NO115702B - - Google Patents

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet cykloserin.

Nærværende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av den nye substans cykloserin.

I løpet av de siste 10 år er et stort antall nye antibiotiske produkter blitt kjent, og de er funnet å være i besittelse av verdifulle terapeutiske egenskaper. I løpet av den samme periode er også et stort antall antibiotiske produkter blitt oppdaget som på grunn av sin giftighet eller på grunn av et snevert antibakterielt spektrum er blitt funnet å være av liten eller ingen verdi som terapeutiske midler. Mange av de antibiotika som er blitt funnet å ha verdifulle egenskaper er aktive bare mot visse typer patogne organismer og deres brukbarhet har avtatt på grunn av utvik-lingen av motstandsdyktige stammer av patogene organismer som ikke angripes av de antibiotiske materialer. Av denne grunn eksisterer der et behov for nye antibiotika som hjelpemidler i kampen mot sykdommer forårsaket av patogene organismer.

Det nye antibiotikum cykloserin hvis

fremstilling er gjenstand for nærværende oppfinnelse, er et antibakterielt middel med et bredt spektrum og som er aktivt både mot Gram-negative og Gram-positive

bakterier omfattende mycobakteria som Mycobakterium ranae. Det nye antibiotikum fremstilles lett ved hjelp av en hittil ikke beskrevne art av en mikro-organisme som er blitt betegnet som Streptomyces orchidaceus. Organismen isolertes fra en

jordprøve som stammet fra en farm i Penn-sylvania og kulturen rensedes ved mange enkelte koloni- isolasjoner.

Cykloserin er et amfoterisk stoff som

inneholder svakt sure og svakt basiske grupper. Den antibiotiske forbindelse er lett oppløselig i vann, spesielt oppløselig i glykoler, isopropylalkohol, metanol, etanol og aceton. Forbindelsen er uoppløselig i heksan, bensin, kloroform, eter, petroleumseter, dioksan, 1-butanol, etylacetat og etylendiklorid.

Krystallinsk cykloserin tørket ved kon-stant vakuum, fantes ved kjemisk analyse å inneholde kullstoff, vannstoff, kvelstoff og surstoff i følgende mengder: Den nye antibiotiske forbindelse har et Van Slyke kvelstoffinnhold på 12,9 % og en optisk dreining på

C = 2,0 %, L = 1,0 dm, vandig oppløsning. Antibiotikumet er blitt isolert i en amorf form og i krystallinsk form i hvilket siste det foreligger i form av lange, temmelig grove hvite nåler. Cykloserin har en mole-kylvekt av 102 og oppviser karakteristisk absorpsjon i ultrafiolet lys med en bølge-lengde av 224 mikron. Antibiotikumet i krystallinsk form mykner ved 133,8° C og smelter under spaltning ved 137,2° C idet smeltepunktet bestemmes i' et Thiele rør med en forvarmet badtemperatur på 130° C og temperaturen av antibiotikumet heve-des 10, pr. minutt. Forbindelsen sublimerer langsomt ved 100° C under vakuum.

Rent omkrystallisert cykloserin er opp-løselig i vann, lite oppløselig i glykoler, isopropylalkohol, metanol, etanol dioksan, 1-butanol og aceton, og uoppløselig i heksan, benzen, kloroform, eter, petroleumeter, etylacetat og etylendiklorid. Analysert viste rent omkrystallisert cykloserin følgende innhold av kullstoff, vannstoff, kvellstoff og surstoff:

Rent omkrystallisert cykloserin har en op-OCO

tisk rotasjon av a j° „ = + 136,8°,

5461A

C = 5,0 %, L = 2,0 dm, 2N natriumhydrok-sydoppløsning. Rent omkrystallisert cykloserin har et tilsynelatende smeltepunkt på 155—157° C. Smeltepunktet ble bestemt på en Fisher - Johns smeltepunktsblokk, temperaturen av cykloserin ble hevet 6° pr. minutt.

Den nye antibiotiske forbindelse gir en gulig brun farve underkastet en ninhydrin test. Det nye materialet reagerer med kup-rionet og gir en grønn farve i vandig opp-løsning, mens med jern reagerer det og gir en rødlig brun farve i vandig oppløs-ning, og den antibiotiske aktivitet øde-legges i begge tilfeller.

Cykloserin hydrolyseres ved 140° C med IN saltsyre, og når hydrolysatet kromato-graferes på papir, gir det et stoff som gir typisk ninhydrinreaksjon på alfa-amino-syrer. Det nye antibiotikum oksyderes av vandig permanganat-oppløsning og brom-vann som begge avfarves ved tilsetning av cykloserin til oppløsningen. Antibiotikumet inaktiveres ikke i vandige oppløsninger ved tilsetning av små mengder peroksyd.

Infrarøde absorpsjonsstudier er blitt utført i en suspensjon oppnådd ved å røre ut omkrystallisert cykloserin av høy renhet mer mineralolje. Det infrarøde absorp-sjonsspektrum av materialet vises på fig. 1 av vedlagte tegninger. Kurven viser karakteristisk absorpsjon for cykloserin ved føl-gende bølgelengder uttrykt i mikrofon: 6,15, 6,55, 6,65 7,20, 7,40, 7,50, 7,85, 8,20, 8,60, 8,80, 9,00, 9,40, 10,65, 10,90, 11,30, 11,40, 12,05, 12,50, 13,25.

Disse verdier kan avleses på kurven.

Et krystallinsk sølvderivat av antibiotikumet cykloserin kan fremstilles ved å tilsette en vannoppløselig sølvforbindelse som sølvnitrat til en oppløsning av antibiotikumet idet pH for reaksjonsblandingen holdes på ca. 6,5. Det krystallinske sølvderivat bunnfaller fra den vandige opp-løsning i form av firkantede plater. Sølv-forbindelsen, muligvis sølvsaltet av cykloserin har vært underkastet infrarøde absorpsjonsstudier i form av en mineralolje suspensjon. Det infrarøde absorpsjons-spektrum av det krystallinske sølvderivat er vist på fig. II av vedføyde tegninger. Kurven «A» er absorpsjonsspektret for ren mineralolje og kurven «B» er spektret for oljesuspensjonen av sølvderivatet av cykloserin. Karakteristisk absorpsjon vil bemerkes ved følgende bølgelengder angitt i mikroner: 6,17, 6,30, 6,37, 7,09, 7,50, 7,90, 8,72, 9,05, 9,73, 10,15, 10,35, 11,11 og 12,17. Analyser av sølvsaltet angir nærværet av sølv, kullstoff, vannstoff, kvelstoff og surstoff i følgende forhold:

Cykloserin i en acetonvannblanding gir et krystallinsk derivat som ikke har noen biologisk aktivitet. Dette krystallinske derivat er blitt funnet ved kjemisk analyse å ha følgende sammensetning:

Det nye antibiotiske materiale cykloserin kan absorberes fra en vandig opp-løsning på en sterk basisk anion-utveksler harpiks i den frie base eller OH- form og kan vaskes ut fra slike harpikser ved andre anioner enn OH— som f. eks. acetat, formiat, klorid, sulfat osv. Det antibiotiske materialet kan også absorberes fra vandige oppløsninger på sterk sur kationutveksler harpiks i den frie syre eller H-j- form. Ty-piske anionutveksler harpikser på hvilke antibiotikumet absorberes, inkluderer Amberlite IRA-400 (modifisert aminharpiks av sterk basisk anion-utveksler), Amberlite IRA-410 (modifisert av sterk basisk anion-utveksler), Dowex-2 (sterk basisk anion-utveksler harpiks av divinylbenzentypen) etc. En typisk kation-utveksler harpiks på hvilken antibiotikumet absorberes er Am-berlie IR-120 (kation-utveksler harpiks av typen polystyren-kjerne-sulfonsyre).

Den antibakterielle aktivitet av cykloserin måles i enheter idet en enhet i aktivitet er ekvivalent til en enhet penicillin ved bruk av penicillin «cup plate» prøve-metoden under bruk av penicillin som standard. Ren krystallinsk cykloserin har en aktivitet på omtrent 5 enh./mg.

Cykloserin er aktiv både mot Gram-positive og Gram-negative bakterier. Den følgende tabell viser et antibakterisk spektrum for cykloserin oppnådd ved agarfor-tynnings-metoden under bruk av Strep-tomysin «Assay Agar».

Organismen som produserer cykloserin Stretomyces orchidaceus danner en lang, forgrenet luft-myselium som er godt ut-viklet og vanligvis grå-lyserød av farve. Lange, rette sporophoregrener seg ut fra luft-hyfen. De kjedef ormede sporer er ovale til sylindriske og er omtrent 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse. Kjedene er vanligvis sammensatt av 30—50 konidier. Organismen er mesophil og gir svak vekst over 37° C. Organismen er aerob og gir et i noen media oppløselig pigment som vanligvis er brunt når dannet.

De følgende karakteristika ble obser-vert i kolonimorphologi, vekstvaner og bio-kjemiske reaksjoner når organismen Streptomyces orchidaceus ble dyrket på de an-gitte substrater ved 28° C.

Glukose asparagin agar: Moderat vekst, skråagaren er godt dekket med grålig-lyserød myselium avbrutt av hvite dotter. Kjempekolonien har lavendelf arget midte som er nedtrukket. Kolonien er grålig-lyserød med hvit kant. Intet oppløselig pigment dannes. Kolonien er lett hevet med jevn kant. Sporedannelse og luftmyselium er kraftig. Baksiden er lyserød med gult senter. Conidia er i form av lange kjeder — 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner. Noe fuktighet dannes på overflaten av myseliet. Enkel koloni er omtrent 16 mm i diameter etter 15 dagers vekst.

Gelatin Stav: Veksten er moderat. Ca. halvparten av røret blir væske i løpet av 15 dager. Mørkegrått myselium kleber til overflaten og sidene av røret. Meget mørkt pigment dannes i løpet av 24 timer etter-hvert som væskedannelsen skrider frem, og dette pigment diffuserer bare inne i den flytende del.

Lakmus melk: Veksten er god med olivengrønt myselium klebende til sidene av røret. Den øvre halvdel av røret er blålig purpurfarget med den nedre halvdel av røret brunt. Ingen lukt merkes. Det opp-trer peptonisering uten koagulasjon og pH blir langsomt alkalisk. Veksten er langsom, og det tar 7 dager før en hud dannes.

Glukose nærings agar: Meget sterk vekst fremkalles på skråagaren. Kjempekolonien har lavendelfarget midte med en smal hvit kant. Mesteparten av kolonien er grå. Intet pigment dannes. Kolonien er 25 mm i diameter i løpet av 15 dager. Conidia er rette kjeder med 30—50 conidia pr. kjede. De er 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse og nesten sylindriske i form.

Nærings agar: Veksten er meget dårlig på skråagaren. Kjempekolonien har grålig mørkt senter med hvit kant. I løpet av 15 dager er kolonien 11 mm i diameter med kjøttfarget vegetativt myselium på den ytre kant. Baksiden har beige senter med resten av kolonien med kremfarge. Intet pigment dannes. Conidial morfologi og arrangement likner de funnet på glukose agar: Potet terning: Veksten er meget sterk, grågrønn i farge og sterkt vridd. Kulturen har glatt overflate med noe hvitt luft-myselium. Brunt pigment kan påvises i løpet av 24 timer, hvilket skifter over til grønnlig grått og dif funderer gjennom poteten.

Bly acetat agar: Veksten er skrantet med meget lite luftmyselium og sporer.

Ingen H2S dannes. Noe brunt pigment dif-f under er gjennom mediet. En hård, glatt skinnende overflate dannes i løpet av 15 dager. Baksiden av kolonien er brun.' ■■■

Kalsiummalat: Veksten er dårlig. Hvitt luftmyselium er radialt. Intet oppløselig pigment dannes, og ingen klaring rundt kolonien bemerkes. Kalsiummalat utnyttes. I løpet av 15 dager er kolonien ca. 10 mm i diameter. Den er tynn, og dens grener med hvitt luftmyselium har et hvitt, kornet utseende. Små, perlende væske-uttrednin-ger fremkalles på myseliums overflate. Baksiden er lysegrønn. Conidiale kjeder er korte med 10—20 conidia pr. kjede.

Stivelsesnitrat agar: Veksten er moderat. Kolonien har blålig grått senter med konsentriske ringer og ligger flatt med overflaten av agaren. Intet oppløselig pigment dannes. Stivelse utnyttes som kullstoff-kilde, og NO., brukes som kvelstoff-kilde. Kolonistørrelsen etter 15 dager er<1> ca. 14 mm i diameter.

Stivelse agar B: Veksten er moderat; bedre enn med stivelsesnitrat agar. Kolonien har lavendelfarget overflate med rå kanter og er ca. 20 mm i diameter etter 15 dager. Intet oppløselig pigment produseres. Organismen kan nyttiggjøre stivelse og/ eller asparagin som kullstoff-kilde. Den kan også nyttiggjøre asparagin og/eller nitrater som kvelstoff-kilde. Konidiene er i form av rette kjeder med ca. 50—80 konidier pr. kjede. Konidiene har oval til sylin-drisk form og er ca. 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse.

Emeron' s agar: Veksten er moderat med lysegrå myseliumsvekst avbrutt med hvite dotter. Veksten er hurtig i 24 timer. Baksiden etter 15 dager er mellombrun med krem kanter. Lysebrun pigment dannes i løpet av 15 dager. Konidie kjedene er for-holdsvis korte, 10—20 konidier pr. kjede. Konidiene er 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse.

Ty rosin agar: Veksten er meget dårlig; bare luftmyselium vises med liten, sporedannelse. Kolonien er bakterieliknende — meget med ru kanter og ca. 5 mm i diameter. Baksiden av kolonien er gul. Intet pigment produseres. Konidiene er i form av rette kjeder med ca. 20—25 konidier pr. kjede. Tyrosin og/eller (NH4)2S04 er dår-lige kilder for kvelstoff.

Koboltamidex agar: Veksten er sterk i 24 timer. Etter 15 dagers vekst, dyp laven-del farge med orange-beige ring opptil en lysegrå kant. Kolonien er ca. 23 mm i diameter. Et lysebrunt pigment dannes. Baksiden av kolonien er lys beige med krem kant. Konidiene er kjeder på 30—50 konidier pr. kjede og er 1,0—1,2 gange 1,3—1,5 mikroner i størrelse.

Bennetts agar: Veksten er sparsom og hvit til å begynne med, blir derpå sterk med grålig-lyserød luftmyselium med hvite streker. Kolonien er ca. 20 mm i diameter etter 15 dager. Veksten er langsom; karrig etter utløpet av 3 dager. Kolonien er grålig-lyserød med hvit irregulær kant. Baksiden er kremfarget beige. Et lysebrunt pigment dannes. Konidiene er 30—50 pr. rett kjede og ca. 0,8—1,0 gange 1,0—1,5 mikroner. Konidiene er ovale til sylindriske av form.

Natriumalbuminat agar: Veksten er sparsom til moderat i løpet av 15 dager. Myseliveksten har et grått, fint, mugg-soppliknende utseende som langsomt kom-mer til syne. Kolonien sr stor, ved utløpet av 15 dager er den ca. 23 mm i diameter. Sporene stråler ut fra1 sentrum av kolonien og forsvinner inn i en tynn, fargeløs myse-lievekst. Baksiden av kolonien er kremlik-nende lyserød. Konidiene er 1,0—1,2 gange 1,5—1,7 mikroner i diameter. Intet pigment dannes.

Cykloserin har ikke hittil blitt vist å være brukbar ved menneskelig terapi i noen av sine kjente former. Det er imidlertid blitt påvist at cykloserin er et effektivt vekstfremmende materiale for bruk som tilsatt dyre- og fjærfeføde. Den følgende tabell viser resultatene av kyllingvekst-stu-dier i hvilke den gjennomsnittlige gevinst i grupper på 20 kyllinger matet med en vanlig handelstype-rasjon ble sammenlik-net med den gjennomsnittlige vektgevin-sten for en gruppe på 20 kyllinger matet' med samme handelstype-rasjon med tillegg av 1 pst. av for inneholdende 0,3 enheter av antibiotikumet cykloserin pr. milligram. Tallene viser gjennomsnittet av tre forsøk pr. kylling for kontrollen og to forsøk for kyllinger matet med rasjonen inneholdende cykloserin. Kyllingene ble tatt til prøve på den dag de ble klekket, og prøven avsluttet etter 30 dager på prøvekosten.

Cykloserin fremstilles fra den oven-nevnte organisme Streptomyces orchidaceus i egnete næringsmedier. Medier som inneholder en egnet proteinkilde og en egnet kilde av kullhydrater er tilstrekkelig for cykloserin produksjon når luft tilføres til næringsmediene som smittes ved en temperatur mellom 20 og 30° C. Vanligvis foretrekkes temperaturer på ca. 28° C for dyrkning av organismer i et næringsmedium.

De mest foretrukne proteinstoffer brukt som kvelstoff-kilder i næringsmedier for cykloserin fremstilling, er blitt funnet å være soyabønne-produkter. Egnede soya-bønne-produkter omfatter soyabønne-olje-mel, vanlig soyabønne oppløst mel, fullstendig ristet soyagrøp, «Kelsovsoy» (fin-malt raffinert protein fra soyabønner), «Nutrisoy» (tørt soyabønne melliknende produkt), etc. Andre proteinkilder som kan brukes for næringsmedier for cykloserin fremstilling er alfa-alfamel aminosyrekake, faste melkebestanddeler, mysenæring, tør-ket hvetekli, malt hvete, kasein, «Ossein konsentrat» (konsentrert albuminmate-riale som blir tilbake etter å ha behandlet ben med saltsyre), «Edamin» (enzymatisk digering av melkealbumin, etc. Imidlertid resulterer disse materialer vanligvis i en produksjon med lavere utbytter av cykloserin enn når soyabønneprodukter brukes.

En egnet kullhydratkilde som kan brukes i næringsmedier for fremstilling av det nye antibiotiske cykloserin er glukose. Andre kullhydratkilder som kan brukes er sucrose, melkesukker, maltsukker, stivelse glycerol, etc.

I sin alminnelighet er det funnet at utbyttene av cykloserin økes ved tilsetning av kalsiumkarbonat til næringsmediet. For maksimalproduksjon av cykloserin skal mediet inneholde fra ca. 0,25 til ca. 4 pst. kull-hydrat og fra ca. 0,25 til ca. 5 vektsprosent av proteinmaterialet. Kalsiumkarbonat skal brukes i mengder som beløper seg til fra ca. 0,1 til ca. 1,5 vektsprosent. Ved fremstillingen av den nye blanding foretrekkes et medium sammensatt av ca. 3 pst. raffinert soyabønne-mel, ca. 2 pst. glukose og ca. 0,5 pst. kalsiumkarbonat.

Da organismen Streptomyces orchidaceus er en aerobisk organisme, må luft til-føres til næringsmediet og omrøring kan brukes for å dispergere den tilsatte luft gjennom næringsmediet. Omrøring og luft-ning vil være klare for fagmannen så vel som ethvert av de vanlige brukte midler er egnet for cykloserin fremstilling. Det er vanligvis nødvendig å tilsette et antiskum-memiddel til næringsmediet under fermenteringen for fremstillingen av cykloserin, og ethvert av de vanlige antiskumme-midler som f. eks. mineralolje, talgolje, etc. kan brukes for dette formål.

De følgende eksempler gis for å klar-gjøre fremstillingen av cykloserin.

Eksempel 1:

En porsjon av et medium på 1100 liter som består av: som nødvendig ble smittet i et gjærings-kar med en kultur av organismen Streptomyces orchidaceus. Mediet ble luftet ved til-føring av luft 0,45 ms pr. minutt under et trykk av 0,7 kg pr. cm-'. Fermenteringen fortsattes ved en temperatur på 28° C i 96 timer, og den følgende tabell viser meng-dene cykloserin produsert ved forskjellige intervaller under fermentering.

Cykloserin, fremstillet som beskrevet ovenfor, kan utvinnes fra næringsmediet i hvilken der fremstilles ved å nyttiggjøre seg materialets kjemiske egenskaper. Vanligvis foretrekkes det å absorbere antibiotikumet fra næringsmediet i hvilket det er fremstillet på en sterkt basisk anion-nt-veksler harpiks i hydroksydform. Cykloserin elueres fra anion-utveksler harpiksen med et anion forskjellig fra hydroksyd, avfarves med kull, og antibiotikumet bunn-felles fra eluatet som krystallinsk sølvderi-vat ved å tilsette et oppløselig sølvsalt til eluatet. Derpå blandes det krystallinske sølvderivat av cykloserin med vann og tilsettes et surt materiale til blandingen som har et anion med evne til å danne et uopp-løselig salt med sølv for å bunnfelle et uoppløselig sølvsalt og etterlate cykloserin i oppløsningen. Den tilbakeblivende opp-løsning kan fryses til tørrhet under vakuum for å oppnå cykloserin i en fast, amorf form eller et med vann blandbart oppløs-ningsmiddel i hvilket cykloserin er uopp-løselig, eller bare svakt oppløselig, kan tilsettes til oppløsningen for å bunnfelle cykloserin i krystallinsk form. Hvis det bland-bare oppløsningsmiddel som brukes er aceton, kan filtratet, etter fjerning av krystallinsk cykloserin, las henstå i flere timer hvorpå etter konsentrering i vakuum, et krystallinsk acetonderivat av cykloserin vil bunnfelle fra oppløsningen.

Det følgende eksempel gjengis for å illustrere utvinningen av cykloserin fra næringsmedia i hvilke det er fremstillet.

Eksempel 2.

En 300 liters porsjon av. et nærings-

medium i hvilket cykloserin fremstiltes og som inneholdt 4,8 enheter cykloserin pr.

ml filtrertes og førtes gjennom 10 liter Dowex-2 (sterk, basisk anion-utveksler

harpiks) i OH- form i en 15 cm kolonne med en strømningshastighet på 1200 ml pr.

minutt. Kolonnen ble derpå vasket med vann og cykloserin eluert fra harpiksen med 0,2N og svovelsyre med en hastighet på 1200 ml pr. minutt, og eluatet samledes

opp i 18 to-liters fraksjoner. pH fra elu-

atene ble derpå justert til ca. 7,0, hvoretter 1 vektsprosent av avfargende kull blande-

des inn i eluatfraksj onene og ble derpå filt-

rert fra. Til de avfargede eluater tilsattes derpå 0,5 mg sølvnitrat pr. enhet antibio-

tisk aktivitet inneholdt i eluatet, og pH opprettholdtes ved 6,5 med natriumhydrok-

syd. Et krystallinsk sølvderivat av cyklo-

serin bunnfeltes fra eluatet og filtrertes,

vaskedes med aceton og tørkedes i vakuum.

Den følgende tabell gir resultatene av 9 av eluatfraksj onene nevnt ovenfor.

En 10-grams porsjon av krystallinsk

sølvderivat fra eluat 14 vist i Tabell IV ble blandet med 60 ml vann, og til denne blan-

ding tilsettes 89 ml 0,5165xN saltsyre. Sølv-

klorid bunnfeltes fra oppløsningen og fjer-

nedes derfra ved filtrering. Den tilbakebli-

vende oppløsning ble frosset tørr i vakuum og inneholdt 4,4 gram fast, amorf cyklose-

rin med 5,15 enheter pr. mg.

En 1-grams porsjon av amorf Strepto-

myces orchidaceus oppnådd som beskrevet ovenfor, oppløstes i 7,5 ml vann, og til denne oppløsning tilsattes 5 ml aceton.

Krystallinsk cykloserin bunnfalt fra opp-

løsningen hvorpå ytterligere 5 ml aceton tilsattes for å sikre fullstendig krystallise-

ring. Krystallene ble filtrert fra oppløs-

ningen og ble vasket med aceton og ga 0,6177 gram luft-tørre krystaller inne-

holdende 4.32 enheter pr. mg og 14 pst.

fuktighet. Etter fjerning av fuktigheten ved tørring, viste materialet 5,02 enheter pr. mg. Filtratet etter fjerning av krystal-

linsk cykloserin fikk stå over natten, kon-

sentrertes derpå i vakuum til ca. 5,0 ml hvorpå et krystallinsk acetonderivåt bunn-

falt fra oppløsningen. Krystallene filtrertes fra oppløsningen, ble vasket med aceton,

ble tørket og ga 0,1468 gram av et materi-

ale som ved forsøk viste ingen biologisk effekt.

Claims (3)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet cykloserin med aktivitet overfor både Gram-positive og Gram-nega-

tive organismer, og sølvsaltet av samme,karakterisert ved at en stamme Streptomyces orchidaceus, som forekommer i form av konidier av størrelse ca. 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner, dyrkes under aerobe be-tingelser i et næringsmedium, og at et am-fotert produkt som er oppløselig i vann, del-vis oppløselig i glykoler, isopropylalkohol, metanol, etanol, dioksan, 1-butanol og aceton og uoppløselig i heksan, benzol, kloroform, eter, petroleumseter, etylacetat og etylendiklorid utvinnes fra næringsmediet, hvilket produkt inneholder 6,00 pst. hydro-gen, 35,49 pst. kullstoff, 26,55 pst. nitrogen og 31,96 pst. oksygen (ved subtraksjon), og som har en optisk dreining i 2N natrium- 25 hydroksydoppløsning på [a]5461A = + 136,8°, C = 5,0 pst. L = 2,0 dm, og som i krystallinsk form i en mineraloljesuspen-sjon oppviser karakteristisk adsorpsjon i spektrets infrarøde del ved følgende bølge-lengder uttrykt i mikroner: 6.15, 6.55, 6.65, 7.20, 7.40, 7.50, 7.85, 8.20, 8.80, 9.00, 9.40 10.65, 10.90, 11.30, 11.40, 12.05, 12.50 og 13.25 og hvilket amfotere produkt eventuelt omdan-nes til et krystallinsk sølvsalt ved at en vannopløselig sølvforbindelse settes til en oppløsning av det utvunne antibiotikum, idet pH for reaksjonsblandingen holdes på ca. 6.5.

2. Fremgangsmåte etter påstand 1, karakterisert ved at kvellstoffkilden i næringsmediet fortrinsvis er soyabønnepro- dukter, som r', eks. soyabønnemel, ristet soyagrøp etc.

3. Fremgangsmåte etter påstand 1 og 2, karakterisert ved at kultiveringen av organismen Streptomyces orchidaceus, skjer i nærvær av kalsiumkarbonat i en mengde av 0,1 til 1,5 vektsprosent.