JPH1052284A - Ｄｎａマーカーを用いたホウレンソウの雌雄判別法 - Google Patents
Ｄｎａマーカーを用いたホウレンソウの雌雄判別法Info
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- JPH1052284A JPH1052284A JP9124012A JP12401297A JPH1052284A JP H1052284 A JPH1052284 A JP H1052284A JP 9124012 A JP9124012 A JP 9124012A JP 12401297 A JP12401297 A JP 12401297A JP H1052284 A JPH1052284 A JP H1052284A
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Abstract
(57)【要約】
【解決手段】 ホウレンソウの雄株に特異的に存在する
ＤＮＡを指標としてホウレンソウの雌雄を判別する方
法、及びそれに用いるＤＮＡ。 【効果】 簡易かつ迅速なホウレンソウの雌雄判別方法
を提供する。
ＤＮＡを指標としてホウレンソウの雌雄を判別する方
法、及びそれに用いるＤＮＡ。 【効果】 簡易かつ迅速なホウレンソウの雌雄判別方法
を提供する。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ホウレンソウの雌
雄を抽台前に簡易かつ迅速に判別する方法、及びそれに
用いるＤＮＡに関する。
雄を抽台前に簡易かつ迅速に判別する方法、及びそれに
用いるＤＮＡに関する。
【０００２】
【従来の技術】ホウレンソウは雌雄異株の植物であり、
雄花だけをつける雄株、雌花だけをつける雌株、雄花と
雌花の両方をつける間性株が存在する。その遺伝様式は
動物で一般的に見られるＸＹ型と同様のメカニズムを持
ち、性決定遺伝子は第一染色体に複対立遺伝子として存
在すると考えられている（Ellis and Janick 1960, Am.
J.Botany 47:210-214,Iizuka and Janick 1962, Geneti
cs 47:1225-1241, Sugiyama and Suto 1964, Bull.Nat.
Inst.Agr.Sci.(Japan)Series D,No.11.211-329）。
雄花だけをつける雄株、雌花だけをつける雌株、雄花と
雌花の両方をつける間性株が存在する。その遺伝様式は
動物で一般的に見られるＸＹ型と同様のメカニズムを持
ち、性決定遺伝子は第一染色体に複対立遺伝子として存
在すると考えられている（Ellis and Janick 1960, Am.
J.Botany 47:210-214,Iizuka and Janick 1962, Geneti
cs 47:1225-1241, Sugiyama and Suto 1964, Bull.Nat.
Inst.Agr.Sci.(Japan)Series D,No.11.211-329）。
【０００３】このような雌雄異株の植物について，育種
の過程で選抜した個体の雌雄を早期に判別することは、
育種の作業効率を高める上で重要であるが、ホウレンソ
ウの場合、雌雄における核型の相違が動物のように明確
ではないため性染色体の識別は困難であり、雌雄の形態
的な差異が明確に現れる抽だい後でなければ雌雄を明確
に判別することができない。
の過程で選抜した個体の雌雄を早期に判別することは、
育種の作業効率を高める上で重要であるが、ホウレンソ
ウの場合、雌雄における核型の相違が動物のように明確
ではないため性染色体の識別は困難であり、雌雄の形態
的な差異が明確に現れる抽だい後でなければ雌雄を明確
に判別することができない。
【０００４】植物の雌雄を早期に判別する方法として、
ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）マーカ
ーやＳＣＡＲ（Sequence Characterized Amplified Reg
ions）マーカーなどのＤＮＡマーカーを利用する方法が
知られている。ＲＡＰＤ法は、ウイリアムス（Williams
1990, Nucleic Acids Res 18:6531-6535 ）が開発した
もので、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を基本に
した技術で、手順が比較的簡便であるため、その後植物
を中心に急速に広まった。しかし、ＲＡＰＤ法は、従来
のＰＣＲ法に比べてアニーリング温度を低く設定するた
め（35℃〜42℃）、ＤＮＡの純度、核酸自動増幅器の違
いなどで予期せぬ実験誤差を引き起こす場合がある。一
方、ＳＣＡＲ法は、パラン及びミッチェルモア（Paran
and Michelmore 1993,Theor Appl Genet 85:985-993 ）
が開発したもので、得られたＲＡＰＤマーカーの塩基配
列を決定し、その配列を基にＰＣＲプライマーを合成
し、より実験誤差の少ない領域を増幅するものである。
ＲＡＰＤ（Random Amplified Polymorphic DNA）マーカ
ーやＳＣＡＲ（Sequence Characterized Amplified Reg
ions）マーカーなどのＤＮＡマーカーを利用する方法が
知られている。ＲＡＰＤ法は、ウイリアムス（Williams
1990, Nucleic Acids Res 18:6531-6535 ）が開発した
もので、ポリメラーゼ連鎖反応法（ＰＣＲ法）を基本に
した技術で、手順が比較的簡便であるため、その後植物
を中心に急速に広まった。しかし、ＲＡＰＤ法は、従来
のＰＣＲ法に比べてアニーリング温度を低く設定するた
め（35℃〜42℃）、ＤＮＡの純度、核酸自動増幅器の違
いなどで予期せぬ実験誤差を引き起こす場合がある。一
方、ＳＣＡＲ法は、パラン及びミッチェルモア（Paran
and Michelmore 1993,Theor Appl Genet 85:985-993 ）
が開発したもので、得られたＲＡＰＤマーカーの塩基配
列を決定し、その配列を基にＰＣＲプライマーを合成
し、より実験誤差の少ない領域を増幅するものである。
【０００５】このようなＤＮＡマーカーは、植物の雌雄
を判別するのに極めて有効な手段であるが、現在までの
ところ、ＤＮＡマーカーを用いて雌雄の判別を行った例
は、マツヨイセンノウ（Melandrium album Garcke ）や
ピスタシオノキ（Pistacia vera L.）など数種の植物
のほかには、報告されておらず（Mulcahy et al.1992,S
ex Plant Reprod 5:86-88, Hormaza et al. 1994, Theo
r Appl Genet 89:9-19）、ホウレンソウについてはその
ような例は全く知られていない。
を判別するのに極めて有効な手段であるが、現在までの
ところ、ＤＮＡマーカーを用いて雌雄の判別を行った例
は、マツヨイセンノウ（Melandrium album Garcke ）や
ピスタシオノキ（Pistacia vera L.）など数種の植物
のほかには、報告されておらず（Mulcahy et al.1992,S
ex Plant Reprod 5:86-88, Hormaza et al. 1994, Theo
r Appl Genet 89:9-19）、ホウレンソウについてはその
ような例は全く知られていない。
【０００６】
【発明が解決しようとする課題】前記のように、ホウレ
ンソウの雌雄を抽台前に判別する手段はいまだ確立され
ておらず、このことが、ホウレンソウの育種及び採種の
作業効率を低下させる一因になっている。本発明は、こ
のような問題を解決すべくなされたものであり、その目
的とするところは、ホウレンソウの雌雄を幼苗の段階で
簡易かつ迅速に判別する手段を提供することにある。
ンソウの雌雄を抽台前に判別する手段はいまだ確立され
ておらず、このことが、ホウレンソウの育種及び採種の
作業効率を低下させる一因になっている。本発明は、こ
のような問題を解決すべくなされたものであり、その目
的とするところは、ホウレンソウの雌雄を幼苗の段階で
簡易かつ迅速に判別する手段を提供することにある。
【０００７】
【課題を解決するための手段】本発明者等は、前記課題
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ホウレンソウの雄
株に特異的に存在するＤＮＡを見出し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、ホウレンソウの雄株に特異的
に存在するＤＮＡを指標としてホウレンソウの雌雄を判
別することを特徴とするホウレンソウの雌雄判別法であ
る。
を解決すべく鋭意検討を重ねた結果、ホウレンソウの雄
株に特異的に存在するＤＮＡを見出し、本発明を完成し
た。すなわち、本発明は、ホウレンソウの雄株に特異的
に存在するＤＮＡを指標としてホウレンソウの雌雄を判
別することを特徴とするホウレンソウの雌雄判別法であ
る。
【０００８】以下、本発明を詳細に説明する。本発明の
ホウレンソウの雌雄判別法は、ホウレンソウの雄株に特
異的に存在するＤＮＡを指標として行う。本発明の雌雄
判別法は、ホウレンソウ、すなわち、スピナーキア・オ
レラーケア（Spinacia oleracea L. ）に属する植物で
あれば、いかなる品種にも適用できる。
ホウレンソウの雌雄判別法は、ホウレンソウの雄株に特
異的に存在するＤＮＡを指標として行う。本発明の雌雄
判別法は、ホウレンソウ、すなわち、スピナーキア・オ
レラーケア（Spinacia oleracea L. ）に属する植物で
あれば、いかなる品種にも適用できる。
【０００９】指標として用いるＤＮＡは、ホウレンソウ
の雄株に特異的に存在するものであれば特に制限はな
く、例えば、Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２０Ｃ又はこれら
のＤＮＡの一部分と同一のＤＮＡを使用することができ
る。ここで「Ｔ１１Ａ」とは、配列番号１で表されるＤ
ＮＡである。また、「Ｖ２０Ａ」とは、配列番号２で表
されるＤＮＡである。「Ｖ２０Ｃ」とは、長さが０．９
kbのＤＮＡであって、配列番号３で表される塩基配列と
配列番号４で表される塩基配列を含むＤＮＡである。
の雄株に特異的に存在するものであれば特に制限はな
く、例えば、Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２０Ｃ又はこれら
のＤＮＡの一部分と同一のＤＮＡを使用することができ
る。ここで「Ｔ１１Ａ」とは、配列番号１で表されるＤ
ＮＡである。また、「Ｖ２０Ａ」とは、配列番号２で表
されるＤＮＡである。「Ｖ２０Ｃ」とは、長さが０．９
kbのＤＮＡであって、配列番号３で表される塩基配列と
配列番号４で表される塩基配列を含むＤＮＡである。
【００１０】ＤＮＡを指標として雌雄の判別を行うと
は、雄株に特異的に存在するＤＮＡを何らかの手法で検
出することにより、雌雄の判別を行うことをいう。具体
的には、指標となるＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（以
下「ＰＣＲ」という。）により検出する方法、指標とな
るＤＮＡをサザン・ブロット法により検出する方法など
を挙げることができるが、これらに限定されるわけでは
ない。
は、雄株に特異的に存在するＤＮＡを何らかの手法で検
出することにより、雌雄の判別を行うことをいう。具体
的には、指標となるＤＮＡをポリメラーゼ連鎖反応（以
下「ＰＣＲ」という。）により検出する方法、指標とな
るＤＮＡをサザン・ブロット法により検出する方法など
を挙げることができるが、これらに限定されるわけでは
ない。
【００１１】ＰＣＲにより検出する方法は、雌雄を判別
しようとするホウレンソウから抽出したＤＮＡを鋳型と
し、所定のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲにより前
記プライマーに挟まれる領域を増幅し、得られた増幅産
物の中に指標となるＤＮＡが含まれているかどうかによ
りホウレンソウの雌雄を判別する。ここで用いるプライ
マーとしては、例えば、Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ、又はＶ２
０Ｃの一部分と同一の２種類のＤＮＡを用いることがで
きる。具体的には、配列番号５で表される「１−７」、
配列番号６で表される「ＴＡＦ１−７」、配列番号７で
表される「ＣＯＭＴ」、配列番号８で表される「ＩＮＴ
１−７」、配列番号９で表される「１−３」、配列番号
１０で表される「ＴＡＦ１−３」、配列番号１１で表さ
れる「ＣＯＰＴ」、配列番号１２で表される「ＩＮＴ１
−３」、配列番号１３で表される「１０１−７」、配列
番号１４で表される「ＩＮ１０１−７」、配列番号１５
で表される「ＣＯＭＶ」、配列番号１６で表される「１
０１−３」、配列番号１７で表される「ＩＮ１０１−
３」、配列番号１８で表される「ＣＯＰＶ」、配列番号
１９で表される「１２−７」、配列番号２０で表される
「１２−３」等のプライマーを例示することができる。
２種類のプライマーの組合せとしては、前記のプライマ
ーを任意に組み合わせればよいが、好ましい組合せとし
ては、１−３とＴＡＦ１−７、１−７とＣＯＭＴ、１−
７とＴＡＦ１−３、１−７とＩＮＴ１−３、ＴＡＦ１−
３とＴＡＦ１−７、ＴＡＦ１−７とＣＯＭＴ、ＴＡＦ１
−７とＩＮＴ１−３、１０１−７とＩＮ１０１−３、Ｉ
Ｎ１０１−７とＩＮ１０１−３などを挙げることがで
き、これらの中でもＴＡＦ１−７とＣＯＭＴの組合せが
特に好ましい。また、プライマーとしては、ＲＡＰＤ法
に用いられる配列番号２１で表される「ＯＰＴ１１」、
配列番号２２で表される「ＯＰＱ２０」、配列番号２３
で表される「ＯＰＵ１６」、配列番号２４で表される
「ＯＰＶ２０」を用いることもできる。なお、上記した
プライマーとＴ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃとの関係
は、図８〜図１３に示すとおりである。
しようとするホウレンソウから抽出したＤＮＡを鋳型と
し、所定のＤＮＡをプライマーとして、ＰＣＲにより前
記プライマーに挟まれる領域を増幅し、得られた増幅産
物の中に指標となるＤＮＡが含まれているかどうかによ
りホウレンソウの雌雄を判別する。ここで用いるプライ
マーとしては、例えば、Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ、又はＶ２
０Ｃの一部分と同一の２種類のＤＮＡを用いることがで
きる。具体的には、配列番号５で表される「１−７」、
配列番号６で表される「ＴＡＦ１−７」、配列番号７で
表される「ＣＯＭＴ」、配列番号８で表される「ＩＮＴ
１−７」、配列番号９で表される「１−３」、配列番号
１０で表される「ＴＡＦ１−３」、配列番号１１で表さ
れる「ＣＯＰＴ」、配列番号１２で表される「ＩＮＴ１
−３」、配列番号１３で表される「１０１−７」、配列
番号１４で表される「ＩＮ１０１−７」、配列番号１５
で表される「ＣＯＭＶ」、配列番号１６で表される「１
０１−３」、配列番号１７で表される「ＩＮ１０１−
３」、配列番号１８で表される「ＣＯＰＶ」、配列番号
１９で表される「１２−７」、配列番号２０で表される
「１２−３」等のプライマーを例示することができる。
２種類のプライマーの組合せとしては、前記のプライマ
ーを任意に組み合わせればよいが、好ましい組合せとし
ては、１−３とＴＡＦ１−７、１−７とＣＯＭＴ、１−
７とＴＡＦ１−３、１−７とＩＮＴ１−３、ＴＡＦ１−
３とＴＡＦ１−７、ＴＡＦ１−７とＣＯＭＴ、ＴＡＦ１
−７とＩＮＴ１−３、１０１−７とＩＮ１０１−３、Ｉ
Ｎ１０１−７とＩＮ１０１−３などを挙げることがで
き、これらの中でもＴＡＦ１−７とＣＯＭＴの組合せが
特に好ましい。また、プライマーとしては、ＲＡＰＤ法
に用いられる配列番号２１で表される「ＯＰＴ１１」、
配列番号２２で表される「ＯＰＱ２０」、配列番号２３
で表される「ＯＰＵ１６」、配列番号２４で表される
「ＯＰＶ２０」を用いることもできる。なお、上記した
プライマーとＴ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃとの関係
は、図８〜図１３に示すとおりである。
【００１２】ＤＮＡの抽出は、特別な方法を用いる必要
はなく、常法に従って行うことができる。ＤＮＡの抽出
に用いる部位は、葉、茎、根などいずれでもよく、ま
た、種子、胚、培養細胞などから抽出してもよい。ま
た、ＰＣＲの条件は、通常行われる温度、サイクルによ
り行うことができるが、プライマーとしてＯＰＴ１１、
ＯＰＱ２０、ＯＰＵ１６及びＯＰＶ２０を用いる場合
は、通常よりもアニーリング温度を低く設定することが
望ましい。
はなく、常法に従って行うことができる。ＤＮＡの抽出
に用いる部位は、葉、茎、根などいずれでもよく、ま
た、種子、胚、培養細胞などから抽出してもよい。ま
た、ＰＣＲの条件は、通常行われる温度、サイクルによ
り行うことができるが、プライマーとしてＯＰＴ１１、
ＯＰＱ２０、ＯＰＵ１６及びＯＰＶ２０を用いる場合
は、通常よりもアニーリング温度を低く設定することが
望ましい。
【００１３】指標となるＤＮＡの長さは、ＰＣＲプライ
マーのＴ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃ上の位置から推
定できるので、増幅産物を電気泳動することにより指標
となるＤＮＡが増幅産物中に含まれているかどうかを判
断することができる。次に、本発明に用いるＤＮＡの製
造方法について説明する。
マーのＴ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃ上の位置から推
定できるので、増幅産物を電気泳動することにより指標
となるＤＮＡが増幅産物中に含まれているかどうかを判
断することができる。次に、本発明に用いるＤＮＡの製
造方法について説明する。
【００１４】Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃは、雄株
のホウレンソウのＤＮＡを鋳型とし、前述したプライマ
ーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動で分別
し、各ＤＮＡの含まれるゲル部分を切り出し、ゲルを分
解することにより製造することができる。また、１−
７、ＴＡＦ１−７、ＣＯＭＴ、ＩＮＴ１−７、１−３、
ＴＡＦ１−３、ＣＯＰＴ、ＩＮＴ１−３、１０１−７、
ＩＮ１０１−７、ＣＯＭＶ、１０１−３、ＩＮ１０１−
３、ＣＯＰＶ、１２−７及び１２−３は、いずれも１９
〜２５のヌクレオチドからなる短いＤＮＡ断片であるか
ら、市販のＤＮＡ合成機等を用いて合成することができ
る。
のホウレンソウのＤＮＡを鋳型とし、前述したプライマ
ーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を電気泳動で分別
し、各ＤＮＡの含まれるゲル部分を切り出し、ゲルを分
解することにより製造することができる。また、１−
７、ＴＡＦ１−７、ＣＯＭＴ、ＩＮＴ１−７、１−３、
ＴＡＦ１−３、ＣＯＰＴ、ＩＮＴ１−３、１０１−７、
ＩＮ１０１−７、ＣＯＭＶ、１０１−３、ＩＮ１０１−
３、ＣＯＰＶ、１２−７及び１２−３は、いずれも１９
〜２５のヌクレオチドからなる短いＤＮＡ断片であるか
ら、市販のＤＮＡ合成機等を用いて合成することができ
る。
【００１５】
【００１６】
〔実施例１〕ホウレンソウの雄株に特異的に存在するＤ
ＮＡマーカーを特定するために、ホウレンソウの雄株と
雌株のそれぞれから抽出したＤＮＡをＲＡＰＤ法により
解析した。
ＮＡマーカーを特定するために、ホウレンソウの雄株と
雌株のそれぞれから抽出したＤＮＡをＲＡＰＤ法により
解析した。
【００１７】アトラス（Ｆ１品種：サカタのタネ）の兄
妹交配（雌×雄）後代143 個体を用いて雄個体に特異的
に存在するＲＡＰＤマーカーの選別を行った。更に得ら
れたＲＡＰＤマーカーがホウレンソウの他の系統におい
ても広く利用できることを確認するために、東洋系ホウ
レンソウ３系統（Ujou-2、Ujou-3、SPT ）、西洋系ホウ
レンソウ３系統（ATF 、PAF 、SDM ）の雄株、雌株各５
個体について同様の試験を行った。 ＲＡＰＤ用のプラ
イマーとして、オペロン社が市販している10merのラン
ダム・プライマー・キットのＯＰＡ〜ＯＰＺ、計26セッ
ト各20種類、合計520 種類のプライマーを用いた。播種
後20〜30日目の各個体からＰＥＸ法（Jhingan 1992 Met
hods in Molecular and Cellular Biology 3: 15-22 ）
によってＤＮＡを抽出した。ＲＡＰＤ法のＰＣＲ反応
は、アステック社のプログラマブル・コントロール・シ
ステム PC-700 を用いて94℃（１分）−42℃（１分）−
72℃（２分）を40サイクル行った。その後、1.8%のアガ
ロース・ゲルで電気泳動しエチジウム・ブロマイドで染
色した後、紫外線ランプで発光させてバンドの有無を確
認した。
妹交配（雌×雄）後代143 個体を用いて雄個体に特異的
に存在するＲＡＰＤマーカーの選別を行った。更に得ら
れたＲＡＰＤマーカーがホウレンソウの他の系統におい
ても広く利用できることを確認するために、東洋系ホウ
レンソウ３系統（Ujou-2、Ujou-3、SPT ）、西洋系ホウ
レンソウ３系統（ATF 、PAF 、SDM ）の雄株、雌株各５
個体について同様の試験を行った。 ＲＡＰＤ用のプラ
イマーとして、オペロン社が市販している10merのラン
ダム・プライマー・キットのＯＰＡ〜ＯＰＺ、計26セッ
ト各20種類、合計520 種類のプライマーを用いた。播種
後20〜30日目の各個体からＰＥＸ法（Jhingan 1992 Met
hods in Molecular and Cellular Biology 3: 15-22 ）
によってＤＮＡを抽出した。ＲＡＰＤ法のＰＣＲ反応
は、アステック社のプログラマブル・コントロール・シ
ステム PC-700 を用いて94℃（１分）−42℃（１分）−
72℃（２分）を40サイクル行った。その後、1.8%のアガ
ロース・ゲルで電気泳動しエチジウム・ブロマイドで染
色した後、紫外線ランプで発光させてバンドの有無を確
認した。
【００１８】アトラスの兄妹交配後代（143 個体）にお
いて、雄株に100%特異的に存在する５つのマーカー・バ
ンド（Ｔ１１Ａ、Ｑ２０Ａ、Ｕ１６Ａ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２
０Ｃ）が確認された（図１、２、３）。西洋系及び東洋
系各３系統について各マーカー・バンドの有無を確認し
た結果、Ｑ２０Ａ、Ｕ１６Ａは東洋系品種の一部におい
てのみ雄株に特異的にみられるバンドがあり、Ｔ１１
Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃは、東洋系、西洋系いずれの
品種においても同様に雄株に特異的に認められた（図
４、図５、図６）。アトラスの兄妹交配後代（６６７個
体）において更に組換え頻度を調べた結果、Ｔ１１Ａ、
Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃがいずれも0/667 、Ｑ２０Ａが1/
667 、であった。この結果、Ｔ１１Ａ（1.7kb ）、Ｖ２
０Ａ（1.3kb）及びＶ２０Ｃ（0.9kb ）のマーカー・バ
ンドが雄性決定遺伝子に強く連鎖したＤＮＡマーカーで
あることが明らかになった。
いて、雄株に100%特異的に存在する５つのマーカー・バ
ンド（Ｔ１１Ａ、Ｑ２０Ａ、Ｕ１６Ａ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２
０Ｃ）が確認された（図１、２、３）。西洋系及び東洋
系各３系統について各マーカー・バンドの有無を確認し
た結果、Ｑ２０Ａ、Ｕ１６Ａは東洋系品種の一部におい
てのみ雄株に特異的にみられるバンドがあり、Ｔ１１
Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃは、東洋系、西洋系いずれの
品種においても同様に雄株に特異的に認められた（図
４、図５、図６）。アトラスの兄妹交配後代（６６７個
体）において更に組換え頻度を調べた結果、Ｔ１１Ａ、
Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃがいずれも0/667 、Ｑ２０Ａが1/
667 、であった。この結果、Ｔ１１Ａ（1.7kb ）、Ｖ２
０Ａ（1.3kb）及びＶ２０Ｃ（0.9kb ）のマーカー・バ
ンドが雄性決定遺伝子に強く連鎖したＤＮＡマーカーで
あることが明らかになった。
【００１９】〔実施例２〕実施例１で得られたＴ１１Ａ
（1.7kb ）、Ｖ２０Ａ（1.3kb ）及びＶ２０Ｃ（0.9kb
）の各フラグメントをゲルから抽出し、精製後、ベク
ター（pBluescriptSK(-) 、東洋紡）に繋ぎ、大腸菌
（ＪＭ１０９、東洋紡）に導入してクローニングした。
得られた各クローンがＲＡＰＤ法で得られた特異的なマ
ーカー・バンドに対応するものであることを明らかにす
るために、ディゴキシゲニンで標識し、サザン・ハイブ
リダイゼイションを行った（ベーリンガー・マンハイム
社製、Dig キット使用）。この結果を図７に示す。図中
のＡが、ＯＰＴ１１及びＯＰＶ２０をプライマーとした
場合の増幅産物の電気泳動の結果を示し、Ｂ、Ｃ、Ｄは
Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃをそれぞれプローブと
した場合のサザン・ブロッテイングの結果を示す。図７
が示すように、各クローンがそれぞれのＲＡＰＤ産物に
ハイブリダイズし、目的のマーカー・バンドがクローニ
ングされていることが明らかになった。
（1.7kb ）、Ｖ２０Ａ（1.3kb ）及びＶ２０Ｃ（0.9kb
）の各フラグメントをゲルから抽出し、精製後、ベク
ター（pBluescriptSK(-) 、東洋紡）に繋ぎ、大腸菌
（ＪＭ１０９、東洋紡）に導入してクローニングした。
得られた各クローンがＲＡＰＤ法で得られた特異的なマ
ーカー・バンドに対応するものであることを明らかにす
るために、ディゴキシゲニンで標識し、サザン・ハイブ
リダイゼイションを行った（ベーリンガー・マンハイム
社製、Dig キット使用）。この結果を図７に示す。図中
のＡが、ＯＰＴ１１及びＯＰＶ２０をプライマーとした
場合の増幅産物の電気泳動の結果を示し、Ｂ、Ｃ、Ｄは
Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ及びＶ２０Ｃをそれぞれプローブと
した場合のサザン・ブロッテイングの結果を示す。図７
が示すように、各クローンがそれぞれのＲＡＰＤ産物に
ハイブリダイズし、目的のマーカー・バンドがクローニ
ングされていることが明らかになった。
【００２０】Ｔ１１ＡとＶ２０Ａの全領域、及びＶ２０
Ｃの両末端から300 〜400bp の領域について、核酸塩基
配列解析器 373A （ABI 社製）を用いて塩基配列を決定
した。Ｔ１１Ａの全塩基配列を配列番号１に、Ｖ２０Ａ
の全塩基配列を配列番号２に、Ｖ２０Ｃ（0.9kb ）のＴ
７側（挿入ベクターのＴ７プロモーター側）の塩基配列
を配列番号３に、Ｔ３側（挿入ベクターのＴ３プロモー
ター側）の塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。
Ｃの両末端から300 〜400bp の領域について、核酸塩基
配列解析器 373A （ABI 社製）を用いて塩基配列を決定
した。Ｔ１１Ａの全塩基配列を配列番号１に、Ｖ２０Ａ
の全塩基配列を配列番号２に、Ｖ２０Ｃ（0.9kb ）のＴ
７側（挿入ベクターのＴ７プロモーター側）の塩基配列
を配列番号３に、Ｔ３側（挿入ベクターのＴ３プロモー
ター側）の塩基配列を配列番号４にそれぞれ示す。
【００２１】〔実施例３〕配列番号１により表されるＤ
ＮＡの塩基配列に基づき、表１に示すＰＣＲプライマー
を合成した（サワデー・テクノロジー社に委託）。
ＮＡの塩基配列に基づき、表１に示すＰＣＲプライマー
を合成した（サワデー・テクノロジー社に委託）。
【００２２】
【表１】
【００２３】表１のプライマーを表２のように組み合わ
せ、ホウレンソウ（系統：Ujou-1、サカタのタネ育成
系）の雄株、雌株のそれぞれから抽出したＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲを行った。
せ、ホウレンソウ（系統：Ujou-1、サカタのタネ育成
系）の雄株、雌株のそれぞれから抽出したＤＮＡを鋳型
としてＰＣＲを行った。
【００２４】
【表２】
【００２５】ＤＮＡの抽出は実施例１と同様にＰＥＸ法
に従った。ＰＣＲは、実施例１と同様のアステック社の
Programmable Control system PC-700を用い、94℃（１
分）−60℃（２分）−72℃（２分）を３０サイクル行っ
た。得られた増幅産物を実施例１と同様のアガロース・
ゲルで電気泳動、染色して予測されるサイズのＤＮＡマ
ーカー・バンドが雄に特異的に増幅されているかどうか
を調べた。結果を図１４及び表２に示す。図中のＭは分
子量マーカー（ニッポン．ジーン社製、Marker6 ）であ
る。図１４及び表２が示すように、プライマーの１２組
合せ中、７組で雄株に特異的なＤＮＡマーカー・バンド
を検出できた。
に従った。ＰＣＲは、実施例１と同様のアステック社の
Programmable Control system PC-700を用い、94℃（１
分）−60℃（２分）−72℃（２分）を３０サイクル行っ
た。得られた増幅産物を実施例１と同様のアガロース・
ゲルで電気泳動、染色して予測されるサイズのＤＮＡマ
ーカー・バンドが雄に特異的に増幅されているかどうか
を調べた。結果を図１４及び表２に示す。図中のＭは分
子量マーカー（ニッポン．ジーン社製、Marker6 ）であ
る。図１４及び表２が示すように、プライマーの１２組
合せ中、７組で雄株に特異的なＤＮＡマーカー・バンド
を検出できた。
【００２６】〔実施例４〕配列番号２により示される塩
基配列に基づき、表３に示すＰＣＲプライマーを合成し
た。
基配列に基づき、表３に示すＰＣＲプライマーを合成し
た。
【００２７】
【表３】
【００２８】表３のプライマーを表４のように組み合わ
せ、ＰＣＲを行い、得られた増幅産物を同様に電気泳
動、染色して予測されるサイズのＤＮＡマーカー・バン
ドが雄株に特異的に存在するかどうか調べた。
せ、ＰＣＲを行い、得られた増幅産物を同様に電気泳
動、染色して予測されるサイズのＤＮＡマーカー・バン
ドが雄株に特異的に存在するかどうか調べた。
【００２９】
【表４】
【００３０】結果を表４に示す。５組合せ中２組合せで
雄株に特異的なＤＮＡマーカー・バンドが検出できた
（図１５、図１６）。
雄株に特異的なＤＮＡマーカー・バンドが検出できた
（図１５、図１６）。
【００３１】〔実施例５〕最も安定的に検出できるプラ
イマー組合せを決定するために、表２、表４に示す各プ
ライマー組合せについて、異なる個体から抽出したＤＮ
Ａを用いてＰＣＲを行い、電気泳動により目的とするＤ
ＮＡマーカー・バンドの有無を調べた。ＰＣＲはパーキ
ン・エルマー社製の核酸自動増幅器 9600 型を用い、94
℃（15秒）−60℃（30秒）−72℃（30秒）で３０サイク
ル行った。ＤＮＡの抽出は実施例３の方法を簡略化して
行った。実験に供した組合せのうち、ＴＡＦ１−７＋Ｃ
ＯＭＴの組合せが最も実験誤差が少なかった（図１
７）。
イマー組合せを決定するために、表２、表４に示す各プ
ライマー組合せについて、異なる個体から抽出したＤＮ
Ａを用いてＰＣＲを行い、電気泳動により目的とするＤ
ＮＡマーカー・バンドの有無を調べた。ＰＣＲはパーキ
ン・エルマー社製の核酸自動増幅器 9600 型を用い、94
℃（15秒）−60℃（30秒）−72℃（30秒）で３０サイク
ル行った。ＤＮＡの抽出は実施例３の方法を簡略化して
行った。実験に供した組合せのうち、ＴＡＦ１−７＋Ｃ
ＯＭＴの組合せが最も実験誤差が少なかった（図１
７）。
【００３２】
【発明の効果】本発明は、ホウレンソウの新規な雌雄判
別方法を提供する。この方法により抽だい前のホウレン
ソウについて簡易かつ迅速に雌雄を判別できる。
別方法を提供する。この方法により抽だい前のホウレン
ソウについて簡易かつ迅速に雌雄を判別できる。
【００３３】
配列番号 １ 配列の長さ：１６５９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名 ：ホウレンソウ 配列 TTCCCCGCGA CTTCACACTC GTCATTTCAT TCTCGACCCT AATTAACTCC TCTTTACCCA 60 ATTAGAAATC AATGCTGAAA AAAGTCTATT TCGAAATCTA GCCCTTTGTT TTTAGTCATG 120 TTTTTTGTCT AATCTATGTA AAAATCTAGG TTAAACATAA TATATTTCCA ATTTGTTATG 180 GAAGGAAGAC TTATATATAT GCTTATATTG TGGGGATTCT ATGAGAATCA GTTCAACCAC 240 TACATCAGAT TGATTTGTTT ATGCATTTTG TCCAAATATC ATGTTATCAT ATACTTGTAT 300 TTAATTTCTC GAACATATTA TTAAGCCTAG GACTGTTATG ATAATGGGGC TTGTATTTCT 360 TATGGGAGGG GAAATGCATC ATTGATTTCC AATGAAATGG GAATTAGTTA TTATAATCAC 420 GAGTACATGA TTATAATAAA TGTGAAGAAC AGGGCAATAT GCTAGAAATT GCCCCTTACA 480 AAGGGATAAT GCGGATGTTA GAGAACAAGT TGTTGTAGTG GTTAATATGC TAGTTTGAAG 540 GGATATAATG GTGATGATAG ACTGGTAGAA ATGTCCATGG TGGTGTTTAG GTGATGATAT 600 GATTTACTTT GGATGTGGTC ATGCTGGTAT TTAGAAAAAA CATGGGGGTG GTACAAAATA 660 CAGAGGTGCT ACCGTGCTTG TTGGACCTAG TGGCTATGAT ATGCTAACAG AGTCAATAGT 720 TTTGACTAGG AATAAATATA CACATAATAT TTTTGACGGG CTGATGTTTC CTTCTGGCGT 780 TGATTTTCAC GATTTACTAA TGACAGATGG ATAAGATGTT TTCATTTTAG ATAAAGAATA 840 GACAAGTTAT TTATCATTTG AATCCTTGCA ACAACGATTT TTTGACAAAA TTTGCATAGC 900 TCAACCTTTA TGATTACTGA TGAGGCATGA TGAGTTTTTT CATAATCAAC TATTCTACTT 960 TGAGTAGGTT GCTAATATCG TATGTTTTCC ATCTTTAACT TGTGAAACTT AGCCAACAGG 1020 TGAAAACATA TTGTTACGCC TCAGATATAC ATGACACATG GATTGGTAGT ATGGCAGGAT 1080 TGTGAACCTC TATAATGTTA CTTTCTGGAG ACTGCAGAAT ACTTGAAAAC ACTTCAGCCT 1140 TCAAGTACTT TATTTTTTCT TCTGTCGACT CACACATGCT TGTTCTTCTT GGCAGTGTTA 1200 AGAGTTCCTC TAATTTATAT TATTATGCTG TTCATCTTTA TGTGGTTAGG GGGTCATTAG 1260 AAGTGGCAAT AGGTTGCTAC GCAAGATTGT TTGCTTGATT GATCTGGAAA TTTTATTTGC 1320 TGTTATTCTT TTGTGAGTCT ATTTCTACGT TTCAGCTTCC TGGCATGTGT ACTTATGTTT 1380 TCTATTTTTT TGTTAGTGTT GGTCATATCT GGTATGTGTA TTTTTGGGAT TATAGCTTGT 1440 GATGCAAAGA TTTCTGCTGT AGAATGAAGG GGGCTGTAGG GATATTACTT ATGTAAGTGT 1500 TCTCATCCAG TTAATCTCTT TAAAAGTAGT GTATGTTCAC GTTTTTTTTT GCAGAATTGC 1560 AGACTTCTTG GTTGTGATCT CGTAGCTTTC TCGTATGAAT TTTTTATTGG TAATTTGAAT 1620 TCATTGTTTG CTTGTGGTTT GACACTCTAT CGCGGGGAA 1659
【００３４】配列番号 ２ 配列の長さ：１３４７ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名 ：ホウレンソウ 配列 CAGCATGGTC CCTACCGTTG AATCAGTTGT TGTAAGGTAA AGCCTGAGTG GAGAACCCGA 60 TATTGTTGGC TTTAACACTG GTGGATTTGA AAATTAGTCC TTGATGGTGT CAAATGCGTA 120 TTGGCAGCCT TCGTCCCATA CCTTGGGCTC ACTCTTGTGG AGTTTTTGGA ACACTTTCTC 180 ACAAATCATG GTGAGTTTTA AAATGTACCT GTTGATGTAT TGTAACTTGC CAAGGAACTC 240 CCAAATTTCG TTCTCATTTG CCGGCGATTT CATGTCTAGA CTGGCCTTGT TTTTTGAAGG 300 ATCAGCCTCG ATGCCCTGAG AACTGATGAC ATACCCGAGT AACTTGCCTG ACGTGACCCT 360 GAATGCACAT TTCTGAGGAT TGAGCCTCAT ATTGTATTGT CTGAGCTTGT AGAAGAATTT 420 TCGAAGTACT GTTGTATGCT CATGTCGCTC TTTGGATTTG ACAATCATGT CGTCGACATA 480 TACCTCAAGT TCTCTGTGAA TCATGTCGCT CATGATGGTT GTGGCTATTA TTTAATAGGT 540 AGCCACCGTG TTCTTCGGTC CAAACGGCAT AACAGTGTAG CGGGTTTAGG GTTTCATGTC 600 TAGAATGGCC TTGTTTTTTG AATTGAGGAT CAGGCTCGAT GCCCCGAAAA CTGATGACAT 660 ACCCGAGTAA CATGCCTGAT GTCACCCCGA ATGCACATTT CTGAGGATAG AGCCTCATAT 720 TGTATTGTCT GAGCTTGTAG AAGAATTTTC GAAGTACTGT TGTATGCTCA TGTCGCTCTT 780 TGGATTTGAC AATTATGTCG TCGACATATT CCTCAATTTC TCTGTTAATC ATGTCGCTTA 840 TGATGGTTGT GGTTGTTATT TGATAGGTAG CCCCCGTGTT CTTCAGTCCA AACGGCATAA 900 CTGTTTAGCA ATATGTACCC CACTTAGTGA TGAAGGTTGT CTTCTCCATG TCGTCCTCTG 960 CTATGGGAAT CCGATTGTAG CCTGCGTACC AGTTCATAAA AGAGAGTAAG GCATAATTGG 1020 CTGTGTTGTC GACCAGAATG TCGATGAGTG GCAGTGGAAA ATCGTCTTTA GGGCTAGTCG 1080 TGTTAAGATA TCTGTAATCG ACGCACATTT GAAATTTACC GTCCTTCTTC GGAACTGGAA 1140 CGACATTTGC AATCAATTCT GAATATTTGG ATTCTCGAAT AAACCCGACC TCTAACTGCT 1200 TGGAGACCTC TTCTTTAATT TTGAGGGAAA CACCCGGTTT CACACGACGG AGTTTTTTCT 1260 TGATGGGATT TATGCCTGAA ATGAGGGGAA TTGTATGTTA ACCGATGCTT GGATCAACCC 1320 CTGGCATATC ATGATAGGAC CATGCTG 1347
【００３５】配列番号 ３ 配列の長さ：３６５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名 ：ホウレンソウ 配列 CAGCATGGTC AACTTTGGAA CAAAACACAC GAAGTCAACA TTTCAGGTTA TAAAGGAATT 60 CCTAAGGCAC ACAGGCCAAA TTGCACAAAA GCACCATCAA TGCATGTGCA GCAGCTGCAT 120 CAAAGANTAG CAAATNATGC AGACGGTACC AGTAGTTCAT ATGCAGCAGC TGCACCAAGC 180 AGTCAAGAAC GTCAATGCAC CAGCAGCAGC AGNACAANGC ATCANGTATA AAGCANTANC 240 TTCATAAGAA CTGCATAACA TACACTAGAN CAAACANCAA GCCTGTATAA NGGGCTATAG 300 TCAGCAGGCT CCCAGCAAGC CTGATCAGNA GGTTNCTNGC AAGNCTGCTT TTGAGTAAGG 360 TTCAA 365
【００３６】配列番号 ４ 配列の長さ：３４４ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：２本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：Genomic DNA 起源 生物名 ：ホウレンソウ 配列 CAGCATGGTC TTGCATTGTG CATGATAACG GAGTAATACA GTTATTGACT TGCCTCTCAT 60 TGACATCATA TATAGTATAA ATGGAAAACA TTGACATCAA CAAACCCCAA ACCTTAGTAC 120 TGGTTGTATA TAAACTGGTG TTGTTGTTGT CCTTGTATCA CANCTCGGCT CTATAGGTGT 180 CGAACCTGGG CCTAGACCCT CGGAATGGAA GGTCTATTAA GAAAAGTTAG ATGCCTAGTT 240 CATGCATTAG TAAATCTACT TCTGCATTCA GCATTTGANT TATACTGGCC ATTGTGCATT 300 CGGTCAACCG GCCAATGGCT TTACCAACCC ANGCCCCTGC CTGT 344
【００３７】配列番号 ５ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCACACTCG TCATTTCATT CTCGA
【００３８】配列番号 ６ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTAATTAACT CCTCTTTACC CA
【００３９】配列番号 ７ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATACAAGCC CCATTATCAT AA
【００４０】配列番号 ８ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＡＴＡＴＴＡＴＴＡＡ ＧＣＣＴＡＧＧＡＣＴ Ｇ
【００４１】配列番号 ９ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ＧＡＧＴＧＴＣＡＡＡ ＣＣＡＣＡＡＧＣＡＡ ＡＣＡ
ＡＴ
ＡＴ
【００４２】配列番号 １０ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AATTCATACG AGAAAGCTAC GA
【００４３】配列番号 １１ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AGTCTATTTC TACGTTTCAG CT
【００４４】配列番号 １２ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 AAAACATAAG TACACATGCC AG
【００４５】配列番号 １３ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TACCGTTGAA TCAGTTGTTG TAAGG
【００４６】配列番号 １４ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GACCCTGAAT GCACATTTCT GA
【００４７】配列番号 １５ 配列の長さ：２２ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGACAATAC AATATGAGGC TC
【００４８】配列番号 １６ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTTGATCCAA GCATCGGTTA ACATA
【００４９】配列番号 １７ 配列の長さ：２１ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GGTCGACAAC ACAGCCAATT A
【００５０】配列番号 １８ 配列の長さ：１９ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACCAGTTCAT AAAAGAGAG
【００５１】配列番号 １９ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 ACTTTGGAAC AAAACACACG AAGTC
【００５２】配列番号 ２０ 配列の長さ：２５ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GCATTGTGCA TGATAACGGA GTAAT
【００５３】配列番号 ２１ 配列の長さ：１０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TTCCCCGCGA
【００５４】配列番号 ２２ 配列の長さ：１０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 TCGCCCAGTC
【００５５】配列番号 ２３ 配列の長さ：１０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CTGCGCTGGA
【００５６】配列番号 ２４ 配列の長さ：１０ 配列の型 ：核酸 鎖の数 ：１本鎖 トポロジー：直線状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGCATGGTC
【図１】アトラスの兄妹交配後代を鋳型に用いたＲＡＰ
Ｄ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＴ１
１）。
Ｄ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＴ１
１）。
【図２】アトラスの兄妹交配後代を鋳型に用いたＲＡＰ
Ｄ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＱ２
０）。
Ｄ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＱ２
０）。
【図３】アトラスの兄妹交配後代を鋳型に用いたＲＡＰ
Ｄ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＶ２
０）。
Ｄ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＶ２
０）。
【図４】東洋系、西洋系各３系統の雌雄個体におけるＲ
ＡＰＤ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＴ
１１）。
ＡＰＤ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＴ
１１）。
【図５】東洋系、西洋系各３系統の雌雄個体におけるＲ
ＡＰＤ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＱ
２０）。
ＡＰＤ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＱ
２０）。
【図６】東洋系、西洋系各３系統の雌雄個体におけるＲ
ＡＰＤ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＶ
２０）。
ＡＰＤ産物の電気泳動写真である（プライマー：ＯＰＶ
２０）。
【図７】ＲＡＰＤ産物の電気泳動写真である。
【図８】Ｔ１１ＡのＴ７側塩基配列とその増幅に用いる
プライマーの位置関係を示す図である。
プライマーの位置関係を示す図である。
【図９】Ｔ１１ＡのＴ３側塩基配列とその増幅に用いる
プライマーの位置関係を示す図である。
プライマーの位置関係を示す図である。
【図１０】Ｖ２０ＡのＴ７側塩基配列とその増幅に用い
るプライマーの位置関係を示す図である。
るプライマーの位置関係を示す図である。
【図１１】Ｖ２０ＡのＴ３側塩基配列とその増幅に用い
るプライマーの位置関係を示す図である。
るプライマーの位置関係を示す図である。
【図１２】Ｖ２０ＣのＴ７側塩基配列とその増幅に用い
るプライマーの位置関係を示す図である。
るプライマーの位置関係を示す図である。
【図１３】Ｖ２０ＣのＴ３側塩基配列とその増幅に用い
るプライマーの位置関係を示す図である。
るプライマーの位置関係を示す図である。
【図１４】Ｔ１１Ａの塩基配列をもとに合成したプライ
マーによるＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
マーによるＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
【図１５】プライマー：１０１−７とＩＮ１０１−３に
よるＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
よるＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
【図１６】プライマー：ＩＮ１０１−７とＩＮ１０１−
３によるＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
３によるＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
【図１７】プライマー：ＴＡＦ１−７とＣＯＭＴによる
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
ＰＣＲ増幅産物の電気泳動写真である。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成９年９月１２日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【手続補正２】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図２
【補正方法】変更
【補正内容】
【図２】
【手続補正３】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図３
【補正方法】変更
【補正内容】
【図３】
【手続補正４】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図４】
【手続補正５】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図５】
【手続補正６】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図６】
【手続補正７】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図７】
【手続補正８】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１４
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１４】
【手続補正９】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１５
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１５】
【手続補正１０】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１６
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１６】
【手続補正１１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】図１７
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１７】
Claims (9)
- 【請求項１】 ホウレンソウの雄株に特異的に存在する
ＤＮＡを指標としてホウレンソウの雌雄を判別すること
を特徴とするホウレンソウの雌雄判別法。 - 【請求項２】 ホウレンソウの雄株に特異的に存在する
ＤＮＡが、Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ、Ｖ２０Ｃ、又はこれら
のＤＮＡの一部分と同一のＤＮＡであることを特徴とす
る請求項１記載のホウレンソウの雌雄判別法。 - 【請求項３】 以下の工程からなるホウレンソウの雌雄
判別法： （１）雌雄を判別しようとするホウレンソウからＤＮＡ
を抽出する （２）Ｔ１１Ａ、Ｖ２０Ａ又はＶ２０Ｃの一部分と同一
のＤＮＡを２種類合成する （３）（１）の工程で抽出したＤＮＡを鋳型とし、
（２）の工程で合成した２種類のＤＮＡをプライマーと
して、前記プライマーに挟まれる領域を増幅する （４）得られる増幅産物の中に雄株に特異的に存在する
ＤＮＡが含まれているかどうかによりホウレンソウの雌
雄を判別する。 - 【請求項４】 ２種類のＤＮＡの組合せが、１−３とＴ
ＡＦ１−７、１−７とＣＯＭＴ、１−７とＴＡＦ１−
３、１−７とＩＮＴ１−３、ＴＡＦ１−３とＴＡＦ１−
７、ＴＡＦ１−７とＣＯＭＴ、ＴＡＦ１−７とＩＮＴ１
−３、１０１−７とＩＮ１０１−３又はＩＮ１０１−７
とＩＮ１０１−３であることを特徴とする請求項３記載
のホウレンソウの雌雄判別法。 - 【請求項５】 以下の工程からなるホウレンソウの雌雄
判別法： （１）雌雄を判別しようとするホウレンソウからＤＮＡ
を抽出する （２）（１）工程で抽出したＤＮＡを鋳型とし、ＯＰＴ
１１、ＯＰＱ２０、ＯＰＵ１６又はＯＰＶ２０をプライ
マーとして、前記プライマーに挟まれる領域を増幅する （３）得られる増幅産物の中に雄株に特異的に存在する
ＤＮＡが含まれているかどうかによりホウレンソウの雌
雄を判別する。 - 【請求項６】 配列番号１記載の塩基配列により表され
るホウレンソウの雄株に特異的に存在するＤＮＡ。 - 【請求項７】 配列番号２記載の塩基配列により表され
るホウレンソウの雄株に特異的に存在するＤＮＡ。 - 【請求項８】 配列番号３により表されるＤＮＡと配列
番号４により表されるＤＮＡを含み、かつ、長さが０．
９kbである、ホウレンソウの雄株に特異的に存在するＤ
ＮＡ。 - 【請求項９】 配列番号５ないし２０いずれか一の配列
番号により表されるＤＮＡ。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP9124012A JPH1052284A (ja) | 1996-05-14 | 1997-05-14 | Ｄｎａマーカーを用いたホウレンソウの雌雄判別法 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP8-119124 | 1996-05-14 | ||
| JP11912496 | 1996-05-14 | ||
| JP9124012A JPH1052284A (ja) | 1996-05-14 | 1997-05-14 | Ｄｎａマーカーを用いたホウレンソウの雌雄判別法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH1052284A true JPH1052284A (ja) | 1998-02-24 |
Family
ID=26456918
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP9124012A Pending JPH1052284A (ja) | 1996-05-14 | 1997-05-14 | Ｄｎａマーカーを用いたホウレンソウの雌雄判別法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPH1052284A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009284903A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Seminis Vegetable Seeds Inc | ホウレンソウ系統ｓｍｂ６６−１０８２ｆ |
-
1997
- 1997-05-14 JP JP9124012A patent/JPH1052284A/ja active Pending
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2009284903A (ja) * | 2008-05-30 | 2009-12-10 | Seminis Vegetable Seeds Inc | ホウレンソウ系統ｓｍｂ６６−１０８２ｆ |
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