NO162612B - Fremgangsmaate til fremstilling av en fettsyre markert medradioaktivt jod i omega-stillingen. - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til å fremstille

på stedet en injiserbar fettsyre som i U)-stillingen er markert med radioaktivt jod.

Nærmere bestemt befatter den seg med fremstilling av fettsyrer som er markert med jod 123 eller med jod 131, og som kan benyttes som radiofarmasøytiske produkter for studium av stoffskifteforstyrrelser av hjertet hos mennesker ved scintigrafi (sporundersøkelser).

Det er kjent at langkjedede fettsyrer utgjør en av de viktigste energikilder for hjertemuskelen, og at stoffskiftet hos fettsyrer som i posisjon w er markert med radioaktive isotoper av jod: 123 I og <131>I, har vist seg å ligge meget nær det hos naturlige fettsyrer. Videre gjør et studium av oppfangningen av disse i hjertemuskelen det mulig å få opp-lysning om cellefunksjonen, og de nevnte markerte fettsyrer er derfor av stor interesse innen nukleær medisin, så meget mer som de ellers tilfredsstiller de krav som må oppfylles ved en anvendelse som radiofarmasøytiske produkter. Således influerer markeringen ikke på molekylets biologiske egenskaper. Valget av radioaktivt jod 123 som markeringssubstans tilfredsstiller biologiske og tekniske hensyn som kort tids-rom på 6-20 h og yemisjon med en energi av størrelsesorden 100-200 keV. Og videre er de jodmarkerte derivater av fettsyrer lite toksiske, og graden av oppfangning er høy.

Imidlertid reiser deres anvendelse innen sykehustjenesten visse problemer, da det for tiden er umulig i nukleær-medi-sinske laboratorier å realisere fremstillingen av det markerte produkt på tidspunktet for dets bruk.

For å oppnå fettsyrer markert med radioaktivt jod har man hittil benyttet Robinson-metoden, som består i å utveksle bromet hos en bromert fettsyre som skal markeres, med radioaktivt jod (jfr. Int. J. Appl. Radiat. Isot. Bind 28, s. 149, 1977). I alminnelighet gjennomfører man utbytningsreaksjonen på bromert fettsyre i oppløsning i butanol som har fått tilsatt en oppløsning av radioaktive jodider (Na<+>, <1>23I~) i samme oppløsningsmiddel. Utbytningen skjer ved at oppløs-ningen tilbakeløpskokes i 90 min eller mer. Et innledende studium har vist at denne metode fører til vanskelig reprodu-serbare markeringsutbytter, ofte under 80%. Denne teknikk, hvor man gjør bruk av en rekke langvarige og relativt kompliserte operasjoner, krever i betraktning, av det lave utveks-lingsutbytte en rensning før det radiofarmasøytiske produkt injiseres.

For å gjennomføre denne fase med rensning av markert syre benytter man i alminnelighet HPLC-kromatografi, dvs. en teknikk som ikke kan benyttes rutinemessig i et nukleær-medisinsk laboratorium hvor. man ikke disponerer spesialisert personale. Det er derfor umulig å lage den markerte fettsyre innen rammen av sykehustjenesten.

Den foreliggende oppfinnelse tar nettopp sikte på en fremgangsmåte til fremstilling av en fettsyre markert med radioaktivt jod, hvormed man får et høyt markeringsutbytte og det derfor blir mulig å unngå ulempen ved de tidligere metoder. Således er det i betraktning av det høye markeringsutbytte ikke lenger nødvendig å gjøre bruk av et meget kinkig rense-trinn for å isolere det radiofarmasøytiske produkt før bruk. Dermed blir det mulig å utføre fremstillingen av den markerte fettsyre i det "varme" laboratorium i en nukleær-medisinsk avdeling uten spesialisert personale.

Fremgangsmåte i henhold til oppfinnelsen er kjennetegnet ved at man lar en i omegastilling bromert eller jodert fettsyre reagere med radioaktivt alkalimetalljodid i tørr tilstand eller med en vandig oppløsning av dette, i nærvær av en ytterligere og vesentlig større mengde ikke-radioaktivt alkalimetalljodid for å bytte ut denne fettsyres brom eller jod med radioaktivt jod. Fremgangsmåtens ytterligere trekk fremgår av de uselvsten-dige krav.

Generelt gjennomfører man denne utbytningsreaksjon ved

i omtrent 10.min å varme.opp til en temperatur av omtrent 102-105|OC, en oppløsning av bromert eller jodert fettsyre i et med vann blandbart keton inneholdende det ytterligere al-kalimetall jodid, som f.eks. utgjøres av et i et keton oppløse-lig alkalimetalljodid, f.eks. natriumjodid, etter å ha tilsatt denne oppløsning radioaktivt alkalimetalljodid i tørr tilstand eller en vandig oppløsning av radioaktivt jodid. Dette arbeide utføres i en forseglet flakong, f.eks. antibiotikumflakong

lukket med en gummimembran.

Det radioaktive alkalimetalljodid i tørr tilstand resp. den vandige oppløsning av radioaktivt alkalimetalljodid har fortrinnsvis en pH-verdi på omtrent 7. Når man benytter en vandig oppløsning av radioaktivt jodid, har denne oppløsning fortrinnsvis en volumetrisk aktivitet på minst 20 millicurie pr. ml.

Når man benytter radioaktivt alkalimetalljodid i tørr tilstand, har dette fortrinnsvis en slik aktivitet at forholdet mellom dets aktivitet i millicurie og vekten i mg av bromert eller jodert fettsyre høyst er 0,6.

Som eksempel på ketoner egnet til å benyttes kan nevnes aceton eller metyletylketon.

Denne fremgangsmåte slik den er angitt ovenfor, gjør

det mulig å senke konsentrasjonen av oksyderte former for radioaktivt jod i markeringsoppløsningen (molekylært jod og jodationer), som ved reaksjon på substratet eller oppløs-ningsmiddelet dels kan føre til dannelse av radioaktive forurensninger og dels kan senke markeringsutbyttet.

Skjønt det i utbytningsreaksjonene i alminnelighet er å foretrekke å unngå nærvær av ikke-radioaktivt jodid som deltar i utbytningsreaksjonen og derved senker markeringsutbyttet, har man således funnet at det ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen var mulig å nyttiggjøre seg tilstedeværelsen av et slikt ytterligere alkalimetalljodid for å bedre markeringsutbyttet. Imidlertid bør konsentrasjonen av ikke-radioaktive ("kalde") jodidioner være meget høy sammenholdt med konsentrasjonen av radioaktive jodidioner og neglisjerbar i forhold til konsentrasjonen av halogenert fettsyre. I alminnelighet benytter man en slik mengde av ytterligere jodid at molforholdet mellom jodert eller bromert fettsyre og ytterligere jodid utgjør 2.10 til 10 .

De ikke-radioaktive jodidioner har to vesentlige funk-sjoner: Under de forhold som foreligger ved utbytningen i ketonisk miljø og i nærvær av vann,.bevirker spor av oksydasjons-midler (molekylært oksygen) dannelsen av oksyderte former for jod (I2, 10^...) som immobiliserer en del av det radioaktive jod. Hvis derimot konsentrasjonen av radioaktive jodidioner i reaksjonsmiljøet er meget lavere enn konsentrasjonen av kalde jodidioner, blir molfraksjonen av oksydert: radioaktivt jod neglisjerbar, noe som medfører en bedring av markeringsutbyttet.

Selv om reaksjonen gjennomføres i organisk fase, gjør tilstedeværelsen av spor av vann det mulig å ta sikte på dismutasjonslikevekt: og forøvrig er jodidionene i likevekt med I-^:

Tilsetningen av ytterligere jodider forskyver likevekten i retning av 2, noe som senker konsentrasjonene..av formene IO3 og I, i oppløsningen.

Likeledes har man kunnet fastslå at man ved å arbeide med jodid i tørr tilstand ved pH 7 eller med en jodidoppløsning ved pH 7 fremfor i basisk miljø får en påtagelig bedring av markeringsutbyttet. Denne effekt som skyldes senkningen av pH-verdien, er sikkert knyttet til en forskyvning av jodets dismutasjonslikevekt i retning av 2 og som følge derav en senkning av konsentrasjonen av jodationer.

Forøvrig har man kunnet fastslå, at fremga,ngsmåten ifølge oppfinnelsen gjør det mulig å. oppnå et markeringsutbytte på minst 95% med relativt kort utbytningstid, i regelen ikke over 5-7 min.

Etter denne utbytningsreaksjon avdamper man oppløsnings-middelet, idet man fortsetter oppvarmingen etter å ha innført en luftenål i den forseglede .flakong. Derpå behandler man det oppnådde tørre produkt for å bringe det på en form som kan injiseres i det menneskelige legeme. Til formålet til-føyer man det en injiserbar tampongoppløsning som er svakt alkalisk, f.eks. med pH-verdi omtrent'9, f.eks. en tampong-oppløsning av natriumkarbohat. Man får dermed en kolloider-bar suspensjon av markert fettsyre som man løser opp i en væske forenlig med det menneskelige legeme, f.eks. en opp-løsning av menneskelig serum-albumin eller blodserumet fra pasienten.

Markeringsmetoden ifølge oppfinnelsen fører således til at man får et radiofarmasøytisk produkt som kan injiseres direkte uten.behov for kompliserte og langvarige operasjoner. Således utgjør den samlede varighet av operasjonene til markering og omdannelse av det markerte produkt til injiserbar oppløsning ikke mer enn 30 min, og disse operasjoner kan gjennomføres av ikke spesialisert personale i det "varme" laboratorium i en sykehusavdeling på tidspunktet for bruken.

I dette tilfelle har man på forhånd renset de benyttede reagenser for å gjøre dem sterile og uantennelige. For å lette operasjonene tilpasser man de forskjellige reagenser unntatt oppløsningen av radioaktivt jodid, i flakonger som hver inneholder de nødvendige mengder for fremstilling av den dose av radiofarmasøytisk produkt som skal injiseres. Flakongene blir så plassert i et magasin .for at man for hver operasjon skal ha til rådighet alle nødvendige reagenser

som har vært underkastet de ønskede kontroller, og som holder seg stabile i flere måneder.

Det blir dermed mulig å begrense omkostningene til. hver scintigrafisk undersøkelse, for. operasjonene når det gjelder kontroll og rensning, er mindre, besværlige når de utføres på et parti av produkter som har vært kondisjonert samlet, enn på hver dose av markert produkt.

Magasinene omfatter et' bærestativ med. kamre til å oppta en rekke flakonger, nemlig:

- en første flakong inneholdende en krystallisert fettsyre, - en annen flakong inneholdende et keton og et medbringende jodid, - en tredje flakong inneholdende en svakt alkalisk injiserbar tampongoppløsning, og - en fjerde flakong inneholdende menneskelig serum-albumin.

Ved en foretrukket utførelsesform for fremgangsmåten gjennomfører man utbytningsreaksjonen med utgangspunkt i det joderte derivat av fettsyren som skal markeres.

Dermed øker man.hastigheten av utbytningsreaksjonen, for jod er en bedre nukleofil gruppe, og man kan derfor få en fullstendig reaksjon etter omtrent 5 min. Videre gjør det forhold at man går ut fra et jodert derivat, det mulig å oppnå et homogent produkt og unngå å injisere bromert derivat og dermed dannelsen in vivo av bromacetat, som er giftig.

De iCO-stillingen joderte eller bromerte langkjedede fettsyrederivater kan fås ved en tosyleringsreaksjon avdO-hydroksylerte fettsyrer etterfulgt av en utbytningsreaksjon TsO ,

X~.

Når de CO-hydroksylerte fettsyrer ikke finnes i naturlig tilstand, kan man oppnå dem enten ut. fra naturlige tri-hydroksysyrer ved 8-elimineringsreaksjon eller ved kondensasjon av en omegabromert kortkjedet syre på en ekte acetylenalkohol, noe som fører til en c*>-hydroksy-acetylensyre,

som man så reduserer for å oppnå etylenderivatet eller den mettede forbindelse.

Eksempelvis kan man oppnå hydroksy-16 heksadecen-9-oin-E-rsyre ut fra oleuritinsyre som forekommer i naturlig tilstand, som beskrevet av D. E. Ames, T. G-' Goodburn,

A. W. Jevans og J. F. Mc. Ghie j. Chem. Soc. (C), 268, 1968.

Omdannelsen av trihydroksy-9, 10, 16-heksadecanqinsyre til hydroksy 16-heksadecen-9-oin-E eller-Z-syre gjennomføres ved innvirkning av fosfoniumjodid på diastereoisomere av aleuritinsyre etterfulgt.av en alkalisk hydrolyse.

Når man benytter denne metode, blir imidlertid reaksjons-utbyttene relativt små. Det er derfor å foretrekke å gjennom-føre den samlede syntese av de halogenerte fettsyrer i omegastilling ved kondensasjon av en kortkjedet omega-bromert syre på en acetylenalkohol. Denne metode byr på mange muligheter både hår det gjelder kjedelengde og umettet posisjon. Valget av omega-bromert syre og acetylenalkohol gjør det likeledes mulig å innføre flere trippel- eller dobbeltbindinger i hydrokarbonkjeden.

Fremstillingen av en jodert fettsyre i samsvar med formelen:

hvor Y betegner kjedestykkene -CH2-CH2- eller -CH=CH- og n og n' betegner hele tall fra 3 til 10, er karakterisert ved at man kondenserer en omegabromert syre med formelen: og en acetylenalkohol med formelen: i flytende ammoniakk i nærvær av litiumamid for å oppnå en hydroksy-omega-alkynoinsyre med formelen:

at hydroksy-omega-alkynoinsyren deretter underkastes en reduksjon for å gi den tilsvarende hydroksy-omega-alkenoinsyre eller hydroksy-omega-alkanoinsyre,

at denne hydroksy-omega-alkanoinsyre eller hydroksy-omega-alkenoinsyre bringes til å. reagere jrjed. paratoluensul-fonylklorid for å gi det tilsvarende tosylerte fettsyrederivat,

og at det således oppnådde tosylerte derivat underkastes en tosylat-jodutbytningsreaksjon foir å gi det til-

svarende joderte derivat.

Ved en variant av denne metode fremstiller man en jodert fettsyre med formelen:

hvor n og n<1> er hele tall fra 3 til 10, ved at hydroksy-omega-alkynoinsyren direkte underkastes tosylerings- og utbytnings-reaks jonene.

Det følgende reaksjonsskjema sammenfatter de forskjellige stadier av disse synteseprosesser:

De ekte acetylenalkoholer som benyttes som utgangsprodukter for denne syntese, kan fremstilles ved nukleofil sub-stitusjon av acetylidjonene på saltet av en brom-alkanoinsyre i flytende ammoniakk i henhold til følgende reaksjonsskjema: og ved reaksjon av den oppnådde syres karboksylgruppe ved be-handling meddiazometan etterfulgt av en reduksjon i eter i henhold til følgende skjema:

De brom-omega-alkanoinsyrer som benyttes som utgangsprodukter for denne syntese, kan fås ved reaksjon av dibromo-1 omegaalkan på natriumderivatet av etylmalonat, noe som fører til di- og mono-kondensasjonsprodukter, idet derivatet isoleres ved destillasjon av reaksjonsblandingen under redusert trykk:

+ (EtOCO)2 CH-(CH2)n-CH(COOEt)2 + NaBr

etterfulgt av en dekarboksylering i surt miljø (HBr) av etyl-bromo-omega-alkylmalonatet for å gi bromo-omega-alkanoinsyre i henhold til følgende skjema:

Kondensasjonsreaks jonen , (e) a.V en i omegastilling

bromert syre og en ekte acetylenalkohol for dannelse av en hydroksy-omega-alkynoinsyre. gjennomføres i flytende ammoniakk i nærvær av litiumamid.. Valget.ay litium beror på at dette metall blokkerer OH-funksjonen; den bromerte syres reaksjon på dilitiumderivatet av acetylenalkoholen bevirker ikke O-alkyl-eringj bare C-alkylering iakttas. Acetylenalkoholen bør

benyttes i stort overskudd i forhold til bromert syre (3-10 mol til 1 mol), for da, hastigheten av kondensasjons-reaksjonen er meget liten ved -35°C, risikerer man å iaktta duplisering av den bromerte syre eller.dannelse av amin.

Den oppnådde hydroksy-omega-alky no.insyre blir så underkastet en partiell eller total reduksjon for å danne den tilsvarende hydroksy-omega-alkenoinsyre eller -alkanoinsyre, som så vil kunne omdannes ved tosylering og jodering av hydroksyl-endegruppen til.mettet jodert syre eller etylen-Z-eller - E-syre. - for å oppnå jodo-omega-alkanoinsyrene gjennomfører man en total hydrogenering av hydroksy-omega-alky noinsyrene. Den anvendte katalysator er Adams-platina (Pt02)/ og reaksjonen utføres enten i eddiksyre eller i en alkohol, f.eks. propanol, eller også i eter, - for å oppnå jodo-omega-alkenoin^Z-syrene utfører man en partiell og ytterst stereoselektiv katalytisk hydrogenering av hydroksy-omega-alkynoinsyrene ved hjelp av en Lindlar katalysator (katalysator med 5% palladium på kalsiumkarbonat avaktivert ved 95°C med en blyacetat-oppløsning) i nærvær av kinolin.

For å oppnå jodo-omega-alkenoin-E-syrene utfører man en stereospesifikk reduksjon av hydroksy-omega-alkynoinsyrene på kjemisk vei. Det benyttede reduksjonsmiddel er natrium oppløst i flytende ammoniakk under trykk ved en temperatur av 20-60°C.

De i omegastilling hydroksylerte fettsyrer blir så underkastet tosylerings- og utbytningsreaksjonene (f, f,

f" eller f"') for å gi de i omegastilling joderte fettsyrer.

Tosy-leringsreaksjonen gjennomføres i pyridin eller i

et oppløsningsmiddel som f.eks. diklormetan. For å unngå eliminasjon gjennomfører man i alle tilfeller reaksjonen ved lav temperatur mellom 0 og 5°C. Reaksjonstiden varierer fra 2\ til 24 timer når man benytter pyridin som oppløsnings-middel, mens den er. 8 dager hvis man benytter diklormetan.

Denne reaksjon blir derfor fortrinnsvis gjennomført i pyridin under anvendelse av et.overskudd av para-toluensul-fonylklorid i forhold til alkohol.

Utbytningsreaksjonen består i et angrep på tosylatet som er en meget god utgangsgruppe, med det nukleofile ion

I~:

Denne tosylat-jod-utbytningsreaksjon kan sammenlignes

med en brom-jodutbytning, og foregår i aceton under tilbakeløp i henhold til GENSLER- og TOMAS-metoden. Den bør gjennomføres under nitrogenatmosfære.

Før de joderte eller bromerte derivater tas i bruk i fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir de renset ved høyeffektiv væskekromatografi ved bruk av en bærer på silisium-basis og et elueringsmiddel som vesentlig utgjøres av heptan, eter og eddiksyre. I alminnelighet benytter man for dette rensningstrinn en HPLC-kromatograf utstyrt med et differensial-refraktometer og med en eller flere silisiumkolonner av type Prep Pak 50 0 og gjennomfører > elueringen ved hjelp av en blanding av 97,8% heptan, 1,8% eter og 0,4% eddiksyre i en strømning av 200 ml/min under et trykk på 5 bar, ved injeksjon av en prøve på 3-5 g.

Man kan øke utbyttet av rensningen ved å seriekoble to silisiumkolonner og høyne polariteten av oppløsningsmiddelet. som i dette tilfelle utgjøres av en blanding av 95,6% heptan, 4% eter og 0,4% eddiksyre. i en strømning på 50 ml/min og under et trykk på 8 bar. Etter dette rensningstrinn.blir det joderte eller bromerte derivat underkastet en sterilisering og deretter kondisjonert i flakonger.

Ytterligere fordeler og særtrekk ved oppfinnelsen vil fremgå bedre ved lesning ay de følgende eksempler, som selv-sagt anføres som rent illustrerende bg ikke som begrensende. EKSEMPEL 1: Fremstilling av som utgangsmateriale anvendte fett syrer jodert i omegastilling.

1) Fremstilling av acetylenalkoholer

a) - Fremstilling av alkynoinsyre

H-C ==C-Na

Br-(CH-) ,-COOH HOCO-(CH,) ,-C==C-H,

NH3

I en trehalset flaske inneholdende 2 1 flytende ammoniakk og under acetylenstrøm løser man opp 40 g Na under stadig omrøring. Tilsetningen av acetylen fortsetter inntil blåfargen av oppløst natrium forsvinner. Man tilsetter langsomt 0,49 mol brom-omega-alkanoinsyre oppløst i 150 ml THF, og deretter 150 ml rent THF. Blandingen omrøres fortsatt i 15 h inntil all ammoniakk er fordampet. Bunnfallet gjenvinnes med litt eter og hydrolyseres. Reaksjonsblandingen ansyres (HC1 11N),

og produktet ekstraheres med eter. Den eteriserte fase vaskes med vann, filtreres på faseseparerende Whatman-papir og inndampes. Produktet destilleres under redusert trykk: 93s£Y2lZl2i2s.yr§_i2J.f 5_): H-C=C-(CH2) 5-COOH

KokepunktQ g = 95-100°C, utbytte 65% Ngny_n=8zoinsYre__(n^=62 : H-C=C- (CH2) g-COOH

KokepunktQ 5 = 106-108°C, utbytte 65%

b) - Omdannelse av syren til - acetylenalkohol Diazometan oppløst i eter tilsettes det oppnådde produkt ifølge a) inntil vedvarende gulfarging. Over-skytende diazometan tilintetgjøres med noen dråper eddiksyre. Etervolumet bringes på 200 ml ved inn-dampning. Man får da 0,3 mol ester, og utbyttet av forestringen blir i virkeligheten praktisk talt kvantitativt.

I en trehalset ballong på 2 1 utstyrt med en kjøler, en bromampulle bg et røreverk, bringer man inn en suspensjon av 11,4 g LiAlH4 i 500 ml vannfri eter mens blandingen holdes på 0°C. Esteren oppløst i eter (0,3 mol i 200 ml) tilsettes dråpevis, og omrøringen fortsettes i 2 timer, stadig ved 0°C. Oppløsningen blir så hydrolysert med 80 ml NaOH. 5N (inntil flokkulering). Den faste fase vaskes med eter. Den eteriserte fase vaskes med en

oppløsning av mettet ammoniumklorid filtrert på faseseparerende Whatman-^papir. Eteren avdampes, og residuet tørkes ved azeotropisk destillasjon (benzen) samt destilleres under redusert trykk'.

• Okty_n-7-ol_l: Kokepunkt Q g = 74°C; utbytte 65%

• Nonyn-8-ol_l: KokepunktQ g = 85°C; utbytte 90%

2) Fremstilling av omega- bromert syre

a) - Fremstilling av etyl- bromo- omega- alkylmalonat

Br-(CH-) -Br + NaCH(COOEt)0 Br-(CH0) -CH(COOEt)0

Z n z zn z + NaBr

I en trehalset beholder utstyrt med en kjøler, en bromampulle og et røreverk, blir 0,4 5 mol (10,35 g) Na oppløst i 140 ml absolutt etanol destillert på magnesium. Til den avkjølte oppløsning (20°C) setter man langsomt 0,90 mol (133,2 g) destillert etylmalonat (kokepunkt^,. = 102°C). Blandingen oppvarmes i 1 h til 60°C på vannbad og kjøles så til 0°C. Så tilsetter man langsomt 0,49 mol dibromo-l-omega-alkan oppløst.i 98 ml vannfri eter. Reaksjonsblandingen får henstå 3 døgn ved værelse-temperatur. Eter og etanol avdampes, og residuet opp-tatt med 200 ml vann blir ekstrahert fire ganger med 250 ml eter. Den eteriserte. fase yaskes med vann, filtreres på faseseparerende Whatman-papir og tørkes på <N>^SQ^. Eteren aydampés.,. og reaks jonsproduktet destilleres under redusert trykk. Man oppsamler følgende fraksjoner:

Et<y>l-jbromo-5-2entYl!imalonat:

Br-(CH2)5-CH(COOEt)2

1: Etylmalonat CH2 (COOEt) 2: Kokepunk^ = 64°C

2: Dibromopentan Br-(CE2) 5~Br: Kokepunk^ = 74°C

3: Etyl-(bromo-5-pentyl)-malonat

Br-(CH2)5-CH(COOEt)2: Kokepunkt1=154°Cj utbytte 43% 4: Tetraester (EtOCO)2CH-(CH2)5~CH(COOEt)2: Kokepunkt 1 ?> 160°C.

Etyl jbromo;6-heksYl]_-malonat x

Br-(CH2)g-CH(COOEt)2 o

1: Etylmalonat: Kokepunkt.^ = 95-100°C

2: Dibromoheksan Br-(CH2)g-Br: Kokepunkt13 ■= 90°C

3: Etyl(bromo-6-heksyl)-malonat

Br-(CH„),-CH(COOEt)„ : Kokepunkt. , = 139°C,

n u = 1,460, utbytte 41%

D

4: Tetraester av dikarboksysebacinsyre (EtOCO)2-CH-(CH2)g-CH(COOEt)2: KokepunktQ 3 > 139°C.

Etyl^bromo;<1>0-decyl)_;malonat:

Br-(CH2)10"CH(COOEt)2

1: Etylmalonat: Kokepunkt^ = 64°C

2: Dibromodecan Br- (CH2) 10~Br : Kokepunk^ = 150°C 3: Etyl(bromo-10-decyl)-malonat

Br-(CH2)10-CH(COOEt)2 : Kokepunk^ = 192°C utbytte 61%

4: Tetraester (EtOCO)2CH-(CH2)10"CH(COOEt)2:

Kokepunkt 1 = 195°C

b) - Omdannelse til bromo- Qmega- aikanolnsyre Br-(CH2),n-CH(COOEt)2 EB;r > Br-(CH.^^-CQQH

Man varmer opp 0,18 mol maloinderviat og 51 g HBr til 48 % i vann i en trehalset beholder utstyrt med en bromampulle og en destillasjonskolonne med tilbakeløps-kjøler. Reaksjonsblandingen bringes på 120-150°C. Etylbromidet avdestilleres oventil med vann og HBr. Etter hvert som destillasjonen skrider frem, setter man i beholderen til en mengde bromsyre lik mengden av oppsamlet destillat (i alt 150 ml). Blandingen varmes i 4 h. Etter avkjøling blir produktet hydrolysert med is og 250 ml vann.

Syren felles ut i fast tilstand. Den ekstraheres med eter (500 ml). Den eteriserte fase vaskes en gang med vann og avdampes. Sluttelig blir råsyren tørket ved azeotropisk destillasjon (øH) og destillert under redusert trykk: <Br>g<mo>-<7>-<hep_tanoins>Y<r>e Br- (CH2) g-COOH: Kokepunkt0 8 = 124°C; utbytte 74% §E2S2l§l2?StåS2iS§YE§ Br-(CH2) 7~COOH: KokepunktQ g = 142°C: utbytte 67,5%

Br<omo>;12_dodecanoinsyre Br- (CH2) ^- COOH:

Kokepunkt0 g = 174°C; utbytte 30,5%.

3) Fremstilling av hydroksy- omega- alkynoinsyre

Denne reaksjon gjennomføres i en trehalset beholder utstyrt med et mekanisk røreverk, en bromampulle og en kullsyreis-kjøler (-80°C). Til 0,32 mol litiumamid (dannet ved reaksjon av 2,24 g Li i nærvær av ferri-nitrat) oppløst i 1,5 1 flytende ammoniakk setter man 0,124 mol acetylenalkohol oppløst i 100 ml vannfri THF (i 30 min).- Omrøringen fortsettes i 45 min etter til-settingens slutt. Man tilføyer dråpevis 0,048 mol bromo-alkanoinsyre oppløst i 200 ml vannfri THF. Reaksjonsblandingen holdes under omrøring i 20 h. Etter avdampning av ammoniakken blir blandingen hydrolysert ved tilsetting av is. Oppløsningens pH-verdi bringes på 3 (HCl 11N), og syren ekstraheres med eter og tørkes deretter ved azeotropisk destillasjon (benzen). Den blir rekrystallisert i en eter-pentanblanding.

4) Partiell katalytisk - hydrogenering til hyflroksy-omega- alkenoin- z- syre

Denne hydrogenering gjennomføres i et apparat som omfatter et hydrogenforråd, et hydrogeneringskar og en vakuumanordning. I en erlenmeyerflaske inneholdende 40 ml propanol eller eter oppløses 3,7.10 mol hydroksy-omega-alkynoinsyre og 450 mg kinolin.

Man tilsetter så 150 mg Lindlar-katalysator. og erlenmeyerflasken festes til hydrogeneringsbeholderen. Etter spyling av beholderen blir omrøring satt i gang, og hydrogenforbruket måles som funksjon av tiden ved normalt trykk. Etter avsluttet hydrogenering blir opp-løsningen filtrert og propanolen avdampet, og residuet tas opp med 100 ml eter, som vaskes to ganger med ansyret vann (HC1) og to ganger med vann. Den . eteriserte fase filtreres på faseseparerende Whatman-papir og avdampes. Produktet analyseres. De to (med C, . og C^g) syntetiserte etylen-Z-syrer er væskeformet ved vanlig temperatur. Utbyttene er av størrelsesorden 80%. 5) Total hydrogenering til hydroksy- omega- alkenolnsyre Man går frem på samme måte som ved den foregående operasjon. Reaksjonen utføres på 3,7.10 -3 mol hydroksy-omega-alkynoinsyre i nærvær av 20 mg Pt02« Produktene rekrystalliseres i aceton. Utbyttene er på 70-80%. 6) Partiell hydrogenering til hydroksy- omega- alkenoiinr ' E- syre

Hydroksy-omega-alkynoinsyren (3,7.10 mol) oppløses i 50 ml vannfri eter og helles i en autoklay på 500 ml. Systemet avkjøles til -50°C (acetpn, kullsyreis). Man tilsetter så hurtig 2 g natrium oppløst i 150 ml flytende ammoniakk. Autoklaven lukkes og skakes i i h i vannbad ved 57°C Gjenværende ammoniakk avdampes, og reaksjonsblandingen hydrolyseres (is + <y>ann). Miljø-et ansyres (HC1 11N) og produktet ekstraheres med eter. Den eteriserte fase vaskes med vann, filtreres på faseseparerende Whatman-papir og avdampes. Produktet analyseres. Utbytte 50-60%.

7) Tosylering av omega- hydroksysyren

-3

3,6.10 mol omega-hydroksysyre oppløses i 6 ml pyridin.

Oppløsningen holdes under omrøring på 0°C. 0,86 g (4,5.10 _ 3 mol) paratoluen-sulfonylklorid tilsettes porsjonsvis. Omrøringen fortsettes i 8 h, og deretter blir systemet holdt på 5°C i 10-48 h. Reaksjonen etterfølges av kromatografi på tynt skikt (elueringsmiddel: eter, pentan 7/3, bærer Si02, detektering ved oppvarming av platen etter pulverisering med en 1% opp-løsning av koboltklorid i 10% I^SO^). Reaksjonsmiljøet hydrolyseres ved langsom tilsetting av 1 ml vann etterfulgt av rask tilsetting av 6 ml vann. Fettsyretosylatet blir så ekstrahert med CR^C^ og rekrystallisert i pentan ved -20 C.

8) Jodering av fettsyretosylatet

Joderingsreaksjonen av fettsyretosylatet gjennomføres under nitrogenatmosfære. Det ovennevnte tosylat blir oppløst i 20 ml aceton, og 2,2 g (14,8.10~3 mol) Nal tilsettes. Reaksjonsblandingen bringes på tilbake-løpskjøling i 2 h. Oppløsningen filtreres, acetonet avdampes, og produktet opptas i 100 ml eter. Den eteriserte fase vaskes to ganger med 50 ml vann med tilsatt natriummetabisulfitt (Na2S20^, 20%) og blir deretter inndampet.

Produktet tørkes ved azeotropisk destillasjon (aceton) og blir deretter krystallisert i pentan ved -20°C. Det blir så analysert:

^2dll4-tetradecen-7-oin-Z-syre:

Smeltepunkt S 20°C

J<g>d-14-tetradecanoinsY£e:

S = 65-67 °C

Man fikk på samme måte joderte fettsyrer i henhold til følgende tabell:

EKSEMPEL 2: Fremstilling av fettsyre markert med radioaktivt jod.

Dette eksempel anskueliggjør fremstilling av jod-16-heksadecen-9-oin-E-syre ved hjelp av jod 123.

I dette eksempel tilsetter man i en flakong inneholdende en viss mengde krystallinisert fettsyre,

1,4 ml aceton inneholdende 3,5 ug natriumjodid, hvoretter man tilsetter innholdet av denne flakong i en annen flakong som inneholder 35 mikroliter natriumjodid 123, noe som representerer en aktivitet på 1 millicurie. Deretter varmer man

denne flakong i tørt vannbad ved 103°C i 5 min.

Ved slutten av denne operasjon bestemmer man markeringsutbyttet ved elektroforese i veronalt miljø ved 200 volt i 30 min for å la jodidionene migrere, og ved telling av radio-aktivitetstoppene på de forskjellige soner av elektroforese-papiret. De oppnådde resultater ved gjennomførelse av markeringen av forskjellige mengder fettsyre er angitt i følgende tabell:

Ut fra denne tabell kan man fastslå at der fås meget gode resultater med 285 millicurie radioaktivt jod pr. g fettsyre.

EKSEMPEL 3

Dette eksempel anskueliggjør innflytelsen av pH-verdien

av oppløsningen av radioaktivt jod på de oppnådde resultater.

Man oppløser 2 mg jod-16-heksa.decen-9-oinsyre i 2 ml aceton inneholdende 5 mikrogram natriumjodid, og setter

den oppnådde oppløsning til 40 mikroliter oppløsning av

radioaktivt kaliumjodid med en samlet aktivitet på 1 millicurie, hvoretter man oppvarmer systemet til 103°C i tørt vannbad i 5 min.

Ved slutten av denne operasjon bestemmer man markeringsutbyttet ved elektroforese og telling som før. Når man benytter en jodidoppløsning med pH 12,3, blir markeringsutbyttet 85,2%, mens markeringsutbyttet blir 93,3% når man benytter en jodidoppløsning med en pH-verdi av omtrent 7. Således fastslår man at anvendelsen av en jodidoppløsning med pH-verdi 7 gjør det mulig å høyne markeringsutbyttet merkbart.

EKSEMPEL 4

Dette eksempel anskueliggjør innflytelsen av den volu-metriske aktivitet av den vandige oppløsning av radioaktivt jodid og av de benyttede volumer av jodidoppløsning og fett-syreoppløsning på de oppnådde resultater.

I dette eksempel benytter man for markeringen en opp-løsning omfattende 2,5 mg/ml jod-16-heksadecen-9-oinsyre i aceton inneholdende medbringende natriumiodid i et molforhold fettsyre : medbringende jodid =4.10 2. Til acetonoppløs-ningen med fettsyre og medbringende jodid setter man en viss mengde vandig oppløsning av radioaktivt natriumjodid, hvoretter man bringer systemet på en temperatur av 102-104°C i et tørt vannbad i 5 min. Ved slutten av denne operasjon bestemmer man markeringsutbyttet ved kromatografi på anionisk harpiks DOWEX AG-1 X8 form Cl : Harpiksen kondisjoneres under aceton, en brøkdel av markeringsoppløsningen plassert på harpiksen blir eluert av denne oppløsning, jodidene holdes tilbake, og den radioaktive fettsyre elueres.

De oppnådde resultater for forskjellige volumer av fettsyreoppløsningen i aceton og av oppløsningen av radioaktivt natriumjodid er gjengitt i tabell I. i;eiiLuuBB, eiuexiiiyBiuiuuei : iieptctn : jou v, eter : ou v, eddiksyre I V). Radioaktiv!tetsfaktoren Rf ligger mellom 0,9 og 1 for fettsyren og er lite forskjellig fra 0 for de ioniserte komponenter. Båndene av cellulose svarende til radioaktivitetsfaktorer Rf på (0-0,2, ... (0,8-1) gjenvinnes, og deres radioaktivitet måles.

Kvaliteten av det markerte produkt kontrolleres med ana-lytisk HPLC under følgende betingelser:

- stasjonær fase, SiC^ (10 pm)

- elueringsmiddel: heptan 98,1%

eter 1,5%

eddiksyre 0,4%

- strømning: 7 ml/min

Kolonnen blir på forhånd kondisjonert med en n-heptan-oppløsning inneholdende 3% eddiksyre.

Den rå markeringsoppløsning analyseres etter følgende metode: Markeringsoppløsningens aceton avdampes (uten tap av radioaktivitet); den markerte fettsyre analysert i oppløst form i elueringsmiddelet fører til et eneste radioaktivt produkt som absorberer i UV-området (- 7,5 kolonnevolumer). Undersøkt på NMR ''"H har dette produkt egenskaper som den opprinnelige joderte fettsyre. Under alle undersøkelsene tilkjennegir HPLC-analysen ikke radioaktive eller UV-absor-berende forurensninger (>1%).

Forøvrig skal det påpekes at det ay følgende grunner ikke er mulig å analysere markeringsoppløsningen i aceton direkte: - aceton inneholder ofte forurensninger som absorberer i UV-området, - det ser ut til at fettsyren og dette oppløsningsmiddel fører til separate HPLC-tilknytninger.

Ved å betrakte tabell I fastslår man at de beste resul-

tater oppnås når man benytter et volum av natriumjodid på

80 mikroliter, som representerer en total aktivitet på 2 millicurie, og et volum av fettsyreoppløsning på 2,8 milliliter, som har en fettsyrekonsentrasjon på 2,5 mg/ml og en slik kon-sentrasjon av medbringende jodid at molforholdet fettsyre/med-2

bringende Nal blir 4.10 .

Forøvrig har man konstatert at oppvarmingstid lenger enn 5 min ikke hadde noen innvirkning på markeringsutbyttet.

Sluttelig har man fra disse resultater kunnet utlede at volumforholdet mellom fettsyreoppløsning og Na 12 3I-oppløsning bør være minst 14.

EKSEMPEL 5

I dette eksempel studerer man innvirkningen av volumforholdet mellom vandig oppløsning og fettsyreoppløsning på markeringsutbyttet i tilfelletav markering av jod-16-heksa-decen-9-oinsyre med jod 131.

I dette tilfelle benytter man samme arbeidsmetode som i eksempel 4. De oppnådde resultater er oppført i tabell II, som likeledes angir de benyttede betingelser.

EKSEMPEL 6

Dette eksempel anskueliggjør fremstilling av en injiserbar oppløsning av fettsyre markert med jod 123 ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Hver av de bestanddeler som er nødvendige for markeringen og for å gi en injiserbar oppløsning, kondisjoneres til steri-litet og uantennelighet i en flakong av "penicillin"- typen. Disse flakonger, som på forhånd er behandlet og underkastet alle de nødvendige kontroller for medisinsk bruk, anbringes i et magasin, som således inneholder: - en flakong A inneholdende 7 mg krystallisert jod-16-heksa-decen-9-oinsyre,

- en flakong B inneholdende aceton og natriumjodid,

- en flakong C inneholdende tampongoppløsning med pH 9 og med følgende sammensetning:

. 0,28 mg vannfritt natriumkarbonat og

. 1,6 mg natriumbikarbonat pr. ml oppløsning av natrium-klorid i konsentrasjonen 9-1000, - en> flakong D inneholdende menneskelig albumin i 20% opp-løsning i fysiologisk serum.

For markeringen benytter man ennvidere en flakong inneholdende den nødvendige mengde av vandig oppløsning av radioaktivt jodid, som leveres i siste øyeblikk. Denne flakong inneholder 40 mikroliter vandig natriumjodidoppløsning med pH 7 og en samlet aktivitet av jod 123 på 1 millicurie.

For å gjennomføre markeringen tar man fra flakong B

2,8 cm 3 aceton inneholdende 7 yg natriumjodid og setter den til innholdet av flakong A, altså 7 mg krystallisert fettsyre, noe som gjør det mulig å få en oppløsning av fettsyre i aceton inneholdende det tilsiktede volum av medførende natriumjodid.

Man tar så 1,4 cm 3 fra oppløsningen i flakong A og tilsetter den i den med gummimembran forseglede flakong som inneholder oppløsningen av radioaktivt jodid ved pH 7.

Derpå anbringer man denne forseglede flakong inneholdende opp-løsningen med radioaktivt jodid og fettsyreoppløsningen i et tørt vannbad og varmer den opp til en temperatur av 102-103°C i 5 min for å bevirke utbyttingsreaksjonen og få en

123

fettsyre markert med I. Etter oppvarmingen innfører man en luftenål i gummimembranen som lukker for flakongen,for å fjerne acetonen ved avdampning. Etter denne operasjon tar man fra flakong C 3 ml tampongoppløsning og innfører den i den flakong som inneholder markert fettsyre, hvoretter man anbringer denne flakong i et tørt vannbad, idet man underkaster innholdet en skakning og varmer opp til 70<Q>C i omtrent 15 min for å få en kolloidal suspensjon av markert fettsyre.

Når suspensjonen er blitt avkjølt, tilsetter man så 1 ml menneskelig albuminserum som man tar fra, flakong d, og opp-løsningen blir da klar: den således oppnådde oppløsning av jodert fettsyre markert med jod 123 administreres direkte ved intravenøs injeksjon.

EKSEMPEL 7

Dette eksempel anskueliggjør fremstillingen av en injiserbar oppløsning av fettsyre som er markert med jod 123 ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, men under anvendelse av radioaktivt jodid i tørr tilstand istedenfor i vandig opp-løsning.

Dette radioaktive jodid i tørr tilstand fikk man ved å inndampe en vandig oppløsning av radioaktivt jodid 123 produsert i syklotron og levert med pH 7 med en aktivitet av 10 millicurie pr. milliliter. For å omdanne denne oppløsning til tørt radioaktivt jodid innfører man i en leveringsflakong av penicillintypen et volum svarende til den ønskede aktivitet og kalibrert for brukstidspunktet. Man innfører så flakongen i et tørt termostatstyrt bad på 100°C uten propp og inndamper tørt. Så propper man flakongen til, tar den ut og underkaster den en sterilisering i autoklav ved 120°C i 20 min.

De bestanddeler som behøves for markeringen oppbevares i et magasin som likedan som i eksempel 6 inneholder: - en flakong A inneholdende 7 mg krystallisert jod-16-heksa-decen-9-oinsyre,

- en flakong B inneholdende aceton og natriumjodid,

- en flakong C inneholdende 5 ml tampongoppløsning med pH 9, og

- en flakong D inneholdende menneskelig albumin i 20%'s oppløs-ning i fysiologisk serum.

For markeringen anvender man ennvidere en flakong med den nødvendige aktivitet av radioaktivt jodid i tørr tilstand levert i siste øyeblikk. Denne flakong inneholder 4 millicurie radioaktivt jodid ved pH 7 i tørr tilstand.

For å gjennomføre markeringen tar man fra flakong B 1 ml aceton inneholdende 2,5 ug natriumjodid og setter den til innholdet av flakong A, altså til 7 mg krystallisert fettsyre, noe som gjør det mulig å få en acetonoppløsning ay fettsyre inneholdende den tilsiktede mengde medførende natriumjodid, hvoretter man tar ut hele oppløsningen fra flakong A (1 ml) og tilsetter den i den med teflonmembran forseglede flakong som inneholder det radioaktive jodid i tørr tilstand ved pH 7. Så anbringer man den forseglede flakong inneholdende radioaktivt jodid og fettsyreoppløsning i et tørt vannbad og varmer opp til en temperatur på 102-103°C i 5 min for å bevirke utbytnings-reaks jonen og få en fettsyre markert med jod 123. Etter oppvarmingen fører man i flakongens lukkede teflonmembran inn en luftenål for å fjerne aceton ved avdampning. Etter denne operasjon tar man ut 4 ml tampongoppløsning fra flakong C, inn-fører den i flakongen med markert fettsyre og anbringer så denne i et tørt vannbad mens man skaker innholdet og varmer opp til 70<Q>C i omtrent 15 min for å få en suspensjon av markert fettsyre. Når suspensjonen er avkjølet, tilsetter man så

1,5 ml menneskelig albuminserum som man tar fra flakong D, og oppløsningen blir dermed klar.

Etter å ha fremstilt den injiserbare oppløsning bestemmer man markeringsutbyttet.. som finnes å være 98,3%, noe som til-svarer 1,7% fritt radioaktivt jodid.

Man vil således se at man ved å arbeide med radioaktivt jodid i tørr tilstand kan få bedre resultat.

For å få dette forhold bekreftet foretar man forskjellige markeringer på jod-16-heksadecen-9-oinsyre under samme betingelser som tidligere, men under anvendelse av vandige opp-løsninger av radioaktivt jodid hver med en samlet aktivitet på

4 millicurie, men med forskjellige volumer (30, 200 og 500 pl). Man bestemmer likeledes markeringsutbyttet. De oppnådde resultater blir som angitt i den følgende tabell:

Claims (4)

1. Fremgangsmåte til fremstilling av en fettsyre markert med radioaktivt jod i -stillingen og med høyt markeringsutbytte, karakterisert ved at man lar en i omegastilling bromert eller jodert fettsyre reagere med radioaktivt alkalimetalljodid i tørr tilstand eller med en vandig oppløsning av dette i nærvær av en ytterligere og vesentlig større mengde ikke-radioaktivt alkalimetalljodid for å bytte ut fettsyrens brom eller jod med radioaktivt jod.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at det radioaktive alkali-metall- jodid i tørr tilstand eller i vandig oppløsning har en pH-verdi på omtrent 7.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at det ytterligere jodid er natriumjodid.

4. Fremgangsmåte som angitt i et av kravene 1-3, karakterisert ved at den bromerte eller joderte fettsyre oppløses i et med vann blandbart keton inneholdende det ytterligere alkalimetalljodid, og at man tilsetter denne fettsyreoppløsning det tørre radioaktive alkalimetalljodid eller den vandige oppløsning av dette.