NO170754B - Fremgangsmaate for fremstilling av vandig insulinpreparater - Google Patents

Description

Denne oppfinnelse angår fremstilling av insulinpreparater inneholdende magnesiumioner. Preparatene oppviser forbedrede terapeutiske egenskaper.

Insulinpreparater som anvendes for behandling av diabetes, omfatter både oppløsninger og suspensjoner av insulin. Insulinsuspensjonene, alle med langvarig virkning, har pH-verdier rundt 7. Insulinoppløsningene har pH-verdier enten rundt 3 (hurtigvirkende såvel som langvarig virkende oppløsninger) eller rundt 7 (bare hurtigvirkende oppløsninger).

Grunnen til avstanden mellom de to pH-områder for insulinoppløsninger er den lave oppløselighet i vann av insulin rundt dets isoelektriske pH (ca. pH 5,3) både i fravær av sinkioner (Tanford and Epstein: J.Am.Chem.Soc. 76 (1954), 2163 - 69, Fig. 1) og i nærvær av sinkioner (Fredericq and Neurath: J.Am.Chem.Soc. 72 (1950), 2684 - 91, Fig. 4).

De sure insulinoppløsninger anvendes ikke lenger i så omfattende grad som de gjorde da man i begynnelsen brukte insulin, på grunn av nedbrytningen av insulin ved deamidering.

Ifølge foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en fremgangsmåte for fremstilling av vandige insulinpreparater for parenteral administrering inneholdende minst 20 insulinenheter pr. mol. Fremgangsmåten karakteriseres ved at vann blandes med insulin eller et derivat derav og magnesiumioner, for å oppnå en oppløsning med en magnesiumkonsentrasjon i området fra 0,005 til 0,5 M, hvis nødvendig, reguleres pH-verdien innen området fra 3 til 8,5, fortrinnsvis under 8, og eventuelt tilsettes sink og/eller protamin, og eventuelt anvendes et langvarig virkende bunnfall av insulin eller et derivat derav.

Foreliggende oppfinnelse er basert på de følgende overraskende oppdagelser: 1) Oppløsninger inneholdende insulin i terapeutisk passende konsentrasjoner kan fremstilles ved magnesiumion-konsentrasjoner på 0,05 til 0,5 mol/liter i pH-området 4 til 6,2, dvs. rundt insulinets isoelektriske punkt.. 2) I pH-området fra 3-4, som ikke passer for insulin på grunn av kjemisk ustabilitet, kan oppløsninger av insulinderivater fremstilles i nærvær av magnesiumioner i konsentrasjoner på 0,005 til 0,5 M, forutsatt at Asn^<1> er substituert med en aminosyrerest som ikke inneholder en amidogruppe. 3) Også i pH-området på 6,2 - 8,5, kan nyttige insulin-oppløsninger, eventuelt inneholdende et insulin-bunnfall, fremstilles i nærvær av magnesiumioner i konsentrasjoner på 0,005 til 0,5 M.

Preparatene fremstilt ifølge foreliggende oppfinnelse har egenskaper som er bedre enn egenskapene hos de tidligere vanlige insulinpreparater.

Når det gjelder 1), er det nu overraskende funnet at mange magnesiumsalter, for eksempel magnesiumklorid, har en solubiliserende virkning på insulin ved pH-verdier på 4 til 6,2, både i seg selv og sammenlignet med de tilsvarende natrium-, kalium- og ammoniumsalter (se eksempel 1 nedenfor). Forskjellige blandinger av magnesiumsalter har den samme virkning. Det kan derfor konkluderes at tilstedeværelsen av magnesiumioner i visse konsentrasjoner er en kritisk parameter for oppløseligheten av insulin ved pH-verdier på 4 til 6,2. Uttrykket magnesiumioner skal her forstås å omfatte både frie og bundne magnesiumioner.

Det er dessuten overraskende funnet at protamin kan innarbeides i insulinoppløsningene fremstilt ifølge oppfinnelsen med pH-verdier på 4 til 6,2 uten utfeining av protamin-insulinkompleks. Ved regulering til en pH-verdi på ca. 7, vil et slikt kompleks utfelles.

Kalsiumioner øker også insulinoppløseligheten i pH-området på 4 til 6,2. Resultatene av in vitro forsøk under simulerte fysiologiske tilstander viser imidlertid at injeksjon av en oppløsning inneholdende kalsiumioner i vev, vil forårsake utfelning av kalsiumkarbonat og kalsiumfosfat selv ved kalsiumkonsentrasjoner langt under 0,05 M. Andre forsøk viser at utfelning av tilsvarende magnesiumforbindelser ikke vil finne sted ved injeksjon av oppløsninger fremstilt ifølge oppfinnelsen. Eftersom utfelning av kalsium-forbindelser i vev kan være skadelig (på grunn av risikoen for kunstig frembrakt forkalkning) bør innholdet av frie kalsiumioner i insulinpreparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen ikke være vesentlig høyere enn det som svarer til kalsiuminnholdet i ekstracellulære væsker. Fortrinnsvis inneholder preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen mindre enn 10 mM kalsium, særlig foretrukket mindre enn 2 mM kalsiumioner.

Såvidt det har vært mulig å fastslå, er det i tidligere litteratur som angår insulinoppløsninger inneholdende magnesiumioner, ikke nevnt noe om pH-intervallet på pH 4 til 6,2 eller magnesiumionekonsentrasjoner på 0,005 til 0,5 mol/- liter.

Dansk patent 63 000 angår preparater inneholdende suspensjoner av komplekser dannet av insulin, varighetsøkende midler (dvs. protamin) og magnesiumioner ved pH-verdier fra 6,5 til 7, hvor de angitte magnesiumkonsentrasjoner er under 0,004 M.

US-patent 4 196 196 angår et preparat for økning av vaskulær perfusjon og reperfusjon i sykdomstilstander, hvor preparatet består av glukose, insulin og magnesiumdikaliumetylendiamin-tetraeddiksyre. Ifølge eksemplet inneholder det kjente preparat 0,02 insulinenheter pr. ml.

US-patent 4 472 385 angår stabilisering av sink-insulin-oppløsninger ved pH-verdier fra 7 til 8, og den forbedrede stabilitet oppnås ved tilsetning av ca. 0,0004 til 0,01 M kalsium- eller magnesiumioner. Den øvre grense for magnesium-konsentras j onen i de kjente eksempler er 0,002 M.

Innholdet av de tre ovennevnte patenter faller utenfor rammen av foreliggende oppfinnelse.

I henhold til foreliggende oppfinnelse kan magnesiumioner i det ovenfor angitte konsentrasjonsområde settes til en oppløsning av insulin eller av et insulinderivat, idet denne oppløsning eventuelt dessuten inneholder utfelt insulin eller et utfelt insulinderivat med langvarig virkning. For subkutan administrering tilsettes magnesiumioner for å oppnå en oppløsning med en virkning som begynner tidligere, eller hvis oppløsningen inneholder protamin, en langvarig virkning. Hvis preparatet fremstilt ifølge oppfinnelsen også inneholder utfelt insulin eller et utfelt insulinderivat, kan man oppnå et tofase-preparat. Sammenlignet med de kjente tofase-insulinpreparater, har tofase-preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen, en blodsukker-senkende virkning som begynner raskere. Eksempler på utfelt insulin er sink-insulin-krystaller og protamin-sinkinsulin-krystaller.

Konsentrasjonen av oppløst insulin kan være i området på 2 0 til 500 insulinenheter pr. ml.

I og for seg kjente stabilisatorer og konserveringsmidler kan være til stede i insulinpreparatet.

Protamin kan være til stede, hensiktsmessig i mengder fra 8 til 40 % (vekt/vekt) basert på vekten av insulin, idet 10 til 3 0 % (vekt/vekt) er et foretrukket område.

Fravær av retarderende stoffer i insulinoppløsningene fremstilt ifølge oppfinnelsen gjorde at absorpsjonen av insulin ble overraskende funnet å være raskere enn for sammenlignings-insulin (se eksempler 2 til 9 og 11 nedenfor). Denne egenskap er nyttig for et hurtigvirkende insulin, særlig i tilknytning til en behandling med flere injeksjoner hvor insulin gies før hvert måltid. Med en virkning som begynner raskere, kan insulinen hensiktsmessig taes nærmere måltidet enn med vanlige hurtigvirkende insulinoppløsninger. Videre vil en raskere forsvinning av insulin sannsynligvis redusere risikoen for hypoglykemi efter måltidet.

Insulinoppløsninger fremstilt ifølge oppfinnelsen med en pH-verdi i området 3 - 6,2 kan også være særlig nyttige for infusjon ved hjelp av pumper, fordi det ikke finner sted insulinutfeining forårsaket av karbondioksyd-diffusjon gjennom kateteret. Slik utfelning er leilighetsvis iakttatt med nøytrale infusjonsoppløsninger og antas å skyldes den senkning av pH-verdien som forårsakes av karbondioksyd.

Insulinoppløsninger fremstilt ifølge oppfinnelsen inneholdende over 5 %, fortrinnsvis over 8 %, spesielt over 10 % (vekt/vekt), protamin på basis av insulin, oppviser forsinket absorpsjon av insulin efter subkutan injeksjon i griser sammenlignet med sammenligningsinsulinet (se eksemplene 4 og 5 nedenfor). Fortrinnsvis er innholdet av protamin under 50 %, fortrinnsvis under 40 %, særlig foretrukket under 30 %

(vekt/vekt). Protamin-insulin-preparater fremstilt ifølge oppfinnelsen har en fordel sammenlignet med langvarig virkende nøytrale insulin-protamin-suspensjoner eftersom man ikke får den uheldige sedimentering. De kjente nøytrale protamin-insulin-preparater er suspensjoner, mens de foretrukne protamin-insulin-preparater fremstilt ifølge oppfinnelsen er oppløsninger ved pH-verdier under 6,2.

Oppløsningene fremstilt ifølge oppfinnelsen antas å være særlig velegnet for administrering fra fyllepenn-lignende innretninger som anvendes for behandling ved flere insulin-injeksjoner.

Preparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan inneholde et naturlig forekommende insulin og/eller et derivat derav. Foretrukne insuliner for praktisk utførelse av denne oppfinnelse er fra mennesker, griser og storfé, særlig fra mennesker. Også andre naturlig forekommende insuliner kan anvendes ved praktisk utførelse av oppfinnelsen. Fortrinnsvis anvendes insulin med høy renhet. I denne sammenheng skal uttrykket insulin når det anvendes i flertall eller i generisk betydning, forstås å omfatte både naturlig forekommende insuliner og insulinderivater.

Noen forskjeller med hensyn til egenskaper kan man vente å finne når det gjelder naturlig forekommende insuliner og insulinderivater.

Betegnelsen derivater av insulin (eller insulinderivater) skal her forstås å bety peptider som har blodsukkersenkende virkning og har en aminosyre-sammensetning som er identisk med den man finner hos mennesker-insulin, med det forbehold at noen av aminosyre-restene er utskiftet med andre aminosyre-rester, og eventuelt er den C-terminale karboksygruppen i B-kjeden beskyttet. Eksempler på slike insulinderivater er blant annet beskrevet i to europeiske patentansøkninger, publikasjoner 86301755 og 86306721, som det her skal henvises til.

Når menneske-, grise- eller storfé-insulin anvendes for fremstilling av oppløsninger ifølge oppfinnelsen, må sinkinnholdet i insulinet være lavt, normalt mindre enn 1 sinkion pr. heksamer insulin, fortrinnsvis under 0,5, særlig under 0,1 sinkioner/heksamer (svarende til mindre enn 0,02 % (vekt/vekt) på basis av insulin), for å unngå utfelning av insulin ved pH-verdier over 4, og dette gjelder også for oppløsninger inneholdende protamin. Sink-insulin-krystaller kan befries for sink, for eksempel ved den utsaltningsprosess fulgt av utfelning ved pH 5 (Schlichtkrull: Acta Chem.Scand. 10

(1956), 1455 - 58). Hvis imidlertid midlet som kan danne komplekse med sink, såsom citrat, er til stede, kan sinkinnholdet være høyere.

Når insulinderivater anvendes, er ikke sinkinnholdet nødvendigvis kritisk i samme grad. I noen tilfeller med insulinderivater, kan høye konsentrasjoner av sinkioner (for eksempel opp til 10 sinkioner pr. heksamer) være forenlig med insulin-oppløseligheter under betingelsene for oppløsningene fremstilt ifølge oppfinnelsen, eller kan til og med være ønskelig (se europeisk patentansøkning 86301755).

Protamin er kjent for å være en heterogen blanding. Protamin kan oppnås fra fisker såsom Oncorhynchus keta. Imidlertid kan også protamin fra andre fisker anvendes. Normalt markedsføres protamin som protaminsulfat. Imidlertid kan også andre salter anvendes. Fortrinnsvis anvendes protamin med høy renhet.

Som eksempler på andre foretrukne preparater kan nevnes preparater inneholdende både sink og protamin. I slike preparater, som kan være oppløsninger av insulinderivater i pH-området 3-4 eller nøytrale suspensjoner av pattedyr-insulin, kan sinkinnholdet være opptil ca. 25 sinkioner pr. heksamer insulin eller insulinderivat.

Innholdet av insulin i oppløsninger fremstilt ifølge oppfinnelsen kan være i området 20 til 500 IU/ml, fortrinnsvis fra 30 til 200 IU/ml, spesielt i området 40 til.100 IU/ml, i preparater for injeksjon. For andre formål med parenteral administrering kan imidlertid irisulininnholdet være høyere. Insulinoppløsningen kan blandes med et fast insulinmateriale såsom sink-insulin-krystaller eller sink-protamin-insulin-krystaller.

I henhold til oppfinnelsen kan en rekke oppløselige magnesiumsalter anvendes, både hver for seg og blandet. Eksempler på passende anioner er klorid, sulfat, monokarboksylater såsom acetat, propionat og butyrat, og dikarboksylater såsom suksinat, aspartat og glutamat. Den optimale konsentrasjon av magnesiumioner vil være avhengig av anvendt(e) salt(er) og bør velges under hensyntagen til den ønskede virkningstid for preparatet, insulin-oppløseligheten og preparatets nærhet til isotone tilstander. Isotone konsentrasjoner av magnesiumsalter viser stor variasjon slik som det kan illustreres ved de isotone konsentrasjoner av magnesiumklorid og magnesiumsulfat som er henholdsvis ca. 0,1 M og 0,26 M. Andre salter, aminosyrer og ikke-ioniske midler (bortsett fra konserveringsmidler) kan være til stede hvis de er ugiftige og forlikelige med insulinpreparatet i sin helhet.

Ifølge oppfinnelsen er området for passende magnesiumionekonsentrasjoner 0,005 M til 0,5 M, fortrinnsvis over 0,01 M, særlig over 0,05 M. Den øvre grense er noe vilkårlig, idet den velges ut fra den antagelse at i noen tilfeller (for eksempel ved intraperitoneal infusjon) kan en viss overskridelse av den isotone tilstand godtas. I henhold til en foretrukket utførelsesform av denne oppfinnelse fremstilles preparater inneholdende 0,08 M til 0,3 M magneiumioner.

Konserveringsmidlet som settes til insulinpreparatet, kan være slik som i de tidligere vanlige insulinpreparater, for eksempel fenol, m-kresol og metylparaben.

For fremstilling av vandige insulinoppløsninger kan en svakt sur oppløsning av insulin blandes med en oppløsning inneholdende alle de andre bestanddeler i det ferdige preparat. Derefter følger regulering av pH-verdien i den grad det er nødvendig, særlig til området 5-6 omrøring inntil man oppnår en klar oppløsning og til slutt steril filtrering. Eventuelt kan en steril, langvarig virkende insulinsuspensjon settes til den sterile insulinoppløsning slik at man får et preparat ved en tofase-virkning. For å beskytte preparatene mot denaturering som kan finne sted ved leilighetsvis oppvarmning og risting, kan man innføre kjente stabiliseringsmidler såsom fosfolipider.

Preparater inneholdende et insulinderivat fremstilles på analog måte.

Insulinpreparatene fremstilt ifølge oppfinnelsen kan anvendes ved behandling av diabetes. Det anbefales at dosen av insulinprepatene fremstilt ifølge oppfinnelsen velges av en lege på tilsvarende måte som ved valg av dosen av kjente insulinpreparater for injeksjon.

De følgende eksempler illustrerer hvordan magnesiumioner øker oppløseligheten av insulin, hvordan foretrukne insulin-preparater kan fremstilles og hvordan de virker efter injeksjon i griser.

Eksempel 1

Sure oppløsninger inneholdende 2 00 IU sinkfritt, humant monokomponent-insul in pr. ml, en spormengde av humant mono125I-(A19)-insulin, 2 g fenol/liter og et salt (angitt i tabell I nedenfor) ved omtrentlig isoton konsentrasjon, ble regulert til pH-verdiene angitt i tabell I. Oppløselighetene ble bestemt ved måling av radioaktivitet-konsentrasjoner i væsken på toppen og overføring av resultatene til IU/ml (1 IU svarer til 38 /xg insulin) . Virkningen av saltene på oppløseligheten av insulin (IU/ml) ved romtemperatur fremgår av tabell I.

Tabell I viser at oppløseligheten av insulin i en omtrentlig isoton oppløsning av magnesiumklorid er overraskende mye høyere enn oppløselighetene i tilsvarende oppløsninger av natriumklorid, kaliumklorid og ammoniumklorid, alle ved pH 4 - 6, og nærmer seg 100 IU/ml, en vanlig anvendt konsentrasjon i insulinpreparater for injeksjon.

Oppløseligheten av insulin (IU/ml) ved romtemperatur, ved pH 5,5 og ved forskjellige konsentrasjoner av saltene ble bestemt og er vist i tabell II nedenfor.

Tabell II viser en forbedret oppløselighet i magnesium-kloridoppløsninger sammenlignet med natriumklorid-, kaliumklorid- og ammoniumkloridoppløsninger over et bredt område av saltkonsentrasjoner.

Eksempel 2

En oppløsning, betegnet 1, med den følgende sammensetning ble fremstilt: 0,15 M magnesiumbutyrat, 0,006 M sitronsyre, 2 g/liter av fenol og 100 IU/ml av sinkfritt, humant monokomponent-insulin; pH: 5,8.

En oppløsning, betegnet 0, fremstilt som et standard hurtigvirkende insulinpreparat, "Actrapid"HM, med følgende sammensetning, ble anvendt som sammenligning: 16 g glycerol/liter, 2 g fenol/liter og 100 IU/ml av humant monokomponent-insulin (2 sinkioner/heksamer); pH: 7,4. Dette medium er i overensstemmelse med de krav som er angitt i United States Pharmacopeia XIX for Neutral Insulin Injection.

Humant mono-125I-(A19)-insulin ble tilsatt i spor-konsentrasjoner (0,3 - 1 juCi/ml) til begge oppløsninger. Derefter ble 0,1 ml av hver oppløsning inj isert separat subkutant i to griser. Absorpsjonen ble fulgt ved ekstern overvåkning av radioaktiviteten som holdt seg på injeksjonsstedet, ved hjelp av en scintillasjons-krystalldetektor, koblet til et spektrometer, analogt med en metode som er utviklet for absorpsjonsundersøkelser i mennesker (Binder

(1969): "Absorption of injected insulin". Avhandling). Blodprøver ble tatt for bestemmelse av plasmaglukose og plasmainsulin. Resultatene er vist i tabell III nedenfor.

Tabell III viser tidsforløpene med gjenværende radioaktivitet, plasmaglukose og plasma IRI (immunoreaktivt insulin, bestemt ved radioimmunomåling). Mengdene av radioaktivitet ved injeksjonsstedet er gitt i prosent av den mengde som ble målt umiddelbart efter injeksjon (tid = 0). Plasmaglukose-konsentrasjoner er gitt i prosent av verdien for blod-prøven tatt umiddelbart før injeksjon (tid = 0).

Oppløsning 0: Sammenligningsoppløsning gitt til en gris (vekt: 77 kg).

Oppløsning 1: Prøveoppløsning gitt til en annen gris (vekt: 79 kg).

Som det vil fremgå av tabell III, absorberes prøveinsulin-preparatet raskere enn sammenligningsinsulin-preparatet. Dette er helt i overensstemmelse med forholdet mellom henholdsvis forløpet plasmaglukose for oppløsningene 0 og 1, og mellom forløpene av plasma IRI for oppløsningene 0 og 1, med tiden.

Eksempel 3

En oppløsning betegnet 2 med følgende sammensetning ble fremstilt: 0,175 M magnesiumacetat, 0,0375 M eddiksyre, 2 g/liter av fenol, 100 IU/ml av sinkfritt humant monokomponent-insulin; pH 5,5.

Spor-insulin ble tilsatt som i eksempel 2. 0,1 ml av oppløsning 2 ble injisert subkutant i en gris på den ene side av halsen, mens 0,1 ml av sammenligningsinsulin-oppløsningen, 0, (fremstilt som beskrevet i eksempel 2) ble inj isert subkutant i den samme gris på den annen side av halsen.

Absorpsjonen ble fulgt som i eksempel 2. En uke efter ble forsøket gjentatt med ombytting av injeksjonsstedene. Resultatene er vist i tabell IV.

Det fremgår av denne tabell at forsøksinsulin-preparatet absorberes raskere enn.sammenligningsinsulin-i

preparatet.

Eksempel 4

To oppløsninger betegnet 3A og 3B med følgende sammensetninger ble fremstilt: 3A: 0,14 M MgSOA, 0,05 M MgCl2, 2 g/liter av fenol, 100 IU/ml av sinkfritt, humant monokomponent-insul in; pH regulert til 5,5 med HCl. 3_B: Som 3A, med en tilsetning av 1 mg protaminsulfat/ml.

Spor-insulin ble tilsatt som i eksempel 2. 0,1 ml av oppløsning 3A ble injisert subkutant i Gris I og Gris II på den ene side av halsen. 0,1 ml av oppløsning 3B ble injiset på tilsvarende måte i Gris III og Gris IV. 0,1 ml av en sammenligningsinsulin-oppløsning, 0, (fremstilt som beskrevet i ek sempel 2) ble injisert subkutant i hver av de fire griser på den annen side av halsen. Absorpsjonen ble fulgt som i eksempel 2. Resultatene er vist i tabell V.

Det fremgår av denne tabell at insulinet i forsøks-preparatet absorberes raskere enn insulinet i sammenligningspreparatet i fravær av protamin, men langsommere enn insulinet i sammenligningspreparatet i nærvær av protamin.

Eksempel 5

Tre oppløsninger betegnet 4A,,4B og 4C med følgende sammensetninger ble fremstilt: 4A: 0,18 M magnesiumsuksinat, 0,01 M MgCl2, 0,002 M MnSO^, 0,02 M ravsyre, 2 g/liter av fenol, 100 IU/ml av sinkfritt, humant monokomponent-insulin; pH 5,6. 4B: Som 4A men med en tilsetning av 0,55 mg protaminsulfat/ml. 4C: Som 4A, men med tilsetning av 0,73 mg protaminsulfat/ml.

Spor-insulin ble tilsatt som i eksempel 2. 0,1 ml av oppløsningene 4A, 4B og 4C ble injisert subkutant i henholdsvis Griser A, B og C, på en side av halsen. 0,1 ml av en sammenligningsinsulin-oppløsning, 0, (fremstilt som beskrevet i eksempel 2) ble injisert subkutant i hver av de tre griser på den annen side av halsen. Absorpsjonen ble fulgt som i eksempel 2. En uke senere ble forsøket gjentatt med ombytning av injeksjonsstedene,. Resultatene er vist i tabell VI.

i

Tabell VI

Data fra eksempel 5. Forløpet av gjenværende radioaktivitet med tiden. Middelverdier fra to forsøk. 4A: uten protamin.

4B: med protamin, lavt innhold. AC: med protamin, høyt innhold.

Det fremgår av denne tabell at i forhold til insulinet i sammenligningspreparatet absorberes insulinet fra forsøks-preparatet raskere i fravær av protamin, langsommere med det lave innhold av protamin og enda langsommere med det høye innhold av protamin.

I eksemplene 6 til 8, 10 og 11 ble absorpsjonsegenskapene for forsøkspreparatene undersøkt sammenlignet med en human "Actrapid" sammenligningsoppløsning, som i eksemplene 2-5.

I eksempel 9 ble en annen sammenligningsoppløsning anvendt, se nedenfor. For enkelhetsskyld er imidlertid resultatet av sammenligningen gitt som et gjennomsnittsforhold:

hvor T50Z (test) og T50Z (ref) er tiden som når fra injeksjons-tidspunktet inntil radioaktiviteten målt ved injeksjonsstedet har avtatt til halvparten av den opprinnelige verdi for henholdsvis forsøkspreparatet og sammenligningspreparatet. Antall undersøkte dyr er betegnet N.

Eksempel 6

Prøveoppløsning: 0,14 M MgS04, 0,05 M MgCl2, 0,01 M magnesiumacetat, 0,002 M CaCl2, 2 g m-kresol/1, 100 IU/ml sinkfritt, humant monokomponent-insulin pluss menneske-spor-insulin; pH-verdi regulert til 5,7 med saltsyre.

0,04 ml av hver av forsøksoppløsningene og sammen-ligningsoppløsningene ble injisert i hver gris.

R-verdien ble funnet å være 0,7 3 (N = 6).

Eksempel 7

Forsøksoppløsning: 0,02 M MgCl2, 0,11 M arginin monohydroklorid, 2 g fenol/1, 100 IU/ml sinkfritt, humant monokomponent-insulin pluss spor-insulin; pH-verdi regulert til 7,7 med NaOH.

0,08 ml av hver av forsøksoppløsningene og sammenligningsoppløsningene blir injisert i hver gris.

R-verdien ble funnet å være 0,74 (N = 2).

Eksempel 8

Forsøksoppløsning: 0,095 M MgCl2, 2 g fenol/1, 100 IU ekvivalenter/ml sinkfritt grise-mdnodesamidoinsulin pluss spor-derivat; pH-verdi regulert til 3,2 med saltsyre.

0,08 ml av hver av forsøksoppløsningene og sammenligningsoppløsningene blir injisert i hver gris.

R-verdien ble funnet å være 0,71 (N = 2).

i

Eksempel 9

Forsøksoppløsning: 0,095 M MgCl2, 2 g fenol/1, 100 IU ekvivalenter/ml sinkfritt, humant1, insulinderivat med Ser(B9) erstattet med Asp og Thr(B27) erstattet med Glu, pluss spor-derivat; pH-verdi regulert til 7,4.

Eftersom derivatet tilberedt, som "Actrapid" var kjent på forhånd for å bli absorbert raskere enn menneske "Actrapid"

(se europeisk patentansøkning 83306721), var sammenlignings-oppløsningen i dette eksempel derivatet tilberedt som "Actrapid" og med 100 IU ekvivalenter/ml derivat.

0,08 ml av hver av forsøksoppløsningene og sammenligningsoppløsningene ble injisert i hver gris.

R-verdien ble funnet å være 0,85 (N = 5).

Også med dette raskere absorberbare insulinderivat oppnås således en forbedret virkning på absorpsjonen vedhjelp av magnesiumioner.

Eksempel 10

Forsøksoppløsning 1: 0,095 M MgCl2, 0,002 M sinkacetat,

1 mg protaminsulfat/ml, 3 g m-kresol/ml, 100 IU ekvivalenter/- ml sinkfritt grise-monodesamidoinsulin pluss spor-derivat; pH-verdi regulert til 3,2 med saltsyre.

Forsøksoppløsning 2: som 1, bortsett fra at 0,095 M MgCl2 ble erstattet med 0,14 M NaCl.

0,05 ml av forsøksoppløsningen (enten 1 eller 2) og av sammenligningsoppløsningen (menneske-"Actrapid" pluss menneske-spor-insulin) ble injisert i hver gris.

R-verdiene ble funnet å være 3,7 (N = 2) og 2,9 (N = 2) for henholdsvis forsøksoppløsningene 1 og 2.

Resultatene viser den varighetsøkende virkning av magnesiumioner, i tillegg til den av sinkioner, for protamin-holdige monodesamidoinsulin-oppløsninger.

Eksempel 11

En farmakokinetisk undersøkelse ble foretatt i friske frivillige personer. Forsøksoppløsning: 0,14 M MgSOA, 0,05 M MgCl2, 0,01 M magnesiumacetat, 2 g m-kresol/1, 100 IU/ml sinkfritt, humant monokomponent-insulin; pH-verdi regulert til 5,7 med saltsyre. Sammenligningsoppløsning ("Actrapid" HM): 16 g glycerol/1, 3 g m-kresol/1, 100 IU/ml humant monokomponent-insulin (3 sinkioner/heksamer); pH: 7,4.

Humant-<125>I-insulin ble tilsatt i spor-konsentrasjoner på 5 og 3 /iCi/ml til henholdsvis forsøksoppløsning og sammen-ligningsoppløsning. 4 IU av forsøksoppløsningen ble injisert subkutant i det ene lår og 4 IU av sammenligningsoppløsningen i det annet lår hos hver person. Bruk av de to preparater i enten høyre eller venstre lår var vilkårlig. Absorpsjonen ble fulgt ved kontinuerlig utvendig overvåkning av den radioaktivitet som var tilbake ved injeksjonsstedet på hvert lår.

R-verdien ble funnet å være 0,78 (N = 15). I fravær av retarderende stoffer vil en forsterkende virkning på absorpsjonen av insulin også oppnås ved hjelp av magnesiumioner hos mennesker.

Claims (9)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av vandige insulin-preparater for parenteral administrering inneholdende minst 20 insulinenheter pr. mol, karakterisert ved at vann blandes med insulin eller et derivat derav og magnesiumioner, for å oppnå en oppløsning med en magnesiumkonsentrasjon i området fra 0,005 til 0,5 M, hvis nødvendig, reguleres pH-verdien innen området fra 3 til 8,5, fortrinnsvis under 8, og eventuelt tilsettes sink og/eller protamin, og eventuelt anvendes et langvarig virkende bunnfall av insulin eller et derivat derav.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at magnesium anvendes i en mengde slik at det oppnås en magnesiumkonsentrasjon over 0,01 M.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at preparatet fremstilles med en pH-verdi i området fra 4 til 6,2 og fortrinnsvis med en magnesiumkonsentrasjon over 0,05 M.

4. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at magnesium anvendes i en mengde slik at det oppnås en magnesiumkonsentrasjon over 0,05 M, særlig i området fra 0,08 M til 0,3 M.

5. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at det anvendes insulin i en mengde under 500 insulinenheter pr. ml, fortrinnsvis fra 3 0 til 200 insulinenheter pr. ml, særlig foretrukket fra 40 til 100 insulinenheter pr. ml.

6. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at pH-verdien reguleres til en verdi i området fra 5 til 6.

7. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det tilsettes mindre enn 1 sinkion pr. heksamer insulin eller insulinderivat, fortrinnsvis mindre enn 0,5 sinkioner pr. heksamer insulin eller insulinderivat, særlig foretrukket mindre enn 0,1 sinkioner pr. heksamer insulin eller insulinderivat.

8. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved' at produktet fremstilles som hurtigvirkende, dvs. med en pH rundt 7.

9. Fremgangsmåte ifølge et av de foregående krav, karakterisert ved at det anvendes protamin i en mengde på mer enn 5 % (vekt/vekt), fortrinnsvis mer enn 10 %, basert på innholdet av insulin eller insulinderivat, og fortrinnsvis mindre enn 50 % protamin, særlig foretrukket mindre enn 4 0 % protamin, med det forbehold at pH-verdien holdes under 6,2.