NO156474B

NO156474B - Fremgangsmaate til fremstilling av funksjonelle proteinhydrolysater

Info

Publication number: NO156474B
Application number: NO823675A
Authority: NO
Inventors: Scharf Udo; Schlingmann Merten; Von Rymon Lipins Gert-Wolfhard
Original assignee: Hoechst Ag
Priority date: 1981-11-05
Filing date: 1982-11-04
Publication date: 1987-06-22
Also published as: KR840002214A; RO86249A; JPS5881740A; DK490582A; PT75799A; DE3143947A1; GR77382B; ES8307455A1; AU9014482A; FI823758A0; FI823758L; ATE30204T1; AU554815B2; PL238868A1; EP0079023A3; DE3277452D1; IL67173A0; RO86249B; ES517067A0; DD208543A5

Description

Oppfinnelsens gjenstand er fremgangsmåte til fremstilling

av funksjonelle proteinhydrolysater fra et mikrobielt proteinisolat.

Fremstillingen av mikrobielle proteiner er allerede omtalt i mange publikasjoner. En spesielt fordelaktig fremgangsmåte er kjent fra det tyske patent 26 33 451 hvor en proteinrik bakteriecellemasse utvinnes ved dyrking av bakterier av stammen methylomonas clara ATCC 31 226 i et metanolholdig næringsmedium. Fra det således utvunnede bioprotein lar det seg fremstille et for næringsmiddeltormål egnet proteinisolat hvori ifølge fremgangsmåten ifølge DE-AS 26 33 666 ved ekstrahering med en spesiell oppløsningsmiddelblanding lipid- og nukleinsyreinnholdet reduseres betraktelig. Uten nedsett-

else av det i mikrobielt fremstilte bioproteiner ikke anvendbare for næringsmiddelformål, spesielt for menneskenæring da nukleinsyrene ikke fullstendig avbygges i den menneske-

lige organisme og avbygningsproduktene bare utskilles i utilstrekkelig grad. Det kan derfor komme til anrikning av nukleinsyreavbygningsprodukter i organismen og derved frem-bringes sydkommer som gikt.

Enskjønt de ifølge fremgangsmåten ifølge DE-AS 26 33 666 fremstilte eggehviteisolater er høyverdige proteiner, er det for deres anvendelse i næringsmidler satt grenser fordi deres næringsmiddelteknologiske egenskaper enda ikke til-fredsstiller alle krav. Av nye eggehvitestoffer forlanges ved siden av gode ernæringsfysiologiske egenskaper alt etter det foreskrevne anvendelsesområdet en god oppløselighet eller suspenderbarhet, en høy skumbarhet og skumstabilitet samt en til de eventuelle krav tilfredsstillende oljebinde-fasthet av emulsjonens kapasitet. Hvilke av disse funksjonelle egenskaper som fremfor alt kreves avhenger av den eventuelt foreskrevne anvendelse av proteiner. Det skal f.eks. anvendes til forbedring av egenskapene av en majones skal forlanges av det fremfor alt den evne under stabiliser-ende emulsjoner. Skal det derimot anvendes i skumbakst som en marengs, forlanger man fra en dertil egnet eggehvite fremfor alt høy skumbarhet og skumstabilitet. Er derimot dets anvendelse tenkt som kaffelysgjører da er det ved siden av emulsjonskapasiteten spesielt viktig at eggehvitene er godt oppløselige.

For å rettferdiggjøre disse mangfoldige krav er det derfor allerede fremkommet tallrike forslag til modifisering av proteiner. Således er det fra den ålment tilgjengelige japanske søknad Sho 53-6491 allerede kjent for skumdannelse av egnede vannoppløselige eggehvitestoffer som fremstilles ved proteolyttisk avbygning av mikrobielt fremstilte proteiner. De således dannede eggehvitestoffer skal også være anvendbare til skumdannelse i ildslukningsmidler og i sement.

Fra britisk patentsøknad 2 043 651 er det kjent en fremgangsmåte til fremstilling av et for proteiner og makropeptider befridd eggehvitehydrolysat ved anvendelse av ultrafiltrering. Derved fåes en blanding av peptider av lav molekylvekt som kan anvendes som diettnæringsmiddel. Fremstillingen av funksjonelle eggehvitehydrolysater omtales ikke her.

I det tyske Offenlegungsschrift 2 745 954 omtales en fremgangsmåte til fremstilling av funksjonelle proteiner hvor ikke renset naturlig protein av forskjellig opprinnelse oppvarmes i vandig medium til proteinutfelling og det ut-felte adskilte protein behandles deretter med proteolyttiske enzymer. Det dannede eggehvitehydrolysat skal ikke ha noen bitter smak og fremfor alt utmerke seg ved god vannopp-løselighet og varmestabilitet over et vidt pH-område. Så

vidt mikrobielle proteiner anvendes, nevnes som utgangs-produkter bare gjær, imidlertid ingen bakterier. De utvunnede eggehviteprodukter tilskrives riktignok generelt funksjonelle egenskaper. Disse egenskaper karakteriseres imidlertid ikke mer nøyaktig og det vises heller ikke hvilke anvendelsesmuligheter som fremkommer på grunn av spesielle funksjonelle egenskaper.

Det forelå derfor den oppgave å fremstille ernæringsfysiologisk høyverdig og smaksmessig gode eggehvitehydrolysater som på grunn av deres spesifikke næringsmiddelteknologiske egenskaper er i stand til å overta helt spesielle funksjoner ved forar-beidelsen til høyverdige næringsmidler. Denne oppgave skulle løses på grunnlag av mikrobielle eggehvitestoffer som f.eks. er tilgjengelig ved fremgangsmåten ifølge tysk patent 26 33 451 eller andre fremgangsmåter hvori det anvendes mikro-organismer til proteindannelse.

Oppfinnelsen vedrører en fremgangsmåte til fremstilling av funksjonelt hydrolysat med et proteininnhold over 90 vekt-%, et nukléinsyreinnhold under 2 vekt-%, et lipidinnhold under 1 vekt-%, en suspenderbarhet på 80-100%, et skumningstall på 4-7, en halveringstid for skummet på 10-300 minutter, en emulsjonskapasitet på 300-500 ml olje/g protein og en molekylvekt mellom 125.000 og 100 Dalton fra et mikrobielt proteinisolat ifølge hvilke proteinisolat først ekstraheres med en i det vesentlig vannfri blanding av metanol og ammoniakk for minskning av lipidinnholdet og deretter med vann for minskning av nukleinsyreinnholdet, idet fremgangsmåten er karakterisert ved at det oppnådde proteinmaterialet deretter hydrolyseres enzymatisk ved hjelp av en eller flere endoproteaser til det funksjonelle hydrolysat, hvoretter dette hydrolysat eventuelt oppdeles i en fraksjon (A) som med ellers samme egenskaper som det nevnte hydrolysat har

en oppløselighet på 100%,

et skumningstall på 9-16,

en halveringstid for skummet på 20-120 minutter,

en emulsjonskapasitet på 30-60 ml olje/g protein og en molekylvekt mellom 5.000 og 100 Dalton,

og en fraksjon (B) som ved ellers slike egenskaper som det nevnte hydrolysat har

en suspenderbarhet på 70-90%,

et skumningstall på 1-3,

en halveringstid for skummet på 2-1000 minutter, en emulsjonskapasitet på 400-800 ml olje/g protein og

en molekylvekt mellom 125.000 og 5000 Dalton,

ved ultrafiltrering, idet fraksjonen (A) fåes som permeat og fraksjonen (B) som retentat.

Ved ovennevnte fremgangsmåte kan fraksjonering av det funksjonelle hydrolysat gjennomføres uten å isolére dette ved hjelp av en membranreaktor, idet fraksjon (A) fåes som permeat og fraksjon (B) som retentat.

Ovennevnte kombinasjon av viktige næringsmiddelteknologiske egenskaper hvorunder spesielt den gode skumbarhet og skumstabilitet samtidig høy emulgerbarhet er å fremheve, gir fagfolk med en gang den første henvisning på de mulige anvendelsesområder av slike eggehvitehydrolysater. Alltid når næringsmidler skal ha en løsgjort struktur samtidig imidlertid inneholde vannoppløselige og fett-uoppløselige bestanddeler slik det f.eks. er tilfelle ved desserter, bake- og deigvarer og imitasjonsost,

også ved tilsetning av ovennevnte eggehvitehydrolysater ikke bare en ernæringsfysiologisk forbedring, men også

en teknologisk forarbeidelse av næringsmidlet lettes.

Det finnes imidlertid mange næringsmiddelteknologiske problem-stillinger som ikke mer kan løses ved et slikt universielt eggehvitehydrolysat. Således finnes det eksempelvis anvendelsesområder hvori det til skumbarhet og skumstabilitet dessuten stilles vesentlig høyere krav, idet imidlertid en god emulgeringsevne er mindre forlangt. Herved er det f.eks. tenkt på skumaktige sukkervarer som marengs, skummet spiseis, desserter og lignende. Dessuten står på andre anvendelsesområder krav til en høy emulgeringsevne i forgrunnen.

Her kan det f.eks. nevnes spesielt i pølsevarer, osteproduk-ter, konditorivarer, kremer, men også majoneser og salatsaus og andre fett-tilberedninger.

Disse oppgaver kunne nå løses ved bestemte fraksjoner (A)

av ovennevnte eggehvitehydrolysat.

Ved denne egenskapskombinasjon er ved siden av den gode oppløselighet fremfor alt en fremragende skumbarhet påfall-ende, mens emulgeringsevnen ikke er sterkt utpreget.

Et annet egenskapsbilde viser imidlertid en annen fraksjon

(B) av det funksjonelle eggehvitehydrolysat av ovennevnte type.

Denne fraksjon utmerker seg altså ved en spesiell høy emulgeringsevne.

Det ovenfor i første rekke nevnte universelt anvendbare funksjonelle eggehvitehydrolysat fremstilles ved at et mikrobielt eggehvitestoff, fortrinnsvis protein utvunnet av bakterier, spesielt av metylomonas clara ATCC 31 226 i første rekke underkastes en ekstraheringsbehandling for å nedsette dets nukleinsyre- og dets lipidinnhold og deretter avbygges hydrolyttisk ved innvirkning av en eller flere endoproteaser. Den for anvendelse av det funksjonelle eggehviteisolat ifølge oppfinnelsen som næringsmiddel vesentlig nedsettelse av nukleinsyre- og lipidinnhold av proteinmassen kan riktignok gjennomføres etter en rekke forskjellige fremgangsmåter som vanligvis er karakterisert ved alkalisk oppslutning av cellematerialet. Av alle disse fremgangsmåter er det imidlertid å foretrekke den fra det tyske utlegningsskrift 26 33 666 kjente fremgangsmåte hvor cellematerialet i første rekke behandles med en mest mulig, til fullstendig, vannfri ekstraheringsblanding av en alkohol som metanol og ammoniakk og deretter med vann. Denne metode er vesentlig mer skånende enn alle andre fremgangsmåter, hindrer en avbygning eller beskadigelse av proteinet og fører allerede etter en meget kort innvirkningstid til en omtrent fullstendig fjerning av lipider og nukleinsyrer.

Det til den således fremstilte proteinmasse settes for hydrolyse hensiktsmessig i første rekke sterilt, filtrert drikkevann inntil det er nådd et tørrstoffinnhold mellom 10 og 20 vekt-%. pH-verdien og suspensjonen innstilles hensiktsmessig med fortynnet NaOH på den for virkningen av den til anvendelse kommende protease optimale pH-verdi som vanligvis ligger mellom 7,0 og 8,0. Til suspensjonen settes deretter proteasen ved en temperatur mellom 30 og 50°C, idet vektforholdet enzym/substrat skal ligge mellom 1:500 og 1:1000.

De anvendte enzymer er endoproteaser hvis pH-optimum fortrinnsvis ligger i det nøytrale området. For oppnåelse av smaksmessig godt eggehvitehydrolysat som er fritt for en hver bitter smak, har det fremfor alt vist seg spesielt egnet proteasene alkalase 0,6 L, corolase S 60, trypsin PTN 3,OS og a-chymotrypsin samt blandinger av disse enzymer.

Under den 15-240 minutter lange proteolyse holdes bland-ingens temperatur konstant. Derved forskyver suspensjonens pH-verdi seg langsomt til det sure området. Det er derfor nødvendig med stadig etterdosering av alkali, spesielt fortynnet natronlut og sørge for at den pH-verdi bibeholdes som er optimal for virkningen av dette enzym.

Etter avslutningen av inkubasjonen oppvarmes blandingen for inaktivering av enzymet fortrinnsvis ca. 5 minutter ved 80°C. Det således dannede hydrolysat kan direkte føres til tørke-prosessen eller viderespaltes ved fraksjonering for å få eggehvitehydrolysater med høyspesifikke egenskaper.

Den enkleste mulighet til viderebearbeiding av ovennevnte eggehvitehydrolysat består i at spesielt høymolekylære, ikke-suspenderbare partikler adskilles ved hjelp av en separator. Det da dannede produkt har da riktignok alle øvrige egenskaper av det opprinnelige eggehvitehydrolysat, utmerker seg imidlertid med en 100%-ig suspenderbarhet. Vanligvis må den ved separeringen utvunnede tynnfase imidlertid dessuten viderespaltes ved fraksjonering.

For oppdeling av separatortynnfasen egner det seg fremfor

alt ultrafiltrering, idet det kommer til anvendelse et platefilter eller hulfibre med en oppslutningsgrense på 80.000-100.000 Dalton. Herved oppnås en adskillelse i en klar oppløselig lavmolekylær fraksjon, permeatet og en uklar suspenderbar høymolekylær fraksjon, retentatet. Permeatet fra ultrafiltreringen er en klar vannoppløselig peptidbland-ing med en molekylvektsfordeling mellom 100 og 5.000 Dalton. Den er lett fordøyelig og egner seg av denne grunn også

meget godt ved såvel til eggehviteanrikning av flytende næringsmiddel som også til enteral ernæring av nyopererte pasienter. Spesielt bemerkelsesverdig med hensyn til de funksjonelle egenskaper av denne funksjon er imidlertid at de allerede ikke fraksjonerte eggehvitehydrolysat tilstede-værende skumnings- og skumstabiliseringsegenskaper er kon-sentrert i denne lavmolekylære fraksjon.

Derimot er retentatet fra ultrafiltreringen en uklar suspensjon som etter tørkning kan suspenderes godt i vann.

Denne fraksjon viser meget gode emulsjonsstabiliserings-egenskaper og kan derfor finne anvendelse som emulgator i fettrike næringsmidler. Dessuten viser denne fraksjon utpregede viskositetsøkende egenskaper som muliggjør dens anvendelse som fortykningsmidler ved fremstillingen og tilbe-redningen av næringsmidler.

En spesiell enkel fraksjonering av det ved proteolyse dannede hydrolysat er mulig ved hjelp av en membranreaktor. Herved er det nemlig ikke mer nødvendig å isolere hydrolysatet før fraksjoneringen, men allerede under hydrolysen adskilles stadig den lavmolekylære fraksjon mens den høyeremolekylære del forblir i reaktoren som retentat.

Følgende eksempler forklarer fremstilling, utprøving og anvendelse av eggehvitehydrolysatene ifølge oppfinnelsen. Prosentangivelser refererer seg til vekt hvis intet annet

er angitt.

Som proteinisolat ble det anvendt et produkt ifølge det

tyske patent 2 633 451, eksempel 2.

Eksemp_el_l

100 g mikrobielt proteinisolat hvis nukleinsyre- og lipidinnhold er blitt nedsatt etter fremgangsmåten ifølge tysk utlegningsskrift 2 633 666, suspenderes i 900 ml vann og pH-verdien innstilles ved tilsetning av 4 N NaOH til 8,0. Suspensjonen forinkuberes ved 45°C og blandes med 0,5 ml alkalase 0,6 L (Fa. Novo) og inkuberes 15 minutter under omrøring ved 4 5°C. For inaktivering av enzymet oppvarmes blandingen 5 minutter ved 90°C, pH-verdien innstilles på

7,0 og suspensjonen tørkes.

Eksemp_el_2

100 g mikrobielt proteinisolat hvis nukleinsyre- og fettinn-hold er blitt nedsatt ved fremgangsmåten ifølge tysk utleg-ningsskrif t 2 633 666, suspenderes i 900 ml vann og pH-verdien innstilles ved tilsetning av 4 N NaOH på 8,0. Suspensjonen forinkuberes ved 45°C og blandes med 100 mg trypsin PTN 3.OS (Fa. Novo) og inkuberes ved konstant pH-betingelser i 4 timer under omrøring ved 4 5°C. For inaktivering av enzymet oppvarmes blandingen 5 minutter ved 80°C, pH-verdien innstilles på 7,0 og suspensjonen tørkes.

Eksempel 3

Det gåes frem som i eksempel 2 imidlertid gjennomføres proteo-lysen ved tilsetning av 150 ml trypsin/chymotrypsin 2/1S

(Fa. Novo), videre forarbeides deretter imidlertid som i eksempel 2 .

Eksempel 4

Det i eksempel 2 fremstilte hydrolysat underkastes før tørk-ning en ultrafiltrering på et Hollow-Fiber-ultrafiltreringssystem (Fa. Amicon DC-2) med patroner av en oppslutningsgrense på 100.000 Dalton (HIP 100). Retentatet og permeatet samles adskilt og tørkes.

Eksempel 5

1 g mikrobielt proteinisolat hvis nukleinsyre- og fettinn-hold er blitt nedsatt ved fremgangsmåten ifølge tysk utlegningsskrift 26 33 666 suspenderes i 9 liter vannog pH-verdien innstilles ved tilsetning av 4 N NaOH på 8,0. Suspensjonen forinkuberes i en enzymreaktor ved 45°C og blandes med 1 g trypsin PTN 3. O S (Fa. Novo) og inkuberes under konstante temperatur- og pH-betingelser under omrøring. Etter 30 minutters inkubasjonstid settes en ekstrem sirkulering av inkuba-sjonsblandingen over en Hollow-Fiber-ultrafiltreringssystem (Fa. Amicon DC-10) i drift med patroner av oppslutningsgrense 5000 Dalton (H 10 P5), retentatet tilbakeføres til enzymreaktoren og væskevolumet korrigeres med vann. Permeatet samles og tørkes.

Etter avslutning av inkubasjonstiden inaktiveres enzymet i enzymreaktoren ved hjelp av varmebehandling (5 minutter/

80°C) og retenatet tørkes.

Eksempel 6

De ifølge eksempel 1-5 fremstilte mikrobielle proteinhydrolysater ble undersøkt og deres oppløselighetsegenskaper:

100 ml av en 10%-ig suspensjon innstilles til den ønskede pH-verdi (HCl/NaOH), homogeniseres kort og sentrifugeres i et pa forhånd veiet sentrifugeglass ved 1500 g. Det over-stående avdek anteres og sedimentet tørkes ved lOOoc til konstant vekt. Glasset med residuet veies og oppløseligheten beregnes.

Eksempel 7

De etter eksemplene 1-5 fremstilte proteinhydrolysater ble undersøkt på deres skumningsegenskaper: 25 ml av 5% suspensjon innstilles på den ønskede pH-verdi (HCl/NaOH) og skummes i en 500 ml målesylinder med laboratorie-homogenisator ("Ultraturrax fra fa. Jahnke & Kunkel, type T 45) i et minutt. Det bestemmes: (overensstemmende med: Lin, M.J.Y.; Humbert, E.S.: J.Food Sei. 39, 368 (1974)). Skumholdeverditid: Tidsrom, inntil 50 volum-% av utgangs- oppløsningen igjen er trådt ut av skummet. (overensstemmende med: Satterlee, L.D.; Zachariah, N.Y.; Levin E.: J. Food Sei. 38. 268 (1973)).

Eksempel 8

De etter eksemplene 1-5 fremstilte proteinhydrolysater ble under-søkt på deres emulgeringsevne: 20 ml produktoppløsning (10, 5, 1 respektiv 0,5%) ble innstilt på den ønskede pH-verdi (HCl/NaOH) og emulgert med 60-80 ml solsikkeolje ved hjelp av en laboratorie-homogenisator ("Ultraturrax" Janke & Kunkel, type 18-10). Vurderingen av den dannede emulsjon foregikk i tilknytning til Aoki, H.; Nagamori, N: Nippon Shokulin Kogyo Gakkaishi 28 (11), 550 (1980) ved be-stemmelse av viskositeten ( visko - måler Haake VT 181).

Emulsjonskapasitetene definert som ml olje/g protein

(Kinsella, J.E.: Critical Reviews in Foods Science and Nutrition 4, 219 (1976):

Eksempel 9

Molekylvektbestemmelsene i produktene fra eksempel 1-3 og retenatene fra eksempel 4 og 5 foregår over gelkromatografi på "Sephadex" G 100 i en 48% urinstoff og 0,1% natrium-laurylsulfatholdig ammoniumacetatpuffer av pH 7,4.

Eksempel 10

Molekylvektbestemmelsen av permeatene fra eksempel 4 og 5 foregikk over gelkromatografi på "Sephadex" G50 og G25 i 0,01 M Na-acetatpuffer pH 7,0. Permeatene er karakterisert ved en molvekt mellom 100 og 5000 Dalton.

Eksempel 11

Av de fra eksemplene 4 og 5 fremstilte permeat av membran-filtrasjonen fremstilles en 10-15 % (v/g) oppløsning i vann. 50 ml av denne oppløsning slåes med en husholdningsmixer til en stiv skummasse og porsjonsvis innarbeides 100 g pudder-sukker og 5 g vaniljesukker. Skummassen formes med krem-sprøyte og bakes 75 minutter ved 120°C.

Den således dannede marengs utmerker seg ved jevn finporet struktur og artstypisk smak.

Eksempel 12

Av det fra eksempel 4 og 5 fremstilte retentat fra membran-filtreringen fremstilles en 1-2 %-ig (g/g) oppløsning! vann.

15 ml av denne oppløsning utrøres med en halv teskje salt,

1 dråpe eddik og en h teskje sennep og deretter innarbeides porsjonsvis tilsammen 125 ml planteolje under sterk omrøring med en husholdningsblander.

Den således fremstilte salatmajones er en fullstendig homogen emulsjon med høy stabilitet uten uheldig sensoriske egenskaper.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av funksjonelt hydrolysat med et proteininnhold over 90 vekt-%, et nukleinsyreinnhold under 2 vekt-%, et lipidinnhold under 1 vekt-%, en suspenderbarhet på 80-100%, et skumningstall på 4-7, en halveringstid for skummet på 10-300 minutter, en emulsjonskapasitet på 300-500 ml olje/g protein og en molekylvekt mellom 125.000 og 100 Dalton fra et mikrobielt proteinisolat ifølge hvilke proteinisolatet først ekstraheres med en i det vesentlige vannfri blanding av metanol og ammoniakk for minskning av lipidinnholdet og deretter med vann for minskning av nukleinsyreinnholdet, karakterisert ved at det oppnådde proteinmaterialet deretter hydrolyseres enzymatisk ved hjelp av en eller flere endoproteaser til det funksjonelle hydrolysat, hvoretter dette hydrolysat eventuelt oppdeles i en fraksjon (A) som med ellers samme egenskaper som det nevnte hydrolysat har en oppløselighet på 100%, et skumningstall på 9-16, en halveringstid for skummet på 20-120 minutter, en emulsjonskapasitet på 30-60 ml olje/g protein og en molekylvekt mellom 5.000 og 100 Dalton, og en fraksjon (B) som ved ellers like egenskaper som det nevnte hydrolysat har en suspenderbarhet på 70-90%, et skumningstall på 1-3, en halveringstid for skummet på 2-1000 minutter, én emulsjonskapasitet på 400-800 ml olje/g protein og en molekylvekt mellom 125.000 og 5000 Dalton, ved ultrafiltrering, idet fraksjon (A) fåes som permeat og fraksjonen (B) som retentat.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1, karakterisert ved at fraksjonering av det funksjonelle hydrolysatet gjennomføres uten å isolere dette ved hjelp av en membranreaktor, idet fraksjonen (A) fåes som permeat og fraksjon (B= som retentat.