MÉTODO PARA EL TRATAMIENTO DE SÍNDROMES DE LA VEJIGA Y DEL TRACTO URINARIO INFERIOR
Campo técnico La presente invención se relaciona con síndromes de la vejiga y del tracto urinario inferior, particularmente, síntomas de irritación, y con un método para tratar los mismos usando antagonistas del receptor Id-adrenérgico (aIdAR) . La invención se refiere además a un método para seleccionar compuestos por su capacidad para servir como antagonistas aIdAR. Antecedentes Los síntomas de las vías urinarias inferiores (SVUI) que resultan de la obstrucción de la salida de la vejiga (OSV) siguen siendo uno de los desórdenes más comúnmente encontrados en uroüogía, y pueden ser secundarios a causas anatómicas fijas y/o funcionales (Steers y colaboradores, Voiding dysfunction: diagnosis, classification, and management, in Adult and Pediatric Urology; Third Edition, J.Y. Gillenwater, y colaboradores, Editors, 1996, Mosby-Year Book. Inc.: St . Louis, páginas 1220-1325) . Las causas de la obstrucción de la salida de la vejiga incluyen agrandamiento prostático (benigno o maligno), contracción del cuello de la vejiga, estrechez uretra], y estrechez meatal (Steers y colaboradores, Voiding dysfunction: diagnosis, classification, and management, in Adult e.nd Pediatric Urology; Third Edition, J.Y. Gillenwater, y colaboradores, Editors, 1996, Mosby-Year Book. Inc.: St . Louis, páginas 1220-1325) . Los síntomas asociados con la obstrucción de la salida de la vejiga típicamente caen en categorías de obstrucción o de irritación: los síntomas de obstrucción incluyen hesitancia, corriente débil, orinación prolongada, y sentimientos de vaciamiento incompleto, mientras que los síntomas de irritación consisten en frecuencia, urgencia, nicturia, y contracciones de la vejiga inestables. La veiiga funcionalmente y anatómicamente se divide en el detrusor (cuerpo y base ventral) y trígono (porción dorsal de la base que se extiende entre los orificios ureterales y el cuello de la vejiga) (Zderic y colaboradores, Voiding function: relevant anatomy, physiology, pharmacology, and molecular aspects, in Adult and Pediatric Urology; Third Edition, J.Y. Gillenwater, y colaboradores, Editors, 1996, Mosby-Year Book, Inc.: St. Louis. Páginas 1159-1219), con distinta histología, histoq ímica, y farmacología. En cambio, la próstata y el trígono tienen suministro vascular similar, inervación, y expresión receptora (Gosling y colaboradores, Detrusor morphoLogy in relation to bladder outflow obstruction and instability, in Benign Prostatic Hypertrophy, F. Hinman, Editor, 1983, Springer-Verlag: Berlin, página 666-71). La fisiología de los síntomas de las vías urinarias inferiores secundarios a la hipertrofia prostática benigna (HPB) tiene dos componentes: (1) un componente estático
£^&^«&»j^g relacionado con el aumento en la masa celular prostática y (2) un componente dinámico relacionado con variaciones en el tono del músculo liso prostático (Caine y colaboradores, Brit . J. Urol. 47:193-202 (1975)). Histológicamente el HPB está caracterizada por hiperplasia glandular epitelial y estromal (fibromuscular) , con este último siendo el factor dominante en la patogénesis de HPB clínicamente significativa (Shapiro y colaborador J. Urol 147:1293-1297 (1992)) Por lo tanto se ha dado mucha atención al papel del sistema nervioso simpático y a los receptores o^-adrenérgico (axAR) en el componente dinámico de la obstrucción de la salida de la vejiga, conduciendo a estudios clínicos de antagonistas de o^AR como sustancias para aliviar la obstrucción de salida. Estos estudios han encontrado que los antagonistas o^AR relajan el músculo liso prostático, aliviando los síntomas de obstrucción (Chapple,
Brit. J. Urol. 1:47-55 (1995), Caine, Urol, Clin, N. Am.
17:641-649 (1990), Kawabe y Niijima, Urol, Ing. 42:280-284
(1987), Lepor y colaboradores, J. Urol. 148:1467-1474 (1992),
Reuther y Aagaard, Urol, Ing. 39:312-313 (1984), Matyus y Horvath, Med. Res. Rev. 17:523-535 (1997)). Además, los antagonistas o^AR se ha encontrado que alivian los síntomas de irritación de la vejiga en hombres (más frecuentemente asociados con HPB) y mujeres (Matyus y Horvath, Med. Res. Rev. 17:523-535 (1997), Seréis y Stein, Neurourol . Urodyn. 17:31-36 (1998) ) . Aunque es lógico asumir que la eliminación de la obstrucción de la salida de la vejiga aliviaría los síntomas de irritación, varios estudios recientes sugieren que la relación entre la irritabilidad de la vejiga y la obstrucción de la salida no es lineal (Caine, Urol. Clin. N. Am. 17:641-649 5 (1990), Chapple y Smith, Brit. J. Urol. 73:117-123 (1994), Steers y De, J. Urol. 140:864-71 (1988), Steers y colaboradores, Am. J. Physiol. 266:R20 (1994)). Los o^AR son miembros de una familia mayor de receptores adrenérgicos acoplados a proteína G que median
10 acciones de las catecolaminas endógenas norepinefrina (NE) y epinefrina, dando como resultado la contracción del músculo liso. Los ADNc que codifican tres distintos o^AR subtipos ( Ia O'ib ai ) han sido clonados, expresados en células, y se ha caracterizado farmacológicamente la proteína resultante
15 (Schwinn y colaboradores, J. Pharmacol, Exper. Ther. 272:134- 142 (1995), Hieble y colaboradores, Pharmacol. Rev. 47:267-70
(1995) ) . Los OíjAR predominan en el trígono de la próstata y la vejiga (Price y colaboradores, J. Urol. 150:546-551 (1993)), y se ha mostrado que son funcionalmente importantes para mediar
20 la contracción del músculo liso de la próstata (Forray y colaboradores, Mol. Pharmacol, 45:703-708 (1994), Lepor y colaboradores, J. Pharmacol. Exper. Ther. 270:722-727 (1994). Además de los tres subtipos de axAR clonados que tienen gran afinidad por el antagonista prazosina, un cuarto tipo de xAR
25 con baja afinidad para la prazosina (?íIL) ha sido postulado
^^^^tóe|ij»sá«g»^^^¿^^^^^^^* (Muramatsu y colaboradores, Brit J. Urol. 74:572-578 1994)). A pesar de la evidencia inicial que sugiere un papel de la 1LAR en la contracción del músculo liso de la próstata humana (Ford y colaboradores, Mol. Pharmacol, 49:209-215 (1996)), datos más 5 recientes sugieren que RS17053 (el compuesto usado en estos estudios) detecta un estado de baja afinidad del alaAR en tejidos en vez de una 1LAR distinta (Ford y colaboradores, Br. J. Pharmacol, 121:1127-1135 (1997)). Ya que los antagonistas o^AR no selectivos actualmente usados para tratar la hipertrofia
10 prostática benigna tienen efectos colaterales indeseables incluyendo ligero dolor de cabeza, mareo, y astenia (Carruthers, Drug Safety 11:12-20 (1994)), muchos investigadores han sugerido que el antagonista selectivo del subtipo alaAR podría ser benéfico para mejorar los síntomas
15 relacionados con la hipertrofia prostática benigna vía aliviar la obstrucción de la salida de la vejiga (Matyus y Horvath, Med. Res. Rev. 17:523-535 (1997), Hieble y Ruffolo, Jr., Exp. Opin. Invest. Drugs 6:367-387 (1997)). Sin embargo, este enfoque no toma en cuenta que los síntomas de irritación pueden
20 persistir a pesar del alivio de la obstrucción de la salida (Hieble y Ruffolo, Jr., Exp. Opin. Invest. Drugs 6:367-387 (1997) ) . Existe muy poca información con respecto al papel de los OíjAR en el detrusor humano. Uno de los pocos estudios que
25 enfocan este problema sugieren que la vejiga humana (domo)
solamente contiene los laAR ( alden y colaboradores, J. Urol. 157:1032-1038 (1997)). Sin embargo, ya que los síntomas de la vejiga con irritación persisten en algunos pacientes a pesar del alivio de la obstrucción de la salida de la vejiga, los antagonistas OíjAR no selectivos pueden aliviar los efectos irritantes de la hipertrofia prostática benigna a través de efectos directos sobre el detrusor de la vejiga o de otros sitios involucrados en la micción. La presente invención es resultado de darse cuenta que el detrusor humano expresa dos subtipos OíjAR ( Id>aIa) . Esta realización hace posible la identificación de los antagonistas selectivos subtipos axAR que se pueden usar para tratar los síntomas de irritación. Sumario de la Invención La presente invención se relaciona en general con los síndromes de la vejiga y de las vías urinarias inferiores, más particularmente, con un método para identificar antagonistas aldAR que se pueden usar para tratar síntomas de irritación. La invención también se relaciona con un método para tratar síntomas de irritación usando estas sustancias. Otros objetos y ventajas de la invención serán aparentes de la descripción detallada que sigue: Breve descripción de los dibujos Las Figuras 1A-1C. Esquemáticos de la ubicación de las sondas de subtipo o^AR. Resaltados en negritas están las regiones de ala (Figura ÍA) , alb (Figura IB) , y ld (Figura 1C) AR codificado por sondas usados en los ensayos de protección de RNasa . Figura 2. Isoterma de enlace de saturación representativa generada usando concentraciones crecientes del 5 antagonista radioetiquetado xAR [125I]HEAT en membranas de detrusor humanas. Kd es 130 ± 1.09 pM (n = 5), similar al reportado para células que expresan establemente cada subtipo axAR humano clonado (Schwinn y colaboradores, J Pharmacol. Exper. Ther. 272:134-142 (1995). ala/dAR de la referencia se
10 refiere al subtipo ldAR descrito en la presente ya que la nomenclatura de axAR usado aquí es la nomenclatura IUPHAR (Hieble y colaboradores, Phar. Rev. 97:267 (1995)). Figura 3. Los ensayos de protección de RNasa que examinan la expresión del subtipo o^AR en el detrusor se
15 realizaron en todos los pacientes (n = 13) . Un ensayo de protección de Rnasa representativo que presenta los resultados de cinco pacientes es mostrado. En este experimento, la sonda radioetiquetada para cada subtipo o^AR se muestra en el extremo izquierdo junto con fragmentos protegidos (de izquierda a
20 derecha) resultantes del ARN extraído de células de fibroblastos de rata-1 estables que expresan cada subtipo xAR humano clonado (20 mg; sonda de centro, positiva) , ARNt de levadura (20 mg; control negativo) y ARN total aislado de detrusor humano (20 mg) de cinco pacientes (franjas 1-5) . Los
25 tiempos de exposición en gel fueron de 24 horas para la sonda
^® ¡* y las franjas de control positivas y 72 horas para el ARNt y las muestras de detrusor humano. Aunque el subtipo ?íldAR de la banda de ARNm es mayor que el fragmento protegido de laAR, la sonda alaAR contiene 73 por ciento más de aUTP radioetiquetada en comparación con la ld; por lo tanto, después de la normalización para la incorporación de etiqueta radioactiva, el predominio de dos veces del subtipo ldAR en el detrusor humano es aparente . Figuras 4A y 4B. Los resultados de experimentos de reacción de cadena de polimerasa - RT en el detrusor humano (Figurai 4A) y ARN de vejiga entera de rata (Figura 4B) . El ADNc específico subtipo axAR en vectores de plásmidos sirvieron como controles positivos. Figura 5. La expresión del subtipo xAR en detrusor humano se determinó usando análisis de competición con el ligando selectivo del subtipo aldAR BMY7378. Los resultados de una curva representativa se muestran demostrando un ajuste de dos sitios con alta afinidad Ki correspondiente al aldAR. Descripción detallada de la invención La presente invención se basa en el reconocimiento de ldAR como el subtipo axAR responsable de síntomas de irritación asociados con enfermedades de la vejiga y de las vías uninarias inferiores. La invención proporciona, en una modalidad, un método para seleccionar antagonistas de ?íldAR y, en otra modalidad, un método para tratar síntomas de irritación usando antagonistas ldAR. (La nomenclatura usada en la presente es la nueva nomenclatura proporcionada en Hieble y colaboradores, Phar. Rev. 97:267 (1995)). El método de tratamiento al cual se relaciona la invención comprende administrar a un paciente que sufre síntomas de irritación una cantidad de un antagonista de ?íldAR suficiente para aliviar estos síntomas. De acuerdo con la invención, los síntomas de irritación incluyen frecuencia de micción, urgencia de micción, nicturia y contracciones de la vejiga inestables. Los pacientes que pueden recibir tratamiento incluyen hombres y mujeres, niños y adultos. En los hombres, un antagonista preferido es tanto una antagonista OíjAR como un antagonista ldAR. En mujeres, los antagonistas preferidos son antagonistas específicos ldAR. La cantidad del antagonista que se va a administrar y el régimen de tratamiento variará con el antagonista, el paciente y el efecto buscado. Dosis óptimas y regímenes, sin embargo, se pueden determinar fácilmente por una persona con la experiencia en la técnica relevante . La presente invención también se relaciona con un método de seleccionar compuestos por su capacidad para enlazairse principalmente con aldAR y mediante esto funcionar, potencialmente, como antagonistas ldAR. Los antagonistas selectivos ?íldAR preferidos muestran cuando menos una selectividad de dos veces por ldAR en relación con alaAR o albAR. Los ensayos de enlace de esta modalidad de la invención incluyen ensayos sin células en las cuales aldAR, una porción de los mismos (por ejemplo una porción de transmembrana relevante -- ver, en general, Hwa y colaboradores, J. Biol. Chem. 5 271:7956 (1996)), se incuba con un compuesto de prueba (proteináceo o no proteináceo) el cual, ventajosamente, lleva una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta radioactiva o fluorescente) . Preparaciones de membranas que llevan ?íldAR se pueden usar en este ensayo, incluyendo preparaciones
10 disponibles comercialmente (por ejemplo, el juego multi- receptor NEN (NET 1034) ) . Después de la incubación, el aldAR, o porción del mismo, libre o pegado al compuesto de prueba, se puede separar del compuesto de prueba no pegado usando cualquiera de una variedad de técnicas (por ejemplo, el aldAR (o
15 porción del mismo) (por ejemplo, asociado con una membrana) se puede pegar a un soporte sólido (por ejemplo, a una placa o columna) y lavar libre de compuesto de prueba no pegado) . La cantidatd de compuesto de prueba pegado a aldAR, o porción del mismo, se determina entonces usando una técnica adecuada para
20 detectetr la etiqueta usada (por ejemplo, conteo de centelleo líquido en el caso de un compuesto de prueba radioetiquetado) . (Ver Schwinn y colaboradores, J. Pharm. Exp. Ther. 272:134 (1995) ) . Ensayos de enlace de esta modalidad también pueden
25 tomar la forma de ensayos de enlace de competición sin célula.
Estos ensayos se pueden llevar a cabo como se describe en los Ejemplos que siguen (ver particularmente el Ejemplo 2 (siendo el compuesto de prueba sustituido por BMY 7378) - ver también Schwinn y colaboradores, J. Pharm. Exp. Ther. 272:134 (1995)). Alternativamente, aldAR, o porción del mismo, se puede incubar con un compuesto que se sabe que interactúa, específicamente, con ?í?dA (por ejemplo, BMY7378) , este compuesto, ventajosamente, lleva una etiqueta detectable (por ejemplo, una etiqueta radioactiva o fluorescente) . Un compuesto de prueba (proteináceo o no proteináceo) se añade a la reacción y se prueba para determinar su capacidad para competir con el compuesto conocido (etiquetado) para enlazarse con aldAR, o porción del mismo. El compuesto conocido libre (etiquetado) se puede separar del compuesto conocido ligado, y la cantidad de compuesto conocido ligado se determina para valorar la capacidad del compuesto de prueba para competir. Este ensayo se puede formatear para facilitar la selección de un gran número de compuestos de prueba enlazando el aldAR, o porción del mismo o, a un soporte sólido de manera que fácilmente se pueda lavar sin reactivos no ligados. aldAR, o porción del mismo, conveniente para su uso en ensayoe: sin células descritos anteriormente se puede aislar a partir de fuentes naturales (por ejemplo, como preparaciones de membranas derivadas de la vejiga, por ejemplo, vejiga humana) o preparar recombinantemente o químicamente. El ?ldAR, o
aa porción del mismo, o se puede preparar como una proteína de fusión usando, por ejemplo, técnicas recombinantes conocidas. Las proteínas de fusión preferidas incluyen una etiqueta HIS, una etiqueta FLAG, una etiqueta GFP u otra etiqueta (fracción) conveniente para su uso en ensayos colorimétricos. Típicamente, la fracción no-aldAR está presente en la proteína de fusión N-terminal al aldAR, o porción del dominio de la misma, pero también puede ser C-terminal. Como se indica anteriormente, la porción aldAR, o porción de la misma, se puede presentar ligada a un soporte sólido,, incluyendo una placa o cuenta de plástico o vidrio, una resina cromatográfica, un filtro o una membrana. Los métodos de unión de proteínas, o membranas que contienen el mismo, estos soportes son muy conocidos en la técnica. Los ensayos de enlace de la invención también incluyen ensayos basados en células en las cuales el aldAR, o porción del mismo, se asocia con la membrana celular de una célula intacta. Células convenientes para su uso en estas pruebas incluyen células que expresan naturalmente aldAR y células que han sido diseñadas técnicamente para expresar, ventaj samente, sobre expresar aldAR (o porción del mismo) . Ventaj samente, las células que expresan aldAR humano se usan. Las células convenientes son preferiblemente células eucarióticas, incluyendo de mamíferos (humanos y no humanos) , células de insectos y células de levadura.
Las células se pueden diseñar técnicamente para expresar aldAR (ventajosamente, aldAR humano o porciones del mismo) introduciendo en un huésped seleccionado (por ejemplo, un huésped eucariótico) una construcción de expresión que comprende una secuencia que codifica aldAR, o porción del mismo, operablemente enlazado a un promotor. Una variedad de vectores y promotores se puede usar. (Ver Schwinn y colaboradores, J. Pharm. Exp. Ther. 272:134 (1995)). La introducción de la construcción en el huésped se puede efectuar usando cualquier variedad de protocolos de transfección/transformación estándares (ver Molecular Biology, A Laboratory Manual , segunda edición, J. Sambrook, E.F. Fritsch y T. Maniatis, Cold Spring Harbor Press, 1989) . Las células así producidas se pueden cultivetr utilizando técnicas de cultivo establecidas convenientes para el huésped implicado. Las condiciones de cultivo se pueden optimizar para asegurar la expresión de la secuencia de codificación de aldAR (o porción de la misma) . Aunque para los ensayos de enlace basados en células es apropiado que el aldAR (o porción del mismo) se asocie con la membrana celular, para otros propósitos el producto de la expresión se puede secretar en el medio de cultivo o estar presente en el citoplasma de la célula. En los ensayos de enlace basados en células de la invención se pueden llevar a cabo esencialmente como se describe anteriormente con respecto a los ensayos sin células.
á&maáj .
Ventajosamente, la célula usada expresa predominantemente el subtipo aldAR. A manera de ejemplo, el ensayo de enlace basado en célula se puede llevar a cabo añadiendo compuesto de prueba (venta osamente, que lleva una etiqueta detectable (por ejemplo, radioactivo o fluorescente) ) , al medio en el cual las células que expresan aldAR (o porción del mismo) se cultivan, incubando el compuesto de prueba con las células bajo condiciones favorables para enlazar y luego remover el compuesto de prueba no enlazado y determinar la cantidad del compuesto de prueba asociado con las células. Como en el caso de los ensayos sin células, los ensayos basados en células también pueden tomar la forma de ensayos de competición, como se describió anteriormente. Por ejemplo, un compuesto conocido por enlazar ?íldAR (y preferiblemente etiquetado con una etiqueta detectable) se puede incubar con células que expresan aldAR (o porción del mismo) en presencia y ausencia de compuesto de prueba. La afinidcid de un compuesto de prueba para aldAR se puede valorar determinando la cantidad de compuesto desconocido asociado con las células incubadas en presencia del compuesto de prueba, en comparación con la cantidad asociada con las células en ausencia del compuesto de prueba. Un compuesto de prueba identificado en uno o más de los eneayos descritos anteriormente por ser capaz de enlazarse a aldAR, potencialmente, puede servir como un antagonista aldAR y por lo tanto ser conveniente para su uso en el método de tratamiento de síntomas de irritación de la invención. Para determinar el efecto específico de cualquier compuesto de prueba particular seleccionado con base en su capacidad para enlazar aldAR, se pueden usar varios ensayos incluyendo ensayos IP (ver Schwinn y colaboradores, J. Pharm. Exp. Ther. 272:134 (1995)) y ensayos de contracción de músculo liso y de vejiga (por ejemplo, vejiga humana) (Ford y colaboradores, Mol. Pharm. 49:209 (1996)). Los compuestos convenientes para su uso para tratar síntomas de irritación se asociarán con efectos antagónicos (inhibitorios) en el ensayo IP y los efectos inhibitorios de contracción en el ensayo de contracción. En otra modalidad, la invención se relaciona con compuestos identificados usando los ensayos descritos anteriormente por ser antagonista de aldAR. Los compuestos identi icados de acuerdo con los ensayos anteriores se pueden formulcLr como composiciones farmacéuticas. Estas composiciones comprenden el compuesto y un diluyente o vehículo farmacéuticamente aceptable. El compuesto puede estar presente en forma de dosis unitaria (por ejemplo, como tableta o cápsula.) o como una solución, preferiblemente estéril, particularmente cuando la administración por inyección se anticipa. La dosis y el régimen de dosificación variará, por ejemplo, con el paciente, el compuesto y el efecto buscado. La dosis óptima y regímenes se pueden determinar fácilmente por un
i.
experto en la técnica. En otra modalidad, la invención se relaciona con anticuerpos específicos para aldAR, y fragmentos de enlace de antígeno del mismo, incluyendo F(ab)2' ó F(ab) . Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales y se pueden preparar usando técnicas estándares. Los anticuerpos se pueden usar en protocolos de purificación de aldAR o los anticuerpos se pueden formular como composiciones farmacéuticas y usar terapéuticamente como antagonistas ldAR. En todavía otra modalidad, la presente invención se relaciona con un enfoque de terapia de genes para tratar síntomas de irritación. En esta modalidad, los oligonucleótidos (construcciones) se usan de manera que después de la administración, se tiene como resultado la producción de una molécula que regula hacia abajo la producción de aldAR. En una modalidad relacionada, la presente invención se relaciona con construcciones antisentido aldAR y con un método de usar el mismo para tratar síntomas irritantes. Estas construcciones se pueden diseñar para dirigirse a cualquier variedad de regiones del gen aldAR, incluyendo la secuencia de codificación (por ejemplo, regiones que codifican la porción intracelular que interactúa con la proteína G y participa en la ruta de transducción de señal) y la región 5' no traducida. La administración de las construcciones antes mencionadas se puede efectuar usando cualquiera de una variedad
***"• "»*-de enfoques, incluyendo la instalación en la vejiga (por ejemplo, vía la uretra) y la introducción en el fluido cerebro espina L. Las construcciones también se pueden administrar sistémicamente, en cuyo caso se puede efectuar el direccionamiento usando, por ejemplo, promotores específicos de músculo liso (por ejemplo, músculo liso de la vejiga) . Vectores efectivos para su uso en las modalidades de terapia de gen antisentido descritas anteriormente incluyen vectores virales, tales como vectores retrovirales, vectores adenov rales y vectores virales adenoasociados . Las construcciones también pueden estar presentes en asociación con un lípido, por ejemplo, un liposoma. (Para detalles de construcciones antisentido y sistemas de administración, etcétera, ver, por ejemplo, Wagner Nature 372:333 (1994)) . La cantidad de construcción que se va a administrar variará, por ejemplo, con la construcción, el paciente y el efecto buscado. Un experto en la técnica relevante fácilmente puede optimizar la dosis y el régimen de tratamiento. En todavía otra modalidad, la invención se relaciona con juegos, por ejemplo, juegos convenientes para conducir las pruebas descritas en la presente. Estos juegos pueden incluir aldAR, o porción del mismo, por ejemplo, enlazado a un soporte sólido. El juego puede incluir una secuencia de codificación aldAR, una construcción antisentido aidAR o un anticuerpo específico de aldAR. El juego puede incluir cualquiera de los compuestos anteriores dispuesto con uno o más elementos contenedores. El juego además puede incluir reactivos auxiliares (por ejemplo, reguladores) para su uso en los ensayo . Ciertos aspectos de la presente invención se describen en mayor detalle en los ejemplos no limitantes que siguen. EJEMPLOS Los siguientes detalles experimentales son relevantes para los ejemplos específicos que siguen. Preparación del tejido. El detrusor de vejiga humana de grosor completo se obtuvo como tejido "normal" descartado adyacente a especímenes de tumor (n = 1 cistectomía radical, n = 12 oistoprostatectomía radical por carcinoma celular de transición de la vejiga) con aprobación institucional adecuada. Cada muestra se inspeccionó por un patólogo, y se confirmó el tejido normal. El músculo liso detrusor se desprendió gruesamente de las capas de urotelio serosal, se congeló en nitrógeno líquido dentro de los 30 minutos de la escisión, y se almacenó a -70°C para uso posterior. La vejiga entera de la rata se obtuvo de ratas Sprague-Dawley machos eutanizadas
(Charles River Laboratories; Wilmington, MA) con aprobación del comité de cuidado institucional a los animales. El tejido de ratas se cosechó dentro de los dos minutos de la muerte, se congele en nitrógeno líquido y se almacenó a -70°C para uso posterior. Preparación del detrusor humano y de la membrana de la vejiga de rata. El detrusor humano y la vejiga entera de rata se picaron sobre hielo seco y se suspendieron en regulador de lisis frío (5mM Tris HCl y 5 mM EDTA, pH 7.4) con inhibidores de proteasa, benzamidina (10 miligramos/mililitro) , leupeptina (5 miligramos/mililitro) , e inhibidor de tripsina de frijol de soya (10 miligramos/mililitro) (Sigma Chemical Company; St . Louis, MO) . Se preparó un lisado con un Polytron PT 3000 (Brinkmann; Westbury, NY) a 10,000 rpm durante 10 segundos. Después de aglomerar a 40,000 x g durante 15 minutos
(rotor Sorvall SM24), las membranas se suspendieron en regulador de resuspensión frío (150 mM NaCl , 50 mM Tris HCl, 5 mM EDTA, pH 7.4) con inhibidores de proteasa, y se mantuvieron en hielo para el uso inmediato (o almacenaron a -70°C para uso posterior) . Se determinó el contenido de proteína usando el ensayo Bicinchoninic (EBC) con estándares de albúmina de suero bovino (ASB) (Pierce; Rockford, IL) . Enlace de radioligando. Todos los estudios de ARNm y de proteína descritos se realizaron usando detrusor de cada paciente descrito anteriormente (n = 13) . Con el fin de conservar la muestra, y todavía caracterizar completamente o^AR en detrusor humano, se generaron isotermas de enlace de saturación completa adicionales en muestras de detrusor humano a partir de un subconjunto de pacientes (n = 5) usando un regulador consistente en 150 mM NaCl , 50 mM Tris HCl y 5 mM EDTA, pH 7.4, con inhibidores de proteasa. Cada reacción se realizó por triplicado, en un volumen total de 0.25 mililitros, incluyendo membranas de detrusor humano diluida (50 a 100 miligramos de proteína) y el antagonista de axAR [125I]HEAT (NEN Research Products-DuPont ; Boston, MA) variando en concentración de 2 a 900 pM; el enlace no específico se midió en presencia de 1 mM de prazosin (Sigma) . La reacción continúa a 25°C durante 45 minutos, y termina con una dilución de cinco veces de regulador enfriado en hielo 50 mM Tris HCl, pH 7.4, seguido por filtración rápida sobre filtros GF/C usando un cosechador Brandel . Los filtros secos se contaron en un contador gama. El enlace específico se calculó sustrayendo el enlace no específico del enlace total. Las curvas de saturación se ajustaron con análisis de regresión no iterativa usando software InPlot (GraphPad; San Diego, CA) . La densidad OíjAR total se determinó en cada muestra de detrusor como se describió anteriormente, usando concentración saturante de [12SI]HEAT (300 pM) . Los resultados se reportaron como media ± SEM a dos cifras significativas. Para determinar los valores Ki en detrusor humano para subtipo axAR se realizaron enlace de competición de ligandos discriminantes en triplicado en un volumen total de 0.25 mililitros usando regulador de enlace (ver enlace de saturación anterior) . Las membranas de detrusor humano (50 a
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100 microgramos de proteína) se incubaron con una concentración Kd (12C pM) del antagonista axAR [125I]HEAT, y concentraciones crecientes (10~12 a 10"3 M) de ligando selectivo para aldAR no radioetiquetado BMY7378 (Research Biochemicals International; Natick, MA) . Las condiciones de la reacción fueron como se describen anteriormente. Las curvas se ajustaron con análisis de regresión no iterativo usando software InPlot (GraphPad) . Preparación de ARN. El ARN se extrajo del detrusor humano o de las muestras de vejiga entera de rata usando el método RNazol (Tel-Test, Inc.; Friendswood, TX) . El ARN se cuantificó usando un espectrofotómetro a 260/280 nm, y se dividió en muestras de 20 miligramos para su uso inmediato. Construcciones de ADNc de Ct,AR humano. La sonda ?tlaAR humana consistió en un fragmento de 0.326 kb (Pvull/HindIII) en pGEM-42: (Promega Corporation; Madison, Wl), correspondiente a los nucleótidos 958-1283 del ADNc de o¡laAR humano clonado (GenBank # L31774) . La sonda albAR humana consistió en un fragmento de 0.673 kb (XhoI/BamUI ) en pGEM-4Z (Promega), correspondiente a los nucleótidos 94-766 del ADNc de albAR clonado (GenBank # L31773) . La sonda aldAR humana consistió en un fragmento de 0.377 kb (EcoRI/PstI ) , correspondiente a los nucleót.idos 520-896 del ADNc de aldAR humano clonado (GenBank # L31772) . La Figura 1 muestra la ubicación de cada sonda de subtipo OíjAR dentro de un esquema de la proteína codificada. La sonda de ciclofilina humana consistió en un fragmento de 0.103 kb (Kpnl/EcoRI ) en pTRI (Ambion, Inc.; Austin, TX) , correspondiente a los nucleótidos 38-140 del gen de ciclofilina humano (GenBank # X52856) . Etiquetación de las sondas ARN. Las sondas de ARN radioetiquetadas antisentido de cadena simple se generaron a partir de construcciones de ADNc de axAR linearizado usando ARN polimerasa de T7 (ala_ ciclofilina) y SP6 (alb? ald) como se describe en los Protocolos Promega y la Guía de Aplicaciones (Promega Corporation; Madison, Wl) , el aiaAR y las construcciones de ADNc de aldAR se linearizaron con EcoRI , y la construcción de ADNc de albAR se linearizó con HipdlII. 32P-aUTP (NEN Research Products-DuPont) se incorporó en las sondas de ARN en el momento de la síntesis de sonda. Todas las sondas se purificaron en gel de poliacrilamida al 5 por ciento (300V durante 1.5 hora); después de la exposición la película durante 3 minutos, las sondas de ARN radioetiquetadas se cortaron del gel y se eluyeron pasivamente durante la noche en 400 microlitros de regulador de elución del juego RPA II (Ambion) a 37°C. Ensayos de protección de RNasa. Los ensayos de protección de RNasa se llevaron a cabo como previamente se describió (Zinn y colaboradores, Cell 34:865-879 (1983)) con algunas modificaciones. En resumen, las muestras de ARN total (20 miligramos) se disolvieron en 20 mililitros de regulador de hibridización que contenía > exceso de 20 veces la sonda
«j tow i radioetiquetada (2 x 105 cpm/reacción de aIa, aIb, aId, y 1 x 105 cpm/reacción de ciclofilina) , y se incubó durante la noche a 55°C (aIa, aIb) y 65°C (aId, ciclofilina) . Para asegurar la especi icidad de las sondas selectivas de subtipo axAR humanas antisentido radioetiquetadas sintetizadas, se realizaron ensayos de protección de RNasa en línea con ARN extraído a partir de células de fibroplasto de rata 1 establemente expresando cada subtipo axAR clonado humano. Como control negativo, los ensayos de protección de RNasa para cada sonda selectiva de subtipo OíjAR se realizaron en línea con muestras de ARNt. de levadura y otros subtipos o^AR no hibridizantes . La sonda radioetiquetada antisentido a la región muy conservada del gen de ciclofilina humano constitutivamente expresado también se utilizó como un control para asegurar cantidades idénticas de ARN cotal en cada ensayo. El gel final se expuso a película X-Omat AR (Eastman Kodak Company; Rochester, NY) durante 24-72 horas. Cuantificación de ARNm de axAR en músculo liso de detrusor humano a partir de ensayos de protección de RNasa. Con el fin de cuantificar el ARNm subtipo axAR relativo, cada gel final de ensayo de protección RNasa se expuso a placas Phosphorlmager (Molecular Dynamics; Sunnyvale, CA) durante 24 horas. La integración de volumen de bandas radioetiquetadas protegidas específicas para cada ARNm dio resultado productos de hibridización se corrigió por el fondo se normalizó para la señal de ciclofilina, y se expresó como unidades de densidad arbitrarias, usando análisis de imagen en gel ImageQuant software (Molecular Dynamics) . Las sondas axAR contenían el siguiente número de sitios UTP para la incorporación de 32P-aUTP: aIa 88, aIb 117, aId 51. Las unidades de densidad arbitraria se normalizaron a la sonda de incorporación 3P-aUTP más baja (aIdAR) y se expresó entonces como una fracción (± SEM) de la uerza de señal de ARNm de axAR total . Reacción de cadena de polimerasa (RCP) . Se usó reacción de cadena de polimerasa-RT para confirmar la expresión de subt ipos axAR detrusor humano (para asegurar concentraciones bajas de un subtipo no se perdieran en la vejiga humana) y se comparó con la expresión de ARNm del subtipo axAR en vejiga completa de rata con datos de rata publicados anteriormente (Walden y colaboradores, J. Urol. 157:1032-1038 (1997), Scofield y colaboradores, J. Pharmacol. Exper. Ther. 275:1035-1042 (1995)) . Los cebadores de subtipo axAR humano y de rata se sintetizaron en Duke University Medical Center. La transcripción en reversa de 1 miligramo de detrusor humano tratado con DNasa en ARN de vejiga de rata se realizó por triplicado en una mezcla de reacción de 20 mililitros que contenía 5 mM MgCl2, ImM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, lOmM TrisHCl, 50 mM KCl, 2 mililitros agua tratada DEPC, 2.5 mM de hexómeros aleatorios, una unidad de inhibidor de RNasa, y 2.5 unidades de MuLV transcriptasa inversa (Perkin Elmer; Foster City, CA) ; muestras de control simultaneas no tratadas con transcriptasa inversa se usaron para llevar la amplif cación del ADN genómico. Las reacciones de transcriptasa inversa se corrieron durante 60 minutos a 42 °C, 5 minutos a 95°C, y 10 minutos a 4°C. Cada subtipo de ARNm axAR se amplificó mediante reacción de cadena de polimerasa por triplicado en 100 mililitros de reacción que contenía 50 mM KCl, 10 mM Tris HCl, pH 8.3, 2 mM MgCl2, 200 mM de cada uno de dATP, dCTP, dGTP, y dTTP, 15 pM de cebador sentido y antisentido, 5 por ciento de DMSO, y 2.5 unidades de polimerasa ADN AmpliTaq (Perkin Elmer) . Las reacciones de cadena de polimerasa se realizaron en un ciclador de temperatura DeltaCycler II®. (ERICOMP; San Diego, CA) . Se establecieron las siguientes condiciones para los tres conjuntos de cebadores de rata: un ciclo de desnaturalización durante 3 minutos a 95 °C, 35 ciclos de un minuto a 95°C, un minuto de recocido a 58°C, y un minuto de extensión a 72 °C. Se establecieron las siguientes condiciones para los tres conjuntos de cebadores humanos: un ciclo de desnaturalización durante 3 minutos a 95°C, 35 ciclos de un minuto a 95°C, un minuto de recocido a 60 °C para ?ílay lb, y a 68 °C para ald y una extensión de un minuto a 72°C. Se realizó un ciclo de extensión final durante 10 minutos a 72 °C. Las mezclas de la reacción se enfriaron entonces a 4°C. 10 mililitros de cada producto de reacción de cadena de polimerasa se separó mediante electroforesis en gel en agarosa al 0.8 por ciento. Ya que los experimentos de reacción de cadena de polimerasa fueron solamente confirmatorios por naturaleza por diseño, la cuantificación exacta (que requiere reacción de cadena de polimerasa competitiva) no se realizó. Sin embargo, para asegurar que cualquier declaración con respecto a los niveles de ARNm relativos es apropiado, es importante notar que las condiciones descritas anteriormente (por ejemplo, temperaturas de recocido diferentes) se eligieron después de un análisis preliminar extenso con dada conjunto de cebadores para asegurar condiciones de amplificación óptimas con eficiencia de producto de cebctdor similar. La eficiencia de transcripción de igualdad o inversa para los productos se verificó usando concentraciones iguales de ADNc de control inicial; estas reacciones también sirvieron como control positivo para el uso de conjuntos de cebadores correctos. Treinta y cinco ciclos de amplificación se eligieron ya que es en el extremo superior del rango de amplif cación lineal para los seis conjuntos de cebadores (ARNm de OÍJA fue raro en la línea base en muchos tejidos humanos y en nuestras manos 40 ciclos de amplificación es donde la curva se convierte en no lineal) . Ej emplo 1 Población de pacientes humanos El músculo liso detrusor humano se obtuvo de pacientes varones (n = 12) y mujeres (n = 1) . La edad de los pacientes varió de 56 a 76 años de edad (promedio = 59.6) . La historia médica pasada significativa incluyó abuso de tabaco, enfermedad de arteria coronaria, hipertensión controlada con o^AR ó ßAR (n = 3) , y una historia de obstrucción de la salida de la vejiga (n = 2) que necesitó recepción transuretral previa de próstata. La comparación de resultados de pacientes con hipertensión y/o obstrucción de la salida de la vejiga (n = 5) sugirió que la historia médica no afectó los resultados. Un estudio más grande se requeriría para hacer cualquier declaración definitiva con respecto a esto. Ejemplo 2 Enlace de saturación de ligando O^AR Las características farmacológicas del OÍJAR en detrusor humano incluyen Kd para el antagonista radioetiquetado axAR [125I]HEAT de 130 ± 1.9 pM, similar al reportado para células que expresan establemente el subtipo axAR humano clonado (Schwinn y colaboradores, J Pharmacol. Exper. Ther. 272:134-142 (1995) ) . Una isoterma de enlace de saturación representativa se muestra en la Figura 2. La densidad total de o^AR se mide mediante enlace de saturación en preparaciones de membrana detrusor humano con el antagonista axAR [125I]HEAT es 6.3 + 1.0 fmol/mg proteína (promedio ± SEM, rango 2.7-9.0, n = 13). Aunque baja (con enlace no específico correspondientemente alto de 70-80 por ciento como se esperaba) , la expresión o^AR es reproducible y consistente con y entre pacientes.
Ejemplo 3 Identificación y cuantificación de los subtipos de ARNm xAR en detrusor de vejiga humana Con el fin de determinar cuáles subtipos de axAR están presentes en el detrusor humano, se eligieron enfoques moleculares debido a su sensibilidad y especificidad. Para asegurar la especificidad de sondas selectivas de subtipo axAR humano antisentido radioetiquetado sintetizadas, se realizaron ensayos de protección de RNasa simultáneamente con ARN total extraído de células de fibroblasto 1 de rata expresando cada subtipo OijAR humano clonado. Cada sonda específica de subtipo OfjAR protege un solo fragmento predominante de tamaño predicho sin hibridización cruzada (+Figura 3, células de control positivo) ; una falta de hibridización cruzada entre subtipos con cada sonda (Price y colaboradores, Mol. Pharmacol 46:221-226 (1994)) . Como se demostró previamente un control negativo adicional, los ensayos de protección de RNasa para cada sonda selectiva de subtipo axAR se realizó en línea con muestras de ARNt de; levadura, en donde no se demostró hibridización (Figura 3, franja ARNt) . El detrusor humano contenía ARNm aIdAR > aIaAR, pero ninguna ARNm de aIbAR en todo paciente estudiado (n = 13; la Figura 3 muestra resultados representativos de los pacientes número 1 hasta 5) . Estos datos, cuando se corrigieron para fondo, se normalizaron para contenido de ciclofilina, y se corrigieron para incorporación de sonda 32P-aUTP, revela que el ARNm de aldAR constituye 66 ± 4.8 por ciento y el ARNm de laAR 34 ± 4.8 por ciento del ARNm axAR en detrusor humano. Ejemplo 4 Confirmación del ARNm subtipo axAR en detrusor humano en comparación con vejiga completa de rata usando reacción de cadena de polimerasa-RT Con el fin de confirmar resultados de los ensayos de protección de RNasa y para comparar con otro modelo animal usado frecuentemente (rata) la expresión del subtipo axAR se examinó usando reacción de cadena de polimerasa-RT en cada paciente. Las secuencias de nucleótidos de cebador, las temperaturas de fusión (TJ , y las posiciones de cebador relativas a la secuencia de ADNc se muestran en la Tabla 1 y Tabla 2; estos cebadores no extienden un intrón. TABLA 1. Cebadores de oligonucleótidos usados para reacción de cadena de polimerasa-RT subtipo axAR de rata
TABLA 2. Cebadores de oligonucleótidos usados para reacción de cadena de polimerasa-RT subtipo axAR humana
Aunque los ensayos de protección de RNasa se consideran el "estándar de oro" para cuantificar el ARNm presente en el tejido dado este enfoque no es tan sensible como la reacción de cadena de polimerasa, por lo tanto muy pequeñas cantidades de ARNm se pueden perder en un ensayo de protección de RNasia pero demostrar por reacción de cadena de polimerasa.
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Como se muestra en la Figura 4, la reacción de cadena de polimerasa-RT dada en ARN total de detrusor humano muestra la presencia de alaAR y aldAR, y carencia de ARNm albAR, consistente con los datos del ensayo de protección de RNasa. Es de notarse que las cuentas de ARNm aldAR por aproximadamente 60-70 por ciento del ARNm o^AR total en detrusor humano contando el ARNm alaAR por el 30-40 por ciento de nuevo confirmando los resultados del ensayo de protección de RNasa. La heterogeneidad de la especie (humano contra rata) del subtipo axAR de la expresión de ARNm había sido reportada previamente para muchos tejidos (Price y colaboradores, Mol. Pharmacol. 46:221-226 (1994), Price y colaboradores, Mol. Pharmacol. 45:171-175 (1994)) . Sin embargo, como se ve en la Figura 4, la reacción de cadena de polimerasa-RT realizada en ARN total de vejiga de rata depositada demostró la presencia de los tres ARNm OíjAR en aproximadamente concentraciones iguales en rata. Ejemplo 5 Determinación de la expresión del subtipo axAR a un nivel de proteí a Se usó análisis de competición para determinar la expresión del subtipo axAR a un nivel de proteína detrusor humano. Ya que los estudios moleculares demuestran una predominancia de ARNm de aldAR, el compuesto selectivo de aldAR se usó en estos estudios. Como se representa gráficamente en la Figura 5, un ajuste de dos sitios es evidente en todo
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paciente estudiado (n = 13) , con predominio de alta afinidad de enlace (pKx alta = 8.6 ± 0.2 [66 ± 3.1 por ciento total] contra pKx baja = 4.9 ± 0.2 [35 ± 3.1 por ciento total] (Tabla 3) . --5 TABLA 3. Resultados de la competición entre experimentos utilizando membranas de fibroblastos de rata 1 establemente transfectadas con cada subtipo axAR (controles) y el detrusor humano (n = 13) . Ya que no se encontró albAR en el
10 detrusor humano por ensayos de protección de RNasa y reacción de cadena de polimerasa-RT, se utilizó un ajuste de uno contra dos sitios de los datos. BMY737 (pK 15
20 Todos los documentos citados anteriormente se incorporan mediante la presente por entero como referencia. Un experto en la técnica apreciará a partir de la lectura, de esta descripción que varios en formas y detalles se
25 pueden hacer sin apartarse del verdadero alcance de la invención.