DE102010010666A1

DE102010010666A1 - Diagnose und Therapie von Krebserkrankungen mittels Fettsäuren

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Publication number: DE102010010666A1
Application number: DE102010010666A
Authority: DE
Inventors: Anmelder Gleich
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2010-03-01
Filing date: 2010-03-01
Publication date: 2011-09-01

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft die diagnostische und/oder therapeutische Behandlung einer Krebserkrankung, insbesondere des Prostatakarzinoms.

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft die diagnostische und/oder therapeutische Behandlung einer Krebserkrankung, insbesondere des Prostatakarzinoms.
Statistisch gesehen entwickelt jeder dritte Europäer im Laufe seines Lebens Krebs. In Deutschland erkranken etwa 395.000 Menschen jährlich an Krebs, davon rund 195.000 Frauen und 200.000 Männer. Die meisten Fälle treten im Alter von über sechzig Jahren auf.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste lebensbedrohliche Tumorerkrankung des Mannes in der westlichen Hemisphäre. In Deutschland treten jährlich ca. 60.000 Erkrankungen auf. Die Mortalität liegt bei ca. 10% der Erkrankten. Das Prostatakarzinom geht vom Drüsengewebe der Prostata (Vorsteherdrüse) aus. Die Erkrankung ist im Frühstadium symptomlos. Im fortgeschrittenen Stadium können Beschwerden wie Blasenentleerungsstörungen, Knochenschmerzen und später Gewichtsverlust und Blutarmut auftreten.
Ziel der prätherapeutischen Diagnostik des Prostatakarzinoms ist die möglichst exakte Bestimmung des lokalen Ausmaßes des Prostatakarzinoms bezüglich intraprostatischer Lokalisationen, Kapseldurchbruch, Samenblaseninfiltration, Infiltration der neurovaskulären Bündel und ggf. der umgebenden Organe des kleinen Beckens, die Detektion einer lokoregionären Lymphknotenmetastasierung und ggf. einer Fernmetastasierung. Eine exakte prätherapeutische Diagnostik ist deshalb wichtig, weil die verfügbaren Behandlungsstrategien in strenger Abhängigkeit vom festgestellten klinischen Stadium der Tumorerkrankung und Risikoprofil festgelegt werden müssen. Wird die Diagnose erst gestellt, wenn bereits Symptome aufgetreten sind, hat häufig schon eine Metastasierung stattgefunden, vorrangig in die lokalen Lymphknoten oder in das Skelett.
In der Diagnostik hat sich die Positronen-Emissions-Tomographie (PET) in Verbindung mit der Computertomographie (CT) etabliert. Diese Methodik ermöglicht die molekulare, funktionelle und morphologische Bildgebung in einem Untersuchungsprotokoll. Sie ermöglicht die Erkennung von Tumorerkrankungen häufig schon im Frühstadium, die Stadienbestimmung und, bei wiederholter Anwendung, die Beobachtung des Krankheitsverlaufs und eine verbesserte Beurteilung des Therapieansprechens bei therapeutischen Interventionen.
In den letzten Jahren wird insbesondere in diagnostischen Problemfällen im Zusammenhang mit einem Prostatakarzinom, z. B. bei negativer Stanzbiopsie und einem persistierendem Verdacht, die Bildgebung mittels PET/CT unter Verwendung der radioaktiv markierten Tracer ¹¹C- und ¹⁸F-Cholin, ¹⁸F-Desoxyglukose (¹⁸F-FDG) oder ¹¹C-Acetat, dazu verwendet, um das Karzinom zu lokalisieren und eine gezielte Rebiopsie zu ermöglichen. Die Aufnahme dieser Tracer in fokale Herdbefunde der peripheren Zone der Prostata stellt ein diagnostisches Kriterium für das Vorliegen eines Prostatakarzinoms dar.
Allerdings ist das ¹¹C- bzw. ¹⁸F-Cholin-, ¹⁸F-FDG- oder ¹¹C-Acetatsignal häufig schwer zu interpretieren. Dies liegt z. T. daran, dass die Abbauprodukte dieser Tracer in komplexe Stoffwechselprozesse des Intermediärstoffwechsels des gutartigen Prostatagewebes involviert sein können. Deshalb ist die Spezifität des derzeitigen Prostatakarzinomnachweises über die Aufnahme von ¹¹C- bzw. ¹⁸F-Cholin, ¹⁸F-FDG oder ¹¹C-Acetat suboptimal. Ebenso werden mittels dieser Tracer kleinere Tumormanifestationen maskiert, so dass eine zuverlässige Bestimmung der gesamten intraprostatischen Karzinomausdehnung nicht möglich ist.
Aus den vorstehend genannten Gründen werden derzeit zur individuellen Entscheidungsfindung betreffend einen einzelnen Patienten statistische Modelle über Risikoszenarien einer Patientenpopulation mit einem naturgemäß großen statistischen Streubereich herangezogen.
Insgesamt lässt sich also feststellen, dass das derzeitige auf der zellulären Aufnahme der vorstehend genannten Tracern beruhende Diagnoseverfahren sowohl für die Identifizierung eines Prostatakarzinoms beim individuellen Patienten als auch für die Dokumentation der intraprostatischen Ausdehnung des Prostatakarzinoms suboptimal ist.
In der WO 2009/109798 wird die Verwendung von ¹⁸F-fluormarkierten Malonsäure zum Nachweis des Prostatakarzinoms vorgeschlagen. Diese Methode hat sich jedoch in der Praxis nicht bewährt.
Es besteht deshalb ein Bedarf an alternativen Verfahren zur diagnostischen und therapeutischen Behandlung von Tumorerkrankungen.
Vor diesem Hintergrund liegt der vorliegenden Erfindung die Aufgabe zugrunde, die Nachteile aus dem Stand der Technik in Bezug auf die Diagnostik von Tumorerkrankungen möglichst zu vermeiden. Insbesondere soll eine Verbindung bereitgestellt werden, mit der sowohl eine verbesserte Diagnostik als ggf. auch eine Therapie einer Tumorerkrankung möglich ist.
Diese Aufgabe wird mit der Bereitstellung einer Fettsäure gelöst.
Die Erfinder haben überraschenderweise festgestellt, dass in malignen Tumoren ein stark aktiver Fettsäuresynthase-Komplex (FASN) vorliegt und dies diagnostisch und therapeutisch genutzt werden kann. FASN ist ein Proteindimer, das alle für die Biosynthese freier Fettsäuren (FFA) notwendigen Enzyme sowie das für den FFA-Transport wichtige Protein Alcyl-Carrier-Protein (ACP) enthält.
Die Erfinder haben nun erstmals erkannt, dass exogen zugeführte Fettsäuren präferenziell in Tumorzellen aufgenommen werden und somit besonders geeignet sind, zur diagnostischen und therapeutischen Behandlung einer Krebserkrankung eingesetzt zu werden.
Diese Erkenntnis war deshalb besonders überraschend, da in dem Dokument WO 2009/109798 (a. a. O.) die Auffassung vertreten wird, der Fettsäurebedarf im Prostatakarzinom sei besonders niedrig, vgl. S. 4, Zeilen 20 bis 23. Ein Fachmann würde demnach annehmen, dass Fettsäuren für eine diagnostische und/oder therapeutische Behandlung von Tumorerkrankungen gerade nicht geeignet sind.
Besonders vorteilhaft ist es erfindungsgemäß, dass die Fettsäuren, insbesondere die Palmitinsäure, nach ihrer Applikation innerhalb eines für eine Untersuchung geeigneten Zeitfensters von ca. einer Stunde in die meisten nicht-tumoralen Körpergewebe nur in äußerst geringen Mengen aufgenommen werden. Damit gelingt im Gegensatz zu den bislang im Stand der Technik verwendeten Tracern ¹¹C- bzw. ¹⁸F-Cholin oder ¹¹C-Acetat eine zuverlässige Abbildung des Tumorgewebes und insbesondere eine scharfe Abgrenzung gegenüber nicht-tumoralen Geweben. Im Rahmen einer diagnostischen Verwendung der Fettsäure können so klinische Entscheidungen über therapeutische Strategien zur Behandlung der Krebserkrankung anhand eines individuell ermittelten Tumorstadiums getroffen werden. Statistische Modelle über Risikoszenarien müssten nicht mehr herangezogen werden.
Die der Erfindung zugrundeliegende Aufgabe wird durch die Bereitstellung einer diagnostischen und/oder therapeutischen Zusammensetzung, die eine Fettsäure aufweist, vollkommen gelöst. Insbesondere sind neben der Fettsäure keine weiteren Wirkstoffe, aktiven Verbindungen oder Substanzen erforderlich, um eine Eignung als Diagnostikum oder Therapeutikum herbeizuführen.
Fettsäuren bzw. Monokarbonsäuren bezeichnen Verbindungen, die aus einer Carboxylgruppe (-COOH) und einer unterschiedlich langen, meist unverzweigten Kohlenwasserstoffkette bestehen. Fettsäuren unterscheiden sich voneinander durch unterschiedlich lange Kohlenwasserstoffketten, d. h. durch die Anzahl der C-Atome, sowie die mögliche Anwesenheit, Anzahl und Position von Doppelbindungen. Man kann Fettsäuren aufgrund ihrer Kettenlänge in kurzkettige mit bis zu einschließlich 5 C-Atomen, mittelkettige mit 6 bis einschließlich 13 C-Atomen, und langkettige Fettsäuren mit mehr als 13 C-Atomen einteilen.
Vor diesem Hintergrund wird die vorliegende Erfindung auch durch die Verwendung einer Verbindung gelöst, die folgende Strukturformel aufweist:
in der R ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter oder zumindest teilweise ungesättigter acyclischer Kohlenwasserstoffrest ist,
wobei R substituiert sein kann mit 1 bis 5 Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁- bis C₆-alkyl, C₂- bis C₆-alkenyl, vorzugsweise Vinyl, C₂- bis C₆-alkinyl, C₃- bis C₆-cycloalkyl, C₆- bis C₁₀-aryl, vorzugsweise Phenyl, 3- bis 25-gliedriges Heterocyclyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, Hydroxy, C₁- bis C₆-alkoxy, Amino, C₁← bis C₆-alkylamino, Carbonyl, Alkylcarbonyl, Alkylcarbonylamino, Alkyloxycarbonylamino, Carboxy, Carboxyalkyl Carboxamido, Halogen, Cyano, Nitro, Azido,
wobei Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl, Alkoxy und Alkylamino ihrerseits substituiert sein können mit 1 bis 10 Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁- bis C₆-alkyl, C₂- bis C₆-alkenyl, vorzugsweise Vinyl, C₂- bis C₆-alkinyl, C₃- bis C₆-cycloalkyl, C₆- bis C₁₀-aryl, vorzugsweise Phenyl, 3- bis 25-gliedriges Heterocyclyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, Hydroxy, C₁- bis C₆-alkoxy, Amino, C₁- bis C₆-alkylamino, Carbonyl, Alkylcarbonyl, Alkylcarbonylamino, Alkyloxycarbonylamino, Carboxy, Carboxyalkyl Carboxamido, Halogen, Cyano, Nitro, Azido.
Vorzugsweise kann es sich bei der Fettsäure um eine mittelkettige Fettsäure mit R = C₇–C₁₃, und oder um eine langkettige Fettsäure mit R > C₁₃ handeln. Ferner haben die Erfinder festgestellt, dass es sich bei der Fettsäure vorzugsweise um eine ungeradzahlige Fettsäure mit R = C₇, C₉, C₁₁ usw. und/oder um eine geradzahlige Fettsäure mit R = C₈, C₁₀, C₁₂ handeln kann. Darüber hinaus haben die Erfinder herausgefunden, dass sowohl eine gesättigte Fettsäure, d. h. eine solche, die keine Doppelbindungen zwischen den C-Atomen in R aufweist (C_nH2_n+1COOH, n = Anzahl der Atome), oder eine ungesättigte Fettsäure, d. h. um eine solche, die mindestens eine Doppelbindung in R aufweist, geeignet sein kann.
Erfindungsgemäß ist es deshalb bevorzugt, wenn R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C₇- bis C₂₄-geradkettiges Alkyl, C₇- bis C₂₄-verzweigtes Alkyl, C₇- bis C₂₄-geradkettiges Alkenyl, C₇- bis C₂₄-verzweigtes Alkenyl, C₇- bis C₂₄-geradkettiges Alkinyl, C₇- bis C₂₄-verzweigtes Alkinyl.
Wie die Erfinder feststellen konnten, führt die Verwendung von derart charakterisierten Fettsäuren zu besonders guten Ergebnissen.
Dabei ist es bevorzugt, wenn die Fettsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Önathansäure (Heptansäure; C₇), Caprylsäure (Octansäure; C₈), Pelargonsäure (Nonansäure; C₉), Caprinsäure (Decansäure; C₁₀), Undecansäure (C₁₁), Laurinsäure (Dodecansäure; C₁₂), Tridecansäure (C₁₃), Myristinsäure (Tetradecansäure; C₁₄), Pentadecansäure (C₁₅), Palmitinsäure (Hexadecansäure; C₁₆), Margarinsäure (Heptadecansäure; C₁₇), Stearinsäure (Octadecansäure; C₁₈), Nonadecansäure (C₁₉), Arachinsäure (Eicosansäure; C₂₀), Behensäure (Docosansäure; C₂₂), Lignocerinsäure (Tetracosansäure; C₂₄).
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass bereits potentiell geeignete Fettsäuren bereitgestellt wird.
Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Weiterbildung weist die Fettsäure einen detektierbaren Marker auf.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass die konstruktiven Voraussetzungen für eine Detektion bzw. Lokalisierung der Fettsäure im Zell- bzw. Gewebeverband bzw. dem Patienten ermöglicht wird.
Erfindungsgemäß wird unter einem detektierbaren Marker jedes Atom, Molekül und jede Verbindung verstanden, welche dazu verwendet werden können, um einen detektierbaren und vorzugsweise quantifizierbaren Effekt zu erzeugen und an die erfindungsgemäße Fettsäure angebracht zu werden. Eine nicht-limitierende Auflistung dieser Marker umfasst beispielsweise Enzyme, die ein detektierbares Signal erzeugen, beispielsweise durch Colorimetrie, Fluoreszenz oder Lumineszenz, wie beispielsweise die Meerrettichperoxidase, alkalische Phosphatase, Beta-Galaktosidase oder Glukose-6-Phosphat-Dehydrogenase, Chromophore, wie fluoreszierende, lumineszierende oder Farbverbindungen, Gruppen mit einer Elektronendichte, die durch die Elektronenmikroskopie oder über deren elektrische Eigenschaft detektiert werden können, wie beispielsweise Leitfähigkeit, Amperometrie, Voltametrie oder Impedanz, detektierbare Gruppen, z. B. Moleküle mit ausreichender Größe, um detektierbare Modifizierungen ihrer physikalischen und/oder chemischen Eigenschaften zu induzieren. Diese Detektion kann mittels optischer Verfahren, wie beispielsweise Diffraktion, Oberflächenplasmonresonanz, Oberflächenvariation oder Kontaktwinkelvariation erfolgen oder mittels physikalischer Verfahren, wie beispielsweise Atomkraftspektroskopie und dem Tunneleffekt.
Besonders bevorzugte detektierbare Marker sind radioaktive Marker, wie vorzugsweise ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁹Z, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ¹²³I, ¹²⁵I und ¹³¹I.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine Lokalisierung bzw. Detektierung der Fettsäure mittels Autoradiographie, Szintigraphie, Single Photonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) gegebenenfalls in Verbindung mit der Computertomographie (CT), oder aber der gängigen Positronen-Emissions-Tomographie (PET), vorzugsweise in Kombination mit einer Computertomographie (CT), erfolgen kann. Die genannten radioaktiven Marker besitzen sehr günstige strahlenhygienische Eigenschaften, wie beispielsweise kurze Halbwertszeiten. Diese Maßnahme hat auch den Vorteil, dass die derzeit zur Diagnose von Krebserkrankungen eingesetzten Apparaturen weiterhin Verwendung finden.
Erfindungsgemäß bevorzugt ist es, wenn die Fettsäure 1-¹¹C-Palmitinsäure (1-¹¹C-Hexadecansäure) ist, bzw. die erfindungsgemäße Verbindung folgende Strukturformel aufweist:
Wie die Erfinder festgestellt haben, handelt es sich bei der Palmitinsäure bzw. der vorstehenden erfindungsgemäßen Verbindung um eine besonders geeignete Fettsäure für eine diagnostische und/oder therapeutische Verwendung zur Detektion und/oder Behandlung von Tumoren. Die Erfinder konnten sowohl in Prostatakarzinomzelllinien als auch im Tiermodell im Vergleich zu nicht-turnoralen Geweben eine stark gesteigerte Aufnahme von radioaktiv markierter Palmitinsäure bis zum zehnfachen des derzeit besten Biomarkers für die klinische Bildgebung des Prostatakarzinoms, dem ¹¹C-Cholin, messen.
Ein besonderer Vorteil in der Verwendung von Palmitinsäure besteht darin, dass sie eine besonders günstige physiologische Verteilung beim Menschen zeigt. Endogen zugeführte Palmitinsäure wird ansonsten im Wesentlichen im Herzmuskel unter Nahrungskarenzbedingungen angereichert und erreicht die maximale myokardiale Aktivität innerhalb von acht Minuten nach Applikation. Die Palmitinsäure wird in die meisten Abdominalorgane und das blutbildende Knochenmark in deutlich geringeren Konzentrationen aufgenommen als die bisher eingesetzten Radiopharmaka ¹¹C-Cholin, ¹⁸F-Cholin und ¹¹C-Acetat. Basierend auf umfangreichen tierexperimentellen Untersuchungen kann davon ausgegangen werden, dass die Anreicherung von Palmitinsäure in nicht-tumoralen Geweben im Untersuchungszeitfenster von ca. einer Stunde nach Applikation, beispielsweise intravenöser Injektion, marginal ist. Im Falle der Verwendung eines radioaktiven Markers in der Palmitinsäure, wie beispielsweise ¹¹C, wird dadurch die Strahlenbelastung des Patienten minimiert.
Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass es sich bei der Palmitinsäure um eine körpereigene Fettsäure handelt. Diese wird im Rahmen der erfindungsgemäßen Verwendung vorzugsweise in Mengen von ca. 0,1 bis 50 μg appliziert, vorzugsweise intravenös. Damit beträgt die zu applizierende Menge von Palmitinsäure weniger als 1/15 der physiologischen Menge freier Fettsäuren in einem Liter Plasma. Die Wahrscheinlichkeit, dass es dadurch zum Auftreten von Nebenwirkungen kommt, ist äußerst gering.
Die Verträglichkeit von Palmitinsäure ist umfangreich beschrieben. So wird Plamitinsäure in zahlreichen Kosmetika, beispielsweise Feuchtigkeitscremes, Rasierseife, Lippenstift und Shampoos sowie Nahrungsmitteln, z. B. Käse, als Zusatzstoff verwendet.
Palmitinsäure ist außerdem Bestandteil verschiedener zugelassener Medikamente, wie beispielsweise dem Ultraschallkontrastmittel Levovist^®, das pro Gramm Kontrastmittel 1 mg Palmitinsäure enthält, der Infusionsemulsion Omegaven-Fresenius^®, die pro 100 ml Lösung 1 g Palmitinsäure enthält, und Sorvanta^®, das zur vorbeugenden Anwendung bei Frühgeborenen mit erhöhtem Risiko eines Atemnotsyndroms eingesetzt wird, und welches ca. 0,7 bis 5,55 mg Palmitinsäure pro 4 ml-Einheit des Arzneimittels enthält.
Die Toxizität von Palmitinsäure ist äußerst gering. Die LD50 von Palmitinsäure wurde bei der Ratte mit > 2 g/kg bestimmt. Eine konservative Abschätzung des Sicherheitsabstandes zur LD50 der Ratte liegt bei 10⁷ bis 10⁸.
Die Palmitinsäure lässt sich ferner besonders gut radioaktiv markieren, indem vorzugsweise das C-Atom der Carboxylgruppe durch ein Nuklid, vorzugsweise ¹¹C, ersetzt wird. Das dadurch erhaltene Radiopharmakon, die ¹¹C-Palmitinsäure, ist chemisch identisch mit der körpereigenen Fettsäure und deshalb erfindungsgemäß besonders geeignet.
Bei einer beispielsweise einmaligen intravenösen Applikation einer ¹¹C-Palmitinsäurelösung mit einem Anteil von ca. 0,1 bis 50 μg ¹¹C-Palmitinsäure entsprechend dem sogenannten ”Microdose”-Ansatz der European Medicines Agency (EMEA), in dem weniger als 100 μg Substanzmenge einmalig intravenös appliziert werden, ist die Anwendung unter Toxizitätsgesichtspunkten unbedenklich. Dementsprechend wurden bei kardiologischen Untersuchungen mit ¹¹C-Palmitinsäure keine Nebenwirkungen beobachtet.
Nach einer alternativen ebenfalls bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Fettsäure um (E/Z)-13-¹³¹I-Iodtridec-12-ensäure und/oder (E/Z)-15-¹³¹I-Iodpentadec-14-ensäure.
Wie die Erfinder in ihren Experimenten feststellen konnten, zeichnen sich diese beiden Fettsäuren durch eine besonders hohe spezifische zelluläre Aufnahme und Retention in Prostatakarzinomzellen aus, während in benignen Zellen (BPH) die Retention erheblich abnimmt und dadurch eine Abgrenzung der malignen Zellen von den benignen Zellen besonders gut gelingt.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Fettsäure zur Behandlung einer Krebserkrankung vorgesehen, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Urogenitalkrebs, einschließlich dem Prostatakarzinom, kolorektales Karzinom, Brustkrebs, Lungenkarzinom, Malignes Melanom, Kopf-Hals-Karzinom, Malignes Lymphom, Neoplasie des hämatopoetischen Systems, Skeletttumor und Weichteiltumor.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass eine solche diagnostische und/oder therapeutische Substanz bzw. Zusammensetzung bereitgestellt wird, die zum Zwecke der Behandlung wichtigster Krebserkrankungen eingesetzt werden kann.
Nach einer erfindungsgemäß bevorzugten Weiterbildung weist die Fettsäure ein Zytostatikum auf.
Mit dieser Maßnahme wird die Fettsäure bzw. eine diese enthaltende Zusammensetzung zu einem Therapeutikum weitergebildet. Durch die hohe Tumorspezifität und -selektivität der Fettsäure ist eine zielgerichtete therapeutische Behandlung des Tumors möglich und die Belastung des Organismus im Allgemeinen, insbesondere der nicht-tumoralen Gewebe, wird auf ein Minimum reduziert. Geeignete Zytostatika umfassen Alkylantien, Platinanaloga, Interkalantien, Antibiotika, Mitosehemmer, Taxane, Topoisomerasehemmer, Antimetabolite und andere Verbindungen. Diese lassen sich mittels im Stand der Technik allgemein bekannter Verfahren an die Fettsäure koppeln.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer Fettsäure, und (2) Formulierung der Fettsäure in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, wobei die Fettsäure jene aus der erfindungsgemäßen Verwendung ist.
Pharmazeutisch akzeptable Träger sind im Stand der Technik umfassend beschrieben, beispielsweise in Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart, Kibbe et al. (2000), Handbook of pharmaceutical excipients, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press. Der Inhalt der vorgenannten Publikationen ist Gegenstand der vorliegenden Offenbarung.
Die Eigenschaften, Vorteile und besonderen Merkmale im Zusammenhang mit der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verwendung der Fettsäure gelten für das erfindungsgemäße Herstellungsverfahren entsprechend.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Krebserkrankung bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer Fettsäure, (2) Einbringung der Fettsäure in das Lebewesen, und ggf. (3) Detektieren und/oder Lokalisieren der Fettsäure in dem Lebewesen, wobei die Fettsäure jene aus der erfindungsgemäßen Verwendung ist.
Die Eigenschaften, Vorteile und besonderen Merkmale im Zusammenhang mit der vorstehend genannten erfindungsgemäßen Verwendung der Fettsäure gelten für das erfindungsgemäße Behandlungsverfahren entsprechend.
Dabei ist es bevorzugt, wenn Schritt (3) des erfindungsgemäßen Behandlungsverfahrens mittels eines bildgebenden Verfahrens erfolgt, welches vorzugsweise eine Autoragiographie, Szintigraphie, Single Photonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) gegebenenfalls in Verbindung mit der Computertomographie (CT), oder eine Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie (PET/CT) ist.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass zwei in der Klinik routinemäßig zur Verfügung stehenden und zuverlässigen Diagnoseverfahren Anwendung finden.
Ferner ist es erfindungsgemäß bevorzugt, wenn in Schritt (2) ca. 0,1 bis 50 μg Fettsäure intravenös in das Lebewesen eingebracht werden.
Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass lediglich geringe Mengen der Fettsäure appliziert werden, die dem Microdose-Ansatz der EMEA entsprechen und unter Toxizitätsgesichtspunkten unbedenklich sind.
Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Die vorliegende Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher erläutert, aus denen sich weitere Merkmale, Vorteile und Eigenschaften der Erfindung ergeben. Dabei wird Bezug genommen auf die beigefügten Abbildungen, in denen Folgendes dargestellt ist:
1 zeigt die Strukturformeln der beispielhaft untersuchten radiomarkierten Fettsäuren;
2 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹⁴C-markierter Palmitinsäure in verschiedene Prostatakarzinomzelllinien jeweils nach zwei- und vierundzwanzigstündiger Inkubation.
3 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹¹C-markierter Palmitinsäure in verschiedene Prostatakarzinomzelllinien jeweils nach zehn- und sechzigminütiger Inkubation.
4 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹⁸F-markierter Palmitinsäure in verschiedene Prostatakarzinomzelllinien jeweils nach ein- und vierstündiger Inkubation;
5 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹⁴C-markierter Myristinsäure in verschiedene Prostatakarzinomzelllinien jeweils nach zwei- und vierundzwanzigstündiger Inkubation der Zellen, die achtzehn Stunden vor der Zugabe von ¹⁴C-Myristinsäure mit C75 vorbehandelt wurden;
6 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹³¹I-markierter Fettsäure in verschiedene Prostatakarzinomzellen nach zwei- und vierundzwanzigstündiger Inkubation mit und ohne Zugabe des Inhibitors Caprylsäure;
7 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹³¹I-markierter Fettsäure in verschiedene Prostatakarzinomzellen nach ein-, vier- und vierundzwanzigstündiger Inkubation;
8 zeigt die zelluläre Aufnahme von ¹³¹I-markierter IVCORT in verschiedene Prostatakarzinomzelllinien nach zwei- und vierundzwanzigstündiger Inkubation;
9 zeigt die zelluläre Aufnahme der momentan verwendeten Tracer ¹⁸F-FDG und ¹¹C-Cholin (Cho) in verschiedene Prostatakarzinomzelllinien nach dreißigminütiger Inkubation;
10 zeigt das Ergebnis einer Western-Blot-Untersuchung zur Expression der Fettsäuresynthase in verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien;
11 zeigt das Ergebnis einer Immunfluoreszenzuntersuchung zur Expression der Fettsäuresynthase in verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien;
12 zeigt das Ergebnis einer In-vivo-Untersuchung in der Maus zur Biodistribution von ¹⁴C-markierter Palmitinsäure;
13 zeigt das Ergebnis einer immunhistologischen Untersuchung zur Expression der Fettsäuresynthase in neoplastischen Epithelien von Patienten mit einem Adenokarzinom der Prostata.
Ausführungsbeispiele
1. Material und Methoden
1.1 Zelllinien
Untersucht wurden die Prostatakarzinomzelllinien Du 145, PC 3, LNCaP, LNCaP C4-2, TRAMP, sowie die cytokinstimulierten benignen Zelllinien RWPR, PrEC und BPH-1. Bei LNCap, TRAMP und Du 145 handelt es sich um androgensensitive Prostatakarzinomzelllinien, bei PC 3 um eine androgenresistente, entdifferenzierte humane Prostatakarzinomzelllinie. RWPE, PrEC und BPH-1 sind humane, benigne, androgensensitive Zelllinien des Prostataepithels, die mit dem humanen Papillomvirus 18 bzw. dem großen T-Antigen des SV 40 immortalisiert wurden. Die TRAMP-Zelllinie ist eine antrogensensitive, transgene Epithelzelllinie der Prostata der C57BL/7-Maus. Diese Epithelzelllinie wurde mit einem Konstrukt des –426/+28-Ratten-Probasin-Promotors und dem großen T-Antigen von SV40 transfiziert und dadurch eine maligne Transformation induziert.
Alle verwendeten neoplastischen Zelllinien sind in der Literatur gut charakterisiert und stellen häufig verwendete Zellkulturmodelle des Prostatakarzinoms dar.
1.2 Fettsäuren
1-¹⁴C-Myristinsäure und 1-¹⁴C-Palmitinsäure: Kommerziell erhältliche 1-¹⁴C-Myristinsäure (40–60 mCi/mmol; Lösung in Ethanol, 100 μCi/mL, Fa. ”Moravek”) und 1-¹⁴C-Palmitinsäure (40–60 mCi/mmol; Lösung in Ethanol, 100 μCi/mL, Fa. ”Moravek”) wurden von Fa. ”Harmann Analytic GmbH” bezogen und wie geliefert verwendet.
1-¹¹C-Palmitinsäure: Kohlenstoff-11 wird in Form von ¹¹CO₂ an einem Zyklotron PETtrace (General Electric) über die Kernreaktion ¹⁴N(p, α)¹¹C im ¹⁴N-Target produziert. Die erzeugte ¹¹CO₂-Aktivität wird in einer mit dem flüssigen Argon gekühlten Schleife gesammelt und danach mit einem Stickstoffstrom innerhalb von 5 min zur Vorlage von 0.5 M Pentadecylmagnesiumbromid in Et₂O (0.5 mL) übergeleitet. Der Reaktionsabbruch erfolgt durch Zugabe 1 N TFA (1 mL). MeCN (1 mL) wurde addiert und das Reaktionsgemisch wird für 2 min auf 60°°C im schwachen Stickstoffstrom erhitzt. Die Reaktionsmatrix wird auf ca. 30°C abgekühlt, durch dem 0.4 μm Membranfilter filtriert und über eine automatisierte Injektionseinheit (Fluss-Detektor) auf ein semipräparatives Radio-HPLC-System (stationäre Phase: Luna C18(2), 250 × 10 mm, Phenomenex; mobile Phase: 90% CH₃CN/H₂O; Fluss: 6 ml/min; Radiodetektor und UV-Detektor (210 nm)) injiziert. Die Produktfraktion wird nach ca. 8 min durch Ventilschaltung isoliert und in eine Vorlage von 50 ml Wasser überführt. Im Anschluss erfolgt eine Festphasenextraktion mittels einer C-18 Kartusche (Sep-Pak light, C-18, Waters). Die Elution erfolgt mit 2 mL EtOH gefolgt von 20 ml isot. NaCl-Lösung. Die radiochemische Ausbeute bezogen auf das eingesetzte ¹¹C-CO₂ liegt zwischen 0.5–5%. Die Qualitätskontrolle der ¹¹C-Palmitinsäure erfolgt mittels des gleichen Radio-HPLC-Systems unter identischen chromatographischen Bedienungen (R_t = 8.3 min). Die Produktidentifikation erfolgt durch Vergleich der Retentionszeiten der Produkte mit denen der ”kalten” Palmitinsäure.
15-(4-^123/131I-Iodphenyl)-pentadecansäure: 15-(4-Iodphenyl)pentadecansäure (0.5 g, 1.13 mmol) wird in MeOH (50 mL) gelöst. Konzentrierte Schwefelsäure (1 mL) wird tropfenweise innerhalb 1 Minute zugegeben. Das Reaktionsgemisch wird für weitere 16 Std. unter Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsgemisch unter Vakuum auf ca. 20 mL konzentriert und mit Ether (70 mL) und 5% NaHCO₃ (50 mL) verdünnt. Die Etherlösung wird nacheinander mit 5% NaHCO₃ (50 mL), Wasser (3 × 20 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 20 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der organischen Phase wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Man erhält Methyl 15-(4-Iodphenyl)pentadecanoat (0.51 g, 99%) als gelben Feststoff.
Methyl 15-(4-Iodphenyl)pentadecanoat (0.2 g, 0.44 mmol) wird in wasserfreiem Toluol (10 mL) unter Argonatmosphäre gelöst. Bistributylzinn (0.43 mL, 0.49 g, 0.85 mmol) und Pd(PPh₃)₄ (10 mg, 8.7 μmol) werden nacheinander zugefügt und das Reaktionsgemisch wird für 3 Std. bei 110°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird Toluol unter vermindertem Druck abdestilliert. Der verbliebene Rückstand wird mittels Säulenchromatographie (an Kieselgel, mobile Phase: Hexan:Ether = 30:1) gereinigt. Man erhält Methyl 15-(4-Tributylzinnphenyl)pentadecanoat (0.12 g, 44%) als leicht gelbliches Öl.
Methyl 15-(4-Tributylzinnphenyl)pentadecanoat (0.12 g, 0.19 mmol) wird in Ethanol (4 mL) gelöst. 1 N NaOH Lösung (1 mL) wird addiert und das Reaktionsgemisch wird für 40 min bei 50°C gerührt. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsgemisch mit Ether (50 mL) und 1 N HCl (40 mL) verdünnt. Die organische Phase wird mit 1 N HCl (40 mL), Wasser (3 × 20 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 20 mL) gewaschen und über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der getrockneten Etherlösung wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Man erhält 15-(4-Tributylzinnphenyl)pentadecansäure (0.1 g, 85%) als farbloses Öl.
Zur Vorlage von Ethanol (20 μL) werden 15-(4-Tributylzinnphenyl)pentadecansäure (10 μL, 9 mg/mL in 60% MeOH), Essigsäure (20 μL) und n. c. a. ¹³¹I-NaI (10 μL in 0.05 N NaOH, 25 MBq) addiert. Durch Zugabe von Chloramin T Lösung (30 μL, 4 mg/mL in 60% MeOH) wird die Markierungsreaktion gestartet. Der Reaktionsabbruch erfolgt nach 5 min Reaktionszeit durch Zugabe einer gesättigten Methionin Lösung (60 μL). Danach werden EtOH (50 μL) und AcOH (50 μL) zugefügt. Der Reaktionsansatz wird mittels eines semipräparativen Radio-HPLC-Systems (stationäre Phase: LiChrospher 60 Select B 5 μ RP C-8; 250 × 10 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: 80% CH₃CN mit 0,1% TFA; Fluss: 4 mL/min; Radiodetektor und UV-Detektor (220 nm)) separiert. Die Produktfraktion mit einer Retentionszeit von 12.2–13.8 min wird per Ventilschaltung isoliert, mit Wasser (15 mL) verdünnt und per Festphasenextraktion (Sep-Pak light C-18, Waters) gereinigt. Nach Waschen der Kartusche mit Wasser (2 × 10 mL) wird das Produkt mit Ethanol (2 mL) eluiert. Die radiochemische Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Radioiod liegt zwischen 86–90%. Die Qualitätskontrolle der produzierten Radioiod-markierten Titelverbindung erfolgt mittels analytischer Radio-HPLC (stationäre Phase: LiChrospher Select B 5 μ, 250 × 4,6 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: 80% CH₃CN mit 0.1% TFA; Fluss: 1 mL/min; Radiodetektor und UV-Detektor (220 nm), R_t = 12.2 min). Die Produktidentifikation erfolgt durch Vergleich der Retentionszeiten des radiomarkierten Produktes mit der entsprechenden ”kalten” Standardverbindung. Die radiochemische Reinheit des Produktes beträgt > 99%.
¹⁸F-16-Fluorpalmitinsäure: ω-Pentadecalacton (5 g, 20.80 mmol) und (±)-10-Camphorsulfonsäure (1 g, 4.3 mmol) werden in trockenem Methanol (250 mL) gelöst. Das Reaktionsgemisch wird für 16 Std. unter Rückfluss gekocht. Nach dem Abkühlen wird das Reaktionsgemisch unter vermindertem Druck auf ca. 30 mL konzentriert und mit Ether (200 mL) und 5% NaHCO₃ (100 mL) verdünnt. Die organische Phase wird nacheinander mit 5% NaHCO₃ (50 mL), Wasser (3 × 20 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 20 mL) gewaschen. Die Etherlösung wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der organischen Phase wird das Lösungsmittel unter Vakuum abdestilliert. Man erhält Methyl 16-Hydroxypalmitat (5.1 g, 96%) als farblosen Feststoff.
Methyl 16-Hydroxypalmitat (4.0 g, 15.72 mmol) und Triethylamin (2.85 mL, 2.07 g, 20.44 mmol) werden in CH₂Cl₂ (100 mL) gelöst. Der Reaktionskolben wird im Eisbad gekühlt. Unter weiterer Kühlung und intensivem Rühren wird innerhalb von 3 Minuten Mesylchlorid (1.58 mL, 2.34 g, 20.44 mmol) zugetropft und das Reaktionsgemisch wird für weitere 3 Std. gerührt. Im Anschluss wird N,N-Dimethyltrimethylendiamin (1.29 mL, 1.02 g, 10 mmol) tropfenweise zugegeben. Nach etwa 1 Std. wird das Reaktionsgemisch auf Raumtemperatur erwärmt und mit Ether (500 mL) und 1 N NaHSO₄ (200 mL) verdünnt. Die Etherlösung wird abgetrennt und nacheinander mit 1 N NaHSO₄ (3 × 50 mL), 5% NaHCO₃ (3 × 50 mL) Wasser (3 × 50 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 20 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet, filtriert und aufkonzentriert. Der verbliebene Rückstand wird aus Ether/Pentan umkristallisiert. Man erhält Methyl 16-Methylsulfonyloxypalmitat (4.2 g, 80%) als farblosen Feststoff.
Zur Radiosynthese wird eine fernbedienbare Syntheseeinheit von Nuclear Interface (GE) verwendet. Das zyklotronproduziertes [¹⁸F]Fluorid wird auf einer konditionierten (10 ml 1 N NaHCO₃, 10 ml Wasser) Anionenaustauscherkartusche (Sep-Pak light, Accell Plus QMA, Waters) fixiert und damit von der [¹⁸O]Wasser-Matrix separiert. Es folgt die Elution des [¹⁸F]Fluorid mit 360 μl 0,066 M K₂CO₃ und anschließend 20 mg Kryptofix 2.2.2. in 1 ml Acetonitril. Durch die nachfolgende 6 minütige azeotrope Destillation unter Vakuum (ca. 6 mbar) bis zur Trockne bei zunächst 95°C und später 100°C wird das Radionuklid für die Markierungsreaktion aktiviert. Die Radiomarkierung gelingt durch Zugabe von Methyl 16-Methylsulfonyloxypalmitat (8 mg) in Acetonitril (1 ml) und unter Umsetzung bei 85°C für 10 min. Man erhält das entschützte Produkt im Anschluss durch Hydrolyse der Methylestergruppe für 10 min bei 80°C nach Zugabe von 1 N NaOH (400 μl). Die Reaktionsmatrix wird auf 30°C abgekühlt und mit dem HPLC-Eluent (2 ml, 65% Acetonitril) und Essigsäure (300 μl) versetzt. Das neutralisierte und verdünnte Reaktionsgemisch wird mit Hilfe einer Al₂O₃-Kartusche (Sep-Pak light, Alumina N, Waters) von nicht umgesetztem [¹⁸F]Fluorid befreit und über eine automatisierte Injektionseinheit (Fluss-Detektor) auf ein semipräparatives Radio-HPLC-System (stationäre Phase: LiChrospher Select B 5 μ, 250 × 10 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: 70% CH₃CN/H₂O; Fluss: 5 ml/min; Radiodetektor und UV-Detektor (210 nm)) injiziert. Die Produktfraktion wird nach ca. 13 min durch Ventilschaltung isoliert und in eine Vorlage von 50 ml Wasser überführt. Im Anschluss erfolgt eine Festphasenextraktion mittels einer C-18 Kartusche (Sep-Pak light, C-18, Waters). Die Elution erfolgt mit 1 mL EtOH gefolgt von 10 ml isot. NaCl-Lösung. Ausgehend von ca. 45 GBq[¹⁸F]Fluorid werden ca. 4–6 GBq Produkt mit einer radiochemische Reinheit > 95% innerhalb von 65 min erhalten. Die Qualitätskontrolle der produzierten Fluor-18 markierten Fettsäuren erfolgt mittels des gleichen Radio-HPLC-Systems unter identischen chromatographischen Bedienungen (R_t = 13.3 min). Die Produktidentifikation erfolgt durch Vergleich der Retentionszeiten der Produkte mit denen der entsprechenden ”kalten” Standardverbindungen.
^123/131I-(E/Z)-15-Iodpentadec-14-ensäure und (E/Z)-13-¹³¹-I-Iodtridec-12-ensäure: Tridecynyl-12-ol-1 (4.95 g, 29.71 mmol), Ph₃P (11.69 g, 44.57 mmol) und Imidazol (3.034 g, 44.57 mmol) werden in THF (50 mL) unter Argonatmosphäre und Eiskühlung gelöst. Jod (10.406 g, 41.0 mmol) gelöst in THF (20 mL) wird tropfenweise innerhalb von 20 Minuten beigefügt. Das Reaktionsgemisch wird 2 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Im Anschluss wird innerhalb 2 Minuten tropfenweise gesättigte Na₂S₂O₃ Lösung (3 mL) zugegeben. Man trocknet das Reaktionsgemisch über Magnesiumsulfat. Der erhaltene Rückstand wird mit Pentan (20 × 50 mL) extrahiert. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abdestilliert und der Rückstand mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (mobile Phase: Petrolether 40/60) gereinigt. Man erhält 13-Iodtridecyn-1 (6.4 g, 93%) als farblose Flüssigkeit.
NaH (0.92 g, 22.86 mmol; 60%ige Suspension in Paraffinöl) wird in Tetrahydrofuran (50 mL) unter Argonatmosphäre suspendiert und bei Raumtemperatur gerührt. Innerhalb von 3 Minuten wird tropfenweise Dimethylmalonat (2.62 mL, 3.02 g, 22.86 mmol) zugegeben (exothermische Reaktion, Gasentwicklung). Das Reaktionsgemisch wird für 5 min gerührt. im Anschluss werden nacheinander 13-Iodtridecyn-1 (4.0 g, 13.06 mmol) und DMSO (50 mL) addiert und das Reaktionsgemisch für weitere 20 Stunden gerührt. THF wird unter vermindertem Druck abdestilliert. Der verbleibende Rückstand wird mit 1 M KHSO₄ (25 mL) und Wasser (500 mL) verdünnt. Die entstehende Emulsion wird mit Pentan (400 mL) extrahiert. Die Pentanlösung wird nacheinander mit 1 M KHSO₄ (50 mL), Wasser (5 × 100 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (50 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der getrockneten organischen Phase wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der verbleibende Rückstand wird mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (mobile Phase: Petrolether 40/60:Aceton = 10:1) gereinigt. Man erhält Dimethyl-2-tridec-12-ynylmalonat (3.25 g, 80%) als farbloses Öl, das sich langsam als farbloser Feststoff auskristallisiert.
Dimethyl-2-tridec-12-ynylmalonat (1.0 g, 3.22 mmol), NaCl (0.35 g, 5.99 mmol) und Wasser (0.32 mL, 0.32 g, 17.76 mmol) werden in DMSO (5.1 mL) unter Argonatmosphäre gelöst und anschließend 3 Std. bei 175°C gerührt. Nach Abkühlung des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur wird Pentan (100 mL) zugefügt. Die Pentanlösung wird nacheinander mit Wasser (6 × 50 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 10 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der organischen Phase wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der verbleibende Rückstand wird mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (mobile Phase: Hexan:Aceton = 20:1) gereinigt. Man erhält Methyl Pentadec-14-enoat (0.7 g, 86%) als farblosen Feststoff.
Methyl Pentadec-14-enoat (0.7 g, 2.77 mmol), Tributylstannan (1.03 mL, 1.13 g, 3.88 mmol) wird mit AIBN (15 mg) in Toluol (10 mL) unter Argonatmosphäre gelöst. Die Lösung wird sorgfältig entgast, innerhalb von 20 min auf 80°C erhitzt und anschließend für 2 Stunden bei 80°C gerührt. Nach Abkühlung des Reaktionsgemisches auf Raumtemperatur wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck abdestilliert. Der erhaltene Rückstand wird mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (0.1% CaO) (mobile Phase: Petrolether 40/60:Aceton = 30:1) zwei Mal gereinigt. Man erhält Methyl 15-Tributylzinnpentadecanoat (0.61 g, 40%) als E/Z-Isomerengemisch (30:70) als farbloses Öl.
Zur Vorlage von Ethanol (20 μL) werden Methyl 15-Tributylzinnpentadecanoat (2 μL, 10.09 mg/mL in MeOH), Essigsäure (1 μL) und n. c. a. ¹³¹I-NaI (5 μL in 0.05 N NaOH, 197 MBq) addiert. Durch Zugabe von Chloramin T Lösung (5 μL, 4 mg/mL in 66% MeOH) wird die Markierungsreaktion gestartet. Der Reaktionsabbruch erfolgt nach 3 min Reaktionszeit durch Zugabe einer gesättigten Methionin Lösung (10 μL). Danach wird EtOH (180 μL) zugefügt. 1 N NaOH (50 μL) wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch wird für 25 min auf 80°C erhitzt. Der Reaktionsabbruch erfolgt durch Zugabe 33% MeCN (0.75 mL, 0.1% TFA). Der Reaktionsansatz wird mittels eines semipräparativen Radio-HPLC-Systems (stationäre Phase: LiChrospher 60 Select B 5 μ RP C-8; 250 × 10 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: Gradient: H₂O (0.1% TFA), 5 min; 0 → 80% CH₃CN (0,1% TFA), 10 min, 80% CH₃CN (0,1% TFA), 20 min; Fluss: 4 mL/min; Radiodetektor und UV-Detektor (220 nm)) separiert. Die Produktfraktion mit einer Retentionszeit 18.0–49.6 min wird per Ventilschaltung isoliert, mit Wasser (15 mL) verdünnt und per Festphasenextraktion (Sep-Pak light C-18, Waters) gereinigt. Nach Waschen der Kartusche mit Wasser (2 × 10 mL) wird das Produkt mit Ethanol (2 mL) eluiert. Die radiochemische Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Radioiod liegt zwischen 30–35%. Die Qualitätskontrolle der produzierten Radioiod-markierten Titelverbindung erfolgt mittels analytischer Radio-HPLC (stationäre Phase: LiChrospher Select B 5 μ, 250 × 4 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: H₂O (0.1% TFA), 5 min; 0 → 80% CH₃CN (0,1% TFA), 10 min, 80% CH₃CN (0,1% TFA), 20 min; Fluss: 1 mL/min; Radiodetektor und UV-Detektor (220 nm), R_t = 17.0 min). Die Produktidentifikation erfolgt durch Vergleich der Retentionszeiten des radiomarkierten Produktes mit der entsprechenden ”kalten” Standardverbindung. Die radiochemische Reinheit des Produktes beträgt > 96%.
(E)-13-^131/123I-Iod-2-methylentridec-12-ensäure: Undec-11-ynsäure (3.2 g, 27.18 mmol), Meldrumsäure (2.61 g, 18.08 mmol) und DMAP (3.32 g, 27.18 mmol) werden in trockenem CH₂Cl₂ (100 mL) gelöst. Der Reaktionskolben wird auf –20°C gekühlt. DCC (3.73 g, 18.08 mmol) wird addiert und Reaktionsgemisch innerhalb von 1 Std. auf 0–4°C erwärmt. Nach dem 16 Std. bei 4°C wird das weiße Präzipitat (DCU) von dem Reaktionsgemisch abfiltriert. Die Dichlormethanlösung wird nacheinander mit 1 M KHSO₄ (6 × 100 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 50 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet und filtriert. Die Dichlormethanlösung wird auf 0–4°C gekühlt und AcOH (16 mL) wird zugesetzt. NaBH₄ (1.64 g, 43.35 mmol) wird innerhalb von 15 min addiert und das Reaktionsgemisch wird für 1 Std. bei gleicher Temperatur gerührt. AcOH (16 mL) und NaBH₄ (1.64 g, 43.35 mmol, innerhalb von 15 min) werden nacheinander zugefügt, das Reaktionsgemisch wird für weitere 16 Std. bei 4°C gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft. Der verbleibende Rückstand wird in Ether gelöst (300 mL). Die Etherlösung wird nacheinander mit Wasser (3 × 100 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 50 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der Lösung wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Der Rückstand wird mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (zwei Mal: mobile Phase: EtOAc:Hexan = 1:5 und EtOAc:Hexan:CH₂Cl₂ = 1:5:6) gereinigt. Das Rohprodukt wird anschließend zwei Mal aus EtOAc/Hexan umkristallisiert. Man erhält 2,2-Dimethyl-5-undec-10-ynyl-[1,3]dioxane-4,6-dion (2.8 g, 54%) als farblosen Feststoff.
2,2-Dimethyl-5-undec-10-ynyl-[1,3]dioxane-4,6-dion (2.037 g, 6.92 mmol) und Dimethylmethylenimmoniumiodid (3.2 g, 17.3 mmol) werden in trockenem Methanol (20 mL) unter Argonatmosphäre gelöst und das Reaktionsgemisch wird Übernacht unter Rückfluss erhitzt. Methanol wird unter vermindertem Druck entfernt. Der verbleibende Rückstand wird in Ether (100 mL) gelöst. Die Etherlösung wird nacheinander mit 1 N KHSO₄ (2 × 50 mL) Wasser (3 × 50 mL) und einer gesättigten Kochsalzlösung (2 × 50 mL) gewaschen. Die organische Phase wird über Magnesiumsulfat getrocknet. Nach Filtration der Lösung wird das Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt. Man erhält Methyl 2-Methylentridec-12-ynoat (1.5 g, 98%) als farblose Flüssigkeit.
Pd(PPh₃)₂Cl₂ (32 mg, 45.6 μmol) wird in einer Lösung von Methyl 2-Methylentridec-12-ynoat (0.50 g, 2.25 mmol) in THF (10 mL) unter Argonatmosphäre suspendiert. Unter starkem Rühren wird Bu₃SnH (0.726 mL, 0.786 g, 2.70 mmol) tropfenweise innerhalb von 2 min addiert und das Reaktionsgemisch wird für weitere 10 min gerührt. Das Lösungsmittel wird unter vermindertem Druck abgedampft und der verbliebene Rückstand wird mittels Säulenchromatographie an Kieselgel (mobile Phase: EtOAc:Hexan = 1:15) gereinigt. Man erhält Methyl 2-Methylentributyltintridec-12-enoat (0.74 g, 64%) als 13E/12-Isomerengemisch (60:40) als farbloses Öl.
Zur Vorlage von Ethanol (20 μL) werden Methyl 2-Methylen-13E/12-tributyltintridec-12-enoat (10 μL, 9.44 mg/mL in 60% MeOH, 0.184 μmol), Essigsäure (1 μL) und n. c. a. ¹³¹I-NaI (10 μL in 0.05 M NaOH; 90 MBq) addiert. Durch Zugabe von Chloramin T Lösung (30 μL, 4 mg/mL solution in 60% MeOH, 0.53 μmol) wird die Markierungsreaktion gestartet. Der Reaktionsabbruch erfolgt nach 3 min Reaktionszeit durch Zugabe einer gesättigten Methionin Lösung (80 μL). Danach wird EtOH (200 μL) zugefügt. 1 N NaOH (1 mL) wird zugesetzt und das Reaktionsgemisch wird für 25 min auf 80°C erhitzt. Der Reaktionsabbruch erfolgt durch Zugabe AcOH (70 μL). Der Reaktionsansatz wird mittels eines semipräparativen Radio-HPLC-Systems (stationäre Phase: LiChrospher 60 Select B 5 μ RP C-8; 250 × 10 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: 70% CH₃CN (0,1% TFA); Fluss: 4 mL/min; Radiodetektor und UV-Detektor (220 nm)) separiert. Die Produktfraktion mit einer Retentionszeit 11.0–12.9 min wird per Ventilschaltung isoliert, mit Wasser (15 mL) verdünnt und per Festphasenextraktion (Sep-Pak light C-18, Waters) gereinigt. Nach Waschen der Kartusche mit Wasser (2 × 10 mL) wird das Produkt mit Ethanol (2 mL) eluiert.
Die radiochemische Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Radioiod liegt zwischen 50–58%. Die Qualitätskontrolle der produzierten Radioiod-markierten Titelverbindung erfolgt mittels analytischer Radio-HPLC (stationäre Phase: LiChrospher Select B 5 μ, 250 × 4 mm, Chromatographie Service; mobile Phase: 80% CH₃CN (0,1% TFA); Fluss: 1 mL/min; Radiodetektor und UV-Detektor (220 nm), R_t = 6.5 min). Die Produktidentifikation erfolgt durch Vergleich der Retentionszeiten des radiomarkierten Produktes mit der entsprechenden ”kalten” Standardverbindung. Die radiochemische Reinheit des Produktes beträgt > 99%.
1.3 Aufnahme der Fettsäuren in verschiedene Prostatakarzinomzellen in vitro
5 × 10⁵ der jeweiligen Zellen wurden in 12 Vertiefungen-Platten 24. Stunden vor Versuchsbeginn ausplattiert. Die Zellen wurden in für den Zelltyp geeigneten Medien (1 ml/Vertiefung) bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank kultiviert. Eine Stunde vor Zugabe der Aktivität erfolgte der Mediumswechsel (900 μl/well). Das Medium enthielt 3 μg fettfreie Albumine/Vertiefung. Bei C-14 markierten Fettsäuren bzw. C-14 Azetat wurden ca. 20 kBq/100 μl/Vertiefung markiertes Substrat der Vertiefung zugesetzt und gemischt. Die Inkubation erfolgte für 2 und 24 Stunden bei 37°C und 5% CO₂ im Brutschrank. Nach der Inkubationszeit wurde das Medium vorsichtig abgenommen und die Zellen zweimal mit PBS vorsichtig gewaschen. Der abgenommene Überstand und beide Waschschritte wurden zur Bestimmung der nicht aufgenommenen Aktivität in ein Messgefäß überführt. Die Zellen wurden durch Zugabe von 1 ml 1 M NaOH abgelöst und zur Bestimmung der aufgenommenen Aktivität in ein Messgefäß (10 ml) überführt. Die wells wurden abschließend mit 1 ml 1 M HCl gewaschen. Zur Bestimmung der in den wells verbliebenen Aktivität wurde der letzte Waschschritt in ein Messgefäß überführt. In alle Proben wurden 10 ml Szintillationsflüssigkeit (Ultima Gold, Perkin Elmer, No. 6013329) gegeben. Nach 2 Stunden wurden die Proben im Flüssigkeitsszintillationszähler (Tri-Carb 2800 TR, Perkin Elmer) zusammen mit geeigneten Standards gemessen. Die Aktivität wurde in der applizierten Dosis pro 5 × 10⁵ Zellen bestimmt. Die zelluläre Aufnahme von C-11, F-18 markierten und I-131 bzw. I-123 markierten Fettsäuren wurde nach gleichem Protokoll untersucht. Die Messung der Radioaktivität wurde bei diesen Experimenten im Gammazähler (Cobra 2, GE Healthcare/Packard Instruments) durchgeführt.
1.4 Western-Blot-Analyse zur Expression der Fettsäuresynthase
Zur Untersuchung der Expression des Fettsäuresynthasekomplexes FAS in den den jeweiligen Zelllinien wurden die Zellen mittels des RIPA-Puffers (50 mM IRIS-HCl, pH 7.4, 300 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1% NP-40, 1 mM PMSF, Complete Protease Inhibitor Cocktail von Roche) lysiert. Nach Bestimmung der Proteinkonzentration (mittels Bradford Reagenz, Sigma Aldrich) wurden die gewonnenen Zelllysate in einem 1:1-Verhältnis mit dem Laemmli Probenpuffer (2% SDS, 25% Glycerol, 0.01% Bromophenol Blau und 5% β-Mercaptomethanol) vermischt und für 3 min bei 95°C denaturiert. Je 50 μg Protein/Tasche wurden auf das TRIS-HCl-Gel (5%) aufgetragen. Die nach der Gelelektrophorese (2 h bei 100 V) aufgetrennten Proteine wurden auf eine Polyvinylidenfluorid (PVDF) Membran (PALL, Dreieich, Deutschland) mit einem Semi-Dry-Transfer-System (Bio-Rad Labolatories, München) geblottet. Das FAS wurde mit Hilfe eines FAS-spezifischen Antikörpers (Cell Signaling, Kaninchen anti-FAS, Verdünnung 1:1000 in TBS mit 5% Milchpulver und 0,1% Tween-20, Inkubation über Nacht bei 4°C) detektiert. Als Kontrolle wurde der monoklonale Antikörper gegen das Haushaltsantigen Glyceraldehyd-3-phosphatdehydrogenase (Ambion, Maus anti-GAPDH, Verdünnung 1:5000 in TBS mit 5% Milchpulver und 0,1% Tween-20, Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur) verwendet. Zum Nachweis der Antikörperbindung dienten die mit Meerrettich-Peroxidase markierten Anti-Kanincheßn- bzw. Anti-Maus-Antikörper und das ECL-Substrat (ECL Plus Western Blotting, Amersham Biosciences) auf einem ECL Hyperfilm (Amersham Biosciences).
1.5 Immunfluoreszenzanalyse zur Expression der Fettsäuresynthase
TRAMP-Mäuse wurden kommerziell erworben (Jackson Labolatory). Die TRAMP-Mäuse wurden durch Verpaarung der hemizygoten Weibchen mit den Wildtyp-Männchen gezüchtet. Das entstehende männliche F1-Nachkommen wurde anschließend hinsichtlich der transgenen SV40-Tag-Expression mittels PCR-basierender Genotypisierung getestet. Hierfür wird aus den Zellen der entnommenen Schwanzspitze mit Hilfe des DNeasy Blood & Tissue Kits (Qiagen) die genomische DNA isoliert. Das SV40-Tag wird mittels spezifischen Primer-Sets in einer PCR Analyse nachgewiesen. Das amplifizierte SV40-Tag wird mittels einer DNA Gelelektrophorese (1,5% TBE-Gel) und Ethidiumbromid Färbung nachgewiesen.
Männliche TRAMP-Mäuse entwickeln ein progressives Androgensensitives Prostatakarzinom. Im Alter von ca. 6 Wochen entwickeln diese Tiere eine low-grade intraepitheliale Neoplasie (PIN), die sich im Alter von 12 Wochen zu einer high-grade PIN weiterentwickelt. Fokale Adenome sind nach ca. 12–18 Wochen nachweisbar. Ein progressives, metastasiertes Prostatakarzinom entwickelt sich im Alter von 24–30 Wochen. Häufigste Metastasierungsorte sind Lymphknoten, Leber, Lungen und seltener Knochen, Nieren und Nebennieren. Ab dem Alter von 12 Wochen ist die FAS-Expression in den sich entwickelnden Tumormanifestationen der Prostata deutlich gesteigert. Demgegenüber ist in der normalen Prostata die FAS-Expression ausgesprochen niedrig. Die FAS-Expression steigt mit zunehmendem Alter, Tumorprogression und metastatischer Tumorerkrankung an und ist auch in den Metastasen nachweisbar.
Die Expression des FAS-Komplexes wurde in den PCa-Zelllinien LNCaP, Du145, PC3 und LNCaP-C4-2 untersucht. Hierfür wurden 2·10^5 Zellen pro Deckgläschen 24 h vor Versuchsbeginn ausplattiert und bei 37°C und 5% CO₂ inkubiert. Nach Waschen mit 1 ml PBS/Vertiefung erfolgte die Fixierung mit 4%igem PFA (Paraformaldehyd) für 15 min bei Raumtemperatur. Nach 3-maligem Waschen mit 500 μl kaltem PBS erfolgte die Permeabilisierung der Zellmembran in eiskaltem Methanol für 10 min bei –20°C. Nach erneutem Waschen mit kaltem PBS wurden die Zellen in 5% Ziegenserum für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Nach Abziehen des Ziegenserums erfolgte die Inkubation mit 200 μl eines polyklonalen FAS-spezifischen Antikörpers (cell signalling, Kaninchen-Anti-FAS, Verdünnung 1:50 in PBS) über Nacht bei 4°C. Nach 3maligem Waschen in kaltem PBS erfolgte die Inkubation mit dem sekundären Ziege-Anti-Kaninchen-Cy3-markiertem Antikörper (Dianova, Verdünnung 1:75 in PBS) für 60 min bei Raumtemperatur. Nach 3-maligem Waschen mit jeweils 1 ml PBS erfolgt die Gegenfärbung mit Hoechst (1 μg/ml). Die Präparate wurden erneut 3mal mit PBS gewaschen und mit Vectrashield-Medium eingebettet.
1.6 Analyse zur Biodistribution von ¹⁴C-Palmitinsäure
Eine Million LNCaP-C4-2 Prostatakarzinomzellen wurden in 200 μl einer 1:1-Mischung aus RPMI-Zellkulturmedium:Matrigel-Basement-Membrarte-Matrix, (BD Biosciences) SCID-Mäusen (C.B17/Icr-Prkdc^SCID/Crl, Charles River) subkutan über der rechten bzw. linken Flanke injiziert. Nach ca. 14 Tagen entwickelte sich ein gut palpabler subkutaner Tumorknoten. Die Tiere wurden für die Biodistributionsstudie mit C-14-Palmitinsäure eingesetzt, wenn die Knötchen einen Durchmesser von ca. 1 mm aufwiesen.
Zur Bestimmung der tumoralen C-14-Palmitinsäure-Anreicherung und Biodistribution in den in diesem Kontext wichtigsten parenchymatösen Organen wurden ca. 100 kBq C-14 Palmitinsäure in 200 μl 0.9% NaCl i. v. in eine Schwanzvene injiziert. Vor der C-14-Palmitinsäure-Injektion wurden die Tiere einer Rompun-Narkose in einer Dosierung von 16 mg/kg Rompun (200 μl i. p) unterzogen. Es wurde die C-14-Aktivität im Myokard, in der Leber, Niere, Muskel, Prostata und im Tumorgewebe in % der applizierten Dosis/Gramm Gewebe bestimmt. Die entnommenen Proben wurden in 2 ml von einem Gewebelöser Solvable über Nacht bei 60°C inkubiert. Zu vollständig gelösten Proben wurden 10 ml Ultima Gold hinzugegeben und ca. 2 Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Die Messung erfolgte im Flüssigkeitsszintillationszähler (Tri-Carb 2800 TR,, Perkin Elmer).
1.7 Immunhistologische Analyse zur Expression der Fettsäuresynthase
Gewebsschnitte von Karzinomgewebe der Prostata wurden in Xylol entparaffiniert. Danach wurde mit einer absteigenden Alkoholreihe entwässert (100%, 95%, 70%, 50%). Durch die anschließende Inkubation der Präparate im Citratpuffer, pH 6.0 für 10 Minuten bei 95–99°C erfolgte die Freilegung des Antigens. Nach Abkühlen auf Raumtemperatur wurde mit destilliertem Wasser 3mal gewaschen und zur Blockierung der endogenen Peroxidase-Aktivität für 10 Minuten mit 3%igem H₂O₂ inkubiert. Nach erneutem Waschen mit Aquadest wurde 3mal für 5 Minuten in TEST (150 mM NaCl, 20 mM TRIS-HCl pH 7.5, 0.1% Tween 20) inkubiert. Danach wurde mit 5%igem Ziegenserum/TEST eine Stunde bei Raumtemperatur blockiert. Es erfolgte die Inkubation mit 70–100 μl FAS-Antikörper (cell signalling, Kaninchen-Anti-FAS, Verdünnung 1:50 in PBS) über Nacht bei 4°C. Die Präparate wurden im TEST (TBS/0,1% Tween 20) für 5 Minuten gewaschen und mit dem sekundären Anti-Kaninchen DAKO EN VISION Peroxidase-Konjugat für 30 Minuten in einer feuchten Kammer inkubiert. Zur Detektion der Bindung wurden die Schnitte mit dem Chromogen DAB (3,3'-Diaminobenzidin von DAKO) für 10 min bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde mit H₂O gestoppt. Abschließend wurden die Präparate mit Hämalaun gegengefärbt, mit Leitungswasser gebläut und mit Glyceringelatine (vorgewärmt auf 71° Celsius) eingebettet.
2. Ergebnisse
2.1 Untersuchte radiomarkierte Fettsäuren
Die Strukturformeln der untersuchten radiomarkierten Fettsäuren sind in 1 dargestellt. (A) 1-¹⁴C-Hexadekansäure (1-¹⁴C-Palmitinsäure), (B) 1-¹¹C-Hexadekansäure (1-¹¹C-Palmitinsäure) (C) 1¹⁴C-Tetradekansäure (1¹⁴C-Myristinsäure), (D) 16-¹⁸F-Fluorhexadekansäure (16-¹⁸F-Palmitinsäure), (E) 15(4-¹³¹I-Iodphenyl)-Pentadekansäure, (F) (E/Z)-13-¹³¹I-Iodtridec-l2-ensäure, (G) (E/Z)-15-¹³¹I-Iodpentadec-14-ensäure, (H) (E)-13-¹³¹I-Iod-2-methylentridec-12-ensäure.
2.2 Zelluläre Aufnahme der Fettsäuren in verschiedene Karzinomzelllinien in vitro
Die Erfinder haben in verschiedenen Ansätzen untersucht, in welchem Maße Karzinomzelllinien die synthetisierten Fettsäuren aufnehmen können und somit durch diese zielgerichtet markiert werden können. Maß für die zelluläre Aufnahme der radiomarkierten Fettsäure ist der prozentuelle Anteil der zum Nährmedium zugegebenen Radioaktivitätsmenge, normiert auf die angegebene Zellzahl [%-ID (5e5 Zellen)].
Die Erfinder konnten dabei nachweisen, dass ¹⁴C-markierte Palmitinsäure nach zwei und vierundzwanzig Stunden signifikant in Zellen verschiedener Prostatakarzinomzelllinien aufgenommen werden. In TRAMP-Zellen zeigte sich eine besonders starke Aufnahme der Fettsäure. Die diesbezüglich erhaltenen Daten sind mit einem Faktor 5 zu multiplizieren (*); vgl. 2a und 2b. Da die Markierung mit ¹⁴C das Fettsäuremolekül in seiner chemischen Struktur nicht verändert, können diese Ergebnisse direkt auf ¹¹C-markierte Fettsäuren übertragen werden.
Die Erfinder konnten bestätigen, dass auch ¹¹C-markierte Palmitinsäure nach zehn Minuten und nach einer Stunde signifikant in Zellen verschiedener Prostatakarzinomzelllinien aufgenommen wird; vgl. 3.
Ein entsprechendes Ergebnis konnten die Erfinder für ¹⁸F-markierte Palmitinsäure nach ein- und vierstündiger Inkubation beobachten; vgl. 4.
In einem weiteren Experiment wurden die Zellen der verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien zunächst mit C75, einem Inhibitor der endogenen Fettsäuresynthes, für 18 Stunden vorbehandelt und anschließend die zelluläre Aufnahme von ¹⁴C-Myristinsäure untersucht. Dabei zeigte sich eine konsistent hohe ¹⁴C-Myristinsäureaufnahme in die Prostatakarzinomzelleln, so dass auch bei inhibierter endogenen Fettsäuresynthese die exogene Fettsäureaufnahme unbeeinflusst bleibt. Das Ergebnis ist in 5 dargestellt.
Als nächstes wurde die Aufnahme von (E/Z)-13-I-131 Jodtridec-12-ensäure in DU145-Zellen (6a), LNCaP-Zellen (6b), in PC3-Zellen (6c) ohne und mit 300 μmol Caprylsäure, einem Inhibitor der (Alpha-methylacyl-CoA racemase) AMACR, in einer die AMACR inhibierenden Konzentration, untersucht. Es wurde nachgewiesen, dass Inhibition der AMACR die Aufnahme von (E/Z)-13-I-131 Jodtridec-12-ensäure nicht beeinträchtigt.
In 7 ist die Aufnahme von 15-(4-¹³¹1-Iodphenyl)-Pentadecansäure, einer terminal substituierten Fettsäure, in Zellen verschiedener Prostatakarzinomzelllinien nach jeweils ein-, vier- und vierundzwanzigstündiger Inkubation dargestellt. Auch diese Fettsäure wird signifikant in die verschiedenen Karzinomzelllinien aufgenommen.
In einem weiteren Experiment wurde die Aufnahme von (E)-13-¹³¹I-Iod-2-methytridec-l2-ensäure in Zellen verschiedener Prostatakarzinomzelllinien nach zwei- und vierundzwanzigstündiger Inkubation untersucht. Das Ergebnis ist in 8 gezeigt. Auch hier konnte beobachtet werden, dass die Fettsäure signifikant in die Tumorzellen aufgenommen wird.
2.3 Zelluläre Aufnahme der Tracer aus dem Stand der Technik in verschiedene Karzinomzelllinien
In einem nächsten Experiment wurde im Vergleich zu den vorherigen Experimenten die Aufnahme der beiden derzeit am häufigsten in der funktionellen Bildgebung des Prostatakarzinoms eingesetzten Biomarker, das ¹¹C-Cholin (¹¹C-Cho) und die ¹⁸F-Desoxyglukose (¹⁸F-FDG), in Zellen verschiedener Prostatazelllinien untersucht. Das Ergebnis ist in 9 dargestellt. Dabei zeigt sich, dass diese derzeit eingesetzten Biomarker im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Fettsäuren deutlich schlechter in die Tumorzellen aufgenommen werden. Die Aufnahme dieser Biomarker ist im Vergleich zu den erfindungsgemäßen Fettsäuren um ein bis zwei Zehnerpotenzen niedriger.
2.4 Expression des Fettsäuresynthasekomplexes (FASN) in Karzinomzelllinien
In einem weiteren Experiment wurde mittels Western-Blot-Analyse untersucht, wie sich das Expressionsniveau des Fettsäuresynthasekomplexes (FASN) in verschiedenen Prostatakarzinomzelllinien darstellt. Das Ergebnis ist in 10 gezeigt. Dabei zeigt sich in den untersuchten Zelllinien eine besonders starke Expression von FASN.
In einem weiteren Experiment wurde die Expression des FASN in den Prostatakarzinomzelllinien Du 145, PC-3, LNCaP und LNCaP-C4-2 mittels Immunfluoreszenzanalyse untersucht. Das Ergebnis ist in 11 dargestellt. Diese Ergebnisse bestätigen die Ergebnisse aus der Western-Blot-Analyse. Sämtliche untersuchten Prostatakarzinomzelllinien zeigen eine starke Expression der Fettsäuresynthase. C = Negativkontrolle; die Aufnahmen wurden 20-fach vergrößert (20 x); der Maßstabsbalken entspricht 100 μm.
In einem weiteren Experiment wurde die FASN-Expression in neoplastischen Epithelien von Patienten mit einem Adeno-Karzinom der Prostata anhand von entsprechendem Biopsiematerial untersucht. Das Ergebnis ist in 13 dargestellt. Auch dieses Experiment bestätigt eine sehr starke Expression der FAS in den untersuchten neoplastischen Epithelien; α-FAS = Antikörper gegen die Fettsäuresynthase, CS = ”cell signalling”, C = negative Kontrolle, HE = Hämatoxylin-Eosin-Färbung
2.5 Biodistribution der Fettsäuren in vivo
Im subkutanen LNCap-C-4-2SCID-Mausmodell des Prostatakarzinoms, einem in vivo-Modell, wurde untersucht, in welchen Organen bzw. Geweben sich die erfindungsgemäße Fettsäure akkumuliert. Die Mäuse wurden zwischen 15 und 60 min nach der Injektion der Fettsäure untersucht. Das Ergebnis dieser Untersuchung, in der beispielhaft die ¹⁴C-markierte Palmitinsäure verwendet wurde, ist in
12 gezeigt. Dabei zeigt sich, dass die ¹⁴C-markierte Palmitinsäure hochspezifisch und selektiv in die Zellen des Prostatakarzinoms aufgenommen wird. Alle anderen untersuchten Organe zeigen, mit Aufnahme der Leber und der Prostata kaum oder keinerlei Aufnahme der Fettsäure. Die Erfinder konnten die oben unter 2.2 dargestellten in vitro erzielten Ergebnisse bestätigen. Spur 1 = Blut, Spur 2 = Herz, Spur 3 = Lunge, Spur 4 = Leber, Spur 5 = Milz, Spur 6 = Niere, Spur 7 = Dickdarm, Spur 8 = Dünndarm, Spur 9 = Magen, Spur 10 = Muskel, Spur 11 = Wirbelkörper, Spur 12 = Knochen, Spur 13 = Prostata und Spur 14 = Tumor; M = Maus; OM = gemessene Organmasse.
Da die Markierung mit ¹⁴C das Fettsäuremolekül in seiner chemischen Struktur nicht verändert, können auch diese Ergebnisse direkt auf ¹¹C-markierte Fettsäuren übertragen werden.
3. Fazit
Die Erfinder haben verschiedene radioaktiv markierte Fettsäuren und die derzeit am häufigsten verwendeten Substanzen zum Nachweis des Prostatakarzinoms, das ¹¹C-Cholin (¹¹C-Cho) und die ¹⁸F-Desoxyglukose (¹⁸F-FDG), hinsichtlich ihrer Eignung zur therapeutischen und diagnostischen Behandlung einer Krebserkrankung, wie beispielsweise dem Prostatakarzinom, miteinander verglichen. Die Untersuchungen wurden in vitro an verschiedenen Tumorzelllinien, aber auch in in vivo an einem allgemein anerkannten Mausmodell durchgeführt. Den Erfindern gelang es dabei nachzuweisen, dass die Fettsäuren um ein Vielfaches besser, selektiver und spezifischer als die derzeit verwendeten Substanzen in die Tumorzellen aufgenommen werden und deshalb für die diagnostische und therapeutische Behandlung einer Krebserkrankung besonders geeignet sind.
ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

WO 2009/109798 [0010, 0016]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Bauer et al. (1999), Lehrbuch der pharmazeutischen Technologie, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft mbH Stuttgart [0047]
Kibbe et al. (2000), Handbook of pharmaceutical excipients, American Pharmaceutical Association and Pharmaceutical Press [0047]

Claims

Verwendung einer Fettsäure zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Krebserkrankung.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure eine mittel-(C₇ bis C₁₃) und/oder langkettige Fettsäure (> C₁₃) ist.
Verwendung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure eine gerad- und/oder ungeradzahlige Fettsäure ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure eine gesättigte und/oder ungesättigte Fettsäure ist.
Verwendung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Önanthsäure (Heptansäure; C₇), Caprylsäure (Octansäure; C₈), Pelargonsäure (Nonansäure; C₉), Caprinsäure (Decansäure; C₁₀), Undecansäure (C₁₁), Laurinsäure (Dodecansäure; C₁₂), Tridecansäure (C₁₃), Myristinsäure (Tetradecansäure; C₁₄), Pentadecansäure (C₁₅), Palmitinsäure (Hexadecansäure; C₁₆), Margarinsäure (Heptadecansäure; C₁₇), Stearinsäure (Octadecansäure; C₁₈), Nonadecansäure (C₁₉), Arachinsäure (Eicosansäure; C₂₀), Behensäure (Docosansäure; C₂₂), Lignocerinsäure (Tetracosansäure; C₂₄).
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure einen detektierbaren Marker aufweist.
Verwendung nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass der detektierbare Marker ein radioaktiver Marker ist.
Verwendung nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass der radioaktive Marker ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: ¹¹C, ¹⁴C, ¹⁸F, ⁶⁴Cu, ⁶⁸Ga, ⁸⁹Z, ⁷⁵Br, ⁷⁶Br, ⁷⁷Br, ¹²³I, ¹²⁵I, und ¹³¹I.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure 1-¹¹C-Palmitinsäure (1-¹¹C-Hexadecansäure) ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure (E/Z)-13-¹³¹I-Iodtridec-12-ensäure ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure (E/Z)-15-¹³¹1-Iodpentadec-14-ensäure ist.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Krebserkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: Urogenitalkrebs, einschließlich Prostatakarzinom, kolorektales Karzinom, Brustkrebs, Lungenkarzinom, Malignes Melanom, Kopf-Hals-Karzinom, Malignes Lymphom, Neoplasie des hämatopoetischen Systems, Skeletttumor und Weichteiltumor.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure folgende Strukturformel aufweist:
in der R ein geradkettiger oder verzweigter, gesättigter oder zumindest teilweise ungesättigter acyclischer Kohlenwasserstoffrest ist, wobei R substituiert sein kann mit 1 bis 5 Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁- bis C₆-alkyl, C₂- bis C₆-alkenyl, vorzugsweise Vinyl, C₂- bis C₆-alkinyl, C₃- bis C₆-cycloalkyl, C₆- bis C₁₀-aryl, vorzugsweise Phenyl, 3- bis 25-gliedriges Heterocyclyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, Hydroxy, C₁- bis C₆-alkoxy, Amino, C₁- bis C₆-alkylamino, Carbonyl, Alkylcarbonyl, Alkylcarbonylamino, Alkyloxycarbonylamino, Carboxy, Carboxyalkyl Carboxamido, Halogen, Cyano, Nitro, Azido, wobei Alkyl, Alkenyl, Alkinyl, Cycloalkyl, Aryl, Heterocyclyl und Heteroaryl, Alkoxy und Alkylamino ihrerseits substituiert sein können mit 1 bis 10 Substituenten ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus: C₁- bis C₆-alkyl, C₂- bis C₆-alkenyl, vorzugsweise Vinyl, C₂- bis C₆-alkinyl, C₃- bis C₆-cycloalkyl, C₆- bis C₁₀-aryl, vorzugsweise Phenyl, 3- bis 25-gliedriges Heterocyclyl, 5- oder 6-gliedriges Heteroaryl, Hydroxy, C₁- bis C₆-alkoxy, Amino, C₁- bis C₆-alkylamino, Carbonyl, Alkylcarbonyl, Alkylcarbonylamino, Alkyloxycarbonylamino, Carboxy, Carboxyalkyl Carboxamido, Halogen, Cyano, Nitro, Azido.
Verwendung nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass R ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus: C₇ bis C₂₄ geradkettiges Alkyl, C₇- bis C₂₄-verzweigtes Alkyl, C₇- bis C₂₄-geradkettiges Alkenyl, C₇- bis C₂₄-verzweigtes Alkenyl, C₇- bis C₂₄-geradkettiges Alkinyl, C₇- bis C₂₄-verzweigtes Alkinyl.
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure folgende Strukturformel aufweist:
Verwendung nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure ein Zytostatikum ausweist.
Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer Fettsäure, und (2) Formulierung der Fettsäure in einen pharmazeutisch akzeptablen Träger, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure jene aus der Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 ist.
Verfahren zur diagnostischen und/oder therapeutischen Behandlung einer Krebserkrankung bei einem menschlichen oder tierischen Lebewesen, das folgende Schritte aufweist: (1) Bereitstellung einer Fettsäure, (2) Einbringung der Fettsäure in das Lebewesen, und ggf. (3) Detektieren und/oder Lokalisieren der Fettsäure in dem Lebewesen, dadurch gekennzeichnet, dass die Fettsäure jene aus der Verwendung nach einem der Ansprüche 1 bis 16 ist.
Verfahren nach Anspruch 18, dadurch gekennzeichnet, dass Schritt (3) mittels eines bildgebenden Verfahrens erfolgt.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren eine Autoradiographie ist.
Verfahren nach Anspruch 19, dadurch gekennzeichnet, dass das bildgebende Verfahren eine Szintigraphie, Single Photonen-Emissions-Computertomographie (SPECT) gegebenenfalls in Verbindung mit der Computertomographie (SPECT/CT) oder eine Positronen-Emissions-Tomographie/Computertomographie (PET/CT) ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 18 bis 21, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt (2) ca. 0,1 bis 50 μg Fettsäure intravenös in das Lebewesen eingebracht werden.