NO115702B

NO115702B -

Info

Publication number: NO115702B
Application number: NO16716667A
Authority: NO
Inventors: R Turner
Original assignee: Improved Machinery Inc
Priority date: 1966-03-09
Filing date: 1967-03-07
Publication date: 1968-11-18
Also published as: FI50157B; FI50157C

Description

Fremgangsmåte for fremstilling av antibiotikumet cykloserin. Process for producing the antibiotic cycloserine.

Nærværende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for fremstilling av den nye substans cykloserin. The present invention relates to a method for producing the new substance cycloserine.

I løpet av de siste 10 år er et stort antall nye antibiotiske produkter blitt kjent, og de er funnet å være i besittelse av verdifulle terapeutiske egenskaper. I løpet av den samme periode er også et stort antall antibiotiske produkter blitt oppdaget som på grunn av sin giftighet eller på grunn av et snevert antibakterielt spektrum er blitt funnet å være av liten eller ingen verdi som terapeutiske midler. Mange av de antibiotika som er blitt funnet å ha verdifulle egenskaper er aktive bare mot visse typer patogne organismer og deres brukbarhet har avtatt på grunn av utvik-lingen av motstandsdyktige stammer av patogene organismer som ikke angripes av de antibiotiske materialer. Av denne grunn eksisterer der et behov for nye antibiotika som hjelpemidler i kampen mot sykdommer forårsaket av patogene organismer. During the last 10 years, a large number of new antibiotic products have become known and have been found to possess valuable therapeutic properties. During the same period, a large number of antibiotic products have also been discovered which, because of their toxicity or because of a narrow antibacterial spectrum, have been found to be of little or no value as therapeutic agents. Many of the antibiotics which have been found to have valuable properties are active only against certain types of pathogenic organisms and their utility has declined due to the development of resistant strains of pathogenic organisms which are not attacked by the antibiotic materials. For this reason, there is a need for new antibiotics as aids in the fight against diseases caused by pathogenic organisms.

Det nye antibiotikum cykloserin hvis The new antibiotic cycloserine if

fremstilling er gjenstand for nærværende oppfinnelse, er et antibakterielt middel med et bredt spektrum og som er aktivt både mot Gram-negative og Gram-positive preparation is the subject of the present invention, is an antibacterial agent with a broad spectrum and which is active against both Gram-negative and Gram-positive

bakterier omfattende mycobakteria som Mycobakterium ranae. Det nye antibiotikum fremstilles lett ved hjelp av en hittil ikke beskrevne art av en mikro-organisme som er blitt betegnet som Streptomyces orchidaceus. Organismen isolertes fra en bacteria including mycobacteria such as Mycobacterium ranae. The new antibiotic is easily produced using a hitherto undescribed species of micro-organism which has been named Streptomyces orchidaceus. The organism was isolated from a

jordprøve som stammet fra en farm i Penn-sylvania og kulturen rensedes ved mange enkelte koloni- isolasjoner. soil sample which originated from a farm in Pennsylvania and the culture was purified by many individual colony isolations.

Cykloserin er et amfoterisk stoff som Cycloserine is an amphoteric substance which

inneholder svakt sure og svakt basiske grupper. Den antibiotiske forbindelse er lett oppløselig i vann, spesielt oppløselig i glykoler, isopropylalkohol, metanol, etanol og aceton. Forbindelsen er uoppløselig i heksan, bensin, kloroform, eter, petroleumseter, dioksan, 1-butanol, etylacetat og etylendiklorid. contains weakly acidic and weakly basic groups. The antibiotic compound is readily soluble in water, particularly soluble in glycols, isopropyl alcohol, methanol, ethanol and acetone. The compound is insoluble in hexane, petrol, chloroform, ether, petroleum ether, dioxane, 1-butanol, ethyl acetate and ethylene dichloride.

Krystallinsk cykloserin tørket ved kon-stant vakuum, fantes ved kjemisk analyse å inneholde kullstoff, vannstoff, kvelstoff og surstoff i følgende mengder: Den nye antibiotiske forbindelse har et Van Slyke kvelstoffinnhold på 12,9 % og en optisk dreining på Crystalline cycloserine dried under constant vacuum was found by chemical analysis to contain carbon, water, nitrogen and oxygen in the following amounts: The new antibiotic compound has a Van Slyke nitrogen content of 12.9% and an optical rotation of

C = 2,0 %, L = 1,0 dm, vandig oppløsning. Antibiotikumet er blitt isolert i en amorf form og i krystallinsk form i hvilket siste det foreligger i form av lange, temmelig grove hvite nåler. Cykloserin har en mole-kylvekt av 102 og oppviser karakteristisk absorpsjon i ultrafiolet lys med en bølge-lengde av 224 mikron. Antibiotikumet i krystallinsk form mykner ved 133,8° C og smelter under spaltning ved 137,2° C idet smeltepunktet bestemmes i' et Thiele rør med en forvarmet badtemperatur på 130° C og temperaturen av antibiotikumet heve-des 10, pr. minutt. Forbindelsen sublimerer langsomt ved 100° C under vakuum. C = 2.0%, L = 1.0 dm, aqueous solution. The antibiotic has been isolated in an amorphous form and in a crystalline form, in the latter of which it exists in the form of long, rather coarse white needles. Cycloserine has a molecular weight of 102 and exhibits characteristic absorption in ultraviolet light with a wavelength of 224 microns. The antibiotic in crystalline form softens at 133.8° C and melts during cleavage at 137.2° C, the melting point being determined in a Thiele tube with a preheated bath temperature of 130° C and the temperature of the antibiotic raised 10, per minute. The compound sublimes slowly at 100° C under vacuum.

Rent omkrystallisert cykloserin er opp-løselig i vann, lite oppløselig i glykoler, isopropylalkohol, metanol, etanol dioksan, 1-butanol og aceton, og uoppløselig i heksan, benzen, kloroform, eter, petroleumeter, etylacetat og etylendiklorid. Analysert viste rent omkrystallisert cykloserin følgende innhold av kullstoff, vannstoff, kvellstoff og surstoff: Pure recrystallized cycloserine is soluble in water, slightly soluble in glycols, isopropyl alcohol, methanol, ethanol dioxane, 1-butanol and acetone, and insoluble in hexane, benzene, chloroform, ether, petroleum ether, ethyl acetate and ethylene dichloride. When analyzed, pure recrystallized cycloserine showed the following content of carbon, water, sulfur and oxygen:

Rent omkrystallisert cykloserin har en op-OCO Pure recrystallized cycloserine has an op-OCO

tisk rotasjon av a j° „ = + 136,8°, tical rotation of a j° „ = + 136.8°,

5461A 5461A

C = 5,0 %, L = 2,0 dm, 2N natriumhydrok-sydoppløsning. Rent omkrystallisert cykloserin har et tilsynelatende smeltepunkt på 155—157° C. Smeltepunktet ble bestemt på en Fisher - Johns smeltepunktsblokk, temperaturen av cykloserin ble hevet 6° pr. minutt. C = 5.0%, L = 2.0 dm, 2N sodium hydroxide solution. Pure recrystallized cycloserine has an apparent melting point of 155-157° C. The melting point was determined on a Fisher-Johns melting point block, the temperature of cycloserine was raised 6° per minute.

Den nye antibiotiske forbindelse gir en gulig brun farve underkastet en ninhydrin test. Det nye materialet reagerer med kup-rionet og gir en grønn farve i vandig opp-løsning, mens med jern reagerer det og gir en rødlig brun farve i vandig oppløs-ning, og den antibiotiske aktivitet øde-legges i begge tilfeller. The new antibiotic compound gives a yellowish brown color when subjected to a ninhydrin test. The new material reacts with the cup ion and gives a green color in aqueous solution, while with iron it reacts and gives a reddish brown color in aqueous solution, and the antibiotic activity is destroyed in both cases.

Cykloserin hydrolyseres ved 140° C med IN saltsyre, og når hydrolysatet kromato-graferes på papir, gir det et stoff som gir typisk ninhydrinreaksjon på alfa-amino-syrer. Det nye antibiotikum oksyderes av vandig permanganat-oppløsning og brom-vann som begge avfarves ved tilsetning av cykloserin til oppløsningen. Antibiotikumet inaktiveres ikke i vandige oppløsninger ved tilsetning av små mengder peroksyd. Cycloserine is hydrolysed at 140° C with 1N hydrochloric acid, and when the hydrolyzate is chromatographed on paper, it gives a substance which gives a typical ninhydrin reaction to alpha-amino acids. The new antibiotic is oxidized by aqueous permanganate solution and bromine water, both of which are decolorized by adding cycloserine to the solution. The antibiotic is not inactivated in aqueous solutions by the addition of small amounts of peroxide.

Infrarøde absorpsjonsstudier er blitt utført i en suspensjon oppnådd ved å røre ut omkrystallisert cykloserin av høy renhet mer mineralolje. Det infrarøde absorp-sjonsspektrum av materialet vises på fig. 1 av vedlagte tegninger. Kurven viser karakteristisk absorpsjon for cykloserin ved føl-gende bølgelengder uttrykt i mikrofon: 6,15, 6,55, 6,65 7,20, 7,40, 7,50, 7,85, 8,20, 8,60, 8,80, 9,00, 9,40, 10,65, 10,90, 11,30, 11,40, 12,05, 12,50, 13,25. Infrared absorption studies have been carried out in a suspension obtained by stirring recrystallized cycloserine of high purity with more mineral oil. The infrared absorption spectrum of the material is shown in fig. 1 of the attached drawings. The curve shows characteristic absorption for cycloserine at the following wavelengths expressed in microns: 6.15, 6.55, 6.65 7.20, 7.40, 7.50, 7.85, 8.20, 8.60, 8.80, 9.00, 9.40, 10.65, 10.90, 11.30, 11.40, 12.05, 12.50, 13.25.

Disse verdier kan avleses på kurven. These values can be read on the curve.

Et krystallinsk sølvderivat av antibiotikumet cykloserin kan fremstilles ved å tilsette en vannoppløselig sølvforbindelse som sølvnitrat til en oppløsning av antibiotikumet idet pH for reaksjonsblandingen holdes på ca. 6,5. Det krystallinske sølvderivat bunnfaller fra den vandige opp-løsning i form av firkantede plater. Sølv-forbindelsen, muligvis sølvsaltet av cykloserin har vært underkastet infrarøde absorpsjonsstudier i form av en mineralolje suspensjon. Det infrarøde absorpsjons-spektrum av det krystallinske sølvderivat er vist på fig. II av vedføyde tegninger. Kurven «A» er absorpsjonsspektret for ren mineralolje og kurven «B» er spektret for oljesuspensjonen av sølvderivatet av cykloserin. Karakteristisk absorpsjon vil bemerkes ved følgende bølgelengder angitt i mikroner: 6,17, 6,30, 6,37, 7,09, 7,50, 7,90, 8,72, 9,05, 9,73, 10,15, 10,35, 11,11 og 12,17. Analyser av sølvsaltet angir nærværet av sølv, kullstoff, vannstoff, kvelstoff og surstoff i følgende forhold: A crystalline silver derivative of the antibiotic cycloserine can be prepared by adding a water-soluble silver compound such as silver nitrate to a solution of the antibiotic, keeping the pH of the reaction mixture at approx. 6.5. The crystalline silver derivative precipitates from the aqueous solution in the form of square plates. The silver compound, possibly the silver salt of cycloserine, has been subjected to infrared absorption studies in the form of a mineral oil suspension. The infrared absorption spectrum of the crystalline silver derivative is shown in fig. II of attached drawings. Curve "A" is the absorption spectrum for pure mineral oil and curve "B" is the spectrum for the oil suspension of the silver derivative of cycloserine. Characteristic absorption will be noted at the following wavelengths in microns: 6.17, 6.30, 6.37, 7.09, 7.50, 7.90, 8.72, 9.05, 9.73, 10.15 , 10.35, 11.11 and 12.17. Analyzes of the silver salt indicate the presence of silver, carbon, water, nitrogen and oxygen in the following proportions:

Cykloserin i en acetonvannblanding gir et krystallinsk derivat som ikke har noen biologisk aktivitet. Dette krystallinske derivat er blitt funnet ved kjemisk analyse å ha følgende sammensetning: Cycloserine in an acetone-water mixture gives a crystalline derivative that has no biological activity. This crystalline derivative has been found by chemical analysis to have the following composition:

Det nye antibiotiske materiale cykloserin kan absorberes fra en vandig opp-løsning på en sterk basisk anion-utveksler harpiks i den frie base eller OH- form og kan vaskes ut fra slike harpikser ved andre anioner enn OH— som f. eks. acetat, formiat, klorid, sulfat osv. Det antibiotiske materialet kan også absorberes fra vandige oppløsninger på sterk sur kationutveksler harpiks i den frie syre eller H-j- form. Ty-piske anionutveksler harpikser på hvilke antibiotikumet absorberes, inkluderer Amberlite IRA-400 (modifisert aminharpiks av sterk basisk anion-utveksler), Amberlite IRA-410 (modifisert av sterk basisk anion-utveksler), Dowex-2 (sterk basisk anion-utveksler harpiks av divinylbenzentypen) etc. En typisk kation-utveksler harpiks på hvilken antibiotikumet absorberes er Am-berlie IR-120 (kation-utveksler harpiks av typen polystyren-kjerne-sulfonsyre). The new antibiotic material cycloserine can be absorbed from an aqueous solution on a strong basic anion-exchange resin in the free base or OH- form and can be washed out of such resins by anions other than OH— such as e.g. acetate, formate, chloride, sulfate, etc. The antibiotic material can also be absorbed from aqueous solutions of strong acid cation exchange resin in the free acid or H-j- form. Typical anion exchange resins on which the antibiotic is absorbed include Amberlite IRA-400 (modified amine resin of strong base anion exchanger), Amberlite IRA-410 (modified of strong base anion exchanger), Dowex-2 (strong base anion exchanger resin of the divinylbenzene type) etc. A typical cation exchange resin on which the antibiotic is absorbed is Amberlie IR-120 (polystyrene core sulfonic acid type cation exchange resin).

Den antibakterielle aktivitet av cykloserin måles i enheter idet en enhet i aktivitet er ekvivalent til en enhet penicillin ved bruk av penicillin «cup plate» prøve-metoden under bruk av penicillin som standard. Ren krystallinsk cykloserin har en aktivitet på omtrent 5 enh./mg. The antibacterial activity of cycloserine is measured in units, as one unit of activity is equivalent to one unit of penicillin using the penicillin "cup plate" test method using penicillin as a standard. Pure crystalline cycloserine has an activity of approximately 5 units/mg.

Cykloserin er aktiv både mot Gram-positive og Gram-negative bakterier. Den følgende tabell viser et antibakterisk spektrum for cykloserin oppnådd ved agarfor-tynnings-metoden under bruk av Strep-tomysin «Assay Agar». Cycloserine is active against both Gram-positive and Gram-negative bacteria. The following table shows an antibacterial spectrum for cycloserine obtained by the agar dilution method using Strep-tomycin "Assay Agar".

Organismen som produserer cykloserin Stretomyces orchidaceus danner en lang, forgrenet luft-myselium som er godt ut-viklet og vanligvis grå-lyserød av farve. Lange, rette sporophoregrener seg ut fra luft-hyfen. De kjedef ormede sporer er ovale til sylindriske og er omtrent 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse. Kjedene er vanligvis sammensatt av 30—50 konidier. Organismen er mesophil og gir svak vekst over 37° C. Organismen er aerob og gir et i noen media oppløselig pigment som vanligvis er brunt når dannet. The cycloserine-producing organism Stretomyces orchidaceus forms a long, branching aerial mycelium that is well developed and usually grey-pink in colour. Long, straight sporophores branch out from the aerial hyphae. The chain-shaped spores are oval to cylindrical and are approximately 1.0-1.5 by 1.5-2.0 microns in size. The chains are usually composed of 30-50 conidia. The organism is mesophilic and produces weak growth above 37° C. The organism is aerobic and produces a pigment soluble in some media which is usually brown when formed.

De følgende karakteristika ble obser-vert i kolonimorphologi, vekstvaner og bio-kjemiske reaksjoner når organismen Streptomyces orchidaceus ble dyrket på de an-gitte substrater ved 28° C. The following characteristics were observed in colony morphology, growth habits and biochemical reactions when the organism Streptomyces orchidaceus was grown on the stated substrates at 28°C.

Glukose asparagin agar: Moderat vekst, skråagaren er godt dekket med grålig-lyserød myselium avbrutt av hvite dotter. Kjempekolonien har lavendelf arget midte som er nedtrukket. Kolonien er grålig-lyserød med hvit kant. Intet oppløselig pigment dannes. Kolonien er lett hevet med jevn kant. Sporedannelse og luftmyselium er kraftig. Baksiden er lyserød med gult senter. Conidia er i form av lange kjeder — 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner. Noe fuktighet dannes på overflaten av myseliet. Enkel koloni er omtrent 16 mm i diameter etter 15 dagers vekst. Glucose asparagine agar: Moderate growth, the agar slant is well covered with greyish-pink mycelium interrupted by white dots. The giant colony has a lavender colored center which is drawn down. The colony is greyish-pink with a white border. No soluble pigment is formed. The colony is slightly raised with a smooth edge. Spore formation and aerial mycelium are vigorous. The back is light pink with a yellow center. Conidia are in the form of long chains — 1.0—1.5 by 1.5—2.0 microns. Some moisture forms on the surface of the mycelium. Single colony is approximately 16 mm in diameter after 15 days of growth.

Gelatin Stav: Veksten er moderat. Ca. halvparten av røret blir væske i løpet av 15 dager. Mørkegrått myselium kleber til overflaten og sidene av røret. Meget mørkt pigment dannes i løpet av 24 timer etter-hvert som væskedannelsen skrider frem, og dette pigment diffuserer bare inne i den flytende del. Gelatin Stav: Growth is moderate. About. half of the tube becomes liquid within 15 days. Dark gray mycelium adheres to the surface and sides of the tube. Very dark pigment is formed within 24 hours as liquefaction progresses, and this pigment only diffuses inside the liquid part.

Lakmus melk: Veksten er god med olivengrønt myselium klebende til sidene av røret. Den øvre halvdel av røret er blålig purpurfarget med den nedre halvdel av røret brunt. Ingen lukt merkes. Det opp-trer peptonisering uten koagulasjon og pH blir langsomt alkalisk. Veksten er langsom, og det tar 7 dager før en hud dannes. Litmus milk: Growth is good with olive green mycelium clinging to the sides of the tube. The upper half of the tube is bluish purple with the lower half of the tube brown. No smell is noticeable. Peptonization occurs without coagulation and the pH slowly becomes alkaline. Growth is slow, and it takes 7 days for a skin to form.

Glukose nærings agar: Meget sterk vekst fremkalles på skråagaren. Kjempekolonien har lavendelfarget midte med en smal hvit kant. Mesteparten av kolonien er grå. Intet pigment dannes. Kolonien er 25 mm i diameter i løpet av 15 dager. Conidia er rette kjeder med 30—50 conidia pr. kjede. De er 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse og nesten sylindriske i form. Glucose nutrient agar: Very strong growth is induced on the agar slant. The giant colony has a lavender colored center with a narrow white border. Most of the colony is gray. No pigment is formed. The colony is 25 mm in diameter within 15 days. Conidia are straight chains with 30-50 conidia per chain. They are 1.0—1.5 by 1.5—2.0 microns in size and nearly cylindrical in shape.

Nærings agar: Veksten er meget dårlig på skråagaren. Kjempekolonien har grålig mørkt senter med hvit kant. I løpet av 15 dager er kolonien 11 mm i diameter med kjøttfarget vegetativt myselium på den ytre kant. Baksiden har beige senter med resten av kolonien med kremfarge. Intet pigment dannes. Conidial morfologi og arrangement likner de funnet på glukose agar: Potet terning: Veksten er meget sterk, grågrønn i farge og sterkt vridd. Kulturen har glatt overflate med noe hvitt luft-myselium. Brunt pigment kan påvises i løpet av 24 timer, hvilket skifter over til grønnlig grått og dif funderer gjennom poteten. Nutrient agar: Growth is very poor on slanted agar. The giant colony has a grayish dark center with a white border. Within 15 days the colony is 11 mm in diameter with flesh colored vegetative mycelium on the outer edge. The back has a beige center with the rest of the colony a cream color. No pigment is formed. Conidial morphology and arrangement are similar to those found on glucose agar: Potato cube: The growth is very strong, grey-green in color and strongly twisted. The culture has a smooth surface with some white aerial mycelium. Brown pigment can be detected within 24 hours, which changes to greenish gray and diffuses through the potato.

Bly acetat agar: Veksten er skrantet med meget lite luftmyselium og sporer. Lead acetate agar: The growth is stunted with very little aerial mycelium and spores.

Ingen H2S dannes. Noe brunt pigment dif-f under er gjennom mediet. En hård, glatt skinnende overflate dannes i løpet av 15 dager. Baksiden av kolonien er brun.' ■■■ No H2S is formed. Some brown pigment dif-f below is through the medium. A hard, smooth shiny surface forms within 15 days. The back of the colony is brown.' ■■■

Kalsiummalat: Veksten er dårlig. Hvitt luftmyselium er radialt. Intet oppløselig pigment dannes, og ingen klaring rundt kolonien bemerkes. Kalsiummalat utnyttes. I løpet av 15 dager er kolonien ca. 10 mm i diameter. Den er tynn, og dens grener med hvitt luftmyselium har et hvitt, kornet utseende. Små, perlende væske-uttrednin-ger fremkalles på myseliums overflate. Baksiden er lysegrønn. Conidiale kjeder er korte med 10—20 conidia pr. kjede. Calcium malate: Growth is poor. White aerial mycelium is radial. No soluble pigment is formed, and no clearing around the colony is noted. Calcium malate is utilized. Within 15 days, the colony is approx. 10 mm in diameter. It is thin, and its branches with white aerial mycelium have a white, grainy appearance. Small, pearly liquid secretions are produced on the surface of the mycelium. The back is light green. Conidial chains are short with 10-20 conidia per chain.

Stivelsesnitrat agar: Veksten er moderat. Kolonien har blålig grått senter med konsentriske ringer og ligger flatt med overflaten av agaren. Intet oppløselig pigment dannes. Stivelse utnyttes som kullstoff-kilde, og NO., brukes som kvelstoff-kilde. Kolonistørrelsen etter 15 dager er<1> ca. 14 mm i diameter. Starch nitrate agar: Growth is moderate. The colony has a bluish gray center with concentric rings and lies flat with the surface of the agar. No soluble pigment is formed. Starch is used as a carbon source, and NO. is used as a nitrogen source. The colony size after 15 days is<1> approx. 14 mm in diameter.

Stivelse agar B: Veksten er moderat; bedre enn med stivelsesnitrat agar. Kolonien har lavendelfarget overflate med rå kanter og er ca. 20 mm i diameter etter 15 dager. Intet oppløselig pigment produseres. Organismen kan nyttiggjøre stivelse og/ eller asparagin som kullstoff-kilde. Den kan også nyttiggjøre asparagin og/eller nitrater som kvelstoff-kilde. Konidiene er i form av rette kjeder med ca. 50—80 konidier pr. kjede. Konidiene har oval til sylin-drisk form og er ca. 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse. Starch agar B: Growth is moderate; better than with starch nitrate agar. The colony has a lavender-coloured surface with raw edges and is approx. 20 mm in diameter after 15 days. No soluble pigment is produced. The organism can utilize starch and/or asparagine as a carbon source. It can also utilize asparagine and/or nitrates as a nitrogen source. The conidia are in the form of straight chains with approx. 50-80 conidia per chain. The conidia have an oval to cylindrical shape and are approx. 1.0—1.5 by 1.5—2.0 microns in size.

Emeron' s agar: Veksten er moderat med lysegrå myseliumsvekst avbrutt med hvite dotter. Veksten er hurtig i 24 timer. Baksiden etter 15 dager er mellombrun med krem kanter. Lysebrun pigment dannes i løpet av 15 dager. Konidie kjedene er for-holdsvis korte, 10—20 konidier pr. kjede. Konidiene er 1,0—1,5 gange 1,5—2,0 mikroner i størrelse. Emeron's agar: Growth is moderate with light gray mycelium growth interrupted by white dots. Growth is rapid for 24 hours. The back after 15 days is medium brown with cream edges. Light brown pigment is formed within 15 days. The conidial chains are relatively short, 10-20 conidia per chain. The conidia are 1.0—1.5 by 1.5—2.0 microns in size.

Ty rosin agar: Veksten er meget dårlig; bare luftmyselium vises med liten, sporedannelse. Kolonien er bakterieliknende — meget med ru kanter og ca. 5 mm i diameter. Baksiden av kolonien er gul. Intet pigment produseres. Konidiene er i form av rette kjeder med ca. 20—25 konidier pr. kjede. Tyrosin og/eller (NH4)2S04 er dår-lige kilder for kvelstoff. Ty raisin agar: Growth is very poor; only aerial mycelium appears with small, spore formation. The colony is bacteria-like — very rough-edged and approx. 5 mm in diameter. The back of the colony is yellow. No pigment is produced. The conidia are in the form of straight chains with approx. 20-25 conidia per chain. Tyrosine and/or (NH4)2S04 are poor sources of nitrogen.

Koboltamidex agar: Veksten er sterk i 24 timer. Etter 15 dagers vekst, dyp laven-del farge med orange-beige ring opptil en lysegrå kant. Kolonien er ca. 23 mm i diameter. Et lysebrunt pigment dannes. Baksiden av kolonien er lys beige med krem kant. Konidiene er kjeder på 30—50 konidier pr. kjede og er 1,0—1,2 gange 1,3—1,5 mikroner i størrelse. Coboltamidex agar: Growth is strong for 24 hours. After 15 days of growth, deep lavender part color with orange-beige ring up to a light gray edge. The colony is approx. 23 mm in diameter. A light brown pigment is formed. The back of the colony is light beige with a cream border. The conidia are chains of 30-50 conidia per chain and is 1.0—1.2 by 1.3—1.5 microns in size.

Bennetts agar: Veksten er sparsom og hvit til å begynne med, blir derpå sterk med grålig-lyserød luftmyselium med hvite streker. Kolonien er ca. 20 mm i diameter etter 15 dager. Veksten er langsom; karrig etter utløpet av 3 dager. Kolonien er grålig-lyserød med hvit irregulær kant. Baksiden er kremfarget beige. Et lysebrunt pigment dannes. Konidiene er 30—50 pr. rett kjede og ca. 0,8—1,0 gange 1,0—1,5 mikroner. Konidiene er ovale til sylindriske av form. Bennett's agar: Growth is sparse and white at first, then becomes strong with greyish-pink aerial mycelium with white streaks. The colony is approx. 20 mm in diameter after 15 days. Growth is slow; barren after the expiration of 3 days. The colony is greyish-pink with a white irregular border. The back is cream colored beige. A light brown pigment is formed. The conidia are 30-50 per straight chain and approx. 0.8—1.0 by 1.0—1.5 microns. The conidia are oval to cylindrical in shape.

Natriumalbuminat agar: Veksten er sparsom til moderat i løpet av 15 dager. Myseliveksten har et grått, fint, mugg-soppliknende utseende som langsomt kom-mer til syne. Kolonien sr stor, ved utløpet av 15 dager er den ca. 23 mm i diameter. Sporene stråler ut fra1 sentrum av kolonien og forsvinner inn i en tynn, fargeløs myse-lievekst. Baksiden av kolonien er kremlik-nende lyserød. Konidiene er 1,0—1,2 gange 1,5—1,7 mikroner i diameter. Intet pigment dannes. Sodium albuminate agar: Growth is sparse to moderate within 15 days. The mycelium growth has a grey, fine, mold-like appearance which slowly becomes visible. The colony is large, at the end of 15 days it is approx. 23 mm in diameter. The spores radiate from1 the center of the colony and disappear into a thin, colorless growth of whey. The back of the colony is creamy pink. The conidia are 1.0—1.2 by 1.5—1.7 microns in diameter. No pigment is formed.

Cykloserin har ikke hittil blitt vist å være brukbar ved menneskelig terapi i noen av sine kjente former. Det er imidlertid blitt påvist at cykloserin er et effektivt vekstfremmende materiale for bruk som tilsatt dyre- og fjærfeføde. Den følgende tabell viser resultatene av kyllingvekst-stu-dier i hvilke den gjennomsnittlige gevinst i grupper på 20 kyllinger matet med en vanlig handelstype-rasjon ble sammenlik-net med den gjennomsnittlige vektgevin-sten for en gruppe på 20 kyllinger matet' med samme handelstype-rasjon med tillegg av 1 pst. av for inneholdende 0,3 enheter av antibiotikumet cykloserin pr. milligram. Tallene viser gjennomsnittet av tre forsøk pr. kylling for kontrollen og to forsøk for kyllinger matet med rasjonen inneholdende cykloserin. Kyllingene ble tatt til prøve på den dag de ble klekket, og prøven avsluttet etter 30 dager på prøvekosten. Cycloserine has not yet been shown to be useful in human therapy in any of its known forms. However, it has been demonstrated that cycloserine is an effective growth-promoting material for use as added animal and poultry feed. The following table shows the results of chicken growth studies in which the average gain in groups of 20 chickens fed a common commercial type ration was compared with the average weight gain of a group of 20 chickens fed the same commercial type ration with the addition of 1 per cent of containing 0.3 units of the antibiotic cycloserine per milligrams. The figures show the average of three attempts per chicken for the control and two trials for chickens fed the ration containing cycloserine. The chickens were sampled on the day they were hatched, and the sample ended after 30 days on the sample diet.

Cykloserin fremstilles fra den oven-nevnte organisme Streptomyces orchidaceus i egnete næringsmedier. Medier som inneholder en egnet proteinkilde og en egnet kilde av kullhydrater er tilstrekkelig for cykloserin produksjon når luft tilføres til næringsmediene som smittes ved en temperatur mellom 20 og 30° C. Vanligvis foretrekkes temperaturer på ca. 28° C for dyrkning av organismer i et næringsmedium. Cycloserine is produced from the above-mentioned organism Streptomyces orchidaceus in suitable nutrient media. Media containing a suitable protein source and a suitable source of carbohydrates are sufficient for cycloserine production when air is supplied to the nutrient media which is infected at a temperature between 20 and 30° C. Generally, temperatures of approx. 28° C for the cultivation of organisms in a nutrient medium.

De mest foretrukne proteinstoffer brukt som kvelstoff-kilder i næringsmedier for cykloserin fremstilling, er blitt funnet å være soyabønne-produkter. Egnede soya-bønne-produkter omfatter soyabønne-olje-mel, vanlig soyabønne oppløst mel, fullstendig ristet soyagrøp, «Kelsovsoy» (fin-malt raffinert protein fra soyabønner), «Nutrisoy» (tørt soyabønne melliknende produkt), etc. Andre proteinkilder som kan brukes for næringsmedier for cykloserin fremstilling er alfa-alfamel aminosyrekake, faste melkebestanddeler, mysenæring, tør-ket hvetekli, malt hvete, kasein, «Ossein konsentrat» (konsentrert albuminmate-riale som blir tilbake etter å ha behandlet ben med saltsyre), «Edamin» (enzymatisk digering av melkealbumin, etc. Imidlertid resulterer disse materialer vanligvis i en produksjon med lavere utbytter av cykloserin enn når soyabønneprodukter brukes. The most preferred protein substances used as nitrogen sources in nutrient media for cycloserine production have been found to be soybean products. Suitable soybean products include soybean oil meal, regular soybean meal, fully roasted soybean meal, "Kelsovsoy" (finely ground refined protein from soybeans), "Nutrisoy" (dry soybean meal-like product), etc. Other protein sources such as can be used for nutrient media for cycloserine production are alpha-alpha flour amino acid cake, milk solids, whey nutrition, dried wheat bran, ground wheat, casein, "Ossein concentrate" (concentrated albumin material that remains after treating bones with hydrochloric acid), " Edamin" (enzymatic digestion of milk albumin, etc. However, these materials usually result in a production with lower yields of cycloserine than when soybean products are used.

En egnet kullhydratkilde som kan brukes i næringsmedier for fremstilling av det nye antibiotiske cykloserin er glukose. Andre kullhydratkilder som kan brukes er sucrose, melkesukker, maltsukker, stivelse glycerol, etc. A suitable carbohydrate source that can be used in nutrient media for the production of the new antibiotic cycloserine is glucose. Other carbohydrate sources that can be used are sucrose, milk sugar, malt sugar, starch glycerol, etc.

I sin alminnelighet er det funnet at utbyttene av cykloserin økes ved tilsetning av kalsiumkarbonat til næringsmediet. For maksimalproduksjon av cykloserin skal mediet inneholde fra ca. 0,25 til ca. 4 pst. kull-hydrat og fra ca. 0,25 til ca. 5 vektsprosent av proteinmaterialet. Kalsiumkarbonat skal brukes i mengder som beløper seg til fra ca. 0,1 til ca. 1,5 vektsprosent. Ved fremstillingen av den nye blanding foretrekkes et medium sammensatt av ca. 3 pst. raffinert soyabønne-mel, ca. 2 pst. glukose og ca. 0,5 pst. kalsiumkarbonat. In general, it has been found that the yields of cycloserine are increased by adding calcium carbonate to the nutrient medium. For maximum production of cycloserine, the medium must contain from approx. 0.25 to approx. 4 percent carbon hydrate and from approx. 0.25 to approx. 5% by weight of the protein material. Calcium carbonate must be used in amounts amounting to from approx. 0.1 to approx. 1.5% by weight. In the preparation of the new mixture, a medium composed of approx. 3 percent refined soybean flour, approx. 2 percent glucose and approx. 0.5 percent calcium carbonate.

Da organismen Streptomyces orchidaceus er en aerobisk organisme, må luft til-føres til næringsmediet og omrøring kan brukes for å dispergere den tilsatte luft gjennom næringsmediet. Omrøring og luft-ning vil være klare for fagmannen så vel som ethvert av de vanlige brukte midler er egnet for cykloserin fremstilling. Det er vanligvis nødvendig å tilsette et antiskum-memiddel til næringsmediet under fermenteringen for fremstillingen av cykloserin, og ethvert av de vanlige antiskumme-midler som f. eks. mineralolje, talgolje, etc. kan brukes for dette formål. As the organism Streptomyces orchidaceus is an aerobic organism, air must be added to the nutrient medium and stirring can be used to disperse the added air through the nutrient medium. Agitation and aeration will be clear to the person skilled in the art as well as any of the commonly used agents are suitable for cycloserine preparation. It is usually necessary to add an antifoam agent to the nutrient medium during the fermentation for the production of cycloserine, and any of the usual antifoam agents such as e.g. mineral oil, tallow oil, etc. can be used for this purpose.

De følgende eksempler gis for å klar-gjøre fremstillingen av cykloserin. The following examples are given to clarify the preparation of cycloserine.

Eksempel 1: Example 1:

En porsjon av et medium på 1100 liter som består av: som nødvendig ble smittet i et gjærings-kar med en kultur av organismen Streptomyces orchidaceus. Mediet ble luftet ved til-føring av luft 0,45 ms pr. minutt under et trykk av 0,7 kg pr. cm-'. Fermenteringen fortsattes ved en temperatur på 28° C i 96 timer, og den følgende tabell viser meng-dene cykloserin produsert ved forskjellige intervaller under fermentering. A portion of a medium of 1100 litres consisting of: as necessary was infected in a fermentation vessel with a culture of the organism Streptomyces orchidaceus. The medium was aerated by supplying air 0.45 ms per minute under a pressure of 0.7 kg per cm-'. The fermentation was continued at a temperature of 28° C. for 96 hours, and the following table shows the amounts of cycloserine produced at different intervals during fermentation.

Cykloserin, fremstillet som beskrevet ovenfor, kan utvinnes fra næringsmediet i hvilken der fremstilles ved å nyttiggjøre seg materialets kjemiske egenskaper. Vanligvis foretrekkes det å absorbere antibiotikumet fra næringsmediet i hvilket det er fremstillet på en sterkt basisk anion-nt-veksler harpiks i hydroksydform. Cykloserin elueres fra anion-utveksler harpiksen med et anion forskjellig fra hydroksyd, avfarves med kull, og antibiotikumet bunn-felles fra eluatet som krystallinsk sølvderi-vat ved å tilsette et oppløselig sølvsalt til eluatet. Derpå blandes det krystallinske sølvderivat av cykloserin med vann og tilsettes et surt materiale til blandingen som har et anion med evne til å danne et uopp-løselig salt med sølv for å bunnfelle et uoppløselig sølvsalt og etterlate cykloserin i oppløsningen. Den tilbakeblivende opp-løsning kan fryses til tørrhet under vakuum for å oppnå cykloserin i en fast, amorf form eller et med vann blandbart oppløs-ningsmiddel i hvilket cykloserin er uopp-løselig, eller bare svakt oppløselig, kan tilsettes til oppløsningen for å bunnfelle cykloserin i krystallinsk form. Hvis det bland-bare oppløsningsmiddel som brukes er aceton, kan filtratet, etter fjerning av krystallinsk cykloserin, las henstå i flere timer hvorpå etter konsentrering i vakuum, et krystallinsk acetonderivat av cykloserin vil bunnfelle fra oppløsningen. Cycloserine, produced as described above, can be recovered from the nutrient medium in which it is produced by making use of the material's chemical properties. Generally, it is preferred to absorb the antibiotic from the nutrient medium in which it is prepared on a strongly basic anion-nt-exchange resin in the hydroxide form. Cycloserine is eluted from the anion-exchange resin with an anion other than hydroxide, decolorized with charcoal, and the antibiotic is precipitated from the eluate as a crystalline silver derivative by adding a soluble silver salt to the eluate. Then the crystalline silver derivative of cycloserine is mixed with water and an acidic material is added to the mixture which has an anion capable of forming an insoluble salt with silver to precipitate an insoluble silver salt and leave cycloserine in solution. The remaining solution can be frozen to dryness under vacuum to obtain cycloserine in a solid, amorphous form or a water-miscible solvent in which cycloserine is insoluble, or only slightly soluble, can be added to the solution to precipitate cycloserine in crystalline form. If the miscible solvent used is acetone, the filtrate, after removal of crystalline cycloserine, can be allowed to stand for several hours whereupon, after concentration in vacuo, a crystalline acetone derivative of cycloserine will precipitate from the solution.

Det følgende eksempel gjengis for å illustrere utvinningen av cykloserin fra næringsmedia i hvilke det er fremstillet. The following example is given to illustrate the recovery of cycloserine from the nutrient media in which it is prepared.

Eksempel 2. Example 2.

En 300 liters porsjon av. et nærings- A 300 liter portion of. a nutritional

medium i hvilket cykloserin fremstiltes og som inneholdt 4,8 enheter cykloserin pr. medium in which cycloserine was produced and which contained 4.8 units of cycloserine per

ml filtrertes og førtes gjennom 10 liter Dowex-2 (sterk, basisk anion-utveksler ml was filtered and passed through 10 liters of Dowex-2 (strong, basic anion exchanger

harpiks) i OH- form i en 15 cm kolonne med en strømningshastighet på 1200 ml pr. resin) in OH form in a 15 cm column with a flow rate of 1200 ml per

minutt. Kolonnen ble derpå vasket med vann og cykloserin eluert fra harpiksen med 0,2N og svovelsyre med en hastighet på 1200 ml pr. minutt, og eluatet samledes minute. The column was then washed with water and cycloserine eluted from the resin with 0.2N sulfuric acid at a rate of 1200 ml per minute. minute, and the eluate was collected

opp i 18 to-liters fraksjoner. pH fra elu- up to 18 two-litre fractions. pH from elu-

atene ble derpå justert til ca. 7,0, hvoretter 1 vektsprosent av avfargende kull blande- The Athens was then adjusted to approx. 7.0, after which 1 percent by weight of decolorizing charcoal mix-

des inn i eluatfraksj onene og ble derpå filt- des into the eluate fractions and was then filtered

rert fra. Til de avfargede eluater tilsattes derpå 0,5 mg sølvnitrat pr. enhet antibio- straight from. 0.5 mg of silver nitrate per unit antibio-

tisk aktivitet inneholdt i eluatet, og pH opprettholdtes ved 6,5 med natriumhydrok- activity contained in the eluate, and the pH was maintained at 6.5 with sodium hydroxide

syd. Et krystallinsk sølvderivat av cyklo- south. A crystalline silver derivative of cyclo-

serin bunnfeltes fra eluatet og filtrertes, serine was precipitated from the eluate and filtered,

vaskedes med aceton og tørkedes i vakuum. was washed with acetone and dried in vacuum.

Den følgende tabell gir resultatene av 9 av eluatfraksj onene nevnt ovenfor. The following table gives the results of 9 of the eluate fractions mentioned above.

En 10-grams porsjon av krystallinsk A 10-gram portion of crystalline

sølvderivat fra eluat 14 vist i Tabell IV ble blandet med 60 ml vann, og til denne blan- silver derivative from eluate 14 shown in Table IV was mixed with 60 ml of water, and to this mix-

ding tilsettes 89 ml 0,5165xN saltsyre. Sølv- 89 ml of 0.5165xN hydrochloric acid is then added. Silver-

klorid bunnfeltes fra oppløsningen og fjer- chloride is precipitated from the solution and removed

nedes derfra ved filtrering. Den tilbakebli- down from there by filtration. The remaining

vende oppløsning ble frosset tørr i vakuum og inneholdt 4,4 gram fast, amorf cyklose- reversed solution was freeze-dried in vacuo and contained 4.4 grams of solid, amorphous cyclose-

rin med 5,15 enheter pr. mg. rin with 5.15 units per mg.

En 1-grams porsjon av amorf Strepto- A 1-gram portion of amorphous Strepto-

myces orchidaceus oppnådd som beskrevet ovenfor, oppløstes i 7,5 ml vann, og til denne oppløsning tilsattes 5 ml aceton. myces orchidaceus obtained as described above was dissolved in 7.5 ml of water, and 5 ml of acetone was added to this solution.

Krystallinsk cykloserin bunnfalt fra opp- Crystalline cycloserine precipitated from the

løsningen hvorpå ytterligere 5 ml aceton tilsattes for å sikre fullstendig krystallise- the solution, after which a further 5 ml of acetone was added to ensure complete crystallization

ring. Krystallene ble filtrert fra oppløs- ring. The crystals were filtered from the solvent

ningen og ble vasket med aceton og ga 0,6177 gram luft-tørre krystaller inne- the reaction and was washed with acetone to give 0.6177 grams of air-dry crystals in

holdende 4.32 enheter pr. mg og 14 pst. holding 4.32 units per mg and 14 per cent.

fuktighet. Etter fjerning av fuktigheten ved tørring, viste materialet 5,02 enheter pr. mg. Filtratet etter fjerning av krystal- moisture. After removal of the moisture by drying, the material showed 5.02 units per mg. The filtrate after removal of crystal

linsk cykloserin fikk stå over natten, kon- linical cycloserine was allowed to stand overnight, con-

sentrertes derpå i vakuum til ca. 5,0 ml hvorpå et krystallinsk acetonderivåt bunn- was then concentrated in vacuum to approx. 5.0 ml, on which a crystalline acetone-derivative bottom

falt fra oppløsningen. Krystallene filtrertes fra oppløsningen, ble vasket med aceton, dropped from the solution. The crystals were filtered from the solution, washed with acetone,

ble tørket og ga 0,1468 gram av et materi- was dried to give 0.1468 grams of a material

ale som ved forsøk viste ingen biologisk effekt. ale which, when tested, showed no biological effect.

Claims

1. Process for producing the antibiotic cycloserine with activity against both Gram-positive and Gram-negative

tive organisms, and the silver salt of the same, characterized in that a strain Streptomyces orchidaceus, which occurs in the form of conidia of size approx. 1.0—1.5 by 1.5—2.0 microns, grown under aerobic conditions in a nutrient medium, and that an amphoteric product which is soluble in water, partially soluble in glycols, isopropyl alcohol, methanol , ethanol, dioxane, 1-butanol and acetone and insoluble in hexane, benzene, chloroform, ether, petroleum ether, ethyl acetate and ethylene dichloride are recovered from the nutrient medium, which product contains 6.00 percent hydrogen, 35.49 percent carbon, 26 .55% nitrogen and 31.96% oxygen (by subtraction), and which has an optical rotation in 2N sodium hydroxide solution of [a]5461A = + 136.8°, C = 5.0% L = 2.0 dm, and which in crystalline form in a mineral oil suspension exhibits characteristic adsorption in the infrared part of the spectrum at the following wavelengths expressed in microns: 6.15, 6.55, 6.65, 7.20, 7.40, 7.50, 7.85, 8.20, 8.80, 9.00 , 9.40 10.65, 10.90, 11.30, 11.40, 12.05, 12.50 and 13.25 and which amphoteric product is eventually converted into a crystalline silver salt by a water-soluble silver compound see is added to a solution of the recovered antibiotic, the pH of the reaction mixture being kept at approx. 6.5.

2. Method according to claim 1, characterized in that the nitrogen source in the nutrient medium is preferably soybean pro- ducts, like r', e.g. soybean flour, roasted soybean meal, etc.

3. Method according to claims 1 and 2, characterized in that the cultivation of the organism Streptomyces orchidaceus takes place in the presence of calcium carbonate in an amount of 0.1 to 1.5 percent by weight.