MXPA06005879A

MXPA06005879A - Dimeros de triazina para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Info

Publication number: MXPA06005879A
Application number: MXPA06005879A
Authority: MX
Inventors: Boulos Zacharie; Lyne Gagnon; Christopher Penney; Shaun D Abbott; Jean-Francois Bienvenu; Alan D Cameron; Jean-Simon Duceppe; Abdallah Ezzitouni; Daniel Fortin; Karine Houde; Nancie Moreau; Nicole Wilb; Brigitte Grouix
Original assignee: Prometic Biosciences Inc
Priority date: 2003-11-24
Filing date: 2004-11-22
Publication date: 2007-01-26
Also published as: US7683061B2; PL1687297T3; US20070149528A1; ES2501169T3; JP2007512259A; WO2005049607A1; CA2554635C; IL175814A0; WO2005049607B1; AU2004291186A1; EP1687297A1; JP5160788B2; EP1687297B1; CA2554635A1; DK1687297T3; PT1687297E; BRPI0416843A8; BRPI0416843A; EP1687297A4; AU2004291186B2

Abstract

Las compuestos que contienen dos anillos de triazina mono o disustituidos enlazados covalentemente por un enlazador organico, pero no enlazados directamente entre si, se pueden utilizar para tratar enfermedades autoinmunes; las enfermedades autoinmunes que pueden ser sujetas al tratamiento con los compuestos de esta invencion incluyen artritis reumatoide, lupus sistemico eritomatoso (SLE), trombocitopenia idiopatica (inmune) (ITP), glomerulonefritis y vasculitis; la presente invencion tambien se refiere a la reduccion de la toxicidad de farmaco que con frecuencia acompana a las terapias tradicionales para las enfermedades autoinmunes; los compuestos tambien se pueden utilizar para unir anticuerpos in vitro o ex vivo.

Description

DIMEROS DE TRIAZINA PARA EL TRATAMIENTO DE ENFERMEDADES AUTOINMUNES REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS Esta solicitud reclama el beneficio de la solicitud de E.U.A. provisional No. 60/524,021 , presentada el 24 de noviembre de 2003.

CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere al tratamiento de enfermedades autoinmunes con nuevos compuestos orgánicos. Estos compuestos contienen dos anillos de triazina mono- o di-sustituidos covalentemente enlazados por un enlazador orgánico, pero no directamente enlazados uno a otro.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Enfermedad autoinmune se refiere a un grupo de trastornos o enfermedades en las cuales el daño al tejido está asociado con una respuesta inmune humoral y/o mediada por células a constituyentes del cuerpo o, en un sentido más amplio, una respuesta inmune "a sí misma". La respuesta inmune patológica puede ser sistémica o específica de órganos. Es decir, por ejemplo, la respuesta inmune dirigida a si misma puede afectar articulaciones, la piel, la vaina de mielina que protege las neuronas, el riñon, hígado, páncreas, tiroides, glándulas suprarrenales y ovarios. De hecho, la lista de enfermedades autoinmunes está compuesta de más de ochenta trastornos. Unas cuantas enfermedades tales como vitíligo, en los cuales aparecen parches sin pigmentación en la piel, son simplemente molestas. La mayoría de las demás son debilitantes, a menudo progresivas con el tiempo y finalmente mortales. El lupus eritematoso sistémico (SLE, por sus siglas en inglés), por ejemplo, es uña enfermedad crónica en la cual 10-15% de los pacientes mueren dentro de una década de diagnóstico. En todas excepto algunas enfermedades autoinmunes, la relación en cuanto a sexos se inclina hacia las mujeres. Por ejemplo, en SLE la relación de pacientes mujeres a hombres es de nueve a uno. En un caso particular, la enfermedad de Hashimoto, en la cual el sistema inmune ataca la glándula tiroides, la relación es de cincuenta a uno. Desde hace mucho se sabe que la formación del complejo inmune juega un papel en la etiología y progresión de la enfermedad autoinmune. Por ejemplo, en Goodman y Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, 16a. Edición (1980), Macmillan Publishing Co., en la página 683, la inflamación en pacientes con artritis se afirma que probablemente implica fagocitosis por leucocitos de complejos de antígeno, anticuerpo y complemento - complejos inmunes. Pero sólo ahora se ha reconocido que la inflamación causada por complejos inmunes en las articulaciones (artritis), los ríñones (glomerulonefritis) y vasos sanguíneos (vasculitis) es una causa principal de morbidez en enfermedades autoinmunes como lo señala P.M. Hogarth et al., Annual Reports in Medicinal Chemistry, 37, 217-224 (2002). La formación de complejo inmune incrementada se correlaciona con la presencia de anticuerpos dirigida a sí mismo o llamados autoanticuerpos, y la presencia de estos últimos también pueden contribuir a inflamación de tejido ya sea como parte de un complejo inmune o no unido a antígeno (anticuerpo libre). En algunas enfermedades autoinmunes, la presencia de autoanticuerpo libre contribuye significativamente a la patología de la enfermedad. Esto se ha demostrado claramente, por ejemplo, en SLE (anticuerpos anti-ADN), ITP (respuesta de anticuerpo dirigida a plaquetas) y a un grado menor, artritis reumatoide (factor reumatoide reactivo a IgG). La importancia del papel de los complejos inmunes y autoanticuerpos libres es demostrada adicionalmente por el hecho de que el tratamiento exitoso de ciertas enfermedades autoinmunes se ha logrado mediante la remoción de complejos inmunes y anticuerpo libre mediante procedimientos de inmunoadsorción específicos. Por ejemplo, el uso de un procedimiento de aféresis en el cual complejos inmunes y anticuerpos son removidos por el paso de la sangre de un paciente a través de una columna de inmunoafinidad (Prosorba®) fue aprobado por la U. S. FDA (Administración de Fármacos y Alimentos de los E.U.A.) en 1987 para ITP y en 1999 para artritis reumatoide. Actualmente, sin embargo, no hay un método aprobado para el tratamiento de enfermedades autoinmunes que facilite la eliminación de complejos inmunes y autoanticuerpos mediante la administración de un fármaco.

Otro aspecto de la etiología y progresión de enfermedad autoinmune es el papel de las citocinas proinflamatorias. Bajo circunstancias normales, las citocinas proinflamatorias tales como factor de necrosis tumoral a (FNTa) e interleucina-1 (IL-1) juegan un papel protector en la respuesta a infección y estrés celular. Pero las consecuencias patológicas que resultan de producción crónica y/o producción excesiva de FNTa e IL-1 se cree que fundamentan la progresión de muchas enfermedades autoinmunes tales como artritis reumatoide, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria y psoriasis. Otras citocinas proinflamatorias incluyen interleucina-6, interleucina-8, interleucina-17 y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos. Sin embargo, parece ser que FNTa está por arriba de la cascada de citocina proinflamatoria. Es decir, en términos de bloqueo de una citocina proinflamatoria, el bloqueo de FNTa proveería el efecto terapéutico máximo. La capacidad de FNTa para regular descendentemente otras citocinas proinflamatorias es revisada por M. Feldmann en Perspectives, 2: 364-371 (2002). De hecho, el impacto del antagonismo de FNTa como una opción de tratamiento para artritis, artritis psoriática, psoriasis y enfermedad de Crohn ha sido ¡lustrado por la aprobación por la U.S. FDA de Remicade (anticuerpo monoclonal anti-FNTa quimérico), Enbrel (proteína de fusión de receptor p75 de FNTa) y Humira (anticuerpo monoclonal anti-FNTa humano). Como se puede inferir a partir de la discusión anterior referente a la etiología y progresión de enfermedad autoinmune, su patogénesis es compleja y multifactorial. Como tal, hay una multitud de terapia disponible.

Pero la mayoría de las enfermedades autoinmunes son deficientemente controladas por los tratamientos actuales. Tratamientos convencionales no son uniformemente efectivos y a menudo están asociados con toxicidad moderada a severa. Sin embargo, la discusión anterior indica que existe la necesidad de compuestos orgánicos simples, bien definidos que pueden ayudar al cuerpo a eliminar complejos inmunes o por lo menos prevenir la deposición de complejos inmunes circulantes y/o (simultáneamente) inhibir la actividad de FNTa mientras aún es generalmente no tóxico para el paciente. En resumen, existe la necesidad de un tratamiento eficaz pero no tóxico de enfermedad autoinmune crónica. La presente invención provee compuestos que son útiles para el tratamiento de enfermedad autoinmune crónica. Aunque inicialmente no son amenazantes para la vida, la mayoría de las enfermedades autoinmunes son condiciones crónicas que hacen lento el progreso a un estado debilitante. aunque están disponibles numerosas terapias, los tratamientos convencionales no son rutinariamente eficaces. Más problemática es toxicidad acompañante que a menudo prohibe el uso a largo plazo necesario con una enfermedad crónica. Los tratamientos actuales para enfermedad autoinmune se pueden clasificar ampliamente en dos grupos: aquellos fármacos que disminuyen o suprimen la respuesta inmune a sí misma y aquellos fármacos que dirigen los síntomas que surgen de inflamación crónica. Con mayor detalle, los tratamientos convencionales para enfermedad autoinmune (v.gr., principalmente artritis) son los siguientes : 1. Fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs): Estos incluyen aspirina, ibuprofen, naproxen, etodolac y ketoprofen. Los NSAIDs no son fármacos relativamente potentes y son los más comúnmente usados como fármacos antiinflamatorios en las primeras etapas de enfermedad para aliviar el dolor e hinchazón que acompaña artritis). Pero los NSAIDs están asociados con irritación gastrointestinal y toxicidad del hígado. A fin de enfrentar la ulceración gastrointestinal asociada con el uso de muchos NSAIDs, recientemente se han desarrollado fármacos de NSAID más selectivos que selectivamente inhiben (Vioxx, Celebrex) o preferencia I mente inhiben (Mobicox) ciclooxigenasa-2 (inhibidores de COX-2). Sin embargo, los inhibidores de COX-2 despliegan efectos colaterales no deseables que incluyen irritación gastrointestinal, especialmente con uso a largo plazo. 2. Corticosteroides: Estos incluyen prednisona y dexametasona. Los corticosteroides son los agentes antiinflamatorios más ampliamente usados para el tratamiento de artritis reumatoide. Pero incrementan significativamente el riesgo de osteoporosis, toxicidad gastrointestinal e infección que surge de supresión inmune generalizada. Por lo tanto, los corticosteroides tienden a ser usados para el tratamiento de la aparición de la enfermedad (v.gr., SLE) y no como un tratamiento crónico. 3. Fármacos antireumáticos modificadores de enfermedad (DMARDs): estos incluyen fármacos citotóxicos tales como metotrexato, azatioprina y ciclofosfamida, ¡nmunosupresores potentes tales como ciclosporina A (Sandimmune, Neoral) y FK506 (tacrolimus) y una variedad de otros fármacos tales como hidrocloroquina y sales de oro orgánico (v.gr., aurotioglucosa). Los DMAKDs son fármacos potentes y de esta manera pueden desplegar eficacia significativa en la reducción de inflamación reductora y reducción en la velocidad de progresión de la enfermedad. Como tales, los médicos han usado tradicionalmente DMARDs como una segunda línea de después de NSAIDs. Como fármacos potentes, sin embargo, DMARDs tienen toxicidad significativa asociada con su uso. Los fármacos citotóxicos, por ejemplo, interfieren con la duplicación de ADN que se manifiesta a sí misma con un número de efectos tóxicos. Estos últimos incluyen depresión de médula ósea y subsecuente riesgo de infección y neoplasia. El uso de ciclosporina A y FK506 está limitado por efectos colaterales severos que incluyen toxicidades renal y hepática. Los efectos tóxicos asociados con el uso de hidrocloroquina incluyen ceguera, neuromiopatía y malestar gastrointestinal. El efecto colateral más común que surge de terapia con sales de oro es dermatitis. Pero la toxicidad del oro también puede causar nefritis y depresión de médula ósea. 4. Sustancias biológicas: Estas incluyen las proteínas recombínantes Remicade, Enbrel y Humira, todas las cuales tienen como objetivo FNTa; Kineret, la cual tiene como objetivo interleucina-1 ; Amevive, la cual tiene como objetivo células T (glicoproteína de CD2); y Raptiva la cual también tiene como objetivo células T (anticuerpo anti-CD Ha). Pero las proteínas recombinantes y, en particular, los anticuerpos recombinantes son difíciles de producir para uso ampliamente diseminado y tienen efectos colaterales tóxicos asociados con su uso. Las toxicidades incluyen reacciones inmunológicas potenciales, especialmente con el uso prolongado que puede requerirse para condiciones crónicas. Además de la respuesta de HAMA (anticuerpo anti-ratón humana) bien conocida asociada con anticuerpos quiméricos o humanizados, mecanismos de citotoxicidad mediada por anticuerpo (ADCC y mediado por complemento) puede conducir a efectos colaterales. Más recientemente, se descubrió que los anticuerpos, independientemente de la fuente o especificidad de antígeno, puede convertir oxígeno molecular a peróxido de hidrógeno y ozono como lo describe P. Wentworth et al. Science 293, 1806-1811 (2001 ) y 298, 2195-2199 (2002). Esto podría conducir a daño celular y tisular que pudiera exacerbar el tratamiento de una condición autoinmune con uso prolongado. Por ejemplo, se mostró que la producción de peróxido de hidrógeno y ozono por anticuerpos podría ser enlazado a una respuesta inflamatoria en ratas: una denominada reacción de Arthus. La actividad anti-FNTa potente del anticuerpo Remicade ha conducido a riesgo incrementado de infecciones oportunistas que incluyen tuberculosis, histoplasmosis, listeriosis y pneumocitosis. Por lo tanto, un objetivo de la presente invención es proveer compuestos novedosos para usarse en el tratamiento de enfermedad autoinmune.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a un método novedoso para el tratamiento de enfermedad autoinunune crónica, en particular artritis y SLE, mediante la administración de un compuesto a un mamífero, preferiblemente un humano. Por lo tanto, de conformidad con esta invención, se proveen ciertos dímeros de triazina mono- o disustituidos (en los cuales un monómero de triazina está conectado al otro por un enlazador orgánico) y sus composiciones farmacéuticas que son capaces del aclaramiento de complejos inmunes o de limitar su deposición dentro de órganos corporales tales como el riñon y/o de inhibir las acciones proinflamatorias de FNTa. En una modalidad preferida de esta invención, estos compuestos de triazina afectarán ambos aspectos del proceso de inflamación: complejos inmunes y FNTa. El beneficio terapéutico que resulta de este doble mecanismo de acción se manifestará en términos de un perfil de toxicidad mejorado. Es decir, los compuestos de triazina descritos en esta invención no son inhibidores potentes de FNTa ni eliminarán completamente los complejos inmunes. El FNTa no juega un papel en la protección contra infección mientras que los complejos inmunes juegan un papel en mecanismos de retroalimentación que regulan las respuestas inmunes (llamados determinantes idiopáticos). La eficacia terapéutica puede resultar del efecto aditivo de los dos mecanismos de acción. Además, la toxicidad debida a tratamiento crónico y/u otros fármacos usados en combinación pueden ser por lo menos reducidos o evitados.

En otra modalidad de la presente invención, los compuestos de triazina afectarán únicamente a un aspecto del proceso de inflamación. Es decir, estos compuestos afectarán ya sea complejos inmunes o FNTa. En el caso en donde los compuestos de triazina influyen en la eliminación de complejos inmunes o evitan su deposición, se espera que dichos compuestos sean particularmente útiles para el tratamiento de artritis, lupus eritematoso sistémico (SLE), trombocitopenia idiopática (inmune) (ITP), glomerulonefritis y vasculitis. En el caso en donde los compuestos de triazina inhiben FNTa, se espera que dichos compuestos sean particularmente útiles para el tratamiento de artritis reumatoide, artritis psoriática, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis alquilosante, síndrome de Sjógren, enfermedad de Still (síndrome de activación de macrófagos), uveitis, escleroderma, míositis, síndrome de Reiter y síndrome de Wegener. Desde luego, es posible que algunos compuestos de triazina de esta invención afecten el proceso de inflamación mediante un mecanismo bioquímico que es adicional a y distinto de un efecto sobre complejos inmunes y/o FNTa. Pero independientemente del mecanismo(s) por el cual los compuestos de triazina afectan la enfermedad autoinmune objetivo, un aspecto importante de esta invención es que dichos compuestos no afectan potencialmente algún aspecto del proceso de inflamación por lo que se obtendrá una toxicidad deletérea. Aspectos adicionales de la invención serán evidentes para un experto en la técnica a partir de la siguiente descripción y reivindicaciones, y generalizaciones para la misma.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La figura 1 ¡lustra una curva de respuesta a la dosis del compuesto 1 sobre la fagocitosis de complejos inmunes por células similares a macrófagos RAW 264.7. Las figuras 2-3 ¡lustran el efecto del compuesto en ratones NZBxNZW: mortalidad (figura 2) o proteinuria (figura 3). La figura 3A ilustra ratones con 5 g/l o más y la figura 3B ¡lustra ratones con mejora de filtración en riñon. La figura 4 ilustra el efecto de los compuestos 1 y 9 sobre la mortalidad de ratones NZBxNZW. La figura 5 ilustra el efecto de los compuestos 1 y 20 sobre la mortalidad de ratones MRL/lpr. La figura 6 ¡lustra el efecto de los compuestos 1 , 5 y 19a-20 sobre hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). La figura 7 ilustra el efecto de los compuestos 47, 51 y 49 sobre DTH. La figura 8 ilustra el efecto de los compuestos 1 y 19a sobre DE. La figura 9 ilustra el efecto del compuesto 1 sobre artritis inducida por colágeno. La figura 10 ilustra el efecto de los compuestos 1 y 19a sobre artritis inducida por adyuvante. La figura 11 ¡lustra el efecto de administración oral e intravenosa de los compuestos 1 y 19a sobre artritis inducida por adyuvante.

La figura 12 ilustra el efecto de administración oral e intravenosa del compuesto 19a sobre artritis inducida por adyuvante. La figura 13 ilustra la desnaturalización (dodecilsulfato de sodio o SDS) por electroforesis de gel de poliacrilamida (PAGE) de IgG total humana ligada y purificada por el compuesto 19b enlazada a la resina: franja 1 , estándares pre-teñidos (intervalo amplio); franja 2, IgG total humana; franja 3,fracción de flujo pasante; franja 4, fracción de lavado; y franja 5, fracción eluida.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La presente invención incluye compuestos, o derivados farmacéuticamente aceptables de los mismos, de la siguiente fórmula general: en donde Y'; R' = hidrógeno o alquilo de C1-4, N-metilaminoalquilo de C1-4 o N,N-dimetilaminoalquilo; A no es necesariamente igual a C; y en donde Ri, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno, alquilo o alquenilo de C2-6, hidroxialquilo C2-6, aminoalquilo C2-6, trifluorometilo, pentafluoroetilo, fenilo, naftilo, bencilo, bifenilo, fenetilo, piperazinilo, N-metilpiperazinilo, N-etilpiperazinilo, morfolinilo, piperidinilo, metilpiperidinilo, etilpiperidinilo, indenilo, 2,3-dihidroindenilo, cicloalquilo o cicloalquenilo de C4-C7, indoilo, metilindoilo, etilindoilo o anillos heterocíclicos aromáticos de cinco miembros sustituidos de las siguientes fórmulas: X se define como antes y Z = NH, CH2 o anillos de fenilo sustituidos de las siguientes fórmulas: X y R' se definen como antes ariamente igual a m W = hidrógeno, CH3, NH2, COOR', OR'.

Hal = Halógeno (F, Cl, etc.).

X y R' se definen como antes. En un aspecto de la presente invención, se proveen dímeros de triazina disustituidos en los cuales cada monómero de triazina está conectado al otro por un enlazador orgánico en donde dicho enlazador contiene un grupo fenilo 1 , 3- o 1 ,4-sustituido. Es decir, En tales casos, es posible que A = C = 0 y el grupo fenilo se vuelva el enlazador que conecta los dos monómeros de triazina. En tal caso, la fórmula general se vuelve: Esto representa un aspecto preferido de esta invención cuando A = C = 0 pero se provee otra modalidad preferida cuando A = ~(CH2)p-, en donde n = 1 ó 2 mientras que C = 0, o A = 0 mientras que C = -(CH2)n-- en donde n = 1 ó 2, o A = C = ~(CH2)n-- en donde n = 1 ó 2. Por lo tanto, por ejemplo, un aspecto preferido de esta invención es A = ™(CH2)2~ y C = 0, o A = 0 y C = ~(CH2)2~. En un caso preferido, la fórmula general se vuelve: En una modalidad alternativa de la invención, ningún grupo fenilo está presente en el enlazador orgánico que conecte los dos anillos de triazína disustituidos, o B = 0. Es decir, los dímeros de triazina están conectados por una cadena de alquilo. Por lo tanto, por ejemplo, otro aspecto preferido de esta invención es A = C = -CH2- y B = 0. Por lo tanto, el enlazador orgánico contiene un --CH2CH2~ o grupo etileno y la fórmula general se vuelve: Independientemente del enlazador orgánico que conecta los dos anillos de triazina, es una modalidad preferida de esta invención en la que R-i, R2, R3 y R4 se definen como sigue: R1 = hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo = aminoetilo, amínopropilo, aminobutilo = fenilo, anilino, hidroxifenilo R2 = fenetilo, hidroxifenetilo, aminofenetilo = R3. R4 = fenilo, anilino, hidroxifenilo Particularmente preferidos son los siguientes compuestos: Compuestos del grupo 1 en donde A = -CH2-, B = 0, C = ~CH2- (enlazador de etileno): No. de compuesto Estructura Compuestos del grupo 2 en donde A ompuesto Estructura Sin embargo, esta invención no se limita a los dos grupos de compuestos anteriores, y otros compuestos particularmente preferidos incluyen los siguientes: No. de compuesto Estructura Los compuestos de la presente invención pueden facilitar el aclaramiento de complejos inmunes por fagocitosis o pueden limitar la deposición de complejos dentro de los órganos y tejidos corporales por su capacidad a antagonizar la unión de complejos inmunes a superficies de órganos y tejidos. El mecanismo por el cual los complejos inmunes se unen a varias superficies puede implicar unión a receptores de Fe de superficie celular. Los receptores de Fe son glicoproteínas de leucocitos inflamatorios que se unen a la porción Fe (cola) de las ¡nmunoglobulinas. Los receptores de Fe también están presentes en numerosos tejidos y proveen un sitio para unión y subsecuente deposición de complejos inmunes sobre superficies celulares. Por ejemplo, la deposición sobre tejido renal de autoanticuerpo que contiene complejos mediante la unión a receptores de Fe se piensa que dispara una respuesta inflamatoria típica de SLE que puede conducir a glomerulonefrítís. Los receptores de Fe bien caracterizados incluyen: Fc?RI, Fc?RII y Fc?RIII (receptores de IgG); FceRI (el receptor de IgE) y Fca;RI (el receptor de IgA). De manera interesante, la proteína A de estafilococos es una proteína bacteriana de superficie celular que se puede unir a la porción Fe (cola) de la mayoría de los anticuerpos. Por ejemplo, la proteína A se unirá a inmunoglobulinas lgG1 , lgG2 e lgG4 humanas. De manera más importante, se ha sabido por muchos años que la proteína A puede inhibir la unión de anticuerpo IgG que contiene complejos inmunes a receptores de Fe. Por ejemplo, A. Sulica et al, Immunology 38, 173-179 (1979) reportó que la proteína A inhibe la unión del complejo inmune que contiene IgG a receptores de Fe pero la proteína A incrementa la unión de IgG a linfocitos y macrófagos. Más recientemente, con la disponibilidad de ratones deficientes en receptor de Fe (cadena ?), se hizo posible establecer el rol principal de los receptores de Fe de IgG (Fc?R) en mediar las respuestas efectoras vistas en enfermedades autoinmunes tales como SLE y artritis reumatoide, como lo indica M. Marino et al. Nature Biotechnology 18, 735-739 (2000). De manera más específica, estos autores afirmaron que los agentes que pueden interferir con la unión de complejos inmunes a Fc?R debe mitigar la SLE. Proveen soporte experimental para esta afirmación al tratar una cepa especial de ratones (MRL/fpr) que desarrolla un síndrome que es similar a SLE humana con un péptido que se une a la porción Fe de IgG. La tasa de supervivencia de animales tratados (80%) fue significativamente mayor que los animales no tratados (10%). En un artículo de revisión reciente de P. M. Hogarth Current Opinión in Immunology 14,798-802 (2002), se estableció que Fc?R actúa temprano en el proceso de inflamación y el acoplamiento por complejos inmunes es una señal potente para la liberación de citocinas proinflamatorias tales como FNTa. En aquellos casos en donde los compuestos de la presente invención afectan algún aspecto de aclaramiento o deposición de complejo inmune, pueden hacerlo por su capacidad para simular a la proteína A. Es decir, dichos compuestos se pueden unir a la porción Fe de IgG humana como se evalúa por su capacidad para inhibir la unión de proteína A a IgG humana, como se determina in vitro por ELISA competitiva. Al unirse a la porción Fe de IgG humana de una manera similar a la proteína A, tal como los compuestos que simulan a la proteína A puede alterar los complejos inmunes que contienen IgG a Fc?R. Subsecuentemente, esto evitaría la deposición de complejos inmunes y por lo tanto facilitar su aclaramiento así como disminuir la liberación de citocinas proinflamatorias. Además, o en forma alternativa, los compuestos de la presente invención pueden inhibir la actividad proinflamatoria de FNTa. A diferencia de los anticuerpos monoclonales anti-FNTa recombinantes actualmente aprobados (Remicade, Humera) o receptor de FNTa (Enbrel), compuestos de la presente invención no inhiben la unión de FNTa al receptor de FNTa p55 (CD120a) o al receptor de FNTa p75 (CD120b). sin embargo, los compuestos de la presente invención pueden inhibir el efecto de FNTa como se afirma por su capacidad para inhibir apoptosis/citotoxicidad inducidas por FNTa en la línea celular de murino WEHI 164 (13var). Además, los compuestos de la presente invención pueden inhibir la producción de FNTa, como se afirma por su capacidad para inhibir la producción de FNTa inducida por LPS en la línea celular de murino J774A-1. FNTa es producido por muchos tipos de células que incluyen fibroblastos y numerosos subconjuntos de células inmunes. Ejemplos de estos últimos incluyen macrófagos, monocitos, células B y T y células cebadas. Es una molécula pleiotrópica producida en respuesta a una variedad de estímulos y que pueden ejercer efectos sobre la mayoría de los tipos de células. Bajo circunstancias normales, niveles bajos de FNTa en el suero confieren protección contra patógenos, tumores y daño tisular. Por lo tanto, en términos de uso crónico o continuo de los compuestos de la presente invención como agentes terapéuticos, un aspecto de esta invención puede ser que estos compuestos no sean inhibidores potentes de los efectos o producción de FNTa, ni inhiben de manera potente la unión de FNTa a su receptor. El potencial para uso a largo plazo de los compuestos de esta invención es demostrado por el tratamiento de ratones NZBW/FI (otro modelo para SLE humana) con compuestos para aproximadamente un año sin observación de alguna toxicidad significativa. De manera similar a las sustancias biológicas antes descritas, otros inhibidores de FNTa despliegan toxicidad que limita el uso a largo plazo o crónico. Por ejemplo, talidomida (N-ftalimidoglutarimida) es un fármaco antiinflamatorio sintético que inhibe FNTa. Pero ensayos clínicos para pacientes con artritis reumatoide en su mayoría no han sido exitosos debido a su toxicidad inaceptable. Efectos colaterales severos somnolescencia incluida, neuropatía periférica y salpullido severo. Muchos fármacos que se usan comúnmente como inmunosupresores tales como ciclosporina A y metotrexato muestran propiedades inhibidoras de FNTa pero tampoco se pueden usar sobre una base crónica debido a su toxicidad. De hecho, el papel pivotal jugado por FNTa en muchas enfermedades autoinmunes, como lo evidencia el éxito terapéutico de sustancias biológicas recientemente aprobadas junto con la falta de fármacos eficaces pero no tóxicos disponibles para tratamiento crónico, ha conducido a la investigación de un número de enfoques para la inhibición de FNTa. Los enfoques han incluido la búsqueda de inhibidores de fosfodiesterasa IV, agonistas de adenosina, inhibidores de metaloproteinasa de matriz (v.gr., inhibidores de TACE), inhibidores de transducción de señal (v.gr., p38 MAP cinasa) e inhibidores de factores de transcripción (v.gr., NFkB). Claramente entonces, existe la necesidad de compuestos que puedan inhibir eficazmente los efectos de FNTa pero que se pueden usar sobre una base a largo plazo para el tratamiento de enfermedades autoinmunes crónicas. La presente invención provee compuestos novedosos como se define por la fórmula general anterior que son útiles para el tratamiento de enfermedad autoinmune crónica. Estos compuestos pueden facilitar el aclaramiento de complejos inmunes por fagocitosis o pueden limitar la deposición de complejos inmunes con órganos y tejidos corporales por su capacidad para antagonizar la unión de complejos inmunes a superficies de órganos y tejidos. En este caso, dichos compuestos pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de aquellas enfermedades autoinmunes en donde los complejos inmunes juegan un papel importante en la patología de la enfermedad: v.gr., artritis, SLE, ITP, glomerulonefritis y vasculitis. Alternativamente, los compuestos de esta invención puede inhibir las acciones proinflamatorias de FNTa. En este caso, dichos compuestos pueden ser particularmente útiles para el tratamiento de enfermedades autoinmunes en donde la inhibición de la actividad biológica de FNTa es importante para la patología de la enfermedad: v.gr., artritis, artritis psoriática, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis alquilosante, síndrome de Sjógren, enfermedad de Still (síndrome de activación de macrófagos), uveitis, escleroderma, miositis, síndrome de Reiter y síndrome de Wegener. En una modalidad preferida of esta invención, estos compuestos pueden simular la acción de proteína A bacteriana facilitando así el aclaramiento de complejos inmunes e inhibir la actividad biológica y efecto subsecuente de FNTa. En cualquier caso, no se pretende que el alcance de la presente invención sea limitado por el mecanismo por el cual ocurre una mejora en cualquier condición inflamatoria indicativa de una enfermedad autoinmune. De hecho, una mejora en una condición autoinmune puede ocurrir mediante el uso de los compuestos de esta invención por un mecanismo poco definido o desconocido, pero dicha mejora siendo determinada por actividad in vivo desplegada en un modelo animal apropiado. Por lo tanto, el mecanismo(s) por el cual ocurre la eficacia del compuesto no es un aspecto importante ni limitante de esta invención. De manera importante, sin embargo, es el hecho de que los compuestos de esta invención exhibe toxicidad limitada de tal manera que se puedan administrar consecuentemente para el tratamiento de enfermedad autoinmune crónica. Los compuestos de la presente invención incluyen todos los derivados farmacéuticamente aceptables, tales como sales y formas de profármacos de los mismos, y análogos así como cualesquiera isómeros geométricos, o enantiómeros. Las formulaciones del compuesto activo se pueden preparar para proveer una composición farmacéutica en una forma adecuada para administración enteral, en la mucosa (incluyendo sublingual, pulmonar y rectal), parenteral (incluyendo intramuscular, intradérmica, subcutánea e intravenosa) o tópica (incluyendo pomadas, cremas o lociones). En particular, los compuestos de la presente invención se pueden solubilizar en un solvente de alcohol o poliol (v.gr., solutol US 15 (hidroxiestearato de polietilenglicol 660 de BASF), glicerol, etanol, etc.) o cualquier otro solvente biocompatibile tal como sulfóxído de dimetilo (DMSO) o cremofor EL (también de BASF). En donde es apropiado, la formulación puede ser convenientemente presentada en unidades de dosis discretas y se puede preparar por cualesquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de formulación farmacéutica. Todos los métodos incluyen el paso de juntar el ingrediente farmacéutico activo con vehículos líquidos o vehículos sólidos divididos o ambos según lo determinen las necesidades. Cuando es apropiado, las formulaciones antes descritas se pueden adaptar para proveer liberación sostenida del ingrediente farmacéutico activo. Las formulaciones de liberación sostenida bien conocidas para la técnica incluyen el uso de una inyección de bolo, infusión continua, polímeros biocompatibles o liposomas. Elecciones adecuadas en cantidades y tiempo de dosis, formulación y vías de administración se pueden hacer con el fin de lograr una respuesta favorable en el mamífero (es decir, eficacia), y evitar toxicidad indeseada u otro daño al mismo (es decir, seguridad). Por lo tanto, "efectivo" se refiere a dichas elecciones que implican manipulación de rutina de condiciones para lograr un efecto deseado: v.gr., reducir o de otra manera mitigar el daño al tejido asociado con una respuesta inmune a constituyentes del cuerpo (órganos y tejidos como glándulas suprarrenales, ojos, articulaciones, riñon, hígado, pulmón, páncreas, sistema nervioso, piel, tiroides, etc.); reanudar el estado ¡nmunológico o normalizar un trastorno/condición patológica del mamífero (título de anticuerpos, subconjuntos de células inmunes, señalización por citocinas o quimiocínas, complejos inmunes antígeno-anticuerpo, etc.); remoción de anticuerpos libres y/o complejos inmunes antígeno-anticuerpo de la circulación; indicios de laboratorio de enfermedad autoinmune (concentración o cantidad absoluta de mediadores de inflamación solubles, presencia de autoanticuerpos, proliferación celular, etc.); y combinaciones de los mismos. En particular, se pueden evitar efectos deletéreos de tratamiento de anti-FNTa convencional. La cantidad del compuesto administrado depende de factores tales como, por ejemplo, bioactividad y biodisponibilidad del compuesto (v.gr., vida media en el cuerpo, estabilidad y metabolismo); las propiedades químicas del compuesto (v.gr., peso molecular, carácter hidrofóbíco y solubilidad); vía y programa de administración; y similares. También se entenderá que el nivel de dosis específico por ser logrado para cualquier paciente particular puede depender de varios factores, incluyendo la edad, salud, historia médica, peso, combinación con uno o más de otros fármacos, y severidad de la enfermedad. El término "tratamiento" se refiere, entre otras cosas, a reducir o aliviar uno o más síntomas de enfermedad autoinmune en un mamífero (v.gr., humano) afectado por enfermedad o en riesgo de desarrollar la enfermedad.

Para un paciente dado, la mejora en un síntoma, su empeoramiento, regresión, o progresión se puede determinar por una medición objetiva o subjetiva. El tratamiento también puede implicar la combinación con otros modos de tratamiento y agentes (v.gr., fármacos antiinflamatorios, agentes que unen anticuerpo de tipo FNTa o receptor soluble, NSAIDs, corticosteroides, DMARDs) existentes. Por lo tanto, se pueden poner en práctica el tratamiento de combinación. En dichas modalidades, se prefiere que la toxicidad de tratamiento crónico o el agente adicional es por lo menos reducido o evitado al reducir la cantidad o concentración del agente adicional usado en comparación con el tratamiento sin un compuesto de la presente invención. Los expertos en la técnica apreciarán que la referencia aquí al tratamiento se extiende a profilaxis así como terapia de enfermedad autoinmune establecida o crónica. Se apreciará además que la cantidad de un compuesto de la invención requerido para tratamiento variará no sólo con el compuesto particular usado para tratamiento sino también con la vía de administración, la naturaleza de la condición autoinmune siendo tratada y la edad y salud general del paciente. La dosis que ha de ser administrada finalmente será a discreción del médico. En general, sin embargo, la dosis estará en el intervalo de aproximadamente 0.1 mg/kg a aproximadamente 200 mg/kg de peso corporal por día. Preferiblemente, variará de aproximadamente 1 mg/kg a aproximadamente 100 mg/kg de peso corporal por día. Muy preferiblemente, el intervalo será entre 2 mg/kg a 50 mg de peso corporal por día. Finalmente, y en donde es apropiado, los compuestos de la presente invención se pueden usar en combinación con otros tratamientos para enfermedad autoinmune bien conocida en la técnica. Otros tratamientos de la técnica anterior incluyen aquellos descritos anteriormente como se representa por fármacos antiinflamatorios no esteroideos (NSAIDs) (v.gr., ibuprofen, aspirina, naproxen, etodolac y ketoprofen); corticosteroides (v.gr., hidrocortisona, prednisona y dexametasona); fármacos anti-reumáticos modificadores de enfermedad (DMARDs) (v.gr., fármacos citotóxicos como metotrexato o azatioprina, inmunosupresores como ciclosporina o FK506, hidrocloroquina, sales de oro orgánico) y sustancias biológicas. Los componentes individuales de dichas combinaciones se pueden administrar ya sea secuencialmente o simultáneamente en formulaciones farmacéuticas separadas o combinadas. Alternativamente, se pueden crear nuevas formulaciones farmacéuticas para acomodar la combinación de los compuestos de esta invención con tratamientos convencionales para enfermedad autoinmune. Los compuestos de la presente invención también se pueden usar como agentes de afinidad para unirse a anticuerpo (v.gr., isotipos humanos com IgM, IgD, IgAl, lgA2, IgE, lgG1 , lgG2, lgG3, y/o lgG4) in vitro o ex vivo. El anticuerpo libre (es decir, no unido a antígeno) y/o complejo inmune anticuerpo-antígeno puede ser unido específicamente por dichos agentes de afinidad. Los complejos de afinidad grande se pueden aislar por precipitación selectiva o centrifugación diferencial, o identificar por pruebas de floculación. Pero se prefiere inmovilizar uno o más compuestos a un material de soporte insoluble (v.gr., agarosa, dextrano, celulosa, poliacrilamida, otros materiales poliméricos, sílice y vidrio) preferiblemente covalentemente enlazado directamente o indirectamente por un enlazador. Un compuesto de la presente invención se puede sintetizar in situ sobre el soporte o a través de un enlazador orgánico activado. Opcionalmente, el enlazador puede ser digerible (v.gr., por un agente reductor o proteasa específica del sitio) de tal manera que el compuesto (con o sin anticuerpo de unión) se puede desprender del soporte. Por ejemplo, uno o más compuestos de la presente invención pueden ser covalentemente enlazados a un soporte en forma de un portaobjetos, placa de pozos múltiples, fibra óptica, chip de proteína o tubo de ensayo para pruebas y análisis; caja de cultivo de tejidos para incubar células o antígeno; y esferas magnéticas, membrana porosa o medios cromatográficos para separación. Anticuerpos u otro material que contiene Fe se pueden unir a uno o más compuestos de la presente invención (es decir, aislamiento), y después separar opcionalmente del material no unido (con o sin lavado y rondas múltiples de unión bajo condiciones diferentes) para purificar material que contiene Fe. Por ejemplo, resistencia iónica (v.gr., concentración de sal) o pH pueden cambiar las condiciones de unión y usarse para liberar material que contiene Fe. Los anticuerpos libres y/o complejos inmunes se pueden aislar para diagnóstico de laboratorio clínico. La aféresis usando cromatografía de lecho estándar o fluidizado se puede usar para remover anticuerpo libre y/o complejos inmunes de la circulación: un fluido fisiológico (v.gr., sangre) se incuba con material de soporte insoluble sobre el cual se unen cual uno o más compuestos de la presente invención, por lo menos algún material de anticuerpo se une al compuesto(s) y se inmobiliza sobre el soporte, el anticuerpo de unión se separa del resto del fluido fisiológico, y por lo menos algunos de los componentes restantes (solubles) del fluido fisiológico es regresado al mamífero del cual se obtuvo. Es conveniente empacar el dispositivo que contiene uno o más compuestos de la invención para aféresis (v.gr., una columna) bajo condiciones asépticas y reemplazarlo después de usarlo. El anticuerpo se puede aislar de una composición y después opcionalmente separar a cualquier grado deseado de purificación. Una composición que contiene anticuerpo se incuba con material de soporte insoluble sobre el cual uno o más compuestos de la presente invención se unen, y por lo menos algún material de anticuerpo se une al compuesto(s) e inmobiliza sobre el soporte. El anticuerpo unido se puede separar del resto de la composición y ese resto es agotado del anticuerpo total o aquella fracción de anticuerpo que se une (v.gr., uno o más isotipos). El anticuerpo aislado sobre el soporte puede ser liberado al lavar o digerir el enlazador. Ya sea el anticuerpo enriquecido o los componentes de la composición agotada o ambos son el producto deseado. Es conveniente repetir la unión y lavado bajo condiciones de incubación diferentes para incrementar la eficiencia de aislamiento y separación.

Por lo tanto, en otra modalidad de la presente invención, un dispositivo o equipo se provee para usarse en los métodos anteriormente descritos. Por ejemplo, se puede usar para unir anticuerpo, para aislamiento de anticuerpo, para remover anticuerpo de una composición o la circulación, para separación de anticuerpo, y para purificar anticuerpo de un material de fuente u otra composición. El producto se puede empacar de manera aséptica bajo condiciones farmacéuticamente aceptables o almacenarse bajo condiciones estériles para el laboratorio clínico. Uno o más compuestos de la presente invención se unen a un material de soporte insoluble y se empacan en un dispositivo (v.gr., columna) o equipo con uno o más componentes opcionales: regulador de pH de almacenamiento, soluciones de unión y lavado, y un agente para separar los compuestos del soporte.

EJEMPLOS Los siguientes ejemplos ¡lustran además la práctica de esta invención pero no se pretende que sean limitantes de la misma. La secuencia de síntesis general para la preparación de los compuestos útiles en la presente invención se delinea en los esquemas I y II. El esquema I ilustra la vía de síntesis usada para los compuestos descritos en esta invención excepto aquellos compuestos que pertenecen al grupo 2. También, el esquema II demuestra el método de síntesis usado para compuestos descritos en esta invención excepto aquellos compuestos que pertenecen al grupo 1.

ESQUEMA 1 Método A Método B (R4) Ri, R?, R3 y R4 se definen como antes. Reactivos: (a) anilina u otra arilamina, NaHCO3 acuoso, acetona/H2O, 0°C; (b) 2-(4-hidroxifenil)etilamina u otra aralquiloamina, NaHCO3 acuoso, HF/acetona/H2O, temperatura ambiente; (c) etilendiamina, DBEA, THF, 60°C; (d) etilendiamina, NaHCO3 acuoso, THF/acetona/H2O, temperatura ambiente; (e) 2-(4-h¡drox¡fenil)etilamina o derivados de 2-(4-hidroxifenil)etilamina, Et3N, THF, 60°C.

ESQUEMA 2 Método A R1, R2, R3, R4 y X se definen como antes. Reactivos: (a) anilina u otra arilamina, NaHCO3 acuoso, acetona/H2O, 0°C; (b) etanolamina u otra alcanolamina, o alquilodiamina, NaHCO3 acuoso, TBF/acetona/H2O, temperatura ambiente; (C) H2N— THF/acetona/ H20, temperatura ambiente o NaHH?F; (c) R3 NH2 • ^ gN, THF, 50 °C.

Método B (síntesis de fase sólida): n = 2-6, X se define como antes. Reactivos: (a) 1 ) amina, DCE, RT, 17.5 hr, 400 rpm; 2) metanol, DFEA, temperatura ambiente, 1 hr, 400 rpm; (b) cloruro cianúrico, DIEA, THF, temperatura ambiente, 30 min, 400 rpm; (c) 1 ) para aminas alifáticas: amina, DIEA, NMP, temperatura ambiente, 20 hr, 400 rpm; 2) para aminas aromáticas: amina, DIEA, NMP, 50°C, 24 hr, 400 rpm; (d) amina, DIEA, NMP, 80°C, 20 hr, 400 rpm; (e) 5% ácido trifluoroacético/dicloroetano, temperatura ambiente, 1 hr, 400 rpm.

Instrumentación: Todos los cromatogramas de CLAR y espectros de masa se registraron en un instrumento HP 1100 LC-MS usando un detector de disposición de diodo. Una columna de C18 analítica (250 x 4.6 mm, 5 mieras) con un gradiente de 10-70% de acetonitrilo-agua que contenía 0.01 % de TFA en 10 min y un flujo de 1 ml/min (método 1) o una columna de C18 analítica (75 x 4.6 mm, 5 mieras) con un gradiente de 10 a 99% de acetonitrilo-agua que contiene 0.01 % de TFA en 10 min y un flujo de 1 ml/min (método 2) o una columna de C18 analítica (75 x 4.6 mm, 5 mieras) con un gradiente de 15-99% de acetonitrilo-agua que contiene 0.01 % de TFA en 6 min y un flujo de 2 ml/min (método 3) o una columna de C18 analítica (75 x 4. 6 mm, 5 mieras) con un gradiente de 10-40% de acetonitrilo-agua que contiene 0.01 % de TFA en 6 min y un flujo de 2 ml/min (método 4) o una columna de C18 analítica (75 x 4.6 mm, 5 mieras) con un gradiente de 1-20% de acetonitrilo-agua que contiene 0.01% de TFA en 6 min y un flujo de 2 ml/min (método 5).

EJEMPLO 1 (Ejemplo representativo del esquema l método A): Síntesis del compuesto 1 ambiente 1 A una suspensión de cloruro cianúrico (20 g, 108 mmoles) en acetona (120 ml) y hielo (50 ml) a 0°C se añadió gota a gota una solución de anilina (10 g, 107 mmoles) en acetona (45 ml). Al final de la adición, el pH de la solución Se ajustó de 1 a 7 con bicarbonato de sodio acuoso al 5% (150 ml). El precipitado se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó bajo vacío. Esto dio 2,4-dicloro-6-fenilamino-1 ,3,5-triazina como un sólido blanquecino (24.3 g, rendimiento de 93%). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución de la diclorotriazina (6.2 g, 25.7 mmoles) en THF (300 ml) a temperatura ambiente se añadió una solución de 2-(4-hidroxifenil)etilamina (3.6 g, 25.9 mmoles) en acetona (100 ml) y agua (100 ml), seguido por bicarbonato de sodio acuoso al 5% (50 ml). Después de 20 hr de reacción a temperatura ambiente, la solución se diluyó con agua (50 ml) y acetato de etilo (50 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera (150 ml), se secaron sobre sulfato de sodio anhidro, se filtraron y se evaporaron a sequedad. Esto dio 2-cloro-4-(2-[4-hidroxifenil]etilamino)-6-fenilamino-1 ,3,5-triazina como un sólido blanquecino (8.5 g, rendimiento de 97%). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. Este derivado de triazina (384 mg, 1.1 mmoles) se disolvió en THF (11 ml) a temperatura ambiente. A esta solución se añadió etilendiamina (68 µl, 1.0 mmoles) seguido por diisopropiletilamina (355 µl, 2.0 mmoles). Después de 20 hr a 50°C, la solución se diluyó con metanol (10 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 25S (sílice, hexano/AcOEt 9:1 a 0:1 ) para dar el compuesto 1 como un sólido blanco. Rendimiento del producto: 267 mg (78%); 1H RMN (300 MHz, CD3OD) d 7.63 (m, 4H), 7.21 (t, 4H, J = 7.6 Hz), 6.98 (m, 6H), 6.68 (d, 4H, J = 7.9 Hz), 3.48 (m, 8H), 2.84 (m, 4H); LRMS (FAB+): m/z 672.0 (MH+); HRMS: calculado para MH+ C36H39N12O2, 671.33191; encontrado 671.33060; CLAR (método 1 ): 8.0 min.

EJEMPLO 2 (Un ejemplo representativo del esquema II método A): Síntesis del compuesto 17 A una solución de 2,4-dicloro-6-aminofenil-1 ,3,5-triazina (1.6 g, 6.6 mmoles) en THF (70 ml) a temperatura ambiente se añadió una solución de etanolamina (439 mg, 7.3 mmoles) en acetona (24 ml) y agua (24 ml), seguido por bicarbonato de sodio acuoso al 5% (15 ml). La reacción se agitó durante 20 hr a temperatura ambiente. La mezcla se diluyó después con agua (25 ml) y acetato de etilo (25 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 25 ml). La capa orgánica se lavó con salmuera (50 ml), se secó sobre sulfato de sodio anhidro, se filtró y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 40S (sílice, hexano/AcOEt. 9:1 a 0:1) para dar 2-cloro-4-(2-hidroxietilamino)-6-aminofenil-1 ,3,5-triazina como un sólido blanco (1.6 g, rendimiento de 91 %). Este compuesto (710 mg, 2.7 mmoles) se disolvió en THF (26 ml) y 2-(4-aminofenil)etilamina (1.1 ml, 8.0 mmoles) se añadió seguido por trietilamina (1.1 ml, 8.0 mmoles). La reacción se agitó durante 20 hr a 60°C y después se diluyó con metanol (20 ml). El solvente se removió bajo presión reducida y el residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 40S (sílice, AcOEt/MeOH 1 :0 a 9:1 ) para dar 2-[2-(4-aminofenil)etilamino]-4-(2-hidroxietilamino)-6-fenilamino-1 ,3,5-triazina como un sólido blanquecino (916 mg, rendimiento de 91%). A una solución de 2,4-dicloro-6-aminofenil-1 ,3,5-triazina (356 mg, 1.5 mmoles) en THF (30 ml)/acetona (11 ml)/agua (11 ml) se añadió una solución del derivado de 1 ,3,5-triazina anterior (540 mg, 1.5 mmoles) en THF (14 mi) seguido por solución de bicarbonato de sodio al 5% (10 mi). La reacción se agitó durante 20 hr a temperatura ambiente y la solución se diluyó con agua (30 ml) y acetato de etilo (30 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (30 ml). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera (40 ml), se secaron sobre sulfato de sodio anhidro and se filtraron. Esto dio 2-{4-[2-(4-{4-cloro-6-fenilamino-[1 ,3,5]triazin-2-ilamino}-fenil)-etilamino]-6-fenilamino- [1 ,3,5]triazin-2-ilamino}-etanol como un sólido blanquecino (860 mg, rendimiento cuantitativo). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución de este compuesto (41 mg, 0.1 mmoles) en THF (1 ml) se añadió 2-(4-aminofenil)etilamina (28 µl, 0.2 mmoles) seguido por trietilamina (30 µl, 0.2 mmoles). Después de 20 hr de reacción a 50°C, la solución se diluyó con metanol (5 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 12M (sílice, AcOEt/MeOH 1 :0 a 9:1) para dar el compuesto 17 como un sólido blanco. Rendimiento del producto: 30 mg (79%); 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.63-7.39 (m, 6H), 7.14 (m, 4H), 7.04 (d, 2H, J = 8.6 Hz), 6.86 (m, 4H), 6.56 (d, 2H, J = 7.8 Hz), 3.59 (m, 2H), 3.43 (m, 6H), 2.75 (m, 2H), 2.66 (t, 2H, J = 7.5 Hz); LRMS (ESI): m/z 670.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.3 min.

EJEMPLO 3 sólida del compuesto 16 Reactivos: (a) 1 ) 1 ,4-diaminobutano, diclorometano, 17.5 h, 400 rpm; 2) MeOH, DIEA, 25°C, 1 hr, 400 rpm; (b) cloruro cianúrico, DIEA, THF, 25°C, 30 min., 400 rpm; (c) anilina, DIEA, NMP, 50°C, 24 hr, 400 rpm; (d) 2-(4-aminofenil)etilamina, NMP, 80°C, 20 hr, 400 rpm; (e) 2-(4-hidroxifenil) etilamina, DIEA, NMP, 80°C, 20 hr, 400 rpm; (f) ácido trifluoroacético al 5%/dicloroetano, 25°C, 1 hr, 400 rpm.

Instrumentación La síntesis de fase sólida se llevó a cabo en minibloques Bohdan. Estaban en juegos de dos, que poseían cuarenta y ocho tubos de reacción de polipropileno. Cada tubo tenía una frita en el fondo para filtración del soporte sólido. Un tornillo que actúa como válvula permite (o no) el fluido de líquidos. Un bloque de transferencia de calor que rodeaba todos los tubos se añadió para proveer el calentamiento apropiado de las reacciones. Los bloques de transferencia de calor se acoplaron a un circulador de calentamiento refrigerado Julabo FP 40. Los tubos se cubrieron con una lámina de Teflón, septos de hule y se cerraron con la parte superior del bloque que contiene grapas para mantenerlos herméticamente cerrados. Los bloques se agitaron en un agitador Innova modificado de New Brunswick Scientific. Para evaporación, se usó un Genevac HT-4II.

Unión de 1 ,4-diaminobutano a la resina 2-clorotritilo para síntesis de fase sólida En un vial (4.0 ml) se colocó resina (53.0 mg, 1.9 mmoles) seguido por diclorometano (1.5 ml) y THF (0.5 ml). Esta mezcla se homogeneizó mediante el uso de una pipeta automática. De esta mezcla, 2.0 ml se colocaron en el pozo en un bloque. Al abrir la válvula, la resina se filtró del solvente. Después se añadió diclorometano (1.0 ml) para lavar la resina en cada pozo. La válvula se cerró y 1 ,4-diaminobutano (41 mg, 0.47 mmoles) en diclorometano (2.0 ml) se añadió y el bloque se tapó se tapó y se colocó en el agitador durante 17.5 hr a temperatura ambiente y 400 rpm. Los bloques se colocaron después en el aparato de recolección de vacío, y la resina se filtró al abrir la válvula. La resina se lavó con NMP (2x), metanol (2x), agua (3x), metanol (2x), diclorometano (2x) y THF (1x) respectivamente.

Primera adición de cloruro cianúrico La válvula se cerró y 1.0 ml de una solución de DIEA (68 µl, 0.5 mmoles) en THF (1 ml) se surtió después en el pozo. A esta mezcla se añadió 1 ml de una solución de cloruro cianúrico (87 mg, 0.5 mmoles) en THF (1.0 ml). Los bloques se taparon con una lámina de Teflon y se colocó un septo de hule en el agitador y se agitó durante 30 min a temperatura ambiente, 400 rpm. El bloque se removió del agitador y se colocó en un aparato de recolección de vacío. La válvula se abrió después para filtrar la resina. THF (1.0 mi) se añadió para lavar la mezcla. La válvula se cerró y se añadió más THF (1.0 ml). El bloque se colocó en un agitador durante 5 min y la válvula se abrió para filtrar la resina. Después de tres lavados con THF, un último lavado con NMP se llevó a cabo para la siguiente reacción.

Adición de anilina a dicloro-1 ,3,5-triazina Una solución de DIEA (82 µl, 0.5 mmoles) en NMP (1.0 ml) se preparó y se colocó en el pozo con la válvula cerrada. A esta mezcla se añadió una solución de anilina (43 µl, 0.5 mmoles) en NMP (1.0 ml). 1.0 ml de esta solución se distribuyó en cada pozo. Los bloques se colocaron en el agitador y se agitaron durante 17.5 hr a 50°C a 400 rpm. Los bloques se enfriaron a 25°C y se removieron del agitador. La resina se filtró después y se lavó con NMP (5x) usando el mismo procedimiento descrito anteriormente.

Adición del enlazador al monocloro-1 ,3,5-triazina Una solución de DIEA (82 µl, 0.5 mmoles) en NMP (1.0 ml) se preparó y se colocó en el pozo con la válvula cerrada. 2-(4-aminofenil) etilamina (52 µl, 0.4 mmoles) se colocó en un vial (4.0 ml) y se añadió NMP (1.0 ml) para dar una solución. Los bloques se colocaron en el agitador y se agitaron durante 18.5 hr a 80°C a 400 rpm. Después de 18 hr, los bloques se enfriaron a 25°C y se removieron del agitador. La resinas se filtraron y se lavaron con NMP (5x), diclorometano (1x), metanol (1x), diclorometano (1x), metanol (1x) y diclorometano (1x) de conformidad con el mismo procedimiento que el descrio antes. Mediante el cierre de la válvula, los bloques estuvieron listos para el siguiente paso.

Segunda adición de cloruro cianúrico El mismo procedimiento que antes.

Segunda adición de anilina a dicloro-1 ,3,5-triazina Una solución de DIEA (82 µl, 0.5 mmoles) en NMP (1.0 ml) se preparó y se colocó en el pozo con la válvula cerrada. Anilina (43 µl, 0.5 mmoles) se colocó en un vial (4.0 ml) y se añadió NMP (1.0 ml). La solución de anilina se surtió en el pozo. Los bloques se colocaron en el agitador y se agitaron durante 19 hr a 50°C, a 400 rpm. Los bloques se enfriaron después a 25°C, se removieron del agitador y se trataron de conformidad con el mismo procedimiento que el descrito previamente. La resina se filtró y se lavó con NMP (5x). Mediante el cierre de la válvula, los bloques estuvieron listos para el siguiente paso.

Segunda adición de 2-(4-hidroxifenil)etilamina a monocloro-1 ,3,5-triazina Una solución de DIEA (82 µl, 0.5 mmoles) en NMP (1.0 ml) se preparó y se colocó en el pozo con la válvula cerrada. 2-(4-hidroxifenil)etilamina (65 mg, 0.5 mmoles) se colocó en el vial (4 ml) y se añadió NMP (1.0 ml) para dar una solución. La solución de 2-(4-hidroxifenil) etilamina (1 ml) se distribuyó en el pozo y el bloque se colocó en el agitador y se agitó durante 23 hr a 80°C a 400 rpm. El bloque se enfrió a 25°C, se removió del agitador y se trató de conformidad con el mismo procedimiento que el descrito previamente. La resina se filtró y se lavó con NMP (5x), diclorometano (1x), metanol (1x), diclorometano (1x), metanol (1x) y diclorometano (1x) respectivamente. Mediante el cierre de la válvula, los bloques estuvieron listos para el siguiente paso.

Digestión de la resina Una solución de ácido trifluoroacético al 5% en dicloroatano se preparó y se añadieron 2 ml al pozo. Los bloques se taparon, se colocaron en el agitador y se agitaron durante 1 hr a temperatura ambiente a 400 rpm. Después, los bloques se colocaron en el aparato de base de recolección de vacío. La resina se filtró en una placa #1 de 96 pozos profundos, limpia. Una nueva placa #2 de 96 pozos profundos limpia se colocó en aparato de recolección de vacío. Dicloroetano (1.0 ml) se añadió después en el pozo, la válvula se cerró y se añadió metanol (1.0 ml). Los bloques se agitaron en el agitador durante 5 min, y se filtraron en la placa #2 de pozos profundos. Una nueva placa #3 de 96 pozos produnfos limpia se colocó en el aparato de recolección de vacío, y se añadió metanol (1.0 ml) al pozo. Las placas de 96 pozos profundos (1 y 2) se evaporaron después en un aparato Genevac. La placa #1 se analizó por LC/MS. Las placas se combinaron y se colocaron en el aparato Genevac y se evaporaron nuevamente. Las placas se colocaron en la CLAR/Gilson para purificación. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.64-6.67 (m, 18H), 3.65 (m, 4H), 3.48 (m, 2H), 2.99-2.79 (m, 6H), 1.72 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 698.2 (MH+), 720.2 (M+Na); CLAR (método 2): 4.4 min.

EJEMPLO 4 Síntesis del compuesto 2 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con antranilato de metilo y 2-(4-hidroxifenil)etilamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.82-6.69 (m, 16H), 3.86 (s, 6H), 3.63-3.49 (m, 8H), 2.73 (s, 4H); LRMS (ESI): m/z 787.2 (MH+); CLAR (método 1): 8.2 min.

EJEMPLO 5 Síntesis del compuesto 3 El compuesto anterior se preparó mediante modificación del procedimiento en el ejemplo 1. A una suspensión de cloruro cianúrico (4 g, 21.7 mmoles) en acetona (25 ml) y hielo (10 ml) a 0°C se añadió gota a gota una solución de 2-(4-hidroxifenil)etilamina (2.9 g, 21.5 mmoles) en THF (15 ml), acetona (10 ml) y agua (10 ml). Después del final de la adición, el pH de la solución se llevó de 3 a 7 con una solución al 5% de bicarbonato de sodio (40 ml). Después de 2 hr de reacción a 0°C, la solución se diluyó con agua (10 ml) y acetato de etilo (20 ml). Las dos capas se separaron y la capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (25 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (25 ml), se secaron sobre sulfato de magnesio, se filtraron y se evaporaron a sequedad para dar sólido amarillo claro (5.3 g, 86%). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución de esta diclorotriazina (1.21 g, 4.2 mmoles) en acetona (25 ml) a temperatura ambiente se añadió una solución de amoniaco 0.5 M en dioxano (25 ml, 12.7 mmoles) y la solución se agitó después a 50°C en un tubo sellado durante 60 hr. La solución se concentró después bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó primero en una columna Biotage™ 40M (sílice, hexano/AcOEt 9:1 a 0:1 ) y después CLAR semi-preparativa (columna C18 tapada en los dos extremos, 250 x 10 mm, 5 mieras, H2O/CH3CN que contenía ácido trifluoroacético al 0.05% 7:3 a 1 :9 durante 20 min) para dar la clorotriazina como un sólido blanco (70 mg, 6%). A una suspensión de cloruro cianúrico (3 g, 16.3 mmoles) en acetona (30 ml) y hielo (15 ml) a 0°C se añadió gota a gota una solución de antranilato de metilo (2.46 g, 16.3 mmoles) en acetona (10 ml). Al final de la adición, el pH de la solución se llevó de 1 a 8.5 con una solución al 5% de bicarbonato de sodio. Después de 20 hr de reacción a temperatura ambiente, el precipitado se filtró, se lavó varias veces con agua y se secó bajo vacío para dar un sólido blanquecino (4.51 g, 93%). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución de esta diclorotriazina (2.0 g, 6.7 mmoles) en THF (55 ml) a temperatura ambiente se añadió una solución de 2-(4-hidroxifenil)etilamina (918 mg, 6.7 mmoles) en acetona (5 ml) y agua (2 ml), seguido por una solución al 5% de bicarbonato de sodio. Después de 5 hr de reacción a 50°C, la solución se diluyó con agua y acetato de etilo. La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (3 x 20 ml). Las capas orgánicas se lavaron con salmuera (20 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron. Se obtuvo un sólido blanquecino (2.45 g, 92%). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución de esta clorotriazina (350 mg, 0.9 mmoles) en THF (9 ml) a temperatura ambiente se añadió etilendiamina (584 µl, 8.7 mmoles), seguido por trietilamina (1.22 µl, 8.7 mmoles). Después de 20 hr de reacción a 55°C, la solución se diluyó con metanol (10 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 25S (sílice, hexano/AcOEt 1 :1 a AcOEt/MeOH 3:7) para dar la amina primaria como un sólido blanco (227 mg, 62%). A una solución de esta amina (37 mg, 87 µmoles) en THF (1.5 ml) se añadió una solución de 2-amino-4-cloro-6-[2-(4-hidroxifenil) etilamino]-1 ,3,5-triazina (30 mg, 79 µmoles) en THF (1.5 ml), seguido por diisopropiletilamina (50 µl, 280 µmoles). Después de 48 hr de reacción a 50°C, la solución se diluyó con metanol (10 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó primero en una columna Biotage™ 12M (sílice, hexano/AcOEt 8:2 a AcOBt/MeOH 9:1 ) y después en CLAR semi-preparativa (columna C18 tapada en los dos extremos, 250 x 10 µm, 5 mieras, H2O/CH3CN que contenía ácido trifluoroacético al 0.05% 7:3 a 1 :9 durante 20 min) para dar el compuesto 3 como un sólido blanco. Rendimiento del producto: 17 mg, 33%; 1H RMN (300 MHz, CD3OD) d 8.60-6.55 (m, 12H), 3.90 (s, 3H), 3.70-3.39 (m, 8H), 2.78-2.66 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 653.2 (MH+); CLAR (método 1 ): 4.68 min.

EJEMPLO 6 Síntesis del compuesto 4 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con anilina y A/-1-fer-butiloxicarbonil-2-(4-aminofenil)etilamina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo usando una mezcla de HCI/dioxano a temperatura ambiente durante 3 hr. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.59-7.21 (m, 16H), 3.74-3.69 (m, 4H), 3.25-2.94 (m, 8H); LRMS (ESI): m/z 669.4 (MH+); CLAR (método 2): 4.2 min.

EJEMPLO 7 Síntesis del compuesto 5 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con o-toluidina y 2-(4-hidroxifenil)etilamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.11 (m, 2H), 7.02 (m, 4H), 6.97 (m, 6H), 6.66 (d, J = 7 Hz, 4H), 3.47 (m, 8H), 2.70 (m, 4H), 2.24 (s, 6H); LRMS (ESI): m/z 699 (MH+), 721 (M+Na); CLAR (método 2): 4.8 min.

EJEMPLO 8 Síntesis del compuesto 6 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con anilina y 4-aminobencilamina. Sólido rosa claro; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.72-6.61 (m, 18H), 4.39. (s, 4H), 3.55 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 663.2 (M+Na); CLAR (método 2): 3.6 min.

EJEMPLO 9 Síntesis del compuesto 7 El compuesto anterior se preparó mediante modificación del procedimiento del ejemplo 1. A una suspensión de 1 ,3-fenílendiamina (8.2 g; 75.3 mmoles) en CH2CI2 (21 ml) a 25°C se añadió gota a gota durante 1 hr una solución de carbonato de di-fer-butilo (2.7 g, 12.6 mmoles) en CH2CI2 (130 ml). La solución se agitó después a temperatura ambiente durante la noche. Después de 18 hr de reacción, la solución se evaporó a sequedad bajo presión reducida. El aceite residual se disolvió en acetato de etilo (50 mi) y se lavó con una solución de carbonato de sodio 2N (50 ml). La capa acuosa se extrajo con acetato de etilo (2 x 50 ml). Las capas orgánicas combinadas se lavaron con salmuera (50 ml), se secaron sobre sulfato de sodio, se filtraron y se evaporaron a sequedad. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 40S (sílice, hexano/AcOEt 95:5 a 1 :1) para dar ?/-1-ter-butiloxicarbonil-1 ,3-fen¡Iendiamina como un sólido blanquecino (2.4 g. 93%). A una suspensión de cloruro cianúrico (2.2 g, 11.7 mmoles) en acetona (15 ml) y hielo (6 ml) a 0°C se añadió gota a gota durante 15 min, una solución de ?/-1 -fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina (2.4 g, 11.6 mmoles) en acetona (7 ml). Al final de la adición el pH de la solución se ajustó de 1 a 7 con una solución al 5% de bicarbonato de sodio (25 ml). El precipitado blanco se filtró y se lavó completamente con agua antes de secarse bajo alto vacío. Esto dio 2,4-dicloro-6-(3-? -fer-butilox¡carbonilaminofenil)amino-1 ,3,5-triazina pura como un sólido blanquecino (4.1 g, 99%). El producto se usó en el siguiente paso sin purificación adicional. A una solución de este compuesto (400 mg, 1.12 mmoles) en THF (5 ml) a temperatura ambiente se añadió etilendiamina (38 µl, 0.562 mmoles) seguido por diisopropiletilamina (345 µl, 1.97 mmoles). Después de 20 hr a 25°C, la solución se diluyó con metanol (5 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 25M (sílice, hexano/AcOEt 8:2 a 4:6) para dar N,N'-etilend¡amina di (4-cloro-6-(3-?/-1-íer-butiloxicarbonilaminofenil)-amino-1 ,3,5-triazina como un sólido blanco (314 mg, 80%). Este compuesto (85 mg, 0.1 mmoles) se disolvió en THF (3 ml) a temperatura ambiente y se añadió a una solución de 2-(4-aminofenil)etilamina (100 mg, 0.7 mmoles) en THF (1 ml) seguido por trietilamina (102 µl, 0.7 mmoles). Después de 20 hr t 60°C, la solución se diluyó con metanol (2 ml) y se concentró bajo presión reducida. El residuo crudo se purificó en una columna Biotage™ 25S (sílice, hexano/EtOAc 8:2 a 2:8) para dar N.N'-etilendiamina di[4-(2-[4-am¡nofenil]etilamino)-6-(3-?/-ter-butilox¡carbonilaminofenil)amino-1 ,3,5-triazina como un sólido blanco (97 mg, 89%). A una solución de este material (97 mg, 0.1 mmoles) en CH2CI2 (1.5 ml) a temperatura ambiente se añadió una solución de HCl 4N en dioxano (1.5 ml). Después de 3 hr a 25°C, la solución se diluyó con 1 ,2-dicloroatano (10 ml), se concentró bajo presión reducida y se secó durante 20 hr bajo alto vacío. Sólido amarillo (74 mg, cuantitativo); 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.10-7.10 (m, 16H), 3.80-3.60 (m, 8H), 2.99 (m, 4H); LRMS (ESI): 699.2 (MH+); CLAR (método 2): 2.8 min.

EJEMPLO 10 Síntesis del compuesto 8 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con 2-(4-hidroxifenil)etilamina y éster metílico de L-tirosina. Sólido rosa claro; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.54-6.65 (m, 18H), 4.75 (m, 2H), 3.75-3.40 (m, 14H), 3.18-2.86 (m, 8H); LRMS (ESI): m/z 921.2 (MH+); CLAR (método 2): 5.1 min.

EJEMPL0 11 Síntesis del compuesto 9 El compuesto anterior se preparó por saponificación del compuesto 2 usando exceso de hidróxido de litio en una mezcla de metanol/agua (4:1) a 50°C durante la noche. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 9.00-6.50 (m, 16H), 3.70-3.45 (m, 8H), 2.90-2.75 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 759.20 (MH+); CLAR (método 2): 7.1 min.

EJEMPLO 12 Síntesis del compuesto 10 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con éster metílico de (R)-2-fenilglicina y 2-(4-hidroxifenil)etilamina. La saponificación se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 11. Sólido blanco; 1H RMN (300 MHz, CD3OD) d 7.48-7.32 (m, 10H), 7.05-6.89 (m, 4H), 6.70 (m, 4H), 5.45 (m, 2H), 3.53 (m, 8H), 2.66 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 787.2 (MH+), 785.2 (M-H); CLAR (método 1 ): 6.5 min.

EJEMPL0 13 Síntesis del compuesto 11a El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que se reemplazó anilina por fenol, bicarbonato de sodio por hidruro de sodio y diisopropilamina por carbonato de sodio. Sólido blanco; H RMN (300 MHz, CD3OD) d 7.45-6.95 (m, 12H), 6.80-6.61 (m, 6H), 3.48 (m, 8H), 2.72 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 673.2 (MH+); CLAR (método 1): 8.4 min.

EJEMPLO 14 Síntesis del compuesto 11b El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 empezando con tiofenol y 2-(4-hidroxifenil)etilamina. Sólido anaranjado pálido; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.10-7.64 (m, 10H), 6.40-7.00 (m, 8H), 2.92-3.50 (m, 8H), 2.29-2.70 (m, 10H). LRMS (ESI): m/z 705 (MH+), 727 (M+Na); CLAR (método 2): 7.9 min.

EJEMPLO 15 Síntesis del compuesto 12 El compuesto anterior se preparó mediante acoplamiento del compuesto 1 y clorhidrato de ácido 4-(dimetilamino) butírico usando un exceso de yoduro de 2-cloropiridinio y trietilamina en DMF a temperatura ambiente durante la noche. El compuesto se purificó en una CLAR semi-preparativa (columna C18 tapada en los dos extremos, 250 x 10 µm, 5 mieras, H2O/CH3CN que contenía ácido trifluoroacético al 0.05% 4:2 a 3:2 durante 25 min). Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.52-7.04 (m, 18H), 3.70-3.39 (m, 12H), 3.00-2.75 (m, 8H), 2.92 (s, 9H), 2.85 (s, 3H), 2.11 (m, 4H); 19F RMN (400 MHz, CD3OD) d -77.5; 19F RMN cuantitativo (400 MHz, CD3OD, inserto coaxial de trifluorotolueno): 8 TFA; LRMS (ESI): m/z 897 (MH+), 919 (M+Na); CLAR (método 2): 3.8 min.

EJEMPLO 16 Síntesis del compuesto 13 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que 2-(4-hidroxifenil)etilamina se añadió primero a la 2,4-dicloro-6-fenilamino-1 ,3,5-triazina seguido por la adición del enlazador 2-(4-hidroxifenil)etilamina usando hidruro de sodio en lugar de bicarbonato de sodio. La cadena lateral de etanolamina fue reemplazada por N-1-fer-butiloxicarboniletilendiamina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo con ácido trifluoroacético al 5% en diclorometano (0°C). Polvo blanco; 1H RMN (300 MHz, CD3OD) d 7.59 (m, 6H), 7.21 (m, 8H), 7.05 (d, 1 H, J = 8 Hz), 6.91 (d, 1 H, J = 8Hz), 6.71 (d, 1 H, J = 8 Hz), 6.67 (d, 1 H, J = 8 Hz), 3.72 (m, 4H), 3.59 (t, 1 H, J = 8 Hz), 3.39 (m, 1 H), 3.22 (m, 2H), 2.97 (m, 2H), 2.80 (t, 1 H, J = 7 Hz), 2.70 (t, 1 H, J = 7 Hz); 19F RMN (300 MHz, CD3OD): d -74.8; 19F RMN cuantitativo (300 MHz, CD3OD, inserto coaxial de tifluorotolueno): 3 TFA; LRMS (ESI): m/z 671 (MH+), 654 (M-NH2); CLAR (método 2): 4.5 min.

EJEMPL0 17 Síntesis del compuesto 14 El compuesto anterior se preparó haciendo reaccionar el compuesto 13 con clorhidrato de 1-H-pirazol-1-carboxamidina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 16. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.56 (m, 4H), 7.37 (m, 4H), 7.21 (m, 6H), 7.03 (d, 1 H, J = 8 Hz), 6.90 (d, 1 H, J = 8 Hz), 6.70 (d, 1H, J = 8 Hz), 6.65 (d, 1 H, J = 8Hz), 3.65 (m, 6H), 3.45 (m, 2H), 2.97 (m, 2H), 2.80 (t, 1 H, J = 8Hz), 2.68 (t, 1 H, J = 8Hz); 19F RMN (400 MHz, CD3OD): d -77.8; 19F RMN cuantitativo (400 MHz, CD3OD, inserto coaxial de trifluorotolueno): 2 TFA; LRMS (ESI): m/z 713 (MH+), 696 (M-NH2); CLAR (método 2): 4.8 min.

EJEMPLO 18 Síntesis del compuesto 15 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que 2-(4-aminofenil)etilamina se añadió primero a la 2,4-dicloro-6-fenilamino-1 ,3,5-triazina seguido por la adición de la cadena lateral ?/-1-acetiletilendiamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.77-7.49 (m, 6H), 7.24 (t, 4H, J = 7.9 Hz), 7.12 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 7.04 (d, 2H, 7= 8.4 Hz), 6.96 (m, 2H), 6.70 (d, 2H, J = 8.4 Hz), 3.66-3.46 (m, 8H), 2.88-2.72 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 712.2 (MH+); CLAR (método 2): 5.0 min.

EJEMPLO 19 Síntesis del compuesto 18 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que 2-(4-hidroxifenil)etilamina se añadió primero a la 2,4-dicloro-6-fenilamino-1 ,3,5-triazina seguido por 2-(4-aminofenil)etilamino. La sustitución final en el anillo de triazina se logró usando ? -ter-butiloxicarbonilpiperazina y la remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 16. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.58 (m, 6H), 7.39-6.95 (m, 10H), 6.69 (m, 2H), 4.08 (m, 4H), 3.74-3.52 (m, 4H), 2.96-2.75 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 696.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.7 min.

EJEMPLO 20 Síntesis del compuesto 19a El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que la anilina fue reemplazada por ?/-1 -ter-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 9. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.05-7.11 (m, 16H), 3.94-3.48 (m, 8H), 3.00 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 700.2 (MH+); CLAR (método 2): 3.2 min.

EJEMPLO 21 Síntesis del compuesto 19b El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que la anilina fue reemplazada por ?/-1-fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y etanolamina por 1 ,2-diaminoetano. La remoción del grupo Boc como se describió en el ejemplo 9. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.00-7.60 (m, 16H), 3.40-3.70 (m, H), 3.00-3.20 (m, 2H), 2.70-2.90 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 700 (MH+); CLAR (método 3): 1.3 min.

EJEMPLO 22 Síntesis del compuesto 20 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 empezando con anilina y etanolamina. 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazada por 2-(4-hidroxifenil)etilamina. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.61 (m, 6H), 7.25 (m, 4H), 7.14 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 7.07 (d, 2H, J = 8.5 Hz), 6.98 (m, 2H), 6.70 (m, 2H), 3.69 (m, 2H), 3.55 (m, 6H), 2.83 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 671.2 (MH+); CLAR (método 2): 5.1 min.

EJEMPLO 23 Síntesis del compuesto 21 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 16. La cadena lateral de etilendiamina fue reemplazada por etanolamina. Sólido blanco; 1H RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.58-6.61 (m, 18H), 4.51 (m, 2H), 3.84 (m, 2H), 3.63 (m, 4H), 2.82 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 673.2 (MH+), 695.2 (M+Na); CLAR (método 2): 9.7 min.

EJEMPLO 24 Síntesis del compuesto 22 El compuesto anterior se preparó usando el procedimiento de fase sólida descrito en el ejemplo 3 empezando con etilendiamina y 2-metoxianilina. LRMS (ESI): m/z 701.2 (MH+), 722.4 (M+Na); CLAR (método 2): 4.2 min.

EJEMPLO 25 Síntesis del compuesto 23 El compuesto anterior se preparó usando el procedimiento de fase sólida descrito en el ejemplo 3 empezando con 1,4-diaminobutano y 2-metoxianilina. LRMS (ESI): m/z 729.2 (MH+), 751.2 (M+Na); CLAR (método 2): 4.9 min.

EJEMPLO 26 Síntesis del compuesto 24 El compuesto anterior se preparó usando el procedimiento de fase sólida descrito en el ejemplo 3 empezando con 1 ,3-diaminopropano y anilina. LRMS (ESI): m/z 684.4 (MH+), 706.2 (M+Na); CLAR (método 2): 4.4 min.

EJEMPLO 27 Síntesis del compuesto 25 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que el enlazador de etilendiamina fue reemplazado por 1 ,3-diaminopropano. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.72-7.48 (m, 4H), 7.20 (m, 4H), 7.08 (m, 6H), 6.66 (m, 4H), 3.46 (m, 8H), 2.71 (m, 4H), 1.74 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 685.2 (MH+); CLAR (método 2): 6.0 min.

EJEMPLO 28 Síntesis del compuesto 26 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazado por etanolamina y el enlazador de etilendiamina con 4-aminometilpiperidina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.60 (m, 4H), 7.24 (t, 4H, J = 7.9 Hz), 6.95 (m, 2H), 3.69 (t, 4H, J = 5.8 Hz), 3.50 (t, 4H, J = 5.8 Hz), 3.31 (m, 4H), 2.85 (t, 2H, J = 12.4 Hz), 1.95 (m, 1 H), 1.81 (m, 2H), 1.20 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 573.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.1 min.

EJEMPLO 29 Síntesis del compuesto 27 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 22 excepto que el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazado por 4-aminobencilamina y la cadena lateral de etanolamina fue reemplazada por histamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.66 (m, 7H), 7.22 (m, 6H), 7.08- 6.65 (m, 7H), 4.53 (s, 2H), 3.63 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 3.53 (m, 2H), 2.89 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 2.77 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 707.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.4 min.

EJEMPLO 30 Síntesis del compuesto 28 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 9 excepto que ?/-1 -fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina fue reemplazado por anilina, 2-(4-hidroxifenil)etilamina con 2-(4-aminofenil)etilamina y el enlazador de etilendiamina con 1 ,4-fenilendiamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.72-7.51 (m, 8H), 7.26 (t, 4H, J = 7.9 Hz), 7.06 (d, 4H,. J=7.1 Hz), 6.98 (t, 2H, J = 7.1 Hz), 6.71 (t, 4H, J = 8.2 Hz), 3.57 (t, 4H, J = 7.3 Hz), 2.82 (t, 4H, J = 7.3 Hz); LRMS (ESI): m/z 719.2 (MH+); CLAR (método 1 ): 9.0 min.

EJEMPLO 31 Síntesis del compuesto 29 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que la anilina fue reemplazado por /V-1 -íer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina, 2-[4-hidroxifenil]etilamina con 2-(4-aminofenil)etilamina y ei enlazador de etilendiamina con piperazina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 9. Sólido café; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.46-7.30 (m, 14H), 6.98 (m, 2H), 4.00-3.85 (m, 8H), 3.80-3.75 (m, 4H), 3.01 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 725.4 (MH+); CLAR (método 2): 3.4 min.

EJEMPLO 32 Síntesis del compuesto 30 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que la anilina fue reemplazado por ?/-1 -fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina, 2-(4-hidroxifenil)etilamina con 2-(4-aminofenil)etilamina y el enlazador de etilendiamina con 4-aminometilpiperidina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 9. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.78-7.07 (m, 16H), 3.83-3.56 (m, 6H), 3.14-2.92 (m, 8H), 2.17-1.75 (m, 5H); LRMS (ESI): m/z 753.4 (MH+); CLAR (método 2): 3.2 min EJEMPLO 33 Síntesis del compuesto 31 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que la anilina fue reemplazado por ?/-1 -ter-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina, 2-(4-hidroxifenil)etilamina con 2-(4-aminofenil)etilamina y el enlazador de etilendiamina con 1 ,6-diaminohexano. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 9. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.85-7.06 (m, 16H), 3.74 (m, 4H), 3.48 (m, 4H), 3.01 (m, 4H), 1.68 (m, 4H), 1.47 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 755.2 (MH+), 777.2 (M+Na); CLAR (método 3): 1.4 min.

EJEMPLO 34 Síntesis del compuesto 32 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazado por 2-(4-aminofenil)etilamina y el enlazador de etilendiamina con 4-aminometilpiperidina. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.66-6.74 (m, 18H), 3.64 (m, 4H), 3.09-2.78 (m, 10H), 2.04 (m, 2H), 1.88 (m, 3H); LRMS (ESI): m/z 723.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.1 min.

EJEMPLO 35 Síntesis del compuesto 33 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazado por N-1-ter-butiloxicarbonilpiperazina. La remoción del grupo Boc se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 16. Sólido amarillo claro; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.60 (m, 4H), 7.25 (m, 4H0, 6.98 (m, 4H), 6.68 (d, 2H, J = 8.2 Hz), 3.83 (m, 8H), 3.70 (t, 2H, J = 5.6 Hz), 3.52 (m, 6H), 2.76 (t, 4H, J = 6.3 Hz); LRMS (ESI): m/z 620.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.3 min.

EJEMPLO 36 Síntesis del compuesto 34 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazado por 5-amino-2-metilbencilamina. Sólido amarillo claro. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.75-6.92 (m, 15H), 6.64 (d, 2H, J = 8.0 Hz), 4.52 (s, 2H), 3.68-3.41 (m, 6H), 2.73 (m, 2H), 2.30 (s, 3H); LRMS (ESI): m/z 670.2 (MH+); CLAR (método 2): 4.4 min.

EJEMPLO 37 Síntesis del compuesto 35 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazado por 3-aminobencilamina. Sólido anaranjado; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.75-6.64 (m, 18H), 4.37 (s, 2H), 3.77-3.39 (m, 6H), 2.79 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 656.2 (MH+); CLAR (método 3): 2.4 min.

EJEMPLO 38 Síntesis del compuesto 36 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que 2-(4-hidroxifen¡l)etilamina fue reemplazado por 2-(4-aminofenil)etilamina y el enlazador de etilendiamina con piperazina. Sólido rosa; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.75-6.68 (m, 18H), 3.98-3.65 (m, 16H), 2.77 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 695.2 (MH+); CLAR (método 3): 2.2 min.

EJEMPLO 39 Síntesis del compuesto 37 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 excepto que etanolamina fue reemplazado por 2-(4-hidroxifenil)etilamina y el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina con 2-aminobencilamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.62-6.60 (m, 22H), 4.44-4.38 (m, 2H), 3.53-3.47 (m, 4H), 2.80-2.72 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 733.2 (MH+); CLAR (método 2): 6.5 min.

EJEMPLO 40 Síntesis del compuesto 38 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 9 excepto que ?/-1 -fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina fue reemplazado por anilina, 2-(4-aminofenil)etilamina con 2-(4-hidroxifenil)etilamina y el enlazador de etilendiamína con 1 ,3-fenilendiamina. Sólido amarillo claro; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.61 (m, 4H), 7.29-6.92 (m, 14H), 6.69 (d, 4H, J = 7.4 Hz), 3.52 (t, 4H, J= 7.2 Hz), 2.79 (t, 4H, J 7.2 Hz); LRMS (FAB+): m/z 719.4 (MH+); LRMS (ESI): m/z 719.2 (MH+); CLAR (método 1 ): 8.6 min.

EJEMPLO 41 Síntesis del compuesto 39 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 1 excepto que la monoclorotriazina se trató primero con (/?)-fenilglicinol y trietilamina y el producto obtenido se trató con hidruro de sodio. Sólido blanco; H RMN (500 MHz, CD3OD) d 7.69-6.61 (m, 23H), 5.15 (m, 11 H), 3.96-3.37 (m, 6H), 2.89 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 748.2 (MH+); CLAR (método 1): 8.8 min.

EJEMPLO 42 Síntesis del compuesto 40 El compuesto anterior se preparó usando el procedimiento de fase sólida descrito en el ejemplo 3 empezando con anilina y etilendiamina. LRMS (ESI): m/z 670.4 (MH+), 692.2 (M+Na); CLAR (método 2): 4.2 min.

EJEMPLO 43 Síntesis del compuesto 41 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1) empezando con ?/-1-íer-butiloxicarbon¡l-1 ,3-fenilendiam¡na y -xilendiamina. 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazada por amoniaco gaseoso. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.83 (m, 2H), 7.69 (m, 2H), 7.41 (m, 6H), 7.12 (m, 2H), 4.63 (m, 4H); 19F RMN (376MHz, CD3OD, inserto coaxial de trifluorotolueno): 2 TFA; LRMS (ESI): m/z 537.4 (MH+), 559.2 (M+Na); CLAR (método 5): 4.1 min.

EJEMPLO 44 Síntesis del compuesto 42 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 empezando con A/-1-íer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazada por etanolamina y el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina con 4-aminobencilamina. Sólido amarillo pálido; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.10-7.87 (m, 1 H); 7.86-7.70 (m, 4H); 7.69-7.58 (m, 2H); 7.57-7.40 (m, 5H); 7.20-7.06 (m, 3H); 4.74 (s, 2H); 3.79-3.71 (m, 2H); 3.68-3.56 (m, 2H); LRMS (ESI) m/z 658 (MH+), 680 (M+Na); CLAR (método 5): 5.7 min.

EJEMPLO 45 Síntesis del compuesto 43 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 empezando con N-? -ter- butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-aminofenil) etilamina fue reemplazada por etanolamina y el enlazador 2-(4-aminofenil) etilamina con 3-aminobencilamina. Sólido amarillo pálido; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.06-7.90 (m, 1 H); 7.85-7.67 (m, 4H); 7.66-7.57 (m, 2H); 7.56-7.38 (m, 5H); 7.20-7.08 (m, 3H); 4.77 (s, 2H); 3.76-3.72 (m, 2H); 3.68-3.56 (m, 2H); LRMS (ESI) m/z 658 (MH+), 680 (M+Na); CLAR (método 5): 5.7 min.

EJEMPLO 46 Síntesis del compuesto 44 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 empezando con ?/-1 -íer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-aminofenil)etilamina fue reemplazada por etanolamina y el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina con piperazina. Sólido blanquecino. 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.10-7.82 (m, 3H); 7.80-7.65 (m, 2H); 7.63-7.57 (m, 2H); 7.52 (t, J = 8.2 Hz, 2H); 7.31-7.19 (m, 1 H); 7.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H); 4.09 (s, 8H); 3.81-3.70 (m, 2H); 3.60-3.53 (m, 2H); LRMS (ESI) m/z 622 (MH+), 644 (M+Na); CLAR (método 5): 5.9 min.

EJEMPLO 47 Síntesis del compuesto 45 El compuesto anterior se preparó como en el ejemplo 2 empezando con ?/-1 -íer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y amoniaco. 2-(4-aminofenil) etilamina fue reemplazada por 3-aminobencilamina y el enlazador 2-(4-aminofenil)etilamina con 4-aminobencilamina. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.85-7.24 (m, 14H), 7.14 (m, 2H), 4.72 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 628.4 (MH+), 651.2 (M+Na); CLAR (método 4): 2.7 min.

EJEMPLO 48 Síntesis del compuesto 46 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1 ) empezando con ?/-1-ter-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y 1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-hidroxifenil) etilamina fue reemplazada por etanolamina y amoniaco gaseoso. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.69 (m, 3H), 7.42 (m, 6H), 7.08 (m, 3H), 3.73 (m, 2H), 3.64 (m, 2H); LRMS (ESI): miz 553.4 (MH+), 575.6 (M+Na); CLAR (método 4): 2.0 min.

EJEMPLO 49 Síntesis del compuesto 47 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1 ) empezando con, ?/-1 -fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y 1 ,4-fenilendiamina. 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazada por etanolamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.74 (m, 2H), 7.69 (m, 6H), 7.53 (m, 2H), 7.19 (m, 2H), 3.77 (m, 4H), 3.64 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 597.4 (MH+), 619.6 (M+Na); CLAR (método 4): 2.3 min.

EJEMPLO 50 Síntesis del compuesto 48 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1 ) empezando con ?/-1 -ter-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y p-xilendiamina. 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazada por 4-aminobencilamina. Sólido amarillo; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.75-7.23 (m, 18H), 7.38 (m, 2H), 4.71 (m, 8H); LRMS (ESI): m/z 747.4 (MH+); CLAR (método 4): 3.5 min.

EJEMPLO 51 Síntesis del compuesto 49 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1 ) empezando con ?/-1-íer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y 1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazada por etanolamina. Sólido blanco; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.71 (m, 3H), 7.48 (m, 6H), 7.11 (m, 3H), 3.74 (m, 4H), 3.65 (m, 4H); LRMS (ESI): m/z 597.2 (MH+); CLAR (método 4): 2.2 min.

EJEMPLO 52 Síntesis del compuesto 50 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1 ) empezando con ?/-1 -fer-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y 1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazada por serinol. Sólido café; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 8.20-7.00 (m, 12H), 3.75 (m, 8H); 3.64 (m, 2H); LRMS (ESI): m/z 657.4 (MH+); CLAR (método 5): 4.5 min.

EJEMPLO 53 Síntesis del compuesto 51 El compuesto anterior se preparó por el método B (esquema 1 ) empezando con A/-1 -ter-butiloxicarbonil-1 ,3-fenilendiamina y 1 ,3-fenilendiamina. 2-(4-hidroxifenil)etilamina fue reemplazada por amoniaco gaseoso. Sólido blanquecino; 1H RMN (400 MHz, CD3OD) d 7.71 (m, 3H), 7.42 (m, 6H), 7.11 (m, 3H); LRMS (ESI): m/z 509.4 (MH+), 531.4 (M+Na); CLAR (método 4): 1.7 min.

EJEMPLO 54 Capacidad de los compuestos para simular la proteína A como se determina por ELISA de uñón de proteína A competitiva Como se describió antes, esta prueba evalúa la capacidad de los compuestos ilustrados para simular la proteína A. Dichos compuestos se pueden unir a la porción Fe de la IgG humana como se confirmó por la inhibición de unión de proteína A a una IgG humana. La prueba de ELISA de unión de proteína A competitiva se realizó sobre una superficie de placa de 96 pozos Maxisorp para mejorar la unión de proteína A a la parte inferior de la placa. Los pozos se revistieron con 100 µl de proteína A (0.8 µg) y se incubaron durante la noche a 4°C. Después de la incubación, la proteína A no ligada fue removida por tres lavados con solución salina reguladora de pH de fosfato (PBS). La placa después se incubó con 100 µl/pozo de una solución al 2% de suero de bovino fetal (BSA) durante 1 hr a 37°C para bloquear unión de proteína no específica. Después de la incubación, la placa se lavó tres veces con PBS. 50 µl del compuesto o proteína A, diluido en PBS o PBS-20% de DMSO a concentración apropiada, se añadieron a los pozos seguido por la adición de 50 µl de IgG humana conjugada con peroxidasa (HRP-lgG). Después de 1 hr de incubación a 37°C, la placa se lavó tres veces con PBS para remover HRP-lgC no ligada. HRP-lgG ligada se detectó por incubación con 100 µl de solución de cristales de sal de 2,2'-azino-sulfonato]diamonio (ABTS) durante 20 min en la oscuridad a temperatura ambiente. La placa después se leyó a 405 nm sobre un lector de microplaca universal EL 800 (Bio-Tek). Los datos se analizaron en Microsoft Excel y la concentración del compuesto que inhibe 50% de unión de proteína A (CI5o) se calculó usando software Prism. El cuadro 1 representa la CI5o de los compuestos probados en la prueba de ELISA de unión de proteína A competitiva, que consiste de un análisis de lado por lado en PBS y PBS-20% de DMSO. Se usó DMSO para incrementar la solubilidad de algunos de los compuestos. Estos datos ilustran la capacidad de los compuestos de esta invención para inhibir la unión de proteína A a la porción Fe de IgG.

CUADRO 1 Clgn (µM) de compuestos simuladores de proteína A como se confirmó por ELISA El cuadro 2 resume la Cl50 de cuatro compuestos simuladores de proteína A potentes en comparación con proteína A soluble en la prueba de ELISA competitiva. Los resultados además demuestran la capacidad de los compuestos simuladores de proteína A para inhibir la unión de proteína A a IgG humana.

CUADRO 2 Clgo (µM) de cuatro compuestos comparados con la prueba de ELISA competitiva EJEMPLO 55 Efecto de los compuestos sobre la fagocitosis de complejos inmunes Esta prueba se realizó para determinar la capacidad de compuestos simuladores de proteína A para estimular o inhibir la absorción de FITC-complejo inmune (IC). Se preparó FITC-IC mezclando albúmina de suero humano (HSA)-isotiocianato de fluoresceína (FITC) con anti-HAS de IgG de ratón a una relación de 1 :4 (cuatro moléculas de anticuerpo por una molécula de antígeno) en un agitador giratorio durante 1 hr a temperatura ambiente. IC soluble se incubó después con o sin compuestos o proteína A durante 10 min. esta mezcla se añadió a RAW 264.7 células y se incubó durante 2 hr a 37°C para fagocitosis de IC. Después de la incubación, las células se lavaron dos veces con PBS frío (5 min, 1200 rpm) y se fijaron con 500 µl de PBS que contiene 2% de formaldehído. La señal de FITC absorbido por RAW 264.7, que es indicativo de fagocitosis de IC, se determinó por análisis de citometría de flujo en un contador de Becton Coulter con un láser de argón y la señal se midió a través de un filtro de 530/30 nm. La figura 1 ilustra una curva de respuesta a la dosis del compuesto 1 sobre la fagocitosis de IC con RAW 264.7 (similar a macrófago). Los resultados muestran que la fagocitosis de IC es similar al control a una concentración por abajo de 0.4 µM del compuesto 1. Un incremento en fagocitosis de IC se observa a concentraciones de 1 ,2 y 4 µM, seguido por una inhibición a 10 y 20 µM (aproximadamente 20%). La fagocitosis de IC también se tomó con un compuesto 14 y proteína A. La fagocitosis de IC es inhibida por el compuesto 14 (aproximadamente 50% a 20 µM) y proteína A (aproximadamente 50% a 2 µM y 20 µM).

EJEMPLO 56 Efecto de los compuestos sobre apoptosis inducida por FNTa en línea celular WEHI 13-VAR El efecto de los compuestos sobre apoptosis inducida por FNTa se midió por una prueba biológica estándar usando células WEHI-VAR13.

Estas células sufren apoptosis cuando se incuban en presencia de FNTa; y actinomicina D. 2 x 104 células WEHI-13VAR se incubaron en RPMI complementado con 1% de piruvato de sodio y 10% de FBS, durante la noche a 37°C para adherencia celular. Las células después se cultivaron en la presencia de 1 µg/ml de actimomicina D (para inhibir síntesis de proteína) y 0.04 nM de FNTa; con o sin compuestos a 37°C. Después de 16-24 hr 50 µl de una solución de 2 mg/ml de MTT se añadió a cada pozo y la placa después se incubó durante 4 hr a 37°C. Únicamente las células viables metabolizan MTT para formar sal de formazan, que es detectable al medir la absorbancia a 570 nm. Después de la incubación, la placa se invirtió para remover el medio y células muertas. 150 µl de DMSO se añadió a cada pozo para detener la reacción y solubilizar la sal de formazan. La densidad óptica se leyó en un lector de microplaca universal EL 800 (Bio-Tek). Una disminución en la densidad óptica es evidencia directa de apoptosis celular inducida por FNTa. Los compuestos también se compararon con la actividad de un anticuerpo neutralizante de anti-FNTa. Un valor negativo indica que los compuestos probados, a esa concentración particular, fueron capaces de estimular la apoptosis. El cuadro 3 representa el porcentaje de inhibición de FNTa (apoptosis) de los compuestos probados en la prueba de proliferación de células WER-VARI3 sensibles a FNTa basada en células. Los compuestos demostraron una actividad inhibidora de FNTa en el intervalo de 30-50%. En comparación, el anticuerpo de FNTa demostró una actividad inhibidora de FNTa de 90-95%. Estos datos ilustran la capacidad de los compuestos de esta invención para inhibir la actividad apoptótica de FNTa sobre células WEHI-VAR13 sensibles a FNTa.

CUADRO 3 Efecto de los compuestos sobre la inhibición de FNTa EJEMPLO 57 Efecto de los compuestos sobre la unión de FNTa al receptor de FNTa p55 (CD120a) y el receptor de FNTa p75 (CD 120b) Los compuestos se probaron por su capacidad para unirse a FNTa; o inhibir la interacción de FNTa con sus receptores respectivos; receptor de FNTa p55 y p75. Tres pruebas de ELISA de unión se llevaron a cabo como se describe en Mancini et al. Biochemical Pharmacology 58, 851- 859 (1999). El FNTa o receptor (1 µg/ml) se revistió sobre una placa de 96 pozos Maxisorp, durante la noche a 4°C. Después de la incubación, FNTa no ligado o FNTa p55; receptor o receptor de FNTa p75 fue removido y la placa se lavó tres veces con PBS. La placa después se incubó con 100 µl/pozo de una solución de BSA al 2% durante 1 hr a 37°C para bloquear unión de proteína no específica. Después de la incubación, la placa se lavó tres veces con PBS. Receptor de FNTa p55 humano recombinante biotinilado o FNTa humano recombinante biotinilado se añadió a los pozos en presencia o ausencia de los compuestos. La placa se incubó durante 1 hr a 37°C.

Después de la incubación, la placa se lavó tres veces con PBS para remover receptor p55 o p75 marcado no ligado o FNTa humano recombinante;. 100 µl de avidina-HRP (diluida 1/2000 en PBS-0.1 % de BSA) se añadió a cada pozo y se incubó durante 1 hr a 37°C. Receptor p55 o p75 ligado o FNTa humano recombinante; fue detectado por la adición de 200 µl de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) por pozo durante 15 min. La placa después se leyó a 655 nm en un lector de microplaca universal EL 800 (Bio-Tek), Mississauga, Canadá). Los datos se analizaron en Microsoft Excel y se registraron como el porcentaje de inhibición de unión de p55 o p75 a INFO o unión de Rl (pSS) o RH (p75) de FNTa. El cuadro 4 ilustra el efecto de los compuestos sobre la inhibición de la unión directa de FNTa; Rl y RTI a FNTa (revestido con plástico) y FNTa con sus receptores (revestido con plástico). Cuando FNTa es revestido sobre plástico, los compuestos no inhiben la unión de receptores de Rl y Rll a FNTa. Pero cuando los receptores son revestidos sobre plástico, los compuestos inhiben la unión de FNTa a receptor de Rl receptor y Rll a un menor grado. Los resultados sugieren que la inhibición parece no deberse a la unión directa del compuesto al receptor de FNTa sino más bien a FNTa. Una inhibición menor que 20% se consideró que era insignificante. Un porcentaje negativo de inhibición se puede deber a la precipitación o un incremento en la unión de FNTa a sus receptores respectivos.

CUADRO 4 Efecto de los compuestos sobre la unión de Rl o Rll o FNTa EJEMPLO 58 Efecto de los compuestos sobre la producción de FNTa inducida por LPS en línea celular J774A-1 de ratón El efecto de los compuestos sobre la producción de FNTa se midió por ELISA usando células J774-1 estimuladas por LPS. Las células J774-1 se cultivaron en presencia o ausencia de LPS y compuesto. Las células se cultivaron a 37°C durante 24 hr y posteriormente los sobrenadantes se recogieron para la determinación de la concentración de FNTa; por ELISA como lo recomienda el fabricante (BD Biosciences). Los datos se analizaron en Microsoft Excel y la concentración del compuesto que inhibe 50% de producción de FNTa (también) se calculó usando software Prism. El cuadro 5 resume el efecto de los compuestos sobre la producción de FNTa inducida por LPS sobre células J774-1.

CUADRO 5 Efecto de los compuestos sobre la inhibición de FNTa liberado por inducción de LPS de células J774A.1.

EJEMPLO 59 Efecto de compuestos simuladores de protema A sobre citotoxicidad celular de leucocitos mononucleares de sangre periférica (PBML), ADN, ARN y síntesis de proteína PBML se obtuvieron de la sangre periférica de voluntarios sanos.

La sangre fue sometida a centrifugación por gradientes con Lympholyte-poly (Cedarlane, Homby, Canadá). La capa, que contiene los leucocitos mononucleares, fue recogida y las células se lavaron tres veces en PBS. Las células después se suspendieron en RPMI (Gibco, Burlington, Canadá) complementado con 10% de FBS (Hyclone, Logan, E.U.A.). La viabilidad fue mayor que 99% como se determinó con exclusión por azul de tripano. PBML fueron re-suspendidas a 2 x 106 células/ml. 100 µl de PBML (2 x 105 células) se incubaron en una placa de microtitulación de 96 pozos durante 48 hr en presencia o ausencia del compuesto o proteína A. Las células fueron quiescentes o estimuladas con concanavalina A (ConA; células T) o mitógeno de hierba carmín (PWM; células B). Después de incubarse, las células se trataron con MTT (citotoxicidad) o se pulsaron con 1 µCi de [3H]-timidina (síntesis de ADN), [3H]-uridina (síntesis de ARN) o [3H]-leucina (síntesis de proteína) durante 6 hr. Las placas se cosecharon en un instrumento Tomteck y se contaron en un contador Microbeta ß. El cuadro 6 resume el efecto de compuestos simuladores de proteína A sobre citotoxicidad celular, ADN, ARN y síntesis de proteína en comparación con la proteína A en PBML. La proteína A no tiene efecto sobre ADN, ARN y síntesis de proteína. Además, no induce citotoxicidad celular. La citotoxicidad celular se observó únicamente en PBML estimulado con Con A, un mitógeno que estimula la proliferación de células T. No se observó efecto citotóxico en PBML en reposo. La estimulación de PWM, un mitógeno que estimula la proliferación de células B, no es afectada por los compuestos que simulan la proteína A. Además, el compuesto 1 , 7 y 19a suprime síntesis de ADN y RNA tanto en PBML en reposo como estimulados (ConA y PWM). Únicamente el compuesto 1 y 19a, sin embargo, inhiben la síntesis de proteína en PBML en reposo y estimulados. Estos resultados sugieren una supresión tanto de células T como células B. Estas células están fuertemente implicadas en enfermedades autoinmunes.

CUADRO 6 Efecto de compuestos simuladores de proteína A sobre citotoxicidad de PBML en resposo y estimulados, ADN, ARN y síntesis de proteína ncremento EJEMPLO 60 Efecto de los compuestos sobre lupus eritematoso sistémico (SLE)- glomerulonefritis Ratones de Nueva Zelanda de la cruza híbrida de F1 NZBxNZW desarrollan la mayoría de las anormalidades autoinmunes vistas en SLE y mueren de glomerulonefritis mediada por complejo inmune similar a SLE (IC). Los ratones desarrollan títulos altos de anti-ADN (de doble cadena y una sola cadena) y anticuerpos de extracto nuclear (NE), así como manifestaciones clínicas relacionadas con SLE incluyendo leucopenia, trombocitopenia, proteinuria y glomerulonefritis. Estos ratones desarrollan anticuerpos anti-ADN después de la edad de 3 meses, con un pico de respuesta de anticuerpos anti-ADN que ocurren a los 7 meses. Subsecuentemente, la concentración en el suero de anticuerpos anti-ADN declina, supuestamente como consecuencia de uremia progresiva. Las primeras manifestaciones serológicas de la enfermedad ocurren a aproximadamente 150 días (5 meses). Su supervivencia se evalúa a aproximadamente 250 días. La figura 2 ilustra el efecto del compuesto 1 sobre la mortalidad de los ratones NZBXNZW. La administración intravenosa del compuesto o vehículo se llevó a cabo una vez a la semana desde la semana 18 a la semana 37. El tratamiento cesó durante 11 semanas y se reanudó a la semana 48 para los grupos de control y de compuesto 1. Los resultados indican que el compuesto 1 reduce la mortalidad de ratones NZBxNZW a la semana 37. También retrasa la aparición de síntomas y mortalidad hasta la semana 45. La figura 3 ilustra la proteinuria a la semana 48 a 51. La cantidad de proteína mayor que 5 g/litro en los ratones tratados con el compuesto 1 fue mayor que el control debido a la cinética de la enfermedad; (fase exponencial). Pero al continuar el tratamiento entre la semana 48 y la semana 52 usando la administración semanal del vehículo o compuesto, el compuesto 1 induce una disminución en la concentración de proteína (5 g/iitro) en la orina en comparación con el vehículo solo (figura 3A). Además, un incremento en la cantidad traza de proteína en la orina se observa en ratones tratados con compuesto 1 (figura 3B) indicando una mejora en la filtración en el riñon. Los resultados de un segundo SLE se presentan en la figura 4. Los compuestos retrasan la mortalidad, como se ve mediante un incremento en la supervivencia de ratones NZBxNZW. Los compuestos 1 y 9 incrementa la supervivencia hasta 35% en comparación con el grupo de control. Además, el compuesto 1 prolongó la supervivencia hasta 89 semanas en comparación con 65 semanas para el control. La figura 5 es un ejemplo del efecto de los compuestos sobre la supervivencia de ratones MRL//pr. Estos ratones también desarrollan espontáneamente síndrome similar a SLE. MRL//pr tiene una mutación fas homocigótica, que acelera la autoinmunidad. Los compuestos retrasan la mortalidad como se ve mediante un incremento en la supervivencia de ratones MRL//pr. Además, los compuestos 1 y 20 incrementa la supervivencia (40%) comparada con el grupo de control (10%).

EJEMPLO 61 Efecto de los compuestos sobre la hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) inducida por oxazolona Los compuestos se probaron por su capacidad para tratar hipersensibilidad de tipo retardado (DTH) en ratones. El día 0, los ratones fueron sensibilizados con 100 µl de oxazolona en 5% de acetona. El día 0, 1 y 2, los ratones se trataron mediante administraciones intravenosa u oral del vehículo (control) o metotrexato (MTX; control posítivo/IV) o hidrocortisona (control positivo /PO) o el compuesto a 50 mg/kg a 300 mg de peso corporal. Los ratones fueron desafiados con una aplicación de 50 g de oxazolona sobre la superficie de la oreja derecha (primer desafío, día 3; segundo desafío, día 10). El espesor de la oreja se midió el día 4 al día 7, y el día 1 al 14. También se observó enrojecimiento y formación de costra. Los ratones fueron sacrificados el día 14. Células TDTH (CD4) juegan un papel importante en regular la intensidad de la respuesta de DTH. Los compuestos pueden ejercer una influencia inhibidora sobre la respuesta de DTH a través de su inhibición de activación de células T y ADN, ARN y/o síntesis de proteína. Como se ilustra en las figuras 6 y 7, todos los compuestos inducen una reducción significativa de la inflamación como se ve por el espesor de la parte inferior de la oreja. También, el compuesto 19a por sí solo es equipotente a metotrexato. Los compuestos también reducen el enrojecimiento, formación de costra e hinchazón de la oreja.

Como se ilustra en la figura 8, cuando se administra por vía oral los días 0, 1 y 2, los compuestos 1 y 19a inducen una reducción significativa de la inflamación como se ve por el espesor de la parte inferior de la oreja. También, los compuestos 1 y 19a por sí solos son equipotentes a hidrocortisona a concentraciones de 150 mg/kg (compuesto 1) y 300 mg/kg (compuestos 1 y 19a) de peso corporal. Los compuestos también reducen el enrojecimiento, formación de costra e hinchazón de la oreja.

EJEMPLO 62 Efecto de los compuestos sobre artritis inducida por colágeno La artritis inducida por colágeno (CÍA) fue inducida en ratas Lewis hembras mediante la administración de colágeno de tipo 11 heterólogo (bovino) (250) g) solubilizado en ácido acético 0.1 M y emulsionado en adyuvante de Freund completo (CFA). Las ratas se trataron con el vehículo o metotrexato o compuesto 1 por inyecciones intravenosas los días 8, 9, 12, 14 y 16. Se desarrolló sinovitis típicamente a los 12-15 días después de la inmunización en 80-90% de los animales. Una vez que apareció la artritis, cada pata se examinó dos a tres veces a la semana. Tanto la incidencia como severidad de la artritis se evaluaron. La incidencia se define como el número de ratas con evidencia clínica de inflamación de articulaciones durante el período de estudio mientras que la severidad se cuantificó calificando diariamente cada pata íntegra en una escala de 0 a 4 (0=normal, 4=máximo; cuadro 7) con base en niveles cada vez mayores de hinchazón, eritema periarticular y rigidez. La suma de las calificaciones para las cuatro patas se calculó como el índice artrítico con una calificación posible máxima de 16 por rata. Puesto que CÍA afecta principalmente las extremidades posteriores, las calificaciones de 6-8 representan artritis severa.

CUADRO 7 Definición de calificación de severidad para modelos de artritis en rata CÍA y AIA Como se ¡lustra en la figura 9, 80-90% de los animales desarrolló una sinovitis severa después de 12-15 días de la inmunización. La inflamación alcanza su máximo el día 16. Una reducción significativa (5%) en la severidad de artritis (índice artrítico) se observó mediante inyección intravenosa de metotrexato (control positivo) el día 14 y posteriormente. Una reducción más débil pero significativa (20%) del índice artrítico también se observó con el compuesto 1 del día 16 al día 21.

EJEMPLO 63 Efecto de los compuestos sobre artritis inducida por adyuvante de Freund (AIA) AIA fue inducida en ratas Lewis hembras mediante la inyección de Mycobacterium butyrícum liofilizado suspendido en aceite mineral en el cojinete del pie. El desarrollo de artritis se monitoreó durante un período de 3 semanas después de la inyección de adyuvante. La inflamación alcanzó un pico el día 3 después de la administración de adyuvante. La activación inmune apareció aproximadamente el día 14. Los compuestos se administraron por vía oral o intravenosa a diferentes dosis los días 3, 2 y 1 antes de la inyección de adyuvante y a un régimen diferente como se especifica en el inicio del experimento del día 10 al 21 después de la inyección de adyuvante o los animales se trataron con administración oral del compuesto 19a del día 3 al día 21. El peso corporal se registró. El índice de artritis, que es una medida de inflamación (edema), enrojecimiento y rigidez de las articulaciones, se usó para monitorear el desarrollo de la enfermedad. El grado de artritis se determinó midiendo los diámetros perpendiculares de los tobillos en los planos medio-lateral y dorsoventral usando un calibrador de Vernier. La circunferencia de la articulación en milímetros se calculó después usando una fórmula geométrica. Tanto la incidencia como severidad de la artritis se evaluó. La incidencia se define como el número de ratas con evidencia clínica de inflamación de la articulación durante el período de estudio.

Como se ilustra en la figura 10, 100% de los animales desarrollan rápidamente una sínovitis. La inflamación alcanza su máximo el día 3 después de la inmunización. Los animales se trataron mediante administración intravenosa de los compuestos los días 3, 2, 1 , 12, 13, 14, 18, 19 y 20. Una reducción significativa (50%) en la severidad de artritis (índice inflamatorio) se observó mediante inyección intravenosa de metotrexato (control positivo) el día 19 y después. Una reducción débil pero aún significativa (20%) del índice inflamatorio también se observó con los compuestos 1 y 19a del día 3 al día 5. Además, en la figura 11 , una reducción significativa (hasta 50%) en la severidad de artritis (índice inflamatorio) se observó mediante inyecciones intravenosas (días 3, 2, 1 , 11 , 12 y 13) de los compuestos 1 y 19a sobre inflamación aguda (días 1 a 6). También, una inhibición significativa se observó con la administración oral del compuesto 19a sobre inflamación aguda en comparación con el control y metotrexato. Una inhibición fuerte y significativa de la inflamación también se observó sobre inflamación crónica (días 12 a 21 ) por el compuesto 19a (IV; días 12 a 19, PO; día 16) y metotrexato (días 15 a 21 ). Cuando el compuesto 19a se administró por vía oral cada día (días 3 a 21 ), una inhibición significativa (hasta 50%) de inflamación se observó del día 13 al día 22 (figura 12).

EJEMPLO 64 Uso de compuestos para unir y purificar inmunoglobulinas Como se indicó antes, se pueden usar compuestos ejemplificados como agentes de afinidad para unir anticuerpo y subsecuentemente aislar y purificar el anticuerpo de una mezcla de proteínas. Dicha purificación se logra convenientemente cuando el compuesto es primero covalentemente ligado, ya sea directamente o mediante un enlazador, a un material de soporte insoluble. Por lo tanto, 101 g de esferas de agarosa al 6% entrelazadas (con epiclorohidrina) activadas por epóxido se trataron con una solución de ácido 6-aminohexanoico (8.0 g, 61 mmoles) en agua (101 ml) y la suspensión se ajustó a pH = 12 con NaOH 2M. La reacción se agitó sobre una placa oscilatoria durante 44 hr. Las esferas se filtraron, se lavaron con agua (5 x 100 ml), después se volvieron a suspender en agua (100 ml) y se trataron con una solución de borhidruro de sodio (202 mg, 5.34 mmoles) en NaOH 10 M (20 ml). La reacción se agitó en una placa oscilatoria durante 25 hr. Las esferas se filtraron, se lavaron con agua (11 x 200 ml hasta que el pH del filtrado fue neutro y una muestra del gel se seco por congelamiento para análisis elemental: C 47.366%; H 6.966%; N 0.990%. Con base en un átomo de nitrógeno por molécula de ácido 6-aminohexanoico, esto corresponde a una carga de 707 micromoles/g de gel secado por congelamiento. El gel sedimentado (4 g) se trató con una solución del compuesto 19b (275 mg, 0.30 mmoles) en agua ajustado a pH = 4.5 (3.0 ml). Una solución de clorhidrato de 1-[3-(dimetilamino)propil]-3-etilcarbodimida (400 mg, 2.09 mmoles) en agua ajustado a pH = 4.5 (3.0 ml) se añadió a la reacción que después se agitó sobre una placa oscilatoria durante 21 hr. La suspensión se filtró, se lavó con HCl 0.1 M (3 x 10 ml) y agua (10 x 8 ml) para dar un gel café pálido. El gel empacado (200 en una columna de agitación) se equilibró en 20 mM de PBS (pH = 7). En este formato, el compuesto ejemplificado inmovilizado a un soporte sólido se puede usar para purificación de anticuerpo. La unión de fase sólida evalúa los compuestos ejemplificados por su capacidad para unir, remover y/o purificar inmunoglobulinas. Compuestos ejemplificados fueron ligados ya sea directamente o con un enlazador orgánico a un material de soporte insoluble (resina). El gel (compuesto ejemplificado ligado a la resina) se empacó en una columna giratoria. 200 µl de gel empacado se equilibró en regulador de pH de fosfato de sodio 20 mM (pH = 7). IgG humana total (Sigma, St. Louis, E.U.A.; IgG humana purificada aislada de suero humano normal de acervo) (véase franja 2 de la figura 13 se introdujo a través del gel y el flujo (véase franja 3 de la figura 13) se recogió. El gel se lavó con cinco volúmenes de columna de regulador de pH de fosfato de sodio 20 mM (pH = 7) más NaCl 0.25 M. Las fracciones de lavado (véase franja 4 de la figura 13) se recogieron. Las IgGs ligadas se eluyeron a pH bajo con ácido cítrico 0.1 M (pH = 3). La IgG eluida (véase franja 5 de la figura 13) se recogió y después se neutralizó con Tris HCl (pH = 8). SDS-PAGE (12%) de las fracciones recogidas se realizó y las proteínas se visualizaron usando tinción de azul de Coomassie. Como se representa en la figura 13, hasta 80% de IgG total humana se ligó y se purificó cuando el compuesto 19b se enlazó a la resina mediante un enlazador de ácido aminohexanoico. Las patentes, solicitudes de patente y otras publicaciones citadas aquí se incorporan por referencia en su totalidad. Todas ias modificaciones y sustituciones que están dentro del significado de las reivindicaciones y el intervalo de sus equivalentes legales han de ser abarcados dentro de su alcance. Una reivindicación que usa la transición "que comprende" permite la inclusión de otros elementos que están dentro del alcance de la invención; la invención también la describen dichas reivindicaciones usando la frase de transición "que consiste esencialmente de" (es decir, que permite la inclusión de otros elementos que están dentro del alcance de la reivindicación si no afectan materialmente la operación de la invención) y la transición "que consiste de" (es decir, que permite únicamente los elementos listados en la reivindicación distintos a las impurezas o actividades inconsecuentes que están ordinariamente asociadas con la invención) en vez del término "que comprende de". Cualquiera de las tres transiciones se puede usar para reivindicar la invención. Cabe entender que un elemento descrito en esta especificación 'no debe considerarse como una limitación de la invención reclamada a menos que sea mencionada explícitamente en las reivindicaciones. Por lo tanto, las reivindicaciones son la base para determinar el alcance de protección legal otorgada en vez de una limitación de la especificación que se lee en las reivindicaciones. En distinción por contraste, la técnica anterior se excluye explícitamente de la invención al grado de modalidades específicas que anticiparían la invención reclamada o destruye novedad. Más aún, ninguna relación particular entre limitaciones de una reivindicación se pretende a menos que dicha relación sea explícitamente mencionada en la reivindicación (v.gr., la disposición de componentes en una reivindicación de producto u orden de pasos en una reivindicación de método no es una limitación de la reivindicación a menos que se establezca explícitamente que es así). Todas las posibles combinaciones y permutaciones de los elementos individuales aquí descritos se consideran aspectos de la invención; de manera similar, generalizaciones de la descripción de la invención se consideran como parte de la invención. A partir de lo anterior, sería evidente para un experto en la técnica que la invención se puede modalizar en otras formas específicas sin apartarse de su espíritu o características esenciales. Las modalidades descritas se deben considerar únicamente como ilustrativas, no restrictivas, debido a que el alcance de la protección legal provista para la invención estará indicado por las reivindicaciones anexas y no por la especificación.

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- Un compuesto de la siguiente fórmula: '; R' = hidrógeno o alquilo de C-?_4, y A no es necesariamente igual a C; en donde Ri, R2, 3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidroxialquilo de C2-4, aminoalquilo de C2-4, trifluorometilo, pentafluoroetilo, fenilo, naftilo, bencilo, bifenilo, fenetilo, piperidinilo, metilpiperidinilo, etilpiperidinilo, indenilo, 2,3-dihidroindenilo, cicloalquilo o cicloalquenilo de C4-C , indoilo, metilindoilo, etilindoilo, y anillos heterocíclicos aromáticos de cinco miembros sustituidos de las siguientes fórmulas:

2.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: A = — (CH2)n — , n = 0, 1 ó 2; C = — (CH2)n — , n = 0, 1 ó 2; A no es necesariamente igual a C; y

3.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque: A = — CH2 — y B = 0.

4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 2 ó 3, caracterizado además porque: R-t y R4 se seleccionan del grupo que consiste de hidroxietilo, hidroxipropilo, hidroxibutilo, amino, aminoetilo, aminopropilo, aminobutilo, fenilo, anilino, hidroxifenilo y aminofenetilo; R2 y R3 se seleccionan del grupo que consiste de anilino, aminoanilino, fenetilo e hidroxifenetilo.

5.- Un compuesto seleccionado del grupo que consiste de: No. de compuesto Estructura

6.- El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque se puede unir en forma no covalente a anticuerpos.

7.- El compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque se puede unir en forma no covalente a anticuerpos en donde uno, dos o todos los sustituyentes Ri, R2, R3, R4 son

8.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 6 ó 7, caracterizado además porque los anticuerpos son por lo menos del isotipo de IgG humana.

9.- Una composición que comprende por lo menos un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho compuesto se combina con un vehículo farmacéuticamente aceptable.

10.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque el vehículo solubiliza al compuesto en un solvente de alcohol o poliol.

11.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende una proteína recombinante que es capaz de unirse al FNTa humano.

12.- La composición de. conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque la proteína recombinante es un anticuerpo anti-FNTa o receptor de FNTa soluble.

13.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende metotrexato.

14.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende un corticosteroide antiinflamatorio.

15.- La composición de conformidad con la reivindicación 9, caracterizada además porque comprende un fármaco antiinflamatorio no esteroideo.

16.- Uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 o una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la preparación de un medicamento para administración a un paciente con una enfermedad autoinmune.

17.- El uso que reclama en la reivindicación 16, en donde dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico, trombocitopenia inmune, glomerulonefritis, vasculitis y artritis.

18.- El uso que se reclama en la reivindicación 16, en donde dicha enfermedad autoinmune se selecciona del grupo que consiste de artritis reumatoide, artritis psoriática, psoriasis, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria, espondilitis alquilosante, síndrome de Sjogren, enfermedad de Still (síndrome de activación de macrófagos), uveitis, escleroderma, miositis, síndrome de Reiter y síndrome de Wegener.

19.- El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde el medicamento comprende además una proteína recombínante que es capaz de unirse a FNTa humano y dicha proteína recombinante se usa en una cantidad reducida en presencia de dicho compuesto.

20.- El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 16 a 18, en donde la administración comprende además administración separada de una proteína recombinante que es capaz de unirse a FNTa humano antes y/o después de la administración de dicho compuesto, pero no administración simultánea.

21.- El uso de un compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 para preparar un medicamento para tratar un proceso de inflamación en un paciente.

22.- Un método de purificación de anticuerpos que comprende unir anticuerpos con uno o más compuestos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 covalentemente unidos ya sea directamente o con un enlazador orgánico a un material de soporte insoluble de tal manera que por lo menos algunos anticuerpos no están covalentemente unidos a los compuestos enlazados al soporte ¡nsoluble y purificar dichos anticuerpos.