NL1006052C2

NL1006052C2 - Werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie met DNA-markers.

Info

Publication number: NL1006052C2
Application number: NL1006052A
Authority: NL
Inventors: Toyokazu Akamatsu; Takao Suzuki
Original assignee: Sakata Seed Corp
Priority date: 1996-05-14
Filing date: 1997-05-14
Publication date: 1998-05-20
Also published as: DK55297A; US5910412A; NL1006052A1

Description

5 Werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie met DNA-markers

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het gemakkelijk en snel identificeren van 10 het geslacht van spinazie voordat het in het zaad schiet, en op daarvoor gebruikte DNA's.

Spinazie is een éénsiachtige plant waarbij een mannelijke plant met mannelijke bloemen, een vrouwelijke plant met vrouwelijke bloemen en een daartussen liggende 15 plant met zowel mannelijke als vrouwelijke bloemen voorkomen. Aangenomen wordt dat de wijze van overerving een mechanisme heeft dat vergelijkbaar is met het XY-type dat in het algemeen wordt waargenomen bij dieren, en dat de geslachtsbepalende genen op chromosoom 1 zijn gelegen als 20 meervoudige allelen (Ellis en Janick, i960, 4J7, 1225-1241; Sugiyama en Suto, Bull. Nat. Inst. Agr. Sci. (Japan) Serie D, No. 11, 211-329 (1964)).

Bij dergelijke éénsiachtige planten is het belangrijk het geslacht van door selectie in een kweekproces 25 verkregen afzonderlijke planten snel te kunnen identificeren ter verbetering van de efficiëntie van de kweekhande-lingen. De mannelijke en vrouwelijke plant van spinazie kunnen echter niet onomstotelijk worden vastgesteld totdat de morfologische verschillen tussen de mannelijke en 30 vrouwelijke plant duidelijk worden na het in het zaad schieten, omdat het verschil in karyotype tussen mannelijke en vrouwelijke spinazie niet zo duidelijk is als bij dieren, waardoor het onderscheid van het geslachtschromo-soom moeilijk wordt.

35 Gebruikelijke werkwijzen voor een vroege identifi catie van het geslacht van planten omvatten die waarbij DNA-markers worden gebruikt zoals de RAPD-markers (Random 1006052 2

Amplified Polymorphic DNA), de SCAR-marker (Sequence Characterized Amplified Regions), etc. De RAPD-werkwijze, een techniek gebaseerd op de PCR-werkwijze, werd ontwikkeld door Williams (Nucleic Acids Res .18, 6531-6535 (1990) ) en 5 vanwege zijn betrekkelijk gemakkelijke handelingen werd dit snel een alom gebruikte werkwijze voor planten als het hoofdonderwerp. Er kunnen echter onverwachte experimentele fouten optreden afhankelijk van de zuiverheid van het DNA, de PCR-eenheid etc., omdat de primerhybridisatie("annea-10 ling")-temperatuur (35 tot 42°C) in de RAPD-werkwijze lager is afgesteld dan bij de gebruikelijke PCR-werkwijze. Anderzijds werd door Paran en Michelmore (Theor Appl Genet 85:985-993 (1993)) de SCAR-werkwijze ontwikkeld, waarbij een gebied met minder experimentele fouten wordt geamplifi-15 ceerd onder gebruik van PCR-primers die zijn gesynthetiseerd op basis van een nucleotidensequentie van een RAPD-marker.

Hoewel deze DNA-markers uiterst nuttige middelen zijn voor het identificeren van het geslacht van planten, 20 zijn er in de loop van de tijd zeer weinig gevallen ver meld, waaronder de avondkoekoeksbloem (Melandrium album Garcke) en de pistacheboom (Pistacia vera L.) (Mulcahy et al., Sex Plant Reprod., 5., 86-88 (1992); en Hormaza et al., Theor Appl Genet, 89, 9-19 (1994)) en bestaan er geen 25 soortgelijke vermeldingen met betrekking tot spinazie.

Zoals boven beschreven is de manier voor het identificeren van het geslacht van spinazie voorafgaand aan het in het zaad schieten nog niet vastgesteld, en dit is een factor met lage efficiëntie in het kweken en de zaad- 30 productie van spinazie. De onderhavige uitvinding werd gedaan om dit probleem op te lossen en het doel van de onderhavige uitvinding is te voorzien in een middel voor het gemakkelijk en snel identificeren van het geslacht van spinazie in het stadium van zaailingen.

35 Als resultaat van grondig onderzoek hebben de onderhavige uitvinders gevonden dat er DNA's bestaan die 100605? 3 specifiek in mannelijke spinazieplanten voorkomen, waarmee de onderhavige uitvinding was voltooid.

Dat wil zeggen dat de onderhavige uitvinding betrekking heeft op een werkwijze voor het identificeren 5 van het geslacht van spinazie, waarbij specifiek in mannelijke spinazieplanten voorkomende DNA's worden gebruikt als markers.

Met de werkwijze van de onderhavige uitvinding kan het geslacht van spinazie voor het in het zaad schieten 10 gemakkelijk en snel worden geïdentificeerd.

Figuur 1 is een foto van een elektroforeseprofiel van RAPD-producten waarbij DNA als matrijs werd geëxtraheerd uit nakomelingen van een Atlas-inteeltkruising (in dezelfde generatie) (primer: 0PT11).

15 Figuur 2 is een foto van een elektroforeseprofiel van RAPD-producten waarbij DNA als matrijs werd geëxtraheerd uit nakomelingen van een Atlas-inteeltkruising (in dezelfde generatie) (primer: OPQ20).

Figuur 3 is een foto van een elektroforeseprofiel 20 van RAPD-producten waarbij DNA als matrijs werd geëxtraheerd uit nakomelingen van een Atlas-inteeltkruising (in dezelfde generatie) (primer: OPV20).

Figuur 4 is een foto van een elektroforeseprofiel van RAPD-producten van mannelijke en vrouwelijke exempla-25 ren, elk van drie stammen oosterse en westerse spinazie (primer: 0PT11).

Figuur 5 is een foto van een elektroforeseprofiel van RAPD-producten van mannelijke en vrouwelijke exemplaren, elk van drie stammen oosterse en westerse spinazie 30 (primer: OPQ20).

Figuur 6 is een foto van een elektroforeseprofiel van RAPD-producten van mannelijke en vrouwelijke exemplaren, elk van drie stammen oosterse en westerse spinazie (primer: OPV20).

35 Figuur 7 is een foto van een elektroforeseprofiel van RAPD-produc t en.

100605° 4

Figuur 8 toont het positionele verband tussen de nucleotidensequentie van T11A aan de T7-kant en primers voor de amplificatie daarvan.

Figuur 9 toont het positionele verband tussen de 5 nucleotidensequentie van T11A aan de T3-kant en primers voor de amplificatie daarvan.

Figuur 10 toont het positionele verband tussen de nucleotidensequentie van V20A aan de T7-kant en primers voor de amplificatie daarvan.

10 Figuur 11 toont het positionele verband tussen de nucleotidensequentie van V20A aan de T3-kant en primers voor de amplificatie daarvan.

Figuur 12 toont het positionele verband tussen de nucleotidensequentie van V20C aan de T7-kant en een primer 15 voor de amplificatie daarvan.

Figuur 13 toont het positionele verband tussen de nucleotidensequentie van V20C aan de T3-kant en een primer voor de amplificatie daarvan.

Figuur 14 is een foto van een elektroforeseprofiel 20 van PCR-amplificatieproducten met primers gesynthetiseerd op basis van de nucleotidensequentie van T11A.

Figuur 15 is een foto van een elektroforeseprofiel van PCR-amplificatieproducten met de primers 101-7 en IN101-3.

25 Figuur 16 is een foto van een elektroforeseprofiel van PCR-amplificatieproducten met de primers IN101-7 en IN101-3.

Figuur 17 is een foto van een elektroforeseprof iel van PCR-amplificatieproducten met de primers TAF1-7 en 3 0 COMT.

Hierna wordt de onderhavige uitvinding in detail beschreven.

De werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie volgens de onderhavige uitvinding 35 wordt uitgevoerd onder gebruik van specifiek in mannelijke spinazieplanten voorkomende DNA's als markers.

1006052 5

De werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie volgens de onderhavige uitvinding kan op elke variëteit worden toegepast, voorzover dit een plant is die behoort tot spinazie, dat wil zeggen Spinacia 5 oleracea L.

Het als de marker gebruikte DNA (hierna "marker-DNA" genoemd) is niet aan bijzondere beperkingen onderhevig, voorzover het specifiek in mannelijke spinazieplanten voorkomt, en het omvat bijvoorbeeld T11A, V20A, V20C of een 10 DNA dat identiek is aan een deel daarvan. "T11A" is een DNA dat wordt getoond in SEQ ID no. 1. "V20A" is een DNA dat wordt getoond in SEQ ID no. 2. "V20C" is een 0,9 kb lang DNA dat de nucleotidensequenties van SEQ ID no. 3 en 4 bevat.

15 Het identificeren van het geslacht van planten met het marker-DNA betekent het identificeren van mannelijke en vrouwelijke planten door op de een of andere wijze de uitsluitend in de mannelijke planten voorkomende karakteristieke DNA's te detecteren. Specifiek omvat de techniek 20 van het detecteren van het marker-DNA de polymerase-ket-tingreactie (PCR), Southern-blotting etc., zonder daartoe beperkt te zijn.

In het geval PCR wordt gebruikt voor de detectie van het marker-DNA, wordt een DNA dat is geëxtraheerd uit 25 spinazie waarvan het geslacht moet worden geïdentificeerd, gebruikt als matrijs en worden specifieke DNA's als primers in de PCR gebruikt om het tussen de primers gelegen gebied te amplif iceren, en het geslacht van de spinazie wordt geïdentificeerd door het amplificatieproduct te onderzoeken 30 op de aanwezigheid van het marker-DNA. Voorbeelden van bruikbare primers zijn twee DNA's die identiek zijn aan een deel van bijvoorbeeld T11A, V20A of V20C. Specifiek zijn dergelijke primers "1-7" weergegeven met SEQ ID no. 5, "TAF1-7" weergegeven met SEQ ID no. 6, "COMT" weergegeven 35 met SEQ ID no. 7, "INTI-7" weergegeven met SEQ ID no. 8, "1-3" weergegeven met SEQ ID no. 9, "TAF1-3" weergegeven met SEQ ID no. 10, "COPT" weergegeven met SEQ ID no. 11, 1006°^ 6 "INTI-3" weergegeven met SEQ ID no. 12, "101-7" weergegeven met SEQ ID no. 13, "IN101-7" weergegeven met SEQ ID no. 14, "COMV" weergegeven met SEQ ID no. 15, "101-3" weergegeven met SEQ ID no. 16, "IN101-3" weergegeven met SEQ ID no. 17, 5 "COPV" weergegeven met SEQ ID no. 18, "12-7" weergegeven met SEQ ID no. 19, en "12-3" weergegeven met SEQ ID no. 20. Hoewel er een arbitraire combinatie van twee primers kan worden gebruikt, zijn voorkeurscombinaties 1-3 en TAF1-7, 1-7 en COMT, 1-7 en TAF1-3, 1-7 en INTI-3, TAF1-3 en TAF1-10 7, TAF1-7 en COMT, TAF1-7 en INT1-3, 101-7 en IN101-3, en IN101-7 en IN101-3. Hiervan heeft in het bijzonder de combinatie TAF1-7 en COMT de voorkeur. Het is ook mogelijk als primers gebruik te maken van "OPT11" weergegeven met SEQ ID no. 21, "OPQ20" weergegeven met SEQ ID no. 22, 15 "OPU16" weergegeven met SEQ ID no. 23, en "OPV20" weergege ven met SEQ ID no. 24, die alle worden gebruikt in de RAPD-werkwijze. De bovengenoemde primers kunnen worden gerelateerd aan T11A, V20A en V20C zoals getoond in de figuren 8-13 .

20 Voor het extraheren van DNA uit een plant waarvan het geslacht moet worden geïdentificeerd, kan een gebruikelijke werkwijze worden gebruikt zonder enige speciale werkwijze te gebruiken. Elk deel van de plant, zoals bladeren, stengels, wortels, zaden, embryo's en gekweekte 25 cellen, kan worden gebruikt als bron van DNA. PCR kan worden uitgevoerd met gebruikelijke temperaturen en cycli, maar als OPT11, OPQ20, OPU16 of OPV20 als primer wordt gebruikt wordt de primerhybridisatietemperatuur bij voorkeur lager dan gebruikelijk afgesteld.

30 Omdat de lengte van het marker-DNA kan worden afgeleid uit de posities van de PCR-primers in T11A, V20A of V20C, kan met elektroforese worden beoordeeld of het marker-DNA in het amplificatieproduct aanwezig is.

De bereiding van het in de onderhavige uitvinding 35 gebruikte DNA is als volgt: T11A, V20A en V20C kunnen uit een mannelijke spinazieplant worden bereid door middel van hun selectieve amplificatie met PCR onder gebruik van de 1006052 7 bovengenoemde primers en een van een mannelijke plant afkomstig DNA als de matrijs, gevolgd door elektroforese van het amplificatieproduct en extractie uit hun overeenkomstige banden uit de gel. De primers 1-7, TAF1-7, COMT, 5 INT1-7, 1-3, TAF1-3, COPT, INTI-3, 101-7, IN101-7, COMV, 101-3, IN101-3, COPV, 12-7 en 12-3 zijn korte DNA-fragmen-ten die elk bestaan uit 19 tot 25 nucleotiden, dus ze kunnen onder andere worden gesynthetiseerd in een commerciële DNA-synthesizer.

10 De onderhavige uitvinding wordt meer in detail beschreven aan de hand van de volgende voorbeelden, die niet zijn bedoeld als beperking van de omvang van de onderhavige uitvinding.

15 Voorbeeld 1

In dit voorbeeld werden specifiek in mannelijke spinazieplanten aanwezige DNA-markers geïdentificeerd met de RAPD-werkwijze, waarbij uit respectievelijk mannelijke en vrouwelijke spinazieplanten afkomstige DNA's werden 20 geanalyseerd.

Specifiek in een mannelijke spinazieplant aanwezige RAPD-markers werden op de volgende wijze geselecteerd uit nakomelingen (143 exemplaren) van een inteeltkruising (vrouwtje x mannetje uit dezelfde generatie) van Atlas (Fl-25 variëteit verkrijgbaar bij Sakata Seed Corp., Japan). Om te bevestigen dat de geïdentificeerde RAPD-markers ook gelden voor andere spinaziestammen, werden 5 mannelijke planten en 5 vrouwelijke planten uit elk van drie oosterse stammen (Ujou-2, Ujou-3, SPT) en 3 westerse stammen (ATF, PAF, SDM) 30 op soortgelijke wijze onderzocht.

Een 10-meer random-primerkit (26 sets (OPA-OPZ) van 20 primers), commercieel verkrijgbaar bij Operon Co., werd als primer gebruikt in RAPD. Twintig tot dertig dagen na het zaaien werd DNA uit elke spinazieplant geëxtraheerd 35 met de PEX-werkwijze (Jhingan 1992, Methods in Molecular and Cellular Biology 3:15-22). PCR in de RAPD-werkwijze bestond uit 40 cycli, waarbij elke cyclus werd uitgevoerd ^00 6O50 8 bij 94°C (1 minuut) , 42°C (1 minuut) en 72°C (2 minuten) onder gebruik van een Programmable Control System PC-700 verkrijgbaar bij Astech. Vervolgens werden de amplificatie-producten geëlektroforeerd op 1,8% agarosegels, gekleurd 5 met ethidiumbromide en blootgesteld aan UV-licht om de banden zichtbaar te maken.

Er werden 5 markerbanden gevonden (TlIA, Q20A, U16A, V20A en V20C) die voor 100% specifiek aanwezig waren in mannelijke planten in de nakomelingen van de Atlas-10 inteeltkruising (143 exemplaren) (figuur 1, 2 en 3) . Als andere stammen werden 3 westerse stammen en 3 oosterse stammen onderzocht op de aanwezigheid van dezelfde markers. De resultaten wezen er op dat de markerbanden Q20A en U16A specifiek aanwezig waren in de mannelijke exemplaren van 15 sommige oosterse stammen, en dat de markerbanden T11A, V20A en V20C specifiek aanwezig waren in de mannelijke planten van zowel de oosterse als de westerse stammen (figuur 4, 5 en 6) . Verder onderzoek van hun recombinatiefrequentie in nakomelingen van de Atlas-inteeltkruising (667 exemplaren) 20 gaf aan dat recombinatiefrequenties van T11A, V20A en V20C respectievelijk 0/667 waren, en dat de recombinatiefrequentie van Q20A 1/667 was. Dit resultaat wees er op dat de markerbanden T11A (1,7 kb), V20A (1,3 kb) en V20C (0,9 kb) DNA-markers waren die vast gekoppeld waren aan het gen dat 25 het mannelijk geslacht bepaalt.

Voorbeeld 2 T11A (1,7 kb), V20A (1,3 kb) en V20C (0,9 kb) werden alle uit de gel geëxtraheerd, vervolgens gezuiverd, 30 geligeerd in een Smal-plaats van een vector (pBluescript SK(-), Toyobo Co., Ltd.) en ingebracht in E. coli (JM109, Toyobo Co., Ltd.) voor klonering. Om te bevestigen dat de aldus verkregen respectieve klonen overeenkwamen met de met de RAPD-werkwijze verkregen specifieke markerbanden, werd 35 elke kloon gemerkt met digoxigenine en geanalyseerd met Southern-hybridisatie (onder gebruik van een DIG-kit, Boehringer Mannheim Co.). De resultaten worden getoond in VOoen^? 9 figuur 7. In figuur 7 toont "A" een elektroforeseprofiel van de amplificatieproducten wanneer 0PT11 en OPV20 als primers werden gebruikt, en tonen "B", "C" en "D" profielen van Southern-blotting met T11A, V20A en V20C als probes.

5 Zoals blijkt uit figuur 7 hybridiseerden de respectieve klonen met de overeenkomstige RAPD-producten, er op wijzend dat de desbetreffende markers gekloneerd waren.

Van alle gebieden van T11A en V20A, en van gebieden van 300 tot 400 bp van beide uiteinden van V20C werd de 10 sequentie bepaald in een Auto-sequencer 373A, vervaardigd door ABI Co.

De gehele nucleotidensequentie van T11A wordt getoond in SEQ ID no. 1; de gehele nucleotidensequentie van V20A wordt getoond in SEQ ID no. 2; en eindstandige nucleo-15 tidensequenties van V20C (0,9 kb) van de T7-kant (de kant van de T7-promotor gelegen in de ingevoegde vector) en de T3-kant (de kant van de T3-promotor gelegen in de ingevoegde vector) worden getoond in respectievelijk SEQ ID no. 3 en 4 .

20

Voorbeeld 3

Op basis van de nucleotidensequentie van SEQ ID no. 1 werden de in tabel 1 getoonde PCR-primers gesynthetiseerd (de synthese werd toevertrouwd aan Sawady Technology 2 5 Co. ) .

Tabel 1

Primers Sequenties (5' -* 3')

1-7 TT CACACT CGTCATTTCATT CT CGA

TAF1-7 CTAATTAACTCCTCTTTACCCA

3 0 COMT AATACAAGCCCCATTATCATAA

INT1-7 ATATTATTAAGCCTAGGACTG

1-3 GAGTGTCAAACCACAAGCAAACAAT

TAF1-3 AATTCATACGAGAAAGCTACGA

COPT AGTCTATTTCTACGTTTCAGCT

3 5 INT1-3 AAAACATAAGTACACATGCCAG

1006052 10 PCR werd uitgevoerd waarbij de primers in tabel 1 werden gecombineerd zoals getoond in tabel 2 en uit respectievelijk mannelijke en vrouwelijke spinazieplanten geëxtraheerde DNA's (stam: Ujou-1, gekweekt door Sakata Seed 5 Corp.) werden gebruikt als matrijzen in PCR.

Tabel 2

Combinatie van primers Mannelijk-specifiek DNA

1-3 + COPT afwezig 10 1-3 + TAFl-7 aanwezig 1-3 + INT1-7 afwezig 1-7 + COMT aanwezig 1-7 + TAF1-3 aanwezig 1-7 + INTl-3 aanwezig 15 TAF1-3 + COPT afwezig TAFi-3 + INT1-7 afwezig TAF1-3 + TAFl-7 aanwezig TAFl-7 + COMT aanwezig TAFl-7 + INTl-3 aanwezig 20 INTl-3 + INT1-7 afwezig

De DNA's werden geëxtraheerd met de PEX-werkwijze op dezelfde wijze als in voorbeeld 1. PCR bestond uit 30 cycli, waarbij elke cyclus werd uitgevoerd bij 94 °C (1 25 minuut), 60°C (2 minuten) en 72°C (2 minuten) onder gebruik van hetzelfde Programmable Control System PC-700 (Astech) als in voorbeeld 1.

Om te onderzoeken of de DNA-markers met de geschatte grootte mannelijk-specifiek werden geamplificeerd, 30 werden de amplificatieproducten onderworpen aan agarosegel-elektroforese en gekleurd op dezelfde wijze als in voorbeeld 1. De resultaten worden getoond in figuur 14 en tabel 2. In figuur 14 is "M" een molecuulgewichtsmarker (Marker 6, een product van Nippon Gene K.K.). Zoals blijkt uit 35 figuur 14 en tabel 2 konden de mannelijk-specifieke DNA- 10θ60β° 11 markerbanden worden gedetecteerd in 7 van de 12 gebruikte primercombinaties.

Voorbeeld 4

5 Op basis van de nucleotidensequentie van SEQ ID

no. 2 werden de in tabel 3 getoonde PCR-primers gesynthetiseerd.

Tabel 3 10 Primers Sequenties (5' -* 3' )

101-7 TACCGTTGAATCAGTTGTTGTAAGG

INI01- 7 GACCCTGAATGCACATTTCTGA

COMV CAGACAATACAATATGAGGCTC

101-3 GTTGATCCAAGCATCGGTTAACATA

15 IN101-3 GGTCGACAACACAGCCAATTA

COPV AC CAGTT CATAAAAGAGAG

De primers in tabel 3 werden gecombineerd zoals getoond in tabel 4. Om te onderzoeken of de DNA-markers met 20 de geschatte grootte mannelijk-specifiek werden geamplifi-ceerd, werden de amplificatieproducten onderworpen aan aggarosegelelektroforese en gekleurd op dezelfde wijze als in voorbeeld 1.

25 Tabel 4

Combinatie van primers Mannelijk-specifiek DNA

101-3 + COPV afwezig 101-3 + IN101-7 afwezig 101-7 + COMV afwezig 30 101-7 + IN101-3 aanwezig IN101-7 + IN101-3 aanwezig

De resultaten worden getoond in tabel 4. De mannelijk-specifieke DNA-markerbanden konden worden gede- 10 0 6Λ 5 Γ 9- ^ 12 tecteerd in twee van de vijf gebruikte primercombinaties (figuur 15 en 16).

Voorbeeld 5 5 Voor de bepaling van een primercombinatie die detectie op de meest stabiele wijze mogelijk zou maken, werden de respectieve primercombinaties getoond in tabel 2 en 4 in PCR onderzocht onder gebruik van uit verschillende exemplaren geëxtraheerde DNA's, en in de amplificatiepro-10 ducten werd met elektroforese onderzocht of de desbetreffende DNA-markers aanwezig waren of niet. PCR bestond uit 30 cycli, waarbij elke cyclus werd uitgevoerd bij 94°C (15 seconden), 60°C (30 seconden) en 72°C (30 seconden) met een Gene Amp PCR System 96 00 (Perkin Elmer) . Het DNA werd op 15 een eenvoudiger wijze geëxtraheerd dan in voorbeeld 3.

Van de in dit experiment gebruikte combinaties vertoonde de combinatie TAF1-7 + COMT de minste experimentele fouten (figuur 17).

1006052 13

SEOUENTIELIJST

SEQ ID no . 1:

LENGTE: 1659 basenparen 5 TYPE: nuclelnezuur STRENGVORM: dubbel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: genomisch DNA HERKOMST

10 ORGANISME: spinazie SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 1: TTCCCCGCGA CTTCACACTC GTCATTTCAT TCTCGACCCT AATTAACTCC TCTTTACCCA 60 ATTAGAAATC AATGCTGAAA AAAGTCTATT TCGAAATCTA GCCCTTTGTT TTTAGTCATG 120 TTTTTTGTCT AATCTATGTA AAAATCTAGG TTAAACATAA TATATTTCCA ATTTGTTATG 160 GAAGGAAGAC TTATATATAT GCTTATATTG TGGGGATTCT ATGAGAATCA GTTCAACCAC 240 TACATCAGAT TGATTTGTTT ATGCATTTTG TCCAAATATC ATGTTATCAT ATACTTGTAT 300 TTAATTTCTC GAACATATTA TTAAGCCTAG GACTGTTATG ATAATGGGGC TTGTATTTCT 360 TATGGGAGGG GAAATGCATC ATTGATTTCC AATGAAATGG GAATTAGTTA TTATAATCAC 420 GAGTACATGA TTATAATAAA TGTGAAGAAC AGGGCAATAT GCTAGAAATT GCCCCTTACA 480 AAGGGATAAT GCGGATGTTA GAGAACAAGT TGTTGTAGTG GTTAATATGC TAGTTTGAAG 540 GGATATAATG GTGATGATAG ACTGGTAGAA ATGTCCATGG TGGTGTTTAG GTGATGATAT 600 GATTTACTTT GGATGTGGTC ATGCTGGTAT TTAGAAAAAA CATGGGGGTG GTACAAAATA 660 CAGAGGTGCT ACCGTGCTTG TTGGACCTAG TGGCTATGAT ATGCTAACAG AGTCAATAGT 720 TTTGACTAGG AATAAATATA CACATAATAT TTTTGACGGG CTGATGTTTC CTTCTGGCGT 730 TGATTTTCAC GATTTACTAA TGACAG.ATGG ATAAGATGTT TTCATTTTAG ATAAAGAATA 840 GACAAGTTAT TTATCATTTG AATCCTTGCA ACAACGATTT TTTGACAAAA TTTGCATAGC 900 TCAACCTTTA TGATTACTGA TGAGGCATGA TGAGTTTTTT CATAATCAAC TATTCTACTT 960 TGAGTAGGTT GCTAATATCG TATGTTTTCC ATCTTTAACT TGTGAAACTT AGCCAACAGG 1020 TGAAAACATA TTGTTACGCC TCAGATATAC ATGACACATG GATTGGTAGT ATGGCAGGAT 1060 TGTGAACCTC TATAATGTTA CTTTCTGGAG ACTGCAGAAT ACTTGAAAAC ACTïCAGCCT 1140 1006052 14 TCAAGTACTT TATTTTTTCT TCTGTCGACT CACACATGCT TGTTCTTCTT GGCAGTGTTA 1200 AGAGTTCCTC TAATTTATAT TATTATGCTG TTCATCTTTA TGTGGTTAGG GGGTCATTAG 1260 5 AAGTGGCAAT AGGTTGCTAC GCAAGATTGT TTGCTTGATT GATCTGGAAA TTTTATTTGC 1320 TGTTATTCTT TTGTGAGTCT ATTTCTACGT TTCAGCTTCC TGGCATGTGT ACTTATGTTT 1380 TCTATTTTTT TGTTAGTGTT GGTCATATCT GGTATGTGTA TTTTTGGGAT TATAGCTTGT 1440 GATGCAAAGA TTTCTGCTGT AGAATGAAGG GGGCTGTAGG GATATTACTT ATGTAAGTGT 1500 10 TCTCATCCAG TTAATCTCTT TAAAAGTAGT GTATGTTCAC GTTTTTTTTT GCAGAATTGC 1560 AGACTTCTTG GTTGTGATCT CGTAGCTTTC TCGTATGAAT TTTTTATTGG TAATTTGAAT 1620 TCATTGTTTG CTTGTGGTTT GACACTCTAT CGCGGGGAA 1659 15 SEQ ID no. 2:

LENGTE: 1347 basenparen TYPE: nucleïnezuur 20 STRENGVORM: dubbel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: genomisch DNA HERKOMST

25 ORGANISME: spinazie SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 2: CAGCATGGTC CCTACCGTTG AATCAGTTGT TGTAAGGTAA AGCCTGAGTG GAGAACCCGA 60 TATTGTTGGC TTTAACACTG GTGGATTTGA AAATTAGTCC TTGATGGTGT CAAATGCGTA 120

TTGGCAGCCT TCGTCCCATA CCTTGGGCTC ACTCTTGTGG AGTTTTTGGA ACACTTTCTC ISO

ACAAATCATG GTGAGTTTTA AAATGTACCT GTTGATGTAT TGTAACTTGC CAAGGAACTC 240 CCAAATTTCG TTCTCATTTG CCGGCGATTT CATGTCTAGA CTGGCCTTGT TTTTTGAAGG 300 ATCAGCCTCG ATGCCCTGAG AACTGATGAC ATACCCGAGT AACTTGCCTG ACGTGACCCT 360 GAATGCACAT TTCTGAGGAT TGAGCCTCAT ATTGTATTGT CTGAGCTTGT AGAAGAATTT 420

TCGAAGTACT GTTGTATGCT CATGTCGCTC TTTGGATTTG ACAATCATGT CGTCGACATA 4SO

TACCTCAAGT TCTCTGTGAA TCATGTCGCT CATGATGGTT GTGGCTATTA TTTAATAGGT 540 AGCCACCGTG TTCTTCGGTC CAAACGGCAT AACAGTGTAG CGGGTTTAGG GTTTCATGTC 600 10 0 6 0 F Λ 15 TAGAATGGCC TTGTTTTTTG AATTGAGGAT CAGGCTCGAT GCCCCGAAAA CTGATGACAT 660 ACCCGAGTAA CATGCCTGAT GTCACCCCGA ATGCACATTT CTGAGGATAG AGCCTCATAT 720 TGTATTGTCT GAGCTTGTAG AAGAATTTTC GAAGTACTGT TGTATGCTCA TGTCGCTCTT 780 TGGATTTGAC AATTATGTCG TCGACATATT CCTCAATTTC TCTGTTAATC ATGTCGCTTA 840 TGATGGTTGT GGTTGTTATT TGATAGGTAG CCCCCGTGTT CTTCAGTCCA AACGGCATAA 900 CTGTTTAGCA ATATGTACCC CACTTAGTGA TGAAGGTTGT CTTCTCCATG TCGTCCTCTG 960 1Q CTATGGGAAT CCGATTGTAG CCTGCGTACC AGTTCATAAA AGAGAGTAAG GCATAATTGG 1020 CTGTGTTGTC GACCAGAATG TCGATGAGTG GCAGTGGAAA ATCGTCTTTA GGGCTAGTCG 1080 TGTTAAGATA TCTGTAATCG ACGCACATTT GAAATTTACC GTCCTTCTTC GGAACTGGAA 1140 CGACATTTGC AATCAATTCT GAATATTTGG ATTCTCGAAT AAACCCGACC TCTAACTGCT 1200 15 TGGAGACCTC TTCTTTAATT TTGAGGGAAA CACCCGGTTT CACACGACGG AGTTTTTTCT 1260 TGATGGGATT TATGCCTGAA ATGAGGGGAA TTGTATGTTA ACCGATGCTT GGATCAACCC 1320 CTGGCATATC ATGATAGGAC CATGCTG 1347 SEQ ID no. 3:

20 LENGTE: 365 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: dubbel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: genomisch DNA 25 HERKOMST

ORGANISME: spinazie SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 3: CAGCATGGTC AACTTTGGAA CAAAACACAC GAAGTCAACA TTTCAGGTTA TAAAGGAATT 60 CCTAAGGCAC ACAGGCCAAA TTGCACAAAA GCACCATCAA TGCATGTGCA GCAGCTGCAT 120 CAAAGANTAC CAAATVATCC AGACGGTACC AGTAGTTCAT ATGCAGCAGC TGCACCAAGC 130 AGTCAAGAAC GTCAATGCAC CAGCAGCAGC AGNACAANGC ATCANGTATA AAGCANTANC 240 TTCATAAGAA CTGCATAACA TACACTAGAN CAAACANCAA GCCTGTATAA NGGGCTATAG 300 TCAGCAGGCT CCCAGCAAGC CTGATCAGNA GGTTNCTNGC AAGKCTGCTT TTGAGTAAGG 360 1006053 16 SEQ ID no. 4 :

LENGTE: 344 basenparen 5 TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: dubbel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: genomisch DNA HERKOMST

10 ORGANISME: spinazie SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 4: CAGCATGGTC TTGCATTGTG CATGATAACG GAGTAATACA GTTATTGACT TGCCTCTCAT 60 15 TGACATCATA TATAGTATAA ATGGAAAACA TTGACATCAA CAAACCCCAA ACCTTAGTAC 120 TGGTTGTATA TAAACTGGTG TTGTTGTTGT CCTTGTATCA CANCTCGGCT CTATAGGTGT ISO CGAACCTGGG CCTAGACCCT CGGAATGGAA GGTCTATTAA GAAAAGTTAG ATGCCTAGTT 240 CATGCATTAG TAAATCTACT TCTGCATTCA GCATTTGANT TATACTGGCC ATTGTGCATT 300 20 CGGTCAACCG GCCAATGGCT TTACCAACCC ANGCCCCXGC CTGT 344 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1006052 2 SEQ ID no. 5: 3 LENGTE: 25 basenparen TYPE: nucleïnezuur 4 30 STRENGVORM: enkel 5 TOPOLOGIE: lineair 6 MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 5: 7

TTCACACTCG TCATTTCATT CTCGA

8 35 9 SEQ ID no. 6: 10 LENGTE: 22 basenparen 17 TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA 5 SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 6:

CTAATTAACT CCTCTTTACC CA

SEQ ID no. 7: LENGTE: 22 basenparen 10 TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 7:

15 AATACAAGCC CCATTATCAT AA

SEQ ID no. 8: LENGTE: 21 basenparen TYPE: nucleïnezuur 20 STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 8: ATATTATTAA GCCTAGGACT G 25 SEQ ID no. 9: LENGTE: 25 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel 30 TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 9: GAGTGTCAAA CCACAAGCAA ACAAT 1 1006052 SEQ ID no. 10: LENGTE: 22 basenparen TYPE: nucleïnezuur 18 STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 10:

5 AATTCATACG AGAAAGCTAC GA

SEQ ID no. 11: LENGTE: 22 basenparen TYPE: nucleïnezuur 10 STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 11: AGTCTATTTC TACGTTTCAG CT 15 SEQ ID no. 12: LENGTE: 22 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel 20 TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 12:

AAAACATAAG TACACATGCC AG

25 SEQ ID no. 13: LENGTE: 25 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair 30 MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 13:

TACCGTTGAA TCAGTTGTTG TAAGG

SEQ ID no. 14: 35 LENGTE: 22 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel 1006052 19 TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 14: GACCCTGAAT GCACATTTCT GA 5 SEQ ID no. 15: LENGTE: 22 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel 10 TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 15:

CAGACAATAC AATATGAGGC TC

15 SEQ ID no. 16: LENGTE: 25 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair 20 MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 16:

GTTGATCCAA GCATCGGTTA ACATA

SEQ ID no. 17: 25 LENGTE: 21 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA 30 SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 17:

GGTCGACAAC ACAGCCAATT A

SEQ ID no. 18: LENGTE: 19 basenparen 35 TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair 1006052

s V

20 MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 18:

ACCAGTTCAT AAAAGAGAG

5 SEQ ID no. 19: LENGTE: 25 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair 10 MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 19:

ACTTTGGAAC AAAACACACG AAGTC

SEQ ID no. 20: 15 LENGTE: 25 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA

2 0 SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 20:

GCATTGTGCA TGATAACGGA GTAAT

SEQ ID no. 21: LENGTE: 10 basenparen 25 TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 21:

3 0 TTCCCCGCGA

SEQ ID no. 22: LENGTE: 10 basenparen TYPE: nucleïnezuur 35 STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair

MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA

1006052

Claims

5 LENGTE: 10 basenparen TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA 10 SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 23: CTGCGCTGGA SEQ ID no. 24: LENGTE: 10 basenparen 15 TYPE: nucleïnezuur STRENGVORM: enkel TOPOLOGIE: lineair MOLECUULTYPE: ander nucleïnezuur synthetisch DNA SEQUENTIEBESCHRIJVING: SEQ ID no. 24:

1. Werkwijze voor het identificeren van het 5 geslacht van spinazie, waarbij een specifiek in mannelijke spinazieplanten aanwezig DNA wordt gebruikt als marker voor spinazie.

2. Werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie volgens conclusie 1, waarbij het 10 specifiek in een mannelijke spinazieplant aanwezige DNA T11A, V20A, V20C of een aan een deel daarvan identiek DNA is.

2. CAGCATGGTC 1006052 * * V -CONCLUSIES-

3. Werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie, die de volgende stappen omvat: 15 (1) het extraheren van DNA uit spinazie waarvan het geslacht moet worden bepaald; (2) het synthetiseren van twee verschillende DNA's, identiek aan een deel van TllA, V20A of V20C; (3) met het in stap (1) geëxtraheerde DNA als 20 matrijs en de in stap (2) gesynthetiseerde 2 DNA's als primers, het amplificeren van het tussen die primers gelegen gebied, en (4) het identificeren van het geslacht van de spinazie door te bepalen of een specifiek in de mannelijke 25 plant daarvan aanwezig DNA in het amplificatieproduct aanwezig is of niet.

4. Werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie volgens conclusie 3, waarbij de combinatie van twee verschillende DNA's 1-3 en TAFl-7, 1-7 30 en COMT, 1-7 en TAF1-3, 1-7 en INTI-3, TAF1-3 en TAFl-7, TAFl-7 en COMT, TAFl-7 en INT1-3, 101-7 en IN101-3, of IN101-7 en IN101-3 is.

5. Werkwijze voor het identificeren van het geslacht van spinazie, die de volgende stappen omvat: 35 (1) het extraheren van DNA uit spinazie waarvan het geslacht moet worden bepaald; 1006052