DK171679B1 - Fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C - Google Patents

Description

DK 171679 B1

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C. Nærmere bestemt angår den en fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C ved anvendelse af et antistof til 5 et kompleks af humant protein C og en calciumion, bundet til 'r-carboxyglutaminsyre (Gla) -område af det humane protein C.

Protein C, et vitamin K-afhængigt plasma protein, spiller en vigtig rolle i en levende organisme som en kontrolfaktor i koagulations- og fibrinolytiske systemer. Pro-10 tein C er et forstadie til serin-protease. Fysiologisk aktiveres det ved hjælp af thrombin, bundet til thrombomodulin på overfladelaget af det vaskulære endothel for at blive aktiveret protein C med anti-koagulerende og fibrinolyse-fremmende virkninger.

15 I den foreliggende beskrivelse er protein C nogle gange forkortet til "PC" og aktiveret protein C til "aktiveret PC".

Vigtigheden af virkningen af PC i den levende krop iagttages ved alvorlig periodisk thromboemboli hos patienter 20 med medfødt PC-mangel (Broekmans et al., New Eng. J. Med., 309, 340-344, 1983; Saligsorn et al., New Eng. J. Med., 310, 559-562, 1984). Der fastslås en forlængelse af koagulationstiden og en stigning i fibrinolytisk aktivitet i blodet ved et forsøg, hvori renset aktiveret PC fra okser 25 indgives til hunde (Comp et al., J. Clin. Inv., 68, 1221-1228, 1981), og et forsøg, hvori renset humant aktiveret PC indgives til katte (Burdick et al., Thrombosis Research 45, 413-419, 1987). Disse forsøg tyder på, at en forstyrrelse i koagulation og fibrinolyse kan afhjælpes ved indgift af 30 aktiveret PC.

Det nylige fremskridt indenfor gensplejsningsteknik har gjort det muligt at fremstille rekombinant humant PC ved at klone humant PC-gen i dyreceller, og man overvejer den eventuelle anvendelse af det fremstillede humane PC til 35 behandlingen af medfødt PC-mangel, thromboemboli, dissemineret intravaskulær koagulation og hjerteinfarkt, jf. japansk DK 171679 B1 2 offentliggørelsesskrift nr. 205 487/1986.

Som et terapeutisk middel kan PC indgives som PC ellers som aktiveret PC, afhængigt af den tilstand, der skal behandles.

5 Til indgift som aktiveret PC er det nødvendigt at aktivere naturligt PC, oprenset fra plasma, eller et koagu-lations-faktor-koncentrat eller rekombinant humant PC, renfremstillet ud fra dyrkningsupernatanten af dyreceller under anvendelse af eksempelvis thrombin, thrombin-thrombomodulin-10 kompleks eller slangegift, og isolere det fremkomne aktiverede PC. Eksempelvis er der refereret en fremgangsmåde, som omfatter aktivering af opremset humant PC med oksethrom-bin og rensning af det aktiverede PC under anvendelse af en Sephadex C-50 kolonne og en QAE-Sephadex Q-50 kolonne, frem-15 stillet af Pharmacia (Comp et al., J. Clin. Invest., 68: 1221-1228, 1981) og en fremgangsmåde, som omfatter binding af renset oksethrombin til renset kaninthrombomodulin, fik-seret på en uopløselig bærer, og at man bringer bæreren, til hvilken thrombin/thrombomodulin-komplekset er fikseret, i 20 kontakt med en opløsning af oprenset PC, hvorved man får aktiveret PC, jfr. japansk offentliggørelsesskrift nr.

205 487/1986. Disse fremgangsmåder er ufordelagtige ved, at der kræves megen tid til at fraskille aktiveret PC, der kan indgå en lille mængde thrombin i aktiveret PC, eller der 25 kræves en stor mængde renset humant thrombin eller renset thrombomodulin, og de er ikke fuldstændigt tilfredsstillende til fremstilling af en stor mængde oprenset aktiveret PC.

Man har foreslået monoklonale antistoffer til humant protein C, jfr. Blood & Wessel, 1984, bind 15, nr. 2, side 30 171-174; J. Biochem. , bind 97, nr. 1, 1985, side 127-138, og japansk offentliggørelsesskrift nr. 120 825/1985. Fra disse dokumenter er der kendt ialt 13 monoklonale antistoffer til humant protein C. Seks af disse binder til proteinet C s L-kæde, fem til proteinet C's H-kæde og to genkender et 35 område mellem proteinet C's L-kæde og H-kæde. I J. Biochem., bind 97, nr. 1, 1985, side 127-138 fremføres i slutningen DK 171679 B1 3 (citatet oversat): "Blandt de nærværende fremstillede antistoffer kan nogle være formspecifikke antistoffer, rettet mod proteinets metal-ion-afhængige struktur". Dette er imidlertid en spekulation. I denne artikels sammendrag fast-5 slås det endvidere (citat oversat): "antistoffer, der er specifikke for den lette kæde, binder ikke til nr-carboxyglu-taminsyre-regionen". Denne artikel beskriver ikke det faktum, at sådanne formspecifikke antistoffer faktisk blev tilvejebragt. En sådan kendsgerning er heller ikke senere blevet 10 indberettet.

Desuden er bindingsstederne for de ovennævnte 13 monoklonale antistoffer til humant protein C bindingssteder, som er fælles for protein C og PIVKA-PC. Følgelig kan protein C og PIVAK-PC ikke måles eller bestemmes skelneligt ved disse 15 monoklonale antistoffer.

Fra FEBS Letters, bind 191, nr. 1, oktober 1985, 75-81 er kendt fire monoclonale antistoffer mod humant protein C. Tre af disse binder til humant protein C uanset tilstedeværelsen eller fraværet af en calciumion, og det restende 20 ene antistof binder til humant protein C i nærvær af en calciumion, men binder i det væsentlige ikke til humant protein C uden tilstedeværelsen af en calciumion. Fra denne artikel er det ligeledes kendt, at alle de ovennævnte tre antistoffer har epitoper i aktiveringspeptidområdet i humant protein C.

25 Fra den verserende US-patentansøgning nr. 804 255 (europæisk offentliggørelse nr. 205 046) er kendt et mono-klonalt antistof, specifikt for et kompleks af humant protein C og en calciumion, bundet til human protein C s Gla-område, og en fremgangsmåde til fraskillelse af humant protein C 30 under anvendelse af det monoklonale antistof.

Formålet med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C. Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fraskil-35 lelse af aktiveret humant protein C under anvendelse af et antistof til et kompleks af humant protein C og en calcium- DK 171679 B1 4 ion, bundet til Gla-regionen, på basis af den overraskende erkendelse af den kendsgerning, at dette antistof binder til aktiveret humant protein C.

Et andet formål med den foreliggende opfindelse er 5 at tilvejebringe en fremgangsmåde til særdeles let at fraskille aktiveret protein C med Gla-området.

Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til fordelagtigt at fraskille aktiveret humant protein C, som er aktiveret, har 10 serinproteaseaktivitet og er mindre stabilt end humant protein C, uden at deaktivere det.

Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til let at få særdeles rent aktiveret humant protein C fra eksempelvis en blanding 15 sammensat af humant protein C, aktiveret ved hjælp af et enzym og forskellige urenheder.

Et andet formål med den foreliggende opfindelse er at tilvejebringe en fremgangsmåde til at få aktiveret humant protein C fra en blanding af humant protein C og aktiveret 20 humant protein C, uafhængigt af humant protein C.

Yderligere formål med den foreliggende opfindelse og fordelen med denne vil fremgå af den følgende beskrivelse.

Ifølge den foreliggende opfindelse opnås de ovennævnte formål og fordele ved hjælp af en fremgangsmåde til fraskil-25 lelse af aktiveret humant protein, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at man bringer en blanding indeholdende aktiveret humant protein C med et ί-carboxyglutaminsyre (Gla)-region i nærværelse af calciumioner i kontakt med et fikseret antistof omfattende en uopløselig bærer og fikseret 30 dertil et antistof til et kompleks af humant protein C og en calciumion, bundet til Gla-regionen, hvorved det aktiverede humane protein C indfanges af det fikserede antistof i den form, hvori calciumionen er bundet til Gla-regionen.

Det antistof, der anvendes i denne opfindelse, er et 35 antistof til et kompleks af humant protein og en calciumion, bundet til Gla-regionen, nærmere bestemt et antistof, som DK 171679 Bl 5 ikke genkender humant protein C, hvori calciumioner ikke er bundet til Gla-regionen, men genkender humant protein C med en calciumion bundet til Gla-regionen.

Antistoffet kan være monoklonalt eller polyklonalt 5 forudsat, at der har de ovennævnte egenskaber. Det mono-klonale antistof foretrækkes i denne opfindelse, fordi det er let at masseproducere.

I den foreliggende opfindelse anvendes antistoffet som fikseret til en uopløselige bærer. Den uopløselige bærer 10 kan eksempelvis være cellulose, agarose, tværbundet dextran, polyacrylamid, maleinsyrepolymer, porøst glas, eller en blanding af disse. En fremgangsmåde til fiksering af antistoffet til en sådan uopløselig bærer er kendt pr. se.

Den følgende beskrivelse er rettet mod tilfældet med 15 anvendelse af monoklonale antistoffer.

Det monoklonale antistof kan fremstilles ved at dyrke et hybridoma, der kan producere antistoffet til humant protein C og fraskille og udvælge antistoffet til humant protein C ud fra dyrkningsproduktet.

20 Den her omhandlede fremgangsmåde udføres ved at bringe en blanding indeholdende aktiveret humant protein C med en Gla-region i nærværelse af calciumionen i kontakt med et antistof, fikseret til en uopløselig bærer.

Den ovennævnte blanding kan eksempelvis være en blan-25 ding, der fås fra den ovenstående væske fra dyrknings væsken fra dyreceller, der kan producere aktiveret humant protein C, eksempelvis dyreceller, der fås ved hjælp af gensplejsning, jfr. eksempelvis japansk offentliggørelse nr.

111 690/1987 og de 29. årlige møde i American Society of 30 Hematology, Summary 1400, 1987, eller en blanding, der fås ved at underkaste humant protein C en behandling til omdannelse af det til aktiveret humant protein C, eksempelvis en enzymbehandling.

Nærmere bestemt kan den eksempelvis være en blanding 35 indeholdende aktiveret humant protein C, der fås ved at aktivere humant protein C, der fås fra en kul tur supernatant DK 171679 B1 6 af dyreceller, som producerer rekombinant PC med thrombin, thrombin/thrombomodulin-kompleks eller slangegift, eller en blanding indeholdende rekombinant aktiveret humant protein C, der fås fra en kultursupernatant af dyreceller, som produ-5 cerer rekombinant aktiveret PC.

Det er klart fra den ovenstående beskrivelse, at det humane protein C og aktiverede humane C, refereret til i denne opfindelse, kan omfatte både naturligt forekommende og mutante former, når blot de har en Gla-region.

10 Koncentrationen af calciumioner i nærværelse af hvilke det fikserede antistof bringes i kontakt med en blanding indeholdende aktiveret humant protein, ligger ønskeligt fra 0,1 mM til 50 mM, fortrinsvis fra 1 til 5 mM. Dele af calciumionerne kan om ønsket erstattes af en anden metalion.

15 Den ovennævnte bringen i kontakt kan udføres ved hjælp af en portionsvis fremgangsmåde eller en kolonne-fremgangsmåde.

Således indfanges aktiveret humant protein C i overensstemmelse med fremgangsmåden ifølge den foreliggende opfindelse af det fikserede antistof i den form i hvilken 20 calciumionen bindes til Gla-regionen. Derefter vaskes det fikserede antistof, som har indfanget aktiveret humant PC, sædvanligvis grundigt i nærværelse af calciumionen til fjernelse af ikke-adsorberede protein-urenheder. Til slut behandles det med et vandigt medium, som er i det væsentlige 25 fri for calciumioner, fortrinsvis en pufret vandig opløsning i det væsentlige fri for calciumioner, eller en opløsning indeholdende EDTA.

Som et resultat kan det aktiverede humane protein C fraskilles og udvindes fra det fikserede antistof i en form, 30 som ikke binder calciumionen til Gla-regionen.

Ifølge den her omhandlede opfindelse er der ligeledes tilvejebragt en fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C og humant protein C, uafhængigt af hinanden, fra en blanding indeholdende det aktiverede humane protein 35 C og det humane protein C. Nærmere bestemt tilvejebringer denne opfindelse en fremgangsmåde til fraskillelse af ak- DK 171679 B1 7 tiveret humant protein C, og denne fremgangsmåde er ejendommelig ved, at den omfatter 1) at man bringer en første blanding indeholdende humant protein C og aktiveret human protein C med en Gla- 5 region i kontakt med et første fikseret antistof omfattende en uopløselig bærer og fikseret dertil et første antistof mod humant protein C, men ikke mod aktiveret humant protein C, til dannelse af en anden blanding i det væsentlige fri for humant protein C, medens det humane protein C indfanges 10 af det første fikserede antistof, og 2) at man bringer den anden blanding i nærværelse af calciumioner i kontakt med et andet fikseret antistof omfattende en uopløselig bærer og fikseret dertil et andet antistof mod et kompleks af humant protein C og en calciumion, 15 bundet til Gla-regionen, hvorved det aktiverede humane protein C indfanges af det andet fikserede antistof i den form i hvilken calciumionen er bundet til Gla-regionen.

Det antistof, der er anvendt i trin 1) er et antistof mod et humant protein C, men ikke mod aktiveret humant pro-20 tein C, hvilket antistof genkender humant protein C, men ikke genkender aktiveret humant protein C, uanset om der er bundet en calciumion til Gla-regionen eller ej.

Det ovennævnte antistof kan være monoklonalt eller polyklonalt, når blot det har de ovennævnte egenskaber, men 25 det monoklonale antistof foretrækkes i denne opfindelse.

Det monoklonale antistof kan fås ved at dyrke et hybridoma, der kan producere et antistof mod humant protein C, og fraskille og udvinde et antistof mod humant protein C, men ikke mod aktiveret humant protein C, fra dyrkningspro-30 duktet.

Et sådant antistof fikseres til den uopløselige bærer og anvendes i trin 1) . Kontaktprocessen i trin 1) udføres uanset tilstedeværelsen eller fraværet af calciumioner.

Ifølge trin 1) indfanges humant protein C af det 35 fikserede antistof til dannelse af en blanding, som er i det væsentlige fri for humant protein C.

DK 171679 B1 8

Det skal forstås, at det i indledningen af beskrivelsen af opfindelsen anførte kan anvendes på de andre dele i trin 1) og alle dele i trin 2).

Specifikke fremgangsmåder til fremstilling af mono-5 klonale antistoffer, der kan anvendes i den foreliggende opfindelse, er beskrevet nedenfor i enkeltheder.

A. Isolering oa rensning af et antigen.

Humant protein C, anvendt som et antigen, isoleret 10 fra humant plasma og renses ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Suzuki et al., J. Biol. Chem., 258, 1914-1920 (1983).

B. Immunisering af mus med humant protein C.

Man kan anvende Balb/C hunmus, men man kan ligeledes 15 anvende mus af andre stammer. Immuniseringsfremgangsmåden og koncentrationen af humant protein C bør vælges således, at der dannes en tilstrækkelig mængde antigent stimulerede lymfocytter. Eksempelvis immuniseres en mus intraperitonealt med 50 mikrogram humant protein C tre gange med to ugers 20 mellemrum, og til slut indgives 30 mikrogram humant protein C intravenøst. Adskillige dage efter slutimmuniseringen udtages miltceller fra dyret til fusion.

C. Cellefusion.

25 Milten tages aseptisk ud fra den immuniserede mus, og der fremstilles en suspension af miltcellerne. Miltcellerne fusioneres med musemyelomaceller fra en egnet cellelinie i nærværelse af en egnet fusionspromotor. Det foretrukne forhold mellem miltcellerne og myelomacellerne ligger 30 fra ca. 20:1 til 2:1, og fusionsmediet anvendes passende i en mængde fra 0,5 til 1,5 ml pr. ca. 108 miltceller.

Musemyelomacellerne anvendt til cellefusion, er velkendte. I den foreliggende opfindelse anvendes P3-X63-Ag 8-U1 eller (P3-U1) [jfr. D.E. Yelton et al., Current Topics 35 in Microbiology and Immunology, 81, 1 (1978)].

Fusionspromotoren er fortrinsvis polyethylenglycol DK 171679 B1 9 med en gennemsnitsmolekylvægt fra 1000 til 4000. Andre kendte fusionspromotorer kan ligeledes anvendes. I den foreliggende opfindelse anvendes der fortrinsvis polyethylenglycol med en gennemsnitsmolekylvægt på 1540.

5 D. Udvælgelse af de fusionerende celler.

I en særskilt beholder (såsom en mikrotiterplade) fortyndes en blanding, sammensat af de ikke-fusionerede miltceller, ikke-fusionerende musemyelomaceller og de sam-10 mensmeltede hybridomaceller, med et selektivt medium, der ikke ernærer de ikke-fusionerede musemyelomaceller, og dyrkes i et tidsrum, der er tilstrækkeligt til at dræbe de ikke-fusionerede celler (ca. 1 uge). Et dyrkningsmedium, der ikke ernærer de ikke-fusionerede musemyelomaceller, såsom 15 et HAT-medium, anvendes. I det selektive medium dør de ikke-fusionerede myelomaceller. Eftersom de ikke-fusionerede miltceller er ikke-transformerede celler, dør de ud efter forløbet af en vis tid (1 uge). De anvendte celler kan på den anden side overleve i det selektive medium, eftersom de har 20 både modermyelomacellernes tumornatur og modermiltcellernes natur.

E. Bestemmelse af humant protein C.

Efter at man således har detekteret hybridomacelleme, 25 udtages der prøver af kultursupernatanten og de screenes for antistof mod humant protein C ved hjælp af "emzyme linked immunosorbent assay", (ELISA). Prøveudtagningen sker ved at sætte CaCl2 i en vis koncentration til kultursupernatanten, en enzym-mærket antistofopløsning og en vaskeopløsning, og 30 ligeledes i fravær af CaCl2· Ved udvælgelsen vælges de hyb-ridomaer, som viser sig kun at være positive i nærværelse af CaCl2. Disse hybridomaer producerer og udsondrer et antistof, som ikke genkender humant protein C i fravær af calciumioner, men genkender humant protein C i nærværelse af 35 calciumioner.

DK 171679 B1 10 F. Kloning af hvbridomacellerne. der producerer det ønskede antistof, oa produktion af antistoffet.

Hybridomacelierne, der er i stand til at producere det ønskede antistof, klones ved hjælp af en egnet frem-5 gangsmåde, såsom en grænsefortyndingsmetode, og det ønskede antistof kan fremstilles ved at følge to forskellige fremgangsmåder. Ifølge den første fremgangsmåde dyrkes hydrido-macellerne i et egnet medium i en vis tid, og det monoklonale antistof, produceret af hybridomacellerne, kan isoleres fra 10 kultursupernatanten. Ifølge den anden fremgangsmåde injiceres hybridomacellerne intraperitonealt i en syngenisk eller semisyngenisk mus. Efter en vis tid kan det monoklone antistof, produceret af hybridomacellerne, isoleres fra værtsdyrets blod og ascites.

15 De følgende eksempler belyser den foreliggende op findelse mere specifikt.

Eksempel 1

To Balb/C-hunmus (4 uger gamle) immuniseres med renset 20 humant PC fire gange med 14 dages intervaller. Den første immunisering sker ved intraperitoneal indgift til musene af en blanding (emulsion) af 50 mikrogram humant PC opløst i phosphatpuffer-saltvand (PBS) og det samme rumfang Freund's komplette adjuvant i en mængde på 0,5 ml pr. mus. Den anden 25 og tredje immunisering sker ved intraperitoneal indgift til musen af en blanding af 50 mikrogram humant PC og Freund's inkomplette adjuvant. Den sidste immunisering udføres ved at indgive en PBS-opløsning på 30 mikrogram humant PC fra musenes halevener. Tre dage efter den sidste immunisering 30 anvendes miltcellerne fra de immuniserede mus til cellefusion.

Miltcellerne fra de immuniserede mus og myelomacel-lerne (P3U1) fra en mus af den samme stamme blandes i et forhold fra ca. 2:1 til ca. 15:1 og fusioneres i nærværelse 35 af 50% polyethylenglycol 1540 (et produkt fra Wako Pure Chemicals, Co., Ltd.) i overensstemmelse med fremgangsmåden DK 171679 B1 11 ifølge Kohier og Milstein. De fusionerede celler suspenderes i RPMI-1640 medium (indeholdende 10% FCS) således, at koncentrationen af cellerne bliver 1:106 eller pr. ml. Suspensionen fordeles i fordybningerne i en mikroplade med 96 5 fordybninger (Coster) i en mængde på 100 mikroliter pr. fordybning.

De fusionerede celler inkuberes i en C02"inkubator (5% CC>2, 37°C) . Efter en dags forløb sættes der et medium indeholdende hypoxanthin, aminopterin og thymidin (HAT-me-10 dium) til hver fordybning, og halvdelen af mediets rumfang i hver fordybning fjernes, og HAT-mediet sættes til hver fordybning hver anden eller hver tredje dag. Således screenes hybridomaceller, sammensat af miltcellerne og myelomacel-lerne.

15 Antistoffet i hybridomaceliernes kultursupernatant detektere s ved hjælp af ELISA-fremgangsmåden under anvendelse af en mikrotiterplade, overtrukket med humant PC som et antigen. Som et andet antistof anvendes et alkalisk phospha-tase-mærket kanin-anti-mus-IgG-antistof, og for at bestemme 20 forskellen mellem binding af antistoffet til humant PC i nærværelse af en calciumion og i fravær af en calciumion sættes der TBS (0,02M Tris/HCl, 0,14 M NaCl, pH-værdi 7,4) indeholdende 5mM CaCl2-opløsning til een supernatant fra en fordybning, og der sættes TBS uden CaCl2 til en anden supernatant 25 fra den samme fordybning. Endvidere anvendes TBS indeholdende 5mM CaCl2-opløsning, 0,05% Tween 20/0,02% NaN3-opløsning, eller TBS/0,05% Tween 20/0,02% NaN3-opløsning som et for-tyndningsmiddel til det andet antistof og en vaskepuffer.

De fusionerede celler udpletteres i ialt 541 fordyb-3 0 ninger, og dannelse af kolonier iagttages i 523 fordybninger. Blandt disse viser 44 fordybninger sig at være positive med hensyn til antistofproduktion som vist i tabel I nedenfor.

44 fordybninger viser binding til humant PC i nærværelse af calciumioner, og 32 fordybninger viser binding til humant 35 PC i fravær af calciumioner.

Disse positive fordybninger klones to gange ved hjælp DK 171679 B1 12 af grænsefortyndingsmetoden. De fremkomne klonede celler suspenderes i 90% FCS-10% DMSO og opbevares i flydende nitrogen .

De monoklonale antistoffer, produceret af de indivi-5 duelle kloner, formeres i bughulen hos Balb/C-mus. Humant PC isoleres fra ascites hos mus og renses ved anvendelse af en protein A-Sepharose 4B kolonne.

Tabel I

10 Antal fordybninger, hvori fusions- cellerne er udpletterede 541

Antal fordygninger, som danner kolonier 523

Antal fordybninger, som produ- 15 cerer antistoffer 44

Binding til PC i nærværelse af Ca++ er positive 44

Binding til PC i fravær af Ca++ er positive 32 20

Eksempel 2

IgG'erne fra de forskellige kloner, oprenset fra museascites, undersøges for underklasser, virkningen på ekspressionen af aktiviteten af humant PC, bindingsaktivi-25 teten til L-kæden eller H-kæden og bindingsaktiviteten til humant PC, hvis Gla-region er fjernet ved hjælp af en enzymbehandling under anvendelse af α-chymotrypsin.

Subklasserne bestemmes ved hjælp af Ouchterlony-me-toden under anvendelse af anti-muse-antisera, der er speci-30 fikke for de forskellige klasser.

Virkningen på ekspressionen af aktiviteten af humant PC bestemmes ved at blande IgG og humant PC i et molforhold på 5:1, inkubere blandingen natten over ved 4°C og aktivere inkuberet humant PC ved hjælp af et thrombin/thrombomodulin-35 kompleks og bestemme den humane PC-aktivitet ved at måle den amidolytiske aktivitet under anvendelse af et syntetisk 13 DK 171679 B1 substrat. Som det syntetiske substrat forefindes H-Val-Leu-Arg-NH-^^-N02.2HC1 5 (hvori Val er optisk aktivt D-valin, Leu er optisk aktiv L-leusin og Arg er optisk aktivt L-arginin, hvilket er et produkt fra Kabi Vitrum AB, Sverige, betegnet som "S-2266).

Bindingsaktiviteten til L-kæden eller H-kaeden bestemmes ved at underkaste humant PC elektroforese under redu-10 cerende betingelser for at adskille L- og H-kæderne, fulgt af immunoblotting under anvendelse af en nitrocellulosemembran og HRP-mærket gede-anti-muse-IgG-antistof.

Den Gla-region-fjernede humane PC fremstillet ved grænsehydrolyse under anvendelse af α-chymotrypsin i over-15 ensstemmelse med fremgangsmåden ifølge Esmon et al. [N.L. Esmon et al., J. Bio. Chem., 258, 5548-5553 (1983)], og bindingsevnen af antistofferne til Gla-regionen bestemmes ved hjælp af immunoblotting.

Egenskaberne af antistofferne, produceret af de seks 20 kloner, er opsummeret i tabel II. De calciumion-afhængige antistoffer binder allesammen til L-kæden og binder selv i nærværelse af calciumioner ikke til humant PC, hvorfra Gla-regionen er fjernet. Disse antistoffer påvises kun at genkende det humane PC, som gennemgår formforandringer afhængigt 25 af Gla-regionen, hvortil calciumionen binder.

Tabel II

Epitop på Binding 30 protein C Ca++ til Gla- Virkning

Sub- (L-kæde afhængig region på PC ak-

Klon klasse eller kæde hed fjernet tivering 7B12 IgG! L + 35 10E12 Gx L + 6H2 G]_ L + - - 6C3 G2b H - + 10H11 Gx H + + 6B10-1 G! + 40 DK 171679 B1 14

Eksempel 3

Bindingsevnen af monoklonale antistoffer til PC og aktiveret PC:

Der gennemføres fast fase immunoradiometrisk analyse 5 ved hjælp af fremgangsmåden ifølge Frankel et al. (Frankel et al.: Mol. Immunol., 16, 101-106,1979), og dissociationskonstanter (Kd) i bindingsreaktionerne af monoklonale antistoffer til PC og aktiveret på PC bestemmes ved hjælp af Scratchard analyse.

10 Resultaterne, opnået med to anti-PC-monoklonalle, antistoffer er vist i tabellen.

Tabel III

15 Kd

IgG PC Aktiveret PC

6B10-1 6,86x10“® M 8,70xl0-9 M

20 10H11 5,10x10"9

Det viser sig, at 10H11 er et antistof, som ikke binder til aktiveret PC.

25

Eksempel 4

Fiksering af et antistof til en uopløselig bærer: 0,3 g tør gel af cyanbromid-aktiveret Sepharose 4B (fremstillet af Pharmacia Fine Chemicals, Inc.) kvældes og 30 vaskes med 10 ml ImM HCl og vaskes endvidere med en koblingspuffer (0,1 NaHCC>3, pH-værdi 8,3, indeholdende 0,5 M NaCl) . Koblingspufferen fjernes ved hjælp af sugning, og umiddelbart derefter suspenderes gelen i 2 ml koblingspuffer indeholdende 3 mg antistof 6H2 pr. ml. Suspensionen rystes langsomt natten 35 over. Gelen overføres derpå til 2 ml 1 M ethanolamin-HCl, pH-værdi = 8,0, og suspensionen rystes ved stuetemperatur i 2 timer for at blokere de resterende aktive grupper. Den antistof-bundne Sepharosegel vaskes på et glasfilter skif DK 171679 B1 15 tevis med 0,1 M acetatpuffer (pH-værdi = 4,0) indeholdende 0,5 M NaCl og 0,1 M boratpuffer indeholdende 0,5 M NaCl.

Når absorbansen ved 280 nm for filtratet bliver mindre end 0,01, ækvilibreres der med 0,05 M Tris/HCl (pH-værdi = 7,4) 5 indeholdende 5 mM CaCl2-opløsning og 1 mM benzamidin og fyldes på en kolonne. Som et resultat fremstilles antihumant PC monoklonalt antistof 6H2-bundet Sepharose 4B kolonne (omtales som 6H2 kolonne) . På samme måde som ovenfor fremstilles en anti-human PC monoklonal antistof lOHll-bundet 10 kolonne (omtalt som 10H11 kolonne) ved at anvende antistof 10H11. Aktiveret PC opregnes ved at anvende disse 6H2- og 10H11 kolonner.

Eksempel 5 15 Rensning af aktiveret PC under anvendelse en 6H2 kolonne og en 10H11 kolonne: 30 mikroliter af en blanding af 1,5 U thrombin og thrombomodulin og 300 mikroliter 1% BSA-tilsat pufferopløsning (0,05 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl, 2,5 mM CaCl2-opløsning, 20 pH-værdi = 7,4) sættes til 30 mikroliter renset humant PC (710 mikrogram pr. ml), og blandingen inkuberes ved 37°C i 90 minutter til aktivering af PC.

Reaktionen standses ved at tilsætte 20 mikroliter ATI 11 (20 U) . Denne reaktionsblanding (450 mikroliter) in-25 deholdende aktiveret PC sendes først gennem en 10H11 kolonne og derpå efterhånden gennem en 6H2 kolonne. Disse kolonner er ækvilibrerede med en pufferopløsning (0,05 M Tris/HCl, 0,5 M NaCl-opløsning, 5 mM CaCl2-opløsning, pH-værdi = 7,4). Kolonnerne vaskes med den samme opløsning, og en pufferop-30 løsning (0,06 M Tris/HCl, 0,15 M NaCl-opløsning, 20 mM EDTA, pH-værdi = 7,4) sendes gennem 6H2 kolonnen for at udvinde det adsorberede aktiverede PC som en opløsning.

Opløsningen underkastes SDS-polyacrylamid-elektrofo-rese. Det fastslås, at det udvundne aktiverede PC slet ikke 35 indeholder PC, og udvindeIsesforholdet, målt ud fra aktiviteten, er 62%.

Claims (10)

1. Fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C, kendetegnet ved, at man bringer en blanding indeholdende aktiveret humant protein C med en -r- 5 carboxyglutaminsyre (Gla)-region i nærværelse af calciumioner i kontakt med et fikseret antistof omfattende en uopløselig bærer og fikseret dertil et antistof mod et kompleks af humant protein C og calciumioner, bundet til Gla-regionen, hvorved det aktiverede humane protein C bliver indfanget af 10 det fikserede antistof i den form, hvori calciumionen er bundet til Gla-regionen.

2. Fremgangsmåde ifølge krav l, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter et trin til behandling af det fikserede antistof, der indfanger det aktiverede 15 humane protein C med calciumionen bundet til dets Gla-region, med en vandigt medium i det væsentlige fri for calciumioner, hvorved det aktiverede humane protein C dannes ud fra det fikserede antistof i en form, som ikke binder calciumionen til Gla-regionen.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 2, kendeteg net ved, at det vandige medium er et vandigt medium indeholdende EDTA.

4. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at blandingen er afledt af en kultursupernatant 25 af dyreceller, der kan producere aktiveret humant protein C.

5. Fremgangsmåde ifølge krav 4, kendeteg net ved, at dyrecellerne fås ved gensplejsning.

6. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendeteg net ved, at antistoffet er et monoklonalt antistof.

7. Fremgangsmåde til fraskillelse af aktiveret humant protein C, kendetegnet ved, at man 1. bringer en første blanding indeholdende humant protein C og aktiveret humant protein C med en Gla-region i kontakt med et første fikseret antistof omfattende en uop- 35 løselig bærer og fikseret dertil et første antistof mod humant protein C, men ikke mod aktiveret humant protein C, DK 171679 B1 til dannelse af en anden blanding i det væsentlige fri for humant protein C, fordi det humane protein C indfanges af det første fikserede antistof og 2. bringer den anden blanding i nærværelse af cal-5 ciumioner i kontakt med et andet fikseret antistof omfattende en uopløselig bærer og fikseret dertil et antistof mod et kompleks af humant protein C og en calciumion, bundet til Gla-regionen, hvorved det aktiverede humane protein C indfanges af det andet fikserede antistof i den form, hvori 10 calciumionen er bundet til Gla-regionen.

8. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at den yderligere omfatter et trin til behandling af det andet antistof, der indfanger det aktiverede humane protein C med calciumionen bundet til dets Gla-region, med 15 et vandigt medium i det væsentlige fri for calciumioner, fortrinsvis et vandigt medium indeholdende EDTA, hvorved det aktiverede humane protein C skilles fra det andet fikserede antistof i en form, som ikke binder calciumionen i Gla-regionen.

9. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendeteg net ved, at den første blanding fås ved i det mindste at underkaste en kultursupernatant af dyreceller, fortrinsvis tilvejebragt ved gensplejsning, og som er i stand til at producere humant protein C, en behandling til omdannelse af 25 dele af det humane protein C deri til aktiveret humant protein C.

10. Fremgangsmåde ifølge krav 7, kendetegnet ved, at det første og andet antistof eller begge er monoklonale antistoffer.