MXPA06005093A - Composiciones estabilizadas que comprenden probioti - Google Patents

Abstract

Se proporcionan composiciones bacterianas secas estabilizadas que comprenden más de 10%de un concentrado bacteriano seco que tiene una concentración de bacterias de al menos 1 x 108 cfu/g. Las composiciones tienen una estabilidad mayor. También se proporcionan composiciones bacterianas envasadas, composiciones en dosis unitarias y métodos para elaborar las composiciones de la presente invenci

Description

COMPOSICIONES ESTABILIZADAS QUE COMPRENDEN PROBIOTICOS CAMPO TÉCNICO La presente invención se refiere a composiciones bacterianas secas y estabilizadas que tienen baja actividad de agua. Las composiciones de la presente tienen estabilidad a largo plazo y actividad probiótica.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Recientemente, los probióticos y las composiciones que comprenden estos materiales se han vuelto cada vez más populares para tratar muchas enfermedades. Los probióticos pueden ser bacterias o fracciones purificadas de éstas que proporcionan un beneficio a un huésped, tal como el alivio o profilaxis de una enfermedad, después del consumo. Aunque existen muchas variedades de bacterias probióticas, las composiciones que comprenden estos materiales, especialmente las células bacterianas probióticas viables tienden a ser poco estables. Por ejemplo, se han administrado concentrados secos de bacterias probióticas a mamíferos por medio de la leche y de otras suspensiones acuosas. Sin embargo, a menos que estas composiciones se almacenaran y distribuyeran bajo condiciones de refrigeración, en el pasado era necesario preparar la suspensión inmediatamente antes de usarla a partir de un concentrado seco, o consumir el concentrado seco en forma de polvo o cápsula para garantizar que un porcentaje suficientemente alto de las células administradas mantuvieran su viabilidad en el momento de la administración. Aunque se sabe que los concentrados bacterianos proporcionan algunos beneficios para la estabilidad, éstos no han proporcionado una estabilidad completamente adecuada ni facilidad de uso. Un problema importante relacionado con las composiciones que contienen probióticos es el nivel de agua disponible en la composición. Los niveles moderados a altos de agua en las composiciones probióticas que comprenden concentrados de bacterias secas permiten que la bacteria seca continúe metabolizándose durante el almacenamiento. Este metabolismo produce metabolitos ácidos y otras moléculas, y también descompone las bacterias probióticas y reduce su viabilidad de modo que la composición se arruina o se contamina y por ello no es eficaz ni apta para el consumo. Se han investigado diversos excipientes y materiales de suspensión similares para aislar el agua en las composiciones que contienen probióticos con niveles de éxito diversos. Por ejemplo, la patente de los EE.UU. núm. 4,518,696 describe una composición bacteriana líquida estabilizada que consiste en una mezcla de células secas viables de Lactobacilli probiótico de origen animal y sílice pirogénica; la mezcla dispersada en aceite de girasol anhidro tiene una actividad de agua de hasta 0.20. A pesar de estos avances, la estabilidad en el almacenamiento a largo plazo de las composiciones bacterianas secas ha mejorado bastante, incluso en el caso de las cepas bacterianas más estables. Varias cepas bacterianas todavía deben almacenarse a una temperatura de hasta 5 °C, y aún así no se garantiza la estabilidad a largo plazo. Por ello, existe la necesidad de contar con composiciones probióticas mejoradas, con una mayor estabilidad y un mayor suministro de bacterias probióticas viables. En particular, existe la necesidad de proporcionar composiciones probióticas estables que comprendan cepas bacterianas que previamente han sido difíciles de almacenar a largo plazo a temperatura ambiente.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención proporciona composiciones bacterianas secas que comprenden al menos 10 % de un concentrado de bacterias secas de al menos 1 x 108 cfu/g; la composición tiene una actividad de agua de hasta 0.5. Las composiciones en polvo a granel, en formas encapsuladas o en otras formas similares tienen una mayor estabilidad a largo plazo a 5 °C y a temperatura ambiente. La presente invención también proporciona composiciones bacterianas secas empaquetadas y métodos para elaborar las composiciones de la presente ¡nvención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA FIGURA Figura 1: dependencia de la estabilidad durante el almacenamiento a 25 °C con el paso del tiempo respecto de la concentración bacteriana inicial medida en términos de unidades formadoras de colonias por gramo (cfu/g) de una mezcla 50/50 de bacterias a 2 x 1010, 2 x 108 y 2 x 104 cfu/g con Mannogem EZ (SDM) o Neosorb 20/60 (Neo).

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Todos los pesos, medidas y concentraciones en la presente se miden a 25 °C en la composición en su totalidad, a menos que se especifique de cualquier otra manera. Las partes relevantes de todos los documentos citados se incorporan en la presente como referencia; la mención de cualquier documento no deberá interpretarse como admisión de que el mismo constituye una industria anterior con respecto a la presente invención. A menos que se indique de otra manera, todos los porcentajes de las composiciones referidas en la presente son porcentajes en peso y todas las proporciones son proporciones en peso. A menos que se indique de otra manera, todos los pesos moleculares son pesos moleculares promedios ponderados. Excepto en los casos en que se ofrecen ejemplos específicos de los valores reales medidos, se considera que los valores numéricos citados aquí quedan calificados con el vocablo "aproximadamente". Como se utiliza aquí, la abreviatura "cfu/g" significa "unidades formadoras de colonias por gramo" conforme a la medición con el método proporcionado como parte de European Pharmacopoeial Methods (Métodos de la farmacopea europea), 2003, sección 2.6.12. Como se utiliza aquí, "composiciones de bacterias secas" ¡ncluye composiciones que comprenden menos de 20 % de materiales líquidos a temperatura ambiente, de preferencia menos de 10 %, con más preferencia menos de 8 % y aún con más preferencia menos de 6 % en peso de la composición total. Como se utiliza aquí, "agua ligada" se refiere a las moléculas de agua fuertemente unidas por varios grupos químicos en moléculas más grandes tales como grupos carboxilo, hidroxilo y amino. La presente invención proporciona composiciones bacterianas secas con una actividad de agua (una medida de la capacidad del agua ligada para desorberse de la molécula) de hasta 0.5. De preferencia, la actividad de agua de las composiciones de la presente ¡nvención es menor que 0.4, con más preferencia menor que 0.25 y aún con más preferencia menor que 0.15. Con mayor preferencia, la actividad de agua de las composiciones de conformidad con la presente invención es menor que 0.1. La actividad de agua puede determinarse por medio de métodos conocidos por los expertos en la industria. En la presente, la actividad de agua se determina con un medidor de actividad de agua NovaSina TH200 a 25 °C. En síntesis, el medidor se calibra con sales de calibración. La temperatura de la muestra que se medirá se equilibra en el medidor y luego se determina la actividad de agua como el porcentaje de humedad relativa (%RH) dividido entre 100 después de alcanzar el equilibrio (típicamente de 10 a 20 minutos). Se ha descubierto que la estabilidad de las composiciones bacterianas secas puede mejorar si se reduce la actividad de agua de esas composiciones. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se ha descubierto sorprendentemente que la actividad de agua de las composiciones de la presente ¡nvención puede reducirse, y por lo tanto puede aumentar la estabilidad de la composición si se incrementa la concentración (cantidad de células viables) del concentrado de bacterias secas y la proporción (en peso de composición total) del concentrado de bacterias secas en la composición con respecto a otros constituyentes. Nuevamente, sin limitaciones teóricas, se considera que cuando las composiciones de la presente invención se combinan con un estabilizador de bajo contenido de agua y de baja actividad de agua, el contenido total de agua de esas composiciones es menor, y el agua presente en la composición está ligada fuertemente a las moléculas de su portador. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se considera que el concentrado de bacterias secas puede visualizarse como un sólido amorfo cuya temperatura de transición vitrea (Tg) afecta la estabilidad del sistema. La Tg determina la transición de fase de una composición desde la fase tipo vitrea, sólida y cinéticamente estable hasta un estado líquido/gomoso y termodinámicamente estable. Para obtener la estabilidad durante el almacenamiento se prefiere la fase cinéticamente estable (es decir, la fase vitrea), ya que los índices de reacción y difusión son mucho menores que en la fase líquida/gomosa. Además, se ha determinado que las moléculas de agua ligada se desorben con mayor facilidad y son usadas en el metabolismo bioquímico en el estado líquido/gomoso. La actividad y el contenido de agua de un sistema impacta inversamente en la Tg; cuanto mayor es la actividad o el contenido de agua, menor es la Tg. Por ello, al disminuir la actividad o el contenido de agua del sistema, la Tg aumenta y también aumenta la estabilidad del sistema. Por ello, el suministro controlado del concentrado de bacterias secas y de cualquier material de carga a la actividad total del agua, y por ello a la Tg de la composición puede mejorar la estabilidad de la composición total. Sorprendentemente, se ha descubierto que las bacterias secas tienen una baja actividad de agua. Por ello, se ha descubierto que al usar un nivel alto (es decir, al menos 10 % en peso de la composición de bacterias secas) del concentrado bacteriano seco, en donde ese concentrado tiene una concentración alta de bacterias (al menos 1 x 108 cfu/g), las composiciones se estabilizan ya que se mantiene el bajo contenido de agua y la baja actividad de agua en comparación con las composiciones que comprenden una cantidad menor de concentrado bacteriano seco, o concentrados cuyos recuentos de bacterias son menores. Además, la composición total de bacterias secas que comprende el concentrado de bacterias secas preferentemente es anhidra. Como se utiliza aquí, "anhidro" significa que la composición tiene un contenido de agua de hasta 20 %. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se considera que junto con la baja actividad de agua, las composiciones bacterianas secas de la presente invención cuyo contenido de agua es de hasta 20 % tienen una mayor estabilidad debido al nivel bajo de agua disponible en la composición y a que el agua presente en la composición está fuertemente unida a las moléculas de su portador. El contenido de agua puede determinarse por métodos conocidos por los expertos en la industria. En la presente, el contenido de agua se determina con un analizador gravimétrico térmico TGA Thermal Gravimetric Analyser de TA Instruments y su software asociado. El método del analizador se establece de manera tal que se equilibre a temperatura ambiente (25 °C) seguido de un aumento lineal de la rampa de temperatura a 20 °C por minuto hasta obtener una temperatura final de 105 °C, seguido de un intervalo de espera de 20 minutos a 105 °C. Los datos son analizados por medio del programa de análisis entregado con el analizador, y el contenido de agua de la muestra se determina como un porcentaje de la masa de la muestra. Con más preferencia, las composiciones bacterianas secas de la presente invención tienen un contenido menor que 10 % y aún con más preferencia menor que 8 %. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se considera que al usar un nivel alto de concentrado bacteriano seco, ese concentrado puede actuar como un receptáculo grande para unir el agua que está disponible en la composición. De ese modo, el agua de la composición se dispersa a través del nivel alto de concentrado de bacterias secas sin reducir la Tg de la composición lo suficiente como para pasar al estado líquido/gomoso menos estable a la temperatura de almacenamiento, y manteniendo así la estabilidad de la composición. Las composiciones de la presente invención comprenden al menos 10 % en peso de la composición total de un concentrado de bacterias secas, de preferencia al menos 30 % y con más preferencia al menos 50 %. Como se utiliza aquí, el término "concentrado de bacterias secas" incluye cultivos de fermentación de bacterias que han sido concentradas por procesos tales como centrifugación, secado por congelamiento, secado por aspersión o combinaciones de éstos; los procesos son usados por los expertos en la industria para producir un producto bacteriano concentrado seco que contiene una gran cantidad de células bacterianas que pueden añadirse en la composición de la presente invención. El concentrado de bacterias secas comprende una concentración de bacterias de al menos 1 x108 cfu/g, de preferencia de 1 x108 a 1 x 1014 cfu/g y con más preferencia de 1 x 1010 a 1 x 1014 cfu/g antes de su adición en la composición de la presente ¡nvención. Las bacterias presentes en el concentrado bacteriano seco pueden ser cultivos de bacterias viables (es decir, "vivas") o muertas. De preferencia, las bacterias del concentrado son viables. Como se utiliza aquí, el término "viable" significa que al menos 50 % de las bacterias presentes pueden formar colonias al usar métodos estándar en placa conocidos por los expertos en la industria, de preferencia al menos 60 %, con más preferencia al menos 75 % y aún con más preferencia al menos 90 %. Para determinar el nivel del concentrado de bacterias secas y la concentración de bacterias en el mismo pueden emplearse métodos conocidos por los expertos en la industria. Por ejemplo, para determinar la cantidad del concentrado bacteriano seco presente en una composición de bacterias secas, la composición podría disolverse mezclándola en un volumen determinado de un diluyente adecuado tal como salina amortiguada con fosfato. En una dilución adecuada puede realizarse una evaluación microscópica inicial para evaluar el estado del material. Pueden usarse técnicas de enumeración bacteriana conocidas por los expertos en la industria tales como el método de recuento en placa estándar, técnicas fluorescentes tales como citometría de flujo y el método de recuento D, la enumeración del contador Neubauer (de cualquier otra forma conocido como hemocitómetro) junto con técnicas de tinción tales como cristal violeta o microscopía de contraste de fases. Las proporciones relativas del concentrado de bacterias secas a otros materiales presentes en la composición bacteriana seca pueden evaluarse al restar la masa de excipiente, estabilizador u otros materiales del peso seco total de la composición. Esos materiales (es decir, el concentrado de bacterias no secas) pueden separarse por diversas técnicas conocidas por los expertos en la industria. Por ejemplo, los materiales solubles se pueden disolver y luego se pueden filtrar o centrifugar, y posteriormente se seca el sobrenadante y se pesa la masa seca. Los materiales insolubles pueden separarse por medio de la técnica de centrifugación de gradiente de densidad conocida por los expertos en la industria. En función de la formulación, el experto elegirá los métodos para determinar en forma correcta y precisa la concentración y el nivel del concentrado de bacterias secas presente en la composición. El concentrado de bacterias secas puede comprender otros materiales tales como nutrientes, excreciones bacterianas y otros materiales solubles presentes en los cultivos de fermentación de las bacterias antes del secado. De preferencia, la concentración de estos materiales es de hasta 20 % y con más preferencia de hasta 10 % en peso del concentrado de bacterias secas. Además, con el objeto de aumentar la concentración de bacterias en el concentrado bacteriano seco, el medio de crecimiento que contiene las bacterias puede centrifugarse o filtrarse antes del secado para separar las bacterias del medio. Al extraer la mayor parte del líquido antes del secado se elimina la mayoría de los nutrientes y materiales solubles, y por ello éstos no estarán presentes en el concentrado de bacterias secas. Convenientemente, esto se realiza para aumentar la proporción relativa de bacterias en el concentrado y también para evitar la contaminación excesiva del concentrado de bacterias secas con cualquier toxina bacteriana u otros materiales de ese tipo que pueden no ser aptos para el consumo por parte de los mamíferos. Las bacterias pueden desarrollarse como un cultivo puro (una cepa) o como un cultivo mixto (varias cepas) de la bacteria deseada en un medio líquido que permite el crecimiento adecuado del cultivo o de los cultivos correspondientes. Ese medio puede estar compuesto de proteínas o fracciones de proteínas, de diversos carbohidratos fermentables, estimulantes del crecimiento, sales inorgánicas, amortiguadores, etc.; o el medio puede ser leche entera estéril, leche descremada, suero, u otros sustratos naturales, o combinaciones de éstos. Después de la inoculación, se espera hasta que el cultivo se desarrolle en condiciones de tiempo y temperatura de incubación generalmente optimizadas. El tiempo de incubación puede variar de 4 a 48 horas y la temperatura puede variar de 15 °C a 50 °C en función del organismo o de los organismos que se desarrollan. También puede ser conveniente controlar el pH y el oxígeno disuelto. Una vez que se obtuvo el crecimiento deseado, el cultivo se enfría en su medio de crecimiento hasta una temperatura de 0 °C a 15 °C.

En general, el método usado para obtener un concentrado de bacterias secas se realiza conforme a procedimientos conocidos para el cultivo de esas bacterias. Después de obtener una población bacteriana satisfactoria en un medio de crecimiento adecuado, el pH del caldo puede ser menor que el deseado para preparar un producto seco. Típicamente, el pH final variará de 4.4 a 5.4. Antes de secar el caldo de fermentación es conveniente añadir un reactivo alcalino tal como hidróxido de sodio para aumentar el pH de manera tal que ese pH sea adecuado para la estabilidad de las bacterias. En general, como ya se conocía, es conveniente aumentar el pH hasta el pH neutro (pH 7); el pH se ajusta al menos hasta pH 5.8. Puede usarse cualquier materiai alcalino compatible con los alimentos [NaOH, KOH, NH4 OH, Ca(OH)2, etc.]. De preferencia, el pH se ajusta hasta aproximadamente 6.0 a 6.5. En forma de ejemplo específico, para aumentar el pH puede añadirse hidróxido de sodio hasta obtener un pH de aproximadamente 6.2. Cuando se incorporan otros aditivos en el medio de crecimiento para afectar el pH, tales como los potenciadores de estabilidad de esta invención, el pH puede ajustarse al final si es conveniente. Cuando el concentrado bacteriano se seca por medio de secado por congelamiento, puede ser conveniente incorporar un crioprotector en el cultivo de fermentación antes del secado. Los crioprotectores adecuados conocidos incluyen inositol, sorbitol, manitol, glucosa, sacarosa, jarabe de maíz, DMSO, almidones y almidones modificados de todos los tipos, PVP, maltosa, u otros mono y disacáridos. El nivel de adición puede variar de 1.0 a 300 gramos por litro de cultivo en función del agente específico. Debería utilizarse una cantidad eficaz para minimizar el daño de las células al congelar. Además, el concentrado de bacterias secas debe secarse lo suficiente para reducir el contenido de agua hasta menos de 20 %, de preferencia menos de 10 %, con más preferencia menos de 8 % y aún con más preferencia menos de 6 %. Es conveniente seleccionar un crioprotector de modo que la actividad de agua del concentrado de bacterias secas sea reducida, de preferencia menos de 0.5. Cuando se emplea un método de secado diferente tal como un procedimiento de secado por calor no se usa el crioprotector, y en general puede usarse cualquiera de los diversos procedimientos de secado de bacterias o materiales biológicos útiles para un polvo. Estos procedimientos incluyen secado por congelamiento, secado por aspersión, secado con rodillos y/o secado en bandejas de vacío. En la práctica de la presente ¡nvención, los procedimientos de secado preferidos son el secado por congelamiento o secado por aspersión. El concentrado de bacterias secas puede comprender cualquier familia, género, especie o cepa de bacterias que no sea perjudicial para un animal cuando éste consume ese concentrado por vía oral, de preferencia cepas bacterianas no perjudiciales, de preferencia un probiótico que no es perjudicial después de que los mamíferos lo consumen por vía oral, con más preferencia después que los seres humanos o mascotas lo consumen por vía oral. Como se indicó anteriormente, las bacterias pueden producir toxinas y otras moléculas que pueden ser perjudiciales para los mamíferos, especialmente para los seres humanos. Mientras que cualquier bacteria puede estabilizarse en la composición de la presente invención, la composición preferentemente es adecuada para que los mamíferos la consuman. De preferencia, las bacterias comprenden bacterias de ácido láctico. Los ejemplos no restrictivos de bacterias de ácido láctico adecuadas para usar en la presente incluyen las cepas de Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris, Streptococcus diacetylactis, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus bulgaricus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus bifidus, Lactobacillus casei, Lactobacillus lactis, Lactobacillus plantarum, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus delbruekii, Lactobacillus thermophilus, Lactobacillus fermenta, Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium longum, Bifidobacterium infantis, Bifidobacterium bifidum, y Pediococcus cerevisiae, o mezclas de éstas, de preferencia Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium infantis, o mezclas de éstas. Como un ejemplo no restrictivo se prefieren las cepas de Bifidobacteríum aisladas del tracto gastrointestinal humano reseccionado y lavado como se describe en WO 00/42168. En especial se prefiere la cepa de Bifidobacterium infantis designada como UCC35624, descrita tal como se depositaron en National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB) (Colección nacional de bacterias industriales y marinas) el 13 de enero de 1999, y a la que se asignó el número de acceso NCIMB 41003. Como otro ejemplo no restrictivo se prefieren las cepas de Lactobacillus salivarius aisladas dei tracto gastrointestinal humano reseccionado y lavado como se describió en el documento WO 98/35014. En especial se prefieren las cepas de Lactobacillus salivarius designadas como UCC 1 y UCC 118, descritas tal como se depositaron en National Collections of Industrial and Marine Bacteria Ltd (NCIMB) (Colección nacional de bacterias industriales y marinas) el 27 de noviembre de 1996, y a las que se asignaron los números de acceso NCIMB 40830 y 40829, respectivamente. Componentes opcionales Las composiciones bacterianas secas de la presente invención también pueden comprender un estabilizador. De preferencia, la composición de bacterias secas comprende una combinación de niveles altos de concentrado de bacterias secas y un estabilizador de bajo contenido de agua y de baja actividad de agua; la Tg total del sistema se mantiene lo más alta posible y de ese modo hace que la composición sea más estable. Los estabilizadores son útiles en la presente ¡nvención como cargas o agentes de carga estabilizantes que no aumentan la actividad o el contenido de agua del sistema lo suficiente como para reducir la estabilidad del mismo. De preferencia, el estabilizador de la presente invención comprende un material o materiales que tienen una actividad de agua de menor que 0.5 cuando el contenido de agua es de 10 %. De preferencia, el estabilizador tiene una actividad de agua menor que 0.4, con más preferencia menor que 0.25 y aún con más preferencia menor que 0.15. De preferencia, el contenido de agua del estabilizador es menor que 10 %, con más preferencia menor que 8 % y aún con más preferencia menor que 6 %. Cuando la composición se va a encapsular, el estabilizador preferentemente tiene una actividad de agua menor que 0.4 y con más preferencia menor que 0.15, y un contenido de agua menor que 8 %, con más preferencia menor que 6 %. Sin limitaciones teóricas de ninguna especie, se cree que esto es así porque el proceso de encapsulación puede introducir más agua en la composición, cuando se compara con la composición a granel seca individual, y por ello la composición antes de la encapsulación debe estar lo más seca posible. Las composiciones de la presente invención preferentemente comprenden de 1 % a 90 % de estabilizador en peso de la composición, con más preferencia de 10 % a 70 % de estabilizador, aún con más preferencia de 20 % a 50 % de estabilizador. El estabilizador de la presente invención puede comprender cualquier material cuyo contenido de agua y actividad de agua concuerdan con lo definido anteriormente. De preferencia, el estabilizador es un sólido capaz de fluir. "Sólido capaz de fluir" se refiere a un material sólido particulado cuyo índice de Carr es menor que 20 %, de preferencia menor que 15 %. Como se utiliza aquí, el índice de Carr se determina por medio del método ASTM D6393-99; "Método de prueba estándar para la caracterización de sólidos a granel por medio de índices de Carr" (2002). De preferencia, al menos un estabilizador se selecciona del grupo que comprende polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos, materiales a base de celulosa, polioles, alcoholes polihídricos, sílices, zeolitas, arcillas, alúminas, almidones, azúcares, o mezclas de éstos, con más preferencia polisacáridos, oligosacáridos, materiales a base de celulosa, sílices, zeolitas, arcillas, alúminas, almidones, azúcares, o mezclas de éstos. Aún con más preferencia, al menos un estabilizador se selecciona del grupo que comprende polisacáridos, materiales a base de celulosa, almidones, o mezclas de éstos. Los ejemplos no restrictivos de materiales adecuados para usar en la presente invención se exponen en el Cuadro 1.

Cuadro 1: ejemplos no restrictivos de materiales adecuados para usarse como estabilizador en las composiciones de la presente invención. De preferencia, cuando el contenido de agua es de 10 % el estabilizador tiene una temperatura de transición vitrea (Tg) de más de -0.15 °C, de preferencia mayor que 15 °C y con más preferencia mayor que 20 °C. Como se utiliza aquí, la temperatura de transición vitrea se determina con el método ASTM E1356-98 "Standard Test Method for Assignment of the Glass Transition Temperatures by Differential Scanning Calorimetry or Differential Thermal Analysis" (Métodos de prueba estándar para asignar temperaturas de transición vitrea por medio de calorimetría diferencial de barrido o análisis térmico diferencial) (2003). Con referencia a la Figura 1 puede observarse que con el paso del tiempo la concentración inicial del concentrado de bacterias secas impacta fuertemente en la estabilidad de la composición seca a temperatura ambiente (25 °C). La estabilidad durante el almacenamiento de las composiciones que comprenden 50 % de un concentrado de bacterias secas de 1 x 104 cfu/g es muy limitada cuando se compara con la estabilidad de las composiciones que comprenden 50 % de un concentrado de bacterias secas de 1 x 108 o de 1 x 1010. Además, el efecto de la actividad y contenido de agua del estabilizador se demuestra en forma evidente por medio de los datos de estabilidad. El mannogem EZ (SDM) tiene una actividad de agua de 0.36 y un contenido de agua de hasta 0.5 %, en comparación con la actividad de agua y el contenido de agua del Neosorb 20/60 (0.39 y hasta 2.0 % respectivamente). Las composiciones de la presente invención pueden estar empaquetadas. Si es necesario agregar un estabilizador en la composición, éste puede añadirse en cualquier momento durante el procesamiento, antes del empaquetado. El estabilizador puede añadirse en el caldo de fermentación antes del secado o puede mezclarse con el concentrado bacteriano seco tal como un polvo, después de lo cual la composición se empaqueta. Cuando el estabilizador se añade en el caldo de fermentación bacteriana, éste puede añadirse durante la fermentación, inmediatamente antes del secado o después de un proceso de concentración tal como centrifugación, o en varias de estas etapas del procesamiento. De preferencia, el estabilizador se mezcla seco como un polvo con el concentrado bacteriano seco. Cuando la composición de bacterias secas está empaquetada, la composición puede estar en forma de polvo a granel envasada en envases cerrados tales como tarros o sachets, o puede encapsularse por medio de métodos conocidos por los expertos en la industria. Cuando la composición está encapsulada, el recubrimiento preferentemente comprende materiales de bajo contenido de agua. Los ejemplos no restrictivos de materiales de encapsulación adecuados ¡ncluyen hidroxipropilmetilcelulosa, gelatina, almidones, alginatos o mezclas de éstos, de preferencia hidroxipropilmetilcelulosa. Los tipos y métodos de encapsulación son muy conocidos por los expertos en la industria. Otros métodos se describen en la solicitud copendiente de patente de los EE.UU. número 10/263516. Las composiciones de la presente invención pueden independientemente comprender compuestos opcionales que mejoran su rendimiento. Por ejemplo en las composiciones de la presente pueden incluirse de manera opcional una o más vitaminas, enzimas, plastificantes, agentes colorantes, agentes saborizantes, edulcorantes, antioxidantes, agentes amortiguadores, auxiliares de deslizamiento, otros excipientes, y lo similar. Los ejemplos no limitantes de componentes opcionales se ofrecen a continuación.

Un ingrediente opcional adecuado para usar en la presente ¡ncluye vitaminas. Es posible utilizar por ejemplo vitamina A, vitamina B-i, vitamina B2, vitamina B6, vitamina B-?2, niacina, ácido fólico, biotina, vitamina C, vitamina D, vitamina E, vitamina K, y mezclas de éstos. Las vitaminas solubles en grasa, por ejemplo beta-caroteno y otras fuentes de vitamina A pueden incluirse especialmente debido a su sensibilidad a la humedad. Las vitaminas C, E, y mezclas de éstas son particularmente útiles. Otro ejemplo de componentes opcionales ¡ncluye una o más enzimas. Por ejemplo es posible utilizar una enzima proteolítica (por ejemplo pancreatina). Es posible incorporar en las composiciones uno o más pigmentos u otros agentes colorantes adecuados, tales como tintes y lacas Pueden usarse los tintes US FD&C (por ejemplo amarillo número 5, azul número 2, rojo número 40) y / o lacas US FD&C. Las lacas que se prefieren para usar en la presente invención incluyen por ejemplo la laca roja 40, amarilla número 6, azul 1 , y lo similar. Adicionalmente, es posible utilizar una mezcla de tintes US FD&C y/o lacas US FD&C en combinación con otros alimentos y colorantes de alimentos convencionales. Otros agentes que pueden utilizarse son por ejemplo riboflavina y ß-caroteno. Además es posible utilizar otros agentes colorantes naturales incluyendo por ejemplo extractos de fruta, vegetales, y/o plantas como uva, grosella negra, aronia, zanahoria, remolacha, repollo colorado, y flor de Jamaica. La cantidad de agente utilizado podrá variar en base a los agentes usados y la consistencia o intensidad que se desee de la composición terminada. Por lo general, todo esto lo decidirá un experto en la industria. En las composiciones de la presente ¡nvención pueden incorporarse uno o más agentes saborizantes para mejorar sus cualidades de sabor. En la presente invención puede usarse cualquier agente saborizante natural o sintético. Como se utilizan aquí, esos saborizantes pueden ser sintéticos o naturales. Por ejemplo, en la presente es posible usar uno o más saborizantes botánicos y/o frutales. Los saborizantes de frutas especialmente preferidos son sabores exóticos y lactónicos tales como sabores de granada china, mango, piña, cupuacu, guayava, cacao, papaya, melocotón, y chabacano. Además de estos sabores es posible usar otros sabores frutales diversos tales como sabores de manzana, cítricos, uva, frambuesa, arándano, cereza, toronja, y lo similar. Estos sabores frutales pueden derivarse de fuentes naturales tales como jugos de fruta y aceites saborizantes, o pueden prepararse sintéticamente. La cantidad de agente saborizante utilizada variará en función de los agentes usados y de la intensidad o características deseadas para la composición final. Por lo general, todo esto lo decidirá un experto en la industria. Es posible ¡ncluir en la presente uno o más edulcorantes, ¡ncluyendo por ejemplo edulcorantes de carbohidrato y edulcorantes naturales y/o artificiales sin calorías o bajos en calorías. Por ejemplo, las composiciones de la presente invención pueden endulzarse con cualquiera de los edulcorantes de carbohidratos, con preferencia monosacáridos y/o disacáridos. Los edulcorantes de azúcar preferidos para utilizar en las composiciones de la presente invención ¡ncluyen la sacarosa, fructosa, glucosa, maltosa, y mezclas de éstos. Es posible usar uno o más edulcorantes de alta intensidad. Es posible usar por ejemplo uno o más de los siguientes edulcorantes: sacarina, ciclamatos, edulcorantes de alquiloésteres de bajo peso molecular L-aspartil-L-fenilalanina (por ejemplo, aspartame); L-aspartil-D-alaninamidas descritas en la patente de los EE.UU. núm. 4,411 ,925; L-aspartil-D-serinamidas descritas en la patente de los EE.UU. núm. 4,399,163; edulcorantes de L-aspartil-L-1-hidroximetilalcanoamida descritos en la patente de los EE.UU. núm. 4,338,346; edulcorantes de L-aspartil-1-hidroxietilalcanoamida descritos en la patente de los EE.UU. núm. 4,423,029; edulcorantes de éster y amida de L-aspartil-D-fenilglicina descritos en la solicitud de patente europea 168,112; edulcorantes de 1 -metiléster de N-[N-3,3-dimetilbut¡l)-L-alfa-aspartil]-L-fenilalanina descritos en WO 99/30576; taumatina; dihidrochalconas; ciclamatos; esteviósidos; glicirrizinas, alcoxi aromáticos sintéticos; sucralosa; suosan; miraculina; monelina; sorbitol, xilitol; talina; ciclohexilsuífamatos; imidazolinas sustituidas; ácidos sulfámicos sintéticos tales como acesulfame, acesulfame K y ácidos sulfámicos n-sustituidos; oximas tales como perilartina; péptidos tales como malonatos de aspartilo y ácidos sucanílicos; dipéptidos; edulcorantes a base de aminoácidos tales como gem-diaminoalcanos, ácido mefa-aminobenzoico, alcano del ácido L-aminodicarboxílico, y amidas de algunos ácidos alfa-aminodicarboxílicos y gem-diaminas; y carboxilatos alifáticos o carboxilatos aromáticos heterocíclicos de 3-hidroxi-4-alquiloxifenilo; eritritol; y mezclas de éstos. El aspartame es particularmente preferido. La cantidad de edulcorante usado podrá variar en base a los agentes usados y la consistencia o intensidad que se desee de la composición terminada. Por lo general, todo esto lo decidirá un experto en la industria. Es posible usar uno o más anti oxidantes en las composiciones de la presente invención. Es posible usar anti oxidantes naturales y sintéticos. Ejemplos no restrictivos de anti oxidantes ¡ncluyen los tocoferoles (por ejemplo vitamina E), ácido ascórbico (por ejemplo vitamina C), vitamina A (por ejemplo beta-caroteno), extracto de semilla de uva, selenio, y coenzima Q10. Algunos ejemplos no restrictivos de anti oxidantes sintéticos incluyen hidroxitolueno butilado (BHT), Hidroxianisol butilado (BHA), y el ácido gálico de prenilo. Otros ejemplos no restrictivos de componentes opcionales útiles en las composiciones de la presente invención incluyen diclofenaco, naproxeno, aspirina, indometacina, omeprazol, glicósidos cardíacos, preparaciones de electrólitos con sales de sodio, potasio, o magnesio y preparaciones de calcio y hierro, preparaciones de bisacodil, ácido valproico, 5-ASA, esteroides tales como hidrocortisona, budesonida, laxantes, octreotida, cisaprida, anticolinérgicos, bloqueantes del canal de calcio, antagonistas de 5HT3 tales como ondansetrón y péptidos tales como insulina. Los ejemplos no restrictivos de excipientes incluyen edulcorantes (tal como se describen más adelante); agentes saborizantes y/o colorantes (tal como se describen más adelante), lubricantes sólidos como ácido esteárico y estearato de magnesio; sulfato de calcio; aceites vegetales como aceite de cacahuate, aceite de semilla de algodón, aceite de ajonjolí, aceite de oliva, aceite de maíz y aceite de teobroma; emulsionantes tales como TWEENS; agentes humectantes tales como lauriisulfato de sodio; agentes para formar tabletas tales como aglutinantes, antioxidantes; y conservadores. Método de fabricación Debido a la sensibilidad de las composiciones de la presente invención a los niveles de agua y oxígeno, los niveles de estos materiales preferentemente se controlan durante el proceso de fabricación. En tal sentido, se ha descubierto que la atmósfera bajo la cual las composiciones de la presente invención se secan, muelen, mezclan y envasan preferentemente debería tener una humedad relativa (RH) menor que 50 %, de preferencia menor que 40 % y con más preferencia menor que 36 %. Además, las composiciones preferentemente se preparan en una atmósfera de poco oxígeno. Como se utiliza aquí una "atmósfera de poco oxígeno" ¡ncluye atmósferas que comprenden menos de 10 % de oxígeno, de preferencia menos de 8 % de oxígeno. Las atmósferas de bajo oxígeno pueden generarse usando una atmósfera inerte tal como nitrógeno para desplazar el oxígeno presente en la composición final. Es conveniente que la atmósfera sea de bajo oxígeno ya que cualquier nivel de oxígeno presente en las composiciones puede producir la degradación oxidativa y la pérdida posterior de viabilidad bacteriana de modo que la composición se contamina o se arruina.

Además, puede ser conveniente preacondicionar estabilizadores comercialmente disponibles para reducir su contenido de agua todavía más, antes del mezclado con las bacterias. Los ejemplos no restrictivos de los métodos para obtener esa reducción ¡ncluyen el secado en horno a presión reducida (vacío), secado por congelamiento, eliminación de agua por medio de desecantes, y secado en lecho fluidizado. Método de uso Las composiciones de la presente invención son útiles para tratamientos profilácticos, terapéuticos o no terapéuticos destinados a aliviar enfermedades y condiciones que afectan a los animales, de preferencia a los mamíferos, de preferencia a los seres humanos. Los elementos no restrictivos de la fisiología y salud del animal que se benefician, ya sea al aliviar terapéuticamente los síntomas de la enfermedad o al servir como prevención de la misma por medio de profilaxis incluyen desórdenes inflamatorios, inmunodeficiencia, inflamación intestinal, síndrome de intestino irritable, cáncer (en particular cáncer de los sistemas gastrointestinal e inmune), diarrea, diarrea asociada a antibióticos, apendicitis, desórdenes de autoinmunidad, esclerosis múltiple, enfermedad de Alzheimer, artritis reumatoide, diabetes mellitus, infecciones bacterianas, infecciones virales, infecciones fúngicas, enfermedad periodontal, enfermedad urogenital, trauma asociado a cirugía, enfermedad metastásica inducida por cirugía, sepsis, pérdida de peso, anorexia, control de fiebre, caquexia, cicatrización de heridas, úlceras, infección de barrera intestinal, alergia, asma, desórdenes respiratorios, desórdenes circulatorios, cardiopatía coronaria, anemia, desórdenes del sistema de coagulación sanguínea, enfermedad renal, desórdenes del sistema nervioso central, hepatopatía, isquemia, desórdenes nutricionales, osteoporosis, desórdenes endocrinológicos y desórdenes epidérmicos. De preferencia, se beneficia el tratamiento del tracto gastrointestinal, incluido el tratamiento o prevención de diarrea; regulación del sistema inmune, de preferencia el tratamiento o prevención de inflamación y enfermedad autoinmunitaria; mantenimiento o mejoramiento de la salud de la piel, de preferencia el tratamiento o prevención de enfermedad atópica de la piel; disminución o mejoramiento de los efectos del envejecimiento; ¡ncluyendo alerta mental y niveles de actividad; y prevención de pérdida de peso durante y después de una infección. Las enfermedades de diarrea pueden estar asociadas a la actividad gastrointestinal inflamatoria. Típicamente, las composiciones de la presente invención se suministran a una persona como parte de un régimen de dosis. El régimen de dosis depende del formato de dosificación en el cual se incorpora la composición de bacterias secas. Las formas de dosis unitarias han sido descritas anteriormente como una cápsula o sachet. Típicamente, la dosis unitaria proporciona a la persona bacterias con un nivel de 1 x 105 cfu por dosis a 1 x 1015 cfu por dosis, de preferencia de 1 x107 cfu a 1 x1014 cfu por dosis. La dosis unitaria puede tragarse directamente cuando se proporciona en forma de cápsula. Cuando se proporciona como un sachet cargado con la composición de bacterias secas, el polvo puede ingerirse directamente o mezclarse con leche, yoghurt, u otros materiales portadores líquidos. Típicamente, las cápsulas pueden proporcionar cantidades de dosificación menores que los sachets, ya que el tamaño de la cápsula y su facilidad relativa de ingestión limitarán la cantidad de composición de bacterias secas que puede cargarse en ella. De preferencia, el individuo ingiere la dosis unitaria por lo menos una vez al mes, de preferencia por lo menos una vez a la semana y con más preferencia por lo menos una vez al día.

Ejemplos: Los siguientes ejemplos describen y demuestran aún más las modalidades que están dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos se presentan para fines de ilustración y no deben interpretarse como limitaciones de la presente invención. Donde sea aplicable, los ingredientes se presentan en su denominación CTFA.

Los ejemplos anteriores son composiciones de bacterias secas preparadas de conformidad con el procedimiento siguiente. Todas las operaciones se realizan en un ambiente de humedad controlada en el cual la RH se mantiene entre 30 y 36 %. La cantidad apropiada de bacterias secadas por congelamiento (preconcentradas hasta el CFU/g deseado) se añade a la cavidad de mezclado de un mezclador Pharmatech junto con la cantidad apropiada de un estabilizador tal como celulosa microcristalina, almidón de papa o lo similar. Las bacterias y los estabilizadores se han elegido por su baja actividad de agua y su bajo contenido de agua como también por el tamaño y densidad de partícula similares para permitir un mezclado más eficaz. El espacio vacío dentro de la cavidad de mezclado se limpia con gas nitrógeno seco hasta que los gases del espacio vacío original se reemplazan un total de 10 veces o hasta que la RH dentro de la cavidad de mezclado se reduce hasta menos de 20 %. La cavidad de mezclado luego se sella con una tapa hermética y los polvos se mezclan por 20 minutos a una velocidad de rotación de 6.3 rad/s (60rpm). Una vez finalizado el mezclado, la estabilidad de la mezcla de polvo puede mantenerse si los polvos no quedan expuestos a ambientes de RH alta (más de 36 % de RH) o a ambientes enriquecidos con agua. Los polvos mezclados en seco pueden envasarse en cápsulas de gelatina en un ambiente de nitrógeno/RH baja y almacenarse en recipientes sellados o como polvos secos en sachets o envases. Las cápsulas obtenidas y los polvos contenidos en ellas tienen una mayor estabilidad a largo plazo tanto a bajas temperaturas (4 °C) como a temperatura ambiente (25 °C). En otra modalidad, las composiciones de bacterias secas de los Ejemplos 1 a 8 pueden envasarse en formas de dosis unitarias tales como cápsulas o sachets en un ambiente de nitrógeno/humedad relativa (RH) baja (<36 %). Los Ejemplos 9 a 11 son ejemplos no restrictivos de composiciones de dosis unitarias empaquetadas y envasadas en cápsulas. Las cápsulas se ingieren enteras, como una dosis simple. Los Ejemplos 12 a 14 son ejemplos no restrictivos de composiciones de dosis unitarias envasadas en sachets cuyo recuento de bacterias por dosis es más alto que el correspondiente a las cápsulas.

Aunque modalidades particulares de la presente invención han sido ilustradas y descritas, será evidente para los experimentados en la industria que se pueden hacer diversos cambios y modificaciones sin alejarse del espíritu y alcance de la invención. Se ha pretendido, por consiguiente, incluir en las reivindicaciones anexas todos los cambios y modificaciones dentro del alcance de la ¡nvención.

Claims (27)

REIVINDICACIONES

1. Una composición bacteriana seca que comprende al menos 10 % en peso de la composición total de un concentrado de bacterias secas cuya concentración de bacterias es de al menos 1 x 108 cfu/g, caracterizada porque la composición bacteriana seca final tiene una actividad de agua de hasta 0.5.

2. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , que tiene una actividad de agua menor que 0.4, de preferencia menor que 0.25.

3. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el concentrado bacteriano seco tiene una concentración bacteriana de 1 x 108 cfu/g a 1 x 1014 cfu/g.

4. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , que comprende al menos 30 % del concentrado bacteriano seco.

5. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque las bacterias son viables.

6. La composición' bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , que tiene un contenido total de agua menor que 20 %.

7. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , que además comprende de 1 % a 90 % de un estabilizador.

8. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el estabilizador tiene una actividad de agua menor que 0.5 con un contenido de agua de 10 %.

9. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque el estabilizador tiene una temperatura de transición vitrea mayor que -0.15 °C cuando el contenido de agua es de 10 %.

10. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 7, caracterizada además porque comprende al menos un estabilizador seleccionado del grupo que comprende polisacáridos, oligosacáridos, disacáridos, materiales a base de celulosa, polioles, alcoholes polihídricos, sílices, zeolitas, arcillas, alúminas, almidones, azúcares, y mezclas de éstos

11. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque el concentrado bacteriano seco comprende bacterias de ácido láctico.

12. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 11 , caracterizada además porque las bacterias de ácido láctico comprenden bacterias del género Streptococci, Lactobacillus, Bif idobacteria, y mezclas de éstas.

13. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 12, caracterizada además porque las bacterias de ácido láctico comprenden bacterias de las especies Lactobacillus salivarius, Bifidobacterium infantis, y mezclas de éstas.

14. La composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizada además porque la composición es adecuada para el consumo por parte de los mamíferos.

15. Una composición bacteriana seca envasada que comprende: a) Una composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 ; y b) un envase que comprende la composición bacteriana seca.

16. La composición bacteriana seca envasada de conformidad con la reivindicación 13, caracterizada además porque el envase comprende un sachet o una cápsula.

17. La composición bacteriana seca envasada de conformidad con la reivindicación 16, caracterizada además porque el envase comprende una cápsula.

18. La composición envasada de conformidad con la reivindicación 17, caracterizada además porque la cápsula comprende hidroxilpropilmetilcelulosa, gelatina, almidón, alginatos, o mezclas de éstos.

19. Una composición de dosis unitaria que comprende; i) Una composición bacteriana seca de conformidad con la reivindicación 1 ; y ii) un envase que comprende la composición bacteriana seca; caracterizada además porque la composición de dosis unitaria proporciona de 1 x 105 cfu a 1 x 1015 cfu de bacterias por dosis.

20. Un método para estabilizar una composición bacteriana seca que comprende el paso de proporcionar un concentrado bacteriano seco que tiene una concentración bacteriana de al menos 1 x 108 cfu/g con un nivel de al menos 10 % en peso de la composición bacteriana seca final; la composición bacteriana seca final tiene una actividad de agua menor que 0.5.

21. El método de conformidad con la reivindicación 20, que además comprende el paso de combinar ese concentrado bacteriano seco con un estabilizador que tiene una actividad de agua menor que 0.5 con un contenido de agua de 10 %.

22. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el método comprende la elaboración de la composición en una atmósfera de bajo oxígeno.

23. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el método comprende la elaboración de la composición en una atmósfera cuya humedad relativa es menor que 50 %.

24. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado además porque el concentrado bacteriano seco está secado por congelamiento.

25. Un método para tratar un mamífero que necesita un tratamiento; el método comprende el paso de administrar una composición de conformidad con la reivindicación 19 al mamífero que necesita tratamiento.

26. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque la composición se administra al mamífero al menos una vez al mes.

27. El método de conformidad con la reivindicación 25, caracterizado además porque el mamífero es un ser humano.