NO174161B

NO174161B - Fremgangsm}te for fremstilling av humane interferon-gamma-polypeptidderivater, og rekombinante plasmider inneholdendeet DNA-fragment som koder for polypeptidene

Info

Publication number: NO174161B
Application number: NO845132A
Authority: NO
Inventors: Seiga Itoh; Susumu Sekine; Akiko Saito; Moriyuki Sato
Original assignee: Kyowa Hakko Kogyo Kk
Priority date: 1983-12-26
Filing date: 1984-12-20
Publication date: 1993-12-13
Also published as: DE146944T1; DK168016B1; DK147292A; ES539068A0; DK610884A; US4758656A; DK147292D0; AU580748B2; AU3718484A; DK610884D0; EP0146944A3; NO174161C; EP0146944A2; DE3486111D1; NO845132L; IL73892A0; ES8606490A1; EP0146944B1; IL73892A; CA1303528C

Description

Interferoner (i det følgende betegnet IFN) kan såvidt

vites klassifiseres i tre store grupper, nemlig IFN-a,

IFN-3 og IFN-Y- IFN-a fremstilles hovedsakelig fra leukocytter, IFN-3 fra fibroblaster, og IFN-y fra T-lymfocytter. Disse interferoner er blitt notert som biologisk aktive stoffer med antiviral aktivitet, aktiverende egenskaper på naturlige killer-celler og makrofager, antitumor-aktivitet og lignende. Overføringsmetodene for oppnåelse av interferoner ved isolering fra leukocytter og dyrkede celler kan imidlertid ikke gi dem i tilstrekkelig mengde.

Rekombinant DNA-teknologi er nå blitt utviklet i en slik

grad at masseproduksjon av stoffer som bare utskilles i en liten mengde i celler fra høyere dyr og er vanskelige å isolere, slik som IFN, er blitt mulig ved anvendelse av mikroorganismer. F.eks. ble mRNA fra IFN-3 og IFN-a isolert fra celler, og DNA komplementær til mRNA (cDNA) ble syntetisert enzymatisk og klonet i Escherichia coli [Tanigichi,

et al.: Proe. Jap. Acad., 55 (B) 464-469 (1979), Nagata, et al.: Nature 284, 316-320 (1980)].

Hva angår IFN-y er det rapportert at det har en sterkere celleinhiberende aktivitet enn andre IFN-materialer basert på det forsøk som gjør bruk av animalske celler [B.Y. Rubin og S.L. Gupta: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 77, 5928-5932

(1980)]. Videre er kloning av en IFN-y cDNA inn i Escherichia coli og bestemmelse av dens basesekvens nylig rapportert [P.W. Gray, et al.: Nature 295, 503 (1982), R. Devos,

et al.: Nucleic Acids Research 10, 2487 (1982)].

Det er blitt rapportert at fjerning av 11 aminosyrer fra den C-terminale ende av IFN-a nedsatte den spesifikke aktivitet til en tredjedel [A.E. Franke et al.: DNA 1, 223-230 (1982)], mens addisjon av 18 aminosyrer til den N-terminale ende av IFN-a ikke endrer den spesifikke aktivitet [R.M. King et al.: J. Gen. Virol. 64, 1815-1818 (1983)].

Enkelte derivater av IFN-y er kjent fra NO 833542.

Det naturlige IFN-y har Lys i aminosyreposisjon 9 og denne forbindelsen er kjent fra den modifiserte utgave med Gin i aminosyreposisjon 9 (NO patentsøknad nr. 833543).

Oppfinnerne i foreliggende oppfinnelse har konstruert et derivat hvori den tredje aminosyre i IFN-y som vist i tabell 1, cystein (Cys) ble erstattet med tyrosin (Tyr) (i det følg-ende betegnet 3-Tyr-IFN-y) og fant at den spesifikke aktivitet var 2-4 ganger sterkere enn for moderstoffet IFN-y. Videre konstruerte man de derivater hvori Cys i stilling 1 var erstattet med serin (Ser) (1-Ser-IFN-y), Cys i stilling 3 var erstattet med Ser (3-Ser-IFN-y), Cys i stilling 1 og 3 var erstattet med Ser (1,3-Ser-IFN-y) og N-terminale aminosyrer av IFN-y vist i tabell 1 var sløyfet. Det ble for alle derivater sammenlignet med utgangsmaterialet IFN-y detektert tilsvarende eller større interferonaktivitet.

Foreliggende oppfinnelse angår således en fremgangsmåte for fremstilling av et derivat av det humane interferon-y polypeptid, hvilken fremgangsmåte er kjennetegnet ved at en E. coli-stamme transformeres med et av de rekombinante plasmidene pGVA-4, pGVK-13, pGWC-10, pGVL-10, pGVM-101 eller pGWE-4 som koder for henholdsvis (Tyr-3, Gln-9)y-IFN, (Ser-1,3, Gln-9)y-IFN, (des 1-7, Gln-9)IFN-y, (Ser-1, Gln-9)y-IFN, (Ser-3, Gln-9)IFN-y eller (des 1-4, Gln-9)IFN-y, kulturene dyrkes, polypeptidet akkumuleres i mediet og isoleres fra dette. Oppfinnelsen angår enn videre et rekombinant plasmid, som er kjennetegnet ved at det er valgt fra plasmid pGVA-4, pGVK-13, pGWC-10, pGVL-10, pGVM-101 eller pGWE-4 som er deponert i Escherlchla coli med deponeringsnummer FERM BP-395, 432, 397, 544, 545 og 546.

På tegningen viser:

fig. 1 flytskjema for konstruksjon av pGBD-1,

fig. 2 flytskjema for konstruksjon av pGSB-6 og pGVA-4,

fig. 3 flytskjema for konstruksjon av pGKV-13,

fig. 4 flytskjema for konstruksjon av pGWC-10,

fig. 5 flytskjema for konstruksjon av pGVL-10,

fig. 6 flytskjema for konstruksjon av pGVMlOl, og fig. 7 flytskjema for konstruksjon av pGWE-4.

Escherichia coli inneholdende pIFNy-G4 er blitt deponert i American Type Culture Collection, USA, under nummeret ATCC 39123.

Basesekvensen for IFN-y-DNA i pIFNy-G4 ble bestemt ved metoden ifølge Maxam og Gilbert [Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560

(1977)] og er vist i tabell 1.

Sammenligning av den humane IFN-y-cDNA i pIFNy-G4 og

den kjente IFN-y-cDNA [R. Devos, et al.: Nucleic Acids Research, 10, 2487 (1982)] avslører følgende. Den første basen [adenin (A)] av den triplet som koder for lysin

(den niende aminosyre i det modne humane IFN-y-polypeptid)

i det kjente IFN-y, erstattes med cytosin (C) pIFNy-G4

cDNA. Følgelig er den niende aminosyren fra den N-terminale enden av det humane IFN-y-polypeptid innkodet med pIFNy-G4-cDNA glutamin og ikke lysin. Det er derfor innlysende at pIFNy-G4 koder for et nytt humant IFN-y-polypeptid.

Derivater av IFN-y oppnådd ved fjerning eller erstatning

av aminosyrer i IFN-y vist i tabell 1 er også nye IFN-y-derivater.

Som plasmid for inkorporering av en DNA som koder for IFN-y-derivat kan anvendes et hvilket som helst plasmid så lenge DNA inkorporert deri kan uttrykkes i Escherichia coli. Fortrinnsvis anvendes et plasmid hvori en fremmed DNA kan innsettes etter en egnet promotor slik som trp-promotor eller lac-promotor, og lengden mellom Shine-Dalgarno-sekvens (i det følgende benevnt SD-sekvens) og initieringskodon (ATG) innstilles, f.eks. til 6-18 basepar. Fore-trukne eksempler er pKYPlO, pKYPll og pKYP12, som ble konstruert av oppfinnerne i foreliggende oppfinnelse (japansk publisert ikke-undersøkt patentsøknad nr. 110600/83).

Som vist på tegningens fig. 1 spaltes pIFNa-G4 med PvuII, og BamHI-kjededanner innføres i spaltningssetet for oppnåelse av pGBD-1.

Deretter oppsluttes pGBD-1 med Sinl og BamHI, og et fragment på ca. 850 bp renses ved lavgeleringstemperatur-agarosegel-elektroforese (LGT-metoden) [L. Wieslander: Analytical Biochemistry 98, 305 (1979)]. pKYPlO nedbrytes med

Clal og BamHI, og et fragment på ca. 4,3 kb renses. De således oppnådde DNA fragmenter og en syntetisk DNA er vist på fig. 2, som koder for Tyr som den tredje aminosyre, ligeres med T4-DNA-ligase for oppnåelse av pGSB-6. Deretter nedbrytes pGSB-6 med Clal og underkastes ifyllingsreaksjon med DNA-polymerase I og ligeringsreaksjon med T4-DNA-ligase for oppnåelse av pGVA-4. Den samme prosedyre gjentas med unntagelse av at man benytter den syntetiske DNA, som er vist på fig. 3, som koder Ser, som den første og tredje aminosyre for oppnåelse av plasmid pGVK-13, som koder for et derivat, hvori første og tredje aminosyre

fra den N-terminale enden i IFN-y, Cys, er erstattet-med Ser.

For å oppnå IFN-y-derivat, hvori N-terminale aminosyrer

er fjernet, som vist på fig. 4, nedbrytes pGKA-2 med Clal, behandles med Bal31 i et kort tidsrom på 1-30 minutter

for å utskjære den DNA som koder for N-terminal aminosyre i IFN-y, og behandles med Pstl, og et fragment på 4,3 kb

renses. Separat nedbrytes vektor pTrS-3 inneholdende initieringskodon med SphI, behandles med DNA-polymerase I

og nedbrytes med Pstl, og et fragment på 880 bp renses.

Begge fragmenter ligeres med T4-ligase for oppnåelse av pGWC-10.

Reaksjonsbetingelser som er nødvendige for den rekombinante DNA-teknologi beskrevet i det foregående, er generelt som følger.

Nedbrytning av DNA med restriksjonsenzymer utføres vanligvis ved å omsette 0,1-20 yg DNA med 0,1-100 enheter, fortrinnsvis 1-3 enheter restriksjonsenzym pr. yg DNA i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis 10-40 Tris-HCl (ph 6,0-9,5, fortrinnsvis pH 7,0-8,0), 0-200 mM NaCl og 2-20 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2 ved 20-70°C,(optimal temperatur avhenger av benyttede restriksjonsenzymer)i fra 15 min.

til 24 timer. Reaksjonen stanses vanligvis ved oppvarming til 55-75°C i 5-30 min. eller også ved å inaktivere restriksjonsenzymet med reagensen slik som fenol eller dietylpyrokarbonat.

Rensing av DNA-fragmentene dannet ved nedbrytningen med restriksjonsenzymer utføres ved LGT-metoden eller poly-akrylamidgel-elektroforese fA.M. Maxam, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA 74, 560 (1977)].

Ligering av DNA-fragmentene utføres med 0,3-10 enheter T4-DNA-ligase i en blanding av 2-200 mM, fortrinnsvis

10-40 mM Tris-HCl (pH 6,1-9,5, fortrinnsvis 7,0-8,0),

2-20 mM, fortrinnsvis 5-10 mM MgCl2, 0,1-10 mM, fortrinnsvis 0,5-2,0 mM ATP og 1-50 mM, fortrinnsvis 5-50 mM ditiotreitol ved 1-37°C, fortrinnsvis 3-20°C i fra 15 min. til 72 timer, fortrinnsvis 2-20 timer. Det rekombinakte plasmid DNA som dannes ved ligeringsreaksjonen, innføres i Escherichia coli ved transformasjonsmetoden ifølge Cohen et al.

[S.N. Cohen, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA 69, 2110

(1972)], om nødvendig. Isolering av det rekombinante pladmid DNA fra Escherichia coli, som bærer DNA-materiale, utføres ved den metode som er beskrevet i eksempel 1 eller ved metoden ifølge Birnboim, et al. [H. C. Birnboim, et al:: Nucleic Acids Res. 7, 1513 (1979)]. Plamid DNA nedbrytes med 1-10 typer restriksjonsendonukleaser, og spaltningssetene undersøkes ved agarosegel-elektroforese eller polyakrylamidgel-elektroforese. Videre undersøkes, om nødvendig, basesekvensen for DNA ved metoden ifølge Maxam-Gilbert [Proe. Nati. Acad. Sei. 74, 560 (1977)].

Derivatet av IFN-y-polypeptidet fremstilt ifølge oppfinnelsen fremstilles ved følgende metode.

Escherichia coli K-12 HB101 transformeres med et plasmid,

slik som pGVA-4, og en Escherichia coli-stamme som bærer pGVA-4 utvelges fra ampicillinresistente kolonier (i det følgende betegnet Ap<R>). Den Escherichia coli-stamme som bærer pGVA-4, dyrkes i et medium for fremstilling av et derivat av IFN-y-polypeptid i de dyrkede celler.

Som medium kan benyttes enten et syntetisk medium eller

et naturlig medium så lenge det er egnet for dyrking av Escherichia coli og produksjonen av derivatet av IFN-y-polypeptid .

Som karbonkilde kan anvendes glukose, fruktose, laktose, glycerol, mannitol, sorbitol, osv.

Som nitrogenkilde kan anvendes NH^Cl, (NH4)2S04, kasaminosyre, gjærekstrakt, polypepton, kjøttekstrakt, baktotrypton, maisstøpevæske, osv.

Dessuten kan næringsstoffer slik som K2HPC>4, KH2P04, NaCl, MgS04, vitamin B^^ og MgCl2 anvendes.

Dyrking foretas ved pH 5,5-8,5 og ved 18-40°C med lufting

og omrøring.

Etter dyrking i 5-90 timer akkumuleres derivatet av humant IFN-y-polypeptid i dyrkede celler. De oppsamlede celler behandles med lysozym, åpnes ved gjentatt frysing og opp-ting og underkastes sentrifugering. Den således oppnådde supernatantvæske underkastes ekstraksjon etter en konvensjonell metode for ekstraksjon av polypeptider for utvinning av polypeptidet.

Bestemmelse av humant IFN-y utføres ifølge metoden til Armstrong [J.A. Armstrong, et al.: Appl. Microbiol. 21, 723-725 (1971)].

Oppfinnelsen forklares nærmere ved hjelp av nedenstående eksempler.

E ksempel 1

Konstruksjon av plasmid pGBD-1 med BamHI-spaltningssete nedstrøms fra IFN-y-genet:

I dette eksempel ble 2 yg plasmid pIFNy-G4 [3,6 kilobaser

(i det følgende betegnet Kb)] oppløst i 50 yl (totalvolum)

av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5),

10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 50 mM NaCl (i det føl-gende betegnet "Y-50 bufferoppløsning"). Deretter ble fire enheter restriksjonsenzym PvuII tilsatt, og nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37 °C i 2 timer. 1 ug DNA-fragment (3,6 kb) pIFNy-G4 ble renset ved LGT-metoden. 0,1 pg av DNA-fragmentet og 5 pmol 5'-fosforylert BamHI-kjededanner (5'-pCCGGATCCGG-3') ble ligert ved 4 °C i 18 timer med 2 enheter T4-ligase i 20 ul av en bufferoppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 0,5 mM ATP (i det følgende betegnet "T4-ligasebufferoppløsning" ).

Escherichia coli HB101 [Boliver, et al.: GENE 2, 75 (1977)] ble transformert under anvendelse av det således oppnådde rekombinante plasmid DNA ved metoden ifølge Cohen, et al.

[S.N. Cohen, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 69, 2110

(1972), hvilken metode anvendes for transformasjon av Escherichia coli i det følgende) for oppnåelse av en AP TD-koloni. Plasmid DNA ble isolert fra transformanten ved den kjente metode [H.C. Birnboim, et al.: Nucleic Acids Res., 7, 1513 (1979), hvilken metode anvendes for isolering av plasmid DNA i det følgende]. DNA'en ble nedbrutt med restriksjonsendonukleaser slik som BamHI, og dens struktur ble analysert for å erkjenne at rekombinant plasmid pGBD-1, hvori BamHI-kjededanner var innsatt i PvuII-setet i pIFNy-G4, var oppnådd. Escherichia coli-stamme som bærer plasmid pGBD-1 er deponert i Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Tecknology (i det følgende betegnet FERM) som Escherichia coli IGBD-1 (FERM BP-394) .

Eksempel 2

Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVA-4 som koder for 3-Tyr-IFN-y: pGBD-1 oppnådd i eksempel 1 ble behandlet ved følgende metode for fjerning av modifikasjonen av DNA og danne Sinl-spaltningssetet i plasmidet. Escherichia coli GM31

(thr leu dem his thi ara lac galK, galT, xyl mtl str

tonA) [Marinus, et al.: Molec. Gen. Genet. 127, 47-55

(1973)] ble transformert med pGBD-1 ved en konvensjonell metode. Det ble fremstilt en stor mengde pGBD-1 fra de således oppnådde kolonier ved en konvensjonell metode.

6 yg av den således oppnådde pGBD-1 DNA ble oppløst i 50 yl Y-50 bufferoppløsning. 10 enheter Sinl (produkt fra Bio

Tech Co.) ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble det tilsatt NaCl til en sluttkonsentrasjon på 100 ym og 10 enheter BamHI. Nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 3 timer. Det ble oppnådd ca. 0,8 yg DNA-fragment på ca. 850 basepar (i det følgende betegnet bp) inneholdende størstedelen av human IFN-y-DNA fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.

Separat ble 3 yg pKYPlO fremstilt ved den metode som er beskrevet i japansk publisert ikke-undersøkt patentsøknad nr. 110600/83, oppløst i 40 yl (totalvolum) av en buffer-oppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 100 mM NaCl (i det følgende betegnet "Y-100 bufferoppløsning") og 5 enheter Clal, og BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37 °C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det ved LGT-metoden oppnådd ca. 1,8 ug DNA-fragment på ca. 4,3 Kb inneholdende tryptof an-promotor ( Ptrp)

Modent humant IFN-y-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For å endre den tredje aminosyren (Cys) til

Tyr og for å tilveiebringe et initieringskodon (ATG) som

er nødvendig for ekspresjon like før den første Cys, ble følgende DNA-linker syntetisert.

To enkeltkjedede DNA'-er av 17-mer og 18-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea. et al:

Proe. Nati. Acad. Sei., 75, 5865 (1978)]. Deretter ble

2 yg av den 17-mere og av den 18-mere DNA oppløst i 40 yl

(totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgC12, 5mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotidkinase (produkt fra

Takara Shuzo Co.) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon utført ved 37°C i 60 minutter.

0,4 yg av Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp oppnådd som i det foregående og avledet fra pGBD-1 og 1,0 yg av Clal-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 Kb av ekspresjonsvektoren pKYPlO oppnådd som i det foregående, ble oppløst i 25 yl T4-ligase-bufferoppløsning. Ca. 0,1 yg av DNA-kjededanneren nevnt i det foregående, ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4-DNA-ligase. Ligeringsreaksjonen ble utført ved 4°C i 17 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den oppnådde rekombinante plasmidblanding for oppnåelse av en APR-koloni. Et plasmid pGSB-6 som vist på fig. 2 ble isolert fra dyrkningsvæsken for kolonien. Strukturen til pGSB-6 ble bekreftet ved nedbrytning med EcoRI, Clal og BamHI og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Silbert [A.M. Maxam, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA 74 560 (1977)], at basesekvensen rundt Clal-Sinl i plasmidet pGSB-6 er

Det humane IFN-y-polypeptid som er innkodet av pGSB-6 (derivatet betegnes i det følgende 3-Tyr-IFN-y) er klart forskjellig fra det humane IFN-y-polypeptid ved at den tredje aminosyren (Cys) for modent humant IFN-y er erstattet med Tyr.

Deretter ble en 1 yg pGSB-6 oppløst i 30 yl (totalvolum) Y-50 bufferoppløsning, og 2 enheter Clal ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjonen ble utført ved 37°C i 2 timer. Et DNA-fragment ble utvunnet ved fenolekstraksjon, kloroformekstraksjon og etanolutfelling. DNA-fragmentet ble oppløst i 30 yl av en oppløsning bestående av 67 mM Tris-HCl

(pH 8,8), 6,7 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetanol, 6,7 yM EDTA, 16,6 mM (NH4)2S04, 1 mM dATP, 1 mM dCTP, 1 mM dGTP og 1 mM dTTP, og 5 enheter T4-DNA-polymerase (produkt fra Takara Shuzo Co.) ble tilsatt etterfulgt av ifyllingsreaksjon ved 37°C i 1 time. Et DNA-fragment ble utvunnet ved fenolekstraksjon, kloroformekstraksjon og etanol-utf elling. 0,1 yg av DNA-fragmentet ble oppløst i 50 yl T4-ligase-bufferoppløsning. To enheter T4-ligase ble tilsatt, og ligeringsreaksjon utført ved 4°C i 16 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den således oppnådde DNA-blanding, og plasmid DNA, pGVA-4, ble utvunnet fra den dannede Ap p-koloni. Strukturen til pGVA-4 ble bestemt ved spalting med Nrul, BamHI og EcoRI. Basesekvensen mellom SD og ATG for pGVA-4 ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam og Gilbert som beskrevet i det foregående og illustrert i det følgende.

Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGVA-4, er deponert hos FERM som Escherichia coli IGVA-4 (FERM BP-395) .

Eksempel 3

Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVK-13 som koder for 1,3-Ser-IFN-y:

6 yg pGBD-l-DNA oppnådd som i eksempel 1 ble oppløst i

50 yl Y-50-bufferoppløsning. 10 enheter Sinl (produkt fra Bio Tee Co.) ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble NaCl tilsatt til en sluttkonsentrasjon på 100 mM, og 10 enheter BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,8 yg DNA-fragment på ca. 850 bp inneholdende størstedelen av den humane IFN-y-DNA ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden. Separat ble 3 yg pKYP-10 oppløst i 40 yl (totalvolum) Y-100 bufferoppløsning og 5 enheter av hver av stoffene Hind III og BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det oppnådd ca.

1,8 yg DNA-f ragment med ca. 4,3 Kb inneholdende P^. ved

trp LGT-metoden.

Modent humant IFN-y-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For å endre den første og den tredje aminosyren (Cys) til Ser og for oppnåelse av et initieringskodon (ATG) som er nødvendig for ekspresjon like før den første Ser, ble følgende DNA-kjededanner syntetisert

To enkeltkjedede DNA'er av 20-mer og 19-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., 75, 5765 (1978)]. Deretter ble 2 yg av såvel den 20-mere som den 19-mere DNA oppløst i 40 yl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA

og 1 mM ATP. 30 enheter T4-nukleotidkinase (produkt fra Takara Shuzo Co.) ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon ble ut-ført ved 37°C i 60 minutter.

0,4 yg av Sin I-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp oppnådd.i det foregående og avledet fra pGBD-1 og 1,0 yg av Hindlll-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 kb av ekspresjonsvektoren

pKYPlO oppnådd i det foregående, ble oppløst i 25 yl T4-ligase-bufferoppløsning. Ca. 0,1 yg av DNA-kjededanneren som nevnt i det foregående, ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetningen av 6 enheter T4-DNA-ligase. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 17 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert ved benyttelse

av den oppnådde rekombinante plasmide blanding for oppnåelse av en Ap -koloni. Et plasmid, pGVK-13, vist på fig. 3,

ble isolert fra dyrkningsvæsken for kolonien. Strukturen av pGVK-13 ble bekreftet ved nedbrytning med EcoRI, Hindlll, Clal og BamHI og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert, at basesekvensen fra Hindlll-setet til Sinl-setet i plasmidet pGVK-13 er som følger.

Det humane IFN-y-polypeptid innkodet av pGVK-13 (derivatet betegnes i det følgende 1,3-Ser-IFN-y) er klart forskjellig fra det humane IFN-y-polypeptid ved at første og tredje aminosyre (Cys) i modent humant IFN-y er erstattet med Ser. Escherichia coli-stamme som bærer plasmid pGVK-13,

er deponert hos FERM som Escherichia coli IGVK-13 (FERM BP-432).

Eksempel 4

Konstruksjon av plasmid pGWC-10 som koder for det polypeptid hvori et N-terminalt område av humant IFN-y er fjernet: 25 yg pGKA-2 (5,2 Kb) oppnådd ved fremgangsmåten ifølge referanseeksempel 2 ble oppløst i 400 yl av en buffer-oppløsning bestående av 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 10 mM NaCl (i det følgende betegnet "Y-10 - bufferoppløsning"). 50 enheter Clal (produkt fra Boehringer Mannheim GmbH) ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon utført ved 37°C i 3 timer. Til 80 yl av reaksjonsoppløsningen inneholdende 5 yg DNA Die det tilsatt 12 yl 10-fold konsentrert BAL31-bufferoppløsning [200 mM Tris-HCl (pH 8,1), 1 M NaCl, 120 mM CaCl2], 28 yl vann og 0,25 enheter nuklease-BAL31, reaksjon ble utført ved 30 "C i 20 sekunder. BAL31 har den aktivitet for exonuklease som nedbryter et DNA-molekyl fra enden, og ca. 30 basepar DNA fra Clal-setet.

ble nedbrutt under de ovennevnte betingelser. DNA ble utvunnet fra reaksjonsoppløsningen ved fenolekstraksjon, kloroformekstraksjon og etanolutfelling. 1,0 yg av det således utvunnede pGKA-2-fragment nedbrutt med Clal og BAL31

ble oppløst i 20 yl Y-50 bufferoppløsning. 2 enheter Pstl ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det utvunnet 0,5 yg DNA-fragment på ca. 4,3 Kb ved LGT-metoden.

Deretter ble 5,0 yg ATG-ekspresjonsvektor pTrS3 (3,8 Kb) oppløst i 40 yl Y-50 bufferoppløsning. 10 enheter SphI (produkt fra BRL) ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon utført ved 37°C i 3 timer. Etter fenolekstraksjon og kloroformekstraksjon ble det utvunnet ca. 3,0 yg DNA-fragment ved etanolutfelling. Ca. 3,0 yg av DNA-fragmentet ble oppløst i en oppløsning bestående av 67 mM Tris-Hcl (pH 8,3), 6,7 mM MgCl2, 10 mM merkaptoetanol, 6,7 yM EDTA og 16,6 mM (NH4)2S04, og 1 mM av hvert av stoffene dATP, dTTP, dCTP og dGRP ble tilsatt. Videre ble det tilsatt 6 enheter T4-DNA-polymerase (produkt fra Takara Shuzo Co., hvilket også gjelder det følgende), og reaksjonen ble utført ved 37°C i 1 time for nedbrytning av den fremstikkende ende. Etter fenolekstraksjon ble det ved etanol-utf elling utvunnet 1,0 yg DNA-fragment. 1,0 yg av DNA-fragmentet ble oppløst i 20 yl (totalt volum) Y-50-buffer-oppløsning. 2 enheter Pstl ble tilsatt, og nedbrytnings-, reaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjons-oppløsningen ble utvunnet 0,5 yg DNA-fragment på ca.

880 bp inneholdende P^ ved LGT-metoden.

r trp

0,5 yg Clal-Pstl-fragment (ca. 4,3 Kb) av pGKA2 oppnådd i det foregående og 0,5 yg pTrS3-SphI-T4-polymerase-PstI-fragment (880 bp) oppnådd som i det foregående, ble oppløst i 10 yl (totalvolum) T4-ligase-bufferoppløsning. 0,3 enheter T4-DNA-ligase ble tilsatt, og ligeringsreaksjon utført ved 4°C i 18 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den således oppnådde rekombinante plasmidblanding, og plasmid DNA ble utvunnet fra Ap -kolonien som var dannet, for oppnåelse av pGWC-10 som vist på fig.' 5. Strukturen til pGWC-10 ble funnet ved nedbrytning med EcoRI, Clal og BamHI og agarosedel-elektroforese. Det ble bekreftet ved fremgangsmåten ifølge Maxam og Gilbert at sekvensen ved den N-terminale enden av det humane IFN-y-strukturen i

pGWC-10 var som følger:

Det ble også bekreftet at 7 aminosyrer fra den N-terminale aminosyren (Cys) til den syvende aminosyren (Tyr) i det modne humane IFN-y-polypeptid, var fjernet, og at det humane IFN-y-polypeptidderivat startet med den åttende aminosyren (Val) [derivatet betegnes IFN-y(£1-7)]. Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGWC-10, er blitt deponert hos FERM som Escherichia coli IGWC-10 (FERM BP-397).

Eksempel 5

Fremstilling av IFN-y-derivater med Escherichia coli-stammer som bærer pGBD-1, pGVA-4, pGVK-13 og pGWC-10: Escherichia coli HBlOl-stammer som bærer rekombinante plasmider pGBD-1, pGVA-4, pGVK-13 og pGWC-10 oppnådd i eksempel 1-4,

som betegnes IGBD-1, IGVA-4, IGVK-13 og IGWC-10, ble dyrket ved 37°C i 18 timer i LG-medium (10 g trypton, 5 g gjærekstrakt, 5 g NaCl, 2 g glukose, 1 liter vann, innstilt til pH 7,0 med NaOH). 0,2 ml av dyrkningsvæsken ble podet over i 10 ml MCG-medium (0,6% Na2HP04, 0,3% KH2P04, 0,5%

NaCl, 0,1% NH4C1, 0,5% glukose, 0,5% kasaminosyre, 1 mM

MgS04, 4 yg/ml vitamin B^, pH 7,2) og dyrkning ble utført

ved 30°C i 4 timer. Deretter ble 10 yg/ml indolakrylsyre

(i det følgende betegnet IAA), som er en induser for tryptofan-operon, tilsatt, og dyrkning ble fortsatt i 4 timer. Dyrkningsvæsken ble sentrifugert ved 8000 omdr./min.

i 10 minutter, og de høstede celler ble vasket med buffer-

oppløsning inneholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl

(pH 7,5). Vaskede celler ble suspendert i 1 ml av den

i det foregående beskrevne bufferoppløsning og 5 yl av en oppløsning inneholdende 200 yg lysozym og 0,25 M EDTA (etylendiamintetraeddiksyre) ble tilsatt. Blandingen ble hensatt ved 0°C i 30 minutter, og frysing og tining ble gjentatt 3 ganger for å bryte cellene. De brutte celler ble sentrifugert ved 15000 omdr./min. i 30 minutter for oppnåelse av en supernatant. Mengden av interferon i supernatanten ble bestemt ifølge metoden til Armstrong [J.A. Armstrong, et al.: Appl. Microbiol. 21, 723-725

(1971)], hvori Sindvis-virus ble benyttet som virus, og FL-celler avledet fra humane amnionceller ble benyttet som dyrecellene. Resultatene er angitt i tabell 2.

IGKA-2 er en stamme som bærer plasmid pGKA-2, som koder for IFN-y.

Eksempel 6

Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVLlO som koder for 1-Ser-IFN-y: 6 yg pGBDl DNA oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i 50 yl Y-50 bufferoppløsning. 10 enheter Sinl ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble det tilsatt NaCl til en sluttkonsentrasjon på

100 mM, og 10 enheter BamHI ble tilsatt. Nedbrytnings-reaks jon ble utført ved 37°C i 3 timer. Det ble oppnådd ca. 0,8 yg DNA-fragment med ca. 850 bp inneholdende største-delen av den humane IFN-y-DNA fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.

Separat ble 3 yg pKYPlO DNA fremstilt ved den metode som

er beskrevet i japansk publisert ikke-undersøkt patent-søknad nr. 110600/83, oppløst i 40 yl (totalvolum) Y-50-bufferoppløsning, og 5 enheter av hvert av stoffene Hindlll og BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det ved LGT-metoden oppnådd ca. 1,8 yg DNA-fragment på ca. 4,3 Kb inneholdende tryptofan-<p>romotor (<p>trp)•

Modent humant IFN-y-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For å endre det første Cys til Ser og gi

et initieringskodon (ATG) som er nødvendig for ekspresjon, like før det første Ser, ble følgende DNA-kjededanner syntetisert.

To enkeltkjedede DNA'er av 20-mer og 19-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 75, 5765 (1978)]. Deretter ble 2 yg av den 20-mere og den 19-mere DNA oppløst i 40 yl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA

og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotid-kinase ble til-

satt, og fosforyleringsreåksjon ble utført ved 37°C i 60 minutter.

0,5 ug av Sinl-BamHI-fragmentet på ca. 850 bp oppnådd i det foregående og avledet fra pGBD-1 og 1,0 yg av Hindlll-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 Kb av ekspresjonsvektoren pKYPlO ble oppløst i 25 yl T4-ligasebufferoppløsning. Ca. 0,1 yg av DNA-kjededanneren som nevnt i det foregående ble tilsatt i blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4-DNA-ligase. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 17 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse

av den oppnådde rekombinante plasmide blanding for oppnåelse av en Ap -koloni. Et plasmid, pGVLlO, vist på fig. 5, ble isolert fra dyrkningsmediet for kolonien. Strukturen til pGVLlO ble bekreftet ved nedbrytningen med EcoRI,

Clal, Hindlll og BamHI og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert [A.M. Maxam, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA, 74, 560 (1977)], at basesekvensen fra Hindlll-setet til Sinl-setet i plasmidet pGVLlO er som følger:

Det humane IFN-y-polypeptid, som pGVLlO koder for (derivatet betegnes i det følgende 1-Ser-IFN-y) er klart forskjellig fra det humane IFN-y-polypeptid ved at den første Cys i modent humant IFN-y er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGVLlO er deponert hos FERM som Escherichia colii GVL10 (FERM BP 544).

Eksempel 7

Konstruksjon av rekombinant plasmid pGVMlOl som koder for 3-Ser-IFN-y: 6 yg pGBDl-DNA oppnådd i eksempel 1 ble oppløst i 50 yl Y-50-bufferoppløsning. 10 enheter Sinl ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon utført ved 37°C i 3 timer. Deretter ble det tilsatt NaCl til en sluttkonsentrasjon på 100 mM, og 10 enheter BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Ca. 0,8 ya DNA-fraament på ca. 850 bp inneholdende størstedelen av den humane IFN-y-DNA ble oppnådd fra reaksjonsoppløsningen ved LGT-metoden.

Separat ble 3 yg pKYPlO-DNA fremstilt ved metoden som beskrevet i japansk publisert ikke-undersøkt patentsøknad nr. 110600/83 oppløst i 40 yl (totalvolum) Y-50-bufferoppløsning, og 5 enheter Hindlll og BamHI ble tilsatt. Nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det oppnådd ca. 1,8 yg DNA-fragment på ca. 4,3 Kb inneholdende tryptofan-promotor (P. ) ved LGT-metoden.

trp

Modent humant IFN-y-polypeptid har den N-terminale struktur Cys-Tyr-Cys-. For å endre den tredje aminosyren (Cys)

til Ser og for å oppnå et initieringskodon (ATG), som er nødvendig for ekspresjon, like før den første Cys, ble følgende DNA-linker syntetisert.

To enkeltkjedede DNA<*>er av 20-mer og 19-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode. Deretter ble 2 yg av av så vel den 20-mere som den 19-mere DNA oppløst i 40 yl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2> 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotidkinase ble tilsatt,

og fosforyleringsreaksjon ble utført ved 37°C i 60 minutter.

0,5 yg av Sinl-BamHI-fragment på ca. 850 bp oppnådd som i det foregående og avledet fra pGBDl og 1,0 yg av Hindlll-BamHI-fragmentet på ca. 4,3 Kb av ekspresjonsvektoren pKYPlO ble oppløst i 25 yl T4-ligase-bufferoppløsning. Ca. 0,1 yg av DNA-kjededanneren som nevnt i det foregående, ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4-DNA-ligase. Ligeringsreaksjonen ble utført ved 4°C i 17 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den oppnådde rekombinante plasmide blanding for oppnåelse av en Ap -koloni. Et plasmid, pGVMlOl, vist på fig. 6, ble isolert fra dyrkningsmediet for kolonien. Strukturen til pGVMlOl ble bekreftet ved nedbrytningen av EcoRI, Clal, Hindlll og BamHI og agarose-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at basesekvensen fra Hindlll-setet til Sinl-setet i plasmidet pGVMlOl er som følger:

Det humane IFN-y-polypeptid, som pGVMlOl koder for (derivatet betegnes i det følgende 3-Ser-IFN-y) er klart forskjellig fra det kjente humane IFN-y-polypeptid ved at den tredje aminosyren (Cys) for modent humant IFN-y er erstattet med Ser. Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGVMlOl, er blitt deponert hos FERM som Escherichia coli IGVM101 (FERM BP 545).

Eksempel 8

Konstruksjon av plasmid pGWE4, som koder for det polypeptid hvori et N-terminalt område av det humane IFN-y er fjernet: 25 yg pGKA2 (5,2 Kb) oppnådd ved fremgangsmåten ifølge Referanseeksempel 2 ble oppløst i 400 yl Y-10 bufferoppløsning. 50 enheter Clal ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon utført ved 37°C i 3 timer. Til 80 yl av reaksjonsoppløsningen inneholdende 5 yg DNA ble det tilsatt 12 yl 10-fold konsentrert BAL31-bufferoppløsning, 28 yl vann og 0,25 enheter nuklease BAL31, og reaksjonen ble utført ved 30°C i 10 sekunder. BAL31 har aktiviteten for eksonuklease som nedbryter fra enden av et DNA-molekyl, og ca. 20 basepar DNA fra Clal-setet ble nedbrut under de i det foregående beskrevne betingelser. DNA ble utvunnet fra reaksjonsoppløsningen ved fenolekstraksjon, kloroformekstraksjon og etanolutfelling. 1,0 yg av det således utvundne pGKA2-fragment nedbrutt med Clal og BAL31 ble oppløst i 20 yl Y-50-bufferoppløsning. 2 enheter Pstl ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 2 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det utvunnet 0,5 yg DNA-fragment på ca. 4,3 Kb ved LGT-metoden.

Deretter ble 5,0 yg ATG-ekspresjonsvektor pTrS3 (3,8 Kb) opp-løst i 40 yl Y-50-bufferoppløsning. 10 enheter SpHI ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Etter fenolekstraksjon og kloroformekstraksjon ble ca.

3,0 yg DNA-fragment utvunnet ved etanolutfelling. Ca. 3,0 yg av DNA-fragmentet ble oppløst i en oppløsning bestående av 67 mM Tris-HCl (pH 8,3), 6,7.M MgCl2, 10 mM merkaptoetanol, 6,7 ym EDTA og 16,6 mM (NH^)2S04 og 1 mM av hvert av stoffene dATP, dTTP, dCTP og dGTP. Videre ble det til-

satt 6 enheter T4-DNA-polymerase, og reaksjonen ble ut-

ført ved 37°C i 1 time for nedbrytning av den fremstikkende enden. Etter fenolekstraksjon og kloroformekstraksjon ble det utvunnet 1,0 yg DNA-fragment ved etanolutfelling. 1,0 yg

av DNA-fragmentet ble oppløst i 20 ul (totalvolum) Y-50-bufferoppløsning. 2 enheter Pstl ble tilsatt, og ned-brytningsreaks jon ble utført ved 37°C i 3 timer. Fra reaksjonsoppløsningen ble det ved LGT-metoden utvunnet 0,5 yg DNA-fragment på ca. 880 bp inneholdende ptrp•

0,5 yg Clal-Pstl-fragment (ca. 4,3 Kb) av pGKA2 oppnådd som i det foregående og 0,5 yg pTrS3-SphI-T4-polymerase-PstI-fragment (880 Bp) oppnådd som i det foregående, ble oppløst i 10 yl(totalvolum) T4-ligase-bufferoppløsning. 0,3 enheter T4-DNA-ligase ble tilsatt, og ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i 18 timer.

Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den således oppnådde rekombinante plasmidblanding, og plasmid-DNA ble utvunnet fra Ap -kolonien som var dannet, for oppnåelse av pGWE4 som vist på fig. 7. Strukturen til pGWE4 ble funnet ved nedbrytning med EcoRI, Clal og BamHI

og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam og Gilbert at sekvensen omkring den N-terminale enden av det humane IFN-y-strukturgen i pGWE4 var som følger:

Det ble opså bekreftet at 4 aminosyrer fra den N-terminale aminosyren (Cys) til den fjerde aminosyren (Gin) i det modne IFN-y-polypeptid var fjernet, og at det humane IFN-y-polypeptidderivat ble startet med den femte aminosyren (Asp)

[derivatet betegnes IFN-y(A)-4)].

Escherichia coli stamme som bærer plasmid pGWE4 er blitt deponert hos FERM Escherichia coli IGWE4 (FERM BP-54 6).

Eksempel 9

Produksjon av IFN-y-derivater med Escherichia coli stammer

som bærer pGVLlO, pGVMlOl og pGWE4:

Eschérichia coli HB101 stammer som bærer rekombinante plasmider pGVLlO, pGVMlOl og pGWE4 oppnådd i eksempel 6-8, som betegnes IGVL10, IGVM101 og IGWE4, ble dyrket ved 37°C i 18 timer i LG-medium. 0,2 ml av dyrkningsmediet ble anbrakt i 10 ml MCG-medium, og dyrkning ble foretatt ved 30°C i 4 timer. Deretter ble det tilsatt 10 yg/ml IAA, og dyrking ble fortsatt i 4 timer. Dyrkningsmediet ble sentrifugert ved 8000 omdr./min. i 10 min., og de høstede celler ble vasket med en bufferoppløsning inneholdende 30 mM NaCl og 30 mM Tris-HCl (pH 7,5). Vaskede celler ble suspendert i 1 ml buffer-oppløsning som beskrevet i det foregående, og 5 yl av en oppløsning inneholdende 200 yg lysozym og 0,25. M EDTA ble tilsatt. Blandingen ble sentrifugert i 30 min. for oppnåelse av en supernatant væske. Mengden av interferon i supernatanten ble bestemt etter metoden ifølge Armstrong, hvori Sindvis-virus ble benyttet som virus, og FL-celler avledet fra humane amnionceller ble benyttet som dyrecellene. Resultatet er vist i tabell 3.

IGKA2 er en stamme som bærer plasmid pGKA2 som koder for

IFN-Y.

Referanseeksempel 1

Innsetning av humant IFN-y-DNA i ekspresjonsvektoren pKYP-11:

I dette eksempel ble 6 yg plasmid pIFNy-G4 (3,6 Kb) oppløst

i 50 yl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2> 10 mM ditiotreitol og 50 mM NaCl. Deretter ble 12 enheter av hvert av restriksjons-enzymene PvuII og Hindlll tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 4 timer. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 7 min. for inaktivering av enzymene og underkastet rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av 1,2 yg av et DNA-fragment på 1,3 Kb inneholdende human IFN-y-DNA.

Separat ble 4 yg pKYP-11 oppløst i 40 yl (totalvolum) av

en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 50 mM NaCl. 8 enheter BamHI ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37°C i 3 timer. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65°C i 5 minutter

for inaktivering av enzymet. Deretter ble 30 yM av hvert av stoffene dATP, dCTP, dGTP og dTTP tilsatt, og 8 enheter Escherichia coli DNA-polymerase I (Klenow-fragment, 1 pl) ble tilsatt. Ifyllingsreaksjon ble utført ved 15 °C i 1 time, og reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 68 °C i 15 minutter for inaktivering av DNA-polymerase I. 10 enheter Hindlll ble tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37 °C i 3 timer etterfulgt av oppvarming ved 65 °C i 5 minutter for å inaktivere Hindlll. Nedbrytningsreaksjonsoppløsningen av plasmidet pKYP-11 ble underkastet rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av ca. 2,5 yg av et DNA-fragment på ca. 4,7 Kb inneholdende P,

trp

Deretter ble 0,5 yg av DNA-fragmentet på 1,3 Kp inneholdende human IFN-y-DNA og 1,0 yg av DNA-fragmentet på ca. 4,7 Kb inneholdende Ptrp, som ble oppnådd fra plasmidet pKYP-11,

oppløst i 20 yl av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol og 500 yM ATP, og 4 enheter T4-DNA-ligase ble tilsatt. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4 °C i 18 timer, og Escherichia coli HB101 ble transformert med den oppnådde rekombinante plasmidblanding ved konvensjonell teknikk for oppnåelse av en Ap<R->koloni. Et plasmid, pGC-7, ble separert fra dyrkningsmediet fra kolonien. Strukturen til pGC-7 ble bekreftet ved nedbrytningen med Hindlll, BamHI, Hpal, Sali, EcoRI og Clal og agarosegel-elektroforese. Escherichia coli-stamme inneholdende pGC-7 er blitt deponert hos FERM som Escherichia coli IGC-7 (FERM P-6814, FERM BP-497).

Referanseeksempel 2

Konstruksjon av rekombinant plasmid pGKA-2:

I dette eksempel ble 6 yg av den i Referanseeksempel 1 oppnådde PGC-7-DNA oppløst i 59 yl (totalvolum) av en opp-løsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 10 mM NaCl, og 12 enheter BstNI ble tilsatt. Det ble utført reaksjon ved 60 "C i 3 timer, og reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65 °C i 5 minutter for inaktivering av BstNI. Deretter ble 150 mM NaCl og 8 enheter Sali tilsatt, og nedbrytningsreaksjon ble utført ved 37 "C i 3 timer. Reaksjonsoppløsningen ble oppvarmet ved 65 °C i 5 minutter for inaktivering av Sali og underkastet rensing ved LGT-metoden for oppnåelse av 0,8 ug av et DNA-fragment på ca. 1125 bp inneholdende størstedelen av den humane IFN-y-DNA.

Separat ble 3 yg pKYP-10 oppløst i 40 yl (totalvolum) av

en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 10 mM ditiotreitol og 100 mM NaCl. 6 enheter av hvert av stoffene Hindlll og Sali ble tilsatt, og nedbrytnings-reaks jon ble utført ved 37"°C i 3 timer. Reaks jonsoppløsnin-gen ble oppvarmet ved 65°C i 5 minutter for å inaktivere Hindlll og Sali og underkastet rensing ved LGT-metoden

for oppnåelse av ca. 1,8 yg av et DNA-fragment på ca.

4,1 Kb inneholdende P_,_

trp

Den N-terminale aminosyren i det modne humane IFN-y-polypeptid er Cys. For å uttrykke moden IFN-y-DNA er det nødvendig å tilveiebringe et initieringskodon (ATG) like før det 5'-terminale kodon TGT (Cys) og ytterligere å innstille lengden mellom SD-sekvens etter Ptrp og ATG til en passende lengde på 6-18 bp. Derfor ble følgende DNA-linker syntetisert:

To enkeltkjedede DNA'er av 18-mer og 15-mer ble syntetisert ved en konvensjonell triestermetode [R. Crea, et al.: Proe. Nati. Acad. Sei., USA 75, 5765 (1978)]. Deretter ble 2 yg av den 18-mere og 2 yg av den 15-mere DNA oppløst i 20 yl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 50 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol, 0,1 mM EDTA og 1 mM ATP. 30 enheter T4-polynukleotid-kinase ble tilsatt, og fosforyleringsreaksjon ble utført ved 37 °C i 60 minutter.

Deretter ble 2 yg av så vel fosforylert 18-mer som 15-mer DNA blandet, og blandingen ble oppvarmet ved 70°C i 5 min. og ble hensatt ved romtemperatur for utligning for oppnåelse av DNA-kjededanneren med den i det foregående gitte struktur.

0,4 yg av BstNI-Sall-fragmentet på 1125 bp oppnådd som i det foregående og avledet fra pGC-7 og 1,0 fig av DNA-fragmentet på 4,1 Kb oppnådd ved nedbrytning av ekspresjonsvektoren pKYP-10 med Hindlll og Sali ble oppløst i 25 yl (totalvolum) av en oppløsning inneholdende 20 mM Tris-HCl (pH 7,5), 6 mM MgCl2, 5 mM ditiotreitol og 500 yM ATP.

Ca. 0,1 yg av DNA-kjededanneren som nevnt i det foregående ble tilsatt til blandingen etterfulgt av tilsetning av 6 enheter T4-DNA-ligase. Ligeringsreaksjon ble utført ved 4°C i l"7 timer. Escherichia coli HB101 ble transformert under anvendelse av den oppnådde rekombinante plasmidblanding ved konvensjonell teknikk for oppnåelse av en Ap - koloni. Et plasmid, pGKA-2, som vist på fig. 5, ble isolert fra dyrkningsmediet for kolonien. Strukturen for pGKA-2

ble bekreftet ved nedbrytning av EcoRI, Clal, Hindlll,

BstNI og Sali og agarosegel-elektroforese. Det ble bekreftet ved metoden ifølge Maxam-Gilbert at basesekvensen fra SD-sekvensen (AAGG) til initieringskodonet (ATG) i plasmidet pGKA-2 var "AAGGGTATCGATAAGCTTATG".

Escherichia coli stamme inneholdende pGKA-2 er blitt deponert hos FERM som Escherichia coli IGKA-2 (FERM P-6798, FERM BP-496).

Claims

1. Fremgangsmåte for fremstilling av et derivat av det humane interferon-y polypeptid, karakterisert ved at en E. coli-stamme transformeres med et av de rekombinante plasmidene pGVA-4, pGVK-13, pGWC-10, pGVL-10, pGVM-101 eller pGWE-4 som koder for henholdsvis (Tyr-3, Gln-9)y-IFN, (Ser-1,3, Gln-9)y-IFN, (des 1-7, Gln-9)IFN-y, (Ser-1, Gln-9)y-IFN, (Ser-3, Gln-9)IFN-y eller (des 1-4, Gln-9)IFN-y, kulturene dyrkes, polypeptidet akkumuleres i mediet og isoleres fra dette.

2. Rekombinant plasmid ifølge krav 1, karakterisert ved at det er valgt fra plasmid pGVA-4, pGVK-13, pGWC-10, pGVL-10, pGVM-101 eller pGWE-4 som er deponert i Escherichia coli med deponeringsnummer FERM BP-395, 432, 397, 544, 545 og 546.