JPS60136600A - 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド誘導体 - Google Patents
新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド誘導体Info
- Publication number
- JPS60136600A JPS60136600A JP58246456A JP24645683A JPS60136600A JP S60136600 A JPS60136600 A JP S60136600A JP 58246456 A JP58246456 A JP 58246456A JP 24645683 A JP24645683 A JP 24645683A JP S60136600 A JPS60136600 A JP S60136600A
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- JP
- Japan
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- polypeptide
- ifn
- human interferon
- sequence
- dna
- Prior art date
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- Pending
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/57—IFN-gamma
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- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
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- Biochemistry (AREA)
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- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
本発明は新規なヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド
誘導体、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み
込んだ組換え体プラスミドおよび該プラスミドを含む微
生物を用いるヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘
導体の製造法に関る。
誘導体、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ断片を組み
込んだ組換え体プラスミドおよび該プラスミドを含む微
生物を用いるヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘
導体の製造法に関る。
インターフェロン（以下ＩＦＮと略記する）は、大別し
てＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−Ｔの３種類が
知られてふり、主としてＩＦＮ−αは白血球細胞、ＩＦ
Ｎ−βは線維芽細胞、ＩＦＮ−ＴはＴ−１Ｊンパ球によ
り生産される。これらのＩＦＮは抗ウィルス作用のみな
らず、ナチュラルキラー細胞やマクロファージの活性化
作用、抗腫瘍作用など多くの生物活性を示す物質として
注目を集めている。しかしながら、白血球、培養細胞か
ら分離する従来の方法では、十分な量を供給することが
困難である。
てＩＦＮ−α、ＩＦＮ−βおよびＩＦＮ−Ｔの３種類が
知られてふり、主としてＩＦＮ−αは白血球細胞、ＩＦ
Ｎ−βは線維芽細胞、ＩＦＮ−ＴはＴ−１Ｊンパ球によ
り生産される。これらのＩＦＮは抗ウィルス作用のみな
らず、ナチュラルキラー細胞やマクロファージの活性化
作用、抗腫瘍作用など多くの生物活性を示す物質として
注目を集めている。しかしながら、白血球、培養細胞か
ら分離する従来の方法では、十分な量を供給することが
困難である。
近年急速に発展している組換えＤＮＡ技術はＩＦＮのよ
うに高等生物の細胞では生産量が少なく分離が困難な物
質を微生物で大量に生産することを可能にした。例えば
、ＩＦＮ−βとＩＦＮ−αに関しては、それぞれのｍＲ
ＮΔが細胞より抽出され、これに相補的なりＮＡ （ｃ
ＤＮＡ）が酵素的に合成され、二重６１１ Ｄ ＮＡと
して適当なプラスミドに挿入されて、大腸菌にクローン
化されている〔各日ら：Ｐｒｏｃ、 Ｊａｐ、 Ａｃａ
ｄ、、５５ （Ｂ） 。
うに高等生物の細胞では生産量が少なく分離が困難な物
質を微生物で大量に生産することを可能にした。例えば
、ＩＦＮ−βとＩＦＮ−αに関しては、それぞれのｍＲ
ＮΔが細胞より抽出され、これに相補的なりＮＡ （ｃ
ＤＮＡ）が酵素的に合成され、二重６１１ Ｄ ＮＡと
して適当なプラスミドに挿入されて、大腸菌にクローン
化されている〔各日ら：Ｐｒｏｃ、 Ｊａｐ、 Ａｃａ
ｄ、、５５ （Ｂ） 。
４６４〜４６９ （１９７９）；長円ら： Ｎａｔｕｒ
ｅ２８４．３１６−３２０ （１９８０））。
ｅ２８４．３１６−３２０ （１９８０））。
ＩＦＮ−ｒに関しては、動物細胞実験において他のＩＦ
Ｎより強い細胞増殖阻止作用を有することが示され（Ｂ
、Ｙ、Ｒｕｂｉｎ ａｎｄ Ｓ、Ｌ、Ｇｕｐｔａ ：
Ｐｒｏｃ。
Ｎより強い細胞増殖阻止作用を有することが示され（Ｂ
、Ｙ、Ｒｕｂｉｎ ａｎｄ Ｓ、Ｌ、Ｇｕｐｔａ ：
Ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、Ｓｃｉ、、ＵＳＡ 、 ７ ７
、 ５９２８−５９３２（１９８０）Ｌ最近、ＩＦＮ−
ｒ ｃＤＮＡを大腸菌にクローン化し、その塩基配列を
決めたことが報告されている（Ｐ、ｌ１１．Ｇｒａｙ
ら：１ｌａｔｕｒｅ２９５ 、５０３ （１９８２）、
Ｒ，Ｄｅｖｏｓら： ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｃ！ｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０ 、２４８７ （１９８２）
〕。
、 ５９２８−５９３２（１９８０）Ｌ最近、ＩＦＮ−
ｒ ｃＤＮＡを大腸菌にクローン化し、その塩基配列を
決めたことが報告されている（Ｐ、ｌ１１．Ｇｒａｙ
ら：１ｌａｔｕｒｅ２９５ 、５０３ （１９８２）、
Ｒ，Ｄｅｖｏｓら： ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｃ！ｓ
Ｒｅ５ｅａｒｃｈ １０ 、２４８７ （１９８２）
〕。
本発明者らも独立にＩＦＮ−ｒをコードするＤＮＡをク
ローン化し、その塩基配列が第１表に示したように０ｅ
ｖｏａらが報告した成熟１ＦＮ−ｒと９番目のアミノ酸
がリジン（Ｌｙｓ） （ＡＡ八）からグルタミ”／ （
Ｇｉｎ） （ＣＡＡ） に置換した新規ＩＦＮ−ｒをコ
ードするクローンを得た。さらに本１ＦＮ−Ｔ遺伝子を
トリプトファンプロモーターをもつベクターｐＫＹＰ−
１０（特開昭５８−１１０６００ ）に組みこんで大腸
菌で大量生産することにも成功した。
ローン化し、その塩基配列が第１表に示したように０ｅ
ｖｏａらが報告した成熟１ＦＮ−ｒと９番目のアミノ酸
がリジン（Ｌｙｓ） （ＡＡ八）からグルタミ”／ （
Ｇｉｎ） （ＣＡＡ） に置換した新規ＩＦＮ−ｒをコ
ードするクローンを得た。さらに本１ＦＮ−Ｔ遺伝子を
トリプトファンプロモーターをもつベクターｐＫＹＰ−
１０（特開昭５８−１１０６００ ）に組みこんで大腸
菌で大量生産することにも成功した。
次いで、本発明者らは第１表に示したＩ ＦＮ−Ｔ遺伝
子を出発材料にして、ＩＦＮ−γポリペプチドの誘導体
を製造することを試みた。
子を出発材料にして、ＩＦＮ−γポリペプチドの誘導体
を製造することを試みた。
ＩＦＮ−ｒの誘導体についてはＣ末端より１１個のアミ
ノ酸を欠失させた場合、比活性が１／３に低下する例が
報告されている［Ａ、Ｂ、 Ｆｒａｎｋａ ら；ＤＮΔ
ユ２２３−２３０ （１９８２）Ｌ一方Ｎ末端に１８個
のアミノ酸を付加したＩ ＦＮ−Ｔ誘導体では比活性に
変化が見られなかった［Ｒ，Ｍ、 ＫｉｎｇらＪ、Ｇｅ
ｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６４−１８１５＝１８１８ （１
９８３））。
ノ酸を欠失させた場合、比活性が１／３に低下する例が
報告されている［Ａ、Ｂ、 Ｆｒａｎｋａ ら；ＤＮΔ
ユ２２３−２３０ （１９８２）Ｌ一方Ｎ末端に１８個
のアミノ酸を付加したＩ ＦＮ−Ｔ誘導体では比活性に
変化が見られなかった［Ｒ，Ｍ、 ＫｉｎｇらＪ、Ｇｅ
ｎ、 Ｖｉｒｏｌ、 ６４−１８１５＝１８１８ （１
９８３））。
ＩＦＮ−γの誘導体については未だ報告はないが、本発
明者らは第１表に示したＩＦＮ−Ｔの３番目のアミノ酸
であるンステイン（Ｃｙｓ ）をチロシン（Ｔｙｒ ）
に置換した誘導体（以下３−Ｔｙｒ−ＩＦＮ−γと呼ぶ
ンをつくり、比活性がもとのＩＦＮ−ｒより２〜４倍強
いことを見い出した。
明者らは第１表に示したＩＦＮ−Ｔの３番目のアミノ酸
であるンステイン（Ｃｙｓ ）をチロシン（Ｔｙｒ ）
に置換した誘導体（以下３−Ｔｙｒ−ＩＦＮ−γと呼ぶ
ンをつくり、比活性がもとのＩＦＮ−ｒより２〜４倍強
いことを見い出した。
さらに１＃目の（：ｙｓをセリン（Ｓｅｔ）に置換した
もの（１−３ｅｔ−１ＦＮ−ｒ）、３番目のＣｙｓをＳ
ｅｔに置換したもの（３−３ｅｒ −１ＦＮ−７） 、
１番目と３番目のＣｙｓをＳａｒ に置換したもの（１
，３−８ｅｒ −１Ｆ Ｎ −７）および第１表のＩＦ
Ｎ−ｒのＮ末端のアミノ酸を欠失させた誘導体も造成し
これらの誘導体すべてにもとのＩＦＮ−ｒと同等もしく
はそれ以上のインターフェロン活性を検出し、本発明を
完成するに至った。
もの（１−３ｅｔ−１ＦＮ−ｒ）、３番目のＣｙｓをＳ
ｅｔに置換したもの（３−３ｅｒ −１ＦＮ−７） 、
１番目と３番目のＣｙｓをＳａｒ に置換したもの（１
，３−８ｅｒ −１Ｆ Ｎ −７）および第１表のＩＦ
Ｎ−ｒのＮ末端のアミノ酸を欠失させた誘導体も造成し
これらの誘導体すべてにもとのＩＦＮ−ｒと同等もしく
はそれ以上のインターフェロン活性を検出し、本発明を
完成するに至った。
以下本発明の詳細な説明する。
本発明は、新規なヒ）ＩＦＮ−ｒｌ導体をコードするＤ
ＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを
含む微生物、該微生物を用いる新規なヒトＩＦＮ−ｒポ
リペプチド誘導体の製造法ならびに該ヒ）ＩＦＮ−ｒポ
−リペプチド誘導体自体を提供することを目的とする。
ＮＡを組み込んだ組換え体プラスミド、該プラスミドを
含む微生物、該微生物を用いる新規なヒトＩＦＮ−ｒポ
リペプチド誘導体の製造法ならびに該ヒ）ＩＦＮ−ｒポ
−リペプチド誘導体自体を提供することを目的とする。
本発明の組換え体プラスミドの造成はＩ ＦＮ−ｒをコ
ードするメツセンジャーＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で
得られるｃＤＮＡまたはＩＦＮ−ｒをコードする染色体
ＤＮＡなどを出発物質として行われる。
ードするメツセンジャーＲＮＡから組換えＤＮＡ技術で
得られるｃＤＮＡまたはＩＦＮ−ｒをコードする染色体
ＤＮＡなどを出発物質として行われる。
ヒトＩＦＮ−ｒｃＤＮΔとしては、いかなるものも用い
ることができるが、具体的にはｐｌＦＮｒ−Ｇ４を用い
ることができる。ｐｌＦＮｒ−Ｇ４は大腸菌に挿入され
、ＡＴＣＣ３９１２３として米国アメリカン・タイプ・
カルチア−・コレクンヨンに寄託されている。
ることができるが、具体的にはｐｌＦＮｒ−Ｇ４を用い
ることができる。ｐｌＦＮｒ−Ｇ４は大腸菌に挿入され
、ＡＴＣＣ３９１２３として米国アメリカン・タイプ・
カルチア−・コレクンヨンに寄託されている。
ｐｌＦＮ’ｒ−Ｇ４中のＩＦＮ−ｒＤＮΔはマキザム・
ギ／レバー←法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 、 ７４５６０ （１９７７））により決定
された第１表に示す塩基配列を有している。
ギ／レバー←法（Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、
Ｓｃｉ、 、 ７４５６０ （１９７７））により決定
された第１表に示す塩基配列を有している。
ｐＩＦＮＴ−０４中のヒトＩＦＮ−ｒｃＤＮＡを公知の
Ｉ Ｆ Ｎ −ｒ ｃ ＤＮＡ ［Ｒ，Ｄｅｖｏｓ ら
：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １
０２４８７（１９８２） ：］と比較すると成熟ヒ）Ｉ
ＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末端より９番目のアミノ酸（
Ｌｙｓ）をコードしている最初の塩基であるアデニン（
Ａ ’） ［：Ｒ，Ｄｅｖｏｓ ら：ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １０２４８７（１９８
２） ：］がｐＩＦＮｒ−Ｇ４ ｃＤＮＡにおいては対
応塩基がシトシン（Ｃ）となっているので、このような
遺伝子がコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末
端より９番目のアミノ酸はＬｙｓではなくＧｉｎに置換
することになる。従って１）ＩＦＮ７−０４は新規なヒ
トＩＦＮ−ｒポリペプチドをコードしていることは明白
である。
Ｉ Ｆ Ｎ −ｒ ｃ ＤＮＡ ［Ｒ，Ｄｅｖｏｓ ら
：ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １
０２４８７（１９８２） ：］と比較すると成熟ヒ）Ｉ
ＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末端より９番目のアミノ酸（
Ｌｙｓ）をコードしている最初の塩基であるアデニン（
Ａ ’） ［：Ｒ，Ｄｅｖｏｓ ら：ＮｕｃｌｅｉｃＡ
ｃｉｄｓ Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、 １０２４８７（１９８
２） ：］がｐＩＦＮｒ−Ｇ４ ｃＤＮＡにおいては対
応塩基がシトシン（Ｃ）となっているので、このような
遺伝子がコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末
端より９番目のアミノ酸はＬｙｓではなくＧｉｎに置換
することになる。従って１）ＩＦＮ７−０４は新規なヒ
トＩＦＮ−ｒポリペプチドをコードしていることは明白
である。
従って、第１表に示したＩＦＮ−ｒから一部のアミノ酸
の欠失または置換によって得られるＩＦＮ−Ｔ誘導体も
新規なＩＦＮ−ｒ誘導体である。
の欠失または置換によって得られるＩＦＮ−Ｔ誘導体も
新規なＩＦＮ−ｒ誘導体である。
ＩＦＮ−ｒ誘導体をコードするＤＮＡを組み込むプラス
ミドとしては、大腸菌中で該ＤＮＡが発現できるものな
らどのプラスミドでも使うことができる。好ましくは、
適当なプロモーター、例えばｔｒｐ系、ｌａｃ系のプロ
モーターの下流に外来ＤＮＡを挿入することができ、し
かもシャイン−ダルガノ配列（以下ＳＤ配列と略記する
）と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当な距離、例えば６
〜１８塩基対に調節したプラスミドを用いることがてき
る。具体的に好的なプラスミドとしては、本発明者らに
よって造成さたｐＫＹＰｌｏ、ｐ）（ＹＰＩ １．ｐＫ
ＹＰ１２ （特開昭５８−１１０６００ ）などがあげ
られる。
ミドとしては、大腸菌中で該ＤＮＡが発現できるものな
らどのプラスミドでも使うことができる。好ましくは、
適当なプロモーター、例えばｔｒｐ系、ｌａｃ系のプロ
モーターの下流に外来ＤＮＡを挿入することができ、し
かもシャイン−ダルガノ配列（以下ＳＤ配列と略記する
）と開始コドン（ＡＴＧ）の間を適当な距離、例えば６
〜１８塩基対に調節したプラスミドを用いることがてき
る。具体的に好的なプラスミドとしては、本発明者らに
よって造成さたｐＫＹＰｌｏ、ｐ）（ＹＰＩ １．ｐＫ
ＹＰ１２ （特開昭５８−１１０６００ ）などがあげ
られる。
第り図に示したようにしてｐＩＦＮｒ−Ｇ４をｐ Ｖ
ｕ １＋で切断しこの部位にＢａｍＨＩリンカ−を導入
し、ｐＧＢＩ）ｉを得る。
ｕ １＋で切断しこの部位にＢａｍＨＩリンカ−を導入
し、ｐＧＢＩ）ｉを得る。
ライでｐＧＢＤ−１を５ｉｎｌと１３ａｍＨＩで消化し
低融点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）〔口１ｉ
ｅｓｌａｎｄｅｒ：Ａｎａｌｙｔｕａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ９８３０５（１９７９） にて約８５０
ｂｐ断片を精製し、ｐＫｙｐ、−ｉｏをＣｏａｌとＢａ
ｍＨＩで消化した後約４．３ Ｋ ｂ断片を精製する。
低融点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）〔口１ｉ
ｅｓｌａｎｄｅｒ：Ａｎａｌｙｔｕａｌ Ｂｉｏｃｈｅ
ｍｉｓｔｒｙ ９８３０５（１９７９） にて約８５０
ｂｐ断片を精製し、ｐＫｙｐ、−ｉｏをＣｏａｌとＢａ
ｍＨＩで消化した後約４．３ Ｋ ｂ断片を精製する。
このようにして得た両断片と第２図に示した合成りＮＡ
（３番目のアミノ酸としてＴｙｒをコードする。）をＴ
４−ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐＧＳＢ−６を得
る。
（３番目のアミノ酸としてＴｙｒをコードする。）をＴ
４−ＤＮＡリガーゼにより結合し、ｐＧＳＢ−６を得
る。
続いてｐｃｓＢ−６をＣ１ａｌで消化しＤＮＡポリメラ
ーゼＩで埋めこみ反応を行なった後、Ｔ４ＤＮΔリガー
ゼで結合し、ｐＧＶＡ−４を得る。
ーゼＩで埋めこみ反応を行なった後、Ｔ４ＤＮΔリガー
ゼで結合し、ｐＧＶＡ−４を得る。
ＩＦＮ−ｒのＮ末端から１番目と３番目のアミノ酸をＣ
ｙｓからＳｅｔに置換した誘導体をコードするプラスミ
ドｐＧＶＫ−１３を造成するために、第３図に示した合
成りＮＡ （１，３番目のアミノ酸としてＳｅｒをコー
ドする）を用いること以外上と同様にしてｐｃｖＫ−１
３を得る。
ｙｓからＳｅｔに置換した誘導体をコードするプラスミ
ドｐＧＶＫ−１３を造成するために、第３図に示した合
成りＮＡ （１，３番目のアミノ酸としてＳｅｒをコー
ドする）を用いること以外上と同様にしてｐｃｖＫ−１
３を得る。
またＮ末端の欠落したＩＦＮ−ｒ誘導体を得るためには
第４図に示したようにｐＧＫＡｉをＣ１ａｌで消化後Ｂ
ａ Ｉ ３１を短時間（１〜３０分間）作用させてＩＦ
Ｎ−ｒのＮ末端のアミノ酸をコードするＤＮＡを削り、
続いてＰｓｔｌで消化した後、４．３ Ｋ ｂ断片を精
製する。一方開始コトンを含むベクターｐＴｒＳ−３を
Ｓｐｈ Ｉ消化後ＤＮＡポリメラーゼＩで処理し、さら
にＰＳｔｌで消化した後、８８０ｂｐ断片を精製する。
第４図に示したようにｐＧＫＡｉをＣ１ａｌで消化後Ｂ
ａ Ｉ ３１を短時間（１〜３０分間）作用させてＩＦ
Ｎ−ｒのＮ末端のアミノ酸をコードするＤＮＡを削り、
続いてＰｓｔｌで消化した後、４．３ Ｋ ｂ断片を精
製する。一方開始コトンを含むベクターｐＴｒＳ−３を
Ｓｐｈ Ｉ消化後ＤＮＡポリメラーゼＩで処理し、さら
にＰＳｔｌで消化した後、８８０ｂｐ断片を精製する。
Ｔ４リガーゼで両断片を結合しｐＧＷＣ−１０を得る。
上記組換え技法における反応の条件は、一般的に下記の
とおりである。
とおりである。
ＤＮＡの制限酵素による消化反応は、通常０．１〜２０
μｇのＤＮＡを２−２２−２Ｏ０好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のＴｒ ｉ ５−ＨＣＩｌ （ｐＨ６，０〜９．
５好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭ
のＮａＣｊ！、２〜２０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｒ
ｒｒＭ）のＭｇＣβ２を含む反応液中で、制限′酵素０
，１〜１００単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して
１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる
制限酵素により異なる）において、１５分間〜２４時間
行う。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分
間加熱することによるが、フェノールまたはジエチルピ
ロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる
方法も用いることができる。
μｇのＤＮＡを２−２２−２Ｏ０好ましくは１０〜４０
ｍＭ）のＴｒ ｉ ５−ＨＣＩｌ （ｐＨ６，０〜９．
５好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、０〜２００ｍＭ
のＮａＣｊ！、２〜２０ｍＭ （好ましくは５〜１０ｒ
ｒｒＭ）のＭｇＣβ２を含む反応液中で、制限′酵素０
，１〜１００単位（好ましくは１μｇのＤＮＡに対して
１〜３単位）を用い、２０〜７０℃（至適温度は用いる
制限酵素により異なる）において、１５分間〜２４時間
行う。反応の停止は、通常５５〜７５℃で、５〜３０分
間加熱することによるが、フェノールまたはジエチルピ
ロカーボネートなどの試薬により制限酵素を失活させる
方法も用いることができる。
制限酵素消化によって生じたＤＮＡ断片の精製は、低融
点アガロースゲル電気泳動法〔１１，Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｒ＋Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ９８ 、３０５（１９’７９））やポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法ＣＡ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍ ら：Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 ＵＳ
Ａユ４，５６０ （１！Ｊ７７）：］などによって行う
。
点アガロースゲル電気泳動法〔１１，Ｗｉｅｓｌａｎｄ
ｅｒ＋Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒ
ｙ ９８ 、３０５（１９’７９））やポリアクリルア
ミドゲル電気泳動法ＣＡ、 Ｍ、 Ｍａｘａｍ ら：Ｐ
ｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、八ｃａｄ、 Ｓｃｉ、 、 ＵＳ
Ａユ４，５６０ （１！Ｊ７７）：］などによって行う
。
ＤＮＡ断片の結合反応は、２−２００ｍＭ （好ましく
は１０〜４０ｍＭ）のＴｒ ｉ ５−Ｈ（１！（ｐ Ｈ
６，１〜９．５、好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、
２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇ Ｃｌ
１２．０．１〜１０ ｍＭ （好ましくは０．５−２、
０ ｍ Ｍ ）のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは
５〜１０ｍＭ）のジチオスレイトールを含む反応液中で
、Ｔ４Ｉ）ＮΔリガーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜
３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間
（好ましくは２〜２０時間）行う。
は１０〜４０ｍＭ）のＴｒ ｉ ５−Ｈ（１！（ｐ Ｈ
６，１〜９．５、好ましくはｐ Ｈ７，０〜８．０）、
２〜２０ｍＭ（好ましくは５〜１０ｍＭ）のＭｇ Ｃｌ
１２．０．１〜１０ ｍＭ （好ましくは０．５−２、
０ ｍ Ｍ ）のＡＴＰ、１〜５０ｍＭ （好ましくは
５〜１０ｍＭ）のジチオスレイトールを含む反応液中で
、Ｔ４Ｉ）ＮΔリガーゼ０．３〜１０単位を用い、１〜
３７℃（好ましくは３〜２０℃）で１５分間〜７２時間
（好ましくは２〜２０時間）行う。
結合反応によって生じた組換え体プラスミドＤＮＡは、
必要によりＣｏｈｅｎ らの形質転換法〔Ｓ。
必要によりＣｏｈｅｎ らの形質転換法〔Ｓ。
Ｎ、 Ｃｏｈｅｎ ら＋Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ１． Ａｃａ
ｄ、 Ｓｃｉ、 、 ＵＳＡ６９ 、２１１０（１９７
２） ：］によって、大腸菌に導入する。
ｄ、 Ｓｃｉ、 、 ＵＳＡ６９ 、２１１０（１９７
２） ：］によって、大腸菌に導入する。
組換え体プラスミドＤＮＡを持つ大腸菌から該ＤＮＡの
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはＢｉ
ｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｉｆ、 Ｃ，ＢｉｒｎｂＯｉｍ
ら・Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ７． １
５ １ ３ （１９７９）などを用いて行う。
単離は、後に述べる実施例１に示した方法あるいはＢｉ
ｒｎｂｏｉｍらの方法（Ｉｆ、 Ｃ，ＢｉｒｎｂＯｉｍ
ら・Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、 ７． １
５ １ ３ （１９７９）などを用いて行う。
プラスミドＤＮＡを１〜１０種類の制限酵素で消化後ア
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
ガロースゲル電気泳動あるいはポリアクリルアミドゲル
電気泳動により切断部位を調べる。
更にＤＮＡの塩基配列を決定する必要がある時はマキザ
ム・ギルバード法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 。
ム・ギルバード法［Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ
、 Ｓｃｉ、 。
ユ４．’５６０ （１９７７）：］によって決定する。
以上のような条件で組換え体プラスミドＤＮＡを製造す
ることができる。
ることができる。
本発明のＩＦＮ−ｒポリペプチド誘導体は以下のとおり
に製造できる。
に製造できる。
すなわち、プラスミド（例えばｐＧＶＡ−４）を用いて
大腸菌に一１２ＨＢ１０１を形質転換させ、アンピシリ
ン耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐＧＶＡ
−４を有する大腸菌を選びだす。ｐＧＶＡ−４を有する
大腸菌を培地に培養することにより培養物中にＩＦＮ−
ｒポリペプチド誘導体を生成させることができる。
大腸菌に一１２ＨＢ１０１を形質転換させ、アンピシリ
ン耐性（ＡｐＲ以下同じ）のコロニーの中からｐＧＶＡ
−４を有する大腸菌を選びだす。ｐＧＶＡ−４を有する
大腸菌を培地に培養することにより培養物中にＩＦＮ−
ｒポリペプチド誘導体を生成させることができる。
ここで用いる培地としては大腸菌の生育ならびにＩＦＮ
−ｒポリペプチド誘導体の生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
−ｒポリペプチド誘導体の生産に好適なものならば合成
培地、天然培地のいずれも使用できる。
炭素源としては、グルコース、フラクトース、ラクトー
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ，Ｃ１！。
ス、グリセロール、マンニトール、ソルビトールなどが
、窒素源としては、ＮＨ，Ｃ１！。
（ＮＨ４）２Ｓｏ、、カザミノ酸、酵母エキス。
ポリペプトン、肉エキス、バクトドリプトン、コーン・
ステイープリカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ
２ ）（ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ２゜ＭｇＳＯ
４，ビタミン Ｂ＋ 、ＭｇＣＬなどが使用できる。
ステイープリカーなどが、その他の栄養源としては、Ｋ
２ ）（ＰＯ４、ＫＨ２ＰＯ４、ＮａＣｌ２゜ＭｇＳＯ
４，ビタミン Ｂ＋ 、ＭｇＣＬなどが使用できる。
培養はｐ Ｈ５，５−８，５、温度１８−４０℃で通気
攪拌培養により行われる。
攪拌培養により行われる。
培養５〜９０時間で培養菌体中にヒ）ＩＦＮ−Ｔポリペ
プチド誘導体が蓄積するので、培養物から菌体を集菌し
、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰返して菌体
を破砕し、遠心して得られる上清から通常のポリペプチ
ドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。
プチド誘導体が蓄積するので、培養物から菌体を集菌し
、菌体をリゾチーム処理後、凍結、融解を繰返して菌体
を破砕し、遠心して得られる上清から通常のポリペプチ
ドの抽出方法に従ってポリペプチドを採取する。
ヒ）ＩＦＮ−ｒの定量はアームストロングの方法 ［Ｊ
、八、 Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ら ： Ａｐｐｌ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、２１゜７２３−７２５ （１９７１）
）に従って行う。
、八、 Ａｒｍｓｔｒｏｎｇ ら ： Ａｐｐｌ、Ｍｉ
ｃｒｏｂｉｏｌ、２１゜７２３−７２５ （１９７１）
）に従って行う。
以下に本発明の実施例を示す。
実施例１゜
ＩＦＮ−ｒ遺伝子の下流にＢａｍＨＩ切断部位を有する
プラスミドｐＧＢＤ−１の造成；プラスミドｐ ｒＦＮ
ｒ−Ｇ４ ［３，６キロベース（以下キロベースをＫｂ
と略記する）〕２μｇを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！
（ｐｆｌ ７．５）、１０ｍＭｇ Ｃｊ！ ２ 、 ’
１０ ｍ Ｍジチオスレイトールおよび５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含む全量５０μｌの溶液（以下“Ｙ−５０緩衝
液”と略記する）に溶かし、制限酵素ｐｖｕＩＩ （全
酒造社製、以下制限酵素については特記しない限りすべ
て全酒造社製）４単位を加えて、３７℃で２時間消化反
応を行なった。
プラスミドｐＧＢＤ−１の造成；プラスミドｐ ｒＦＮ
ｒ−Ｇ４ ［３，６キロベース（以下キロベースをＫｂ
と略記する）〕２μｇを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！
（ｐｆｌ ７．５）、１０ｍＭｇ Ｃｊ！ ２ 、 ’
１０ ｍ Ｍジチオスレイトールおよび５０ｍＭ Ｎ
ａＣｌを含む全量５０μｌの溶液（以下“Ｙ−５０緩衝
液”と略記する）に溶かし、制限酵素ｐｖｕＩＩ （全
酒造社製、以下制限酵素については特記しない限りすべ
て全酒造社製）４単位を加えて、３７℃で２時間消化反
応を行なった。
低融点アガロースゲル電気泳動法（以下Ｌ Ｇ Ｔ法と
略記する）にて精製し、３．６．ＫｂのｐｌＦＮｒ−Ｇ
４ ＤＮＡ断片１μｇを得た。このＤＮＡ断片０．１μ
ｇを５ピコモルの５′−リン酸化ＢａｍＨＩリンカ−（
５’ −ｐＣＣＧＧ八ＴＣＣへＧ −３’ ；コラボレ
イティブ社製）の存在下２０ｍＭ）’ＩＩス塩酸（ｐＨ
７，６）、１０ｍＭ ＭｇＣβ２，１３ｍＭジチオスレ
イトールおよび０．５ｍＭ八Ｔへを含む緩衝液（以下こ
の緩衝液を“Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液”と略記する）２０
μβ中２単位のＴ４リガーゼ（宝酒造社製：以下同じ）
を加え、４℃１８時間反応を行った。
略記する）にて精製し、３．６．ＫｂのｐｌＦＮｒ−Ｇ
４ ＤＮＡ断片１μｇを得た。このＤＮＡ断片０．１μ
ｇを５ピコモルの５′−リン酸化ＢａｍＨＩリンカ−（
５’ −ｐＣＣＧＧ八ＴＣＣへＧ −３’ ；コラボレ
イティブ社製）の存在下２０ｍＭ）’ＩＩス塩酸（ｐＨ
７，６）、１０ｍＭ ＭｇＣβ２，１３ｍＭジチオスレ
イトールおよび０．５ｍＭ八Ｔへを含む緩衝液（以下こ
の緩衝液を“Ｔ４１Ｊガーゼ緩衝液”と略記する）２０
μβ中２単位のＴ４リガーゼ（宝酒造社製：以下同じ）
を加え、４℃１８時間反応を行った。
このようにして得た組換え体プラスミドＤＮＡを用い、
大腸菌８８１０１株（Ｓｏｌ １ｖｅｒ ら： Ｇ［１
ＮＥ２．７５ （１９７７）〕を［：ｏｈｅｎ らの方
法〔Ｓ、 Ｎ。
大腸菌８８１０１株（Ｓｏｌ １ｖｅｒ ら： Ｇ［１
ＮＥ２．７５ （１９７７）〕を［：ｏｈｅｎ らの方
法〔Ｓ、 Ｎ。
（：ｏｈｅｎら： Ｐｒｏｃ、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、１９ 。
Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、１９ 。
２１１０（１９７２））（以下大腸菌の形質転換にはこ
の方法を用いる）により形質転換し、アンピシリン耐性
（Ａｐ”、以下同じ）のコロニーを得た。この形質転換
株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法（１，Ｃ，Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍら；Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
。
の方法を用いる）により形質転換し、アンピシリン耐性
（Ａｐ”、以下同じ）のコロニーを得た。この形質転換
株よりプラスミドＤＮＡを公知の方法（１，Ｃ，Ｂｉｒ
ｎｂｏｉｍら；Ｎｕｃｌｅｉｃ 八ｃｉｄｓ Ｒｅｓ、
。
ユ、１５１３ （１９７９））（以下プラスミドＤＮＡ
の分離はこの方法を用いる）に従って分離精製し、該プ
ラスミドＤＮＡをＢａｍ）（Ｉ等の制限酵素で消化する
ことによりプラスミドの構造解析を行った結果、ｐ Ｉ
ＦＮｒ−Ｇ４のｐｖｕｌＩ部位にＢａｍＨＩ！Ｊンカー
が挿入された組換え体プラスミドｐＧＢＤｉを得た。プ
ラスミドｐＧＢＤ−１をもつ大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ Ｂ Ｄ−１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３９４）として工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）に寄託されている。
の分離はこの方法を用いる）に従って分離精製し、該プ
ラスミドＤＮＡをＢａｍ）（Ｉ等の制限酵素で消化する
ことによりプラスミドの構造解析を行った結果、ｐ Ｉ
ＦＮｒ−Ｇ４のｐｖｕｌＩ部位にＢａｍＨＩ！Ｊンカー
が挿入された組換え体プラスミドｐＧＢＤｉを得た。プ
ラスミドｐＧＢＤ−１をもつ大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ Ｂ Ｄ−１（ＦＥＲＭ Ｂ
Ｐ−３９４）として工業技術院微生物工業技術研究所（
微工研）に寄託されている。
実施例２゜
３−Ｔｙｒ−ＩＦＮ−γをコードする組換え体プラスミ
ドｐＧＶＡ−４の造成： 実施例１により得られたｐＧＢＤ−１よりＤＮＡ塩基の
修飾をな（し、５ｉｎｌで切断されるようにするため、
まずｐＧＢＤ−１を常法により大腸菌Ｇ Ｍ ３１ （
ｔｈｒ Ｉｅｕ ｄｃｍ ｈｉｓ ｔｈｉ ａｒａ ｌ
ａｃ ｇａｌＫ、Ｔ、ｘｙｌ ｍｔｌ ｓｔｒ ｔｏｎ
Ａ） （Ｍａｒｉｎｕｓ ら Ｍｏ１ｅｃ。
ドｐＧＶＡ−４の造成： 実施例１により得られたｐＧＢＤ−１よりＤＮＡ塩基の
修飾をな（し、５ｉｎｌで切断されるようにするため、
まずｐＧＢＤ−１を常法により大腸菌Ｇ Ｍ ３１ （
ｔｈｒ Ｉｅｕ ｄｃｍ ｈｉｓ ｔｈｉ ａｒａ ｌ
ａｃ ｇａｌＫ、Ｔ、ｘｙｌ ｍｔｌ ｓｔｒ ｔｏｎ
Ａ） （Ｍａｒｉｎｕｓ ら Ｍｏ１ｅｃ。
Ｇｅｎ、 Ｇｅｎｅｔ、 １２７．４７−５５（１９７
３）］に形質転換、し、得られたコロニーから常法によ
り大量にｐＧＢＤ−１を調製した。得られたｐＧＢＤ−
１ＤＮＡ６μｇをＹ−５０緩衝液５０μβに溶かし、制
限酵素Ｓｉｎ １（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ社製）１０単位を
加え、３７℃で３時間消化反応を行った。次いで、Ｎａ
Ｃｌを終濃度１００ｍＭとなるように加え、ＢａｍＨｌ
１０単位を加え、３７℃でさらに３時間消化反応を行
った。この反応液からＬＧＴ法により、ヒ）ＩＦＮ−ｒ
ＤＮΔの大部分を含む約８５０塩基対（以下ｂｐと略記
する）のＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。
３）］に形質転換、し、得られたコロニーから常法によ
り大量にｐＧＢＤ−１を調製した。得られたｐＧＢＤ−
１ＤＮＡ６μｇをＹ−５０緩衝液５０μβに溶かし、制
限酵素Ｓｉｎ １（Ｂｉｏ Ｔｅｃｈ社製）１０単位を
加え、３７℃で３時間消化反応を行った。次いで、Ｎａ
Ｃｌを終濃度１００ｍＭとなるように加え、ＢａｍＨｌ
１０単位を加え、３７℃でさらに３時間消化反応を行
った。この反応液からＬＧＴ法により、ヒ）ＩＦＮ−ｒ
ＤＮΔの大部分を含む約８５０塩基対（以下ｂｐと略記
する）のＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。
別に、特開昭５８−１１０６００公報記載の方法で調製
したｐＫＹＰｌｏの３μｇを２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
）１７．５）、１０ｍＭ ＭＣＣｊ２２゜１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭＮａＣＩｌ（以下“Ｙ
−１００緩衝液′”と略記する）を含む全量４０μｌの
溶液に溶かし、制限酵素Ｃｊ！ａｌ（ベーリンガーマン
ハイム社）とＢａｍＨＩそれぞれ５単位ずつを加え、３
７℃で３時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法によりトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含
む約４．３ ｋ ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを１等だ
。
したｐＫＹＰｌｏの３μｇを２０ｍＭ）リス−塩酸（ｐ
）１７．５）、１０ｍＭ ＭＣＣｊ２２゜１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭＮａＣＩｌ（以下“Ｙ
−１００緩衝液′”と略記する）を含む全量４０μｌの
溶液に溶かし、制限酵素Ｃｊ！ａｌ（ベーリンガーマン
ハイム社）とＢａｍＨＩそれぞれ５単位ずつを加え、３
７℃で３時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ
法によりトリプトファンプロモーター（Ｐｔｒｐ）を含
む約４．３ ｋ ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを１等だ
。
一方、成熟ヒトＩＦＮ−ｒポリペプチドはＮ末端からＣ
ｙｓ−Ｔｒｙ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この３番目
のＣｙｓをＴｙｒに変換し、かつ発現に必要な開始コド
ン（ＡＴＧ）を最初のＣｙｓの直前に付与する目的で下
記のようなりＮＡ’）ンカーを合成した。
ｙｓ−Ｔｒｙ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この３番目
のＣｙｓをＴｙｒに変換し、かつ発現に必要な開始コド
ン（ＡＴＧ）を最初のＣｙｓの直前に付与する目的で下
記のようなりＮＡ’）ンカーを合成した。
まず一本鎮ＤＮＡ、１７−、、、と１８−、、、を通常
のトリエステル法［Ｒ，Ｃｒｅａ ら； Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
のトリエステル法［Ｒ，Ｃｒｅａ ら； Ｐｒｏｃ、
Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。
Ｓｃｉ、、 ７５，５７６５（１９７８） ］により合
成した。１７−０゜および１８−一、の各々２μｇを５
’Ｑ ｍ Ｍ ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣＣ，５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量４０μβの
溶液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位
（全酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反
応を行った。
成した。１７−０゜および１８−一、の各々２μｇを５
’Ｑ ｍ Ｍ ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）、１０ｍ
Ｍ ＭｇＣＣ，５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量４０μβの
溶液にとかし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ３０単位
（全酒造社製）を加えて、３７℃で６０分間リン酸化反
応を行った。
次に上記で１等だｐＧＢＤ−１由来のＳｉｎｌ−Ｂａｍ
Ｈ［断片（約８５０ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐ
ＫＹＰ１０のＣｊ！ａ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約４．３
ｋｂ）１．０μｇとをＴ４リガーセ緩衝液２５μ！に溶
かし、この混合液に」ニ記ＤＮΔリンカ−を約０．１μ
ｇ加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮΔリガーゼ６
単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行った。
Ｈ［断片（約８５０ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐ
ＫＹＰ１０のＣｊ！ａ Ｉ−ＢａｍＨＩ断片（約４．３
ｋｂ）１．０μｇとをＴ４リガーセ緩衝液２５μ！に溶
かし、この混合液に」ニ記ＤＮΔリンカ−を約０．１μ
ｇ加えた。この混合溶液にさらにＴ４ＤＮΔリガーゼ６
単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し、第
２図に示したｐＧｓＢ−６を得た。ｐＧＳＢ−６の構造
はＥｃｏＲＩ、Ｃｌ１ａ１、Ｂ’ａｍＨＩで消化後、ア
ガロースゲル電気泳動により確認した。ｐＧｓＢ−６の
（：ｊ２ａｌ＝ＳｉｎＩ付近の塩基配列は であることをマキザム・ギルバートの方法［Ａ、 Ｍ。
８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し、第
２図に示したｐＧｓＢ−６を得た。ｐＧＳＢ−６の構造
はＥｃｏＲＩ、Ｃｌ１ａ１、Ｂ’ａｍＨＩで消化後、ア
ガロースゲル電気泳動により確認した。ｐＧｓＢ−６の
（：ｊ２ａｌ＝ＳｉｎＩ付近の塩基配列は であることをマキザム・ギルバートの方法［Ａ、 Ｍ。
Ｍａｘａｍら； Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、
Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ、、ユ１゜５６０ （１９７７））で
確認した。
Ｓｃｉ、ｌｌ５Ａ、、ユ１゜５６０ （１９７７））で
確認した。
ｐＧｓＢ−６のコードするヒトＩ ＦＮ−ｒポリペプチ
ド〔本誘導体を３−Ｔｙｒ−１ＦＮ−ｒと呼ぶ〕は成熟
型ヒトＩＦＮ−ｒの３番目のＣｙｓがＴｙｒに置換して
いる点で公知のものとは明らかに異なる。
ド〔本誘導体を３−Ｔｙｒ−１ＦＮ−ｒと呼ぶ〕は成熟
型ヒトＩＦＮ−ｒの３番目のＣｙｓがＴｙｒに置換して
いる点で公知のものとは明らかに異なる。
さらにｐＧＳＢ−６の１μｇを全量３０μβのＹ−５０
緩衝液に溶かし、２単位のＣｌ１ａｌを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。フェノール抽出、クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。
緩衝液に溶かし、２単位のＣｌ１ａｌを加え、３７℃で
２時間消化反応を行った。フェノール抽出、クロロホル
ム抽出、エタノール沈殿によりＤＮＡ断片を回収した。
このＤＮＡ断片を３０μ！の６７ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｊ！ （ｐ）（８，８） 、 ６．７ｍＭ ＭｇＣＬ
、１０ｍＭメルカプトエタノール、 ６．７μＭ ＥＤ
ＴＡ、 １６．６ｍＭ （Ｎｌｌ＜）２ｓ０４゜１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、１ｍ
Ｍ ｄＧＴＰの溶液に溶かし、５単位の′ｌ゛４ポリメ
ラーゼ（宝？１社製）を加え、３７℃で１時間埋め込み
反応を行った。
ｊ！ （ｐ）（８，８） 、 ６．７ｍＭ ＭｇＣＬ
、１０ｍＭメルカプトエタノール、 ６．７μＭ ＥＤ
ＴＡ、 １６．６ｍＭ （Ｎｌｌ＜）２ｓ０４゜１ｍＭ
ｄＡＴＰ、１ｍＭ ｄＴＴＰ、１ｍＭｄＣＴＰ、１ｍ
Ｍ ｄＧＴＰの溶液に溶かし、５単位の′ｌ゛４ポリメ
ラーゼ（宝？１社製）を加え、３７℃で１時間埋め込み
反応を行った。
フェノール抽出、クロロホルム抽出、エタノール沈殿に
よりＤＮＡ断片を回収し、その０．１μｇを５０μｌの
Ｔ４１Ｊガ−セ緩衝液に溶かし、２．５単位のＴ ／ｌ
ＩＪガ−セを加え４℃で１６時間結合反応を行っブこ
。
よりＤＮＡ断片を回収し、その０．１μｇを５０μｌの
Ｔ４１Ｊガ−セ緩衝液に溶かし、２．５単位のＴ ／ｌ
ＩＪガ−セを加え４℃で１６時間結合反応を行っブこ
。
このようにして得たＤＮＡ混合物を大腸菌ＨＢ１０１株
に形質転換し、生じたΔｐＲのコロニーからプラスミド
ＤＮＡを回収し、ｐＧＶＡ−４を得た。ｐＧＶＡ−４の
構造はＮｒｕｌ、ＢａｍＨＪ、ＥｃｏＲｌにより切断し
て確を忍した。また、ｐｃｖΔ−４の５Ｄ−ＡＴＣ間の
塩基配列はマキサム・ギルバートの方法（前出）により
確認し、であることが明らかとなった。
に形質転換し、生じたΔｐＲのコロニーからプラスミド
ＤＮＡを回収し、ｐＧＶＡ−４を得た。ｐＧＶＡ−４の
構造はＮｒｕｌ、ＢａｍＨＪ、ＥｃｏＲｌにより切断し
て確を忍した。また、ｐｃｖΔ−４の５Ｄ−ＡＴＣ間の
塩基配列はマキサム・ギルバートの方法（前出）により
確認し、であることが明らかとなった。
プラスミドｐＧＶΔ−４をもつ大腸菌はＢｓｃｈｅｒｉ
ｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＧＶＡ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３
９５＞として微工研に寄託されている。
ｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＧＶＡ−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３
９５＞として微工研に寄託されている。
実施例３゜
１．３−３ｅｒ−１ＦＮ−ｒをコードする組換え体プラ
スミドｐＣ，ＶＫ−１，３の造成：実施例１により得ら
れたｐＧＢＤ−１ＤＮＡ６μｇをＹ−５０緩衝液５０μ
βに溶かし、制限酵素Ｓ ｉ ｎ Ｉ （Ｂｉｏ Ｔｅ
ｃ社製）１０単位を加え、３７℃で３時間消化反応を行
った。
スミドｐＣ，ＶＫ−１，３の造成：実施例１により得ら
れたｐＧＢＤ−１ＤＮＡ６μｇをＹ−５０緩衝液５０μ
βに溶かし、制限酵素Ｓ ｉ ｎ Ｉ （Ｂｉｏ Ｔｅ
ｃ社製）１０単位を加え、３７℃で３時間消化反応を行
った。
次いでＮａＣｊ！を終濃度１００ｍＭとなるように加え
、Ｂａｍ）Ｉ Ｔ １０単位を加え、３７℃でさらに３
時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
ヒ） ＩＦＮ−ｒＤＮΔの大部分を含む約８５０ｂｌ）
のＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。
、Ｂａｍ）Ｉ Ｔ １０単位を加え、３７℃でさらに３
時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
ヒ） ＩＦＮ−ｒＤＮΔの大部分を含む約８５０ｂｌ）
のＤＮＡ断片約０．８μｇを得た。
別にｐＫＹＰ−１０の３μｇを２０ｍＭ）リス−塩酸（
ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１！２゜１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭＮａ（１（以下“Ｙ−
１００緩衝液″と略記する）を含む全量４０μβの溶液
に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［とＢａｍＨＩそれぞ
れ５単位ずつを加え３７１シて３時間消化反応を行った
。この反応液からＬ Ｇ Ｔ法によりＰｔｒｐを含む約
４．３ ｋ ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを１等だ。
ｐＨ７，５）、１０ｍＭ ＭｇＣ１！２゜１０ｍＭジチ
オスレイトールおよび１００ｍＭＮａ（１（以下“Ｙ−
１００緩衝液″と略記する）を含む全量４０μβの溶液
に溶かし、制限酵素ＨｉｎｄＩＩ［とＢａｍＨＩそれぞ
れ５単位ずつを加え３７１シて３時間消化反応を行った
。この反応液からＬ Ｇ Ｔ法によりＰｔｒｐを含む約
４．３ ｋ ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを１等だ。
一方、成熟ヒトＩ ＦＮ−ｒポリペプチドはＮ末端から
Ｃｙ ５−Ｔｙ ｒ−Ｃｙ ｓ−の構造を有するがこの
１番目さ３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換し、かつ、発現
に必要な開始コドン（ΔＴＧ）を最初のＳｅｒの直曲に
付与する目的で、下記のようなりＮＡ ？ノンカーを合
成した。
Ｃｙ ５−Ｔｙ ｒ−Ｃｙ ｓ−の構造を有するがこの
１番目さ３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換し、かつ、発現
に必要な開始コドン（ΔＴＧ）を最初のＳｅｒの直曲に
付与する目的で、下記のようなりＮＡ ？ノンカーを合
成した。
まず一本領ＤＮＡ、２０−、、、と１９−ｍａｒを通常
のトリエステル法［Ｒ，Ｃｒｅａら； Ｐｒｏｃ、Ｎａ
目。
のトリエステル法［Ｒ，Ｃｒｅａら； Ｐｒｏｃ、Ｎａ
目。
八ｃａｄ、Ｓｃｉ、、７５．５７６５ （１９７８））
ｌごより合成した。２０−、、、ｒおよび１９−１゜ｒ
の各々２μｇを５０’ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ ’（
ｐＨ７，５） 、１０ｍＭＭｇＣ！２．５ｍＭジチオス
レイトール、Ｏ，１ｍＭＥ Ｄ ＴΔ及び１ｍＭ ＡＴ
Ｐを含む全量４０μβの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ３０単位（宝酒造社製）を加えて、３７
℃で６０分間リン酸化反応を行なった。
ｌごより合成した。２０−、、、ｒおよび１９−１゜ｒ
の各々２μｇを５０’ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ！ ’（
ｐＨ７，５） 、１０ｍＭＭｇＣ！２．５ｍＭジチオス
レイトール、Ｏ，１ｍＭＥ Ｄ ＴΔ及び１ｍＭ ＡＴ
Ｐを含む全量４０μβの溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレ
オチドキナーゼ３０単位（宝酒造社製）を加えて、３７
℃で６０分間リン酸化反応を行なった。
次に上記で得たｐＧＢＤ−１由来のＳｉｎｌ−ＢａｍＨ
Ｔ断片（約８５０ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐＫ
ＹＰ１０のＨｉ ｎ ｄ ＩＨ−Ｂ ａ ｍ Ｈ１断片
（約４．３ｋｂ）１．．０μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２
５μｌに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−を約
０．１μｇ加えた。この混合液にさらにＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行なった
。
Ｔ断片（約８５０ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐＫ
ＹＰ１０のＨｉ ｎ ｄ ＩＨ−Ｂ ａ ｍ Ｈ１断片
（約４．３ｋｂ）１．．０μｇをＴ４リガーゼ緩衝液２
５μｌに溶かし、この混合液に上記ＤＮＡリンカ−を約
０．１μｇ加えた。この混合液にさらにＴ４ＤＮＡリガ
ーゼ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を行なった
。
碍られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、ＡｐＨのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し、第
３図に示したｐＧＶＫ−１３を得た。ｐＧＶＫ−１３の
構造はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｍ、Ｃ（ｌａ Ｔ、Ｂａｍ
ＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により確認した
。ｐＧＶＫ−１３のＨｉｎｄｌ１１部位からＳｉｎｌ部
位までの塩基配列はであることをマキサム・ギルバート
の方法で確認した。
８１０１株を形質転換し、ＡｐＨのコロニーを得た。こ
のコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し、第
３図に示したｐＧＶＫ−１３を得た。ｐＧＶＫ−１３の
構造はＥｃｏＲＩ、Ｈｉｎｄｍ、Ｃ（ｌａ Ｔ、Ｂａｍ
ＨＩで消化後、アガロースゲル電気泳動により確認した
。ｐＧＶＫ−１３のＨｉｎｄｌ１１部位からＳｉｎｌ部
位までの塩基配列はであることをマキサム・ギルバート
の方法で確認した。
ｐＧＶＫ−１３のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチ
ド〔本誘導体を１．３−３ｅｔ −１ＦＮ−ｒと呼ぶ〕
は成熟型ヒ）ＩＦＮ−ｒの１番目と３番目のＣｙｓがＳ
ｅｒに置換している点で公知のものとは明らかに異なる
。プラスミドｐＧＶＫ−１３をもつ大腸菌は微工研にＢ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＶＫ−１３（Ｆ
ｌミＲＭ ｌ］Ｐ−４３２）として寄託されている。
ド〔本誘導体を１．３−３ｅｔ −１ＦＮ−ｒと呼ぶ〕
は成熟型ヒ）ＩＦＮ−ｒの１番目と３番目のＣｙｓがＳ
ｅｒに置換している点で公知のものとは明らかに異なる
。プラスミドｐＧＶＫ−１３をもつ大腸菌は微工研にＢ
ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ ＩＧＶＫ−１３（Ｆ
ｌミＲＭ ｌ］Ｐ−４３２）として寄託されている。
実施例４゜
ヒトＩＦＮ−ｒのＮ末端部分を欠失したポリペプチドを
コードするプラスミドｐｃｗｃ−１０の造成； 参考例２の方法によって得たｐＧＫΔ−２（５，２Ｋｂ
）２５ｕｇを２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）。
コードするプラスミドｐｃｗｃ−１０の造成； 参考例２の方法によって得たｐＧＫΔ−２（５，２Ｋｂ
）２５ｕｇを２０ｍＭトリス−塩酸（ｐＨ７，５）。
１０ｍＭ ＭｇＣｊ！２，１０ｍＭジチオスレイトール
、１０ｍＭ ＮａＣｌ１（以下“Ｙ−１０緩衝液パと略
記する）４００μｌに溶かし、５０単位のＣｊ！ａｌ（
ベーリンガーマンハイム社）を加え、３７℃で３時間消
化反応を行った。この反応液８０μｌ （ＤＮＡとして
５μｇを含む）に１０倍のＢＡＬ３１緩衝液〔２００ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐ Ｈ８，１）、ＬＭ ＮａＣＪ、１
２（１ｍＭ ＣａＣｕ５）を１２μβ、水を２８μｌ加
え、さらにヌクレアーゼＢＡＬ−３１（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製）０．２５単位を
加えて、３０℃で２０秒間反応を行った。ＢＡＬ−３１
はＤＮＡ分子を末端から削ってゆく活性（エキソヌクレ
アーゼ活性）を有し、上記用いた反応条件は０、Ｅａｒ
部位から約３０塩基対削れる条件である。
、１０ｍＭ ＮａＣｌ１（以下“Ｙ−１０緩衝液パと略
記する）４００μｌに溶かし、５０単位のＣｊ！ａｌ（
ベーリンガーマンハイム社）を加え、３７℃で３時間消
化反応を行った。この反応液８０μｌ （ＤＮＡとして
５μｇを含む）に１０倍のＢＡＬ３１緩衝液〔２００ｍ
Ｍトリス−塩酸（ｐ Ｈ８，１）、ＬＭ ＮａＣＪ、１
２（１ｍＭ ＣａＣｕ５）を１２μβ、水を２８μｌ加
え、さらにヌクレアーゼＢＡＬ−３１（ベセスダ・リサ
ーチ・ラボラトリーズ（ＢＲＬ）社製）０．２５単位を
加えて、３０℃で２０秒間反応を行った。ＢＡＬ−３１
はＤＮＡ分子を末端から削ってゆく活性（エキソヌクレ
アーゼ活性）を有し、上記用いた反応条件は０、Ｅａｒ
部位から約３０塩基対削れる条件である。
この反応液をフェノール抽出、クロロホルム抽出後、エ
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。回収したｐＧＫ
Δ−２−Ｃｊ！ａｌ−ＢＡＬ−３１消化断片１．０μｇ
を２０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、２単位のＰｓｔ
ｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法により約４．３ＫｂのＤＮＡ断片０５μ
ｇを回収した。
タノール沈澱によりＤＮＡを回収した。回収したｐＧＫ
Δ−２−Ｃｊ！ａｌ−ＢＡＬ−３１消化断片１．０μｇ
を２０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、２単位のＰｓｔ
ｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った。この反応
液からＬＧＴ法により約４．３ＫｂのＤＮＡ断片０５μ
ｇを回収した。
次に、ΔＴＧ・発現ベクターｐＴｒＳ３（３，８Ｋｂ）
５．０μｇを４０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、１０
単位の５ｐｈｌ（ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で３時間
消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により８８
０ｂｐのＤＮＡ断片３．０μｇを精製１回収した。この
８８０ｂｐのＤＮＡ断片３、Ｏｐｇ を６ ７ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐ）１８．３） 。
５．０μｇを４０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、１０
単位の５ｐｈｌ（ＢＲＬ社製）を加え、３７℃で３時間
消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により８８
０ｂｐのＤＮＡ断片３．０μｇを精製１回収した。この
８８０ｂｐのＤＮＡ断片３、Ｏｐｇ を６ ７ｍＭ Ｔ
ｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐ）１８．３） 。
６．７ｍＭ ’ＭｇＣＣ，１０ｍＭメルカプトエタノー
ル、６．７μＭ ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ （ＮＨ４）
２ＳＯ，を含む溶液に溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。
ル、６．７μＭ ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ （ＮＨ４）
２ＳＯ，を含む溶液に溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ。
ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰそれぞれ１ｍＭになるように加え、
さらに６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製
以下同じ）を加えて、３７℃で１時間反応させ、突出末
端を削った。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、
エタノール沈殿により、ＤＮＡ断片１．０μｇを回収し
た。該ＤＮＡ断片１．０μｇを全量２０μｌのＹ−５０
緩衝液に溶かし、２単位のｐｓｔｌを加え、３７℃で３
時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
、Ｐｔｒｐを含む約８８０ｂｐのＤＮＡ断片０．５μｇ
を回収した。
さらに６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼ（全酒造社製
以下同じ）を加えて、３７℃で１時間反応させ、突出末
端を削った。フェノール抽出、クロロホルム抽出の後、
エタノール沈殿により、ＤＮＡ断片１．０μｇを回収し
た。該ＤＮＡ断片１．０μｇを全量２０μｌのＹ−５０
緩衝液に溶かし、２単位のｐｓｔｌを加え、３７℃で３
時間消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により
、Ｐｔｒｐを含む約８８０ｂｐのＤＮＡ断片０．５μｇ
を回収した。
次に上記で得た、ｐＧＫ／１２のＣｊ２ａｌ−Ｐｓｔｌ
断片（約４．３Ｋｂ）０．５μｇとｐＴｒＳ３−３ｐｈ
Ｉ−Ｔ４ポリメラーゼ−Ｐｓｔｌ断片（８８０ｂｐ）
０．５μｇを全量１０μβのＴ４リガーセ緩衝液に溶か
しＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ０．３単位を加え、
４℃で１８時間結合反応を行った。
断片（約４．３Ｋｂ）０．５μｇとｐＴｒＳ３−３ｐｈ
Ｉ−Ｔ４ポリメラーゼ−Ｐｓｔｌ断片（８８０ｂｐ）
０．５μｇを全量１０μβのＴ４リガーセ緩衝液に溶か
しＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ０．３単位を加え、
４℃で１８時間結合反応を行った。
得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大鴫菌Ｈ
ＢＩＯＩ株を形質転換し、生じたＡｐ“のコロニーから
プラスミドＤＮＡを回収し、第５図に示したｐＧＷＣ−
１０を得た。ｐＧＷＣ−１０の構造は、ＥｃｏＲＴ、Ｃ
１ａ Ｔ、ＢａｍＨＴで消化後、アガロースゲル電気泳
動により確認した。
ＢＩＯＩ株を形質転換し、生じたＡｐ“のコロニーから
プラスミドＤＮＡを回収し、第５図に示したｐＧＷＣ−
１０を得た。ｐＧＷＣ−１０の構造は、ＥｃｏＲＴ、Ｃ
１ａ Ｔ、ＢａｍＨＴで消化後、アガロースゲル電気泳
動により確認した。
ｐＧＷＣ−１０のヒトＩＦＮ−Ｔ構造遺伝子のＮである
ことをマキザム・ギルバートの方法で確認し、成熟型ヒ
）ＩＦＮ−ｒポリペプチド〔本誘導体をＩＦＮ−ｒ（△
１−７）と呼ぶ〕のＮ末端のＣｙｓから７番めのＴｙｒ
まで７つのアミノ酸が欠失し、８番めのＶａｎから始ま
っていることが確認された。プラスミドｐＧＷＣ−１０
をもつ大腸菌はＥｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｉ Ｇ ＷＣ−１０（ＦＢＲＭＢＰ−３９７）として
微工研に寄託されている。
ことをマキザム・ギルバートの方法で確認し、成熟型ヒ
）ＩＦＮ−ｒポリペプチド〔本誘導体をＩＦＮ−ｒ（△
１−７）と呼ぶ〕のＮ末端のＣｙｓから７番めのＴｙｒ
まで７つのアミノ酸が欠失し、８番めのＶａｎから始ま
っていることが確認された。プラスミドｐＧＷＣ−１０
をもつ大腸菌はＥｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ
Ｉ Ｇ ＷＣ−１０（ＦＢＲＭＢＰ−３９７）として
微工研に寄託されている。
実施例５゜
ｐＧＢＤ−１，ｐＧＶΔ−４，ｐＧＶＫ−１３゜ｐｃｗ
ｃ−１Ｑを保有する大腸菌によるＩＦＩＩ−Ｔ誘導体の
生産： 実施例１〜４で得た組換え体プラスミドｐＧＢＤ−１，
ｐＧＶΔ−４，ｐＧＶＫ−１３およびｐＧＷＣ−１０を
もつ大腸菌８８１０１株（それぞれをＩＧＢＤＩ、ＩＧ
ＶＡ−４，ＩＧＶＫ−１３およびＩＧＷＣｉｏと命名）
をＬＧ倍地〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｊ！５ｇ、クルコース２ｇを水１１にとがしＮａＯＨ
にてｐＨを７．０とする。〕で３３７℃１８時間培養し
、この培養液０．２ｎ＋１を１０ｍ１のＭＣＧ培地（Ｎ
ａ２ＨＰ ０４０．６％、ＫＨ２Ｐ○、０．３％。
ｃ−１Ｑを保有する大腸菌によるＩＦＩＩ−Ｔ誘導体の
生産： 実施例１〜４で得た組換え体プラスミドｐＧＢＤ−１，
ｐＧＶΔ−４，ｐＧＶＫ−１３およびｐＧＷＣ−１０を
もつ大腸菌８８１０１株（それぞれをＩＧＢＤＩ、ＩＧ
ＶＡ−４，ＩＧＶＫ−１３およびＩＧＷＣｉｏと命名）
をＬＧ倍地〔トリプトン１０ｇ、酵母エキス５ｇ、Ｎａ
Ｃｊ！５ｇ、クルコース２ｇを水１１にとがしＮａＯＨ
にてｐＨを７．０とする。〕で３３７℃１８時間培養し
、この培養液０．２ｎ＋１を１０ｍ１のＭＣＧ培地（Ｎ
ａ２ＨＰ ０４０．６％、ＫＨ２Ｐ○、０．３％。
ＮａＣｊｌ’ ０．５％、ＮＨ，（１０，１％、グルコ
ース０．５％、カザミノ酸０．５％、ＪＳ○、１ｍＭ。
ース０．５％、カザミノ酸０．５％、ＪＳ○、１ｍＭ。
ビタミンＢ＋ ４μｇ／ｍｌ ｐ）１７．２）に接種し
、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンのインデ
ューサーであるインドールアクリル酸（以下ＩＡＡと略
す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を
続けた。培養液を８．０００Ｔｐｍ。
、３０℃で４〜８時間培養後、トリプトファンのインデ
ューサーであるインドールアクリル酸（以下ＩＡＡと略
す）を１０μｇ／ｍｌ加え、さらに２〜１２時間培養を
続けた。培養液を８．０００Ｔｐｍ。
１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭ ＮａＣｊ！。
３０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｊ２ （ｐＨ７，５）緩衝液
で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液１ｍｌに懸濁し、２
００μｇのリゾチーム、０．２５ＭＥＤＴＡ（エチレン
ジアミンテトラ酢酸）を５μｍ加えて３０分間０℃に放
置した後、凍結・融解を３回くり返して菌体をこわした
。これを１５．’０００ ｒ ｐ ｍ 、 ３０分間遠
心して」上清を得、上清中のインターフェロンの量をア
ームストロングの方法に従って定量した〔アームストロ
ング（Ｊ、八、八ｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら；アプライド自
マイクロバイオロジー（＾ｐｐ１． Ｍｉｃｒｏｂ’ｉ
ｏ１． ）２１巻１２３−１２５頁（１９７１） 〕。
で洗浄した。洗浄菌体を上記緩衝液１ｍｌに懸濁し、２
００μｇのリゾチーム、０．２５ＭＥＤＴＡ（エチレン
ジアミンテトラ酢酸）を５μｍ加えて３０分間０℃に放
置した後、凍結・融解を３回くり返して菌体をこわした
。これを１５．’０００ ｒ ｐ ｍ 、 ３０分間遠
心して」上清を得、上清中のインターフェロンの量をア
ームストロングの方法に従って定量した〔アームストロ
ング（Ｊ、八、八ｒｍｓｔｒｏｎｇ）ら；アプライド自
マイクロバイオロジー（＾ｐｐ１． Ｍｉｃｒｏｂ’ｉ
ｏ１． ）２１巻１２３−１２５頁（１９７１） 〕。
〔但し、ウィルスとしては５ｉｎｄｖｉｓ ｖｉｒｕｓ
動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来のエフエル・セル（
ＦＬ ｃｅｌｌ ）を用いた。
動物細胞としてはヒト羊膜細胞由来のエフエル・セル（
ＦＬ ｃｅｌｌ ）を用いた。
結果を第１表に示す。
第 １ 表
１６に八−２はＩＰＮ−ｒをコードするプラスミドｐＧ
ＫＡ−２を含む菌株。
ＫＡ−２を含む菌株。
参考例１゜
発現ベクターｐＫＹＰ−１１へのヒトＩＦＮ−ＴＤＮＡ
の組み込みニ プラスミドｐ ＩＦＮｒ−Ｇ４ ’（３，６Ｋｂ） ６
μｇを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、
１０ｍＭＭｇＣｊ！□ １０ｍＭジチオスレイトールお
よび５０ｍＭ Ｎ’ａＣ１を含む全量５０ｕＡの溶液に
溶かし、制限酵素ＰｖｕＩＩ １２単位とＨｉｎｄｌ１
１１２単位を加え、３７℃で４時間消化反応を行った。
の組み込みニ プラスミドｐ ＩＦＮｒ−Ｇ４ ’（３，６Ｋｂ） ６
μｇを２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ！ （ｐＨ７，５）、
１０ｍＭＭｇＣｊ！□ １０ｍＭジチオスレイトールお
よび５０ｍＭ Ｎ’ａＣ１を含む全量５０ｕＡの溶液に
溶かし、制限酵素ＰｖｕＩＩ １２単位とＨｉｎｄｌ１
１１２単位を加え、３７℃で４時間消化反応を行った。
反応液を６５℃、７分間加熱処理して酵素を失活させ、
低融点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）にて精製
し、１．３ Ｋ ｂのヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮ
Ａ断片１．２μｇを得た。
低融点アガロースゲル電気泳動法（ＬＧＴ法）にて精製
し、１．３ Ｋ ｂのヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮ
Ａ断片１．２μｇを得た。
別にｐＫＹＰ−１１の４μｇを２０ｍＭトリス−塩酸（
ｐＨ７，５） 、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２２゜ｌＱｍＭ
ジチオスレイトールおよび５０ｍＭＮａＣ４を含む全量
４０μｌの溶液に溶かし、ＢａｍＨＩを８単位加え、３
７℃で３時間消化反応を行った。反応液を６５℃、５分
間加熱して酵素を失活させた。これにｄΔＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ。
ｐＨ７，５） 、１０ ｍＭ ＭｇＣｌ２２゜ｌＱｍＭ
ジチオスレイトールおよび５０ｍＭＮａＣ４を含む全量
４０μｌの溶液に溶かし、ＢａｍＨＩを８単位加え、３
７℃で３時間消化反応を行った。反応液を６５℃、５分
間加熱して酵素を失活させた。これにｄΔＴＰ、ｄＣＴ
Ｐ。
ｄＧＴＰ、ｄＴＴＰを各々３０μＭになるように加え、
さらに８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片、 Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製。
さらに８単位の大腸菌ＤＮＡポリメラーゼＩ （Ｋｌｅ
ｎｏｗ断片、 Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂ
ｓ社製。
１μ！）を加えて１５℃で１時間埋め込み反応させた。
ＤＮＡポリメラーゼＩを失活させるため６８℃で１５分
間加熱処理後、ＨｉｎｄＩ［１１０単位を加え３７℃で
さらに３時間消化反応してから、再び６５℃で５分間加
熱し、Ｈｉｎｄｌｎを失活させた。このようにして得た
プラスミドｐＫＹＰ−１１の消化反応液よりＬＧＴ法に
て精製し、Ｐｔｒｐを含む約４．７ Ｋ ｂのＤＮＡ断
片約２．５μｇを得た。
間加熱処理後、ＨｉｎｄＩ［１１０単位を加え３７℃で
さらに３時間消化反応してから、再び６５℃で５分間加
熱し、Ｈｉｎｄｌｎを失活させた。このようにして得た
プラスミドｐＫＹＰ−１１の消化反応液よりＬＧＴ法に
て精製し、Ｐｔｒｐを含む約４．７ Ｋ ｂのＤＮＡ断
片約２．５μｇを得た。
ヒトＩ’ＦＮ−ｒＤＮＡを含むＤＮＡ断片（１，３Ｋｂ
）０．５μｇとプラスミドｐＫＹＰ−１１より碍たＰｔ
ｒｐを含む約４．７ Ｋ ｂのＤＮＡ断片１，０μｇを
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ
ＭｇＣｌ１２．５ｍＭジチオスレイトールおよび５００
μＭΔＴＰを含む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製
）４単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。得
られた組換え体プラスミドの混合物を用いて常法通り大
腸菌８８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得
た。このコロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第
１図に示したｐＧＣ−７を得た。ｐｃｃ−７の構造は、
Ｈｉｎｄｌｌｌ。
）０．５μｇとプラスミドｐＫＹＰ−１１より碍たＰｔ
ｒｐを含む約４．７ Ｋ ｂのＤＮＡ断片１，０μｇを
２０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ
ＭｇＣｌ１２．５ｍＭジチオスレイトールおよび５００
μＭΔＴＰを含む溶液２０μｌに溶かし、Ｔ４ＤＮＡリ
ガーゼ（Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ社製
）４単位を加え、４℃で１８時間結合反応を行った。得
られた組換え体プラスミドの混合物を用いて常法通り大
腸菌８８１０１株を形質転換し、ＡｐＲのコロニーを得
た。このコロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第
１図に示したｐＧＣ−７を得た。ｐｃｃ−７の構造は、
Ｈｉｎｄｌｌｌ。
Ｈｐａｌ、５ａｊ２１．ＥｃｏＲＩおよびＣＪ’ａｌで
消化後、アガロースゲル電気泳動により確認した。Ｉ）
Ｃ；Ｃ−７を含む大腸菌菌株は微工研にＵｓｃｈｅｒｉ
ｃｌ＋ｉａ ｃｏ旦１６Ｃ−７（ＦＥＲＭ Ｐ−６８１
４）として寄託されている。
消化後、アガロースゲル電気泳動により確認した。Ｉ）
Ｃ；Ｃ−７を含む大腸菌菌株は微工研にＵｓｃｈｅｒｉ
ｃｌ＋ｉａ ｃｏ旦１６Ｃ−７（ＦＥＲＭ Ｐ−６８１
４）として寄託されている。
参考例２゜
組換え体プラスミドｐＧＫΔ−２の造成：参考例１によ
り得られたｐＧＣ−７ＤＮ、Ａ６μｇを２０ｍＭＴｒｉ
ｓ −ＨＣｊ２ （ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＣ，
１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭ ＮａＣｊ
ｌ！を含む全量５９μＩ！、Ｑ溶液に溶かし、制限酵素
Ｂ ｓ ｔ Ｎ Ｉ （Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ社製）１２単位を加え、６０℃で３時間反応
させた後、６５℃で５分間加熱してＢｓｔＮＩを失活さ
せた。次いでＮａＣＪを１５０ｍＭとなるように加え、
Ｓａｊ！ １８単位を加えて３７℃でさらに３時間消化
反応を行った。再び６５℃で５分間加熱して５ａｉｌを
失活させ、ＬＧＴ法にて精製し、ヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡ
の大部分を含む約１１２５ｂ’ｐのＤＮＡ断片約０．８
μｇを得た。
り得られたｐＧＣ−７ＤＮ、Ａ６μｇを２０ｍＭＴｒｉ
ｓ −ＨＣｊ２ （ｐＨ７，５）、１０ｍＭＭｇＣＣ，
１０ｍＭジチオスレイトールおよび１０ｍＭ ＮａＣｊ
ｌ！を含む全量５９μＩ！、Ｑ溶液に溶かし、制限酵素
Ｂ ｓ ｔ Ｎ Ｉ （Ｎｅｗ Ｂｎｇｌａｎｄ Ｂｉ
ｏｌａｂｓ社製）１２単位を加え、６０℃で３時間反応
させた後、６５℃で５分間加熱してＢｓｔＮＩを失活さ
せた。次いでＮａＣＪを１５０ｍＭとなるように加え、
Ｓａｊ！ １８単位を加えて３７℃でさらに３時間消化
反応を行った。再び６５℃で５分間加熱して５ａｉｌを
失活させ、ＬＧＴ法にて精製し、ヒトＩＦＮ−ｒＤＮＡ
の大部分を含む約１１２５ｂ’ｐのＤＮＡ断片約０．８
μｇを得た。
別にｐＫＹＰ−１０の３μｇを２０ ｍＭ Ｔｒｉｓ−
ＨＣ（１（ｐｉ−１７，５＞、１［１ｍＭ ＭｇＣＬ
。
ＨＣ（１（ｐｉ−１７，５＞、１［１ｍＭ ＭｇＣＬ
。
１０ｍＭジチオスレイトールおよび１００ｍＭＮａＣｊ
！を含む全量４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌｌとＳａｄ Ｉを各々６単位ずつ加え、３７℃で
３時間消化反応を行った。６５℃で５分間加熱してＨｉ
ｎｄＩＩ［とＳａｄ Ｉを失活させた。この消化反応液
をＬＧＴ法にて精製し、Ｐｔｒｐを含む約４．１． Ｋ
ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを得た。
！を含む全量４０μｌの溶液に溶かし、制限酵素Ｈｉｎ
ｄｌｌｌとＳａｄ Ｉを各々６単位ずつ加え、３７℃で
３時間消化反応を行った。６５℃で５分間加熱してＨｉ
ｎｄＩＩ［とＳａｄ Ｉを失活させた。この消化反応液
をＬＧＴ法にて精製し、Ｐｔｒｐを含む約４．１． Ｋ
ｂのＤＮＡ断片約１．８μｇを得た。
一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−ｒポリペプチドのＮ末端はＣｙ
ｓであるので、成熟ＩＦＮ−ｒＤＮＡを発現させるため
には、５′末端のＴＧＴ （Ｃｙｓ）の直前に開始コド
ン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰｔｒｐ
の下流のＳＤ−配列とＡ Ｔ Ｇとの距離は、６〜１８
ｂｐの間の適当な長さが必要であることなどの理由から
、下記のＤＮＡリンカ−を合成した。
ｓであるので、成熟ＩＦＮ−ｒＤＮＡを発現させるため
には、５′末端のＴＧＴ （Ｃｙｓ）の直前に開始コド
ン（ＡＴＧ）を付与する必要があること、またＰｔｒｐ
の下流のＳＤ−配列とＡ Ｔ Ｇとの距離は、６〜１８
ｂｐの間の適当な長さが必要であることなどの理由から
、下記のＤＮＡリンカ−を合成した。
まず、１本鎖ＤＮＡ、１３−ｍａｒと１５−ｍａｒを通
常のトリエステル法〔Ｒ，Ｃｒｅａら＋ ｐｒｏｃ。
常のトリエステル法〔Ｒ，Ｃｒｅａら＋ ｐｒｏｃ。
Ｎａｔｌ、 Ａｃａｄ、 Ｓｃｉ、 ＵＳ八、 ７５．
５７６５ （１９７８） ） ｌごより合成した。１３
−ｍｅｒおよび１５−ｔｉｅｒの各々２μｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣＩＩ （ｐＨ７，５）１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ１２．５ｍＭジチオスｌ／イ）−ル、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量２０μｌの
溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリ
ンガ−・マンハイム社製）３０単位を加えて、３７℃で
６０分間リン酸化反応を行った。
５７６５ （１９７８） ） ｌごより合成した。１３
−ｍｅｒおよび１５−ｔｉｅｒの各々２μｇを５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ −ＨＣＩＩ （ｐＨ７，５）１０ｍＭ Ｍ
ｇＣｌ１２．５ｍＭジチオスｌ／イ）−ル、０．１ｍＭ
ＥＤＴＡおよび１ｍＭ ＡＴＰを含む全量２０μｌの
溶液に溶かし、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ベーリ
ンガ−・マンハイム社製）３０単位を加えて、３７℃で
６０分間リン酸化反応を行った。
リン酸化した１３−ｍａｒと１５−ｍａｒを２μｇずつ
混合し、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリ
ングを行うことにより上記構造を有するＤＮＡリンカ−
を得た。
混合し、７０℃で５分間加熱後室温に放置してアニーリ
ングを行うことにより上記構造を有するＤＮＡリンカ−
を得た。
上記で得たｐｃｃ−７由来のＢｓｔＮＩ−３ａβ■断片
（１１２５ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐＫＹＰ−
１０をＨｉｎｄｌｌｌと５ａｊｌ！ Ｉで消化しテ辱た
ＤＮＡ断片（４，１Ｋｂ）１．０ａｇを２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣβ２゜５ｍ
Ｍジチオスレイトールおよび５００ａＭ ＡＴＰを含む
全量２５μｌの溶液に溶かし、この混合溶液に上記Ｄ
Ｎ Ａ ＩＪシンカを約０．１μｇ加えた。この場合液
にさらにＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ６単位を加え
、４℃で１７時間結合反応を行った。得られた組換え体
プラスミドの混合物を用いて、常法通り、大腸菌８８１
０１株を形質転換し、八Ｐ１のコロニーを得た。このコ
ロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第５図に示し
たｐＧＫＡ−２を得た。
（１１２５ｂｐ）０．４μｇと発現ベクターｐＫＹＰ−
１０をＨｉｎｄｌｌｌと５ａｊｌ！ Ｉで消化しテ辱た
ＤＮＡ断片（４，１Ｋｂ）１．０ａｇを２０ｍＭＴｒｉ
ｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７，５）、６ｍＭ ＭｇＣβ２゜５ｍ
Ｍジチオスレイトールおよび５００ａＭ ＡＴＰを含む
全量２５μｌの溶液に溶かし、この混合溶液に上記Ｄ
Ｎ Ａ ＩＪシンカを約０．１μｇ加えた。この場合液
にさらにＴ ４ Ｄ Ｎ Ａ ＩＪガーゼ６単位を加え
、４℃で１７時間結合反応を行った。得られた組換え体
プラスミドの混合物を用いて、常法通り、大腸菌８８１
０１株を形質転換し、八Ｐ１のコロニーを得た。このコ
ロニーの培養液よりプラスミドを分離し、第５図に示し
たｐＧＫＡ−２を得た。
ｐＧＫＡ−２の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｃｆ１ａ Ｉ。
ＨｉｎｄＩＩ［、ＢｓｔＮＩ、ＳａβＩて消化後、アガ
ロースゲル電気泳動により確認した。プラスミドｐＧＫ
Ａ−２のＳＤ−配列（ＡＡＧＧ）から開始コドン（ＡＴ
Ｇ）までの塩基配列は ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧΔＴＡΔＧＣＴＴΔＴＧであるこ
とを、マキサム・ギルバートの方法で確ｇ忍した。
ロースゲル電気泳動により確認した。プラスミドｐＧＫ
Ａ−２のＳＤ−配列（ＡＡＧＧ）から開始コドン（ＡＴ
Ｇ）までの塩基配列は ＡＡＧＧＧＴＡＴＣＧΔＴＡΔＧＣＴＴΔＴＧであるこ
とを、マキサム・ギルバートの方法で確ｇ忍した。
ｐＧ−ＫＡ−２を含む大腸菌は微工研にＢｓｃｂｅｒｉ
ｃｈｉａ ｃｏ旦 ＩＧＫＡ’−２（ＦＥＲＭ Ｐ−６
７９８）として寄託されている。
ｃｈｉａ ｃｏ旦 ＩＧＫＡ’−２（ＦＥＲＭ Ｐ−６
７９８）として寄託されている。
第１図は、プラスミドｐＧＢＤ−１の造成のフロー・シ
ートを示す。 第２図は、プラスミドｐＧｓＢ−６，ｐＧＶＡ−４の造
成のフロー・シートを示す。 第３図は、プラスミドｐＧＶＫ−１３の造成のフロー・
シートを示す。 第４図は、プラスミドｐＧＷＣ−１０の造成のフロー・
シートを示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社代表者 木
下祝部 第１図 第４図 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４６４５６号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロン−γポリペプチド誘導体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社昭和５９年３月７日（
発送日：昭和５９年３月２７日）５、補正の対象 手 続 補 正 書 昭和Ｓ９年７月ｌ１日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４６４５６号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ［００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（Ｔ口Ｌ ： ０３−
２０１−７２１１ 内線２７５１）明細書の発明の詳細
な説明の欄、特許請求の範囲の欄および図面 ５、補正の内容 ［実施例に。 １−３ｅ ｒ−ＩＦ’Ｎ−ｒをコードする組換え体プラ
スミドｐｃｖｔ、１０の造成： 実施例１により得られたｐ Ｇ Ｂ Ｄ ｌ Ｄ ＮＡ
６μｇをＹ−５０緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素
５ｉｎｌ ｔｏ単位を加え、３７℃で３時間消化反応を
行った。次いで、ＮａＣβを終濃度１００ｍｔ１４きな
るように加え、ＢａｍＨＩ ’１０単位を加え、３７℃
でさらに３時間消化反応を行った。 この反応液からｌ Ｇ Ｔ法により、ヒト［ＦＮ−ｒＤ
ＮΔの大部分を含む、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片０．８
μｇを得た。 別に、特開昭５８−１１０６ （ｌ ０号公報記載の方
法で調製したｐＫＹＰｌｏ ＤＮＡ ３μｇをＹ−５０
緩衝液（全量４０μＩｌ）に溶かし、制限酵素Ｈｉ ｎ
ｄ ＩＩおよびＢ ａ ｍ ｌ−１１をそれぞれ５単
位ずつ加え、３７℃で３時間消化反応を行った。 この反応液から、Ｌ Ｇ Ｔ法により、トリブトファン
ブ０％−ター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．３ Ｋ ｂのＤ
ＮＡ断片約１．８μｇ’ｃ得た。 一方、成熟ヒト１ＦＮ−ｒポリペプチドは、Ｎ末端から
、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この１
番目のＣｙｓをＳ、ｅｒに置換し、かつ、発現に必要な
開始コドン（ＡＴＧ）を最初のＳｅｒの直前に付与する
目的で、下記のような１） Ｎ Ａリンカ−を合成した
。 まず、■本領ＤＮＡ、 ２０−＋ｎｅｔと１９＝ｍａｒ
を通常のトリエステル法［： ｌｔ、ｃｒｅａ ら；
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、７５．５７６５ （１９７８）］
ｌこより合成した。 ２０−ｍｅｒおよび１９−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍ
Ｍ−塩酸（ｐＨ７，５） 、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ１２
．５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡお
よび１ｍＭ ＡＴ Ｐを含む全量４０μｌに溶かし、１
゛４ボリヌクレオチドキナ一セ３０単位を加えて、３′
７℃で６０分間リン酸化反応を行った。 次に上記で得たｐＧＢＤ１由来のＳ ｉ ｎ Ｉ −Ｂ
ａｍＨ１断片（約８５０ｂｐ）０．５μｇと発現ベクタ
ーｐＫＹＰ１０のＨｉｎｄｌｌ−Ｂａｍ）Ｉｆ断片（約
４．３Ｋｂ）１．０μｇとｆＴ４１）ガー卆緩衝液２５
μｌに溶かし、上記ＤＮＡリンカ−を約０．１μｇ加え
た。この混合液に、父らにＴ ４’ Ｄ ＮＡツリガー
ゼ単位を加え、４℃で１７ｉ間結答反応を行った。 １尋られた組換えプラスミドの混合物を用いて、大腸菌
８８１０１株を形質転換し、ΔｐＩ＋のコロニーを得た
。このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し
、第５図に示したｐＧＶＬ １０を得た。ｐＧＶＬｌｏ
の構造は、ＥｃｏＲＩ。 ｐｃｖＬｌ ０のＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩ部位から８１ｎ
Ｉ部位までの塩基配列は、 であることを、マキザム・ギルバートの方法〔八。 ５６０ （１９７７）〕で確認した。 ｐＧＶＬ １０のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチ
ド〔本誘導体を１−５ｅｒ−１ＦＮ−γと呼ぶ〕は成熟
ヒ）ＩＦＮ−γの１番目のＣｙｓがＳｅｒにｉ換してい
る点でゑ知のものと、明らかに異なる。プラスミドｐＧ
ＶＬ１０をもつ大腸菌ＢＦ−’Ｊ４４）として微工研に
寄託されている。 実施例７゜ ３−’５ｅｒ−１ＦＮ−ｒをコードする組換え伺プラス
ミドｐＧＶＭ １０１の造成： 実施例１により得られたｐＧＢＤｌ 、ＤＮＡ６μｇを
Ｙ−５０緩衝液５０μ！に溶かし、制肖酵素５ｉｎｌ
１０単位を加え、３７℃で３時…消化反応を行った。次
いでＮａＣＪ！を終濃度１ｃ・ｍＭとなるように加え、
Ｂａｍ１（Ｉ １０単位る加え、３７℃でさらに３時間
消化反応を行った。 この反応液からＬＧＴ法により、ヒトＩＦＮ−７ＤＮＡ
の大部分を含む、約８５０ｂｐの゛ＤＮ’Ａ眺片０．１
μｇを得た。 別に、特開昭５８−１１０’６００号公報記載Ｑ方法で
調製しｊたｐＫＹＰｌｏ ＤＮＡ ３μｇイＹ−５０緩
衝液（全量４０μｌ）に溶かし、制御ｊ酵素Ｈｉ ｎ
ｄ ＬＩＴお１びＢａｍＨＩをそれぞれ５Ａ位ずつ加え
、３７℃（千′楡時間消化反応を行った。 この反応液から、ＬａＴｉｈにより、トリブトフフンプ
ロモーター（Ｐｔｒｐ）４’＆む約４．３ Ｋ ｂ Ｑ
ＤＮΔＤＮＡ１．８μｇを得た。 一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−ｒポリペプチドは、を端末から
Ｃｙ・ｓ−Ｔ’ｙｒ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この
３＠目のＣ９ＳをＳｅｔに置換し、ｉつ、発現に必要な
開始コドン（ＡＴ（１；）を最初σＣｙｓの直前に付与
する目的で、下記のようなりＮＡリンカ−を合成した。 び ０ まず、１木ｔｉＪｌＤＮΔ、 ２０−ｍａｒと１９
−ｍａｒを通常のトリエステル法により合成した。２０
−＋ｒ＋ｅｒおよび１９−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐ ｌ−１７，５）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｆ＊ 、５ｍＭジチオスｉ レイトール、０．１ｍＭ
ＥＤ↑゛Δおよび１ｍＭΔＴＰを含む全量４０μｌに
溶かし、Ｔ４ポリヌ〉 クレオチドキナーゼ３０単位を
加えて、３７℃で６ （１分間リン酸化反応を古ミだ。 □”′。１速 次に上記で１号たｐＧＢＤ１由来のＳ
ｉｎＩ−ＢａｍＨＩ断片（約８５０ｂｐ）０．５μｇと
発現ベクターｐＫＹＰ１０の旧ｎ”ｄｌｌｌ−ＢａｍＨ
Ｉ断片（約４．３Ｋｂ）１．０μｇとをＴ４リガーゼ緩
） 衝液２５μ！に溶かし、上記ＤＮＡリンカ−を約０
、ｌμｇを加えた。この混合液に、さらにＴ４Ｉ ＤＮ
ＡＩＪガーセ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を
行った。 得られた組換えプラスミドの混合物を用いて、） 大腸
菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Δｐ１１のコ口ニーを得
た。このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収
し、第６図に示したｐＧＶＭ １０１を得た。ｐＧＶＭ
ｌｏｌの構造は、ＥＣ０ＲＴ。 ＣＲａ Ｉ、Ｉ（ｉｎｄｌｌ［、ＢａｍＨＩで消化後、
アガロースゲル電気泳動により確認した。 ｐＧＶＭｌｏｌのｌ（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩ部位から５ｉ
ｎ１部位までの塩基配列は、 であることを、マキサム・ギルバートの方法で確δ忍
しゾこ。 ｐＧＶＭ １０１のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプ
チド〔本誘導体を３−３ｅｒ−１ＦＮ−ｒと呼ぶ〕は成
熟型ヒトＩＦＮ−ｒの３番目のＣｙｓがＳｅｒに置換し
ている点で公知のものと、明らかに異なる。プラスミド
ｐＧＶＭ１０１をもつ大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｌ ＧＶＭ Ｌ Ｏ１（ＦＥＲＭＢＰ−５
４５）として微工研に寄託されている。 実施例８゜ ヒ）ＩＦＮ−ｒのＮ末端部分を欠失したポリペプチドを
コードするプラスミドｐＧＷＥ４の造成：参考例２の方
法によって得たｐＧＫＡ２（５，２Ｋｂ）２５μｇをＹ
−１０緩衝液４００μ！に溶かし、５０単位のＣｆｆａ
ｌを加え、３７℃で３時間消化反応を行った。この反応
液８０μｆ （ＤＮＡとして５μｇを含む）に１０倍の
ＢＡＬ−３１緩衝液を１２μＰ１水を２８μｐ加え、さ
らにヌクレアーゼＢΔＬ−３］ ０．２５単位を加えて
、３０℃で１０秒間反応を行った。ＢＡＬ−３１は、Ｄ
ＮＡ分子を末端から削ってゆく活性（エキソヌクレアー
ゼ活性）を有し、上記用いられた反応条件は、（Ｊ！ａ
１部位から約２０塩基対削れる条件である。 この反応液をフェノール抽出、クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿により、ＤＮＡを回収した。 回収したｐＧＫ△２の（１！ａｌ−ＢＡＬ３１消化断片
１．０μｇを２０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、２単
位のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。この反応から、ＬＧＴ法により約４．３ Ｋ ｂのＤ
ＮＡ断片０．５μｇを回収した。 次に、ＡＴＧ ・発現ベクターｐＴ ｒ Ｓ ３ （３
゜８Ｋｂ）５．０μｇを４０μｐのＹ−５０緩衝液に溶
かし、１０単位のＳｐｈ ｉを加え、３７℃で３時間消
化反応を行った。この反応液からＬ Ｇ Ｔ法により８
８０ｂｐのＤＮＡ断片３．０μｇを精製回収した。この
８８０ｂｐのＤＮＡ断片３．０μｇを６７ｍＭ）リス−
塩酸（ｐＨ８，３）、６．７ｍＭＭｇＣｌ１２．１０ｍ
Ｍメルカプトエ９／−ル。 ６．７ μＭ ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ （ＮＨ４）２
ＳＯ４を含む溶液に溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰｄＧＴＰそれぞれ１ｍＭになるように加え、さらに
６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加えて、３７℃で１
時間反応させ、突出末端を削った。フェノール抽出、ク
ロロホルム抽出の後、工９．／−ル沈殿により、ＤＮＡ
断片１．０μｇを回収した。 該ＤＮＡ断片１．０μｇを全量２０μｇのＹ−５０緩衝
液に溶かし、２単位のＰｓｔＩを加え、３７℃で３時間
消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、Ｐ
ｔｒｐを含む約８８０ｂｐのＤＮＡ断片０．５μｇを回
収した。 次に上記で得た、ｐＧＫＡ２のＣｊｌ！ａｌ−ＰｓｔＩ
断片（約４．３Ｋｂ）０．５μｇとｐＴｒＳ３−３ｐｈ
ｌ−Ｔ４ポリメラーゼ−Ｐｓｔｌ断片（８８０ｂｐ）０
．５μｇを全量１０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし
、Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ０．３単位を加え、４℃で１８
時間結合反応を行った。 得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、生じたＡｐｌのコロニーから
プラスミドＤＮＡを回収し、第７図に示したｐＧＷＥ４
を得た。ｐＧＷＥ４の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｃｊ！ａ
Ｉ、Ｂａｍ１−１１で消化後、アガロースゲル電気泳動
により確認した。 ｐＧＷＥ４のヒトＩＦＮ−ｒ構造遺伝子のＮ末端付近の
配列は、 ＭｅｔΔ５ｐＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｎ−ΔＴＧＧΔＣ
ＣＣΔ１゛ΔＴ Ｇ ′ＦＡ ＣΔＡであることをマキ
サム・ギルバートの方法で、確認し、成熟型ヒ）ＩＦＮ
−ｒポリペプチド〔本誘導体をＩＦＮ−７−（△ｌ〜４
）と呼ぶ〕のＮ末端のＣｙｓから４番目のＧｉｎまで４
つのアミノ酸が欠失し、５番目のΔｓｐから始まってい
ることが確認された。プラスミドｐＧＷＥ４をもつ大腸
菌は８ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ ＧＷＥ４
（ＦＥＲＭＢＰ−５４６）として微工研に寄託されて
いる。 実施例９゜ ｐＧＶＬｌｏ、ｐＧＶＭｌｏｌ、ｐＧＷＥ４を保有する
大腸菌によるＩＦＮ−ｒ誘導体の生産：実施例６〜８で
碍た組換え体プラスミドｐＧＶＬ１０、ｐＧＶＭｌｏｌ
、ｐＧＷＥ４をもつ大腸菌８８１０１株（それぞれをＩ
ＧＶＬＩＯ，ＩＧＶＭｌｏｌおよびＩＧＷＥ４と命名）
をＬＧ培地で３７℃、１８時間培養し、この培養液０．
２ｍｌを１０ｍｌのＭＣＧ培地に接種し、３０℃で４〜
８時間培養後、ＩＡＡを１０μｇ／ｍｌ加え、さらに、
２〜１２時間培養を続けた。培養液をｇ、 ｏ ｏ 。 ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭＮａ（１！
、３０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄し
た。洗浄菌体を上記緩衝液１ｍｌに懸濁し、２ Ｆ）
０μｇのリゾチーム、Ｏ，２５ＭＥＤ′Ｉ″Ａを５μｌ
加えて、３０分間遠心して上清を得、上清中のインター
フェロンの量を！−ムストロングの方法に従って定量し
た。但し、ウィルスとしては、５ｉｎｄｖｉｓ ｖｉｒ
ｕｓ 、動物細胞としては、ヒト羊膜細胞由来のエフエ
ル・セル（ＦＬｃ’ａｌｌ）を用いた。 結果を第２表に示す。 第 ２ 表 （２）明細書第６頁１７行目および２１〜２２行目のｒ
ｌＦＮ−４ＪをｒｌＦＮ−α」に訂正する。 （３）明細書筒３１頁１９行目の「第１図に示した」を
削除する。 （４） 明細書第３３頁下から１２行目の［ｐ ｒ ｏ
ｃ ； ＪをｒＰｒｏｃ、Ｊに訂正する。 （５）明細書第３３頁１２行目の後に次の記載を加入す
る。 「第５図は、プラスミドｐＧＶＬ１０の造成のフロー・
シートを示す。 第６図は、プラスミドｐＧＶＭ １０１の造成のフロー
・シートを示す。 第７図は、プラスミドｐＧＷＥ４の造成のフロー・シー
トを示す。」 （６）第５〜７図゛を明細書に補充する。 −一□□□□−□や （７）明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する
。 （８）受託証（写）を特徴する 特許請求の範囲 （１） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体。 （２）第１図のアミノ酸配列を有するヒトインターフェ
ロン−Ｔポリペプチドから一部のアミノ酸が除去または
置換された特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （３） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドから一
部のアミノ酸の除去がＮ末端からのアミノ酸の除去であ
り、一部のアミノ酸の置換が、Ｎ末端から１番目または
３番目に位置するＣｙｓのうち一方または両方を他のア
ミノ酸に置換することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 （４） ヒトインターフェロン−ＴポリペプチドのＮ末
端からの１番目または３番目に位置するＣｙｓを置換す
る他のアミノ酸がＴｙｒまたはＳｅｒであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （５） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラス
ミド。 （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 （７）該Ｄ’ＮＡ断片が第１表の塩基配列のうち８番目
のＧを八に変換した配列、２番目および／または８番目
のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基を欠
失した配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第
５または６項記載の組換え体プラスミド。 （８） ｐＧＢＤ−１，ｐＧＶΔ−４，ｐＧＶＫ−１３
゜ｐＣ，ＷＣ−１０と称する特許請求の範囲第５または
６項記載の組換え体プラスミド。 （９） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラ
スミドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養
物中にヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
生成蓄積せしめ、該培養物からヒトインターフェロン−
ｒポリペプチド誘導体を採取することを特徴とするヒト
インターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体の製造法。 ＧＯ該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下流
に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第９項
記載の製造法。 （１１）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第９または１０項記載の製造法。 （１２）ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
が第１表に示したアミノ酸配列のうち３番目のＣｙｓを
Ｔｙｒに変換した配列、１番目のＣｙｓをＳｅｒに変換
した配列、３番目のＣｙ −ｓをＳｅｒに変換した配列
、１番目および３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換した配列
、またはＮ末端の１〜７番目のアミノ酸を欠失した配列
を有することを特徴とする特許請求の範囲第９．１０ま
たは１１項記載の製造法。 （１３）ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換体プラスミ
ドを含む微生物。 （１４） 該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーター
の下流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲
第１３項記載の微生物。 （１５）咳微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第１３または１４項記載の微生物。 （Ｉ６）該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列のうち
８番目のＧをΔに変換した配列、２番目および／または
８番目のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩
基を欠失した配列を有することを特徴とする特許請求の
範囲第１３−？１５項記載の微生物。 （１７） ［１ｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ
Ｇ Ｖ△−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５） （１８） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｋ −１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３２） （１９） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｗ Ｃ−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７） （２０）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ Ｇ
Ｂ Ｄ −１（ＦＥ！ＲＭ ＢＰ−３９’４） ６、添付書類の目録 図 面（第５〜７図） １通 受託証 １通 第７図 手続補正書く自発） 昭和６０年７月３／日 特許庁長官 殿 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な
説明の欄および特許請求の範囲の欄 （２〕 明細書箱、１１頁１０行目のｒＡｎａｌｙｔｕ
ａｌ ｊ を［＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｊに訂正する。 （３）明細書第１７頁２行目のｒＢｏｌ １ｖｅｒ Ｊ
をｆＢｏｌｉｖａｒＪ に訂正する。 （４）明細書第１８頁４行目の「Ｔ」をｒｇａＡＴＪに
訂正する。 （５）明細書第２９頁１４行目のｒＭＧ（１２ＪをｒＭ
ｇ５Ａ２Ｊ・に訂正する。 （６）明細書第２９頁１行目のｒＴｒｙＪをｒＴｙｒＪ
に訂正する。 （７） 明細書第２９頁１４行目のｒＴ４ポリメラーゼ
」をｒＴ４ＤＮＡポリメラーゼ」に訂正する。 （８）明細書第入６頁９行〜１０行目の「この反応液・
・・・・・回収した。」を「フェノール抽出、り１０ロ
ホルム抽出後、エタノール沈殿により約３．０／１ｇの
ＤＮＡ断片を回収した。」に訂正する。 （９）明細書第２９頁１４行目のｒ８８０ｂｐの」を削
除する。 σＧ 明細書第２９頁１４行目のｒ３．０ＲＪを「約３
．０犀」に訂正する。 ００ 明細書箱２８頁１０行目のｒＬＧ倍地」をｒＬＧ
培地」に訂正する。 αつ 明細書第２８頁１９行目の「トリプトファン」の
後に「・オペロン」を加入する。 ０Ｊ 明細書第２８頁１９行目の「〜８」を削除する。 ０Ｏ明細書第２８頁２１行〜２２行目の「２〜１２」を
「４」に訂正する。 Ｑ５１ 明細書第２９頁１４行目の［〔但し」を「但し
」に訂正する。 Ｑ６１ 明細書第２９頁１４行および１５行目の「第１
表」を「第２表」に訂正する。 Ｑ７１ 明細書第２９１４行のｒ６８１４Ｊの後に、「
、ＦＥＲＭ ＢＰ−４９７Ｊを加入する。 ０印 明細書箱３５頁３行目のｒ６７９８Ｊの後に、「
、ＦＥＲＭ ＢＰ−４９６Ｊを加入する。 ０ｇｌ 明細書（昭和５９年７月１１日付提出の手続補
正書、以下同じ）第３頁下から１５行目の「−塩」を「
トリス−塩」に訂正する。 （イ）明細書箱８頁２２行〜最下行の「この反応液・・
・・・回収した。」を「フェノール抽出、クロロホルム
抽出後、エタノール沈殿により約３．０縄のＤＮＡ断片
を回収した。」に訂正する。 （２１）明、細書第８頁最下行のｒ８８０ｂｐの」を削
除する。 （２２）明細書第８頁最下行の「３．０■」を「約３．
０厘」に訂正する。 （２３）明細書第２頁１４行目の１２０ｎＪをｒ２０顯
」に訂正する。 （２４）明細書部１０頁２３行目の「〜８」を削除する
。 （２５）明細書第１１頁１２行の「２〜１２」を「４」
に訂正する。 （２６）明細書第１１頁１２行および１３行目の「第２
表」を［第３表］に訂正する。 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 特許請求の範囲 （１） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体。 （２）・第１図のアミノ酸配列を有するヒトインターフ
ェロン−Ｔポリペプチドから一部のアミノ酸が除去また
は置換された特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
。 （３） ヒトインターフェロン−γポリペプチドから一
部のアミノ酸の除去がＮ末端からのアミノ酸の除去であ
り、一部のアミノ酸の置換が、Ｎ末端から１番目または
３番目に位置するＣｙｓのうち一方または両方を他のア
ミノ酸に置換することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 （４）：ｊ）インターフェロン−ＴポリペプチドのＮ末
端からの１番目または３番目に位置するＣｙｓを置換す
る他のアミノ酸がＴｙｒまたはＳｅｒであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （５） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラス
ミド。 （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 （７）該ＤＮＡ断片が第１表の塩基配列のうち８番目の
ＧをΔに変換した配列、２番目および／または８番目の
ＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基を欠失
した配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第５
または６項記載の組換え体プラスミド。 （８） ｐＧＢＤ−１，ｐＧＶＡ−４，ｐＧＶＫ−１３
゜ｐＧＷＣ〜１０と称する特許請求の範囲第５または６
項記載の組換え体プラスミド。 （９） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラ
スミドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養
物中にヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
生成蓄積せしめ、該培養物からヒトインターフェロン−
Ｔポリペプチド誘導体を採取することを特徴とするヒト
インターフェロン−γポリペプーチド誘導体の製造法。 σＯ該Ｉ）ＮΔ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第９
項記載の製造法。 ０υ 該微生物゛が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第９または１０項記載の製造法。 ０り ヒトインターフェロン−γポリペプチド誘導体が
第１表に示したアミノ酸配列のうち３番目のＣｙｓをＴ
ｙｒに変換した配列、１番目のＣｙ、ｓをＳｅｒに変換
した配列、３番目のＣｙｓをＳｅｔに変換した配列、１
番目および３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換した配列、ま
たはＮ末端の１〜７番目のアミノ酸を欠失した配列を有
することを特徴とする特許請求の範囲第９．１０または
１１項記載の製造法。 ０■ ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
コードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換体プラスミド
を含む微生物。 ００ 該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第１
３項記載の微生物。 ０ω 該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特許
請求の範囲第１３または１４項記載の微生物。 α０ 該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列のうち８
番目のＧを八に変換した配列、２番目および／または８
番目のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基
を欠失した配列を有することを特徴とする特許請求の範
囲第１３〜１５項記載の微生物。 ０′？） ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ａ −４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５） ＱＩＤ Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ Ｇ
Ｖ Ｋ −１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３２） Ｑ９） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｗ Ｃ−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７） （２１，８ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＧＢＤ−
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４＞ （２１） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｌ ｌ ０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４４） （２２） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｍ １０１（ＦＥＲ’Ｍ ＢＰ−５４５） （２３’） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ
Ｇ Ｗ Ｅ ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４６）
ートを示す。 第２図は、プラスミドｐＧｓＢ−６，ｐＧＶＡ−４の造
成のフロー・シートを示す。 第３図は、プラスミドｐＧＶＫ−１３の造成のフロー・
シートを示す。 第４図は、プラスミドｐＧＷＣ−１０の造成のフロー・
シートを示す。 特許出願人（１０２）協和醗酵工業株式会社代表者 木
下祝部 第１図 第４図 手続補正書（方式） ％式％ １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４６４５６号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロン−γポリペプチド誘導体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社昭和５９年３月７日（
発送日：昭和５９年３月２７日）５、補正の対象 手 続 補 正 書 昭和Ｓ９年７月ｌ１日 １、事件の表示 昭和５８年特許願第２４６４５６号 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 ［００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社（Ｔ口Ｌ ： ０３−
２０１−７２１１ 内線２７５１）明細書の発明の詳細
な説明の欄、特許請求の範囲の欄および図面 ５、補正の内容 ［実施例に。 １−３ｅ ｒ−ＩＦ’Ｎ−ｒをコードする組換え体プラ
スミドｐｃｖｔ、１０の造成： 実施例１により得られたｐ Ｇ Ｂ Ｄ ｌ Ｄ ＮＡ
６μｇをＹ−５０緩衝液５０μｌに溶かし、制限酵素
５ｉｎｌ ｔｏ単位を加え、３７℃で３時間消化反応を
行った。次いで、ＮａＣβを終濃度１００ｍｔ１４きな
るように加え、ＢａｍＨＩ ’１０単位を加え、３７℃
でさらに３時間消化反応を行った。 この反応液からｌ Ｇ Ｔ法により、ヒト［ＦＮ−ｒＤ
ＮΔの大部分を含む、約８５０ｂｐのＤＮＡ断片０．８
μｇを得た。 別に、特開昭５８−１１０６ （ｌ ０号公報記載の方
法で調製したｐＫＹＰｌｏ ＤＮＡ ３μｇをＹ−５０
緩衝液（全量４０μＩｌ）に溶かし、制限酵素Ｈｉ ｎ
ｄ ＩＩおよびＢ ａ ｍ ｌ−１１をそれぞれ５単
位ずつ加え、３７℃で３時間消化反応を行った。 この反応液から、Ｌ Ｇ Ｔ法により、トリブトファン
ブ０％−ター（Ｐｔｒｐ）を含む約４．３ Ｋ ｂのＤ
ＮＡ断片約１．８μｇ’ｃ得た。 一方、成熟ヒト１ＦＮ−ｒポリペプチドは、Ｎ末端から
、Ｃｙｓ−Ｔｙｒ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この１
番目のＣｙｓをＳ、ｅｒに置換し、かつ、発現に必要な
開始コドン（ＡＴＧ）を最初のＳｅｒの直前に付与する
目的で、下記のような１） Ｎ Ａリンカ−を合成した
。 まず、■本領ＤＮＡ、 ２０−＋ｎｅｔと１９＝ｍａｒ
を通常のトリエステル法［： ｌｔ、ｃｒｅａ ら；
Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、八ｃａｄ。 Ｓｃｉ、 ＵＳＡ、、７５．５７６５ （１９７８）］
ｌこより合成した。 ２０−ｍｅｒおよび１９−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍ
Ｍ−塩酸（ｐＨ７，５） 、 １０ｍＭ ＭｇＣｌ１２
．５ｍＭジチオスレイトール、０．１ｍＭ ＥＤＴＡお
よび１ｍＭ ＡＴ Ｐを含む全量４０μｌに溶かし、１
゛４ボリヌクレオチドキナ一セ３０単位を加えて、３′
７℃で６０分間リン酸化反応を行った。 次に上記で得たｐＧＢＤ１由来のＳ ｉ ｎ Ｉ −Ｂ
ａｍＨ１断片（約８５０ｂｐ）０．５μｇと発現ベクタ
ーｐＫＹＰ１０のＨｉｎｄｌｌ−Ｂａｍ）Ｉｆ断片（約
４．３Ｋｂ）１．０μｇとｆＴ４１）ガー卆緩衝液２５
μｌに溶かし、上記ＤＮＡリンカ−を約０．１μｇ加え
た。この混合液に、父らにＴ ４’ Ｄ ＮＡツリガー
ゼ単位を加え、４℃で１７ｉ間結答反応を行った。 １尋られた組換えプラスミドの混合物を用いて、大腸菌
８８１０１株を形質転換し、ΔｐＩ＋のコロニーを得た
。このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収し
、第５図に示したｐＧＶＬ １０を得た。ｐＧＶＬｌｏ
の構造は、ＥｃｏＲＩ。 ｐｃｖＬｌ ０のＨｉ ｎ ｄ ＩＩＩ部位から８１ｎ
Ｉ部位までの塩基配列は、 であることを、マキザム・ギルバートの方法〔八。 ５６０ （１９７７）〕で確認した。 ｐＧＶＬ １０のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプチ
ド〔本誘導体を１−５ｅｒ−１ＦＮ−γと呼ぶ〕は成熟
ヒ）ＩＦＮ−γの１番目のＣｙｓがＳｅｒにｉ換してい
る点でゑ知のものと、明らかに異なる。プラスミドｐＧ
ＶＬ１０をもつ大腸菌ＢＦ−’Ｊ４４）として微工研に
寄託されている。 実施例７゜ ３−’５ｅｒ−１ＦＮ−ｒをコードする組換え伺プラス
ミドｐＧＶＭ １０１の造成： 実施例１により得られたｐＧＢＤｌ 、ＤＮＡ６μｇを
Ｙ−５０緩衝液５０μ！に溶かし、制肖酵素５ｉｎｌ
１０単位を加え、３７℃で３時…消化反応を行った。次
いでＮａＣＪ！を終濃度１ｃ・ｍＭとなるように加え、
Ｂａｍ１（Ｉ １０単位る加え、３７℃でさらに３時間
消化反応を行った。 この反応液からＬＧＴ法により、ヒトＩＦＮ−７ＤＮＡ
の大部分を含む、約８５０ｂｐの゛ＤＮ’Ａ眺片０．１
μｇを得た。 別に、特開昭５８−１１０’６００号公報記載Ｑ方法で
調製しｊたｐＫＹＰｌｏ ＤＮＡ ３μｇイＹ−５０緩
衝液（全量４０μｌ）に溶かし、制御ｊ酵素Ｈｉ ｎ
ｄ ＬＩＴお１びＢａｍＨＩをそれぞれ５Ａ位ずつ加え
、３７℃（千′楡時間消化反応を行った。 この反応液から、ＬａＴｉｈにより、トリブトフフンプ
ロモーター（Ｐｔｒｐ）４’＆む約４．３ Ｋ ｂ Ｑ
ＤＮΔＤＮＡ１．８μｇを得た。 一方、成熟ヒ）ＩＦＮ−ｒポリペプチドは、を端末から
Ｃｙ・ｓ−Ｔ’ｙｒ−Ｃｙｓ−の構造を有するが、この
３＠目のＣ９ＳをＳｅｔに置換し、ｉつ、発現に必要な
開始コドン（ＡＴ（１；）を最初σＣｙｓの直前に付与
する目的で、下記のようなりＮＡリンカ−を合成した。 び ０ まず、１木ｔｉＪｌＤＮΔ、 ２０−ｍａｒと１９
−ｍａｒを通常のトリエステル法により合成した。２０
−＋ｒ＋ｅｒおよび１９−ｍｅｒの各々２μｇを５０ｍ
Ｍ）リス−塩酸（ｐ ｌ−１７，５）、１０ｍＭ Ｍｇ
Ｃｆ＊ 、５ｍＭジチオスｉ レイトール、０．１ｍＭ
ＥＤ↑゛Δおよび１ｍＭΔＴＰを含む全量４０μｌに
溶かし、Ｔ４ポリヌ〉 クレオチドキナーゼ３０単位を
加えて、３７℃で６ （１分間リン酸化反応を古ミだ。 □”′。１速 次に上記で１号たｐＧＢＤ１由来のＳ
ｉｎＩ−ＢａｍＨＩ断片（約８５０ｂｐ）０．５μｇと
発現ベクターｐＫＹＰ１０の旧ｎ”ｄｌｌｌ−ＢａｍＨ
Ｉ断片（約４．３Ｋｂ）１．０μｇとをＴ４リガーゼ緩
） 衝液２５μ！に溶かし、上記ＤＮＡリンカ−を約０
、ｌμｇを加えた。この混合液に、さらにＴ４Ｉ ＤＮ
ＡＩＪガーセ６単位を加え、４℃で１７時間結合反応を
行った。 得られた組換えプラスミドの混合物を用いて、） 大腸
菌Ｈ８１０１株を形質転換し、Δｐ１１のコ口ニーを得
た。このコロニーの培養液からプラスミドＤＮＡを回収
し、第６図に示したｐＧＶＭ １０１を得た。ｐＧＶＭ
ｌｏｌの構造は、ＥＣ０ＲＴ。 ＣＲａ Ｉ、Ｉ（ｉｎｄｌｌ［、ＢａｍＨＩで消化後、
アガロースゲル電気泳動により確認した。 ｐＧＶＭｌｏｌのｌ（ｉ ｎ ｄ ＩＩＩ部位から５ｉ
ｎ１部位までの塩基配列は、 であることを、マキサム・ギルバートの方法で確δ忍
しゾこ。 ｐＧＶＭ １０１のコードするヒトＩＦＮ−ｒポリペプ
チド〔本誘導体を３−３ｅｒ−１ＦＮ−ｒと呼ぶ〕は成
熟型ヒトＩＦＮ−ｒの３番目のＣｙｓがＳｅｒに置換し
ている点で公知のものと、明らかに異なる。プラスミド
ｐＧＶＭ１０１をもつ大腸菌はＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ
ｃｏｌｉ ｌ ＧＶＭ Ｌ Ｏ１（ＦＥＲＭＢＰ−５
４５）として微工研に寄託されている。 実施例８゜ ヒ）ＩＦＮ−ｒのＮ末端部分を欠失したポリペプチドを
コードするプラスミドｐＧＷＥ４の造成：参考例２の方
法によって得たｐＧＫＡ２（５，２Ｋｂ）２５μｇをＹ
−１０緩衝液４００μ！に溶かし、５０単位のＣｆｆａ
ｌを加え、３７℃で３時間消化反応を行った。この反応
液８０μｆ （ＤＮＡとして５μｇを含む）に１０倍の
ＢＡＬ−３１緩衝液を１２μＰ１水を２８μｐ加え、さ
らにヌクレアーゼＢΔＬ−３］ ０．２５単位を加えて
、３０℃で１０秒間反応を行った。ＢＡＬ−３１は、Ｄ
ＮＡ分子を末端から削ってゆく活性（エキソヌクレアー
ゼ活性）を有し、上記用いられた反応条件は、（Ｊ！ａ
１部位から約２０塩基対削れる条件である。 この反応液をフェノール抽出、クロロホルム抽出後、エ
タノール沈殿により、ＤＮＡを回収した。 回収したｐＧＫ△２の（１！ａｌ−ＢＡＬ３１消化断片
１．０μｇを２０μｌのＹ−５０緩衝液に溶かし、２単
位のＰｓｔｌを加え、３７℃で２時間消化反応を行った
。この反応から、ＬＧＴ法により約４．３ Ｋ ｂのＤ
ＮＡ断片０．５μｇを回収した。 次に、ＡＴＧ ・発現ベクターｐＴ ｒ Ｓ ３ （３
゜８Ｋｂ）５．０μｇを４０μｐのＹ−５０緩衝液に溶
かし、１０単位のＳｐｈ ｉを加え、３７℃で３時間消
化反応を行った。この反応液からＬ Ｇ Ｔ法により８
８０ｂｐのＤＮＡ断片３．０μｇを精製回収した。この
８８０ｂｐのＤＮＡ断片３．０μｇを６７ｍＭ）リス−
塩酸（ｐＨ８，３）、６．７ｍＭＭｇＣｌ１２．１０ｍ
Ｍメルカプトエ９／−ル。 ６．７ μＭ ＥＤＴＡ、１６．６ｍＭ （ＮＨ４）２
ＳＯ４を含む溶液に溶かし、ｄＡＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣ
ＴＰｄＧＴＰそれぞれ１ｍＭになるように加え、さらに
６単位のＴ４ＤＮＡポリメラーゼを加えて、３７℃で１
時間反応させ、突出末端を削った。フェノール抽出、ク
ロロホルム抽出の後、工９．／−ル沈殿により、ＤＮＡ
断片１．０μｇを回収した。 該ＤＮＡ断片１．０μｇを全量２０μｇのＹ−５０緩衝
液に溶かし、２単位のＰｓｔＩを加え、３７℃で３時間
消化反応を行った。この反応液からＬＧＴ法により、Ｐ
ｔｒｐを含む約８８０ｂｐのＤＮＡ断片０．５μｇを回
収した。 次に上記で得た、ｐＧＫＡ２のＣｊｌ！ａｌ−ＰｓｔＩ
断片（約４．３Ｋｂ）０．５μｇとｐＴｒＳ３−３ｐｈ
ｌ−Ｔ４ポリメラーゼ−Ｐｓｔｌ断片（８８０ｂｐ）０
．５μｇを全量１０μｌのＴ４リガーゼ緩衝液に溶かし
、Ｔ４ＤＮＡ’Ｊガーゼ０．３単位を加え、４℃で１８
時間結合反応を行った。 得られた組換え体プラスミドの混合物を用いて大腸菌８
８１０１株を形質転換し、生じたＡｐｌのコロニーから
プラスミドＤＮＡを回収し、第７図に示したｐＧＷＥ４
を得た。ｐＧＷＥ４の構造は、ＥｃｏＲＩ、Ｃｊ！ａ
Ｉ、Ｂａｍ１−１１で消化後、アガロースゲル電気泳動
により確認した。 ｐＧＷＥ４のヒトＩＦＮ−ｒ構造遺伝子のＮ末端付近の
配列は、 ＭｅｔΔ５ｐＰｒｏＴｙｒＶａｌＧｌｎ−ΔＴＧＧΔＣ
ＣＣΔ１゛ΔＴ Ｇ ′ＦＡ ＣΔＡであることをマキ
サム・ギルバートの方法で、確認し、成熟型ヒ）ＩＦＮ
−ｒポリペプチド〔本誘導体をＩＦＮ−７−（△ｌ〜４
）と呼ぶ〕のＮ末端のＣｙｓから４番目のＧｉｎまで４
つのアミノ酸が欠失し、５番目のΔｓｐから始まってい
ることが確認された。プラスミドｐＧＷＥ４をもつ大腸
菌は８ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ ＧＷＥ４
（ＦＥＲＭＢＰ−５４６）として微工研に寄託されて
いる。 実施例９゜ ｐＧＶＬｌｏ、ｐＧＶＭｌｏｌ、ｐＧＷＥ４を保有する
大腸菌によるＩＦＮ−ｒ誘導体の生産：実施例６〜８で
碍た組換え体プラスミドｐＧＶＬ１０、ｐＧＶＭｌｏｌ
、ｐＧＷＥ４をもつ大腸菌８８１０１株（それぞれをＩ
ＧＶＬＩＯ，ＩＧＶＭｌｏｌおよびＩＧＷＥ４と命名）
をＬＧ培地で３７℃、１８時間培養し、この培養液０．
２ｍｌを１０ｍｌのＭＣＧ培地に接種し、３０℃で４〜
８時間培養後、ＩＡＡを１０μｇ／ｍｌ加え、さらに、
２〜１２時間培養を続けた。培養液をｇ、 ｏ ｏ 。 ｒｐｍ、１０分間遠心して集菌し、３０ｍＭＮａ（１！
、３０ｍＭ）リス−塩酸（ｐＨ７，５）緩衝液で洗浄し
た。洗浄菌体を上記緩衝液１ｍｌに懸濁し、２ Ｆ）
０μｇのリゾチーム、Ｏ，２５ＭＥＤ′Ｉ″Ａを５μｌ
加えて、３０分間遠心して上清を得、上清中のインター
フェロンの量を！−ムストロングの方法に従って定量し
た。但し、ウィルスとしては、５ｉｎｄｖｉｓ ｖｉｒ
ｕｓ 、動物細胞としては、ヒト羊膜細胞由来のエフエ
ル・セル（ＦＬｃ’ａｌｌ）を用いた。 結果を第２表に示す。 第 ２ 表 （２）明細書第６頁１７行目および２１〜２２行目のｒ
ｌＦＮ−４ＪをｒｌＦＮ−α」に訂正する。 （３）明細書筒３１頁１９行目の「第１図に示した」を
削除する。 （４） 明細書第３３頁下から１２行目の［ｐ ｒ ｏ
ｃ ； ＪをｒＰｒｏｃ、Ｊに訂正する。 （５）明細書第３３頁１２行目の後に次の記載を加入す
る。 「第５図は、プラスミドｐＧＶＬ１０の造成のフロー・
シートを示す。 第６図は、プラスミドｐＧＶＭ １０１の造成のフロー
・シートを示す。 第７図は、プラスミドｐＧＷＥ４の造成のフロー・シー
トを示す。」 （６）第５〜７図゛を明細書に補充する。 −一□□□□−□や （７）明細書の特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する
。 （８）受託証（写）を特徴する 特許請求の範囲 （１） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体。 （２）第１図のアミノ酸配列を有するヒトインターフェ
ロン−Ｔポリペプチドから一部のアミノ酸が除去または
置換された特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （３） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドから一
部のアミノ酸の除去がＮ末端からのアミノ酸の除去であ
り、一部のアミノ酸の置換が、Ｎ末端から１番目または
３番目に位置するＣｙｓのうち一方または両方を他のア
ミノ酸に置換することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 （４） ヒトインターフェロン−ＴポリペプチドのＮ末
端からの１番目または３番目に位置するＣｙｓを置換す
る他のアミノ酸がＴｙｒまたはＳｅｒであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （５） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラス
ミド。 （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 （７）該Ｄ’ＮＡ断片が第１表の塩基配列のうち８番目
のＧを八に変換した配列、２番目および／または８番目
のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基を欠
失した配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第
５または６項記載の組換え体プラスミド。 （８） ｐＧＢＤ−１，ｐＧＶΔ−４，ｐＧＶＫ−１３
゜ｐＣ，ＷＣ−１０と称する特許請求の範囲第５または
６項記載の組換え体プラスミド。 （９） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラ
スミドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養
物中にヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
生成蓄積せしめ、該培養物からヒトインターフェロン−
ｒポリペプチド誘導体を採取することを特徴とするヒト
インターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体の製造法。 ＧＯ該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下流
に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第９項
記載の製造法。 （１１）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第９または１０項記載の製造法。 （１２）ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
が第１表に示したアミノ酸配列のうち３番目のＣｙｓを
Ｔｙｒに変換した配列、１番目のＣｙｓをＳｅｒに変換
した配列、３番目のＣｙ −ｓをＳｅｒに変換した配列
、１番目および３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換した配列
、またはＮ末端の１〜７番目のアミノ酸を欠失した配列
を有することを特徴とする特許請求の範囲第９．１０ま
たは１１項記載の製造法。 （１３）ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換体プラスミ
ドを含む微生物。 （１４） 該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーター
の下流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲
第１３項記載の微生物。 （１５）咳微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第１３または１４項記載の微生物。 （Ｉ６）該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列のうち
８番目のＧをΔに変換した配列、２番目および／または
８番目のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩
基を欠失した配列を有することを特徴とする特許請求の
範囲第１３−？１５項記載の微生物。 （１７） ［１ｓｃｌ＋ｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ
Ｇ Ｖ△−４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５） （１８） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｋ −１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３２） （１９） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｗ Ｃ−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７） （２０）Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ Ｇ
Ｂ Ｄ −１（ＦＥ！ＲＭ ＢＰ−３９’４） ６、添付書類の目録 図 面（第５〜７図） １通 受託証 １通 第７図 手続補正書く自発） 昭和６０年７月３／日 特許庁長官 殿 ２、発明の名称 新規ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体 ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 郵便番号 １００ 住 所 東京都千代田区大手町−丁目６番１号名 称
（１０２）協和醗酵工業株式会社明細書の発明の詳細な
説明の欄および特許請求の範囲の欄 （２〕 明細書箱、１１頁１０行目のｒＡｎａｌｙｔｕ
ａｌ ｊ を［＾ｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｊに訂正する。 （３）明細書第１７頁２行目のｒＢｏｌ １ｖｅｒ Ｊ
をｆＢｏｌｉｖａｒＪ に訂正する。 （４）明細書第１８頁４行目の「Ｔ」をｒｇａＡＴＪに
訂正する。 （５）明細書第２９頁１４行目のｒＭＧ（１２ＪをｒＭ
ｇ５Ａ２Ｊ・に訂正する。 （６）明細書第２９頁１行目のｒＴｒｙＪをｒＴｙｒＪ
に訂正する。 （７） 明細書第２９頁１４行目のｒＴ４ポリメラーゼ
」をｒＴ４ＤＮＡポリメラーゼ」に訂正する。 （８）明細書第入６頁９行〜１０行目の「この反応液・
・・・・・回収した。」を「フェノール抽出、り１０ロ
ホルム抽出後、エタノール沈殿により約３．０／１ｇの
ＤＮＡ断片を回収した。」に訂正する。 （９）明細書第２９頁１４行目のｒ８８０ｂｐの」を削
除する。 σＧ 明細書第２９頁１４行目のｒ３．０ＲＪを「約３
．０犀」に訂正する。 ００ 明細書箱２８頁１０行目のｒＬＧ倍地」をｒＬＧ
培地」に訂正する。 αつ 明細書第２８頁１９行目の「トリプトファン」の
後に「・オペロン」を加入する。 ０Ｊ 明細書第２８頁１９行目の「〜８」を削除する。 ０Ｏ明細書第２８頁２１行〜２２行目の「２〜１２」を
「４」に訂正する。 Ｑ５１ 明細書第２９頁１４行目の［〔但し」を「但し
」に訂正する。 Ｑ６１ 明細書第２９頁１４行および１５行目の「第１
表」を「第２表」に訂正する。 Ｑ７１ 明細書第２９１４行のｒ６８１４Ｊの後に、「
、ＦＥＲＭ ＢＰ−４９７Ｊを加入する。 ０印 明細書箱３５頁３行目のｒ６７９８Ｊの後に、「
、ＦＥＲＭ ＢＰ−４９６Ｊを加入する。 ０ｇｌ 明細書（昭和５９年７月１１日付提出の手続補
正書、以下同じ）第３頁下から１５行目の「−塩」を「
トリス−塩」に訂正する。 （イ）明細書箱８頁２２行〜最下行の「この反応液・・
・・・回収した。」を「フェノール抽出、クロロホルム
抽出後、エタノール沈殿により約３．０縄のＤＮＡ断片
を回収した。」に訂正する。 （２１）明、細書第８頁最下行のｒ８８０ｂｐの」を削
除する。 （２２）明細書第８頁最下行の「３．０■」を「約３．
０厘」に訂正する。 （２３）明細書第２頁１４行目の１２０ｎＪをｒ２０顯
」に訂正する。 （２４）明細書部１０頁２３行目の「〜８」を削除する
。 （２５）明細書第１１頁１２行の「２〜１２」を「４」
に訂正する。 （２６）明細書第１１頁１２行および１３行目の「第２
表」を［第３表］に訂正する。 （２、特許請求の範囲を別紙のとおり訂正する。 特許請求の範囲 （１） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体。 （２）・第１図のアミノ酸配列を有するヒトインターフ
ェロン−Ｔポリペプチドから一部のアミノ酸が除去また
は置換された特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド
。 （３） ヒトインターフェロン−γポリペプチドから一
部のアミノ酸の除去がＮ末端からのアミノ酸の除去であ
り、一部のアミノ酸の置換が、Ｎ末端から１番目または
３番目に位置するＣｙｓのうち一方または両方を他のア
ミノ酸に置換することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 （４）：ｊ）インターフェロン−ＴポリペプチドのＮ末
端からの１番目または３番目に位置するＣｙｓを置換す
る他のアミノ酸がＴｙｒまたはＳｅｒであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （５） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラス
ミド。 （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 （７）該ＤＮＡ断片が第１表の塩基配列のうち８番目の
ＧをΔに変換した配列、２番目および／または８番目の
ＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基を欠失
した配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第５
または６項記載の組換え体プラスミド。 （８） ｐＧＢＤ−１，ｐＧＶＡ−４，ｐＧＶＫ−１３
゜ｐＧＷＣ〜１０と称する特許請求の範囲第５または６
項記載の組換え体プラスミド。 （９） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラ
スミドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養
物中にヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
生成蓄積せしめ、該培養物からヒトインターフェロン−
Ｔポリペプチド誘導体を採取することを特徴とするヒト
インターフェロン−γポリペプーチド誘導体の製造法。 σＯ該Ｉ）ＮΔ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第９
項記載の製造法。 ０υ 該微生物゛が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第９または１０項記載の製造法。 ０り ヒトインターフェロン−γポリペプチド誘導体が
第１表に示したアミノ酸配列のうち３番目のＣｙｓをＴ
ｙｒに変換した配列、１番目のＣｙ、ｓをＳｅｒに変換
した配列、３番目のＣｙｓをＳｅｔに変換した配列、１
番目および３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換した配列、ま
たはＮ末端の１〜７番目のアミノ酸を欠失した配列を有
することを特徴とする特許請求の範囲第９．１０または
１１項記載の製造法。 ０■ ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
コードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換体プラスミド
を含む微生物。 ００ 該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第１
３項記載の微生物。 ０ω 該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特許
請求の範囲第１３または１４項記載の微生物。 α０ 該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列のうち８
番目のＧを八に変換した配列、２番目および／または８
番目のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基
を欠失した配列を有することを特徴とする特許請求の範
囲第１３〜１５項記載の微生物。 ０′？） ε５ｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ａ −４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５） ＱＩＤ Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｔ Ｇ
Ｖ Ｋ −１３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３２） Ｑ９） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｗ Ｃ−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７） （２１，８ｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ ＩＧＢＤ−
１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４＞ （２１） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｌ ｌ ０（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４４） （２２） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｍ １０１（ＦＥＲ’Ｍ ＢＰ−５４５） （２３’） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ
Ｇ Ｗ Ｅ ４（ＦＥＲＭ ＢＰ−５４６）
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 （１） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体。 （２）第１図のアミノ酸配列を有するヒトインターフェ
ロン−Ｔポリペプチドから一部のアミノ酸が除去または
置換された特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （３） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドから一
部のアミノ酸の除去がＮ末端からのアミノ酸の除去であ
り、一部のアミノ酸の置換が、Ｎ末端から１番目または
３番目に位置するＣｙｓのうち一方または両方を他のア
ミノ酸に置換することを特徴とする特許請求の範囲第１
項記載のポリペプチド。 （４） ヒトインターフェロンーγポリペプチドのＮ末
端からの１番目または３番目に位置するＣｙｓを置換す
る他のアミノ酸がＴｙｒまたはＳｅｒであることを特徴
とする特許請求の範囲第１項記載のポリペプチド。 （５） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラス
ミド。 （６）該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの下
流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第５
項記載の組換え体プラスミド。 （７）該ＤＮＡ断片が第１表の塩基配列のうち８番目の
Ｇを八に変換した配列、２番目および／または８番目の
ＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩基を欠失
した配列を有することを特徴とする特許請求の範囲第５
または６項記載の組換え体プラスミド。 （８） ｐＧＢＤ−１，ｐＧＶＡ〜４．ｐＧＶＫ−１３
゜ｐＧＷＣ−’１０と称する特許請求の範囲第５または
６項記載の組換え体プラスミド。 （９） ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチドの誘導
体をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換え体プラ
スミドを用い形質転換した微生物を培地に培養し、培養
物中にヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体を
生成蓄積せしめ、該培養物からヒトインターフェロン−
Ｔポリペプチド誘導体を採取することを特徴とするヒト
インターフェロン−ｒポリペプチド誘導体の製造法。 Ｑｆ） 該ＤＮＡ断片がトリプトファンプロモーターの
下流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲第
９項記載の製造法。 （１１）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第９または１０項記載の製造法。 （１２）ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
が第１表に示したアミノ酸配列のうち３番目のＣｙｓを
Ｔｙｒに変換した配列、１番目のＣｙｓをＳｅｒに変換
した配列、３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換した配列、１
番目および３番目のＣｙｓをＳｅｒに変換した配列、ま
たはＮ末端の１〜７番目のアミノ酸を欠失した配列を有
することを特徴とする特許請求の範囲第９．１０または
１１項記載の製造法。 （１３）ヒトインターフェロン−Ｔポリペプチド誘導体
をコードするＤＮＡ断片が組み込まれた組換体プラスミ
ドを含む微生物。 （１４）該ＤＮＡ断片がトリプトファン、プロモーター
の下流に組み込まれたことを特徴とする特許請求の範囲
第１３項記載の微生物。 （１５）該微生物が大腸菌に属することを特徴とする特
許請求の範囲第１３または１４項記載の微生物。 （１６）該ＤＮＡ断片が第１表に示した塩基配列のうち
８番目のＧをΔに変換した配列、２番目および／または
８番目のＧをＣに変換した配列または１〜２１番目の塩
基を欠失した配列を有することを特徴とする特許請求の
範囲第１３〜１５項記載の微生物。 （１７） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ａ −４（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９５） （１８） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｖ Ｋ−Ｌ ３（ＦＥＲＭ ＢＰ−４３２） （１９） Ｂｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｗ Ｃ−１０（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９７） （２０） Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｉ Ｇ
Ｂ Ｄ−１（ＦＥＲＭ ＢＰ−３９４）
Priority Applications (13)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58246456A JPS60136600A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド誘導体 |
| DK610884A DK168016B1 (da) | 1983-12-26 | 1984-12-19 | Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid |
| US06/683,363 US4758656A (en) | 1983-12-26 | 1984-12-19 | Novel human interferon-gamma polypeptide derivative |
| NO845132A NO174161C (no) | 1983-12-26 | 1984-12-20 | Fremgangsmåte for fremstilling av humane interferon--polypeptidderivater, og rekombinante plasmider inneholdende et DNA-fragment som koder for polypeptidene |
| DE198484116039T DE146944T1 (de) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Menschliches gamma-interferonpolypeptidderivat. |
| DE84116039T DE3486111T2 (de) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Menschliches gamma-Interferonpolypeptidderivat. |
| EP84116039A EP0146944B1 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Novel human interferon- polypeptide derivative |
| AT84116039T ATE87334T1 (de) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Menschliches gamma-interferonpolypeptidderivat. |
| IL7389284A IL73892A (en) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | A polypeptide derivative at the N-terminus of human interferon-G |
| CA000470904A CA1303528C (en) | 1983-12-26 | 1984-12-21 | Human interferon- _polypeptide derivative |
| AU37184/84A AU580748B2 (en) | 1983-12-26 | 1984-12-24 | Novel human interferon-`` polypeptide derivative |
| ES539068A ES8606490A1 (es) | 1983-12-26 | 1984-12-26 | Un derivado de polipeptido de interferon-a humano |
| DK147292A DK169347B1 (da) | 1983-12-26 | 1992-12-08 | Derivat af humant interferon-gamma-polypeptid |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP58246456A JPS60136600A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド誘導体 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS60136600A true JPS60136600A (ja) | 1985-07-20 |
Family
ID=17148696
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP58246456A Pending JPS60136600A (ja) | 1983-12-26 | 1983-12-26 | 新規ヒトインタ−フエロン−γポリペプチド誘導体 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS60136600A (ja) |
-
1983
- 1983-12-26 JP JP58246456A patent/JPS60136600A/ja active Pending
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