NO175657B - - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører fremgangsmåter for utførelse av en immunologisk bestemmelse av et antigen i en vaeskeprøve hvorved det også gjøres bruk av en lineær standardkurve. Videre angår oppfinnelsen en reagens for bruk ved slike fremgangsmåter.

Oppfinnelsen omfatter i likhet med andre immunologiske bestemmelsesteknikker eller som i det nedenstående også er betegnet immunoanalyseteknikker, en metode for bestemmelse av tilstedeværelsen av, eller mengden av, antigen i en vaeske-prøve, slik som en pasients blod eller urin. Til forskjell fra andre immunoanalyseteknikker forenkler foreliggende oppfinnelse immunoanalysemetoden ved tilveiebringelse av en fremgangsmåte for oppnåelse av en lineær standardkurve, spesielt i den situasjon hvor høye konsentrasjoner av antigen skal måles.

Et antigen er et stoff, vanligvis et protein eller karbo-hydrat, som ved innføring i kroppen stimulerer produksjonen av et antistoff. Et eksempel på et antigen er et fremmed-stoff i kroppen som forårsaker sykdom, slik som et virus.

Et annet eksempel på et antigen er et stoff som gir bevis på en tilstand i kroppen. Slike antigener er av diagnostisk betydning. For eksempel er tilstedeværelsen av antigenet IgE (immunoglobulin E) et tegn på en allergisk tilstand mens antigenet hCG (human korionisk gonadotropin) er en indikasjon på graviditet. Antigenet ferritin, et Jernholdig protein, måles vanligvis som en indikasjon på en av to tilstander: (1) anemi (hvor ferritin er til stede i relativt lave konsentrasjoner); og (2) overvekt av Jern (hvor ferritiner til stede i relativt høye konsentrasjoner). Dette er bare noen eksempler på antigener som er av diagnostisk betydning i immunoanalyser.

Immunoanalyseteknikker baserer seg på dannelsen av et kompleks mellom antigenet som analyseres og et antistoff eller antistoffer. Antistoffene er reagenser som tilsettes under immunoanalysemetoden. Det er tilveiebragt midler hvorved mengden av kompieksdannet antigen og antistoff kan detekteres. Vanligvis oppnås detektering ved bruk av en merking. Merkingen kan f.eks. være en radioaktiv merking, slik som I*<25>, en enzymmerking, slik som pepperrot-peroksydase (ERPO), eller en fluorescerende merking, slik som fluorescein, skjønt andre merkingsmidler er mulig. Merkingen festes til et av elementene som danner antigen:antistoff-komplekset og detekteres vanligvis og/eller kvantifiseres etter separering av det kompleksdannede merkede antigen og antistoff fra det ikke-kompleksdannede, merkede antigen eller antistoff.

Det er flere kjente immunoanalysemetoder som benytter antistoffer som er merket slik at de er analytisk identifiser-bare. "Sandwich"- eller "to-sete"-teknikker innebærer dannelsen av et kompleks mellom antigenet, og to antistoffer som bindes til to forskjellige steder på overflaten av antigenet, på en slik måte at antigenet sies å være "sandwiched"

(inneklemt) mellom de to antistoffene, som beskrevet i US patent 4.016.143. En hensiktsmessig metode for detektering av mengden av antigen:antistoff:antigen-kompleks som er dannet ved slike teknikker, er å tilveiebringe et første umerket antistoff bundet til en fastfase-bærer og et annet, ubundet merket antistoff. På denne måten blir merkingen bundet til den faste bæreren gjennom antistoff:antigen:anti-stof f-sandwichelementet , og det merkede komplekset kan lett isoleres. Ved standardmetoden blir merkingen på den faste bæreren detektert og/eller kvantifisert, selv om mengden av merking som er tilbake i oppløsning, kan måles i en sjelden benyttet variasjon av sandwich-immunoanalysen.

Betegnelsene førsteantistoff og andre antistoff er benyttet heri for klarhetens skyld, og er ikke ment å indikere eller begrense retningen av immunoreaksjonen. Immunoanalysen kan f.eks. forløpe på en fremoverrettet, hurtig fremoverrettet, samtidig, eller revers måte, slik det er kjent innen tek-nikken. Se f.eks. US patent 4.376.110. F.eks. kan antigenet først reagere med det blindede antistoffet og deretter med det merkede antistoffet eller vice versa. Reaksjonene kan også finne sted samtidig. I tilfelle for hurtige fremoverrettede og samtidige analyser benyttes bare en inkubasjon for å bevirke kompleksdannelse, mens fremoverrettede og reverse analyser krever minst to inkubasjoner. Etter en eller flere slike inkubasjoner blir merkingen festet til bæreren gjennom det uoppløseliggjorte antistoff:antigen:-merket antistoff-sandwichelementet. Mengden av merket antistoff på den faste bæreren, eller den mengde som er tilbake i oppløsning, kan deretter detekteres.

Sandwich-immunoanalysen har blitt meget attraktiv i den kli-niske og diagnostiske testingsindustrien, p.g.a. dens høye grad av spesifisitet. Med denne type immunoanalyse er det imidlertid ofte vanskelig å frembringe en reell lineær standardkurve. Det som menes med en reell lineær standardkurve, er en standardkurve som er relativt lineær, dvs. vanligvis 90-105$ lineær, som frembragt i selve systemet. Dette skal holdes adskilt fra en visuelt lineær" standardkurve, hvor den relative lineariteten oppnås ved hjelp av matematisk manipulasjon.

I det spesielle tilfellet av analyser hvor en betydelig mengde antigen skal måles, er frembringelsen av en reell lineær standardkurve ofte en umulig oppgave. Dette er fordi antigenet, når det er til stede i betydelig mengde, ikke kan virke som den begrensende faktor i reaksjonssystemet. Når antigenet som er av interesse, er til stede i tilstrekkelig lav mengde, blir derimot antigenet den hastighetsbegrensende faktoren i immunoanalysen og skaper derved en pseudo-førsteorden-reaksjon og frembringer en lineær standardkurve.

Som bakgrunn skal det nevnes at kjemiske reaksjoner kan klassifiseres på et kinetisk grunnlag, dvs. ved reaksjons-orden, avhengig av den måte på hvilken reaksjonshastigheten påvirkes av konsentrasjonen av reaktantene under et gitt sett av betingelser. En førsteorden-reaksjon er en som forløper ved en hastighet som er direkte proporsjonal med konsentrasjonen av kun en reaktant. Det enkleste eksempelet på en førsteorden-reaksjon er når reaksjonshastigheten A -+ P er nøyaktig proporsjonal med konsentrasjonen av A. Dette er f.eks. det som skjer i tilfellet for isotop-nedbrytning. En analyse basert på en førsteorden-reaksjon vil vanligvis gi en lineær standardkurve.

I en andreorden-reaksjon er reaksjonshastigheten proporsjonal med produktet av konsentrasjonen av to reaktanter eller i annen potens av konsentrasjonen av en enkelt reaktant. Et eksempel på førstnevnte er reaksjonen A + B -» P. Et eksempel på sistnevnte er reaksjonen 2A -» P. En analyse basert på en andreorden-reaksjon, spesielt en andreorden-reaksjon av førstnevnte type, vil vanligvis gi en ikke-lineær standardkurve. Dette er fordi reaksjonshastigheten er avhengig av konsentrasjonen av mer enn en reaktant. Dette gjelder for tredjeorden-reaksjoner, fjerdeorden-reaksjoner, osv.

En andreorden-reaksjon, slik som A+ B P, eller f.eks. en tredjeorden-reaksjon slik som A +B +C P kan under visse forhold synes å være en førsteorden-reaksjon. Hvis f.eks. konsentrasjonen av B og/eller C er meget høy, og den for A er meget lav, kan reaksjonen synes å være førsteorden, fordi dens hastighet vil være nesten proporsjonal med konsentrasjonen av bare en reaktant, nemlig A. I dette tilfelle vil A virke som den hastighetsbegrensende faktor. Under disse spesielle forhold er reaksjonen en tilsynelatende eller speudo-førsteorden-reaksjon.

En sandwich-immunoanalyse kan generelt anses som en tredjeorden-reaksjon, representert ved ligningen hvor O-Abi er et uoppløseliggjort antistoff, Ag er det antigen som er av interesse, og Ab2<*> er det merkede antistoffet som fullfører sandwich-elementet. I tilfellet for en sandwich-immunoanalyse hvor antigenet som er av interesse, er i meget lav konsentrasjon, virker antigenet naturlig som den hastighetsbegrensende faktoren i den totale reaksjonen. I denne begrensede anvendelse blir således immunoreaksjonen en pseudoførsteorden-reaksjon idet reaksjonshastigheten er nesten poroporsjonal med konsentrasjonen av det antigenet som søkes målt. Dette muliggjør frembringelsen av en lineær standardkurve.

I videre anvendelser, hvor antigenet av interesse ikke er til stede i tilstrekkelige lave mengder til naturlig å virke som den hastighetsbegrensende faktoren i den totale immunoreaksjonen, vil en ikke-lineær standardkurve resultere. Det ville være ønskelig også å oppnå en lineær standardkurve i sandwich-immunoanalyser av denne type av flere grunner. Bl. a. gjør en lineær standardkurve det mulig å oppnå en enkeltpunkt-kalibrering som igjen resulterer i nedsatte kost-nader ved utførelse av immunoanalysen samt større egnethet for operatøren. For formål med enkeltpunkt-kalibrering utføres en enkelt standard sammen med en blindprøve. Standarden vil gi enkeltpunktet, mens blindprøven definerer standardkurvens Y-avskjæring. P.g.a. at standardkurven er en rett linje, er det bare nødvendig med to punkter for å definere kurven. En enkelt omdannelsesfaktor kan beregnes for denne kurven.

I tilfellet for en ikke-lineær standardkurve vil et gjennom-snitt på fem standarder vanligvis måtte utføres for å plotte kurven. Dette blir temmelig kostbart når en ny standardkurve tilveiebringes for hvert knippe av immunoanalyser som foretas. Dessuten vil en lineær standardkurve gi mer nøyaktige resultater enn en ikke-lineær standardkurve. Dette fordi det er en viss mengde feil som er naturlig knyttet til kurve-tilpasning av den ikke-lineære standardkurven.

Av disse grunner har forskjellige forsøk blitt foretatt for å oppnå lineære standardkurver i sandwich-immunoanalyser som er konstruert for å måle et antigen som ikke er til stede i tilstrekkelig lav mengde til å gi en pseudoførsteorden-reaksjon under typiske analysebetingelser.

En av de vanligste metodene for å løse dette problemet har vært å justere følgende to parametrer som er til stede i sandwich-immunoanalysesystemet: (1) mengden av uoppløselig-gjort første antistoff; og/eller (2) mengden av merket andre antistoff. Spesielt blir mengden av uoppløseliggjort førsteantistoff og/eller mengden av merket andre antistoff i immunoanalysesystemet øket ifølge denne metoden. Ved å øke antistoffkonsentrasjonen blir antigenet den hastighetsbegrensende faktoren i systemet, og en pseudoførsteorden-reaksjon skapes. Justeringen av disse parametrene er imidlertid begrenset i sin praktiske anvendelse.

Den første parameteren angår tilsetningen av overskudd uoppløseliggjort første antistoff til immunoanalysesystemet. Mengden av antistoff som kan uoppløseliggjøres, er imidlertid nødvendigvis begrenset av mengden av fast bærer i systemet, ofte mengden av kuleoverflate, og av den benyttede belegningsmetode. Det er m.a.o. en endelig grense for den mengde antistoff som effektivt kan bindes til overflaten av en gitt, fast bærer.

Den andre parameteren som er tilgjengelig for justering, under de tidligere kjente metoder, er tilsetningen av overskudd merket antistoff. Denne parameteren er også begrenset ved at det merkede antistoff som tilsettes til systemet ifølge sakens natur, øker bakgrunnsnivået til nevnte standard sandwich-analyse. Bakgrunnen til et system bestemmes av den måling som oppnås når en blindprøve, som bare inneholder reagens og intet av den substans som skal måles, kjøres i systemet. I en immunoanalysesystem inneholder blindprøven intet antigen, og utelukker dermed muligheten av dannelsen av sandwich-komplekset av uopp-løseliggjort antistoff:antigen:merket antistoff i en sandwich-immunoanalyse•

I et ideelt sandwich-immunoanalysesystem bør det ikke være noe merket antistoff festet til den faste fasen når en blindprøve kjøres, p.g.a. fraværet av noe antistoffrantigen-:antistoff-sandwich. Således bør man teoretisk ikke være i stand til å detektere tilstedeværelsen av merking på den uoppløseliggjorte bæreren. Under de ufullkomne betingelsene ifølge hvilke immunoanalyser kjøres, vil det ikke desto mindre bli en viss mengde av det merkede antistoffet ikke-spesifikt adsorbert direkte på den faste bæreren under immunoanalysen. Denne ikke-spesifikke adsorpsjon bidrar til en forhøyet blindprøveavlesning; dvs. detekterbar merking på den uoppløselig bæreren som ikke er relatert til dannelsen av det sandwichelement som søkes målt. Når ytterligere merket antistoff tilsettes til systemet, vil det bli ytterligere ikke-spesifikk adsorpsjon og således et høyere bakgrunnsnivå. Et forøket bakgrunnsnivå har uheldig innvirkning på sensitiviteten til en immunoanalyse. Den" tidligere kjente tilsetning av overskudd merket antistoff er derfor begrenset av mengden av forøket bakgrunn som immunoanalysesystemet er i stand til å tolerere uten å lide et sen-sitivitetstap.

Ytterligere en annen metode som har blitt benyttet, dreier seg om matematisk manupulasjon av standardkurven for å oppnå en visuelt lineær kurve. Denne står i motsetning til den første tidligere kjente metoden som er beskrevet ovenfor, hvorved nivået av antistoffer i systemet justeres i et forsøk på å oppnå en reell lineær standardkurve. En teknikk som er kjent som logit-transformasjon, ligger til grunn for denne andre metoden. Sagt på enkel måte resulterer logit-transformasjon i en semilogaritmisk grafisk fremstilling av forholdet mellom absorbans og antigenmengde. I en slik grafisk fremstilling kan forholdet mellom absorbans og antigenkonsentrasjon approksimeres ved en lineær funksjon, i et begrenset analytisk område, som beskrevet av Sorenson, Scand. J. Clin. Invest., 42, 577-589 (1982).

Linearisering ved logit-transfomasjon er mer fullstendig beskrevet av Williams et al., J. Immunological Methods, 85, 179-294 (1985). Generelt krever disse metodene relativt raffinerte datamaskiner for å utføre en løsning på ligningen representert ved den ikke-lineære standardkurven etter minste kvadraters metode. Mens en lineær approksimasjon av den transformerte kurven kan foretas basert på denne metode og en omdannelsesfaktor kan beregnes ut fra dataene, står man fort-satt tilbake med nødvendigheten av å kjøre en full standardkurve, istedenfor en enkeltstandard.

Mer nylig har har Zvaigzne et al., Clin. Chem., 32(3), 437-440 (1986) utviklet en metode hvorved den ikke-lineære standardkurven lagres i en datamaskin. Zvaigsne et al. kjørte så en enkelt standard, i anledning av etterfølgende analyser, for å oppdatere y-avskjæringen for den transformerte, ikke-lineære standardkurven. I dette henseende oppnår Zvaigzne et al. en form for enkeltpunkt-kalibrering i sammenheng med deres metode. Denne metode opererer imidlertid bare effektivt for ekstremt stabile reagenssystemer. Dessuten krever metoden relativt raffinert datamaskinutstyr, og den kan ikke fullstendig dempe en viss mengde feil som er naturlig forbundet med kurvetilpasningsprosessen.

Det er følgelig et behov for en fremgangsmåte for tilveiebringelse av en reell lineær standardkurve i sandwich-immunoanalyser beregnet for å detektere og/eller måle antigen som er til stede i tilstrekkelig mengde slik at tidligere kjente justeringer av immunoanalysesystemet feiler m.h.t. å gi en lineær standardkurve. Det er et formål med foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe en slik fremgangsmåte. Et annet formål med oppfinnelsen er å tilveiebringe en fremgangsmåte for kalibrering av en standardkurve hvorved bare en enkelt standard behøver å kjøres, og hvilken enkeltstandard kan benyttes for å frembringe en omdannelsesfaktor i fravær av raffinert og/eller kostbart datautstyr.

Ifølge foreliggende oppfinnelse er det således tilveiebragt fremgangsmåter for immunologisk bestemmelse av et antigen i en væskeprøve samt reagens for bruk i denne sammenheng, og disse fremgangsmåter og reagenser er kjennetegnet ved de trekk som fremgår fra de etterfølgende krav 1-10.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir overskudd første antistoff som ikke er bundet til den faste bæreren og/eller overskudd umerket, ubundet andre antistoff, tilsatt til immunoanalysesystemet. Også her benyttes betegnelsene første antistoff og andre antistoff for klarhetens og enkelthetens skyld, og er ikke ment å begrense foreliggende oppfinnelse. Det første ubundede, umerkede antistoffet behøver bare virke som en analog for det første antistoffet som er bundet til den uoppløselige bæreren. Det første ubundede, umerkede antistoffet kan således virkelig være et antistoff som er forskjellig fra det første antistoffet som er uoppløselig-gjort. Det samme gjelder for det ubundede, umerkede andre antistoffet. Dvs., det kan være et antistoff som er forskjellig det merkede andre antistoffet for hvilket det virker som en analog.

Tilsetningen av førsteantistoff som ikke er bundet til den uoppløselige bæreren, er ikke begrenset av det overflate-areal som er tilgjengelig på den uoppløselige bæreren. Tilsetningen av umerkedet, ubundet andre antistoff vil ikke øke bakgrunnen for immunoanalysen. Tilsetningen av en eller begge av disse analogene vil imidlertid gjøre det mulig å oppnå en pseudoførsteorden-reaksjon og således en lineær standardkurve. Fordelene ved foreliggende oppfinnelse i forhold til tidligere kjente metoder vil klart fremgå etter betraktning av de medfølgende tegninger og følgende detal-jerte beskrivelse av oppfinnelsen.

Fig. 1 er en grafisk fremstilling som illustrerer den lineære standardkurven oppnådd i en immunoanalyse for hCG (human korionisk gonadotropin), som generelt er til stede i meget små mengder, under typiske immunoanalysebetingelser idet bare tidligere teknikks justeringer foretas med systemet. Fig. 2 er en grafisk fremstilling som illustrerer den ikke-lineære standardkurven som oppnås i en immunoanalyse for ferritin under typiske tidligere kjente immunoanalysebetingelser og den lineære standardkurven som oppnås ifølge foreliggende oppfinnelse. Fig. 3 er en grafisk fremstilling som viser den ikke-lineære standardkurven som oppnås i en immunoanalyse for IgE (immuno-glubinlin E) under typiske tidligere kjente immunoanalysebetingelser og den lineære standardkurven som oppnås ifølge foreliggende oppfinnelse.

Ifølge foreliggende oppfinnelse blir overskudd av første antistoff som ikke er bundet til den faste bæreren og/eller overskudd av umerket, ubundet andre antistoff tilsatt til et sandwich-immunoanalysesystem. Det ble overraskende funnet at tilsetningen av en av eller begge av disse antistoffene økte parametrene som var tilgjengelige for justering av immunoanalysesystemet. Dette muliggjorde oppnåelse av en reell lineær standardkurve i immunoanalyser hvor antigenet av interesse er til stede i tilstrekkelig høye mengder slik at en reell lineær- standardkurve vanligvis er uoppnåelig gjennom tidligere kjente metoder.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer to ytterligere parametrer tilgjengelig for justering i en sandwich-immunoanalyse for oppnåelse av en pseudoførsteorden-reaksjon og således en lineær standardkurve. Ifølge foreliggende oppfinnelse har de to ytterligere parametrene form av ytterligere reaktanter eller analoger, som tilsettes til sandwich-immunoanalysen for å bortlede overskudd antigen fra det ønskede sluttproduktet. Denne bortledning oppnås gjennom dannelsen av biprodukter i tillegg til de som vanligvis dannes i en sandwich-immunoanalyse.

Tidligere kjente sandwich-immunoanalyser gir vanligvis bare en liten mengde av følgende biprodukter til den ønskede reaksjon som gir 0-Ab^-Ag-Ab2<**->sluttproduktet:

I. O-Ab^-Ag (ufullstendig sandwich)

II. Ag-Ab2<*> (ufullstendig sandwich)

Det merkede biproduktet Ag-Ab2<*> (II) er oppløselig og bidrar ikke til mengden av bundet merking som på standard måte korreleres til mengden av antigen som er til stede i prøven. I den vanlige situasjon hvor mengden av ubundet merking som er tilbake i oppløsning detekteres som en indikasjon på mengden av tilstedeværende antigen i en testprøve vil det merkede biprodukt (II) medvirke svakt til signalet.

Når bare ubundet førsteantistoff tilsettes til et immunoanalysesystem, ifølge foreliggende oppfinnelse, dannes følgende biprodukter i tillegg til biprodukter I og II:

III. Abi~Ag-Ab2<*> (ubundet, merket sandwich)

IV. Abi-Ag (ufullstendig sandwich)

Når bare ubundet, umerket andre antistoff tilsettes til et immunoanalysesystem, dannes forskjellige biprodukter i tillegg til biprodukter I og II, nemlig:

V. 0-Ab^-Ag-Ab2 (bundet, umerket sandwich)

VI. Ag-Ab2 (ufullstendig sandwich)

I det tilfellet hvor både ubundet første antistoff og fritt, umerket andre antistoff begge tilsettes til et immunoanalysesystem, ifølge foreliggende oppfinnelse, vil alle biprodukter I-VI bli dannet, samt følgende ytterligere biprodukt :

VII. Ab1-Ag-Ab2

I tilfellet for biprodukter III-VII er det eneste ytterligere merkede biprodukt dannet ifølge foreliggende oppfinnelse, Abi~Ag-Ab2<*> (III), oppløselig og vil ikke medvirke til om-fanget av signalet som detekteres på den oppløselige bæreren.

Biprodukter har tradisjonelt blitt ansett som uønskede i en immunoanalyse. Dette er fordi reaksjonsbiprodukter forbruker små mengder av det antigen som er av interesse, og represen-terer likevel ikke det ønskede endeprodukt som søkes detektert og/eller kvantifisert. I det tilfelle hvor mengden av merking bundet til den uoppløselige bæreren detekteres som en indikasjon på mengden av tilstedeværende antigen i den prøve som analyseres, slik situasjonen vanligvis er, medvirker ingen av biproduktene til det signal som måles. Den forøkede dannelsen av reaksjonsbiprodukter har således vanligvis blitt ansett som uheldig for en immunoanalyses integritet.

Det har imidlertid uventet blitt funnet at de ytterligere biproduktene som dannes ved foreliggende oppfinnelse, ikke på uheldig måte vil påvirke en immunoanalyses nøyaktighet. Dette er fordi dannelsesgraden av biprodukter synes ha et konstant forhold til den mengde antigen som er til stede i en testprøve. M.a.o. vil forøket antigenkonsentrasjon resultere i forøket biproduktdannelse, og denne økning ble funnet å foregå på en rettlinjet måte.

Det ble også funnet at det ubundede første antistoffet virket som en analog for det første antistoffet som er bundet til den faste bæreren i en typisk sandwich-immunoanalyse. Likeledes virker det umerkede andre antistoffet ifølge oppfinnelsen som en analog for det merkede andre antistoffet i en sandwich-immunoanalyse. Disse analogene, individuelt eller samlet, hever på effektiv måte konsentrasjonen av første antistoff og/eller andre antistoff i immunoanalysesystemet i forhold til mengden av antigen som analyseres, og skaper derved en pseudoførsteorden-reaksjon. Basert på dette prinsipp har det blitt oppnådd reelle lineære kurver i immunoanalyser hvor antigenkonsentrasjonen typisk er tilstrekkelig høy slik at tidligere teknikks metoder for oppnåelse av en reell lineær standarkurve har vist seg å være ineffektive eller utilstrekkelige.

Fordelene ved foreliggende oppfinnelse i forhold til tidligere kjente metoder for oppnåelse av en reell lineær kurve i en sandwich-immunoanalyse fremgår under henvisning til føl-gende eksempler. For enkelthetens og klarhetens skyld viser følgende eksempler bare det trekk ifølge oppfinnelsen som anvender tilsetning av ubundet første antistoff, idet det skal forstås at tilsetningen av umerket, ubundet andre antistoff vil virke på en lignende måte.

I disse eksemplene ble samtidige sandwich-immunoanalyser foretatt ved bruk av et første antistoff belagt p"å en polystyrenkule og et andre antistoff konjugert med pepperrot-peroksydase (HRPO) som virkler som en enzymmerking. Poly-styrenkulene ble belagt til kapasitet med det utpekte første antistoffet for en spesiell immunoanalyse. Mengden av merket andre antistoff ble kvantifisert ifølge HPRO-enzymaktivitet, idet en enhet av ERPO-aktivitet er omtrent ekvivalent med 1 jjg av merket antistoff. Etter en første inkubasjon hvor-antistoff:antigen:antistoff-komplekset ble dannet, ble det uoppløseliggjorte komplekset isolert og underkastet en annen inkubasjon hvor en substratoppløsning for enzymmerkingen ble tilsatt for å produsere et detekterbart signal. Mengden av signal bundet til den uoppløselige bæreren ble deretter kvantifisert .

Eksempel 1

Reagenser:

1) Kuler: Polystyrenkule belagt med Ab^

2) Konjugert oppløsning: buffer, animalsk protein og

Ab2-HRP0

3) Substratoppløsning: buffer, H2O2, og o-fenylendiamin

(OPD).

Metode:

Kongugatoppløsningen inneholder 0,5 TJ av Ab2~HRP0. Analysen utføres ved inkubering av 20 jjI prøve med 250 pl konjugat-oppløsning og en Ab^-belagt kule i 20 min. ved romtemperatur under rysting. Etter den første inkubasjonen ble kulen vasket og reinkubert med 300 pl substratoppløsning i 20 min. ved romtemperatur. Reaksjonen stoppes deretter med 1,0 ml av 0,9 N svovelsyre, og måles for absorbans ved 492 nm på et spektrofotometer. Tabell I angir resultatene, som også er vist på fig. 1.

Dette eksempelet illustrerer en sandwich-immunoanalyse for hCG (human korionisk gonadotropin) under typiske analysebetingelser. hCG-antigenet er vanligvis til stede i relativt meget små mengder og krever således en analysemetode av ekstremt høy sensitivitet. Mengdeområdet for hCG-området i en testprøve er omtrent 1-100 mlU/ml, eller fra 2 x 10—<12>M til 2 x 10-<10>M. I selve reaksjonsblandingen er konsentrasjonen av hCG mindre enn lO-1^. Denne konsentrasjonen er tilstrekkelig lav til at den tidligere kjente metode for økning av Ab2<*->konsentrasjonen er effektiv når det gjelder å oppnå betingelsene for en pseudokinetisk reaksjon av første orden og således en lineær standardkurve.

Eksempel 2

Reagenser:

1) Kuler: Polystyrenkule belagt med Ab^

2) Konjugert oppløsning: Buffer, animalsk protein og

AB2-HRP0

3) Substratoppløsning: Buffer, H202, og o-fenylendiamin

(OPD)

Metode:

Analysene ble utført ved inkubering av 25 pl prøve med 300 pl konjugatoppløsning og en Ab^-belagt kule i 45 min. ved romtemperatur under rysting, fulgt av kulevasking, og en annen inkubasjon med en substratoppløsning. Reaksjonen ble deretter stoppet ved tilsetning av 1,0 pl av 0,9 N svovelsyre, og absorbansen målt ved 492 nm på et spektrof otometer. Tabell II angir resultatene, som også er vist på fig. 2.

Dette eksempelet illustrerer en sandwich-immunoanalyse for ferritin utført under typiske analysebetingelser (A), under anvendelse av den tidligere teknikksjusteringer av systemet

(B) og sluttlig anvendelse av foreliggende oppfinnelse (C) for til slutt å oppnå en reell lineær standardkurve. I

tilfelle for ferritin tilsvarer analyseområdet 5-500 ng/ml av ferritin i en gjennomsnittlig serumprøve et konsentra-sjonsområde fra 1 x 10"<10>M til 1 x 10-<9>M. Sluttkonsentrasjonen av ferritin i reaksjonsblåndingen er ca. 10~<10>m. Som angitt på fig. 2, uten noen justering av systemet annet enn maksimum ladning av Ab^ på polystyrenkulen, er standardkurven bare 60$ lineær ved den eleverte enden av analyseområdet. Tilsetningen av et 50-gangers overskudd av Ab2<* >forbedret standardkurvens linearitet opptil bare 80$.

Ubundet, eller oppløselig, Ab^ ble innført i reaksjonsblandingen for å virke som en O-Ab^-analog. Tilsetningen av oppløselig Abi antas å ha skapt biprodukter III og IV, identifisert ovenfor, som følger:

Tilsetningen av oppløselig Ab^ reduserte graden av O-Ab^-Ag-Abg<*->dannelse og produserte et lavere signal som angitt i kurve C på fig. 2. Ikke desto mindre virket tilstedeværelsen av Ab^ i tillegg til Ab^-0, slik at det ble skapt en pseudoførsteorden-reaksjon og en lineær kurve. Signalet ble forbedret ved økning av den andre inkubasjonstiden til 10 min. (D).

Eksempel 3

Reagenser:

1) Kuler: Polystyrenkule belagt med Ab^

2) Konjugatoppløsning: Buffer, animalsk protein og Abg-HRPO 3) Substratoppløsning: Buffer, H2O2 og o-fenylendiamin

(OPD)

Metode:

Forsøket ble utført ved inkubering av 20 pl prøve med 300 pl konjugatoppløsning og en Ab^-belagt kule ved romtemperatur i 30 min. under rysting. Kulen ble deretter vasket, reinkubert med 300 pl substratoppløsning, stoppet med 1 ml av 0,9 N svovelsyre og avlest ved 492 nm. Tabell 3 sammenligner ytelsesevnen av IgG-reagenser med og uten de kombinerte modifikasjonene av den tidligere teknikk og foreliggende opp-f innelse.

Dette eksempelet illustrerer en sandwich-immunoanalyse for IgE (immunoglobulin E) utført under typiske analysebetingelser (A), og også anvendelse av den kombinerte effekt av tidligere teknikks justeringer til systemet og foreliggende oppfinnelse (B) for å oppnå en reell lineær standardkurve. Ved et analyseområde på ca. 5 til 400 IU/ml i testprøven er sluttkonsentrasjonen av IgE fra 10~<10>M til 10~<9>M i reaksjonsblandingen. Uten hensiktsmessig justering av parametrene i immunoanalysesystemet er standardkurven mindre enn 50$ lineær ved analyseområdets eleverte ende. En temmelig stor mengde Ab2<*>°6 oppløselig Ab^ ble tilsatt for gi en lineær kurve (fig. 3). Dette forsøket viser at foreliggende oppfinnelse kan ta seg av ekstreme tilfeller slik som IgE uten noen vanskelighet.

En sammenligning av de grafiske fremstillinger vist på fig. 1, fig. 2 og fig. 3 demonstrerer effektiviteten av foreliggende oppfinnelse. Det ble uventet funnet at utnyttelse av foreliggende oppfinnelse gjør det mulig å gå ut over den tidligere teknikks begrensninger og således oppnå en lineær standardkurve i immunoanalyser hvor konsentrasjonen av antigenet av interesse er relativt høy.

Antigenet hCG, f.eks., som vanligvis er til stede i reaksjon sblandingen ved en konsentrasjon på mindre enn ca. 10—<11>M, lar seg benytte til effektiv behandling av tidligere kjente metoder. Ferritin og IgE er på den annen side vanligvis til stede i immunoanalyse-reaksjonsblandingen ved en konsentrasjon på henholdsvis 10~<10>M og 10~<10->10~<9>M. Disse konsentrasjonene er i det minste en størrelsesorden høyere enn hCG-konsentrasjonen i reaksjonsblandingen, og behandles således ineffektivt ved justeringer til de tidligere kjente reaksjonsparametrene alene. Ved benyttelse av foreliggende oppfinnelse ble det imidlertid oppnådd reelle lineære standardkurver for ferritin- og IgE-immunoanalyser.

Eksemplene som er beskrevet ovenfor, er kun eksempler på anvendelse av foreliggende oppfinnelse i ferritin- og IgE-sandwich-immunoanalyser. Fagfolk vil forstå at variasjoner i de beskrevne prosesser i disse eksemplene vil være nyttige i andre Immunoanalyser. Innbefattet i disse andre immuno-analysene er analyser for hormonene: prolaktin, HLH (human leutiniserende hormon), FSH (follikkelstimulerende hormon), gastrin, PTH (parathyroidhormon), HGH (human veksthormon), og ACTH (adrenokortikotropisk hormin); den infektiøse sykdom: hepatitt; tumormarkørene: CEA (karsino-embryonisk antigen), PAP (prostatsur fosfatase, og a-fetoprotein; samt: CPK-MB (kreatinfosfokinase-MB), og insulin, blant andre. Foreliggende oppfinnelse skal derfor anses begrenset bare av de medfølgende krav.

Den heri benyttede betegnelse "antigen" skal innbefatte enhver substans til hvilken antistoffer kan produseres og innbefatter følgelig haptener, som kan ha vært gjort antigeniske for det formål å produsere antistoffer.

Den heri benyttede betegnelse "antistoff" skal innbefatte både polyklononale og monoklonaleantistoffer, og inkludere videre referanse til intakte antistoffer og til fragmenter derav som inneholder antistoffets bindingsområde. Slike fragmenter kan være fragmenter av Fab-typen som er definert som fragmenter som mangler Fc-delen, f.eks. Fab-, Fab<1-> og F(ab<1>)2-fragmenter, eller kan være såkalte "halvmolekyl"-fragmenter oppnådd ved reduktiv spaltning av disulfid-bindingene som forbinder tungkjedekomponentene i det intakte antistoffet.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte for utførelse av en immunologisk bestemmelse av et antigen i en vaeskeprøve, karakterisert ved at man danner et kompleks mellom antigenet og minst to antisttoffer, hvorved et av de nevnte antistoffene utgjøres av et første antistoff som er bundet til en uoppløselig bærer, og et av de nevnte antistoffene utgjøres av et andre, ubundet, merket antistoff, hvorigjennom en del av de nevnte merkede antistoffene bindes til den uoppløselige bæreren via nevnte kompleks, og tilfører et ytterligere antistoff valgt blant et umerket, ubundet førsteantistoff, et umerket, ubundet andre antistoff, og blandinger derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det merkede antistoffet er merket med et medlem fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemilumine-scerende forbindelser, bioluminiscerende forbindelser, fluorescerende forbindelser, fosforescerende forbindelser, enzymer, enzym-kofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lecitiner, metall-chelatorer, og derivater derav.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at konsentrasjonen av antigen i reaksjonsblandingen i den immunologiske bestemmelsen er større enn ca. 10-<11>M.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at antigenet velges fra gruppen bestående av ferritin og IgE.

5. Immunologisk bestemmelsesfremgangsmåte der det oppnås en linær standardkurve for bestemmelse av et antigen i en væskeprøve der antigenets konsentrasjon i reaksjonsopp-løsningen er minst 10_11]VI, karakterisert ved at man: (a) bringer væskeprøven i kontakt med et første antistoff som bundet til en uoppløselig bærer, et andre ubundet merket antistoff, og med et ytterligere antistoff valgt fra gruppen bestående av et umerket, ubundet første antistoff, umerket, ubundet andre antistoff, og blandinger derav, hvorved det dannes et uopp-løselig kompleks av bundet første antistoff:antigen:-merket andre antistoff, idet nevnte ytterligere antistoff kompleksdannes med antigenet til dannelse av biprodukter til reaksjonen som avgir det uoppløse-lige komplekset; (b) separerer nevnte uoppløselige kompleks fra væske-prøven, antistoffet, som ikke har reagert og fra eventuelle oppløselige biprodukter; (c) detekterer enten mengden av merket, andre antistoff som er bundet til den uoppløselige bæreren eller mengden av ureagert, merket andre antistoff som ikke har reagert.

6. Fremgangsmåte ifølge krav 5, karakterisert ved at det merkede antistoffer er merket med et element valgt fra gruppen bestående av radioisotoper, kjemilumine-scerende forbindelser, bioluminescerende forbindelser, fluorescerende forbindelser, fosforescerende forbindelser, enzymer, enzym-kofaktorer, haptener, antistoffer, avidin, biotin, karbohydrater, lecitiner, metall-chelatorer, og derivater derav.

7. Reagens, karakterisert ved at den innbefatter (a) et første antistoff mot et antigen, hvorved nevnte første antistoff er bundet til en uoppløselig bærer; (b) et andre antistoff mot nevnte antigen, hvorved nevnte andre antistoff er ubundet og merket; og (c) ytterligere et antistoff valgt fra gruppen bestående av umerket, ubundet første antistoff, et umerket, ubundet andre antistoff, og blandinger derav.

8. Fremgangsmåte for immunologisk bestemmelse av et antigen i en væskeprøve, karakterisert ved at man danner et kompleks mellom antigenet i prøven og minst to antistoffer, hvorved et av de nevnte antistoffene er et første antistoff som er bundet til en uoppløselig bærer, og et av de nevnte antistoffene er et andre, ubundet, merket antistoff, hvorigjennom en del av nevnte merkede antistoffer bindes til den uoppløselige bæreren via nevnte kompleks, og tilsetter en umerket, ubundet analog til det nevnte første antistoffet.

9. Fremgangsmåte for immunologisk bestemmelse av et antigen i en væskeprøve, karakterisert ved at man danner et kompleks mellom antigenet i prøven og minst to antistoffer, hvorved ett av de nevnte antistoffene er et første antistoff som er bundet til en uoppløselig bærer, og et av nevnte antistoffene er et andre, ubundet merket antistoff, hvorigjennom en del av de nevnte merkede antistoffene bindes til den uoppløselige bæreren via nevnte kompleks, og tilsetter en umerket, ubundet analog til det andre antistoffet.

10. Fremgangsmåte for immunologisk bestemmelse av et antigen i en væskeprøve, karakterisert ved at man danner et kompleks mellom antigenet i prøven og minst to antistoffer, hvorved ett av nevnte antistoffene er et første antistoff som er bundet til en uoppløselig bærer, og et av nevnte antistoffene er et andre, ubundet, merket antistoff, hvorigjennom en del av de nevnte merkede antistoffene bindes til den uoppløselige bæreren via nevnte kompleks, og deretter tilsetter umerkede, ubundede analoger til det første og det andre antistoffet.