NO162210B - Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. - Google Patents
Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. Download PDFInfo
- Publication number
- NO162210B NO162210B NO873017A NO873017A NO162210B NO 162210 B NO162210 B NO 162210B NO 873017 A NO873017 A NO 873017A NO 873017 A NO873017 A NO 873017A NO 162210 B NO162210 B NO 162210B
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- monoclonal antibodies
- labeled
- chemotactic activity
- isolation
- antibodies
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 19
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 title claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 title claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 13
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 8
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 8
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 5
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 claims description 5
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 5
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 5
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 5
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 4
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 claims description 3
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 2
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000024203 complement activation Effects 0.000 claims 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims 1
- 230000003399 chemotactic effect Effects 0.000 description 30
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 20
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 17
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 15
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 15
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 13
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 13
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 13
- 206010003445 Ascites Diseases 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 11
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 11
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 9
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 9
- 229920000392 Zymosan Polymers 0.000 description 9
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 8
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 7
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 7
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 6
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 5
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 5
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 5
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108010089414 Anaphylatoxins Proteins 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 4
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 238000001155 isoelectric focusing Methods 0.000 description 4
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 4
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 4
- XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N pristane Chemical compound CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C XOJVVFBFDXDTEG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 4
- 206010001052 Acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 201000000028 adult respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 3
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000007646 directional migration Effects 0.000 description 3
- 239000006167 equilibration buffer Substances 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 230000008569 process Effects 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1,2,3-tricarboxylic acid;phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O.OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O GHCZTIFQWKKGSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 4-aminofolic acid Chemical compound C1=NC2=NC(N)=NC(N)=C2N=C1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 TVZGACDUOSZQKY-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 2
- SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L Brilliant Blue Chemical compound [Na+].[Na+].C=1C=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C(=CC=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=CC=1N(CC)CC1=CC=CC(S([O-])(=O)=O)=C1 SGHZXLIDFTYFHQ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N Histamine Chemical compound NCCC1=CN=CN1 NTYJJOPFIAHURM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 208000013616 Respiratory Distress Syndrome Diseases 0.000 description 2
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 229960003896 aminopterin Drugs 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 2
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 2
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000002975 chemoattractant Substances 0.000 description 2
- 239000005482 chemotactic factor Substances 0.000 description 2
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 2
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 2
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 2
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZXUJWPHOPHHZLR-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trichloro-2-fluoroethane Chemical compound FCC(Cl)(Cl)Cl ZXUJWPHOPHHZLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 1,2-phenylenediamine Chemical compound NC1=CC=CC=C1N GEYOCULIXLDCMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N Amphotericin-B Natural products O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1C=CC=CC=CC=CC=CC=CC=C[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-KKGHZKTASA-N 0.000 description 1
- 108010032595 Antibody Binding Sites Proteins 0.000 description 1
- 238000011725 BALB/c mouse Methods 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L Carbonate Chemical compound [O-]C([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 101710091342 Chemotactic peptide Proteins 0.000 description 1
- 241000700112 Chinchilla Species 0.000 description 1
- 108010034753 Complement Membrane Attack Complex Proteins 0.000 description 1
- 108010069112 Complement System Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000000989 Complement System Proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 238000012286 ELISA Assay Methods 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N [4-(4-hydrazinylphenyl)phenyl]hydrazine Chemical compound C1=CC(NN)=CC=C1C1=CC=C(NN)C=C1 SXEHKFHPFVVDIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 208000011341 adult acute respiratory distress syndrome Diseases 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N amphotericin B Chemical compound O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 APKFDSVGJQXUKY-INPOYWNPSA-N 0.000 description 1
- 229960003942 amphotericin b Drugs 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011545 carbonate/bicarbonate buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012754 cardiac puncture Methods 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N chemotactic peptide Chemical compound CSCC[C@H](NC=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 1
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 210000000883 ear external Anatomy 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 230000006870 function Effects 0.000 description 1
- 238000007499 fusion processing Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000001631 haemodialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 230000000322 hemodialysis Effects 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical group CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229960001340 histamine Drugs 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 150000002617 leukotrienes Chemical class 0.000 description 1
- 230000002101 lytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- GGGDNPWHMNJRFN-UHFFFAOYSA-N metrizoic acid Chemical compound CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C(O)=O)=C1I GGGDNPWHMNJRFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 210000005087 mononuclear cell Anatomy 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 230000030505 negative regulation of chemotaxis Effects 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002572 peristaltic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 1
- 229940113116 polyethylene glycol 1000 Drugs 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 1
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000002460 smooth muscle Anatomy 0.000 description 1
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229950000550 sodium metrizoate Drugs 0.000 description 1
- YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M sodium;3-acetamido-5-[acetyl(methyl)amino]-2,4,6-triiodobenzoate;(2r,3r,4s,5s,6r)-2-[(2r,3s,4s,5r)-3,4-dihydroxy-2,5-bis(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]oxy-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound [Na+].CC(=O)N(C)C1=C(I)C(NC(C)=O)=C(I)C(C([O-])=O)=C1I.O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YEENEYXBHNNNGV-XEHWZWQGSA-M 0.000 description 1
- 239000011343 solid material Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000012134 supernatant fraction Substances 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 238000000954 titration curve Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 1
- 230000008728 vascular permeability Effects 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører monoklonale antistoffer mot C5a for in vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller for isolering av C5a ved immunadsorbsjon, anvendelse av disse monoklonale antistoffer i et immunadsorb-sjonsmateriale som også omfatter et matrisemateriale og et sett for påvisning av C5a i biologiske væsker.
I norsk patentsøknad 85.2705 beskrives animalske monoklonale antistoffer mot humant Clq, og videre anvendelse derav ved påvisning eller bestemmelse av humant Clq i et fluidum. Videre beskrives et prøvesett for bruk i slike fremgangsmåter.
Norsk patentsøknad 85.2426 beskriver monoklonale antistoffer mot endotoksin fra gram-negative bakterier. Denne publikasjon beskriver også immunobestemmelse av gram-negative bakterier eller gram-negativt bakterielt endotoksin og bruk av de fremstilte monoklonale antistoffer bundet til en fast fase for rensing av blod for gram-negative bakterier eller gram-negativt bakterielt endotoksin, dvs. terapeutisk anvendelse derav.
Komplementsystemet består av en kompleks serie proteiner i plasma, hvorav mange er proteinaser. Det er fylogenetisk eldre enn det spesifikke immunsystem, og er sannsynligvis utviklet som en viktig forsvarsmekanisme mot mikrobeinfeksjoner. Komplementsystemet aktiveres via to hovedmekanismer kalt henholdsvis den klassiske og den alternative aktiveringsmåte. Klassisk aktivering skjer hovedsakelig via bundet antistoff
(IgG og IgM). Alternativ aktivering kan skje via strukturer fra mikroorganismer i fravær av antistoffer, f.eks. endotoksin og zymosan. Aktivering kan også skje ved kontakt med forskjellig ikke-biologisk materiale. Begge aktiveringsmåter konvergerer på nivå for komplementfaktor C3 i en kaskadereaksjon og fører til akkumulering av de etterfølgende komplementproteiner i kaskaden til det lytiske "membrane attack complex" (MAC) (et kompleks av proteiner samlet på membraner og som er i stand til å ødelegge biologiske membraner). Under komplementsystemets reaksjoner avspaltes peptider med lav molekylvekt fra den N-terminale enden av alfa-kjede av henholdsvis C3 og C5. Disse peptider kalles anafylatoksiner (C3a og C5a) og er av stor betydning for den inflammatoriske reaksjonen. Begge anafylatoksinene forårsaker histamin-frigjøring fra mastceller med
påfølgende økning av karpermeabilitet og kontraksjon av glatt muskulatur. C5a virker kjemotaktisk (dvs. bevirker en retnings-bestemt vandring) på nøytrofile granulocyter og forårsaker aggregering av de samme. Andre funksjoner av anafylatoksinene er økning i metabolsk aktivitet i nøytrofile granulocyter med frigjøring av toksiske oksygenradikaler og leukotriener. På grunn av sine potente og forskjellige biologiske effekter, har anafylatoksinene, spesielt C5a, vært ansett som mulige pato-genetiske faktorer ved sykdomstilstander som sjokk-lunge syndrom (Adult respiratory distress syndrome, ARDS), og ved komplikasjoner som kan opptre under hemodialyse.
Som ovenfor antydet, vil man når blod kommer i kontakt med kroppsfremmed materiale, kunne få en aktivering av komplementsystemet med frigjøring av C5a som kan forårsake uheldige biologiske effekter hos pasienter.
Det har derfor vært en oppgave for foreliggende oppfinnelse å tilveiebringe monoklonale antistoffer som kan binde komplementfaktor C5a, i den hensikt å påvise og kvantitativt bestemme in vitro dannelsen av C5a, f.eks. ved ekstrakorporeal blodrensing. Videre ønsker man å utvikle en fremgangsmåte og et system for fjerning av komplementfaktor C5a fra biologiske væsker, spesielt blod.
De monoklonale antistoffer ifølge foreliggende oppfinnelse mot komplementfaktor C5a fremstilles ved at
a) miltceller immuniseres med C5a,
b) de immuniserte miltceller hybridiseres med myelomceller, c) hybridcellene selekteres for produksjon av antistoffer mot C5a og d) klones i samme dyreart som miltcellene og myelomcellene er tatt fra og brukes til fremstilling
av ascitesvæsker.
Antistoffene isoleres fra ascitesvæskene ved kjente teknikker som vil bli beskrevet senere.
Ved hjelp av kjente teknikker kan de monoklonale antistoffer mot C5a bindes til matrisematerialer med f.eks. CNBr.
Komplementfaktor C5a kan fjernes fra biologiske væsker ved at de biologiske C5a-holdige væsker bringes i kontakt med et fast materiale hvortil er bundet monoklonale antistoffer mot C5a.
Fortrinnsvis anvender man som matrisematerialer Sepharose eller monodisperse partikler. Som monodisperse partikler er særlig monodisperse polystyrenkuler foretrukne.
Som ovenfor antydet, består et immunoadsorbsjonsmateriale for binding av komplementfaktor C5a av et matrisemateriale med monoklonale antistoffer mot C5a kovalent tilkoblet som ligand. De foretrukne matrisematerialer er nevnt ovenfor.
Det ovenfor skisserte problem ved påvisning og kvantifi-sering av C5a løses med et sett ifølge foreliggende oppfinnelse som omfatter
a) mikro-ELISA-brønner belagt med monoklonale antistoffer som er spesifikke mot C5a ifølge krav 1, b) markør-merket monoklonalt antistoff (f.eks. biotin-merket eller enzym-merket) rettet mot andre struktur-elementer i C5a enn dem de brønnbeleggende antistoffene er rettet mot, c) streptavidin hvis det monoklonale antistoff under b) er biotin-merket,
d) substrat for markør-enzym.
For å bestemme C5a, tilføres brønnene den biologiske væske
som er mistenkt for å inneholde C5a, hvorved tilstedeværende C5a-antigen gjenkjennes av antistoffet i brønnene og bindes strukturspesifikt til dette,
ikke-bundet materiale vaskes vekk,
markør-merket monoklonalt antistoff (f.eks. biotin-merket eller enzym-merket) rettet mot andre struktur-elementer i C5a enn dem de brønn-beleggende antistoffer er rettet mot, tilsettes brønnene,
ikke-bundet materiale vaskes vekk,
hvis markør-merket monoklonalt antistoff er biotin-merket, tilsettes streptavidin med meget høy affinitet overfor biotin, brønnene vaskes grundig,
bundet enzym påvises ved tilsetning av substrat for markør-enzymet,
reaksjonsproduktet av markør-enzymets virkning på substratet registreres kvalitativt eller måles kvantitativt.
Foreliggende oppfinnere har anvendt den følgende prinsip-pielle fremstilling og isolering av C5a fra kanin: a: Aktivering av kaninserum ved hjelp av Zymosan A
(Sigma).
b: Aktivert serum settes på CM-Sephadex C-25 ekvilibrert med 0,1 M Ac-buffer pH 6,0 og kjemotaktisk faktor elueres med en lineær gradient (0,15 til 1,15 M) NaCl i samme buffer.
c: Eluerte fraksjoner som inneholder kjemotaktisk aktivitet settes på en DEAE-Sephadex A-50 kolonne ekvilibrert med 0,02 M fosfatbuffer pH 7,0 , og all kjemotaktisk aktivitet går gjennom anionbytter-kolonnen. C5a foreligger altså i eluatet. Dette benyttes som vaksine til immunisering av mus.
Produksjon av monoklonale antistoffer utføres så etter en metode som er beskrevet av Køhler og Milstein: Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 256, 495-497, 1975 og Goding: Antibody production by hybridomas. J. Immunol. Methods, 39, 285-308, 1980. Utplukking av hybridkulturer ble foretatt med 1: ELISA (med vaksine og vaksine-fraksjoner etter isoelektrisk fokusering som antigen), videre 2: immunoblot med vaksinen overført ved hjelp av elektroforese til nitrocellulosemembraner, videre 3: oppheving/reduksjon av kjemotaktisk aktivitet. Antistoffenes spesifitet dokumenteres ved at C5a's kjemotaktiske aktivitet oppheves. Ved affinitetskromatografi oppnås å binde C5a til CNBr-aktivert Sepharose 4B kolonne med monoklonalt antistoff som ligand, C5a kan elueres ved lav pH med dokumentert kjemotaktisk aktivitet og immunologisk reaktivitet i eluatet.
Etter dette prinsipp ble det fremstilt et panel av monoklonale antistoffer mot C5a med paratoper rettet mot forskjellige deler av C5a-molekylet.
I den etterfølgende beskrivelse ble antistoffer fremstilt i mus mot det kjemotaktiske peptid C5a som stammet fra kanin.
EKSPERIMENTELL DEL
Dyr
Chinchilla-kaniner og BALB-c hunn-mus ble kjøpt fra
Statens Institutt for Folkehelse, Oslo 1, Norge.
Fremstilling av rensede humane nøytrofile granulocyter
Blod fra friske mennesker ble tappet i sterile vakuumbeholdere inneholdende 15 enheter natrium-heparin per ml. (Becton Dickinson, Meylan Cedex, Frankrike). Rensing av nøytrofile granulocyter ble oppnådd ved fremgangsmåten til Bøyum (1). Blod fortynnet med samme volum sterilt, isotont saltvann ble skiktet over natrium-metrizoat/Ficoll (Lymphoprep, Nyegaard & Co. A/S, Oslo, Norway.) Etter sentrifugering ble de mononukleære celler kastet sammen med plasma-supernantanten. Bunn-fraksjon ble vasket én gang i saltvann og rekonstituert til det opprinnelige volum med saltvann, hvoretter man tilsatte 10 volum% dekstran (6 vekt% i saltvann). Etter sedimentering av erytrocytene inneholdt supernantant-fraksjonen nesten ren suspensjon av granulocyter. Etter ytterligere sentrifugeringstrinn konsen-trerte man PMN-suspensjonen til det passende nivå (5-IO<10> per liter).
Ki emotaks i- må1ing
Kjemotaktisk aktivitet, dvs. granulocytenes retningsbestemte vandring, ble bestemt ved under agarose-metoden beskrevet av Nelson et al. (2) med små-modifikasjoner. Agaros (Litex
agarose for gel-elektroforese, Type Nr. HSA, Litex, Danmark)
(1 vekt% sluttkonsentrasjon) ble oppløst i sterilt, destillert vann ved oppvarming i et kokende vannbad i 15 til 2 0 minutter. Etter kjøling til 56°C ble agarosen blandet med et likt volum forvarmet 2X "Minimal Essential Medium" (MEM). Videre ble tilsatt varme-inaktivert humant serum (10 %) og natrium-bikarbonat (37,5 mg pr. 100 ml) medium. 8 milliliter av det varme medium ble overført til hver 50 x 50 mm cellekulturskål
(Nunclon delta SI, Nunc, Roskilde, Danmark). Da forskjellige humane sera kan inneholde varierende mengder av inhiberende faktorer, ble fremgangsmåten standardisert ved å anvende frosne porsjoner av serum fra én donor gjennom alle eksperimenter.
Når eksperimentene ble utført med muse-monoklonale antistoffer, ble muse-ascitesvæske tilsatt agaroseskålene i en konsentrasjon 1 %.
I hver plate ble seks rekker på tre brønner, 2,5 mm diameter og 2,5 mm fra hverandre, stanset ut ved bruk av en mal. Midt-brønnen fikk 10 pl volum inneholdende 5xl0<5> rensede granulocyter. Den ytre brønnen fikk 10 yil av prøve som skulle undersøkes for kjemotaktisk faktor, og den indre brønnen fikk 10 jjI MEM. Skålene ble inkubert i to timer ved 37°C i en fuktig atmosfære inneholdende 5 % C02.
Kvantitering av vandringslengdene ble foretatt ved in situ mikroskopisk undersøkelse på platene ved bruk av et invertert mikroskop (Nikon) med kalibrert okulært mikrometer. De respektive vandringslengder ble definert som avstanden fra kanten av midt-brønnen til det fjerneste punkt hvor 3 celler var på linje i det samme plan og parallelle med kanten av midt-brønnen; A: rettet vandring mot kjemo-attraktanten eller den ytre brønn, B: ikke-stimulert vandring mot den indre brønn som inneholdt MEM. Den kjemotaktiske indeks beregnes som A/B.
Aktivering av serum
Blod ble tatt fra den ytre ørevene hos bevisste kaniner (små volumer) eller gjennom hjertepunksjon av bedøvede kaniner i silikoniserte vakuumbeholdere (Becton Dickinson). Etter koagulering ble serumet sentrifugert i 15 minutter ved 600 g. Zymosan A (Sigma Chemical Co, St. Louis, Mo. USA) ble oppslemmet ved 37°C i isotonisk saltvann til en konsentrasjon på 10 mg/ml, og denne suspensjonen ble blandet med serum i forholdet 1:4. Kontroll-serum fikk samme mengde saltvann. Serumet ble så inkubert ved 37°C i 2 timer med periodevis kraftig omrysting. Zymosan-partiklene ble fjernet ved sentrifugering i 3 0 minutter ved 800 g. Supernantanten ble isolert og gjennomgikk videre rensing eller ble undersøkt for kjemotaktisk aktivitet som Zymosan-aktivert serum (ZAS).
Rensing av kanin C5a
Kationbytterkromatografi ble hovedsakelig utført som beskrevet av Williams og Jose (3). Serum (volumer på 10-80 ml) ble surgjort til pH 6 ved langsom tilsetning av 0,2 M natriumacetatbuffer, pH 3,8, og satt på kolonner (1,5 x 4,0 cm) av karboksymetyl (CM)-Sephadex C-25 (Pharmacia Fine Chemical AB, Uppsala, Sverige) som var ekvilibrert i en blanding av isotont saltvann og 0,1 M natriumacetatbuffer pH 6,0 i forholdet 5:1. Etter vasking med 40 ml ekvilibreringsbuffer ble bundet materiale eluert med en 30 ml lineær NaCl gradient (0,15 M til 1,15 M i ekvilibreringsbufferen. Fraksjoner ble samlet som 1 ml-fraksjoner og undersøkt med hensyn til kjemotaktisk aktivitet. Fraksjonene ble holdt opptil én uke ved 4°C, eller frosset umiddelbart ved -20°C. Fraksjonene ble avsaltet ved gel-filtrering på en 10,5 x 0,8 cm kolonne av Sephadex G-25 (Pharmacia) ekvilibrert i 0,02 M natriumfosfatbuffer pH 7,2. Avsaltede fraksjoner eluert fra CM-Sephadex C-2 5 kolonnen ble
så satt på en 5,0 x 0,8 cm kolonne av DEAE-Sephadex A-50 (Pharmacia) ekvilibrert i 0,02 M natriumfosfatbuffer pH 7,2. Fraksjoner på 1 ml ble samlet og undersøkt med hensyn til kjemotaktisk aktivitet eller lagret ved -20°C. Isoelektrisk fokusering ble foretatt i 24 timer ved 12 00 V i en sukrose-gradient som varierte fra 5 til 50 vektprosent inneholdende 1 % amfolytt-løsning vAmpholine pH 3,5-10, LKB, Bromma, Sverige). Fraksjoner på 1,8 ml hver ble samlet opp ved hjelp av en peristaltisk pumpe og undersøkt med hensyn til kjemotaktisk aktivitet eller lagret ved -20°C.
Natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-gel-elektroforese (SDS-PAGE) (akrylamid 9,12 eller 15 %) ble utført ifølge fremgangsmåten til Laemmli (4) i tris-glycinbuffer pH 8,3 inneholdende 0,1 % SDS. Materialet som inneholdt 1 % SDS, 1 % 2-merkaptoetanol, 10 % glycerol og bromfenol blått, ble oppvarmet i et kokende vannbad i 3 minutter før plassering på gelen. Standard-proteiner (SDS-PAGE standard lav molekylvekt, Bio-Rad) ble kjørt samtidig med prøvene. Gelene ble farget med Comassie brilliantblått T-250.
Immunoblot
Etter SDS-PAGE ble gelene vasket to ganger å 20 minutter med 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 6,5, inneholdende 0,1 % SDS. Prøvene ble overført elektroforetisk i 16 timer ved 25 V til nitrocellulosepapir i 25 mM natriumfosfatbuffer, pH 6,5. Nitrocellulosepapiret ble skåret i strimler som ble inkubert i
1 time med fosfatbuffer-saltvann, pH 7,2, (PBS) inneholdende 3
% Tween 20. Strimlene ble inkubert i to timer med kultur-supernantanter fra hybridomkulturer fortynnet 1:10 i PBS-Tween, eller med muse-ascitesvæske fortynnet 1:1000 i PBS-Tween. Alle trinn ble etterfulgt av grundig vasking med PBS-Tween. Bindingen av antistoffet ble påvist ved inkubering av strimlene med peroksidase-konjugert kanin-antimus-immunoglobuliner (Dakopatts, Dakoimmunglobulins, Danmark) fortynnet 1:1000 i PBS-Tween. Til slutt ble substratet diaminobenzidin og H202 i 0,1 M sitrat-fosfatbuffer, pH 5,0, tilsatt.
ELISA- metode
Linbro mikrotitreringsplater (Cat. No. 76-381-04, Flow Laboratories, Rickmansworth, Herts WD 3,1 PQ, England) ble brukt i alle eksperimenter. Brønnene ble belagt natten over ved romtemperatur med antigen i 0,1 M karbonat-bikarbonatbuffer, pH 9,6. Blokkeringsprosessen, vasking, tilsetning av antiserum, kultur-supernantanter eller ascitesvæske og peroksidase-konjugerte antistoffer var som beskrevet ovenfor for immunoblot. O-fenylen-diamin (OPD,..) og H202 ble tilsatt i 0,1 M sitrat-fosfatbuffer, pH 5,0, og den enzymatiske reaksjon ble avbrutt ved tilsetning av 2 M H2S04. Optisk densitet ble avlest ved 492 nm i en Titertek multiscan (Flow Laboratories).
Fremstilling av monoklonale antistoffer
Fremstilling av antigen
40 til 60 ml ZAS ble satt på CM-Sephadex kolonner.
Eluerte fraksjoner inneholdende kjemotaktisk aktivitet (se nedenunder) ble samlet og konsentrert til 1 ml ved ultra-filtrering ved bruk av et YM-5-filter (Diaflo ultrafiltere, Amicon (0, USA), og satt på en DEAE-Sephadex A-50 kolonne. Kjemotaktisk aktivitet i fraksjoner som ikke bindes til anionbytter-kolonnen, var kilden for immunisering av mus. 0,25 ml ble emulgert i 0,25 ml Freund's fullstendige adjuvans (Difco Lab, USA) og injisert intraperitonealt (ip). Fire uker senere ble 0,25 ml av antigenet emulgert i Freund's ufullstendige adjuvans gitt ip. En sluttdose på 0,1 ml antigen dialysert mot saltvann ble gitt intravenøst i halen to uker senere.
Tre dager senere ble milten fjernet fra en mus, og cellene ble blandet med myelomceller av linjen Sp2/0-Aq-14 (Flow) (ved et forhold miltceller til myelomceller på 4:1) med etter-følgende fusjon som beskrevet av Oi & Herzenberg (5) ved bruk av 50 % polyetylenglykol 1000 som fusjoneringsmiddel (6). Fusjonerte celler ble oppslemmet i HAT-medium bestående av Dulbeccos modifiserte Eagle medium, hypoxanthine 13,61 mg/l, aminopterine 0,18 mg/l og thymidine 3,88 mg/l (Flow Lab.) tilsatt 15 % kalvefoster-serum (Sera-Lab Ltd, England), L-glutamin, 292 mg/l gentamycin 100 mg/l (Gibco Ltd..Skottland) og amfotericin B 1 mg/l (Gibco). Suspensjonen ble fordelt på fem 96-brønners vevskultur-plater (Nunclon 96 F, Nunc) og dyrket i en Steri-Cult C02-inkubator (Forma Scientific, USA) ved 37°C i en atmosfære på 7 % C02 og 95 % relativ fuktighet. Etter 14 dager ble kulturene undersøkt med hensyn til antistoff-produksjon. Den første undersøkelsesmetoden var ved ELISA ved bruk av antigenkilden fortynnet 1 til 500 som belegg. En andre undersøkelse benyttet antigen overført elektroforetisk til nitrocellulosepapir (immunoblot). Et utvalgt antall på syv kulturer ble klonet (7) i 96-brønns vevskultur-plater med et "feeder-layer" av miltceller (2 x IO<5> pr. brønn) fra normale BALB/c-mus. Cellene ble nå dyrket i HT-medium (som HAT-medium med unntak av aminopterine) med samme tilsetninger. Etter en uke ble kulturen igjen undersøkt med ELISA og reklonet, hvoretter positive enkelt-klonete kulturer ble dyrket i vevskultur-kolbe (Nunc).
Seks enkelt-klon-kulturer ble dyrket som ascites-tumorer i mus forbehandlet med pristan (2 ,6 ,10,14-tetrametyl pentadekan, Janssen Chimica, Belgia) intraperetonealt. Cellerester og fett ble fjernet fra ascites-væskene ved sentrifugering og behandling med triklorfluoretan (Lipoclean, Behringwerke, Vest-Tyskland).
Immunoadsorbsi on
Monoklonale antistoffer ble renset fra ascitesvæske ved kromatografi på DEAE-Sephacel (Pharmacia) eller ved ammonium-sulfat-felling. Rensede monoklonale antistoffer ble koblet til CNBr-aktivert Sepharose 4B (Pharmacia) ifølge fabrikantens anvisning. I korthet ble IgG (renset fra 1 ml ascites) inkubert i 0,1 M bikarbonatbuffer, pH 8,3, inneholdende 0,5 M NaCl og 0,5-1,0 g CNBr-aktivert Sepharose 4B (presvellet og vasket i 1 mM HC1) i to timer ved romtemperatur. Etter kobling ble de gjenværende aktive grupper blokkert ved tilsetning av 0,5 M glycin i to timer. Gelen ble så gjentatt vasket med 0,1 M acetatbuffer, pH 4,0, inneholdende 0,5 M NaCl og koblings-buffer.
RESULTATER
Kjemotaktisk aktivitet og partiell rensing av C5a Kati onbytter- kromatogra fi
Når opptil 120 ml kaninserum, aktivert ved en konsentrasjon av Zymosan A 5 mg/ml, ble satt på CM-Sephadex kolonnen, ble all kjemotaktisk aktivitet holdt tilbake. Den kunne elueres fra kolonnen med en gradient av NaCl som normalt startet ved 0,35-0,40 M NaCl. Et typisk resultat er vist i figur 1. Justering av ekvilibreringsbufferens pH til 7,2 førte til målbar kjemotaktisk aktivitet i effluenten. SDS-PAGE av den fraksjon som inneholdt maksimal kjemotaktisk aktivitet, viste minst 11 proteinbånd ved farging med Comassie brilliantblått. Tre proteinbånd med en anslått molekylvekt mindre enn 18 kD ble registrert.
An ionbytter- kromatooraf i
All kjemotaktisk aktivitet passerte anionbytter-kolonnen DEAE-Sephadex A-50 uten å binde seg til den. Flere proteiner som var eluert fra CM-Sephadex ble nå fjernet mens all kjemotaktisk aktivitet ble konservert.
Isoelektrisk fokusering
Fraksjoner som dekket området pH 10,0 til pH 3,5 ble undersøkt, men ingen målbar kjemotaktisk aktivitet ble påvist.
Forsøk på å reetablere fysiologiske betingelser med hensyn til ionestyrke og pH var utilstrekkelig til å påvise kjemotaktisk aktivitet. Et punkt man må ta hensyn til, er at før IEF ble prøven dialysert, og dialyseprosessen i så kort tid som én time ble funnet å føre til 50-90 prosent tap av den kjemotaktiske aktivitet (data ikke vist).
Monoklonale antistoffer
Fusjonsprosessen som er beskrevet, førte til mer enn 450 hybridkloner. Undersøkelsen etter monoklonale antistoffer i kultur-supernantanter med ELISA viste hybridkloner fra 7 3 brønner som ga en O.D. > 0,8 (korrigert for bakgrunn). Immunoblot-prosess ved bruk av kultur-supernantanter fra disse 73 kultur-brønner var positive for 25 supernantanter med hensyn til antigen-antistoffreaksjon tilsvarende en antigen-molekylvekt under 18 kD. Fra disse ga flere en positiv reaksjon mot to antigener i lav-molekylvektsområdet. Syv kulturer som bare ga én linje i immunoblot mot et antigen med anslått molekylvekt 15 kD, og som i preliminære forsøk reduserte kjemotaktisk aktivitet i ZAS, ble klonet. ELISA-positive kloner ble reklonet, og seks ELISA-positive monokloner ble dyrket som ascites-tumorer.
Disse seks monoklonale antistoffer var alle høy-titer-antistoffer i ELISA-målingen ved bruk av antigen-belegg-fraksjoner av ZAS etter CM-Sephadex, CM-Sephadex + DEAE-Sephadex eller IEF. Figur 2 viser et eksempel på en titrerings-kurve for et monoklonalt antistoff. Understøttelse for at disse antistoffer er rettet mot en serumkomponent anriket ved aktivering av komplementsystemet, fikk man ved eksperimenter som anvender eluater fra CM-Sephadex-kolonnen etter påsetting av ZAS og varmeinaktivert kontrollserum.
Immunoblot- analvse ved bruk av monoklonale antistoffer
Som vist i fig. 4, var de monoklonale antistoffer rettet mot et antigen med en estimert molekylvekt på 15 kD bedømt ved
SDS-PAGE.
Inhiberinq av kiemotaksi med monoklonale antistoffer
Inkorporering av monoklonale antistoffer i agarosen førte til fullstendig eller delvis oppheving av den kjemotaktiske aktivitet i Zymosan-aktivert serum. Tabell 1 viser samlet resultatene ved opphevet kjemotaksi av de forskjellige monoklonale antistoffene. En fullstendig oppheving av den kjemotaktiske aktivitet ble oppnådd når de monoklonale antistoffene 3B5D8, 4B1C11, 2A5E3 & 4A3A9 ble tilsatt i et volum på 5 pl sammen med 5 pl ZAS i den ytre brønn av agaroseplaten (data ikke vist). 1 % ascitesvæske ble inkorporert i agarosen. Kjemo-attraktanten i disse eksperimenter er Zymosan-aktivert serum. Hvert resultat er middelverdien av seks målinger. Monoklonalt antistoff 2-1A10C8 er rettet mot et humant glykoprotein og er inngår som en kontroll ved å inkorporere et indifferent monoklonalt antistoff i agarosen. SP 2/0 AG 14 er ascitesvæske produsert av myelomcellelinjen uten fusjon med miltceller.
ELISA av ZAS etter isoelektrisk fokusering
Selv om ingen kjemotaktisk aktivitet ble funnet etter IEF av delvis renset ZAS, påviste monoklonale antistoffer tydelig antigen i fraksjoner høstet fra kolonnen etter IEF (figur 5).
Immunoadsorbsion av kjemotaktisk aktivitet ved hjelp av monoklonale antistoffer
Immunoadsorbentene bandt effektivt den kjemotaktiske aktivitet i Zymosan-aktivert serum. Tabell 2 viser ELISA resultat og kjemotaktisk aktivitet i fraksjoner eluert fra immunoadsorbent hvor 2A5E3 var ligand. Immunoblot analyse av den syre-eluerte fraksjon inneholdende kjemotaktisk aktivitet, viste et bånd med en estimert molekylvekt på ca. 15 kD (ikke vist).
Monoklonalt antistoff 2A5E3 var ligand i dette
eksperimentet. 4 ml ZAS ble satt på immunoadsorbentkolonnen. Fraksjonene utgjorde hver 2 ml. Fraksjon 1-2 ble samlet mens ZAS passerte kolonnen. Fraksjon 3-6 ble samlet mens kolonnen ble vasket med PBS. 2 ml 0,1 M glycin-HCl, pH 2,6 ble satt
tilsvarende til start av fraksjon 7, kolonnen ble deretter vasket med PBS. I ELISA ble fraksjonene fortynnet 1:50 i 0,1 M karbonatbuffer, pH 9,6. Monoklonalt antistoff 4A3A9 ble brukt i ELISA i fortynning 1:2000.
Referanser
1. Bøyum, A. (1968). Scand.J.Clin.Lab.Invest.,21,(Suppl.97),77. 2. Nelson R.D., Quie P.G. & Simmons R.L.: The Journal of
Immunology, 1975, 115,1650-1656. 3. Williams T.J. og Jose P.J.: Mediation of increased vascular permeability after complement activation.
J.Exp.med., 1981,153:136-153.
4. Laemmli, U.K., Nature, 222 eller 227, 680 (1970).
Cleavage of structural proteins during the assembly of
the head of bacteriophage T4.
5. Oi, V.T. & Herzenber, L.A.: Immunoglobulin-producing hybrid cell lines. In: Mishell, B.B. & Shiigi, S.M. (Eds.): Selected methods in cellular immunology. W.H. Freeman & Co.,
San Francisco 1980, pp. 351-372.
6. Davidson, R.L., 0'Malley, K.A. & Wheeler, T.B.: Polyethylene glycol-induced mammalian cell hybridization: Effect of polyethylene glycol molecular weight and
concentration. Somat. Cell Genet., 2: 271-280, 1976-
7. De Blas, A.L., Ratnaparki, M.V. & Mosiman, J.E.:
Estimation of the number of monoclonal hybridomas in a cell fusion experiment. Effect of post-fusion dilution on hybridoma survival. J.Immunol. Methods. 45: 109-115, 1981.
Claims (6)
1. Monoklonale antistoffer mot C5a for in vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller for isolering av C5a ved immunadsorbsjon,
karakterisert ved at de er spesifikke for ulike deler(epitoper) av C5a-molekylet, hvorav minst den ene epitopen er fremkommet under avspaltning av C5a ved komplement-aktivering.
2. Anvendelse av de monoklonale antistoffer ifølge krav 1 i et immunoadsorbsjonsmateriale som også omfatter et matrisemateriale.
3. Anvendelse ifølge krav 2 hvor matrisematerialet er Sepharose.
4. Anvendelse ifølge krav 2 hvor matrisematerialet er monodisperse partikler.
5. Anvendelse ifølge krav 4 hvor de monodisperse partikler er monodisperse polystyrenkuler.
6. Sett for påvisning av C5a i biologiske væsker, karakterisert ved at det omfatter a) mikro-ELISA-brønner belagt med monoklonale antistoffer som er spesifikke mot C5a ifølge krav 1, b) markør-merket monoklonalt antistoff (f.eks. biotin-merket eller enzym-merket) rettet mot andre struktur-elementer i C5a enn dem de brønnbeleggende antistoffene er rettet mot, c) streptavidin hvis det monoklonale antistoff under b) er biotin-merket, d) substrat for markør-enzymet.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO873017A NO162210C (no) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. |
| FI883424A FI883424A (fi) | 1987-07-20 | 1988-07-19 | Antikroppar mot faktor c5a och deras anvaendning. |
| DK402888A DK402888A (da) | 1987-07-20 | 1988-07-19 | Antistoffer mod c5a og anvendelse deraf |
| EP88306612A EP0300740A3 (en) | 1987-07-20 | 1988-07-20 | Monoclonal antibodies to complement c5a |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| NO873017A NO162210C (no) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. |
Publications (4)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO873017D0 NO873017D0 (no) | 1987-07-20 |
| NO873017L NO873017L (no) | 1989-01-23 |
| NO162210B true NO162210B (no) | 1989-08-14 |
| NO162210C NO162210C (no) | 1989-11-22 |
Family
ID=19890107
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO873017A NO162210C (no) | 1987-07-20 | 1987-07-20 | Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0300740A3 (no) |
| DK (1) | DK402888A (no) |
| FI (1) | FI883424A (no) |
| NO (1) | NO162210C (no) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3924924A1 (de) * | 1989-07-27 | 1991-02-07 | Goetze Otto | Verfahren zum nachweis und/oder der quantitativen bestimmung von komplementpeptid c5a und/oder c5adesarg |
| DE4118770A1 (de) * | 1991-06-07 | 1992-12-10 | Progen Biotechnik Gmbh | Verfahren zur herstellung von antikoerpern gegen instabile antigene, antikoerper gegen die aktive form der anaphylatoxine und diese herstellende zellinien und verwendung der antikoerper |
| DE19913707A1 (de) * | 1999-03-26 | 2000-10-05 | Privates Inst Bioserv Gmbh | Immunadsorber zur Sepsistherapie |
| US7361742B2 (en) * | 2002-12-02 | 2008-04-22 | Resistentia Pharmaceuticals Ab | Methods and materials for treating inflammatory conditions |
| EP1802342B1 (de) * | 2004-10-20 | 2013-07-31 | Hans-Werner Prof. Dr. Heinrich | Immunadsorber für die behandlung von entzündungen |
| CN102597005A (zh) * | 2009-06-23 | 2012-07-18 | 阿雷克森制药公司 | 与补体蛋白质结合的双特异性抗体 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DE3366421D1 (en) * | 1982-06-14 | 1986-10-30 | Upjohn Co | Method and kit for removing and assaying complement system fragments |
| JP2703764B2 (ja) * | 1986-04-28 | 1998-01-26 | シータス オンコロジー コーポレイション | 補体成分Ｃ５ａに対するモノクローナル抗体 |
-
1987
- 1987-07-20 NO NO873017A patent/NO162210C/no unknown
-
1988
- 1988-07-19 FI FI883424A patent/FI883424A/fi not_active IP Right Cessation
- 1988-07-19 DK DK402888A patent/DK402888A/da not_active Application Discontinuation
- 1988-07-20 EP EP88306612A patent/EP0300740A3/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI883424A0 (fi) | 1988-07-19 |
| EP0300740A2 (en) | 1989-01-25 |
| DK402888D0 (da) | 1988-07-19 |
| DK402888A (da) | 1989-01-21 |
| NO873017D0 (no) | 1987-07-20 |
| EP0300740A3 (en) | 1990-02-07 |
| NO873017L (no) | 1989-01-23 |
| NO162210C (no) | 1989-11-22 |
| FI883424A (fi) | 1989-01-21 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| EP0205405B1 (en) | Purified immunoglobulin-related factor, novel monoclonal antibodies, hybridoma cell lines, processes and applications | |
| JPH09294584A (ja) | ヒト腫瘍壊死因子に対するモノクロナール抗体 | |
| US4902618A (en) | Production of hybridoma antibodies for interferon | |
| EP0145333B1 (en) | Candida albicans cytoplasmic antigen, monoclonal antibodies against it and methods for the preparation | |
| Taylor et al. | Monoclonal antibodies against surface antigens of schistosomula of Schistosoma mansoni | |
| Hutt-Fletcher et al. | Studies of the Epstein Barr virus receptor found on Raji cells. II. A comparison of lymphocyte binding sites for Epstein Barr virus and C3d. | |
| NO162210B (no) | Monoklonale antistoffer mot c5a for in-vitro anvendelse ved immunologiske kvantitative teknikker eller ved isolering av c5a. | |
| EP0210029B1 (en) | Monoclonal antibodies to human plasma prekallikrein and methods of preparing and using same | |
| Lapeyre et al. | Production and characterization of monoclonal antibodies to staphylococcal enterotoxins: use in immunodetection and immunopurification | |
| US5321123A (en) | Protein S polypeptides and anti-peptide antibodies that inhibit protein S binding to C4B binding protein, diagnostic systems and therapeutic methods | |
| NO302526B1 (no) | Monoklonalt antistoff for anvendelse in vitro, hybridom og anvendelse av antistoffet | |
| DK171679B1 (da) | Fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C | |
| EP0592600B1 (en) | Proteins s polypeptides and uses thereof | |
| KR930002834B1 (ko) | 항유로키나제 모노클론 항체 함유 면역흡착제 및 이를 사용하는 유로키나제 정제방법 | |
| US5939280A (en) | Immunological assay for quantifying peg-modified human granulocyte colony stimulating factor and monoclonal antibodies used in the assay | |
| US5688919A (en) | Process for the purification of factor XIII, monoclonal antibodies against factor XIIIA, the preparation and use thereof | |
| JPH07138296A (ja) | Ｃｓｖｔｃｇ特異的腫瘍細胞の接着受容体の精製及び特性付け | |
| Bergh et al. | Monoclonal antibodies against the major zymosan-induced chemotactic factor in rabbit serum | |
| JPH04228090A (ja) | Ｐｐ４に対するモノクローナル抗体およびその製造方法 | |
| AU690756B2 (en) | Antibodies against allogenic and xenogenic proteins, their use in diagnosis and therapy and methods for the determination thereof | |
| JPH0736019B2 (ja) | 新規な抗ヒトトロンボモジュリンモノクローナル抗体によるヒトトロンボモジュリンおよびその分解産物の定量方法 | |
| JPH0595794A (ja) | ヒトｍ−ｃｓｆ抗体及びヒトｍ−ｃｓｆの測定法 | |
| JPS62207298A (ja) | 抗ヒト胃癌単クロ−ン性抗体 | |
| JPH10179159A (ja) | モノクローナル抗体、免疫吸着剤としての使用およびヒトプラスミノーゲンの製造方法 | |
| JPH1033171A (ja) | モノクローナル抗体および抗線溶剤 |