (for eksempel l,5-difluor-2,4-dinitrobenzen). For eksempel kan et ricinimmuntoksin fremstilles som beskrevet i Vitetta et al. Science, 238:1098 (1987). Karbon-14-merket l-isotiocyanatobenzyl-3-metyldietylentriamin-pentaeddiksyre (MX-DTPA) er et eksempel på et chelateringsmiddel for konjugering av en radioaktiv isotop til antistoffet. Se WO 94/11026. Linkeren kan være en "kølyvbar linker" som fremmer frigjøringen av det cytotoksiske medikament i cellen. For eksempel kan en syrelabil linker, en peptidasesensitiv linker, en lyslabil linker, en dimetyllinker eller en disulfidholdig linker (Chari et al. Cancer Research, 52:127-131 (1992), US patentskrift nr. 5 208 020) anvendes.
Alternativt kan det fremstiles et fusjonsprotein som omfatter anti-IL-17A/F-antistoffet og det cytotoksiske middel, for eksempel ved rekombinante teknikker eller peptidsyntese. DNA-strekket kan omfatte områder som koder for de to delene av konjugatet, enten i nabostilling til hverandre eller adskilt av et område som koder for et linkerpeptid som ikke ødelegger konjugatets ønskede egenskaper.
I nok en utførelse kan antistoffet konjugeres til en "reseptor" (for eksempel streptavidin) for anvendelse i forstyring til tumoren, hvor antistoff-reseptorkonjugatet tilføres til pasienten, fulgt av fjerning av ubundet konjugat fra sirkulasjonen ved anvendelse av et klarningsmiddel og så tilførsel av en "ligand" (for eksempel avidin) som er konjugert til et cytotoksisk middel (for eksempel en radioaktiv isotop).
10. Immunliposomer
Anti-IL-17A/F-antistoffene som beskrives heri kan også utformes som immunliposomer. Et "liposom" er en liten vessikel som består av forskjellige typer av lipider, fosfolipider og/eller surfaktanter som er anvendbar for tilførsel av et medikament til et pattedyr. Liposomets bestanddeler er vanligvis arrangert i en dobbeltsjiktdannelse som ligner lipidarrangementet i biologiske membraner. Liposomer som inneholder antistoffet fremstilles ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, for eksempel som beskrevet i Epstein et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:3688 (1985), Hwang et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 77:4030 (1980), US patentskrift nr. 4 485 045 og 4 544 545 og WO 97/38731, offentliggjort 23. oktober, 1997. Liposomer med forlenget sirkulasjonstid beskrives i US patentskrift nr. 5 013 556.
Spesielt anvendbare liposomer kan fremstilles ved reversfase-inndampings-fremgangsmåten med et lipidpreparat som omfatter fosfatidylcholin, kolesterol og PEG-derivatisert fosfatidyletanolamin (PEG-PE). Liposomene ekstruderes gjennom filtere med definert porestørrelse for dannelse av liposomer med den ønskede diameter. Fab'-fragmenter av antistoffet ifølge foreliggende oppfinnelse kan konjugeres til liposomene som beskrevet i Martin et al, J. Biol. Chem, 257:286-288 (1982) via en disulfid utbyttingsreaksjon. Et kjemoterapeutisk middel foreligger om ønskelig inne i liposomet. Se Gabizon et al, J. National Cancer Inst, 81(19): 1484 (1989).
N. IL- 17A/ F- bindende oligopeptider
IL-17A/F-bindende oligopeptider ifølge foreliggende oppfinnelse er
oligopeptider som bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17 A/F-polypeptid som beskrevet heri. Il-17A/F-bindende oligopeptider kan syntetiseres kjemisk ved anvendelse av kjent metodologi for oligopeptidsyntese, eller det kan fremstilles og renses ved anvendelse av rekombinant teknologi. IL-17A/F-bindende oligopeptider har vanligvis en lengde på
minst tilnærmet 5 aminosyrer, alternativt minst tilnærmet 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, 58, 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 eller 100 aminosyrer eller mer, hvori slike
oligopeptider kan bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. IL-17A/F-bindende oligopeptider kan påvises uten omfattende eksperimentering ved anvendelse av velkjente teknikker. I denne sammenheng skal det bemerkes at teknikker for gjennomsøking av oligopeptidbiblioteker etter oligopeptider som kan bindes spesifikt til et polypeptidmål, er velkjente innen faget (se for eksempel US patentskrift nr. 5 556 762, 5 750 373, 4 708 871, 4 833 092, 5 223 409, 5 403 484, 5 571 689, 5 663 143, PCT-publikasjonene WO 84/03506 og WO84/03564, Geysen et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 81:3998-4002 (1984), Geysen et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 82:178-182 (1985), Geysen et al, i Synthetic Peptides as Antigens, 130-149 (1986), Geysen et al, J. Immunol. Meth, 102:259-274 (1987), Schoofs et al, J. Immunol, 140:611-616 (1988), Cwirla, S. E. et al, (1990), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6378, Lowman, H.B. et al. (1991), Biochemistry, 30:10832, Clackson, T. et al. (1991), Nature, 352: 624, Marks, J. D. et al. (1991), J. Mol. Biol, 222:581, Kang, A.S. et al. (1991), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:8363 og Smith, G. P. (1991), Current Opin. Biotechnol, 2:668).
I denne sammenheng er bakteriofagfremvisning (fagfremvisning) en velkjent teknikk som gjør det mulig å gjennomsøke store oligopeptidbiblioteker for påvisning av et eller flere medlemmer av biblioteket som spesifikt kan bindes til et polypeptidmål. Bakteriofagfremvisning er en teknikk i hvilken polypeptidvarianter fremstilles som fusjonsproteiner med kappeprotein på overflaten av bakteriofagpartikler (Scott, J.K. og Smith, G.P. (1990), Science, 249:386). Anvendbarheten av bakteriofagfremvisning ligger i det faktum at store biblioteker av selektivt randomiserte proteinvarianter eller tilfeldig klonede cDNA hurtig og effektivt kan sorteres for sekvenser som bindes til et målmolekyl med høy affinitet. Fremvisning av biblioteker av peptid (Cwirla S.E. et al.
(1990) Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 87:6378) eller protein (Lowman, H.B. et al. (1991),
Biochemistry, 30:10832, Clackson, T. et al (1991), Nature, 352:624, Marks, J.D. et al.
(1991), J. Mol. Biol, 222:581, Kang, A.S. et al. (1991), Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 88:8363) på bakteroifag har blitt anvendt for gjennomsøking av millionvis av polypeptider eller oligopeptider som har spesifikke bindingsegenskaper (Smith, G.P.
(1991), Current Opin. Biotechnol, 2:668). Sortering av bakteroifagbiblioteker av tilfeldige mutanter krever en strategi for konstruksjon og oppformering av et stort antall varianter, en fremgangsmåte for affinitetsrensing ved anvendelse av målreseptoren og et middel for evaluering av resultatene fra anrikninger med binding. US patentskrift nr. 5 223 409, 5 403 484, 5 571 689 og 5 663 143. Selv om de fleste bakteriofagfremvisningsfremgangsmåter har benyttet filamentøs bakteriofag, er lambdoide bakteriofagfremvisningssystemer (WO 95/34683, US patentskrift nr. 5 627 024), T4-bakteriofagfremvisningssystemer (Ren, Z-J. et al.
(1998), Gene, 215:439, Zhu, Z. (1997), CAN, 33:534, Jiang, J. et al. (1997), can, 128:44380, Ren, Z-J. et al. (1997), CAN, 127:215644, Ren, Z-J. (1996), Protein Sei, 5:1833, Efimov, V. P. et al. (1995), Virus Genes, 10:173) og T7-bakteriofagfremvisningssystemer (Smith, G. P. og Scott, J.K. (1993), Methods in Enzymology, 217, 228-257, US patentskrift nr. 5 766 905) også kjente.
Mange andre forbedringer og varianter av det basale bakteirofagfremvisnings-konsept har nå blitt utviklet. Disse forbedringene øker fremvisningssystemenes evne til å gjennomsøke peptidbiblioteker for binding til valgte målmolekyler og fremvisning av funksjonelle proteiner, slik at disse proteinene kan gjennomsøkes for ønskede egenskaper. Innretninger for kombinatorisk reaksjon for bakteriofagfremvisnings-reaksjoner har blitt utviklet (WO 98/14277), bakteriofagfremvisningsbiblioteker har blitt anvendt for analyse og kontroll av bimolekylære interaksjoner (WO 98/20169, WO 9820159) og egenskapene til innskrenkede heliksformede peptider (WO 98/20036). WO 97/35196 beskriver en fremgangsmåte for isolering av en affinintetsligand i hvilken et bakteriofagfremvisningsbibliotek settes i forbindelse med en løsning i hvilken liganden vil bindes til et målmolekyl og en andre løsning i hvilken affinitetsliganden ikke vil bindes til målmolekylet, for selektiv isolering av bindende ligander. WO 97/46251 beskriver en fremgangsmåte for biogjennomsøking av et tilfeldig bakteriofagfremvisningsbibliotek med et affinintetsbegrenset antistoff, og så isolering av bindende bakteroifag, fulgt av en mikroanrikningsprosess ved anvendelse av mikroplatebrønner for isolering av bakteriofag som bindes med høy affinitet. Anvendelsen av protein A fra Staphylococcus aureus som affinitetsmerkelapp har også blitt rapportert (Li et al. (1998), Mol Biotech, 9:187). WO 97/47314 beskriver anvendelsen av substratsubstraksjons-biblioteker for å skille mellom enzymspesifisiteter ved anvendelse av et kombinatorisk bibliotek som kan være et bakteriofagfremvisningsbibliotek. En fremgangsmåte for utvelgelse av enzymer som er egnede for anvendelse i detergenter ved anvendelse av bakteriofagfremvisning beskrives i WO 97/09446. Andre fremgangsmåter for seleksjon av spesifikt bindende prote«ner beskrives i US patentskrift nr. 5 498 538, 5 432 018 og i WO 98/15833.
Fremgangsmåter for fremstilling av peptidbiblioteker og gjennomsøking av disse bibliotekene beskrives også i US patentskrift nr. 5 723 286, 5 432 018, 5 580 717, 5 427 908, 5 498 530, 5 770 434, 5 734 018, 5 698 426, 5 763 192 og 5 723 323.
O. IL- 17A/ F- bindende organiske molekyler
IL-17A/F-bindende organiske molekyler er organiske molekyler som ikke er oligopeptider eller antistoffer som definert heri, og som bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri. IL-17A/F-bindende organiske molekyler kan påvises og syntetiseres kjemisk ved anvendelse av kjent metodologi (se for eksempel PCT-publikasjonene WO 00/00823 og WO 00/39585). IL-17A/F-bindende organiske molekyler har vanligvis en størrelse på mindre enn tilnærmet 2000 dalton, alterantivt mindre enn tilnærmet 1500, 750, 500, 250 eller 200 dalton, hvori slike organiske molekyler som kan bindes, fortrinnsvis spesifikt, til et IL-17A/F-polypeptid som beskrevet heri, kan påvises uten omfattende eksperimentering ved anvendelse av velkjente teknikker. I denne sammenheng skal det merkes at teknikker for gjennomsøking av biblioteker av organiske molekyler etter molekyler som kan bindes til et polypeptidmål er velkjente innen faget. Se for eksempel PCT-publikasjonene WO 00/00823 og WO 00/39585). IL-17A/F-bindende organiske molekyler kan for eksempel være aldehyder, ketoner, oksimer, hydrazoner, semikarbazoner, karbazider, primære aminer, sekundære aminer, tertiære aminer, N-substituerte hydraziner, hydraider, alkoholer, etere, tioler, tioetere, disulfider, karboksylsyrer, estere, amider, ureaer, karbamater, karbonater, ketaler, tioketaler, acetaler, tioacetaler, arylhalider, arylsulfonater, alkylhalider, alkylsulfonater, aromatiske forbindelser, heterosykliske forbindelser, aniliner, alkener, alkyner, dioler, aminoalkoholer, oksazolidiner, oksazoliner, tiazolidiner, tiazoliner, enaminer, sulfonamider, epoksider, aziridiner, isocyanater, sulfonylklorider, diazoforbindelser, syreklorider eller lignende.
P. Søk etter anti- IL- 17 A/ F- antistoffer, IL- 17 A/ F- bindende oligopeptider og IL- 17A/ F- bindende organiske molekyler med de ønskede egenskaper
Teknikker for fremstilling av antistoffer, oligopeptider og organiske molekyler som bindes til IL-17A/F-polypeptider har blitt beskrevet ovenfor. Man kan videre utvelge antistoffer, oligopeptider eller andre organiske molekyler med visse biologiske egenskaper etter ønske.
De vekstinhiberende virkninger av et anti-IL-17A/F-antistoff, oligopeptid eller annet organisk molekyl ifølge oppfinnelsen kan analyseres ved fremgangsmåter som er kjente innen faget, for eksempel ved anvendelse av celler som uttrykker et IL-17A/F- polypeptid, enten endogent eller etter transfeksjon med IL-17A/F-genet. For eksempel kan egnede tumorccllclinjer og IL-17A/F-transfekterte celler behandles med et monoklonalt anti-IL-17A/F-antistoff, oligopeptid eller annet organisk molekyl ifølge oppfinnelsen i forskjellige konsentrasjoner i noen få dager (for eksempel 2-7) og farges med krystallfiolett eller MTT eller analyseres ved en annen kolorimetrisk analyse. En annen fremgangsmåte for måling av proliferasjon vil være å sammenligne<3>H-tymidinopptaket i celler behandlet i nærvær eller fravær av et anti-IL-17A/F-antistoff, et IL-17A/F-bindende oligopeptid eller et IL-17A/F-bindende organisk molekyl ifølge oppfinnelsen. Etter behandlingen høstes cellene, og mengden radioaktivitet som er inkorporert i DNA kvantifiseres i en scintillasjonsteller. Egnede positive kontroller omfatter behandling av en valgt cellelinje ved et vekstinhiberende antistoff som vites å inhibere veksten av cellelinjen. Vekstinhibering av tumorceller in vivo kan måles på forskjellige måter som er kjente innen faget. Tumorcellen er fortrinnsvis en celle som overuttrykker et IL-17A/F-polypeptid. Anti-IL- 17A/F-antistoffet, det IL-17A/F-bindende oligopeptid eller det IL-17A/F-bindende organiske molekyl vil fortrinnsvis inhibere celleproliferasjonen av en IL-17A/F-uttrykkende tumorcelle in vitro eller in vivo med tilnærmet 25-100% sammenlignet med den ubehandlede tumorcelle, mer foretrukket med tilnærmet 30-100% og enda mer foretrukket med tilnærmet 70-100%) i en utførelse ved en antistoffkonsentrasjon på fra tilnærmet 0,5 til 30 ug/ml. Vekstinhibering kan måles ved en antistoffkonsentrasjon på fra tilnærmet 0,5 til 30 ug/ml eller fra tilnærmet 0,5 nM til 200 nM i cellekultur, hvor vekstinhiberingen bestemmes 1-10 dager etter at tumorcellene har blitt eksponert ovenfor antistoffet. Antistoffet er vekstinhiberende in vivo dersom tilførsel av anti-IL-17A/F-antistoffet i en dose på fra tilnærmet 1 ug/kg til tilnærmet 100 mg/kg kroppsvekt fører til en reduksjon av tumorstørrelsen eller reduksjon av tumorcelleproliferasjonen i løpet av fra tilnærmet 5 dager til 3 måneder fra førstegangs tilførsel av antistoffet, fortrinnsvis i løpet av fra tilnærmet 5 til 30 dager.
For utvelgelse av et anti-IL-17A/F-antistoff, IL-17A/F-bindende oligopeptid eller IL-17A/F-bindende organisk molekyl som induserer celledød, kan tap av membran-integritet, vist ved for eksempel opptak av propidiumjodid (PI), trypanblått eller 7AAD, analyseres og sammenlignes med kontroller. En PI-opptaksanalyse kan utføres i fravær av komplement- og immuneffektorceller. IL-17A/F-polypeptiduttrykkende tumorceller innkuberes med medium alene eller med medium inneholdende det ønskede anti-IL-17A/F-antistoff (for eksempel i en konsentrasjon på tilnærmet 10 ug/ml), IL-17 A/F - bindende oligopeptid eller IL-17A/F-bindende organisk molekyl. Cellene inkuberes i 3 dager. Etter hver behandling vaskes cellene og fordeles på 35 mm 12 x 75-rør med silkork (1 ml per rør, 3 rør per behandlingsgruppe) for fjerning av celleklumper. Rørene tilsettes så PI (10 ug/ml). Prøvene kan analyseres ved anvendelse av et FACSCAN væskestrømscytometer og programvare FACSCONVERT CellQuest (Becton Dickinson). De anti-IL-17A/F-antistoffer, IL-17A/F-bindende oligopeptider eller IL-17A/F-bindende organiske molekyler som induserer et statistisk signifikant nivå av celledød, bestemt ved PI-opptak, kan utvelges som celledødinduserende anti-IL-17A/F-antistoffer, IL-17A/F-bindende oligopeptider eller IL-17A/F-bindende organiske molekyler.
For søk etter antistoffer, oligopeptider eller andre organiske molekyler som bindes til en epitop på et IL-17 A/F -polypeptid som bindes av et antistoff av interesse, kan en rutinemessig kryssblokkeringsanalyse, for eksempel analysen som beskrives i Antibodies, A Laboraotry Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Ed Harlow og David Lane (1988), utføres. Denne analysen kan anvendes for å fastslå hvorvidt et analysert antistoff, oligopeptid eller annet organisk molekyl bindes til det samme setet eller den samme epitop som et kjent anti-IL-17A/F-antistoff. Alternativt eller i tillegg kan epitopkartlegging utføres ved hjelp av fremgangsmåter som er kjente innen faget. For eksempel kan antistoffsekvensen mutageniseres, for eksempel ved alaninskanning, for identifisering av kontaktaminosyrerester. Det muterte antistoff analyseres i utgangspunktet for binding med polyklonalt antistoff, for å sikre korrekt folding. I en annen fremgangsmåte kan peptider som tilsvarer forskjellige områder i et IL-17A/F-polypeptid anvendes i kompetitive analyser med antistoffene som skal analyseres eller med et analyseantistoff og et antistoff med enkarakteriserteller kjent epitop.
Q. Farmasøytiske preparater
De aktive IL-17A/F-molekylene ifølge oppfinnelsen (for eksempel IL-17A/F-polypeptider, anti-IL-17A/F-antistoffer og/eller varianter av begge disse) så vel som andre molekyler som er påvist ved hjelp av gjennomsøkingsanalysene som er beskrevet ovenfor, kan tilføres for behandling av immunrelaterte sykdommer i form av farmasøytiske preparater.
Terapeutiske utforminger av det aktive IL-17A/F-molekyl, fortrinnsvis et polypeptid eller antistoff ifølge oppfinnelsen, fremstilles for lagring ved å blande det aktive molekyl med den ønskede renhetsgrad med om ønskelig farmasøytisk aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer (Remington's Pharmaceutical Sciences, 16. utgave, Osol. A. red (1980)), i form av frysetørkede utforminger eller vandige løsninger. Aksepterbare bærestoffer, eksipienser eller stabilisatorer er ikke-toksiske for mottakeren i de benyttede doser og konsentrasjoner, og omfatter buffere som fosfat, citrat og andre organiske syrer, antioksidanter, innbefattet askorbinsyre og metionin, konserverings-midler (for eksempel oktadecyldimetylbenzylammoniumklorid, heksametoniumklorid, benzalkoniumklorid, benzetoniumklorid, fenol, butyl- eller benzylalkohol, alkyl-parabener, for eksempel metyl- eller propylparaben, katechol, resorcinol, sykloheksanol, 3-pentanol og m-kresol), lavmolekylære polypeptider (med færre enn tilnærmet 10 aminosyrerester), proteiner, for eksempel serumalbumin, gelatin eller immunglobuliner, hydrofile polymerer, for eksempel polyvinylpyrrolidon, aminosyrer som glysin, glutamin, asparagin, histidin, arginin eller lysin, monosakkarider, disakkarider og andre karbohydrater, innbefattet glukose, mannose eller dekstriner, chelateringsmidler, for eksempel EDTA, sukkere som sukkrose, mannitol, trehalose eller sorbitol, saltdannende motioner, for eksempel natrium, metallkomplekser (for eksempel Zn-proteinkomplekser) og/eller ikke-ioniske surfaktanter som TWEEN, PLURONICS eller polyetylenglykol
(PEG).
Forbindelser som har blitt påvist ved gjennomsøkingsanalysene som beskrives her kan utformes på tilsvarende måte ved anvendelse av standardteknikker som er velkjente innen faget.
Lipofeksjoner eller liposomer kan også anvendes for tilførsel av IL-17A/F-molekylet inn i celler. Dersom antistoffragmenter anvendes, foretrekkes det minste inhiberende fragment som spesifikt bindes til målproteinets bindingsdomene. Basert på variabelt områdesekvensene i et antistoff, kan det for eksempel utformes peptidmolekyler som bevarer evnen til å binde målproteinsekvensen. Slike peptider kan syntetiseres kjemisk og/eller fremstilles ved rekombinant DNA-teknologi (se for eksempel Marasco et al. Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 90:7889-7893 (1993)).
Utformingen heri kan også inneholde mer enn en aktiv forbindelse etter behov for den indikasjon som skal behandles, fortrinnsvis forbindelser med komplementære aktiviteter som ikke på uheldig måte påvirker hverandre. Alternativt eller i tillegg kan preparatet omfatte et cytotoksisk middel, et cytokin eller et vekstinhiberende middel. Slike molekyler foreligger fortrinnsvis i kombinasjonen i mengder som er effektive for det påtenkte formål.
De aktive IL-17A/F-molekylene kan også innfanges i mikrokapsler, for eksempel fremstilt ved koacervasjonsteknikker eller ved interfasepolymerisering, for eksempel hydroksymetylcellulose- eller gelatin-mikrokapsler henholdsvis poly-(metylmetakrylat)mikrokapsler, i kolloidale medikamenttilførselssystemer (for eksempel liposomer, albumin mikrokuler, mikroemulsjoner, nanopartikler og nanokapsler) eller i makroemulsjoner. Slike teknikker beskrives i Remington's Pharmaceutical Science, 16. utgave, Osol, A. red. (1980).
Utforminger som skal anvendes for in v/vo-tilførsel må være sterile. Dette oppnås lett ved filtrering gjennom sterilfiltreringsmembraner.
Preparater for vedvarende frigjøring av IL-17A/F-molekylene kan fremstilles. Egnede eksempler på preparater for vedvarende frigjøring omfatter semipermeable støttemidler av faste, hydrofobe polymerer som inneholder antistoffet, hvor støttemidlene foreligger i form av utformede gjenstander, for eksempel filmer eller mikrokapsler. Eksempler på støttemidler for vedvarende frigjøring omfatter polyestere, hydrogeler (for eksempel poly(2-hydroksyetylmetakrylat), eller poly(vinylalkohol)), polylaktider (US patentskrift nr. 3 773 919), kopolymerer av L-glutaminsyre og y-etyl-L-glutamat, ikke-degraderbart etylen-vinylacetat, degraderbare melkesyre-glykolsyre-kopolymerer, for eksempel LURPON DEPOT (injiserbare mikrokuler som består av melkesyre- glykolsyre-kopolymer og leuprolidacetat) og poly-D-(-)-3-hydroksysmørsyre. Mens polymerer som ctylcn-vinylacetat og melkesyre-glykolsyre muliggjør frigjøring av molekyler i mer enn 100 dager, frigjør visse hydrogeler proteiner over kortere tidsrom. Dersom innkapslede antistoffer forblir i kroppen i lengre tid, kan de denatureres eller aggregeres som en følge av eksponering ovenfor fuktighet ved 37°C, noe som fører til tap av biologisk aktivitet og mulige endringer av immunogenisiteten. Rasjonelle strategier kan utformes for stabilisering avhengig av mekanismen som inngår. Dersom for eksempel aggregeringsmekanismen finnes å være intermolekylær S-S-bindingsdannelse via tio-disulfidutbytting, kan stabilisering oppnås ved å modifisere sulfhydrylrester, ved å frysetørke fra sure løsninger, ved å kontrollere fuktighetsinnholdet, ved anvendelse av egnede tilsetningsstoffer og ved å utvikle spesifikke polymere støttemiddelpreparater.
R. Behandlingsfremgangsmåter
Det omfattes at polypeptidene, antistoffene og de andre aktive forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse kan anvendes for behandling av forskjellige immunrelaterte sykdommer og tilstander, for eksempel T-celleformidlede sykdommer, innbefattet sykdommer som særpreges ved infiltrasjon av inflammatoriske celler i et vev, stimulering av T-celleproliferasjon, inhibering av T-celleproliferasjon, økt eller redusert karpermeabilitet eller inhibering av karpermeabilitet, for eksempel autoimmune sykdommer.
Eksempler på tilstander eller sykdommer som kan behandles med polypeptidene, antistoffene eller andre forbindelser ifølge oppfinnelsen omfatter, men er ikke begrenset til, systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, juvenil kronisk artritt, osteoartritt, spondyloartropatier, systemisk sklerose (skleroderma), idiopatiske inflammatoriske myopatier (dermatomyositt, polymyositt), Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi (immun pancytopeni, paroksysmal nokturnal hmoglobinuri), autoimmun trombocytopeni (idiopatisk trombocytopenisk purpura, immunmediert trombocytopeni), tytoiditt (Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocyttyroiditt, atrofisk tyroiditt), diabetes mellitus, immunmediert nyresykdom (glomerulonefritt, tubulointerstitiell nefritt), demyelinerende sykdommer til sentralnervesystemet og det perifere nervesystem, for eksempel multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barré syndrom, og kronisk inflammatorisk, demyelinerende polyneuropati, lever-gallesykdommer, for eksempel infektiøs hepatitt (hepatitt A, B, C, D, E og andre ikke-hepatotrope virus), autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt og skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom (ulcerøs kolitt, Crohns sykdom), glutensensitiv enteropati og Whipples sykdom, autoimmune eller immunmedierte hudsykdommer, innbefattet buløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, psoriasis, allergiske sykdommer som astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat og urtikaria, immunologiske sykdommer i lungen, for eksempel eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose og hypersensitivitetspneumonitt og transplantasjonsassosierte sykdommer, innbefattet transplantatawisning og graft-versus-host-sykdom.
I systemisk lupus erytematosus er den sentrale sykdomsårsak dannelsen av autoreaktive antistoffer mot selv-proteiner/selv-vev og påfølgende dannelse av immun-mediert betennelse. Antistoffer formidler vevsskade, enten direkte eller indirekte. Selv om T-lymfocytter ikke har blitt vist å delta direkte i vevsskaden, er T-lymfocytter nødvendige for utviklingen av autoreaktive antistoffer. Sykdomsfremkomsten er følgende T-lymfocyttavhengig. Flere organer og systemer påvirkes klinisk, innbefattet nyre, lunge, muskel-skjellettsystem, mukokutanøse vev, øye, sentralnervesystemet, hjerte-karsystemet, mage-tarmkanalen, beinmarg og blod.
Reumatoid artritt (RA) er en kronisk, systemisk, autoimmun betennelsessykdom som hovedsakelig omfatter leddmembranen i flere vev, med påfølgende skade på leddbrusken. Patogenesen er T-lymfocyttavhengig og er forbundet med dannelsen av reumatoide faktorer, autoantistoffer rettet mot selv-IgG, med påfølgende dannelse av immunkomplekser som når et høyt nivå i leddvæske og blod. Disse kompleksene i leddet kan indusere den markante infiltrasjon av lymfocytter og monocytter til leddvæsken og påfølgende, markante endringer i leddvæsken, leddrommet/leddvæsken dersom denne er infiltrert med lignende celler i tillegg til flere neutrofile celler. De rammede vev er hovedsakelig ledene, ofte i et symmetrisk mønster. Ekstraartikulær sykdom opptrer imidlertid også i to hovedformer. En form er utviklingen av ekstraartikulære lesjoner med pågående, progressiv leddsykdom og typiske lesjoner omfattende lungefibrose, vaskulitt og kutanøse sår. Den andre formen for ekstraartikulær sykdom er det såkalte Feltys syndrom, som opptrer sent i sykdomsforløpet for RA, noen ganger etter at leddsykdommen har roet seg og omfatter nærvær av neutropeni, trombocytopeni og splenomegali. Dette kan ledsages av vaskulitt i flere organer med dannelse av infarkter, hudsår og koldbrann. Pasientene utvikler også ofte reumatoide knuter i underhudsvevet som ligger over de rammede ledd, knutene kan i et sent stadium ha nekrotiske sentere omgitt av et blandet infiltrat av inflammatoriske celler. Andre manifestasjoner som kan opptre ved RA omfatter perikarditt, pleuritt, koronar arteritt, interstitiell pneumonitt med lungefibrose, keratokonjuncitivitis sicca og reumatoide knuter.
Juvenil kronisk artritt er en kronisk, idiopatisk betennelsessykdom som ofte begynner ved en alder på mindre enn 16 år. Fenotypen har noen likheter med RA, noen pasienter som er positive for reumatoid faktor klassifiseres som juvenil, reumatoid artritt. Sykdommen kan videre oppdeles i tre hovedkategorier: pauciartikulær, polyartikulær og systemisk. Artritten kan være alvorlig og er typisk destruktiv og fører til leddankylose og retardert vekst. Andre manifestasjoner kan omfatte kronisk iridosyklitt og systemisk amyloidosis.
Spondyloatrropatier er en gruppe av forstyrrelser med noen felles kliniske egenskaper og den felles assosiasjonen med ekspresjon av HLA-B27-genproduktet. Forstyrrelsene omfatter ankyloserende spondylitt, Reiters syndrom (reaktiv artritt), artritt forbundet med inflammatorisk tarmsykdom, spondylitt forbundet med psoriasis, juvenil spondyloartropati og ikke-differensiert spondyloartropati. Spesielle egenskaper omfatter sakroileitt med eller uten spondylitt, inflammatorisk, asymmetrisk artritt, assosiasjon med HLA-B27 (et serologisk definert allel i HLA-B-lokus i klasse I MHC), okulær betennelse og fravær av autoantistoffer som er assosiert med andre reumatoide sykdommer. Cellen som oftest impliseres som viktig for induksjon av sykdommen er CD8<+->T-lymfocytten, en celle som er rettet mot antigener som presenteres av klasse I MHC-molekyler. CD8<+->T-celler kan reagere mot klasse I MHC-allelet HLA-B27 som om dette var et fremmed peptid fremvist av MHC klasse I-molekyler. Det har blitt foreslått at en epitop i HLA-B27 kan ligne en bakteriell eller annen mikrobiell, antigen epitop, og således indusere en CD8<+->T-cellerespons.
Systemisk sklerose (skleroderma) har en ukjent etiologi. Et kjennetegn på sykdommen er indurasjon av huden, dette induseres sannsynligvis av en aktiv betennelsesprosess. Skleroderma kan være lokalisert eller systemisk, karlesjoner er alminnelige og endotelcelleskade i mikrovaskulaturen er en tidlig og viktig begivenhet i utviklingen av systemisk sklerose, karskaden kan være immunmediert. Et immunologisk grunnlag antydes av nærværet av mononukleære celleinfiltrater i de kutanøse lesjonene, og nærvær av anti-cellekjerneantistoffer i mange pasienter. ICAM-1 er ofte oppregulert på overflaten av fibroblaster i hudlesjoner, noe som tyder på at T-celleinteraksjon med disse cellene kan spille en rolle i sykdommens patogenese. Andre organer som omfatter er mage-tarmkanalen: atrofi av og fibrose i glattmuskel, noe om fører til unormal peristaltikk/motilitet, nyre: konsentrisk subendotelproliferasjon i intima som rammer små arkute og interlobulære arterier med påfølgende redusert blodomløp i nyrebarken, noe som fører til proteinuri, azotemi og hypertensjon, skjellettmuskel: atrofi, interstitiell fibrose, betennelse, lunge: interstitiell pneumonitt og interstitiell fibrose, og hjerte: kontraksjonsbåndnekrose, arrdannelse/fibrose.
Idiopatiske, inflammatoriske myopatier, innbefattet dermatomyositt, polymyositt og andre, er forstyrrelser med kronisk muskelbetennelse av ukjent opphav, noe som fører til muskelsvakhet. Muskelskaden/betennelsen er ofte symmetrisk og progressiv. Autoantistoffer er forbundet med de fleste former. Disse myosittspesifikke autoantistoffene er rettet mot og inhiberer funksjonen av komponenter, proteiner og RNA, som deltar i proteinsyntesen.
Sjøgrens syndrom skyldes immunmediert betennelse og påfølgende funksjonell ødeleggelse av tårekjertlene og spyttkjertlene. Sykdommen kan være assosiert med eller ledsaget av inflammatoriske bindevevssykdommer. Sykdommen er forbundet med dannelse av autoantistoffer mot antigenene Ro og La, som begge er små RNA- proteinkomplekser. Lesjonene fører til keratokonjunktivitis sicca, xeorstomi, med andre manifestasjoner eller assosiasjoner som omfatter gallecirrhose, perifer eller sensorisk neuropati og palpabel purpura.
Systemisk vaskulitt er sykdommer i hvilke hovedlesjonen er betennelse og påfølgende skade på blodkar, noe som fører til iskemi/nekrose/degenerasjon av vev som forsynes av de rammede karene, og til slutt i noen tilfeller organ-feilfunksjon. Vaskulitt kan også opptre som en sekundær lesjon eller følge av andre immunmedierte betennelsessykdommer som reumatoid artritt, systemisk sklerose osv, særlig i sykdommer som også er forbundet med dannelse av immunkomplekser. Sykdommer i den primære systemiske vaskulittgruppen omfatter: systemisk nekrotiserende vaskulitt, polyarteritis nodosa, allergis angiitt og granulomatose, polyangiitt, Wegeners granulomatose, lymfomatoid granulomatose og kjempecelle artritt. Forskjellige vaskulitter omfatter: mukokutanøst lymfeknutesyndrom (MLNS eller Kawasakis sykdom), isolert CNS-vaskulitt, Behets sykdom, tromboangiitis obliterans (Buergers sykdom) og kutanøs nekrotiserende venulitt. Den patogene mekanisme for de fleste typer av vaskulitt som er opplistet antas primært å være deponering av immunglobulinkomplekser i karveggen, og påfølgende induksjon av en betennelsesrespons, enten via ADCC, komplementaktivering eller begge deler.
Sarkoidose er en tilstand med ukjent årsak som særpreges ved nærvær av epitelioide granulomer i nær sagt alle vev i kroppen, hvor forekomst i lungen er det . vanligste. Patogenesen omfatter vedvarende aktiverende makrofager og lymfoide celler i sykdomsseter, med påfølgende kroniske følger grunnet frigjøringen av lokale og kjemiske aktive produkter som frigjøres av disse celletypene.
Autoimmun hemolytisk anemi, innbefattet autoimmun hemolytisk anemi, immun pancytopeni og paroksysmal nokturnal hemoglobinuri, er en følge av dannelsen av antistoffer som reagerer med antigener som uttrykkes på overflaten av røde blodceller (og i noen tilfeller andre blodceller, innbefattet også blodplater), og er en følge av at disse antistoffbelagte cellene fjernes ved komplementmediert lysering og/eller ADCC/Fc-reseptorformidlede mekanismer.
I autoimmun trombocytopeni, innbefattet trombocytopenisk purpura og immunmediert trombocytopeni i andre kliniske sammenhenger, opptrer ødeleggelse/fjerning av blodplater som en følge av at enten antistoff eller komplement fester seg til blodplatene, og så fjernes ved komplementlysering, ADCC eller FC-reseptormedierte mekanismer.
Tyroiditt innbefattet Graves sykdom, Hashimotos tyroiditt, juvenil lymfocytt tyroiditt og atrofisk tyroiditt, er en følge av en autoimmun respons mot skjoldkjertel antigener med dannelse av antistoffer som reagerer med proteiner som foreligger i, og ofte er spesifikke for skjoldkjertelen. Eksperimentelle modeller foreligger, innbefattet spontane modeller: rotter (BUF- og BB-rotter) og høns (fet hønsestamme), induserbare modeller, immunisering av dyr med enten tyroglobulin eller tyroid mikrosomalt antigen (tyroid peroksidase).
Type I diabetes mellitus eller insulinavhengig diabetes er autoimmun ødeleggelse av øy celler i bukspyttkjertelen, denne ødeleggelsen formidles av auto-antistoffer og autoreaktive T-celler. Antistoffer mot insulin eller insulinreseptoren kan også i fenotypen med ikke-responsivitet på insulin.
Immunformidlede nyresykdommer, innbefattet glomerulonefritt og tubulointerstitiell nefritt, er resultatet av antistoff- eller T-lymfocyttformidlet skade på nyrevev, enten direkte som en følge av dannelsen av autoreaktive antistoffer, eller T-celler mot nyreantigener, eller indirekte som en følge av deponering av antistoffer og/eller immunkomplekser i nyren som reagerer med andre ikke-renale antigener. Følgelig kan andre immunmedierte sykdommer som fører til dannelse av immunkomplekser også indusere immunmediert nyresykdom som en indirekte følge. Både direkte og indirekte immunmekanismer fører til en betennelsesrespons som danner/induserer utviklingen av lesjoner i nyredel, men påfølgende svekket organfunksjon og i noen tilfeller utvikling til nyresvikt. Både humorale og cellulære immunmekanismer kan delta i patogenesen av lesjonene.
Demyelinerende sykdommer i sentralnervesystemet og det perifere nervesystem, innbefattet multippel sklerose, idiopatisk demyelinerende polyneuropati eller Guillain-Barré syndrom og kronisk inflammatorisk, demyelinerende polyneuropati, antas å ha et autoimmunt grunnlag og fører til demyelinering av normene som en følge av skade påført oligodendrocytter eller direkte på myelin. For MS foreligger det materialet som tyder på at sykdomsinduksjonen og sykdomsutviklingen avhenger av T-lymfocytter. Multippel sklerose er en demyelinerende sykdom som er T-lymfocyttavhengig og som enten har et relapserende-remitterende forløp eller et kronisk, progressivt forløp. Etiologien er ukjent, imidlertid bidrar både virusinfeksjoner, genetisk predisposisjon, miljø og autoimmunitet. Lesjonene inneholder infiltrater av hovedsakelig T-lymfocyttmedierte mikrogliaceller og infiltrerende makro fater, CD4<+->T-lymfocytter er den dominerende celletypen i lesjonene. Mekanismen bag oligodendrocyttcellenes død og den påfølgende demyelinering er ikke kjent, men drives sannsynligvis av T-lymfocytter.
Inflammatorisk og fibrotisk lungesykdom, innbefattet eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose og hypersensitivitetspneumonitt, kan omfatte en feilregulert immun-betennelsesrespons. En inhibering av denne responsen vil være terapeutisk gunstig.
Autoimmun eller immunmediert hudsykdom, innbefattet buløse hudsykdommer, erytema multiforme og kontaktdermatitt, medieres av autoantistoffer hvis dannelse er T-lymfocyttavhengig.
Psoriasis er en T-lymfocyttmediert betennelsessykdom. Lesjonene inneholder infiltrater som T-lymfocytter, makrofager og antigenprosesserende celler og noen neutrofile celler.
Allergiske sykdommer, innbefattet astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat og urtikaria, er T-lymfocyttavhengige. Disse sykdommene formidles hovedsakelig av T-lymfocyttindusert betennelse, IgE-mediert betennelse eller en kombinasjon av disse.
Transplantasjonsassosierte sykdommer, innbefattet transplantatawisning og graft-versus-host-sykdom (GVHD) er T-lymfocyttavhengige, inhibering av T-lymfocytt-funksjonen er lindrende.
Andre sykdommer i hvilke en intervensjon i immunresponsen og/eller betennelsesresponsen er gunstig, er infeksjonssykdom, innbefattet, men ikke begrenset til, virusinfeksjon (innbefattet, men ikke begrenset til, AIDS, hepatitt A, B, C, D og E og herpes), bakterieinfeksjoner, soppinfeksjoner og protozo- og parasittinfeksjoner (molekyler (eller derivater/agonister) som stimulerer MLR kan anvendes terapeutisk for å fremme immunresponsen ovenfor infektiøse agents), sykdommer med immunsvikt (molekyler/derivater/agonister) som stimulerer MLR kan benyttes terapeutisk for å forsterke immunresponsen for tilstander med medført, ervervet, infeksjonsindusert (som for HIV-infeksjon) eller iatrogen (for eksempel grunnet kjemoterapi) immunsvikt og neoplasi.
Det har blitt vist at noen mennesker med kreft utvikler et antistoff og/eller en T-lymfocyttrespons mot antigener på neoplastiske celler. Det har også i dyremodeller for neoplasi blitt vist at en forsterkning av immunresponsen kan føre til at den angjeldende neoplasi awises eller regreserer. Molekyler som fremmer T-lymfocyttresponsen i MLR kan benyttes in vivo for å forsterke immunresponsen mot neoplasi. Molekyler som forsterker T-lymfocyttens proliferative respons i MLR (eller lav-molekylære agonister eller antitsoffer som påvirker den samme reseptor på en agonistisk måte) kan anvendes terapeutisk for behandling av kreft. Molekyler som inhiberer lymfocyttresponsen i MLR fungerer også in vivo under neoplasi ved å undertrykke immunresponsen mot en neoplasi, slike molekyler kan enten uttrykkes av de neoplastiske cellene selv, eller ekspresjonen kan induseres av neoplasien i andre celler. Antagonisering av slike inhiberende molekyler (enten med antistoffer, lav-molekylære antagonister eller på andre måter) forsterke den immunmedierte tumoravvisning.
I tillegg kan inhibering av molekyler med proinflammatoriske egenskaper ha terapeutisk nytteverdi i reperfusjonsskade, slag, myokard infarkt, aterosklerose, akutt lungeskade, hemorragisk sjokk, brannskader, sepsis/septisk sjokk, akutt tubulær nekrose, endometriose, degenerativ leddsykdom og pankreatitt. Forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse, for eksempel polypeptider eller antistoffer, tilføres til et pattedyr, fortrinnsvis et menneske, i samsvar med kjente fremgangsmåter, for eksempel intravnøs tilførsel som en bolus eller ved kontinuerlig infusjon over et tidsrom, intramuskulært, intraperitonealt, intracerebrospinalt, subkutant, intra-artikulært, intrasynovialt, intratekalt, oralt, topisk eller ved inhalering (intranasalt, intrapulmonalt). Intravenøs tilførsel eller tilførsel ved inhalering av polypeptider og antistoffer foretrekkes.
I immunadjuvant behandling kan andre behandlingsformer, for eksempel tilførsel av et antikreft middel, kombineres med tilførselen av proteinene, antistoffene eller forbindelsene ifølge foreliggende oppfinnelse. Pasienten som skal behandles med immunadjuvansen ifølge oppfinnelsen kan for eksempel også tilføres et antikreft middel (et kjemoterapeutisk middel) eller strålebehandling. Klargjøring av og doseringsskjema for slike kjemoterapeutiske midler kan anvendes ifølge produsentens instruksjoner, eller som bestemt empirisk av den erfarne utøver. Klargjøring av og doseringsskjemaer for slik kjemoterapi beskrives også i Chemotherapy Service, red, M.C. Perry, Williams & Wilkins, Baltimore, MD (1992). Det kjemoterapeutiske middel kan tilføres før eller etter tilførselen av immunadjuvansen eller gis samtidig med denne. I tillegg kan en anti-østrogenforbindelse, for eksempel tamoksifen, eller et anti-progesteron, for eksempel onapriston (se EP 616812) gis i doser som er kjente for slike molekyler.
Det kan være ønskelig å også tilføre antistoffer mot andre
immunsykdomsassosierte eller tumorassosierte antigener, for eksempel antistoffer som bindes til CD20, CD1 la, CD 18, ErbB2, EGFR, ErbB3, ErbB4 eller vaskulær endotelfaktor (VEGF). Alternativt eller i tillegg kan to eller flere antistoffer som binder samme antigen, eller to eller flere forskjellige antigener som beskrives heri tilføres samtidig til pasienten. Noen ganger kan det være gunstig å også tilføre et eller flere cytokiner til pasienten. I en utførelse tilføres IL-17A/F-polypeptidene som med et vekstinhiberende middel. For eksempel kan det vekstinhiberende middel tilføres først, fulgt av et IL-17A/F-polypeptid. Samtidig tilførsel eller tilførsel først omfattes imidlertid også. Egnede doser av det vekstinhiberende middel er de doser som i dag anvendes, og disse kan reduseres grunnet den kombinerte virkningen (synergien) av det vekstinhiberende middel og IL-17A/F-polypeptidet.
For behandling av immunrelatert sykdom eller en reduksjon av omfanget av sykdommen vil den egnede dose av en forbindelse ifølge oppfinnelsen avhenge av typen sykdom som skal behandles, som definert ovenfor, sykdommens omfang og forløp, hvorvidt middelet tilføres for forebyggende eller terapeutiske formål, tidligere behandling, pasientens kliniske historie og respons på forbindelsen, og den behandlede legens vurderinger. Forbindelsen tilføres til pasienten på egnet vis på et tidspunkt eller over en serie av behandlinger.
For eksempel er, avhengig av sykdommens type og omfang, fra tilnærmet 1 mg/kg til 15 mg/kg (for eksempel 0,1-20 mg/kg) av polypeptid eller antistoff en kandidat for en innledende dose for tilførsel til pasienten, enten ved en eller flere separate tilførsler eller ved kontinuerlig infusjon. En typisk daglig dose kan variere fra tilnærmet 1 mg/kg til 100 mg/kg eller mer, avhengig av faktorene som er nevnt ovenfor. For gjentatt tilførsel over flere dager eller mer, fortsettes behandlingen, avhengig av tilstanden, inntil en ønsket undertrykkelse av sykdomssymptomene opptrer. Andre doseringsskjemaer kan imidlertid være anvendbare. Behandlingens forløp kan lett følges ved konvensjonelle teknikker og analyser.
S. Fremstilte gjenstander
I en annen utførelse av oppfinnelsen tilveiebringes en fremstilt gjenstand som inneholder materialer (som for eksempel omfatter et IL-17A/F-molekyl) som er anvendbar for diagnose eller behandling av forstyrrelsene som er beskrevet ovenfor. Den fremstilte gjenstand omfatter en beholder og instruksjoner. Egnede beholdere omfatter for eksempel flasker, medisinflasker, sprøyter og reagensrør. Beholderne kan være fremstilt av en rekke forskjellige materialer, for eksempel glass eller plast. Beholderen inneholder et preparat som er effektivt for diagnose eller behandling av tilstanden og kan ha en steril adkomståpning (beholderen kan for eksempel være en pose for intravenøse løsninger, eller en medisinflaske med en kork som kan gjennomtrenges av en hypoderm kanyle). Det aktive middel i preparatet er vanligvis et polypeptid eller antistoff ifølge oppfinnelsen. En instruksjon eller merkelapp på eller forbundet med beholderen angir at preparatet kan anvendes for diagnose eller behandling av den valgte tilstand. Den fremstilte gjenstand kan videre omfatte en andre beholder som omfatter en farmasøytisk aksepterbar buffer, for eksempel fosfatbufret saltvann, Ringers løsning og dekstroseløsning. Den kan videre omfatte andre materialer som er ønskelige fra et kommersielt synspunkt og brukersynspunkt, innbefattet andre buffere, fortynningsmidler, filtere, kanyler. Sprøyter og pakkevedlegg med instruksjoner for anvendelse.
T. Diagnose og prognose av immunrelatert sykdom Celleoverflateproteiner, for eksempel proteiner som overuttrykkes i visse immunrelaterte sykdommer, er utmerkede mål for medikamentkandidater eller sykdomsbehandling. De samme proteinene som med utskilte proteiner som kodes av genene som er amplifisert i immunrelaterte sykdomstilstander kan også anvendes for diagnose og prognose av disse sykdommene. For eksempel kan antistoffer som er rettet mot proteinproduktene fra gener som er amplifisert i multippel sklerose, reumatoid artritt, inflammatorisk tarmsykdom eller en annen immunrelatert sykdom anvendes som diagnostiske eller prognostiske midler.
For eksempel kan antistoffer, innbefattet antistoffragmenter, anvendes for kvalitativ eller kvantitativ bestemmelse av ekspresjonen av proteiner som kodes av amplifiserte eller overuttrykte gener ("markørgenprodukter"). Antistoffet er fortrinnsvis utstyrt med en påvisbar merkingsgruppe, for eksempel fluorescerende, og bindingen kan følges ved hjelp av lysmikroskopi, væskestrøms cytometri, fluoirmetri eller andre teknikker som er kjente innen faget. Disse teknikkene er spesielt godt egnet dersom det overuttrykte gen koder for et celleoverflateprotein. Slike bindingsanalyser utføres i det vesentlige som beskrevet ovenfor.
In j/Yw-påvisning av antistoffbinding til markørgenproduktene kan for eksempel utføres ved immunfluorescens eller immunelektron mikroskopi. For dette formål tas en histologisk prøve fra pasienten, og et merket antistoff tilsettes til denne, fortrinnsvis ved å legge antistoffet over en biologisk prøve. Denne fremgangsmåten tillater også en bestemmelse av fordelingen av markørgenproduktet i det undersøkte vev. Det vil være åpenbart for fagfolk at et bredt utvalg av histologiske fremgangsmåter er tilgjengelige for in s/Yw-påvisning.
De påfølgende eksempler gis kun for illustrerende formål, og er ikke ment å begrense omfanget av den foreliggende oppfinnelse på noen måte.
Alle patentskrifter og litteraturreferanser som siteres i den foreliggende beskrivelse inkorporeres heri ved referanse i sin helhet.
EKSEMPLER
Kommersielt tilgjengelige reagenser som det vises til i eksemplene ble anvendt ifølge produsentens instruksjoner, med mindre annet er angitt. Kilden til de celler som i de påfølgende eksempler og i beskrivelsen er identifisert ved hjelp av ATCC-aksesjonsbetegnelser er American Type Culture Collection, Manassas, VA.
Eksempel 1
Rekombinant ekspresjon av et nytt IL-17-cytokin identifisert som IL-17A/F
Transfeksjon av humane 293- nyreceller med cDNA- ekspresjonsvektorer som koder for IL- 17 og IL- 17F
Humane 293-nyreceller ble transfektert med like mengder plasmider som kodet for genene for human IL-17, IL-17C og IL-17F ved anvendelse av en kalsiumfosfat utfellingsfremgangsmåte. For hver T-150-flaske med 50%-80% konfluente celler, ble 50 p.1 av hvert plasmid sammenblandet, slik at det ble dannet en utfelling på cellelaget. En dag etter transfeksjonen ble 50:50 F12:DMEM tilsatt 10% FCS, 5 mM L-glutamin og penicillin-streptomycin fjernet og erstattet med serumfritt PS24-medium, og cellene ble dyrket i ytterligere 4 dager. Etter 4 dager ble kondisjonert medium oppsamlet, sentrifugert og sterilfiltrert før rensingen.
Rensing av rekombinant IL- 17A/ F
A. Innledende fraksjoneringstrinn 1:
To og en halv liter rekombinant IL-17A/F-kondisjonert medium fra transient transfekterte, humane 293-nyrecellekulturer ble oppkonsentrert og dialysert mot 20 mM natriumacetat, pH 5,0, 1 mM natriumazid (Buffer A) til et volum på 480 ml ved anvendelse av en membran med 10 kilodalton grenseverdi, og så satt på en Pharmacia HiLoad S Sepharose 26/10-kolonne ved en elueringshastighet på 6 ml/min. Kolonnen ble eluert med en lineær gradient til 100% Buffer B (20 mM natriumacetat, 1 M NaCl, 1 mM natriumazid, pH 5,0) med en hastighet på 1%/minutt ved en elueringshastighet på 6 ml/min og oppsamling av fraksjoner på 12 ml. SDS PAGE-analyse ble utført på fraksjonene som ble oppsamlet fra denne kolonne. Proteinene ble synliggjort ved sølv-farging. Molekylmassemarkører er avmerket for gelen som inneholder fraksjonene 25-37 (Figur 2). Fraksjon 31 og 32 inneholdt et protein med en tilsynelatende molekylmasse på tilnærmet 33 kD, som er i samsvar med IL-17A/F.
B. Rensing av IL- 17A/ F:
4 ml av fraksjon 32 (Figur 2) ble surgjort med 0,1% trifluoreddiksyre og så ved en elueringshastighet på 0,5 ml/min satt på en Vydac C4-kolonne ekvilibrert med 0,1%) trifluoreddiksyre (Buffer C) og gradienteluert til 100% Buffer D (0,1% trifluoreddiksyre i 100%) acetonitril) med en tre-trinns gradient (0-35% D over et tidsrom på 10 minutter, 25-50%) D over et tidsrom på 35 minutter, 50-100% D over et tidsrom på 10 minutter).
Figur 2 viser kromatogrammet over de eluerte proteinene, målt ved 214 nm og 280 nm. Acetonitril trinngradienten er lagt over profilen. Proteinkonsentrasjonen i fraksjon 38 ble funnet å være 0,536 mg/ml ved aminosyreanalyse. Geler, blott, aminosyresekvensanalyse og aktivitetsanalyse ble utført på denne fraksjonen.
Fraksjon 31 og resten av fraksjon 32 fra HiLoad S-Sepharose-kjøringen ble slått sammen og dialysert mot Buffer A i 8 timer ved anvendelse av en membran med grenseverdi 10 kD, og så sendt gjennom et 0,2 mikronfilter. Dette materialet ble satt på en mono-S-kolonne ekvilibrert med Buffer A ved en elueringshastighet på 1 ml/min og eluert med en 3-trinns gradient til 100% Buffer B (0-30% B over 10 kolonnevolumer, 30-75% over 45 kolonnevolumer, 75-100% B over 10 kolonnevolumer) mens fraksjoner på 1 ml ble oppsamlet. Fraksjonene 26-43 ble analysert og proteinkonsentrasjonen bestemt ved aminosyreanalyse. Konsentrasjonen i fraksjon 31, 32 og 33 var 0,258, 0,359 henholdsvis 0,291 mg/ml. Geler, blott, aminosyresekvensanalyser, massespektrometrisk analyse og akvitetsanalyser ble hovedsakelig utført på fraksjon 32 og 33. Fraksjonene som ble dannet ved kromatografi ble analysert for innhold av IL-17 og IL-17F ved hjelp av Western-blotting. Et |ig/ml av monoklonalt antistoff rettet mot enten IL-17 eller IL-17F ble anvendt for å påvise nærvær av enten IL-17 eller IL-17F i prøvene.
Massespektrotmetrisk analyse av IL- 17A/ F
Aminosyresekvensen og interkjede-disulfidbindingene i modent IL-17A/F ble bestemt ved massespektrometrisk analyse (se Figur 4A, heterodimert IL-17A/F-polypeptid vist med interkjede- og intrakjede-disulfidbindinger). To interkjede-disulfidbindinger ble påvist mellom IL-17F- og IL-17-polypeptidkjeder (mellom aminosyrerest 47iL-i7f og aminosyrerest 129iL-i7 og mellom aminosyrerest 137IL_17Fog aminosyrerest 33iL_i7(fete, sorte streker i Figur 4A). I tillegg dannes to intrakjede-disulfidbindinger i hver av homodimer-polypeptidkj edene i IL-17 (mellom aminosyrerest 102 og 152, og mellom aminosyrerest 107 og 154) og IL-17F (mellom aminosyrerest 94 og 144 og mellom aminosyrerest 99 og 146) (tynne, sorte streker i Figur 4A). Aminosyrene er nummerert relativt til den innledende metioninrest i hver av forløper-polypeptidkjedene (Figur 4A). Figur 4B viser også skjematisk de IL-17A/F-peptidfragmenter som inneholder difulsidbindinger mellom IL-17- og IL-17F-kjeden, som vil forventes ved kløyving av IL-17A/F med trypsin (IL-17A/F-disulfidbindings-fragment nr. 1 betegnes SEKV ID NR: 7, IL-17A/F-disuldidbindingsfragment nr. 2 betegnes SEKV ID NR: 8). Aminosyrene som foreligger i disse fragmentene er angitt og nummererte relativt til den innledende metioninrest i hver kjede.
Den beregnede, tilnærmede molekylmasse av disse fragmentene som vil observeres ved massespektrometri er vist i Figur 4B som 3410,58 Da og 2420,05 Da (IL-17A/F-disulfidbindingsfragment nr. 1, henholdsvis nr. 2). Matriksassosiert laserdesorpsjons/ionisering-"time of flighf-massespektrometri (MALDI-TOF)-peptid-kartlegging ble utført (Figur 4C). 55 pmol av IL-17A/F i en buffer inneholdende 400 mM NaCl, 20 mM NaOAC-buffer, pH 5, ble behandlet over natten ved 37°C med Promega-trypsin av sekvenseringsenhet. Matriksassistert laserdesorpsjon/ionisering-"time of flighf-massespektrometri (MALDI-TOF) ble utført med forsinket ekstraksjon i positiv ionerefleksjonsmodus ved anvendelse av en 2',4',6'-trihydroksyacetofenon-matriks Det resulterende peptidkart inneholdt topper med (M+H)+ = 2420,12 Da for fragment nr. 2 og 3410,60 Da for fragment nr. 1, i samsvar med de disulfidsammenbundne peptider (Figur 4C). Et andre uttak av prøven ble kløyvet ved pH 8 etter reduksjon av disulfidbindingen med ditiotreitol og alkylering av sulfhydrylgrupper med jodacetamid. MALDI-TOF-spekter for denne prøven manglet de angjeldende topper, noe som understøtter teorien om at disse inneholder disulfidbroer. Den ikke-reduserte prøven ble viderekarakterisert vedvæskekromatograif/elektrospray ionisering-ionefelle-massespektrometri (LC-ESI-MS) (Figur 4D). Ionekromatogrammene representerer (ovenfra og nedover) det totale ionekromatogram, det rekonstruerte ionekromatogram (RIC) for IL-17A/F-disulfidbindingsfragment nr. 2 (M+2H)2+ og IL-17A/F-disulfidbindingsfragment nr. 1 (M+2H)3+. Topper som var i samsvar med de to heterodimerene ble observert, mens ingen topper over den kjemiske bakgrunnsstøy ble observert ved de forventede masser for de homodimere peptidene, noe som viser fravær av IL-17- eller IL-17F-homodimerer. Sammensetningen av de disulfidsammenbundne heterodimerene ble så bekreftet ved tandem-massespektrometri. Kollisjonsindusert dissosiering av den dobbeltladede forløper ved m/z 1210,9, som tilsvarer IL-17A/F-disulfindbindings-fragment nr. 2, og den trippelladede forløper ved m/z 1138,0, som tilsvarer IL-17A/F- disulfidbindingsfragment nr. 1. Forventede fragmenttopper fra b- og y-ioneserien ble observert i de tilsvarende spektere.
Bakteriofagbiblioteks gjennomsøking etter antistoffer som bindes til IL- 17A/ F
For påvisning av antistoffer som bindes til IL-17A/F, ble et bakteriofagbibliotek av syntetiske Fab-antistoffer gjennomsøkt. 34 (34) uavhengige kloner som koder for forskjellige Fab-antistoffsekvenser ble påvist. Disse kunne formidle binding til IL-17 A/F. Bakteroifagbilioteket av humane antistoffsekvenser ble fremstilt og gjennomsøkt for antigenspesifikt Fab på en måte til ligner hva som tidligere er beskrevet (Gerstner, R.B. et al., J. Mol. Biol, 321(5):851-62 (2002). Kort beskrevet ble det humaniserte, monoklonale antistoff 4D5, et anti-HER2-antistoff, anvendt som et stillas for konstruksjon av bakteroifagfremviste Fab-biblioteker. Disse Fab-molekylene fremvises monovalent og/eller divalent på bakteriofagen ved fusjon til en homodimeriserbar leuzin-"zipper". For å skape diversitet i biblioteket, valgte vi å randomisere overflateeksponerte tungkjede-CDR-aminosyrerester som også ble funnet å være svært variable i kabat-databasen over naturlige antistoffsekvenser som danner et kontinuerlig strekk. Videre anvendte vi seterettet mutagenese med skreddersydde degenererte kodoner for å skape en aminosyrediversitet som lignet det naturlige immunrepertoar i hvert CDR-sete. Først ble to CDR i tungkjeden, Hl og H2, gitt en begrenset diversitet med samme lengde som Herceptin, mens H3 er utformet til å ha høy degenererthet med en lengde i området fra 7-19. Alle antistoffer som ble erholdt ved den innledende seleksjon i biblioteket har samme lettkjede. Fullengde-IgG eller Fab kan fremstilles ved en en-trinns kloning av tungkjedens variable domene i vektorer som tilfører den ønskede isotypespesifikke konstante område-sekvens. For ytterligere å forbedre affiniteten til bindende molekyler fra tungkjedebiblioteket, kan en annentrinns randomisering av lettkjede-CDR benyttes. Aminosyresekvensen til det området i det variable domenet i tungkj edene som inneholder de tre (3) CDR (H1-H3) fra Fab som binder IL-17A/F vises i Figur 6. Her vises en sammenstilling av et område i den utledede aminosyresekvens til 34 Fab-kloner som koder for forskjellige antistofftungkjedesekvenser som kan bindes til I1-17A/F. De tre tungkjede-CDR-områdene er vist som CDR-H1, CDR-H2 henholdsvis CDR-H3 og er skraverte. Det tilsvarende SEKV ID NR for hver klon er som følger: Klon nr. 1 = SEKV ID NR: 9; Klon nr. 2 = SEKV ID NR: 10; Klon nr. 3 = SEKV ID NR: 11; Klon nr. 4 = SEKV ID NR: 12; Klon nr. 5 = SEKV ID NR: 13; Klon nr. 6 = SEKV ID NR: 14; Klon nr. 7 = SEKV ID NR: 15; Klon nr. 8 = SEKV ID NR: 16; Klon nr. 9 =SEKV ID NR: 17; Klon nr. 10 = SEKV ID NR: 18; Klon nr. 11 = SEKV ID NR: 19; Klon nr. 12 = SEKV ID NR: 20; Klon nr. 13 = SEKV ID NR: 21; Klon nr. 14 = SEKV ID NR: 22; Klon nr. 15 = SEKV ID NR: 23; Klon nr. 16 = SEKV ID NR: 24; Klon nr. 17 = SEKV ID NR: 25; Klon nr. 18 = SEKV ID NR: 26; Klon nr. 19 = SEKV ID NR: 27; Klon nr. 20 =SEKV ID NR: 28; Klon nr. 21 = SEKV ID NR: 29; Klon nr. 22 = SEKV ID NR: 30; Klon nr. 23 = SEKV ID NR: 31; Klon nr. 24 = SEKV ID NR: 32; Klon nr. 25 = SEKV ID NR: 33; Klon nr. 26 = SEKV ID NR: 34; Klon nr. 27 = SEKV ID NR: 35; Klon nr. 28 = SEKV ID NR: 36; Klon nr. 29 = SEKV ID NR: 37; Klon nr. 30 = SEKV ID NR: 38; Klon nr. 31 = SEKV ID NR: 39; Klon nr. 32 = SEKV ID NR: 40; Klon nr. 33 = SEKV ID NR: 41; Klon nr. 34 = SEKV ID NR: 42.
I tillegg vises de tilsvarende, kodende DNA-sekvensene fra hver av de trettifire (34) klonene i Tabell 7 nedenfor (fra SEKV ID NR: 43 til SEKV ID NR: 76).
Cellebaserte analyser - IL- 17A/ F induserer dannelse av IL- 7 og IL- 6
Fraksjoner isolert fra Vudac C4-rensetrinnet beskrevet ovenfor (Figur 3) ble analysert for evnen til IL-17A/F til å indusere dannselav IL-8. Fraksjonene ble analysert ved inkubering med TK-10-celler i 24 timer (0,033 mikroliter fraksjon/ml celle-dyrkningsmedium). Kondisjonert medium ble så oppsamlet, og konsentrasjonen av IL-8 og IL-6 ble målt i hver fraksjon ved ELISA. Fraksjon 38 ble funnet å ha en robust aktivitet. Proteinkonsentrasjonen i fraksjon 38 ble funnet å være 0,536 mg/ml ved aminosyreanalyse. Geler, blott, aminosyresekvensanalyser og akvitetsanalyser ble utført på denne fraksjonen (Figur 3). Alternativt ble fraksjon 31 og det gjenværende volum av fraksjon 32 fra HiLoad S-Sepharose-kjøringen slått sammen og dialysert mot Buffer A i 8 timer ved anvendelse av en membran med 10 kD grenseverdi og sendt gjennom et 0,2 mikronfilter. Dette materialet satt på en Mono-S-kolonne ekvilibrert med Buffer A ved en elueringshastighet på 1 ml/min og eluert med en tre-trinns gradient til 100% Buffer B (0-30%) B over 10 kolonnevolumer, 30-75% B over 45 kolonnevolumer, 45-100% B over kolonnevolumer) mens det ble oppsamlet fraksjoner med 1 ml. Fraksjonene 26-43 ble analysert og proteinkonsentrasjonene bestemt ved aminosyreanalyse. Ren IL-17A/F ble påvist i fraksjonene 31-33 som et enkelt protein med en tilsynelatende molekylmasse på 30-35 kD. Konsentrasjonen i fraksjon 31, 32 og 33 var 0,258, 0,359 henholdsvis 0,291 mg/ml. Geler og proteinsekvensanalyse viste at dette materialet var identisk med IL-17 A/F renset på en C4-kolonne (ovenfor). Dose-responskurver som sammenligner IL-8-og IL-6-induksjonen oppnås med IL-17A/F, IL-17 og IL-17F vises i Figur 5. IL-17A/F, IL-17 og IL-17F ble innkubert med TK-10-celler ved de angitte konsentrasjoner i 24 timer. TK-10-kondisjonert medium ble oppsamlet og analysert ved IL-8-ELISA og IL-6-ELISA.
Diskusjon
Samtidig ekspresjon av mRNA for 11-17 og IL-17F fører til utskilling av et nytt proteinmolekyl som kan bindes til både visse antsitoffer som kan bindes til IL-17 og visse antistoffer som kan bindes til IL-17F. Dette nye proteinmolekyl betegnes heri interleukin-17A/F (IL-17A/F). Denne molekyltypen observeres ikke dersom humane 293-nyreceller fås til å uttrykke enten IL-17 eller IL-17F alene. Kondisjonert medium fra transfekterte celler ble immunutfelt (IP) ved benyttelse av antistoff som kan gjenkjenne IL-17 (spor 1-5) eller IL-17F (spor 6-10), som vist i Figur IA og Figur IB. Immunutfelte proteiner ble så fraksjoner ved Western-blott analyse og blottet med antistoffer mot IL-17 (Figur IA) eller IL-17F (Figur IB). Påvisning av IL-17A/F vises i spor 8 i Figur IA og i spor 3 i Figur IB ved nærvær av IL-17 i et dimert kompleks med IL-17F. Molekylmassen av dette molekylet, bestemt ved ikke-reduserende SDS-PAGE, er tilnærmet 30-34 kD, som er i samsvar med et molekyl som består av et molekyl IL-17 og et molekyl IL-17F sammenbundet via en kovalent binding. Nærværet av dette nye molekylet (IL-17A/F) kan også observeres som et protein med en elektroforetisk mobilitet som er forskjellig fra mobiliteten som observeres dersom enten IL-17 eller IL-17F uttrykkes alene. Dette nye molekylet kan også synliggjøres uten anvendelse av antistoffer ved benyttelse av andre fremgangsmåter for proteinpåvisning, for eksempel konvensjonelle proteinfargingsteknikker.
Nærværet av et nytt proteinmolekyl dannet ved samtidig ekspresjon av IL-17 og IL-17F ble også observert ved å fraksjonere de utskilte proteinene som foreligger i kondisjonert medium ved reversfase-kromatografi. En sammenligning av protein-fraksjonene som ble observert fra de utskilte proteinene dannet av celler som samtidig uttrykker IL-17 og IL-17F med mønstrene som observeres med celler som danner enten IL-17 eller IL-17F, viste nærvær av et ekstra proteinmolekyl. Denne proteinmolekyltypen, IL-17A/F, ble renset og isolert til homogenitet ved kolonnekromatografi (Figur 2 og 3).
Renset protein vandret som et enkelt bånd ved tilnærmet 30-35 kD, bestemt ved ikke-reduserende SDS-PAGE (Figur 3A). Under reduserende betingelser fremkom imidlertid to klart forskjellige bånd med en tilsynelatende molekylmasse på tilnærmet 15-18 kD (ikke vist). IL-17A/F er følgelig en kovalent dimer. En uavhengig måte å analysere sammensetningen av det nye proteinet, N-terminal peptidsekvensanalyse, viste også tydelig at det isolerte IL-17A/F inneholder både IL-17- og IL-17F-peptider (Figur 3B). De påviste peptidsekvensene er identisk med en sekvens som foreligger i den N-terminale ende av IL-17 og IL-17F (Figur 3C). Western-blott-analyse viste at dette nye proteinmolekylet også kunne interagere med både et antistoff som kan bindes til IL-17 og et antistoff som kan bindes til IL-17F. Alle disse observasjonene og den klart forskjellige molekylmassen til det nye isolerte proteinmolekyl tyder på at det isolerte protein IL-17A/F er et nytt proteinmolekyl som omfatter en kovalent assosiasjon mellom IL-17 og IL-17F.
Forekomsten og plasseringen av disulfidbindingene som sammenbinder IL-17-og IL-17F-kjeden i IL-17A/F ble viderekarakterisert vedanvendelse av massespektrometri. Posisjonene av disulfidbindingen i IL-17A/F er vist skjematisk i Figur 4A. To interkjede-disulfidbindinger sammenbinder IL-17- og IL-17F-kjeden i IL-17A/F. Kløyving av IL-17A/F med trypsin vil forventes å gi to forskjellige peptidfragmenter som inneholder interkjede-disulfidbindingene (Il-17A/F-disuIfidbindingsfragment nr. 1 og nr. 2, SEKV ID NR: 7 henholdsvis 8). Disse peptidene er vist skjematisk (Figur 4B) sammen med den tilhørende, utledede molekylmasse. Disse peptidene ble observert ved Matrix-assistert laserdesorpsjon/ionisering-"time of flighf-massespektrometri (MALDI-TOF) (Figur 4C) og ved væskekromatografi-elektrospray ionisering-ionefelle-massespektrometri (LC-ESI-MS) (Figur 4D). Peptidtopper som tilsvarerer homodimerer av IL-17 eller IL-17F ble ikke påvist, noe som viser at det rensede IL-17A/F bestod av kovalente heterodimerer av IL-17 og IL-17F-kjeder, og ikke inneholdt et påvisbart nivå av homodimerer av verken IL-17 eller IL-17F.
I tillegg har antistoffer som bindes til IL-17A/F blitt påvist ved å gjennomsøke et bakteriofagbibliotek av syntetiske Fab-antistoffer. Trettifire (34) uavhengige kloner som koder for forskjellige Fab-antistoffsekvenser ble påvist, og disse kunne formidle binding til IL-17 A/F. Aminosyresekvensen i det området i det variable domenet i tungkj edene som inneholder de tre (3) CDR (H1-H3) fra Fab som binder IL-17 A/F vises i Figur 6. Her vises en sammenstilling av et område i den utledede aminosyresekvens til 34 Fab-kloner som koder for forskjellige antistoff tungkjedesekvenser som kan bindes til IL-17A/F. De tre tungkjede-CDR-områdene er vist som CDR-H1, CDR-H2 henholdsvis CDR-H3 og er fremhevet med gulfarge. De tilsvarende aminosyresekvensene for de trettifire (34) klonene er angitt som SEKV ID NR: 9-42. I tillegg vises de tilsvarende kodene DNA-sekvensene for hver av de påviste trettifire (34) klonene i Tabell 7 nedenfor (SEKV ID NR: 43 til SEKV ID NR: 76). Det har følgelig blitt påvist spesifikke antistoffer som bindes selektivt til det nye heterodimere kompleks IL-17A/F, og disse kan bidra til å modulere aktiviteten av dette nye cytokinet. IL-17A/F ble analysert for evnen til å stimulere en proinflammatorisk respons ved anvendelse av den humane nyrecellelinjen TK-10 (Figur 5). Denne cellelinjen responderer på både IL-17 og IL-17F ved å danne IL-8. IL-17A/F ga også en robust induksjon av IL-8-dannelse i denne cellelinjen (Figur 5A). Det er av interesse at IX-17A/F ble observert å ha en unik aktivitet som var forskjellig fra både IL-17 og IL-17F. Forskjellen i aktivitet skiller seg fra aktiviteten til IL-17 og I1-17F, i begge tilfeller med grovt sett en størrelsesorden. Den vesentlig høyere aktivitet av IL-17A/F enn av IL-17F i denne analysen, tyder på at IL-17A/F kan utgjøre en avgjørende del av den cytokinaktivitet som skyldes IL-17F-genproduktet. Denne unike aktiviteten kan gjøre det mulig for molekylet å ha et særskilt område av virkninger in vivo. IL-17A/F induserte også dannelse av IL-6 fra denne cellelinjen (Figur 5B). I tillegg er det sannsynlig at IL-17 A/F kan ha andre egenskaper som verken foreligger i IL-17 eller IL-17F som en følge av sin nye, heterodimere sammensetning, noe som kan endre kinetikken og benyttelsen av reseptorsubenheter in vivo, og føre til unike, biologiske følger.
Eksempel 2
Påvisning av et nytt IL-17-cytokin som dannes i aktiverte, humant T-celler
Et nytt humant IL-17-cytokin (heri betegnet humant IL-17A/F) beskrives heri for første gang som et naturlig produsert molekyl i aktiverte, humant T-lymfocyttceller. Isolering og aktivering av humant T-lymfocyttceller ble utført og IL-17A/F-dannelse påvist og målt kvantitativt ved IL-17A/F-ELISA, som vist nedenfor.
Isolering og aktivering av humane T- celler
Heparinisert (0,5 ml/50 cc), nytappet, humant blod fra en normal, frisk donor ble fortynnet 1:1 med fysiologisk saltvann, og så lagt over LSM-lymfocyttseparasjons-medium (ICN) og sentrifugert som anbefalt av produsenten (ICN). Gjenvunne mononukleære lymfocytter ble utsådd i vevsdyrkningsflasker i komplett RPMI (RPMI, 10% FCS, 2 mM L-glutamin, penicillin/streptomycin (GIBCO)) i 1 time ved 37°C for å fjerne monocytter. Dyrkningssupernatantene ble sentrifugert for nedsentrifugering av de gjenværende cellene. Humant T-lymfocytter ble så isolert ved negativ seleksjon ved anvendelse av et CD4+-T-celleisoleringssett (MACS). For aktivering av de isolerte T-lymfocyttene, ble vevsdyrkningsflasker belagt med 5fig/ml av hver av anti-CD3 (BD Bioscience) og anti-CD28 (BD Bioscience) i PBS over natten ved 4°C. Etter fjerning av belegningsvæsken ble isolerte, humant T-lymfocytter utsådd i komplett RPMI ved en tilnærmet tetthet på 2 millioner celler per milliliter medium. Prøver av mediet ble oppsamlet på forskjellige tidspunkter etter utsåingen og analysert for IL-17A/F ved ELSA. Kontrollsupernatanter fra ikke-aktiverte celler ble oppsamlet fra cellesupernatanter fra flasker som ikke var belagt med anti-CD3 og anti-CD28.
ELISA- måling av dannelsen av humant IL- 17A/ F i anti- CD3/ anti- CD28-aktiverte, humant T- celler
Nivået av human IL-17A/F ble målt ved ELISA. Anti-humant IL-17 fra mus ble fortynnet i beleggningsbuffer (0,05 M natriumkarbonatbuffer, pH 9,6) og benyttet for belegging av 96-brønners mikrotiterplater (Nunc) i 12-15 timer ved 2-8°C. Alle påfølgende trinn ble utført ved romtemperatur. Uspesifikk binding ble blokkert ved å tømme brønnene og tilsette blokkeringsbuffer (PBS, 0,5%) BSA, 10 ppm Proclin 300). Etter innkubering i 1 time ble brønnene vasket med vaskebuffer (PBS, 0,05% Tween 20, 10 ppm Proclin 300). Referansestandarder for humant IL-17A/F og prøver fortynnet i analysebuffer (PBS, 0,5% BSA, 0,05% Tween 20, 10 ppm Proclin 300) ble så tilsatt. Etter innkubering i 2 timer ble brønnene vasket med vaskebuffer. Biotinylert anti-humant IL-17 fra mus, fortynnet med analysebuffer, ble tilsatt og innkubert i 1 time. Etter vask av platene med vaskebuffer ble streptavidin-HRP (pepperrotperoksidase)
(Amersham) fortynnet med analysebuffer tilsatt, og innkubert i 1 time. Etter vask av platene med vaskebuffer, ble substratløsningen, TMB (tetrametylbenzidin)-peroksidase
(R & D Systems) tilsatt. Fargeutviklingen ble stanset ved tilsetting av 2 N svovelsyre. Platene ble så avlest i en mikrotiterplateleser (SLT) ved 450 nm med en subtrahert nullverdi ved 540 nm. Et fire-parameters kurvetilpasningsprogram ble anvendt for fremstilling av en standardkurve, og konsentrasjonen i prøvene ble erholdt ved å interpolere fra kurvens lineære del. IL-17A og IL-17F inngikk som kontroller i ELISA-analysen for å vise analysens spesifisitet for IL-17A/F (Figur 12).
Resultater:
Resultatene fra ELISA-målingene av dannelsen av IL-17A/F vises i Figur 11. Disse undersøkelsene viser dannelsen av et nytt cytokin, IL-17A/F, fra anti-CD3/anti-CD28-aktiverte humant T-lymfocyttceller, sammenlignet med ikke-aktiverte humane T-celler, hvor ingen produksjon av IL-17A/F ble påvist. Disse resultatene viser for første gang den naturlige forekomst av et nytt cytokin som dannes, og frigjøres som respons på aktivering av humant T-lymfocytter. I tillegg ble ELISA-analysens spesifisitet vist ved å observere nesten ekvivalente mengder av IL-17A/F i tre prøver (nr. 31 - nr. 33) ved analyse i parallell. Neglisjerbare mengder av IL-17A og IL-17F ble påvist i denne IL-17A/F-spesifikke ELISA-analysen (Figur 12).
Undersøkelsene som beskrives heri i Eksempel 1 og 2 fastslår at rekombinant, humant IL-17A/F er et klart nytt cytokin som skiller seg fra humant IL-17 og IL-17F, både når det gjelder proteinstruktur og i cellebaserte aktivitetsanalyser. Ved anvendelse av renset, rekombinant humant IL-17A/F som standard, har det blitt utviklet en ELISA spesifikk for human IL-17A/F (vist i Figur 11). Ved anvendelse av denne spesifikke ELISA, ble indusert ekspresjon av humant IL-17A/F påvist, noe som bekrefter at IL-17A/F dannes naturlig fra aktiverte, humane T-celler i kultur. Følgelig er IL-17A/F et klart nytt cytokin som kan påvises som et naturlig produkt fra isolerte, aktiverte, humane T-celler og hvis rekombinante form har blittkarakterisert, både når det gjelder proteinstruktur og i cellebaserte analyser, til å være forskjellig og skillbar fra beslektede cytokiner.
Dette nye cytokinet kan virke ved å modulere aktiviteten av IL-17 in vivo, ved å virke som en kompetitiv inhibitor av bindingsseter for IL-17 eller andre beslektede cytokiner. IL-17A/F kan også modulere aktiviteten av andre beslektede cytokiner ved å nedregulere bindingsseter for seg selv og/eller bindingsseter for andre, beslektede cytokiner. IL-17A/F kan vise aktivitet via intracellulære adaptere eller signalmolekyler som virker ved å påvirke sin egen signalaktivitet eller aktiviteten til andre, beslektede cytokiner. IL-17A/F har evnen til å påvirke pardannelsen mellom reseptorer og ko-reseptorer som forefinnes på celleoverflaten eller i den intracellulære avdeling.
Disse undersøkelsene tilveiebringer og påvises følgelig et nytt immunstimulerende middel (dvs. IL-17A/F) som kan forsterke immunsystemets respons på et gitt antigen som ikke nødvendigvis har vært immunologisk aktivt tidligere. Følgelig har det nyidentifiserte immunstimulerende middel viktige, kliniske anvendelser. Andre kjente immunstimulerende midler, for eksempel IL-12, har blitt påvist (se Gubler et al, PNAS, 88, 4143 (1991)). I en nylig utprøvning av en kreftvaksine, har forskere fra University of Chicago and Genetics Institute (Cambridge, MA) bygd på den immunstimulerende aktivitet av IL-12 for behandling av melanom (Peterson et al. Journal of Clinical Oncology, 21 (12), 2342-48 (2003)). De ekstraherte fra sirkulasjonen hvite blodceller som bar en eller flere markører fra melanomceller, isolerte antigenet og tilbakeførte dem til pasientene. Normalt vil pasienter ikke ha en immunrespons mot sine egne, humane antigener. Pasientene ble så behandlet med forskjellige doser av IL-12, et immunstimulerende middel som kan indusere proliferasjon av T-celler som samtidig har blitt stimulert av dendrittceller. Grunnet den immunstimulerende virkning av IL-12, ga behandlingen overlegne resultater sammenlignet med tidligere arbeider, hvor pasientens egne dendrittceller ble fremstilt fra mononukleære celler fra perifert blod (PBMC), behandlet med antigener, så dyrket in vitro og tilbakeført til pasienten for å stimulere en anti-kretfrespons (Thurner et al, J. Exp. Med, 190 (11), 1669-78 (1999)). Likeså vil dette nye IL-17A/F-cytokin eller agonister derav kunne finne praktisk anvendbarhet som et immunstimulerende middel, mens molekyler som inhiberer IL-17A/F-aktivitet (antagonister) ville forventes å ha praktisk nytteverdi dersom en inhibering av immunresponsen er ønskelig, for eksempel ved autoimmune sykdommer.
Antistoffer mot dette nye cytokin som enten etterligner (agonistiske antistoffer) eller inhiberer (antagonistiske antistoffer) de immunologiske aktivitetene av IL-17A/F vil følgelig kunne ha terapeutiske kvaliteter. Små molekyler som virker ved å inhibere aktiviteten av dette nye cytokin vil også ha mulige terapeutiske anvendelser.
Eksempel 3
Anvendelse av IL-17A/F som hybridiseringsprobe
Den påfølgende fremgangsmåten beskriver anvendelsen av en nukleotidsekvens som koder for IL-17A/F som hybridiseringsprobe.
DNA som omfatter den kodende sekvens for fullengde eller modent IL-17A/F som beskrevet heri, benyttes som en probe for søk etter homolog DNA (for eksempel DNA som koder for naturlig forekommende varianter av IL-17A/F) i cDNA-biblioteker fra humant vev eller genomiske biblioteker fra humant vev.
Hybridisering og vask av filtere som inneholder DNA fra et av disse bibliotekene utføres under følgende betingelser med høy stringens: hybridisering av radioaktivt merket IL-17A/F-avledet probe til filtrene utføres i en løsning med 50% formamid, 5 x SSC, 0,1% SDS, 0,1% natriumpyrofosfat, 50 mM natriumfosfat, pH 6,8, 2 x Denhardts løsning og 10% dekstransulfat ved 42°C i 20 timer. Filtrene vaskes i en vandig løsning med 0,1 x SSC og 0,1% SDS ved 42°C.
DNA med en ønsket sekvensidentitet med det DNA som koder for fullengde IL-17 A/F med nativsekvens kan så påvises ved anvendelse av standardteknikker som er kjente innen faget.
Eksempel 4
Ekspresjon av IL-17A/F i E. coli
Dette eksempelet illustrerer fremstillingen av en ikke-glykosylert form av IL-17A/F-polypeptider ved rekombinant ekspresjon i E. coli.
DNA-sekvensen som koder for et IL-17A/F-polypeptid amplifiseres i utgangspunktet ved anvendelse av utvalgte PCR-primere. Primerne bør inneholde restriksjonsenzymseter som tilsvarer restriksjonsenzymsetene i den valgte ekspresjonsvektor. En rekke forskjellige ekspresjonsvektorer kan benyttes. Et eksempel på en egnet vektor er pBR322 (avledet fra E. coli, se Bolivar et al. Gene, 2:95 (1977)), som inneholder gener for ampicillin- og tetrasyklinresistens. Vektoren kuttes med restriksjonsenzym og defosforyleres. De PCR-amplifiserte sekvensene ligeres så inn i vektoren. Vektoren vil fortrinnsvis omfatte sekvenser som koder for et antibiotika-resistent gen, en trp-promoter, en polyHis-ledersekvens (innbefattet de første seks STII-kodonene, polyHis-sekvensen og et enterokinase kløyvingssete), området som koder for IL-17A/F-polypeptid, en transkripsjonsterminator fra bakteroifag lambda og et argU-gen.
Ligeringsblandingen anvendes som for transformasjon av en valgt E. coli-stamme ved anvendelse av fremgangsmåtene som beskrives i Sambrook et al, supra. Transformanter påvises ved hjelp av evnen til å vokse på LB-skåler, og antibiotika-resistente kolonier utvelges så. Plasmid-DNA kan isoleres og bekreftes ved restriksjons-analyse og DNA-sekvensering.
Utvalgte kloner kan dyrkes over natten i flytende dyrkningsmedium, for eksempel LB-medium tilsatt antibiotika. Overnatt kulturen kan så anvendes for inokulering av en kultur i større skala. Cellene dyrkes så til en ønsket optisk tetthet, i løpet av hvilken tid ekspresjonspromoteren skrus på.
Etter dyrking av cellene i ytterligere flere timer, kan cellene høstes ved sentrifugering. De nedsentrifugerte cellene kan solubiliseres ved anvendelse av forskjellige midler som er kjente innen faget, og det solubiliserte IL-17A/F-protein kan så renses ved anvendelse av en metallchelaterende kolonne under betingelser som tillater tett binding av proteinet.
IL-17A/F-polypeptider kan uttrykkes i E. coli i en poly-His-merket form ved anvendelse av følgende fremgangsmåter: DNA som koder for et IL-17A/F-polypeptid amplifiseres i utgangspunktet ved anvendelse av utvalgte PCR-primere. Primerne vi inneholde restriksjonsenzymseter som tilsvarer restriksjonsenzymsetene i den valgte ekspresjonsvektor, og andre anvendbare sekvenser som gir effektiv og pålitelig translasjonsinitiering, hurtig rensing på en metallchelaterende kolonne og proteolytisk fjerning med enterokinase. De PCR-amplifiserte poly-His-merkede sekvensene ligeres så inn i en ekspresjonsvektor som anvendes for transformasjon av en E. coU- v<q>xX basert på stamme 52 (W3310 fuhA(tohA) lon GalE rpoHts(htpRts) clpP(laelq). Transformantene dyrkes først i LB tilsatt 50 mg/ml karbenicillin ved 30°C under omrysting inntil O.D. 600 på 3-5 nås. Kulturene fortynnes så 50-100 ganger med CRAP-medium (fremstilt ved å blande 3,57 g (NH4)2S04, 0,71 g natriumcitrat»2H20, 1,07 g KC1, 5,36 g Difco-gjær-ekstrakt, 5,36 g Sheffield hykase SF i 500 ml vann, så vel som 110 mM MPOS, pH 7,3, 0,55% (v/v) glukose og 7 mM MgS04) og dyrket i tilnærmet 20-30 timer ved 30°C under omrysting. Prøver tas så ut for å bekrefte ekspresjon ved SDS-PAGE-analyse, og hovedmengden av kulturen sentrifugeres for nedsentrifugering av cellene. De nedsentrifugerte cellene nedfryses inntil proteinet skal rensens og gjenfoldes.
E. cø//-masse fra 0,5 til 1 1 fermenteringer (6-10 g cellemasse) resuspenderes i 10 volumer (v/v) i 7M guanidin, 20 mM Tris, pH 8 buffer. Fast natriumsulfitt og natriumtetrationat tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 0,1 M, henholdsvis 0,2 M, og løsningen omrøres over natten ved 4°C. Dette trinnet fører til et denaturert protein i hvilket alle cysteinrester er blokkert ved sulfitolisering. Løsningen sentrifugeres ved 40 000 rpm i en Beckman ultrasentrifuge i 30 min. Supernatanten fortynnes med 3-5 volumer metallchelat kolonnebuffer (6M guanidin, 20 mM Tris, pH 7,4) og filtreres gjennom 0,22 mikrofiltere for klaring. Det klarnede ekstrakt settes på en 5 ml Qiagen Ni-NTA-metallchelatkolonne ekvilibrert med metallchelatkolonnebuffer. Kolonnen vaskes med mer buffer inneholdende 50 mM imidazol (Calbiochem, Ultrol-renhet), pH 7,4. Proteinet elueres med buffer inneholdende 250 mM imidazol. Fraksjonene som inneholder det ønskede protein slås sammen og lagres ved 4°C. Proteinkonsentrasjonen beregnes ut fra absorbansen ved 280 nm ved anvendelse av den beregnede ekstinksjons-koeffisient basert på aminosyresekvensen.
Proteinene gjenfoldes ved langsom fortynning av prøven med nyfremstilt gjenfoldingsbuffer bestående av 20 mM Tris, pH 8,6, 0,3 M NaCl, 2,5 M urea, 5 mM cystein, 20 mM glysin og 1 mM EDTA. Gjenfoldingsvolumet velges slik at den endelige proteinkonsentrasjonen er på mellom 50 og 100 mikrogram/ml. Gjenfoldingsløsningen omrøres forsiktig ved 4°C i 12-36 timer. Gjenfoldingsreaksjonen stanses ved tilsetting av TFA til en sluttkonsentrasjon på 0,4% (pH tilnærmet 3). Før videre rensing av proteinet filtreres løsningen gjennom et 0,22 mikrofilter og acetonitril tilsettes til en sluttkonsentrasjon på 2-10%. Det gjenfoldede protein kromatograferes på en Poros Rl/H reversfase-kolonne ved anvendelse av en mobil buffer med 0,1% TFA med eluering med en acetonitrilgradient fra 10-80%). Uttak av fraksjoner med A280-absorbans analyseres i SDS-polyakrylamidgeler, og fraksjoner som inneholder homogent gjenfoldet protein slås sammen. Generelt elueres det korrekt gjenfoldede molekyl av de fleste proteiner ved de laveste acetonitrilkonsentrasjoner, siden disse molekyltypene er de mest kompakte og har sitt hydrofobe indre beskyttet mot interaksjon med reversfase-resinet. Aggregerte molekyltyper elueres vanligvis ved høyere acetonitrilkonsentrasjoner. I tillegg til å fjerne feilfoldede proteinformer fra den ønskede form, fjernes reversfase-trinnet også endotoksin fra prøvene.
Fraksjoner som inneholder det ønskede, foldede IL-17 A/F-polypeptid slås sammen, og acetonitril fjernes ved anvendelse av en forsiktig nitrogenstrøm rettet mot løsningen. Proteinene utformes i 20 mM Hepes, pH 6,8 med 0,14 M natriumklorid og 4% mannitol ved dialyse eller gelfiltrering ved anvendelse av G25 Superfine (Pharmacia)-resiner ekvilibrert i utformingsbuffer og sterilfiltreres.
Eksempel 5
Ekspresjon av IL-17A/F i pattedyrceller
Eksempelet illustrerer fremstillingen av en muligens glykosylert form av IL-17A/F-polypeptider ved rekombinant ekspresjon i pattedyrsceller.
Vektoren pRK5 (se EP 307 247, offentliggjort 15. mars, 1989) benyttes som ekspresjonsvektor. Om ønskelig ligeres IL17A/F-DNA inn i pRK5 med utvalgte restriksjonsenzymer som tillater innsetting av IL-17A/F-DNA ved anvendelse av ligeringsfremgangsmåter som tilsvarer den beskrevet i Sambrook et al, supra. Den r3esterende vektor betegnes pRK5-IL-17A/F.
I en utførelse kan de valgte vertscellene være 293-celler. Humane 293-celler (ATCC CCL 1573) dyrkes til konfluens i vevsdyrkningsskåler i medium, for eksempel DMEM tilsatt fetalt kalveserum og om ønskelig næringsstoffer og/eller antibiotika. Tilnærmet 10 fj.g pRK5-IL-17A/F-DNA blandes med tilnærmet 1 \ ig DNA som koder for VA-RNA-genet (Thimmappaya et al, Cell, 31:543 (1982)) og løses i 500 ul 1 mMTris-HC1, 0,1 mM EDTA, 0,227 M CaCl2. Denne blandingen tilsettes dråpevis 500 ul 50 mM HEPES (pH 7,35), 280 mM NaCl, 1,5 mM NaP04, og en utfelling får dannes i 10 minutter ved 25°C. Det utfelte materialet suspenderes og tilsettes til 293-cellene og får sette seg i tilnærmet 4 timer ved 37°C. Dyrkningsmediet avsuges og 2 ml 20% glyserol i PBS tilsettes i 30 sekunder. 293-cellene vaskes så med serumfritt medium, friskt medium tilsettes og cellene innkuberes i tilnærmet 5 dager.
Tilnærmet 24 timer etter transfeksjonene fjernes dyrkningsmediet og erstattes med dyrkningsmedium (alene) eller dyrkningsmedium tilsatt 200 iiCi/ml S-cystein og 200 LiCi/ml S-metionin. Etter innkubering i 12 timer, oppsamles det kondisjonerte medium, oppkonsentreres ved hjelp av et sentrifugeringsfilter og settes på en 15% SDS-gel. Den ferdigkjølte gel kan tørkes og eksponeres ovenfor røntgenfilm over et valgt tidsrom for å vise nærvær av IL-17A/F-polypeptidet. Kulturene som inneholder transfekterte celler kan innkuberes videre (i serumfritt medium), og mediet analyseres i utvalgte bioanalyser.
I en alternativ teknikk, kan IL-17A/F innføres transient i 293-celler ved anvendelse av dekstransulfatfremangsmåten som beskrives av Somparyrac et al. Proe. Nati. Acad. Sei, 12:7575 (1981). 293-celler dyrkes til maksimal tetthet i en spinnerflaske og tilsettes 700 ug pRK5-IL-17A/F-DNA. Cellene oppkonsentreres først fra spinnerflasken ved sentrifugering og vaskes med PBS. DNA-dekstranutfellingen innkuberes på de nedsentrifugerte cellene i 4 timer. Cellene behandles med 20% glyserol i 90 sekunder, vaskes med vevdyrkningsmedium og tilbakeføres til spinnerflasken inneholdende vevsdyrkningsmedium, 5 |ig/ml bovint insulin og 0,1 ug/ml bovint transferrin. Etter tilnærmet fire dager sentrifugeres det kondisjonerte medium og filtreres for fjerning av celler og cellerester. Prøven som inneholder det uttrykte IL-17A/F-polypeptid kan så oppkonsentreres og renses ved hvilken som helst valgt fremgangsmåte, for eksempel dialyse og/eller kolonnekromatografi.
I en annen utførelse kan IL-17A/F-polypeptider uttrykkes i CHO-celler. pRK5-IL-17A/F kan transfekteres inn i CHO-celler ved anvendelse av kjente reagenser, for eksempel CaP04eller DEAE-dekstran. Som beskrevet ovenfor kan cellekulturene innkuberes og mediet erstattes med dyrkningsmedium (alene), eller medium inneholdende radioaktiv merking, for eksempel<35>S-metionin. Etter å ha påvist nærvær av IL-17A/F-polypeptidet, kan dyrkningsmediet erstattes med serumfritt medium. Kulturene innkuberes fortrinnsvis i tilnærmet 6 dager, hvoretter det kondisjonerte medium høstes. Mediet som inneholder det uttrykte IL-17A/F-polypeptid kan så oppkonsentreres og renses ved hvilken som helst valgt fremgangsmåte.
Epitopmerket IL-17A/F kan også uttrykkes i CHO-vertsceller. IL-17A/F kan subklones ut av pRK5-vektoren. Innskuddet i subklonen kan behandles med PCR for fusjon med opprettholdt leseramme til en valgt epitopmerkelapp, for eksempel en poly-His-merkelapp, inn i en Baculovirus ekspresjonsvektor. Det poly-His-merkee I1-17A/F-innskudd kan så subklone i en SV40-drevet vektor som inneholder en seleksjonsmarkør, for eksempel DHFR, for seleksjon av stabile kloner. Endelig kan CHO-cellene transfekteres (som beskrevet ovenfor) med den SV40-drevne vektor. Merking kan utføres som beskrevet ovenfor for å bekrefte ekspresjon. Dyrkningsmediet som inneholder det uttrykte, poly-His-merkede IL-17A/F kan så oppkonsentreres og renses ved hvilken som helst valgt fremgangsmåte, for eksempel ved Ni<2+->chelat-affinitetskromatografi. IL-17A/F-polypeptider kan også uttrykkes i CHO-celler og/eller COS-celler ved en fremgangsmåte for transient ekspresjon, eller i CHO-celler ved hjelp av en annen fremgangsmåte for stabil ekspresjon.
Stabil ekspresjon i CHO-celler oppnås ved anvendelse av følgende fremgangsmåter. Proteinene uttrykkes som en IgG-konstruksjon (et immunadhesin), i hvilket de kodende sekvenser for de løselige formene (for eksempel ekstracellulære domener) av de angjeldende proteiner er fusjonert til en IgGl-konstantområde-sekvens som inneholder hengseldomenet, CH2-domenet og CH2-domenet og/eller som en poly-His-merket form.
Etter PCR-amplifisering, subklones de angjeldende DNA i en CHO-ekspresjonsvektor ved anvendelse av standardteknikker som beskrevet i Ausubel et al, Current Protocols of Molecular Bioloty, enhet 3.16, John Wiley and Sons (1997). CHO-ekspresjonsvektorer konstrueres slik at de har kompatible restriksjonsseter 5' og 3' for DNA av interesse, noe som tillater enkel overføring av cDNA. Vektoren som anvendes for ekspresjon i CHO-celler er som beskrevet i Lucas et al, Nucl. Acids Res, 24:9 (1774-1779 (1996), og benyttes i den tidligere promoter/enhancer fra SV40 for å styre ekspresjonen av cDNA av interesse, og dihydrofolatreduktase (DHFR). DHFR-ekspresjon tillater seleksjon for stabil opprettholdelse av plasmidet etter transfeksjon. 12 mikrogram av det ønskede plasmid-DNA innføres i tilnærmet 10 millioner CHO-celler ved anvendelse av det kommersielt tilgjengelige transfeksjonsreagens Superfect (Qiagen), Dosper eller Fugene (Boehringer Mannheim). Cellene dyrkes som beskrevet i Lucas et al, supra. Tilnærmet 3 x IO<7>celler nedryses i en ampulle for videre dyrking og produksjon som beskrevet nedenfor.
Ampullene som inneholder plasmid-DNA opptines ved plassering i et vannbad og sammenblandes ved vorteks-behandling. Innholdet pipetteres over i et sentrifugerør som inneholder 10 ml medium og sentrifugeres ved 1000 rpm i 5 minutter. Supernatanten avsuges og cellene resuspenderes i 10 ml selektivt medium (0,2 Lim-filtrert PS20 med 5% totalt bovint serum diafiltrert gjennom en 0,2 um membran). Cellene overføres så til en 100 ml spinnerflaske inneholdende 50 ml selektivt medium. Etter 1-2 dager overføres cellene til en 250 ml spinnerflaske fylt med 150 ml selektivt dyrkningsmedium og innkuberes ved 37°C. Etter ytterligere 2-3 dager tilsettes 3 x IO<5>celler/ml til spinnerflasker på 250 ml, 500 ml og 2000 ml. Cellemediet utbyttes med frisk medium ved sentrifugering og resuspendering i produksjonsmedium. Selv om hvilket som helst egnet CHO-medium kan benyttes, kan i praksis et produksjonsmedium som beskrives i US patentskrift nr. 5 122 469, tildelt 16. juni, 1992, anvendes. 1,2 x IO<6>celler/ml utsås i en 3 1 produksjonsspinnerflaske. På dag 0 bestemmes celletall, pH osv. På dag 1 tas en prøve ut, og man begynner å gjennomblåse spinnerflasken med filtrert luft. På dag 2 tas en prøve ut, temperaturen endres til 33°C og 30 ml 500 g/l glukose og 0,6 ml 10% anti-skum (for eksempel 35% polydimetylsiloksan emulsjon, Dow Corning 365 emulsjon av medisinsk renhet) tilsettes. Gjennom hele produksjonen justeres pH etter 2 og holdes rundt 7,2. Etter 10 dager, eller når prosentandelen av levende celler har falt til under 70%, høstes cellekulturen ved sentrifugering og filtrering gjennom et 0,22 Lim filter. Filtratet ble enten lagret ved 4°C eller umiddelbart satt på kolonner for rensing.
For de poly-His-merkede konstruksjonene renses proteinene ved anvendelse av en Ni-NTA-kolonne (Qiagen). Før rensingen tilsettes imidazol til det kondisjonerte medium til en konsentrasjon på 5 mM. Det kondisjonerte medium pumpes på en 6 ml Ni-NTA-kolonne ekvilibrert med 20 mM Hepes-buffer, pH 7,4, tilsatt 0,3 M NaCl og 5 mM imidazol ved en elueringshastighet på 4-5 ml/min ved 4°C. Etter påsettingen vaskes kolonnen med mer ekvilibreringsbuffer, og proteinet elueres med ekvilibreringsbuffer tilsatt 0,25 M imidazol. Det høy-rensede protein avsaltes så over i en lagringsbuffer inneholdende 10 mM Hepes, 0,14 M NaCl og 4o mannitol, pH 6,8 ved hjelp av en 25 ml G25 Superfine (Pharmacia)-kolonne, og lagres ved -80°C.
Immunadhesin (Fc-holdige)-konstruksjoner renses fra kondisjonert medium som følger. Det kondisjonerte medium pumpes på en 5 ml Protein A-kolonne (Pharmacia) som på forhånd har blitt ekvilibrert med 20 mM Na-fosfatbuffer, pH 6,8. Etter påsettingen vaskes kolonnen grundig med ekvilibreringsbuffer før eluering med 100 mM sitronsyre, pH 3,5. Det eluerte protein nøytraliseres umiddelbart ved oppsamling av fraksjoner på 1 ml i rør som inneholder 275 pil IM Tris-buffer, pH 9. Det høyrensede protein avsaltes så over i lagringsbuffer som beskrevet ovenfor for de poly-His-merkede proteinene. Homogeniteten vurderes ved hjelp SDS-polyakrylamidgeler og ved N-terminal aminosyresekvensering ved Edman-degradering.
Eksempel 6
Ekspresjon av IL-17A/F i gjær
Den påfølgende fremgangsmåten beskriver rekombinant ekspresjon av IL-17A/F-polypeptider i gjær.
Først konstrueres gjærekspresjonsvektorer for intracellulær produksjon eller sekresjon av IL-17A/F fra ADH2/GAPDH-promoteren. DNA som koder for IL-17A/F-polypeptidet og promoteren innsettes i egnede restriksjonsenzymseter i det valgte plasmid for å styre intracellulær ekspresjon av IL-17A/F-polypeptidet. For sekresjon kan DNA som koder for IL-17A/F klones inn i det valgte peptid sammen med DNA som koder for ADH2/GAPDH-promoteren, et nativt IL-17A/F-signalpeptid eller et annet signalpeptid fra pattedyr, eller for eksempel en sekretorisk signalsekvens/ledersekvens fra alfa-faktor eller invertase fra gjær, og linkersekvenser (om nødvendig) for ekspresjon av IL-17A/F.
Gjærceller, for eksempel gjærstamme AB110, kan så transformeres med ekspresjonsplasmidene beskrevet ovenfor, og dyrkes i et valgt fermenteringsmedium. Supernatanter fra de transformerte gjærcellene kan analyseres ved utfelling med 10% trikloreddiksyre og fraksjonering ved SDS-PAGE, fulgt av farging av gelene med Coomassie Blue.
Rekombinante IL-17A/F-polypeptider kan så isoleres og renses ved å fjerne gjærcellene fira fermenteringsmediet ved sentrifugering og så oppkonsentrering av medium ved anvendelse av valgte patronfiltere. Konsentratet som inneholder IL-17A/F-polypeptidet kan renses videre ved anvendelse av valgte kolonnekromatografi resiner.
Eksempel 7
Ekspresjon av IL-17A/F i Baculovirus-infiserte insektsceller
Den påfølgende fremgangsmåten beskriver rekombinant ekspresjon av IL-17A/F-polypeptider i Baculovirus-infiserte insektsceller.
Sekvensen som koder for IL-17A/F fusjoneres oppstrøms for en epitopmerkelapp som foreligger i en Baculovirus ekspresjonsvektor. Slike epitopmerkelapper omfatter poly-His-merkelapper og immunglobulin merkelapper (for eksempel Fc-områder fra IgG). En rekke forskjellige plasmider kan benyttes, innbefattet plasmider avledet fra kommersielt tilgjengelige plasmider som pVL1393 (Novagen). Kort beskrevet amplifiseres sekvensen som koder for IL-17A/F eller den ønskede del av den kodende sekvens for IL-17A/F, for eksempel sekvensen som koder for det ekstracellulære domenet i et transmembranprotein eller sekvensen som koder for det modne protein dersom proteinet er ekstracellulært, ved PCR med primere som er komplementære det 5' og 3' området. 5'-primeren kan omfatte flankerende (utvalgte) restriksjonsenzymseter. Produktet kuttes så med de valgte restriksjonsenzymer og subklones i ekspresjons-vektoren.
Rekombinant Baculovirus fremstilles ved kotransfeksjon av plasmidet beskrevet ovenfor og BaculoGold-virus-DNA (Pharmingen) i Spodoptera frugiperda ("Sf9")-celler (ATCC CRL 1711) ved anvendelse av lipofektin (kommersielt tilgjengelig fra GIBCO-BRL). Etter 4-5 dagers innkubering ved 28°C, høstes de frigjorte virus og anvendes for ytterligere amplifisering. Virusinfeksjon og proteinekspresjon utføres som beskrevet av 0'Reilley et al, Baculovirus expression vectors: A Laboratory Manual, Oxford: Oxford University Press (1994).
Uttrykt poly-His-merket IL-17A/F kan så renses, for eksempel ved Ni20+-chelat-affinitetskromatografi som følger. Ekstrakter fremstilles fra Sf9-celler infisert med rekombinant virus som beskrevet av Rupert et al. Nature, 362:175-179 (1993). Kort beskrevet vaskes Sf9-celler, resuspenderes i ultralyd behandlingsbuffer (25 ml Hepes, pH 7,9, 12,5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 10% glyserol, 0,1% NP-40, 0,4 M KC1), og ultralydbehandles to ganger, hver gang i 20 sekunder på is. De ultralydbehandlede prøvene fjernes ved sentrifugering, og supernatanten fortynnes 50 ganger med påsettingsbuffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10% glyserol, pH 7,8) og filtreres gjennom et 0,45 u.M filter. En Ni -NTA-agarosekolonne (kommersielt tilgjengelig fra Qiagen) klargjøres med et kolonnevolum på 5 ml, vaskes med 25 ml vann og ekvilibreres med 25 ml påsettingsbuffer. Det filtrerte celleekstrakt settes på kolonnen ved en elueringshastighet på 0,5 ml/min. Kolonnen vaskes med påsettingsbuffer til A280 når basalnivået, hvoretter oppsamlingen av fraksjoner starter. Kolonnen vaskes så med en sekundær vaskebuffer (50 mM fosfat, 300 mM NaCl, 10% glyserol, pH 6,0) som eluerer uspesifikt bundet protein. Etter at A280 igjen når basalnivået, fremkalles kolonnen med en imidazolgradient fra 0-500 mM i den sekundære vaskebuffer. Fraksjoner på 1 ml oppsamles og analyseres ved SDS-PAGE og sølvfarging eller Western-blotting med Ni<2+->NTA-konjugert til alkalisk fosfatase (Qiagen). Fraksjoner som inneholder det eluerte, His-10-merkede IL-17A/F slås sammen og dialyseres mot påsettingsbuffer.
Alternativt kan rensingen av IgG-merket (eller Fc-merket) IL-17A/F utføres ved anvendelse av kjente kromatografiteknikker, innbefattet for eksempel Protein A- eller Protein G-kolonnekromatografi.
Eksempel 8
Fremstilling av antistoffer som binder IL-17A/F
Dette eksempelet illustrerer fremstillingen av monoklonale antistoffer som spesifikt kan binde IL-17A/F.
Teknikker for fremstilling av monoklonale antistoffer er kjente innen faget og beskrives for eksempel i Goding, supra. Immunogener som kan benyttes omfatter rensede IL-17A/F-polypeptider, fusjonsproteiner som inneholder IL-17A/F-polypeptider og celler som uttrykker rekombinante IL-17A/F-polypeptider på celleoverflaten. Den erfarne fagperson kan velge immunogen uten omfattende eksperimentering.
Mus, for eksempel BALB/c-mus, immuniseres med IL-17A/F-immunogenet emulgert i komplett Freunds adjuvans og injisert subkutant eller intraperitonealt i en mengde på fra 1 til 100 mikrogram. Alternativt emulgeres immunogenet i MPL-TDM-adjuvans (Ribi Immunochemical Research, Hamilton, MT) og injiseres i dyrets bakre fotputer. De immuniserte musene gis så forsterkerinjeksjoner 10-12 dager senere med mer immunogen emulgert i den valgte adjuvans. Deretter kan dyrene i flere uker gis forsterkerinjeksjoner med ytterligere immuniseringsinjeksjoner. Serumprøver kan regelmessig erholdes fra dyrene ved retroorbital tapping for analyse i ELISA-analyser for påvisning av anti-IL-17A/F-antistoffer.
Etter at et egnet antistofftiter har blitt påvist, kan dyr som er "positive" for antistoff injiseres med en endelig, intravenøs injeksjon av IL-17A/F. Tre til fire dager senere avlives musene og miltcellene høstes. Miltcellene fusjoneres så (ved anvendelse av 35% polyetylenglykolø) til en valgt musemyelomcellelinje, for eksempel P2X63AgU.l, som er tilgjengelig fra ATCC med aksesjonsbetegnelsen CRL 1597. Fusjonene fører til dannelse av hybridomceller, som så kan utsås i 96-brønners vevs-dyrkningsplater inneholdende HAT (hypoxantin, aminopterin og tymidin)-medium for inhibering av proliferasjonen av ikke-fusjonerte celler, myelomhybrider og miltcelle-hybrider.
Hybridomcellene vil analyseres i en ELISA for reaktivitet mot IL-17A/F. Påvisning av "positive" hybridomceller som utskiller de ønskede monoklonale antistoffene mot IL-17A/F ligger innen teknikkens stand.
De positive hybridomcellene kan injiseres intraperitonealt i syngeneiske BALB/c-mus for dannelse av ascites som inneholder de monoklonale anti-IL-17A/F- antistoffene. Alternativt kan hybridomcellene dyrkes i vevsdyrkningsflaser eller rulleflasker. Rensingen av de monoklonale antistoffene som dannes i ascitesvæsken kan oppnås ved anvendelse av ammoniumsulfatutfelling fulgt av geleksklusjonskromatografi. Alternativt kan affinitetskromatografi basert på binding av antistoff til protein A eller protein G benyttes.
Eksempel 9
Rensing av IL-17A/F-polypeptider ved anvendelse av spesifikke antistoffer
Native eller rekombinante IL-17A/F-polypeptider kan renses ved hjelp av en rekke standardteknikker innen faget for proteinrensing. For eksempel renses pro-IL-17A/F-polypeptid, modent IL-17A/F-polypeptid eller pre-IL-17A/F-polypeptid ved immunaffinitetskromatografi ved anvendelse av antistoffer som er spesifikke for IL-17A/F-polypeptidet av interesse. Generelt konstrueres en immunaffmitetskolonne ved kovalent kobling av anti-IL-17A/F-polypeptidantistoffet til et aktivert kromatografiresin.
Polyklonale immunglobuliner fremstilles fra immunserum, enten ved utfelling med ammoniumsulfat eller ved rensing på immobilisert protein A (Pharmacia LKB Biotechnology, Piscataway, N.J.). Likeså fremstilles monoklonale antistoffer fra muse-ascitesvæske ved ammoniumsulfatutfelling eller kromatografi på immobilisert protein A. Delvis renset immunglobulin kobles kovalent til et kromtografiresin, for eksempel CnBr-aktivert SEPHAROSE (Pharmacia LKB Biotechnology). Antistoffet kobles til resinet, resinet blokkeres og resinderivatet vaskes ifølge produsentens instruksjoner.
En slik immunaffmitetskolonne benyttes for rensing av IL-17 A/F-polypeptid ved å fremstille en fraksjon fra celler som inneholder IL-17A/F-polypeptid i løselig form. Dette preparatet erholdes ved solubilisering av hele celler eller en subcellulær fraksjon erholdt ved differensiell sentrifugering ved tilsetning av detergent eller ved andre fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Alternativt kan løselig IL-17A/F-polypeptid som inneholder en signalsekvens utskilles i anvendbare mengder til mediet som cellene dyrkes i.
Et preparat som inneholder løselig IL-17A/F-polypeptid sendes gjennom immun-affinitetskolonnen, og kolonnen vaskes under betingelser som tillater preferensiell absorpsjon av IL-17A/F-polypeptid (for eksempel buffere med høy ionestyrke i nærvær av detergent). Kolonnen elueres så under betingelser som bryter bindingen mellom antistoff og IL-17A/F-polypeptid (for eksempel en buffer med lav pH, tilnærmet pH 2-3, eller en høy konsentrasjon av et kaotropt middel, for eksempel urea eller tiocyanation) og IL-17A/F-polypeptid oppsamles.
Eksempel 10
Søk etter medikamenter
Foreliggende oppfinnelse er spesielt anvendbar for søk etter forbindelser ved anvendelse av IL-17A/F-polypeptider eller bindende fragmenter derav i en rekke forskjellige teknikker for søk etter medikamenter. IL-17A/F-polypeptidet eller fragmentet som benyttes i en slik analyse kan enten foreligge fritt i løsning, være festet til et fast støttemiddel, foreligge på en celleoverflate eller være lokalisert intracellulært. En fremgangsmåte for søk etter medikamenter benytter eukaryote eller prokaryote vertsceller som er stabilt transformert med rekombinante nukleinsyrer som uttrykker IL-17A/F-polypeptidet, eller -fragmentet. Medikamenter analyseres mot slike transformerte celler i kompetitive bindingsanalyser. Slike celler, enten i levende eller fiksert form, kan benyttes for standard bindingsanalyser. Man kan for eksempel måle dannelsen av komplekser mellom IL-17A/F-polypeptid eller et fragment derav, og middelet som skal analyseres. Alternativt kan man undersøke den reduksjon av kompleksdannelsen mellom IL-17A/F-polypeptidet og målcellen, eller målreseptorene som skyldes middelet som analyseres.
Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer således fremgangsmåter for søk etter medikamenter eller andre midler som kan påvirke en IL-17A/F-polypeptidassosiert sykdom eller forstyrrelse. Disse fremgangsmåtene omfatter å sette et slikt middel i forbindelse med et IL-17A/F-polypeptid, eller et fragment derav, og analysere (i) nærvær av et kompleks mellom middelet og IL-17A/F-polypeptidet eller -fragmentet, eller (ii) nærvær av et kompleks mellom IL-17A/F-polypeptidet eller -fragmentet og cellen ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. I slike kompetitive bindingsanalyser er IL-17A/F-polypeptidet eller -fragmentet typisk merket. Etter en egnet innkubering separeres fritt IL-17A/F-polypeptid eller-fragment fra polypeptidet eller fragmentet i bundet form, og mengden av fri eller ikke-kompleksbundet merking er et mål på middelets evne til å bindes til IL-17A/F-polypeptidet eller å interferere med IL-17A/F-polypeptid/cellekomplekset.
En annen teknikk for søk etter medikamenter tilveiebringer søk med høy kapasitet etter forbindelser med en egnet bindingsaffinitet for et polypeptid, og beskrives i detalj i WO 84/03564, offentliggjort 13. september, 1984. Kort beskrevet syntetiseres et stort antall forskjellige, små peptidanalyseforbindelser på et fast støttemiddel, for eksempel plastpinner eller en annen overflate. Når det gjelder et IL-17A/F-polypeptid, får peptidforbindelsene reagere med IL-17A/F-polypeptid og vaskes. Bundet IL-17A/F-polypeptid påvises ved hjelp av fremgangsmåter som er velkjente innen faget. Renset IL-17 A/F-polypeptid kan også benyttes direkte for belegging av plater for anvendelse i de ovenfor nevnte teknikker for medikamentsøk. I tillegg kan ikke-nøytraliserende antistoffer anvendes for innfanging av peptidet og immobilisering av det til det faste støttemiddel.
Foreliggende oppfinnelse omfatter også anvendelse av kompetitive analyser for medikamentsøk i hvilke nøytraliserende antistoffer som kan binde IL-17A/F-polypeptid konkurrerer spesifikt med en analyseforbindelse om binding til IL-17A/F-polypeptid eller fragmenter derav. På denne måten kan antistoffene anvendes for å påvise nærvær av et peptid som har en eller flere antigene determinanter felles med IL-17A/F-polypeptid.
Eksempel 11
Rasjonell medikamentutforming
Målet med rasjonell medikamentutforming er å fremstille strukturanaloger av et biologisk aktivt polypeptid av interesse (dvs. et IL-17 A/F -polypeptid) eller av små molekyler som disse interagerer med, for eksempel agonister, antagonister eller inhibitorer. Alle disse eksemplene kan anvendes for utforming av medikamenter somer mer aktive eller stabile former av IL-17A/F-polypeptidet, eller som forsterker eller interfererer med funksjonen av IL-17A/F-polypeptidet in vivo (se Hodgson, Bio/Technology, 9:19-21 (1991)).
I en tilnærming bestemmes den tre-dimensjonale struktur av IL-17A/F-polypeptidet eller et IL-17A/F-polypeptid-inhibitorkompleks ved røntgen krystallografi, ved datamaskinassistert modellering eller, mest typisk, ved en kombinasjon av disse til tilnærmingene. Både form og ladning av IL-17A/F-polypeptidet må fastslås for å utlede strukturen og bestemme molekylets aktive sete eller seter. Mindre ofte kan anvendbar informasjon vedrøre strukturen av IL-17A/F-polypeptidet erholdes ved modellering basert på strukturen til homologe proteiner. I begge tilfeller anvendes relevant struktur informasjon for utforming av analoge IL-17A/F-polypeptilignende molekyler, eller for å påvise effektive inhibitorer. Anvendbare eksempler på rasjonell medikamentutforming kan omfatte molekyler som har forbedret aktivitet eller stabilitet, som vist av Baxton og Wells, Biochemistry, 31:7796-7801 (1992), eller som virker som inhibitorer, agonister eller antagonister av native peptider, som vist av Athauda et al, J. Biochem, 113:742-746(1993).
Det er også mulig å isolere et mål-spesifikt antistoff, utvalgt ved en funksjonell analyse som beskrevet ovenfor, og så løse krystallstrukturen. Denne tilnærming gir i prinsippet en farmakjerne som påfølgende medikamentforming kan bygge på. Det er mulig å fullstendig unngå proteinkrystallografi ved å fremstille anti-idiotypiske antistoffer (anti-id) mot et funksjonelt, farmakologisk aktivt antistoff. Som et speilbilde av et speilbilde, vil bindingssetet i anti-id-molekylet forventes å være en analog av den opprinnelige reseptor. Anti-id-molekylet kan så anvendes for påvisning og isolering av peptider fra biblioteker av kjemisk eller biologisk fremstilte peptider. De isolerte peptidene vil så fungere som farmakjerner.
Ved hjelp av den foreliggende oppfinnelse kan man fremstille mengder av IL-17A/F-polypeptider som er tilstrekkelige for utførelse av analytiske undersøkelser, for eksempel røntgen krystallografi. I tillegg vil kjennskapet til IL-17 A/F-polypeptid aminosyresekvensen som tilveiebringes heri gi retningslinjer for dem som benytter datamaskinassiserte modelleringsteknikker i stedet for, eller i tillegg til røntgenkry stallografi.
Eksempel 12
In v/vø-sykdomsmodeller
Virkningene av å kombinere anti-IL-17A- og IL-17F-antistoffer som terapeutisk behandling av autoimmune sykdommer ble anslått i musemodeller for reumatoid artritt og multippel sklerose. De analyserte musemodellene omfatter mus behandlet med kollagen type II for induksjon av kollagenindusert artritt (CIA) (en musemodell for reumatoid artritt (RA)) eller behandlet med myelin oligodendrocytt glykoprotein (MOG) for induksjon av eksperimen tell allergisk encefalomyelitt (EAE) (en musemodell for multippel sklerose (MS)).
(1) CIA
7-8 uker gamle DBA-IJ-mus (Jackson Lab, Bar Harbor, Maine) ble immunisert med 100 ug bovint kollagen type II i 100 ul komplett Freunds adjuvans (CFA) på dag 0.
(Barck et al, Arthritis & Rheumatism, 50:3377-3386 (2004)). Kollagen type II i CFA ble injisert intradermalt (i.d.) ved haleroten på høyre side. På dag 21 ble 100 ug bovint kollagen type II i 100 ul ukomplett Freunds adjuvans injisert intradermalt på venstre side av halen. På dag 45 ble dyrene fordelt på følgende grupper: (1) muse-IgG2a-isotype kontroll-mAb (MuIgG2a), 6 mg/kg i 100 |il saltvann subkutant (SC) 3 ganger i uken i 7 uker (n = 40), (2) muse-TNFRII-Fc (musesurrogat for Enbrel) (MuTNFII-Fc), 4 mg/kg i 100 (il saltvann + metotreksat (MTX), 3 mg/kg i 100 ul saltvann (SC) 2 ganger i uken i 7 uker (n = 40), og (3) monoklonalt hamster-musekimert anti-IL- 17A (MuAnti-IL-17)-antistoff og hamster-musekimert anti-IL-17F (MuAnti-IL-17F)-antistoff (mAb), 6 mg/kg i 100 ul saltvann SC tre ganger i uken i 7 uker (n = 40).
Dyrene ble undersøkt 2 ganger i uken med start på dag 33 ved anvendelse av en standardfremgangsmåte for utbedring av artritt. Poengene var 0-4 per pote (hvor 0 betyr ingen sykdom og 4 står for erytem og ødem som omfatter hele poten) med en maksimal poengsum på 16 poeng per dyr. Dyrene i behandlingsgruppene 1-3 ble tilfeldig fordelt basert på kroppsvekt og sykdomspoeng på dag 45. De tre behandlingsgruppene ble balansert til å inneholde det samme antall av mus med mild (gjennomsnittlig poengsum 0-3, 22-23 mus per behandlingsgruppe), moderat (gjennomsnittlig poengsum 4-8, 11-13 mus per behandlingsgruppe) gjelder alvorlig sykdom (gjennomsnittlig poengsum 9 eller høyere, 4-6 mus per behandlingsgruppe). Mikro-computertomografi (MikroCT) (Barck et al, Arthritis & Rheumatism, 50: 3377-3386 (2004))-bilder av ledd ble tatt ved undersøkelsens avslutning på dag 81, og leddets kortikalbein volum (JCBV) ble beregnet.
I DBA-IJ-musene som var behandlet med kollagen type II for induksjon av kollagenindusert artritt (CIA), førte kombinasjonen av anti-IL-17A- og anti-IL-17F-antistoff (Gruppe 3) til en redusert terminal klinisk poengsum på dag 81 sammenlignet med den terminale, kliniske poengsum på dag 81 for mus behandlet med kontroll-IgG2 alene (Gruppe 1) (p = 0,02 (Dunnetfs test, Hsu, J.C, Multiple Comparisons Theory and Methods, Champman og Hall (1996)). I DBA-IJ-musene som var behandlet med kollagen II for induksjon av kollagenindusert artritt (CIA), førte behandlingen med kombinasjonen av anti-IL-17A- og anti-IL-17F-antistoff til en beskyttelse av musene mot beinskade, målt ved et større kortikalbeinvolum i leddet (JCBV), -4,5 for den anti-IL-17A- og IL-17F-behandlede gruppe, sammenlignet med JCBV på -3,7 for mus behandlet med muse-IgG2a-isotypekontroll-mAb (p < 0,001, Dunnetts test).
Evnen til kombinasjonen av IL-17A- og IL-17F-antistoff til å redusere de terminale, kliniske sykdomspoeng i mus med CIA og til å blokkere beinskade i mus med CIA, tyder på at kombinasjonen av IL-17A og IL-17F kan utgjøre et mål for behandling av autoimmune sykdommer, for eksempel reumatoid artritt.
I et lignende eksperiment ble behandling med anti-IL-17A-antistoffer alene addert til undersøkelsen, slik at det ble dannet en fjerde gruppe. Resultatene vises i Figur 19 og 20. Kontrollen var et isotypetilpasset anti-humant landøyda-IgG2a-antistoff (Genentech, Inc.), betegnet "landøyda" i figurene. Kliniske poeng for hver pote ble bestemt ved anvendelse av følgende kriterier:
0 = ingen tegn på erytem og oppsvelling
1 = erytem og mild oppsvelling begrenset til den midtre del av foten (tarsis) eller ankelen
2 = erytem og mild oppsvelling som strekker seg fra ankelen til den midtre del av foten
3 = erytem og moderat oppsvelling som strekker seg fra ankelen til metartarsis leddene
4 = erytem og alvorlig oppsvelling som omfatter ankelen, foten og tærne Gjennomsnittlig poengsum = summen av poeng for de fire potene
Gjennomsnittlig daglig klinisk poengsum = gjennomsnittet av den daglige gjennomsnittlige poengsum
Terminal klinisk poengsum = gjennomsnittlig poengsum på undersøkelsens siste dag
Resultatene viser at kombinasjonen av anti-IL-17A- og anti-IL-17F-antistoff er mer effektiv på en statistisk signifikant måte enn behandling med anti-IL-17A alene.
(2) EAE
Fire grupper av mus med 15 mus per gruppe ble indusert med myelinoligodendrocytt glykoprotein (MOG) som beskrevet nedenfor, og gruppene ble i tillegg tilført følgende antistoffdoser tre ganger per uke etter induksjon med MOG35-55-peptidantigen i CFA: (1) (Gruppe 1) muse-IgG2a-isotypekontroll-mAb (anti-GP120-antistoff), 6 mg/kg i 100 (il saltvann ved intraperitoneal injeksjon (IP), (2) (Gruppe 2) hamster-musekimert anti-IL-17A (MuAnti-IL-17)-mAb, 6 mg/kg i 100 ul saltvann IP, (3) (Gruppe 3) hamster- musekimert anti-IL-17F (MuAnti-IL-17F)-mAb, 6 mg/kg i 100 ul saltvann IP og (4)
(Gruppe 4) hamster-musekimert anti-IL-17A (MuAnti-IL-17)-mAb, 6 mg/kg i 100 p.1 saltvann IP, og hamster-musekimert anti-IL-17F (MuAnti-IL-17F)-mAb, 6 mg/kg i 100 ul saltvann IP.
En dag før induksjonen med MOG (Dag minus 1) ble antistoffdosene som er beskrevet ovenfor tilført som en første dose. På dagen for induksjon med MOG (Dag 0) ble musene immunisert intradermalt med 200 ul emulsjon inneholdende 200 ug MOG35-55-peptid (Liu et al. Nat. Med, 4(1): 78-83 (1998), Suen et al, J. Exp. Med, 186(8): 1233-40 (1997)) i 100 ul PBS og 100 ul CF A, fremstilt ved å blande ukomplett Freunds adjuvans (IFA) med M. tuberculosis H37A (død og inntørket) til 2 mg/ml M. tuberculosis i CFA (200 ug M. tuberculosis per mus). Musene ble videre injisert med 200 ng Pertussis-toksin i 100 ul PBS IP.
På dag 2 ble musene videre injisert med 200 mg Pertussistoksin i 100 ul PBX IP.
For resten av undersøkelsen ble musene tilført antistoffdosene beskrevet ovenfor tre ganger i uken.
Musene ble evaluert for klinisk sykdom ved anvendelse av fremgangsmåten for poengsetting av multippel sklerose (beskrevet nedenfor) minst tre ganger i uken med start på Dag 1. Videre ble dyr som hadde nådd en sykdomsgrad på 4 evaluert daglig (dersom dyr med grad 4 ikke remitterte til grad 3 eller lavere i løpet av 5 dager, ble dyrene avlivet). Videre ble lymfocytter i ryggmarg og hjerne evaluert ved undersøkelsens avslutning. Fremgangsmåten for poengsetting av multippel sklerose ble evaluert ved anvendelse av følgende graderingssystem: (1) grad 0 representerer normale mus med ingen åpenbare sykdomstegn, (2) grad 1 representerer slapp hale (slapp hale er beskrevet som fullstendig slapphet av halen og manglende oppkrølling av halespissen når musen løftes opp) eller svakhet i bakbena (svakhet i bakbena er beskrevet som vaggende gange, hvor det objektive tegn er at ved gange faller musens bakben gjennom metalltrådtoppen av burene), men ikke begge deler, (3) grad 2 representerer slapp hale og svakhet i bakbena, (4) grad 3 representerer en delvis paralyse av bakbena (en delvis paralyse av bakbena er beskrevet som når musene er ute av stand til å anvende bakbena for å bevare bakdelens stilling eller å gå, men fortsatt kan bevege et av bakbena eller begge bakben i en viss grad), (5) grad 4 representerer fullstendig paralyse av bakbena (fullstendig paralyse av bakbena er beskrevet som et fullstendig tap av bevegelse i bakbena, slik at musen kun trekker seg fremover ved hjelp av forbena) og (6) grad 5 representerer dødende tilstand og død ved EAE (avlivet av humane grunner).
I mus med myelinoligodendrocytt glykoprotein (MOG)-indusert eksperimentell allergisk encefalomyelitt (EAE), førte kombinasjonen av anti-IL-17A- og anti-IL- 17F-antistoff (Gruppe 4) til reduserte, terminale, kliniske poengsummer på dag 34, sammenlignet med de terminale, kliniske poengsummer på dag 34 for mus behandlet med gpl20 (Gruppe 1) (p < 0,01 (Dunnets test). Verken anti-IL- 17A (Gruppe 2) eller anti-IL- 17F (Gruppe 3) alene var like effektivt når det gjelder reduksjon av klinisk poengsum som anti-IL-17A og anti-IL- 17F i kombinasjon. Resultatene fra MOA- og CIA-modellene tyder på at behandling av autoimmune sykdommer som reumatoid artritt (RA) og multippel sklerose (MS) kan kreve blokkering av både IL-17A- og IL-17F-signalveien i kombinasjon.
Evnen til kombinasjonen av IL-17A- og IL-17F-antistoff til å redusere terminale, kliniske sykdomspoeng i mus med MOG-indusert EAE tyder på at kombinasjonen av IL-17A og IL-17F kan utgjøre et mål for behandling av autoimmune sykdommer, for eksempel multippel sklerose. Kombinasjonsbehandling rettet mot IL-17A og IL-17F kan omfatte antistoffer med dobbel spesifisitet/kryssreagerende antistoffer (antistoffer som gjenkjenner identiske epitoper eller epitoper som ligner hverandre i IL-17A og IL-17F, basert på sekvenshomologi eller strukturhomologi, som beskrevet i Eksempel 15), bispesifikke antistoffer (antistoffer som har blitt modifisert til å gjenkjenne både IL-17A og IL-17F, for eksempel en arm fra antistoffet som gjenkjenner IL-17A, hvor den andre armen i det samme antistoff gjenkjenner IL-17F, eller tungkj eden fra antistoffet som gjenkjenner IL-17A kombinert med lettkjeden fra antistoffet som gjenkjenner IL-17F) og IL-17A- og IL-17F-antistoffer tilført i kombinasjon (to antistoffer, hvorav ett gjenkjenner
IL-17A og et gjenkjenner IL-17F).
Eksempel 13
In v/Yrø-T-celleaktivering
T-hjelpercellelinjen Th1L.|7som er forskjellig fra Thl og Th2 (se US patentsøknad nr. 10/697 599, US 2004/0156849, innlevert 29. oktober, 2003) og som danner IL-17, stimuleres av IL-23 (Hunter et al, Nat. Rev. Immunol, 5:521-531 (2005), Holscher et al, Curr. Opin. Invest. Drugs, 6: 489-495 (2005)) så vel som andre cytokiner, for eksempel IL-6 og TNFp (Veldhoen M et al, Immunity, 24:179-89 (2006)). For å bestemme produksjonsnivået av IL-17A og IL-17F i Th1L.i7-celler, ble T-celler aktivert med IL6 og TGFP og nivået av IL-17A og IL-17F kvantifisert ved PCR-analyse. Resultater som er i ferd med å fremkomme når det gjelder ThiL.i7-celler, tyder på at denne undergruppen av T-celler kan indusere vevsbetennelse og autoimmunitet, og følgelig spiller en viktig rolle i autoimmun sykdom (Bettelli et al, Nat. Immunol, 8:345-350
(2007)).
FACS-rensede, naive CD4+CD62L+CD25-CD44hi-T-celler (> 99% renhet) (en populasjon av naive CD4+-T-celler) ble innkubert i 48 timer i en plate belagt med aCD3 (anti-CD3-antistoff). Cytokiner (innbefattet IL-6, IL-27 og TGFP) og aCD28 (anti-CD28-antistoff) ble tilsatt i løsning som følger de påfølgende gruppene: (1) ingen cytokiner, (2) IL-6, (3) IL-27, (4) IL-6 0 IL-27, (5) IL-6 0 TGFp eller (6) IL-6 0 TGFp + IL-27. Ekspresjonen av IL-23R, IL-17A og IL-17F ble bestemt ved kvantitativ PCR-analyse og normalisert relativt til rpl 19 (hva er rpl 19?). Antall gangers induksjon ble beregnet ved å normalisere ekspresjonen relativt til ekspresjonen målt i FACS-rensede celler før stimulering.
In vz>ø-T-celleaktivering ved hjelp av IL-6 og TGFp førte til forhøyet produksjon av IL-17A (-18 000 gangers induksjon) og IL-17F (-300 000 gangers induksjon) (Gruppe 5), sammenlignet med aktivering uten behandling (Gruppe 1), IL-6 alene (Gruppe 2), IL-27 alene (Gruppe 3), IL-6 + IL-27 (Gruppe 4) og IL-6 + TGFp + IL-27 (Gruppe 6) (Figur 13).
Resultatene som viser at IL-6 og TGFp induserer dannelse av både IL-17A og IL-17F i kombinasjon med in v/vo-resultatene fra Eksempel 12 tyder på at en effektiv behandling av autoimmune sykdommer, for eksempel reumatoid artritt og multippel sklerose, ved å blokkere funksjonen av ThiL-n-celler kan omfatte inhibering av både IL-17A og IL-17F. Kombinasjonsbehandling rettet mot IL-17A og IL-17F kan omfatte antistoffer med dobbel spesifisitet/kryssreagenrede antistoffer (antistoffer som gjenkjenner identiske epitoper eller epitoper som ligner hverandre og som foreligger i både IL-17A og IL-17F, basert på sekvenshomologi eller strukturhomologi, som beskrevet i Eksempel 15), bispesifikke antistoffer (antistoffer som har blitt modifisert til å gjenkjenne både IL-17A og IL-17F, for eksempel en arm fra antistoffet som gjenkjenner IL-17A, hvor den andre armen i samme antistoff gjenkjenner IL-17F, eller tungkjeden fra antistoffet som gjenkjenner IL-17A kombinert med lettkjeden fra antistoffet som gjenkjenner IL-17F) og IL-17A- og IL-17F-antistoff tilført i kombinasjon (to antistoffer hvorav et gjenkjenner IL-17A og et gjenkjenner IL-17F).
Eksempel 14
Påvisning av reseptor/ligandinteraksjoner - en oversikt over en analyse av PRO-polypeptider for påvisning av reseptor/ligandinteraksjoner
I denne analysen analyseres forskjellige PRO-polypeptider for evne til å binde til et sett av mulige reseptor- eller ligandmolekyler med det formål å påvise reseptor/ligandinteraksjoner. Påvisningen av en ligand for gjenkjent reseptor, en reseptor for en kjent ligand eller et nytt reseptor/ligandpar er nyttig for en rekke forskjellige indikasjoner, innbefattet for eksempel styring av bioaktive molekyler (koblet til liganden eller reseptoren) til en celle som vites å uttrykke reseptoren eller liganden, anvendelse av reseptoren eller liganden som et reagens for påvisning av nærvær av liganden eller reseptoren i en sammensetning som mistenkes å inneholde denne, hvori sammensetningen kan omfatte celler som mistenkes å uttrykke liganden eller reseptoren, modulering av veksten eller en annen biologisk eller immunologisk aktivitet til en celle som vites å uttrykke eller responderer på reseptoren eller liganden, moduleringen av immunresponsen til eller mot celler som uttrykker reseptoren eller liganden, for å muliggjøre fremstilling av agonister, antagonister og/eller antistoffer rettet mot reseptoren eller liganden som vil modulere veksten eller en biologisk eller immunologisk aktivitet til en celle som uttrykker reseptoren eller liganden, og forskjellige andre indikasjoner som vil være åpenbare for gjennomsnitts fagpersonen.
Generelt utføres analysen som følger. Et PRO-polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse som mistenkes å være en ligand for en reseptor, uttrykkes som et fusjonsprotein som inneholder Fc-domenet fra humant IgG (et immunadhesin). Reseptor-ligandbinding påvises ved å la immunadhesinpolypeptidet interagere med celler (for eksempel Cos-celler) som uttrykker kandidater for PRO-polypeptidreseptorer og synliggjører bundet immunadhesin ved hjelp av fluorescerende reagenser rettet mot Fc-fusjonsdomenet og mikroskopisk undersøkelse. Celler som uttrykker kandidatreseptorer fremstilles ved transient transfeksjon i parallell av definerte undergrupper av et bibliotek av cDNA-ekspresjonsvektorer som koder for PRO-polypeptider som kan fungere som reseptormolekyler. Cellene innkuberes så i en time i nærvær av PRO-polypeptid-immunadhesinet som skal analyseres for mulig reseptorbinding. Cellene vaskes så og fikseres med paraformaldehyd. Cellene innkuberes så med fluorescenskonjugert antistoff rettet mot Fc-delen av PRO-polypeptidimmunadhesinet (for eksempel FITC-konjugert anti-humant Fc-antistoff fra geit). Cellene vaskes så igjen og undersøkes mikroskopisk. En positiv interaksjon bestemmes ved nærvær av fluorescensmerking på celler som er transfektert med cDNA som koder for en gitt PRO-polypeptidreseptor eller en blanding av reseptorer og fravær av tilsvarende fluorescensmerking av celler fremstilt på tilsvarende måte som er transfektert med et annet cDNA eller en blanding av cDNA. Dersom en definert blanding av cDNA-ekspresjonsvektorer vurderes å være positiv for interaksjon med et PRO-polypeptidimmunadhesin, analyseres de enkelte cDNA-molekyler som utgjør blandingen hver for seg (blandingen "nedbrytes") for å identifisere det spesifikke cDNA som koder for en reseptor som kan interagere med PRO-polypeptidimmunadhesinet.
I en annen utførelse av denne analysen får et epitopmerket PRO-polypeptid som er en mulig ligand (for eksempel med 8-histidin ("His")-merkelapper) interagere med et sett av mulige reseptor-PRO-polypeptidmolekyler som uttrykkes som fusjoner med Fc-domenet fra humant IgG (immunadhesiner). Etter innkubering i 1 time med det epitopmerkede PRO-polypeptid, immunutfelles reseptorkandidatene med protein A-kuler, og kulene vaskes. En mulig ligandinteraksjon påvises ved hjelp av Western-blott analyse av de immunutfelte kompleksene med antistoffer rettet mot epitopmerkelappen. En interaksjon anses å ha skjedd dersom et bånd med den forventede molekylvekt for det epitopmerkede protein observeres ved Wester-blott analyse med en reseptorkandidat, men ikke observeres med de andre medlemmene av settet av mulige reseptorer.
Ved anvendelse av analysene beskrevet ovenfor, har følgende reseptor/ligand-interaksjoner blitt påvist heri: (1) PRO 1031 (heri betegnet human IL-17B-ligand) bindes til PRO5801 (heri betegnet human IL-17RH1-reseptor). (2) PRO 10272 (heri betegnet human IL-17E-ligand) bindes til PR05 801 (heri betegnet human IL-17RH1-reseptor). (3) PRO20110 (heri betegnet human IL-17F-ligand) bindes til den humane IL-17-reseptor (IL-17R) ((Yao et al, Cytokine, 9(11):794-800 (1997), også heri betegnet PROl) og til PRO20040 (heri betegnet human IL-17RH2-reseptor). (4) PRO 1031 (IL-17B-ligand) og PROl 122 (IL-17C-ligand) bindes ikke til den humane IL-17-reseptor (Li et al. Proe. Nati. Acad. Sei. (USA), 97(2):776-778 (2000)).
Eksempel 15
IL-17F-reseptorbinding, bestemmelse av strukturen til IL-17F
A. Fremgangsmåter
(1) Måling av bindinger
Kinetikken og affiniteten for binding av IL-17, IL-17E (PRO 10272) eller IL-17F (PRO20110) til IL-17R eller IL-17RH1 (PRO5801) ble bestemt ved SPR-måling i et Pharmacia BIAcore 1000-instrument (Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ). IL-17-ligand eller -reseptor ble immobilisert til en gjennomstrømningscelle i en CM5-sensor-brikke ved tilfeldig kobling til aminogrupper, N-hydroksysuksinimidkjemi, ved anvendelse av en fremgangsmåte som er utviklet av produsenten. Et immobiliseringsnivå på tilnærmet 500 resonansenheter (RU) ble erholdt for IL-17R, IL-17RHI1 og IL-17F, mens immobiliseringsnivået for IL-17 og IL-17E var 1200, henholdsvis 1500 RU. Et kraftig signal ble erholdt for binding av IL-17R til immobilisert IL-17. Dersom IL-17R var immobilisert, ble imidlertid kun et svakt signal erholdt for binding av IL-17, noe som tyder på at immobilisering av reseptoren inaktiverer bindingssetet. Etter blokkering av ikke-reagerte seter med etanolamin, ble bindingsmålinger utført ved anvendelse av en gjennomstrømmingshastighet på 25 ul/min. Sensorgrammer ble erholdt for en serie av 6 to ganger seriefortynnede proteinløsninger. Den høyeste, anvendte konsentrasjon var 1000 eller 500 nM protein, og løsningene ble fremstilt i analysebuffer, PBS tilsatt 0,05% Tween-20. Sensorbrikkens overflate ble regenerert mellom bindingssyklusene ved injeksjon av 25 ul 0,1 M eddiksyre, 0,2 M NaCl, pH 3 for eluering av ikke-kovalent bundet protein. Sensorgrammene ble evaluert ifølge en 1:1 bindingsmodell ved ikke-lineær regresjonsanalyse og anvendelse av programvare levert fra produsenten. I separate eksperimenter for måling av konkurranse mellom IL-17-varianter om binding til reseptor, ble en fast reseptorkonsentrasjon innkubert med en varierende konsentrasjon av IL-17-protein, fulgt av injeksjon av blandingen i en gjennomstrømningscelle med immobilisert IL-17-protein. Mengden bundet reseptor ble bestemt ifra resonanssignalet som ble erholdt etter fullført assosiasjonsfase.
(2) Krystallografi
IL-17F krystalliserte som heksagonale plater i hengende dråper over en brønnløsning inneholdende 1,0 M litiumsulfat, 0,5 M ammoniuimsulfat, 1% etanol og 100 mM natriumcitrat, pH 5,6 ved 19°C. Krystallene ble høstet over i en kunstig moderlut som bestod av brønnløsningen uten etanol. Før oppsamling av data ble krystallene neddyppet i kunstig moderlut med 20% glyserol og hurtig avkjølt i flytende
nitrogen. Innledende data ble oppsamlet med en roterende anodegenerator i laboratoriet med CuKa-stråling, og romgruppen ble funnet å være P6jeller P65, med to dimerer i den asymmetriske enhet. For fasebestemmelse ble krystallene derivatisert ved neddypping i 6 timer i kunstig moderlut tilsatt 2 mM timersol. Et nativt datasett og et Hg-MAD (multibølgelengde anormal diffraksjon)-eksperiment ved tre bølgelengder ble oppsamlet ved strålelinje 9-2 ved Standford Cynchrotron Radiation Laboratory. Datasettene ble behandlet ved anvendelse av programmene i HKL-pakken (Otwinowski, Z. og Minor, W, Methods Enzymol, 176:307-326 (1997)). Strukturbestemmelsen ble utført ved anvendelse av programpakken CCP4 (CCP4, Acta Cryst. D50:760-763 (1994)). Patterson-kart viste nærvær av flere velordnede Hg-atomer hvis plassering ble bestemt ved anvendelse av programmet Rantan. En faseforfining ble utført ved hjelp av MLPHARE. En undersøkelse av DM-modifiserte kar viste at romgruppen var P65og viste de ikke-krystallografiske symmetrioperatorer (NCS-operatorer). Hver preotomer bandt et enkelt timerosalmolekyl i et ekvivalent, NCS-relatert sete.
Den opprinnelige strukturen ble innbygd i et eksperimentelt kar med fire-ganger NCS-gjennomsnitt og løsemiddelforflatning, og ble forfinet ved anvendelse av programmene REFMAC_4.0 (CCP4, Acta Cryst. D50:760-763 (1994)) og Brunger, A. T.
(1992), X-PLOR Manual, versjon 3.1 (New Haven, Connecticut: Yale University) som modifisert av Molecular Simulations, Inc. Refleksjoner som ble avsondret for beregning av den frie R-verdi ble utvalgt i tynne resolusjonsskall. En målfunksjon med maksimal sannsynlighet, en total anisotropisk korreksjon og en løsemiddelkorreksjon i det sanne rom ble anvendt under posisjonsforfiningen, den stimulerte herding og forfiningen av den isotrope temperaturfaktor. Den innledende forfining ble utført mot det fjerne 2,65 A-datasett, men forstyrrelser rundt Hg-setene viste seg vanskelige å modellere, så den endelige forfining ble utført mot det native 2.85 A-datasett ved anvendelse av det samme sett av frie R-refleksjoner. I den endelige modell er de fire vektoravledede aminosyrerestene, aminosyrerest 1-8 og aminosyrerest 128-133 uordnede i protomerene A, B og X, mens aminosyrerestene 1-6 og 130-133 er uordnede i protomer Y. IXY-dimeren er en intern løkke (aminosyrerest X20-X23 og Y20-Y25) uordnet, den samme løkken er dårlig ordnet i AB-monomerene. Et Ramachandran-plott viser at 90% av alle ikke-glysin, ikke-prolinrester foreligger i de mest favoriserte områder, 9,2% i de tillatte tilleggsområdene, 0,7% (3 aminosyrerester) i de generøst tillate områder og ingen aminosyrerester i de ikke-tillate områder. Dataoppsamlingen og forfiningsstatestikken gis i Tabell 8. Koordinatene for IL-17F har blitt deponert i Protein Data Bank og har fortsatt ikke blitt gitt en aksesjonskode. Programmene areaimol og resarea (CCP4, Acta Cryst. D50:760-763 (1994)) ble anvendt for beregning av det tilgjengelige overflateareal. Programmene Molscript (Kraulis, P.J, J. Appl. Cryst, 103:1345-1352 (1999)), Raster3D (Merrit, E.A. og Murphy, M:E.P, Acta Cryst. D50:869-873 (1994)), Insight97 (MSI) og Grasp (Nichols et al. Proteins, 11:281-296 (1991)) ble anvendt for analyse og for fremstilling av Figur 15, 17 og 18.
B. Resultater og diskusjon
(1) Reseptorbinding
Overflateplasmonresonans (SPR) ble anvendt for å fastslå hvorvidt IL-17F (PRO20110) binder det ekstracellulære domenet (ECD) fra en av de to reseptorene IL-17R (betegnet PROl) og IL-17RH1 (PRO5801), som har blitt rapportert å binde IL-17-proteiner. Imidlertid ble ingen binding av verken IL-17R eller IL-17RH1 (opp til 1, henholdsvis 0,5 uM) observert til immobilisert IL-17F. I motsetning til dette bant IL-17R immobilisert IL-17 med en moderat bindingsaffinitet (se Tabell 8 nedenfor), i samsvar med tidligere rapporter vedrørende affiniteten for denne interaksjonen (Yao et al, Cytokine, 9:794-800 (1997)). Likeså viste IL-17RH1 høyaffinitetsbinding til IL-17E (Tabell 7), i samsvar med aktiviteten som observeres for induksjon av IL-8-frigjøring fra celler (Lee et al, J. Biol. Chem, 276:1660-1664 (2001)). Videre ble ingen binding
observert mellom IL-17RH1 og IL-17, og mellom IL-17E og IL-17R, som forventet (Shi et al, J. Biol. Chem, 275:19167-19176 (2000), Lee et al, J. Biol. Chem, 276:1660-1664
(2001)).
For å analysere hvorvidt manglende binding av IL-17R eller IL-17RH1 til IL-17F kunne være en følge av immobiliseringskoblet aktivering, ble IL-17F/reseptorbindingen analysert i kompetitive eksperimenter. I disse eksperimentene ble en fast konsentrasjon av IL-17R (500 nM) eller IL-17RH1 (31 nM) innkubert med varierende konsentrasjoner av ligand og så injisert over IL-17- eller IL-17E-overflaten. Mens løselig IL-17 effektivt kunne blokkere bindingen av IL-17R til immobilisert IL-17, ble ingen konkurranse observert med 2 uM IL-17F. Videre kunne 1,3 uM IL-17F ikke blokkere bindingen av IL-17RH1 til immobilisert IL-17E, selv om bindingen ble fullstendig inhibert med løselig IL-17E. Disse resultatene viste at IL-17F ikke bindes med høy affinitet til det rensede, monomere ECD fra verken IL-17R eller IL-17RH1. Som vist i Eksempel 14 (Figur 14) har IL-17F-ligand blitt vist å binde til den nye IL-17RH2-reseptor (PRO20040).
Selv om IL-17F ser ut til å ha en aktivitet som er beslektet med aktiviteten til IL-17F, bindes IL-17F ikke til IL-17R med høy affinitet in vitro. Imidlertid kan en forhøyet binding av IL-17F til Cos-celler som er transfektert med IL-17R påvises (ikke vist), noe som tyder på at IL-17F kan være i stand til å benytte IL-17R, men bare i kombinasjon med andre, ennå ikke identifiserte komponenter, slik at det dannes et signalkompleks med høy affinitet. En lignende mekanisme har blitt postulert for IL-17 for å forklare uoverensstemmelsen mellom reseptoraffiniteten og styrken av den biologiske aktivitet (Yao et al, Cytokine, 9:794-800 (1997)). Resultatene som presenteres heri tyder på at uavhengig av hvilken eller hvilke reseptorer som inngår, hører IL-17F-signalisering til nedstrømsaktiviteter som ligner aktivitetene oppnådd ved stimulering av IL-17R med IL-17.
(2) Bestemmelse av strukturen til IL- 17F
Strukturen til humant IL-17F ble løst ved hjelp av fremgangsmåter for anormal diffraksjon av Hg med flere bølgelengder og forfinet til en Rfriog R^tpå 28,8%, henholdsvis 23, 3% ved en resolusjon på 2,85 A (se Tabell 9 nedenfor). Kjernen i en IL-17F-protomer består av to par av antiparallelle P-tråder, hvor det ene paret omfatter tråd 1 (aminosyrerestene 52.59) og 2 (aminosyrerestene 66-73 og 77-79), mens det andre paret omfatter tråd 3 (89-103) og 4 (110-125). Tråd 2 er avbrutt av et kort strekk med uregelmessig P-struktur. To disulfidbroer (Cys 72/Cysl22 og Cys77/Cys 124) sammenbinder tråd 2 og 4. En tredje disulfidbro (Cysl7/Cys 107) binder løkken mellom tråd 3 og 4 i en protomer til den N-terminale forlengelse av naboprotomeren, slik at det dannes omfattende dimerkontakter (som diskutert nedenfor). Denne N-terminale forlengelsen inneholder også en P-tråd (tråd 0, aminosyrerest 25-32), som danner hydrogenbindingen med tråd 3' i den andre protomer, og en liten a-heliks (aminosyrerest 43-48). Ytterligere elektrontetthet ble observert ved Asn 53, i samsvar med glykosylering av denne aminosyreresten, noe som må forventes ut fra en sekvensanalyse og karakterisering av det rensede protein.
Denne strukturen viser at IL-17F er en fjern homolog av cysteinknutefamilien av proteiner (McDonald, N.Q. og Hendrickson, W.A, Cell, 73:421-424 (1993)), som har fått navnet grunnet sine uvanlige cysteinsammenbindinger (Figur 15). Cysteinknuten karakeriseres ved to sett av parede P-tråder (tråd 1 og 2 og tråd 3 og 4) som er sammenbundet via disulfidbindingen mellom tråd 2 og 4 (Figur 15A, innskudd). En tredje disulfidbro passerer gjennom denne makrosirkelen og sammenbinder tråd 1 og 3. I motsetning til dette inneholder IL-17F kun to av de tre særpregede cysteinbindinger som gir familien sitt navn. IIL-17F danner disulfidbindinger mellom Cys 72/Cys 122 og Cys 77/Cys 124 makrosirkelen i den typiske cysteinknute. Den tredje disulfidbinding, som ville danne "knuten" ved å passere gjennom denne makrosirkelen, foreligger ikke, i stedet er aminosyrest 50 og 89, som foreligger i det samme tre-dimensjonale rom som den tredje disulfidbinding i cysteinknuteproteinet, seriner i IL-17F. Mens Ser50 foreligger i samme konformasjon som den tilsvarende cystein i et knuteprotein, gjør Ser 89 ikke dette. Det er verdt å merke seg at serinet er konservert i disse posisjoner i alle IL-17-familiemedlemmer (se Figur 16), trass i det faktum at strukturen tyder på at den tredje disulfidbinding kunne få plass.
(3) Dimerisering
IL-17F danner dimerer på en parallell måte som ligner nervevekstfaktor (NGF) og andre neutrofiner (McDonal et al. Nature, 354:411-414 (1991)). Dimerens grenseflate er imidlertid usedvanlig stor og begraver i alt 6800 A2 (eller -3400 A2 per monomer), sammenlignet med i alt 3400 A<2>(-1700 A<2>per monomer) for NGF (PDB-kode lWWW.Weismann et al. Nature, 401:184-188 (1999)). Tilnærmet 1/3 av grenseflaten dannet ved interaksjoner mellom tråd 3 og 4 i en monomer, og de samme trådene i den andre monomer, analogt med dimergrenseflaten som observeres i neutrofiner. Enestående for IL-17F er det store overflateareal som begraves via interaksjoner som omfatter den N-terminale forlengelse (aminosyrest 8-48) i hver protomer, som strekker seg over den kanoniske dimergrenseflate, og pakkes mot forskjellige deler fra den andre protomeren.
Den totale ryggradsstruktur i IL-17F-dimeren kan beskrives som et klesplagg hvor en plate<X>A og 172' danner ermene, cysteinknutedisulfidene omgir kragen og plate 3A og 374' sammen med de N-terminale forlengelsene danner legemet, som avsluttes av de to tre-trådede platene (som omfatter trådene 4/3/0' og 0/374') som danner et skjørt i bunnen (Figur 15B, dimensjoner 65 A x 25 A x 30 A). En slående egenskap ved molekylets overflate er et usedvanlig stort hulrom (18AxlOAxlOA dybde), som er lokalisert på dimergrenseflaten og som i det vesentlige er plassert som lommer i klesplagget. Bunnen i hulrommet dannes av aminosyrerester i tråd 3 og 3' (Gin 95, Glu 96, Thr 97 og Leu 98 fra begge kjeder) og 4 og 4' (Lys 115', Val 118 og Val 120'). Aminosyrer i N-enden kler en side av hulrommet (aminosyrerestene Arg 37, Val 38, Met 40), mens den andre siden er kledd av aminosyrerester fra tråd 1 (Tyr 54), tråd 2 (Val 68, Glu 66) og vendingen mellom disse trådene (Tyr 63 og Pro 64). Peptidbindingen mellom Tyr 63 og Pro 64 foreligger i den uvanlige cis-konformasjonen. Siden denne prolinresten er konservert i alle IL-17-sekvenser og alltid har en stor, hydrofob aminosyrerest foran
seg (se Figur 16) er det usannsynlig at denne ptpdibindingen foreligger i cis-
konformasjon i alle IL-17-familiemedlemmer. Den kvikksølvholdige forbindelse, timerosal, som ble anvendt for fasebestemmelse av strukturen, bindes i den nedre ende av dette hulrommet (som orientert i Figur 17) og opptar 30% av rommet.
Strukturegenskapene som er diskutert ovenfor viser at en IL-17-homolog (IL-17F) er et medlem av cysteinknutefoldings superfamilien og dimeriserer på tilsvarende måte som medlemmer av NGF-underfamilien. IL-17-proteiner har neglisjerbar sekvenslikhet med andre medlemmer av superfamilien. For eksempel viser en strukturbasert sekvenssammenstilling av IL-17F og NGF identitet for kun 10 aminosyrerester, innbefattet de fire cysteinrestene som er konservert i cysteinknutemotivet (ikke vist). En begrenset sekvenskonservering er typisk for cysteinknutefoldings superfamilien (McDoland, N.Q. og Hendrickson, W.A, Cell, 73:421-424 (1993)).
Strukturen til IL-17F tillater en generalisering til andre IL-17-familiemedlemmer. Cysteinknutefoldingen, innbefattet lokaliseringen av P-platene og makrosirkel-disulfidbindingen bør være konservert i alle IL-17-homologer (Figur 16). Mer spesielt er IL-17 så lik IL-17F, med nesten 50% sekvensidentitet, at det er mulig å forutsi hvor IL-17 og IL-17F vil ha felles overflateegenskaper og hvor de vil skille seg fra hverandre. Figur 17 viser molekyloverflaten til IL-17F, fargelagt ut fra sekvensidentitet med IL-17. De eneste områdene med omfattende konservering på overflaten av IL-17F, er på de to protomerenes flate side (Figur 17B) og på området "over" hulrommet (Figur 17A). Det konserverte området på protomerflaten kan enten representere konserverte egenskaper som er nødvendige for bevaring av strukturen eller for mulig gjenkjenning av felles bindingspartnere. Det store hulrommet i overflaten av IL-17F forventes således også å foreligge i IL-17, men vil bestå av både konserverte og variable aminosyrerester.
I motsetning til dette er sekvensen til IL-17B, IL-17C og IL-17E signifikant forskjellig fra sekvensen til IL-17F og IL-17, særlig når det gjelder antall ekstra cysteinbindinger og plassering av disse, samt lengden av den N-terminale forlengelse og sekvensen av denne. Trass i denne divergensen er det mulig å gjøre flere prediksjoner når det gjelder disulfidsammenbindingen og virkningen denne vil ha på den N-terminale forlengelse i andre familiemedlemmer. For eksempel utskilles IL-17B som en ikke-kovalent dimer (både fra CHO-celler og innsektsceller (Shi et al, J. Biol. Chem, 275:19167-19176 (2000) og ikke viste resultater), noe som viser at alle de åtte cysteinrestene danner par i en enkelt kjede av dimeren. En av de to ekstra cysteinenen i IL-17B (Cys 103) er plassert mellom de to cysteinene i tråd 2 som deltar i makrosirkelen, mens den andre ekstra cysteinresten foreligges i vendingen mellom tråd 3 og 4 (Figur 16 og Figur 15). Basert på den antagelse at cysteinknutefoldingen er konservert i alle IL-17-homologer, vil den ekstra cysteinrest (Cys 103) i tråd 2 i IL-17B ligge for langt unna til å kunne danne bindinger med cysteinene i tråd<3>/4-løkken. Cys 103 i IL-17B må følgelig danne en disulfidbinding med Cys64 i den N-terminale forlengelse, noe som etterlater de to cysteinene i tråd 3/4-løkken til å danne bindingen med hverandre. For at disse interaksjonene skal finne sted, må den N-terminale forlengelse foreligge i en radikalt forskjellig konformasjon i IL-17B enn den foreligger i IL-17F. Dette er rimelig, siden sekvensen i denne delen av strukturen ikke er konservert i familien, danner svært lite regulær sekundærstruktur og primært pakkes i molekylets periferi. Basert på denne analysen forventes det at IL-17C og IL-17E, som også har en ekstra cysteinrest i tråd 2, også sannsynligvis har sine N-ender i en signifikant forskjellig konformasjon enn for IL-17F og IL-17. Denne analysen deler familien i to klasser basert på disulfidbindingsmønsteret i N-enden.
En imponerende egenskap ved strukturen til IL-17F er det usedvanlig store hulrom som dannes av aminosyrerestene i dimer grenseflaten (Figur 18), noe som tyder på et område som kan binde et annet molekyl. Hulrommet (to per dimer) er sammensatt av en kombinasjon av aminosyrerester som enten er strengt konserverte eller som alltid besitter lignende kjemiske egenskaper (Tyr 54, Tyr 63, Pro 64, Val 120), så vel som andre, som er ekstremt variable blant IL-17-familiemedlemmer (Arg 37, Val 38, Met 40, Ala 95), noe som gir muligheten for å innføre spesifisitet for intermolekylære interaksjoner. Hulrommet har ingen uttalte elektrostatiske overflateegenskaper, men dannes i stedet ved en kombinasjon av hydrofobe, polare og ladde aminosyrerester (se Figur 17A og Figur 18A). Basert på sekvensanalyse vil et tilsvarende hulrom forventes å foreligge i andre IL-17-familiemedlemmer, ut fra den sannsynlig forskjellige konformasjon av den N-terminale forlengelse kan imidlertid de spesifikke egenskapene til hulrommet være temmelig forskjellige i IL-17B, IL-17C og IL-17E.
NGF binder sin høyaffinitetsreseptor, TrkA, i en posisjon som tilsvarer plasseringen av hulrommene i IL-17F. Figur 18B og Fibur 18C viser IL-17F og NGF i samme orientering, slik at plasseringen av hulrommene og TrkA-bindingssetene (som forventes å benyttes av alle neurotrofin/Trk-komplekser, Weismann et al. Nature, 401:184-188 (1999)), femheves. De kjente strukturene til neurotrofin homodimerer (NGF, NT3, NT4), har også et innsøkk på overflaten av denne posisjonen, men dette er mye mindre og mer beskjedent enn hulrommet i IL-17F (McDonald et al. Nature, 354:411-414 (1991)), Butte et al, Biochemistry, 37:16846-16852 (1998), Robinson et al. Protein Sei, 8:2589-2597 (1999)). Trk-familiemedlemmer er reseptor-tyrosinkinaser som interagerer med neurotrofiner via sitt membranproksimale, ekstracellulære Ig-lignende domene. Selv om det ikke forventes at strukturen til IL-17R eller IL-17RH1 inneholder en Ig-lignende folding, kan IL-17-proteiner og neurotrofiner benytte tilsvarende områder på overflaten til å binde sin reseptor.
Neurotrofiner binder ikke bare spesifikke Trk-reseptorer, men kan også samtidig VITT viTD
binde p75 , en andre reseptor som er felles for alle neurotrofiner. P75 binder sine neurotrofinligander via et cysteinrikt ekstracellulært domene som forventes å ligne strukturen i tumornekrosefaktorreseptor 1 (TNFRl) eller dødsreseptor 5 (Banner et al, Cell, 73:431-445 (1993), Hymowitz et al. Mol. Cell, 4:563-571 (1999), Mongkolsapaya
et al., Nat. STruc. Biol., 6: 1048-1053 (1999)). En modell av NGF:p75<NTR->interaksjonen har blitt foreslått basert på mutageneseresultater (Weismann, C. og de Vos, A.M, Cell. Mol. Life. Sei, 58:1-12 (2001)) og antyder at løkkene i hver ende av liganddimeren samt den flate overflate i hver protomer interagerer med p75 VJTp. Sekvensen til IL-17R og IL-17RH1 ligner ikke sekvensen til p75 vinpn og forventes ikke å innta en TNFR1 -lignende folding. Ut fra likheten mellom IL-17 og neutrofinfoldinger er det imidlertid rimelig å ta i betraktning muligheten for en andre reseptorkomponent for IL-17, analogt med neutrofinsystemet.
Videre har proteinet spåtzle blitt foreslått å innta en neutrotrofinfolding (Mizuguchi et ahl, TIBS, 23:239-242 (1998)) og har blitt vist genetisk (om enn ikke ved direkte bindingseksperimenter) å være en reseptor for Toll-reseptoren fra drosophila (Morisato et al, Cell, 76:677-688 (1994)). Siden IL-17 signaliserer via NF-kB i en signalvei som ligner den som benyttes av IL-1 og Toll-reseptorer, som har en felles folding i sitt intracellulære domene, selv om de ekstracellulære domenene er svært forskjellige, er det rimelig å forvente at enten det intracellulære eller ekstracellulære domenet i IL-17-reseptorer, innbefattet andre, hittil ukjente komponenter av signalkomplekset, strukturelt kan ligne deler av disse reseptorene. Uavhengig av reseptorstrukturen vil imidlertid interaksjonsmåten mellom IL-17-ligander og reseptorer sannsynligvis omfatte de dype hulrommene i sidene av IL-17-dimerstrukturen.

Claims (25)

1. Fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette, karakterisert ved at den omfatter tilførsel til pattedyret, av en terapeutisk effektiv mengde av en eller flere antagonister som kan inhibere både IL-17A (SEKV ID NR: 3) og IL-17F (SEKV ID NR: 4) i et IL-17A/F-polypeptid.
2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at pattedyret er et menneske.
3. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at den omfatter tilførsel til mennesket av en terapeutisk effektiv mengde av en IL-17A-antagonist og en IL-17F-antagonist.
4. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at IL-17A-antagonisten er et antistoff som spesifikt binder IL-17A (SEKV ID NR: 3) eller et fragment derav.
5. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at IL-17F-antagonisten er et antistoff som spesifikt binder IL-17F (SEKV ID NR: 4) eller et fragment derav.
6. Fremgangsmåte ifølge krav 3, karakterisert ved at IL-17A-antagonisten er et antistoff som spesifikt binder IL-17A (SEKV ID NR: 3) eller et fragment derav, og at IL-17F-antagonisten er et antistoff som spesifikt binder IL-17F (SEKV ID NR: 4) eller et fragment derav.
7. Fremgangsmåte ifølge krav 2, karakterisert ved at antagonisten er et antistoff som spesifikt bindes til både IL-17A (SEKV ID NR: 3) og IL-17F (SEKV ID NR: 4) i et IL-17A/F-polypeptid, eller et fragment derav.
8. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffet er et kryssreagerende antistoff som gjenkjenner identiske epitoper eller epitoper som ligner hverandre i både IL-17A (SEKV ID NR: 3) og IL-17F (SEKV ID NR: 4).
9. Fremgangsmåte ifølge krav 7, karakterisert ved at antistoffet er et bispesifikt antistoff med IL- 17A- og IL-17F-spesifisitet, eller et fragment derav.
10. Fremgangsmåte ifølge ethvert av kravene 3-9, karakterisert ved at antistoffet er et monoklonalt antistoff eller et fragment derav.
11. Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at det monoklonale antistoff eller antistoffragmentet er kimert, humanisert eller humant.
12. Fremgangsmåte ifølge krav 11, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immunmediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjonsassosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
13. Fremgangsmåte ifølge krav 12, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er multippel sklerose (MS) eller reumatoid artritt (RA).
14. Fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette omfattende samtidig påvirkning av IL-17A og IL-17F i pattedyret, karakterisert ved at den omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et kryssreagerende antistoff, hvori antistoffet gjenkjenner identiske epitoper eller epitoper som ligner hverandre i både IL-17A, et polypeptid med aminosyre sekvensen ifølge SEKV ID NR: 3 og IL-17F, et polypeptid med aminosyresekvensen ifølge SEKV ID NR: 4, eller et fragment av antistoffet.
15. Fremgangsmåte ifølge krav 14, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immun-mediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjonsassosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
16. Fremgangsmåte ifølge krav 15, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er multippel sklerose (MS) eller reumatoid artritt (RA).
17. Fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette omfattende samtidig påvirkning av IL-17A og IL-17F i pattedyret, karakterisert ved at den omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et bispesifikt antistoff, hvori antistoffet består av to armer, hvori en arm i antistoffet gjenkjenner IL-17A, og den andre arm i antistoffet gjenkjenner IL-17F.
18. Fremgangsmåte ifølge krav 17, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immun-mediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjonsassosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
19. Fremgangsmåte ifølge krav 18, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er multippel sklerose (MS) eller reumatoid artritt (RA).
20. Fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette omfattende samtidig påvirkning av IL-17A og IL-17F i pattedyret, karakterisert ved at den omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et bispesifikt antistoff, hvori antistoffet består av en tungkjede som gjenkjenner IL-17A, og en lettkjede som gjenkjenner IL-17F.
21. Fremgangsmåte ifølge krav 20, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immun-mediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjonsassosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
22. Fremgangsmåte ifølge krav 21, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er multippel sklerose (MS) eller reumatoid artritt (RA).
23. Fremgangsmåte for behandling av en immunrelatert forstyrrelse i et pattedyr med behov for dette omfattende samtidig påvirkning av IL-17A og IL-17F i pattedyret, karakterisert ved at den omfatter tilførsel til pattedyret av en terapeutisk effektiv mengde av et bispesifikt antistoff, hvori antistoffet består av en tungkjede som gjenkjenner IL-17F, og en lettkjede som gjenkjenner IL-17A.
24. Fremgangsmåte ifølge krav 23, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er systemisk lupus erytematosis, reumatoid artritt, osteoartritt, juvenil, kronisk artritt, en spondyloartropati, systemisk sklerose, en idiopatisk inflammatorisk myopati, Sjøgrens syndrom, systemisk vaskulitt, sarkoidose, autoimmun hemolytisk anemi, autoimmun trombocytopeni, tyroiditt, diabetes mellitus, en immunmediert nyresykdom, en demyelinerende sykdom i sentralnervesystemet eller det perifere nervesystem, idiopatisk demyelinerende poly-neuropati, Guillain-Barré syndrom, en kronisk inflammatorisk, demyelinerende poly-neuropati, en lever-gallesykdom, infeksiøs eller autoimmun, kronisk aktiv hepatitt, primær gallecirrhose, granulomatøs hepatitt, skleroserende kolangitt, inflammatorisk tarmsykdom, glutensensitiv enteropati, Whipples sykdom, en autoimmun eller immun-mediert hudsykdom, en bulløs hudsykdom, erytema multiforme, kontaktdermatitt, psoriasis, en allergisk sykdom, astma, allergisk rhinitt, atopisk dermatitt, hypersensitivitet ovenfor mat, urtikaria, en immunologisk sykdom i lungen, eosinofil pneumoni, idiopatisk lungefibrose, hypersensitivtetspneumonitt, en transplantasjonsassosiert sykdom, transplantatawisning eller graft-versus-host-sykdom.
25. Fremgangsmåte ifølge krav 24, karakterisert ved at den immunrelaterte forstyrrelse er multippel sklerose (MS) eller reumatoid artritt (RA).
NO20092448A 2006-11-29 2009-06-26 IL-17A/F-heterologe polypeptider og terapeutiske anvendelser derav NO20092448L (no)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US11/606,192 US20070160576A1 (en) 2001-06-05 2006-11-29 IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
PCT/US2007/085269 WO2008067223A2 (en) 2006-11-29 2007-11-20 Il-17a/f heterodimeric polypeptides and therapeutic uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
NO20092448L true NO20092448L (no) 2009-08-26

Family

ID=39468626

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
NO20092448A NO20092448L (no) 2006-11-29 2009-06-26 IL-17A/F-heterologe polypeptider og terapeutiske anvendelser derav

Country Status (26)

Country Link
US (3) US20070160576A1 (no)
EP (3) EP2450050A1 (no)
JP (3) JP2010511056A (no)
KR (1) KR101561926B1 (no)
CN (2) CN104784688A (no)
AR (1) AR064032A1 (no)
AU (1) AU2007325316C1 (no)
BR (1) BRPI0719288A2 (no)
CA (1) CA2666549A1 (no)
CL (1) CL2007003439A1 (no)
CO (1) CO6180451A2 (no)
CR (1) CR10824A (no)
EC (1) ECSP099401A (no)
IL (1) IL197776A0 (no)
MA (1) MA31077B1 (no)
MX (1) MX2009005304A (no)
MY (2) MY171772A (no)
NO (1) NO20092448L (no)
NZ (1) NZ575700A (no)
PE (1) PE20081501A1 (no)
RU (2) RU2440134C2 (no)
SG (1) SG177136A1 (no)
TW (1) TWI527830B (no)
UA (1) UA103297C2 (no)
WO (1) WO2008067223A2 (no)
ZA (2) ZA200902480B (no)

Families Citing this family (36)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7771719B1 (en) * 2000-01-11 2010-08-10 Genentech, Inc. Pharmaceutical compositions, kits, and therapeutic uses of antagonist antibodies to IL-17E
US20040043397A1 (en) * 2000-01-11 2004-03-04 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US20030203451A1 (en) * 2000-08-24 2003-10-30 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US7718397B2 (en) 2000-03-21 2010-05-18 Genentech, Inc. Nucleic acids encoding receptor for IL-17 homologous polypeptides and uses thereof
US20030096969A1 (en) * 2000-06-02 2003-05-22 Genentech, Inc. Secreted and transmembrane polypeptides and nucleic acids encoding the same
US20070160576A1 (en) 2001-06-05 2007-07-12 Genentech, Inc. IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1641822B1 (en) 2003-07-08 2013-05-15 Genentech, Inc. Il-17 a/f heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1983000B1 (en) 2003-11-21 2015-09-02 UCB Biopharma SPRL Method for the treatment of multiple sclerosis by inhibiting IL-17 activity
BRPI0608210A2 (pt) 2005-02-14 2010-11-09 Wyeth Corp métodos de diagnóstico de um distúrbio relacionado com il-17f em um indivìduo e de seleção de compostos capazes de inibirem a ligação de il-17f em il-17r, uso de um antagonista de il-17f, composição farmacêutica, e, adjuvante de vacina
AU2006214473A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor
GB0620729D0 (en) 2006-10-18 2006-11-29 Ucb Sa Biological products
CL2008000883A1 (es) * 2007-03-28 2008-10-03 Wyeth6 3 Metodo de deteccion de compuestos capaces de antagonizar la senalizacion de il-17f/il-17a; compuesto identificado por dicho metodo; uso de una cantidad de un antagonista de senalizacion de il-17f/il-17a, composicion farmaceutica que comprende dicho a
ES2614735T3 (es) * 2007-07-23 2017-06-01 Janssen Biotech, Inc. Métodos y composiciones para tratar los trastornos relacionados con fibrosis usando antagonistas de la IL-17
GB0807413D0 (en) 2008-04-23 2008-05-28 Ucb Pharma Sa Biological products
WO2009136286A2 (en) * 2008-05-05 2009-11-12 Novimmune Sa Anti-il-17a/il-17f cross-reactive antibodies and methods of use thereof
US8790642B2 (en) 2008-08-29 2014-07-29 Genentech, Inc. Cross-reactive and bispecific anti-IL-17A/F antibodies
NZ594514A (en) 2009-03-05 2013-06-28 Abbott Lab Interleukin-17 BINDING PROTEINS
KR101766927B1 (ko) * 2009-04-01 2017-08-09 제넨테크, 인크. 인슐린 저항성 장애의 치료
WO2010128407A2 (en) 2009-05-05 2010-11-11 Novimmune S.A. Anti-il-17f antibodies and methods of use thereof
US20100310502A1 (en) * 2009-06-09 2010-12-09 Anders Linden Method of treating local infections in mammals
AU2010303166A1 (en) * 2009-10-10 2012-05-24 Eleven Biotherapeutics, Inc. IL-17 family cytokine compositions and uses
EP2566971B1 (en) 2010-05-06 2019-03-27 Singulex, Inc. Methods for diagnosing, staging, predicting risk for developing and identifying treatment responders for rheumatoid arthritis
EP3546483A1 (en) 2010-05-20 2019-10-02 Ablynx N.V. Biological materials related to her3
ME02734B (me) 2011-01-14 2017-10-20 Ucb Biopharma Sprl Antitelo koje vezuje il-17a i il-17f
WO2012138977A1 (en) * 2011-04-06 2012-10-11 Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Structural based design of il-17 dominant negative mutants
UA117218C2 (uk) 2011-05-05 2018-07-10 Мерк Патент Гмбх Поліпептид, спрямований проти il-17a, il-17f та/або il17-a/f
WO2013116682A1 (en) 2012-02-02 2013-08-08 Ensemble Therapeutics Corporation Macrocyclic compounds for modulating il-17
CN106132433B (zh) * 2013-12-27 2021-04-06 国立大学法人大阪大学 以il-17a作为靶标的疫苗
WO2016070062A2 (en) 2014-10-31 2016-05-06 Genentech, Inc. Anti-il-17a and il-17f cross reactive antibody variants and compositions comprising and methods of making and using same
CN104784687A (zh) * 2015-04-27 2015-07-22 苏州大学附属第一医院 重组绿脓杆菌鞭毛钩蛋白FlgE的用途
KR20180067676A (ko) 2015-10-27 2018-06-20 유씨비 바이오파마 에스피알엘 항-il-17a/f 항체를 사용한 치료 방법
RU2680011C2 (ru) 2016-04-29 2019-02-14 Закрытое Акционерное Общество "Биокад" Триспецифические антитела против il-17a, il-17f и другой провоспалительной молекулы
AU2017402210B2 (en) * 2017-03-10 2021-08-19 Suzhou Kanova Biopharmaceutical Co., Ltd. Monoclonal antibody against both IL-17A and IL-17F and use of the same
WO2019217407A1 (en) * 2018-05-07 2019-11-14 Yale University Blockade of mir466l-3p binding to il-17a mrna with site-specific target site blocker prevents neuro-inflammatory-mediated disease
AU2019308205A1 (en) * 2018-07-16 2020-11-19 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Non-human animal models of DITRA disease and uses thereof
CN116751277A (zh) * 2023-01-10 2023-09-15 武汉爱博泰克生物科技有限公司 利用毕赤酵母表达活性重组人il-17a蛋白的方法

Family Cites Families (165)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US3896111A (en) 1973-02-20 1975-07-22 Research Corp Ansa macrolides
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4151042A (en) 1977-03-31 1979-04-24 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for producing maytansinol and its derivatives
US4137230A (en) 1977-11-14 1979-01-30 Takeda Chemical Industries, Ltd. Method for the production of maytansinoids
FR2413974A1 (fr) 1978-01-06 1979-08-03 David Bernard Sechoir pour feuilles imprimees par serigraphie
US4265814A (en) 1978-03-24 1981-05-05 Takeda Chemical Industries Matansinol 3-n-hexadecanoate
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
JPS5562090A (en) 1978-10-27 1980-05-10 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55164687A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS5566585A (en) 1978-11-14 1980-05-20 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
US4657760A (en) 1979-03-20 1987-04-14 Ortho Pharmaceutical Corporation Methods and compositions using monoclonal antibody to human T cells
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS55164685A (en) 1979-06-08 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS55164686A (en) 1979-06-11 1980-12-22 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid compound and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
US4309428A (en) 1979-07-30 1982-01-05 Takeda Chemical Industries, Ltd. Maytansinoids
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4399216A (en) 1980-02-25 1983-08-16 The Trustees Of Columbia University Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials
ZA811368B (en) 1980-03-24 1982-04-28 Genentech Inc Bacterial polypedtide expression employing tryptophan promoter-operator
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4873191A (en) 1981-06-12 1989-10-10 Ohio University Genetic transformation of zygotes
US4485045A (en) 1981-07-06 1984-11-27 Research Corporation Synthetic phosphatidyl cholines useful in forming liposomes
NZ201705A (en) 1981-08-31 1986-03-14 Genentech Inc Recombinant dna method for production of hepatitis b surface antigen in yeast
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4943529A (en) 1982-05-19 1990-07-24 Gist-Brocades Nv Kluyveromyces as a host strain
US4870009A (en) 1982-11-22 1989-09-26 The Salk Institute For Biological Studies Method of obtaining gene product through the generation of transgenic animals
AU2353384A (en) 1983-01-19 1984-07-26 Genentech Inc. Amplification in eukaryotic host cells
US4713339A (en) 1983-01-19 1987-12-15 Genentech, Inc. Polycistronic expression vector construction
JPS60500673A (ja) 1983-03-08 1985-05-09 コモンウエルス　セラム　ラボラトリ−ズ　コミツシヨン 抗原活性を有するアミノ酸配列
NZ207394A (en) 1983-03-08 1987-03-06 Commw Serum Lab Commission Detecting or determining sequence of amino acids
WO1984003506A1 (en) 1983-03-08 1984-09-13 Commw Serum Lab Commission Antigenically active amino acid sequences
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4675187A (en) 1983-05-16 1987-06-23 Bristol-Myers Company BBM-1675, a new antibiotic complex
DD266710A3 (de) 1983-06-06 1989-04-12 Ve Forschungszentrum Biotechnologie Verfahren zur biotechnischen Herstellung van alkalischer Phosphatase
US4544545A (en) 1983-06-20 1985-10-01 Trustees University Of Massachusetts Liposomes containing modified cholesterol for organ targeting
AU3145184A (en) 1983-08-16 1985-02-21 Zymogenetics Inc. High expression of foreign genes in schizosaccharomyces pombe
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US4736866A (en) 1984-06-22 1988-04-12 President And Fellows Of Harvard College Transgenic non-human mammals
US4879231A (en) 1984-10-30 1989-11-07 Phillips Petroleum Company Transformation of yeasts of the genus pichia
CH0229046H1 (de) 1985-03-30 1998-07-15 Stuart Alan Kauffman Method for obtaining dna, rna, peptides, polypeptinique. des or proteins by means of a dna recombinant tech
NZ215865A (en) 1985-04-22 1988-10-28 Commw Serum Lab Commission Method of determining the active site of a receptor-binding analogue
EP0206448B1 (en) 1985-06-19 1990-11-14 Ajinomoto Co., Inc. Hemoglobin combined with a poly(alkylene oxide)
US5206344A (en) 1985-06-26 1993-04-27 Cetus Oncology Corporation Interleukin-2 muteins and polymer conjugation thereof
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
EP0272253A4 (en) 1986-03-07 1990-02-05 Massachusetts Inst Technology METHOD FOR IMPROVING GLYCOPROTE INSTABILITY.
GB8610600D0 (en) 1986-04-30 1986-06-04 Novo Industri As Transformation of trichoderma
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US5567610A (en) 1986-09-04 1996-10-22 Bioinvent International Ab Method of producing human monoclonal antibodies and kit therefor
US5763192A (en) 1986-11-20 1998-06-09 Ixsys, Incorporated Process for obtaining DNA, RNA, peptides, polypeptides, or protein, by recombinant DNA technique
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
US4946783A (en) 1987-01-30 1990-08-07 President And Fellows Of Harvard College Periplasmic protease mutants of Escherichia coli
US5010182A (en) 1987-07-28 1991-04-23 Chiron Corporation DNA constructs containing a Kluyveromyces alpha factor leader sequence for directing secretion of heterologous polypeptides
IL87737A (en) 1987-09-11 1993-08-18 Genentech Inc Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells
GB8724885D0 (en) 1987-10-23 1987-11-25 Binns M M Fowlpox virus promotors
US5606040A (en) 1987-10-30 1997-02-25 American Cyanamid Company Antitumor and antibacterial substituted disulfide derivatives prepared from compounds possessing a methyl-trithio group
US5770701A (en) 1987-10-30 1998-06-23 American Cyanamid Company Process for preparing targeted forms of methyltrithio antitumor agents
US5053394A (en) 1988-09-21 1991-10-01 American Cyanamid Company Targeted forms of methyltrithio antitumor agents
ATE105585T1 (de) 1987-12-21 1994-05-15 Univ Toledo Transformation von keimenden pflanzensamen mit hilfe von agrobacterium.
US5266684A (en) 1988-05-02 1993-11-30 The Reagents Of The University Of California Peptide mixtures
US5571689A (en) 1988-06-16 1996-11-05 Washington University Method of N-acylating peptide and proteins with diheteroatom substituted analogs of myristic acid
AU4005289A (en) 1988-08-25 1990-03-01 Smithkline Beecham Corporation Recombinant saccharomyces
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US5663143A (en) 1988-09-02 1997-09-02 Dyax Corp. Engineered human-derived kunitz domains that inhibit human neutrophil elastase
GB8823869D0 (en) 1988-10-12 1988-11-16 Medical Res Council Production of antibodies
US5175384A (en) 1988-12-05 1992-12-29 Genpharm International Transgenic mice depleted in mature t-cells and methods for making transgenic mice
US5225538A (en) 1989-02-23 1993-07-06 Genentech, Inc. Lymphocyte homing receptor/immunoglobulin fusion proteins
US5009772A (en) 1989-02-27 1991-04-23 Kerr-Mcgee Corporation Solvent extraction process
DE69008521T2 (de) 1989-03-07 1994-10-20 Genentech Inc Kovalente konjugate von lipiden und oligonukleotiden.
FR2646437B1 (fr) 1989-04-28 1991-08-30 Transgene Sa Nouvelles sequences d'adn, leur application en tant que sequence codant pour un peptide signal pour la secretion de proteines matures par des levures recombinantes, cassettes d'expression, levures transformees et procede de preparation de proteines correspondant
DE68927344T2 (de) 1989-04-28 1997-02-20 Rhein Biotech Proz & Prod Gmbh Hefezellen der Gattung-Schwanniomyces
CA2055435A1 (en) 1989-05-10 1990-11-11 Eli Gilboa Stably transformed eucaryotic cells comprising a foreign transcribable dna under the control of a pol iii promoter
EP0402226A1 (en) 1989-06-06 1990-12-12 Institut National De La Recherche Agronomique Transformation vectors for yeast yarrowia
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
WO1991000360A1 (en) 1989-06-29 1991-01-10 Medarex, Inc. Bispecific reagents for aids therapy
FR2649120B1 (fr) 1989-06-30 1994-01-28 Cayla Nouvelle souche et ses mutants de champignons filamenteux, procede de production de proteines recombinantes a l'aide de ladite souche et souches et proteines obtenues selon ce procede
WO1991004753A1 (en) 1989-10-02 1991-04-18 Cetus Corporation Conjugates of antisense oligonucleotides and therapeutic uses thereof
US5225212A (en) 1989-10-20 1993-07-06 Liposome Technology, Inc. Microreservoir liposome composition and method
US5013556A (en) 1989-10-20 1991-05-07 Liposome Technology, Inc. Liposomes with enhanced circulation time
ATE139255T1 (de) 1989-10-24 1996-06-15 Gilead Sciences Inc Oligonukleotidanaloga mit neuartigen bindungen
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
CA2026147C (en) 1989-10-25 2006-02-07 Ravi J. Chari Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5498538A (en) 1990-02-15 1996-03-12 The University Of North Carolina At Chapel Hill Totally synthetic affinity reagents
US5229275A (en) 1990-04-26 1993-07-20 Akzo N.V. In-vitro method for producing antigen-specific human monoclonal antibodies
US5427908A (en) 1990-05-01 1995-06-27 Affymax Technologies N.V. Recombinant library screening methods
US5723286A (en) 1990-06-20 1998-03-03 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening systems
ES2108048T3 (es) 1990-08-29 1997-12-16 Genpharm Int Produccion y utilizacion de animales inferiores transgenicos capaces de producir anticuerpos heterologos.
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5698426A (en) 1990-09-28 1997-12-16 Ixsys, Incorporated Surface expression libraries of heteromeric receptors
US5770434A (en) 1990-09-28 1998-06-23 Ixsys Incorporated Soluble peptides having constrained, secondary conformation in solution and method of making same
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JP3523252B2 (ja) 1990-11-21 2004-04-26 ホウテン ファーマシューティカルズ インコーポレイテッド 等モル多種オリゴマー混合物、特にオリゴペプチド混合物の合成
EP0564531B1 (en) 1990-12-03 1998-03-25 Genentech, Inc. Enrichment method for variant proteins with altered binding properties
US5206161A (en) 1991-02-01 1993-04-27 Genentech, Inc. Human plasma carboxypeptidase B
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
JPH06507398A (ja) 1991-05-14 1994-08-25 リプリジェン　コーポレーション Ｈｉｖ感染治療のための異種複合抗体
JP4124480B2 (ja) 1991-06-14 2008-07-23 ジェネンテック・インコーポレーテッド 免疫グロブリン変異体
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
US5270170A (en) 1991-10-16 1993-12-14 Affymax Technologies N.V. Peptide library and screening method
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
ATE297465T1 (de) 1991-11-25 2005-06-15 Enzon Inc Verfahren zur herstellung von multivalenten antigenbindenden proteinen
DE69334255D1 (de) 1992-02-06 2009-02-12 Novartis Vaccines & Diagnostic Marker für Krebs und biosynthetisches Bindeprotein dafür
US5573905A (en) 1992-03-30 1996-11-12 The Scripps Research Institute Encoded combinatorial chemical libraries
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
EP0656064B1 (en) 1992-08-17 1997-03-05 Genentech, Inc. Bispecific immunoadhesins
DE69332981T2 (de) 1992-10-23 2004-05-19 Immunex Corp., Seattle Methoden zur herstellung löslicher, oligomerer proteine
EP0752248B1 (en) 1992-11-13 2000-09-27 Idec Pharmaceuticals Corporation Therapeutic application of chimeric and radiolabeled antibodies to human B lymphocyte restricted differentiation antigen for treatment of B cell lymphoma
CA2150803C (en) 1992-12-02 2006-01-31 Henry Auer Controlled release growth hormone containing microspheres
DE69326937T2 (de) 1993-03-24 2000-12-28 Berlex Biosciences Richmond Kombination von Antihormonale und bindende Moleküle zur Krebsbehandlung
US5536637A (en) 1993-04-07 1996-07-16 Genetics Institute, Inc. Method of screening for cDNA encoding novel secreted mammalian proteins in yeast
US6274711B1 (en) * 1993-06-14 2001-08-14 Inserm, Institut National De La Sante Et De La Recherche Medicale Purified mammalian CTLA-8 antigens and related reagents
US5773001A (en) 1994-06-03 1998-06-30 American Cyanamid Company Conjugates of methyltrithio antitumor agents and intermediates for their synthesis
EP0760012A4 (en) 1994-06-10 1997-07-02 Symbiotech Inc METHODS FOR DETECTING COMPOUNDS BY MEANS OF GENETICALLY MODIFIED LAMBDA BACTERIOPHAGE
US5627024A (en) 1994-08-05 1997-05-06 The Scripps Research Institute Lambdoid bacteriophage vectors for expression and display of foreign proteins
PT779806E (pt) 1994-09-09 2001-02-28 Takeda Chemical Industries Ltd Preparacao de libertacao sustentada contendo um sal metalico de um peptido
US6214388B1 (en) 1994-11-09 2001-04-10 The Regents Of The University Of California Immunoliposomes that optimize internalization into target cells
CA2207869A1 (en) 1994-12-02 1996-06-06 Chiron Corporation Method of promoting an immune response with a bispecific antibody
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5641870A (en) 1995-04-20 1997-06-24 Genentech, Inc. Low pH hydrophobic interaction chromatography for antibody purification
US5739277A (en) 1995-04-14 1998-04-14 Genentech Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US5714586A (en) 1995-06-07 1998-02-03 American Cyanamid Company Methods for the preparation of monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
US5712374A (en) 1995-06-07 1998-01-27 American Cyanamid Company Method for the preparation of substantiallly monomeric calicheamicin derivative/carrier conjugates
PL184531B1 (pl) 1995-06-07 2002-11-29 Alkermes Inc Kompozycja o opóźnionym uwalnianiu ludzkiego hormonu wzrostu do wytwarzania leku do terapii
US5837234A (en) 1995-06-07 1998-11-17 Cytotherapeutics, Inc. Bioartificial organ containing cells encapsulated in a permselective polyether suflfone membrane
ZA965368B (en) 1995-07-14 1997-01-14 Novo Nordisk As A pharmaceutical formulation
US6074849A (en) * 1995-07-19 2000-06-13 Genetics Institute, Inc. Polynucleotides encoding human CTLA-8 related proteins
DE69628026T2 (de) 1995-09-07 2004-04-08 Novozymes A/S Nachweis der aktivität von enzymen für detergenzien durch phagen.
DE19544393A1 (de) 1995-11-15 1997-05-22 Hoechst Schering Agrevo Gmbh Synergistische herbizide Mischungen
WO1997033551A2 (en) 1996-03-15 1997-09-18 Millennium Pharmaceuticals Compositions and methods for the diagnosis, prevention, and treatment of neoplastic cell growth and proliferation
DE69731084T2 (de) 1996-03-20 2006-02-23 Dyax Corp., Cambridge REINIGUNG DES GEWEBE PLASMINOGENAKTIVATORS (tPA)
CA2256449A1 (en) 1996-06-06 1997-12-11 Lajolla Pharmaceutical Company Apl immunoreactive peptides, conjugates thereof and methods of treatment for apl antibody-mediated pathologies
AU735015B2 (en) 1996-06-10 2001-06-28 Scripps Research Institute, The Use of substrate subtraction libraries to distinguish enzyme specificities
US5766905A (en) 1996-06-14 1998-06-16 Associated Universities Inc. Cytoplasmic bacteriophage display system
US5922845A (en) 1996-07-11 1999-07-13 Medarex, Inc. Therapeutic multispecific compounds comprised of anti-Fcα receptor antibodies
EP0929361A4 (en) 1996-10-04 2000-07-19 Whatman Inc DEVICE AND METHOD FOR SIMULTANEOUS MULTIPLE SYNTHESIS
AU4474497A (en) 1996-10-08 1998-05-05 U-Bisys B.V. Methods and means for selecting peptides and proteins having specific affinity for a target
JP2001503064A (ja) 1996-11-06 2001-03-06 ジェネンテク，インコーポレイテッド 拘束されたラセンペプチドとその製法
IL119586A (en) 1996-11-07 2001-09-13 Univ Ramot Discontinuous library of a single biological unit and a method for its preparation
IL119587A (en) 1996-11-07 2000-12-06 Univ Ramot Method of preparing and for obtaining bimolecular interactions
US20020177188A1 (en) * 1998-05-15 2002-11-28 Genentech, Inc. IL-17 homologous polypeptides and therapeutic uses thereof
US6482923B1 (en) * 1997-09-17 2002-11-19 Human Genome Sciences, Inc. Interleukin 17-like receptor protein
US6335155B1 (en) 1998-06-26 2002-01-01 Sunesis Pharmaceuticals, Inc. Methods for rapidly identifying small organic molecule ligands for binding to biological target molecules
CA2355215A1 (en) 1998-12-28 2000-07-06 Jim Wells Identifying small organic molecule ligands for binding
ATE519847T1 (de) 1999-12-23 2011-08-15 Genentech Inc Il-17-homologe polypeptide und ihre therapeutische verwendung
CN1341660A (zh) * 2000-09-07 2002-03-27 上海博德基因开发有限公司 一种新的多肽——人白细胞介素受体－配体(il－17b和il－17br)32.56和编码这种多肽的多核苷酸
US20070160576A1 (en) 2001-06-05 2007-07-12 Genentech, Inc. IL-17A/F heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
AU2002324625B2 (en) * 2001-08-07 2008-05-08 Immunex Corporation Interleukin-1 receptors in the treatment of diseases
WO2004042009A2 (en) 2002-10-30 2004-05-21 Genentech, Inc. Inhibition of il-17 production
EP1641822B1 (en) * 2003-07-08 2013-05-15 Genentech, Inc. Il-17 a/f heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
EP1983000B1 (en) * 2003-11-21 2015-09-02 UCB Biopharma SPRL Method for the treatment of multiple sclerosis by inhibiting IL-17 activity
JP2007535930A (ja) * 2004-05-03 2007-12-13 シェーリング　コーポレイション 皮膚の炎症を予測するためのｉｌ−１７発現の使用；処置方法
US7910540B2 (en) * 2004-06-10 2011-03-22 Zymogenetics, Inc. Soluble ZcytoR14, anti-ZcytoR14 antibodies and binding partners and methods of using in inflammation
AU2006214473A1 (en) * 2005-02-14 2006-08-24 Wyeth Interleukin-17F antibodies and other IL-17F signaling antagonists and uses therefor

Also Published As

Publication number Publication date
ZA201002391B (en) 2012-01-25
US20170291940A1 (en) 2017-10-12
WO2008067223A9 (en) 2008-07-17
CR10824A (es) 2009-08-12
BRPI0719288A2 (pt) 2014-04-15
US20070160576A1 (en) 2007-07-12
JP2010511056A (ja) 2010-04-08
PE20081501A1 (es) 2008-10-30
CL2007003439A1 (es) 2008-07-18
ZA200902480B (en) 2010-07-28
MY171772A (en) 2019-10-29
WO2008067223A3 (en) 2008-09-25
TWI527830B (zh) 2016-04-01
MX2009005304A (es) 2009-05-28
AU2007325316C1 (en) 2014-11-20
KR20090087934A (ko) 2009-08-18
WO2008067223A2 (en) 2008-06-05
JP2015108015A (ja) 2015-06-11
WO2008067223A8 (en) 2009-07-30
EP2056860A2 (en) 2009-05-13
NZ575700A (en) 2012-06-29
TW200831531A (en) 2008-08-01
KR101561926B1 (ko) 2015-10-20
EP2450050A1 (en) 2012-05-09
MY185649A (en) 2021-05-27
UA103297C2 (uk) 2013-10-10
RU2009124453A (ru) 2011-01-10
CA2666549A1 (en) 2008-06-05
ECSP099401A (es) 2009-07-31
AU2007325316B2 (en) 2013-05-09
CN101563098A (zh) 2009-10-21
EP3181147A1 (en) 2017-06-21
IL197776A0 (en) 2011-08-01
JP2013253112A (ja) 2013-12-19
AR064032A1 (es) 2009-03-04
CN104784688A (zh) 2015-07-22
CO6180451A2 (es) 2010-07-19
MA31077B1 (fr) 2010-01-04
AU2007325316A1 (en) 2008-06-05
RU2011140509A (ru) 2013-04-10
SG177136A1 (en) 2012-01-30
US20110256126A1 (en) 2011-10-20
RU2440134C2 (ru) 2012-01-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US20200377585A1 (en) Il-17a/f heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof
NO20092448L (no) IL-17A/F-heterologe polypeptider og terapeutiske anvendelser derav
JP2010046065A (ja) インターロイキン−８と相同なポリペプチドとその治療用途
US20220204606A1 (en) Il-17a/f heterologous polypeptides and therapeutic uses thereof

Legal Events

Date Code Title Description
FC2A Withdrawal, rejection or dismissal of laid open patent application