NO166728B - Anordning og fremgangsmaate for hurtig diagnose av dental karies. - Google Patents

Description

For bestemmelse av et angrep av dental sykdom eller kariesgrad ved tannklinikker eller under tannpleie er det beskrevet flere metoder for å bestemme aktivitet og antall av bakterier eller mikroorganismer slik som f.eks. Streptococcus mutans (heretter beskrevet som S. mutans) og Lactobacillus i spytt eller på dental plaque. Det er tidligere beskrevet en hurtig metode for diagnose som er basert på den .kjensgjerning at mikroorganismer forårsaker fargeforandring i et spesifikt reagens (japansk patentskrift nr.539011 hvori testene er utført på vanlige mikroorganismer). Denne metode omfatter tilsats av en gitt mengde (a) resazurin, (b) et neotetrazoliumklorid eller (c) trifenyltetrazoliumklorid til en dyrkningsvæske (næringskilde for vekst av mikroorganismer) ; nedsenking av prøvepapiret i væske; tørking av prøvepapiret; oppdeling av prøvepapiret. til små-prøvebiter; drypping av en gitt mengde med en bakteriesuspensjon som skal testes på prøvebiten; dyrking av denne ved 37°C i et gitt tidsrom; og bedømmelse av bakterieaktiviteten i bakteriesus-pens jonen ved hjelp av en fargetoneforandring.

Det er også beskrevet forskjellige metoder for bestemmelse av kariesaktivitet. En nylig rapport fra Tsutomu Shimono et al.

("The Japanese Journal of Pedodontics" 18, (3), 606-611 (1980)) kan oppsummeres som følger: dental plaque suspenderes i fysiologisk saltvann. Et gitt volum (0,1 ml) av suspen-sjonen anvendes som ren prøve. Separat fremstilles en løsning som har pH = 7,2 og som inneholder 10% sucrose, 0,006% brom-thymolblått (B.T.B.) og 0,05% natriumazid (Na^N). Prøven inokuleres i løsningen og blandingen får stå ved 37°C i 30

min. Løsningens fargetone forandres fra gulgrønn (negativ)

til lys gulgrønn (falsk positiv) og så til gul (positiv). Det er beskrevet at sammenlignet med resultater fra konvensjonelle dyrkningstester utført samtidig'med den ovenfor beskrevne Shimonos test ble det oppnådd en god korrelasjon med graden

av dental karies hos barn. Masakazu Nakamura et aL beskriver i 'Journal of Dental Health" 30 (4) utgitt i desember 1980

en diagnosemetode og resultater derav ved undersøkelse av barnehageelever. Det ble anvendt resazurin, methylrødt, alizarinrød S, lacmoid, bromcresolgrønt eller bromfenolblått som en fargeindikator. En gitt mengde av en suspensjon

med dental plaque i fysiologisk saltvann ble tilsatt til en dyrkingsvæske som besto av en 0,003% av fargeindikatoren sammen med 10% su.Crose og 0,05% Nå-^N. Etter at kulturen var dyrket ved 37°C i 30 min ble den tannnedbrytende aktivitet bedømt etter en fargetoneforandring i dyrkingsvæsken. Resultatene viste en meget god korrelasjon med graden av dental karies hos barnehageelever. Det ble ennvidere angitt at den mest klare fargeforandring ble iakttatt ved anvendelse av resazurin. I flere rapporter er det beskrevet at resazurin således er en effektiv indikator for bestemmelsen av tannråteaktivitet. Disse metoder er enkle å utføre. De er imidlertid alle våtmetoder hvor spytt eller dental plaque tilsettes til en liten mengde med en fargeutviklende væske som inneholder resazurin eller en pH-indikator, væsken oppvarmes til 37°C og en fargeforandring undersøkes etter 30 min. Disse metoder har i virkelighet ikke blitt anvendt klinisk. Den mest vanlige konvensjonelle teknikk for under-søkelse av tannråteaktivitet innbefatter blanding av 0,1 - 0,2 spytt eller blanding av dental plaque med omtrent 3 ml av et dyrkingsmedium hvoretter denne dyrkes i en inkubator ved 37°C i 24 til 72 timer. Dette er en våtmetode (som bl.a., anvendes over store deler av Japan).

Foreliggende oppfinnelse angår en anordning og en fremgangsmåte for hurtig diagnose av dental karies i et

ikke-vått system, hvilken anordning omfatter en prøvebit bestående av en inert bærer som inneholder et farveindikator-reagensmateriale for bestemmelse av mengden av kariesfrem-kallende mikroorganismer i spytt, hvilket farveindikator-reagensmateriale er resazurin, trifenyltetrazoliumklorid eller methylorange eller et salt derav, hvorved prøvebiten er fremstilt ved å nedsenke den inerte bærer i en løsning inneholdende 0,05-0,003 vekt% av farveindikator-reagens-materialet og 10 vekt% sukrose, etterfulgt av fjerning av de flytende bestanddeler.

Oppfinnelsen er kjennetegnet ved at anordningen ytter-ligere omfatter et bunnpapir for understøttelse av prøve-biten; en dekkfolie for å dekke og feste prøvebiten til bunnpapiret, hvilken folie har et klebende belegg belagt over den indre overflate derav,eller bare langs periferien av den indre overflate derav, slik at prøvebiten kan holdes adskilt fra klebemidlet, og hvilken folie kan fjernes fra bunnpapiret, og en støttende folie anbragt slik at den kan fjernes fra det samme bunnpapir og anbragt ved siden av prøvebiten som er dekket av dekkfolien, idet den støttende folie anvendes for å støtte prøvebiten og dekkfolien etter at prøvebiten er impregnert med spytt, og for å anbringe anordningen på menneskehud. Fig.1 viser en plantegning av den diagnostiske anordning ifølge oppfinnelsen sett ovenfra, og Fig. 2 og 3 viser den samme anordning sett fra siden og under bruk.

på fig. l, som viser en utførelsesform av den diagnostiske anordning, angir tallet 1 en liten rund papirbit med en diameter på 5 til 10 mm eller en firkantet papirbit som har sider på minst 4 mm, hvilken papirbit er blitt impregnert med reagensoppløsningen. Den lille papirbit er fremstilt av vanlig filterpapir som har en tykkelse på fortrinnsvis opp til 0,8 mm. Papirbiten er beskyttet med en dekkende folie 2. Et klebemiddel er tidligere blitt påført periferien 2A av den indre overflate av den dekkende folie 2. En støttende folie 3 er anbragt ved siden av denne og klebet på bunn<p>apiret 4 slik at folien kan tas av. For utførelse av testen er det i mange tilfeller fordelaktig å påføre klebemidlet på hele den dekkende folies indre overflate, slik at én overflate av den lille prøvebit er fast festet til den indre overflate av den dekkende folie. Ved å anbringe anordningen på den ovenfor nevnte måte er den lille prøvebit 1 fullstendig skjermet fra åpen luft

eller luftsirkulasjon og bevart i steril tilstand før bruk. Den støttende folie 3 er en rund folie som har en diameter

på 5 til 10 cm eller en firkantet eller rektangulær folie med omtrent det samme areal. For anvendelse som folie 2

kan det antydes en rund folie som har en diameter på 3 til 5 cm eller en firkantet folie som har omtrent det samme areal. Bunnpapiretsstørrelse er slik at begge foliene 2 og 3 kan plasseres ved siden av hverandre på denne. Disse folier kan være tilvirket av gjennomsiktige organiske harpikser eller transparente plaster.

Reagensløsningen som skal anvendes for, impregnering av den lille papirbit 1 er en vandig oppløsning av et reagens-materiale omfattende 10 vekt% sucrose ogc0,05 - 0/003 vekt%

av henholdsvis resazurin, trifenyltetr,a§cj>lium, neotetrazolium, 2,6-diklorfenolindofenol, methylorange eller salter derav (fortrinnsvis 0,003 vekt% av resazurin). Resazurin anvendes

i dette tilfelle som en fargeindikator. Som beskrevet ovenfor kan tannråteaktiviteten av for eksempel S.mutans bestemmes omgående, om enn indirekte, ved hjelp av forandring av indikatorens fargetone. Spytt og dental plaque inneholder store mengder S.mutans og melkesyrebakterier som be-traktes som de vesentligste årsaker til tannråte. Særlig enzymer fra S.mutans fører til sucrosekondensasjon som danner glucan (dextrin) i dyrkningsvæsken. Sukkeret dekompo-neres enzymatisk og gir lactose (melkesukker). Resazurins fargeforandring forårsakes av akutt enzymatisk reaksjon, forandring i oxydasjonsreduksjonspotensiatet og flytbarhetsned-settelse. Fargeforandringen er for eksempel som følger:

purpur-=r blårød -> rød.

Resazurins fargeforandring som følge av pH-forandring ved fargereaksjon er blitt studert. pH på den sucroseholdige oppløsning senkes ikke til under 6. Fargetoneforandring for-årsaket av S.mutans og spytt fra blåfiolett til rødt skyldes en fargeforandring av resazurin i oxydasjonsreduksjonssystemet. Mekanismen ved dette fenomen kan forklares på følgende måte:

resazurin har maksimal absorpsjon ved en bølgelengde (Xmaks) på 603 nm i absorpsjonsspektret for synlig lys (fluorescerende bølgelengde i fluorescerende spektrum (Xem): 630). Resazurin omdannes til resorufin (som har maksimal absorpsjon ved en bølgelengde på 573 nm; rød) med følgende kjemiske struktur: ved vekst av mikroorganismer eller i nærvær av et reduserende middel.

Det fremgår at forandringen av fargetone av resazurin-indikatoren med S.mutans i spyttet i dyrkningsmediet ikke forårsakes av pH-forandring,men på grunn av en oxydasjons/ reduksjonsreaksjon fordi de ovenfor angitte Amaks- og Aem-verdier er ulike de verdier som måles ved fargetoneforartdring som skyldes forandring i pH. Fargetoneforandringen kan gjøres klarere ved å tilsette et dispergerende middel slik som poly-vinylalkohol. Som vist i de etterfølgende eksempler kan man påvise en sammenheng mellom fargetoneforandringen og tannråteaktiviteten. Tannråteaktiviteten kan derfor bestemmes på grunnlag av fargetoneforandringen. Hvis en anordning fremstilles som ovenfor angitt med unntagelse av at man som indikator anvender trifenyltetrazoliumklorid, forandres fargetonen fra rød til fargeløs. Denne fargeforandring av negativ tannråteaktivitet til positiv tannråteaktivitet. Når det anvendes methylorange som indikator vil fargetonen forandres fra gulaktig grønn til rødaktig gul. Denne fargeforandring indikerer en forandring fra negativ tannråteaktivitet til positiv tannråteaktivitet. Blant disse indikatorer utviser resazurin den klareste forandring av fargetone. I dette tilfellet forandres fargen trinnvis. Denne forandring kan observeres lett med det blotte øye. Derfor anvendes resazurin som hovedindikator ved anordningen ifølge foreliggende oppfinnelse.

Klebemiddel som påføres filmen 2 utgjøres i det vesent-lige av en syntetisk gummi. Klebemidlet bør være lett å

fjerne fra den støttende folie 3 og bunnpapiret 4 ved omgiv-ende temperatur og være istand til igjen å klebe til materialet av en oppvarmer, dvs. materialet av den oppvarmer som anvendes ved dyrkingen, som f.eks. metall, tre eller plast, sammen med den lille papirbit. Nærmere bestemt bør den lille papirbit som er impregnert med spytt eller dental plaque dyrkes ved 37°C i 10 - 15 min mens man hindrer luftilgang og fordampning av vann fra spyttet. Anordningen ifølge oppfinnelsen er en lett, liten anordning som kan oppvarmes ved å anbringe den sammen med folien på overflaten av menneskehud istedet for på en oppvarmer. Av denne årsak er det ønskelig å velge et klebemiddel som er uskadelig for huden. Hvis den støttende folie ikke anbringes på overflaten av oppvarmeren eller på huden, men plasseres i en oppvarmer, kan den støttende folie 3 anvendes uten klebemiddel.

Ved anvendelse av den diagnostiske anordning ifølge oppfinnelsen tas en meget liten mengde av spytt, vanligvis en dråpe, ved hjelp av en dråpepipette eller lignende, folien 2 tas halvveis vekk fra bunnpapiret i anordningen, spyttet i pi-petten dryppes på den lille papirbit 1, spyttet får spre seg tilstrekkelig jevnt, hvoretter folien 2 som dekker den lille papirbiten anbringes på den støttende folie 3 sammen med papirbiten 1. På fig. 2 vises et tilfelle hvor klebemidlet bare er påført på periferien av den indre overflate av folien 2. Den støttende folie 3 som støtter papirbiten 1 og den dekkende folie 2 fjernes fra bunnpapiret 4 sammen med bit 1 og film 2. Deretter anbringes de på overflaten av en oppvarmer eller .en avdekket del av et menneskelegeme som en erstatning for en oppvarmer, og etter 15 minutter undersøker man om det har skjedd en forandring i fargetone på den lille papirbit. Tannråte aktiviteten bedømmes som negativ, svakt positiv eller positiv ifølge fargetoneforandringen (blå-—► purpuraktig rød >rød). Et karakteristisk trekk ved anordningen ifølge oppfinnelsen

er at menneskelegemet kan anvendes i stedet for en oppvarmer for å opprettholde dyrkningstemperaturen ved 37°C.

I det tilfelle at klebemidlet er påført på hele den indre overflate av den dekkende folie 2, avdekkes baksiden av den lille papirbit 1 når folien 2 tas halvveis av, fordi overflaten av papirbiten 1 er fastklebet til folien 2. Følge-lig påføres spyttet på den avdekkede bakside. Etter impregnering med spyttet tas den lille papirbit 1 vekk fra bunnpapiret 4 sammen med folien 2 og anbringes på støttefolien 3 for å oppnå en oppstilling som den vist i fig. 3. De (sammen med støttefolien 3) rives av fra bunnpapiret 4 og anbringes på overflaten eller en avdekket del av et menneskelegeme. Hvis de ikke plasseres i en oppvarmer, er det mulig å anbringe disse, inklusive bunnpapiret 4 i oppvarmeren uten å fjerne støttefolien 3 fra bunnpapiret 4.

Ved å anvende anordningen ifølge oppfinnelsen for diag-nosering av dental karies er det mulig å bestemme tannråteaktiviteten hurtig og enkelt, ikke bare for behandling av pasienter, men også for å forhindre og forebygge tannråte hos barn. Anordningen er videre billig å produsere og distribuere.

De etterfølgende eksempler illustrerer oppfinnelsen.

Eksempel

En bit filterpapir med en diameter på 8 mm ble senket ned i en vandig løsning inneholdende 0,025 vekt% resazurin og 10 vekt% sucrose og ble deretter tørket under dannelse av en liten papirbit 1 (skive) for anvendelse ved diagnosen. Papirbiten 1 ble dekket med en gjennomsiktig dekkende plast-folie 2 med en diameter på 4 cm og med et klebende lag på

hele den indre overflate. Disse ble anbragt på et rektangu-lært bunnpapir 4 med størrelse 5 x 10 cm ved siden av en kvadratisk gjennomsiktig plaststøttefolie 3 med størrelse 4,5x4,5 cm (som har et klebende lag på baksiden). Det resul-terende produkt ble plassert i en gjennomsiktig liten plast-pose og varmeforseglet under dannelse av et sluttprodukt for engangsbruk.

Tester;

Spytt fra hvert individ ble anbragt i en miniatyrkopp. En dråpe (omtrent 0,05 ml) spytt ble tatt ut ved hjelp av en dråpepipette av plast og påført på den blå skive (lille papirbit) 1 som var avdekket ved å fjerne folien 2 eller tatt ut fra anordningen ifølge oppfinnelsen. Etter henstand for å bevirke en tilstrekkelig impregnering ble de anbragt på støttefolien 3. De ble fjernet fra bunnpapiret 4 og anbragt på en av personens armer. Etter 15 minutter ble skiven l's fargetone undersøkt. Resultatene eir vist i tabell 1 i sammenligning med ST mediametode og mitis salivalius-bacitracinnæringsvæskemetoden (BSBB).

De ovenfor angitte forsøksresultater viser klart en positiv sammenheng mellom de voksne forsøkspersoners grad av dental karies og resultatene av diagnosen ifølge farge-tonef orandringen av anordningen.

Det er innlysende at anordningen er effektiv til anvendelse for en hurtig diagnose av tannråteaktivitet etter en ikke våt- men tørrmetode.

Claims (4)

1.Anordning for hurtig diagnose av dental karies i et ikke-vått system, hvilken anordning omfatter en prøvebit bestående av en inert bærer som inneholder et farveindikator-reagensmateriale for bestemmelse av mengden av kariesfrem-kallende mikroorganismer i spytt, hvilket farveindikator-reagensmateriale er resazurin, trifenyltetrazoliumklorid eller methylorange eller et salt derav, hvorved prøvebiten er fremstilt ved å nedsenke den inerte bærer i en løsning inneholdende 0,05-0,003 vekt% av farveindikator-reagens-materialet og 10 vekt% sukrose, etterfulgt av fjerning av de flytende bestanddeler, karakterisert vedat anordningen ytter-ligere omfatter et bunnpapir for understøttelse av prøve-biten; en dekkfolie for å dekke og feste prøvebiten til bunnpapiret, hvilken folie har et klebende belegg belagt over den indre overflate derav,eller bare langs periferien av den indre overflate derav< slik at prøvebiten kan holdes adskilt fra klebemidlet, og hvilken folie kan fjernes fra bunnpapiret, og en støttende folie anbragt slik at den kan fjernes fra det samme bunnpapir og anbragt ved siden av prøvebiten som er dekket av dekkfolien, idet den støttende folie anvendes for å støtte prøvebiten og dekkfolien etter at prøvebiten er impregnert med spytt, og for å anbringe anordningen på menneskehud.

2. Anordning ifølge krav 1,karakterisert vedat prøvebiten er en liten papirbit.

3. Anordning ifølge krav 1,karakterisert vedat folien er fremstilt av en gjennomskinnelig organisk harpiks eller et gjennomskinnelig plastmateriale.

4. Fremgangsmåte for hurtig diagnose av dental karies ved anvendelse av anordningen ifølge krav 1,karakterisert vedat prøvebiten i anordningen impregneres med ca. 0,05 ml spytt, den impregnerte prøvebit inkuberes i 15-30 minutter ved en temperatur på 20-37 °C uten tilførsel av luft mens fordamping av vann fra spyttet forhindres, hvoretter en forandring i farvetone av prøvebiten undersøkes.