MX2015000809A

MX2015000809A - Metodos para detectar y medir la agregacion.

Info

Publication number: MX2015000809A
Application number: MX2015000809A
Authority: MX
Inventors: Ian Gibbons; Elizabeth Holmes; Paul Patel; Samartha Anekal; Swapna Joshi
Original assignee: Theranos Inc
Priority date: 2012-07-18
Filing date: 2013-07-18
Publication date: 2015-05-07
Also published as: MX366275B; AU2013292395A1; IL236769A0; WO2014015194A2; US20150198591A1; US20190293665A1; CA2878880C; BR112015001087A2; US20170023595A1; US20160266142A1; JP2015522825A; JP2022069520A; CN110346568A; WO2014015194A3; KR20150038155A; US20140045170A1; EP2875354A2; US10281479B2; SG11201500344XA; IL236769B

Abstract

Se proporcionan métodos, composiciones, sistemas y dispositivos para llevar a cabo y analizar ensayos de aglutinación. En un aspecto, se proporcionan métodos para el análisis de imágenes de ensayos de aglutinación. En otros aspectos, se proporcionan métodos para realizar los ensayos de aglutinación. En un aspecto, los métodos pueden utilizarse para la detección de varias moléculas, incluyendo virus o anticuerpos contra un virus. En otro aspecto, los métodos pueden utilizarse para determinar la inmunización efectiva de un sujeto.

Description

MÉTODOS PARA DETECTAR Y MEDIR LA AGREGACIÓN REFERENCIA CRUZADA La presente solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de E.U. No.61/673,215 presentada el 18 de julio de 2012, cuya solicitud se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

ANTECEDENTES La agregación o aglutinación de moléculas o células forma la base de diversos ensayos biológicos útiles. La hemaglutinación, es una forma específica de aglutinación que involucra a los glóbulos rojos (GRs). Este fenómeno se utiliza en el laboratorio para determinar el tipo sanguíneo, la presencia y/o cantidad de virus en una muestra sanguínea, y/o la cantidad de ciertos anticuerpos de agentes anti-infecciosos. La hemaglutinación hace que los GRs formen estructuras reticuladas macroscópicas que son estables frente a la agitación moderada. Estas estructuras pueden distinguirse de los GRs no aglutinados mediante observación visual, lo cual forma la base de una variedad de métodos de ensayo tradicionales.

La hemaglutinación puede causarse por virus, bacterias, anticuerpos, y otros factores (por ejemplo, lectinas). Por ejemplo, los anticuerpos que se unen a antígenos tipo A inducirán la hemaglutinación en las muestras que contienen GRs tipo A o AB. De manera similar, los virus y antígenos virales que se unen a moléculas de la superficie celular pueden inducir la hemaglutinación. Los virus pueden contener la proteína "hemaglutinina", que se une a moléculas en las células huésped. Por ejemplo, las proteínas de hemaglutinina pueden unirse al ácido siálico en la membrana de las células huésped, tales como los GRs. El título viral puede aproximarse mediante la observación de la hemaglutinación en varias diluciones de una muestra que contiene el virus. Las bacterias también pueden detectarse y cuantificarse con estos métodos.

A pesar de las aplicaciones muy útiles de los ensayos de hemaglutinación, los métodos actuales son relativamente lentos, subjetivos, y poco confiables para algunos propósitos. Los protocolos de pre-tratamientos tradicionales pueden tardar hasta de 12 a 24 horas, y la inspección visual no es un método robusto para hacer determinaciones cuantitativas. Los ensayos de hemaglutinación se realizan con frecuencia en lugares en donde el tiempo es lo esencial (por ejemplo, para evitar la propagación de un brote viral o durante una transfusión sanguínea de emergencia). Por lo tanto, existe una necesidad considerable en la téenica, de métodos mejorados para detectar y medir la agregación/aglutinación SUMARIO Se proporcionan métodos, composiciones, sistemas y dispositivos para ensayos de aglutinación mejorados. En un aspecto, se proporcionan téenicas de formación de imágenes mejoradas para el análisis de reacciones de aglutinación. En otro aspecto, se proporcionan métodos para reducir el tiempo y/o aumentar la exactitud de las reacciones de aglutinación. En otro aspecto, se proporcionan reactivos mejorados para las reacciones de aglutinación. En otro aspecto, se proporcionan dispositivos mejorados para realizar o analizar las reacciones de aglutinación. También se proporcionan mejoras adicionales y la exposición incluye aspectos adicionales. Pueden utilizarse juntas las múltiples mejoras descritas en la presente.

En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde el anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, y el método incluye las etapas de: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral y la muestra biológica sospechosa de contener el anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) detectar si se produce la aglutinación en la mezcla, en donde la ausencia de aglutinación indica la presencia del anticuerpo, y en donde dichas etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. En otro aspecto relacionado, pero separado, el método incluye (a) incubar una mezcla de eritrocitos, una partícula viral, y una muestra biológica sospechosa de contener el anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de la mezcla, en donde la presencia de un agrupamiento de eritrocitos-partículas virales en la imagen indica la ocurrencia de la aglutinación y la falta de una cantidad detectable del anticuerpo, y en donde la ausencia del agrupamiento indica la falta de aglutinación y la presencia de una cantidad detectable del anticuerpo. En algunas modalidades, se obtiene una imagen de microscopio de la mezcla.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica, en donde el método incluye: (a) incubar una mezcla de eritrocitos o glóbulos rojos modificados, una muestra biológica sospechosa de contener la partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) detectar si se produce la aglutinación en la mezcla, en donde la presencia de la aglutinación indica la presencia de la partícula viral, y en donde las etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. En un aspecto relacionado, pero separado, el método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica incluye: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, una muestra biológica sospechosa de contener la partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de la mezcla, en donde la presencia de un agrupamiento de eritrocitos-partículas virales en la imagen indica la ocurrencia de la aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de la partícula viral, y en donde el ausencia del agrupamiento indica la falta de aglutinación y la falta de una cantidad detectable de la partícula viral. En algunas modalidades, se obtiene una imagen de microscopio de la mezcla.

En otro aspecto, se proporciona un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que incluye: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto que ha sido inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula viral; (b) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (c) determinar la concentración de un anticuerpo contra el virus en la muestra en base a los agrupamientos formados por la aglutinación de los eritrocitos, y en donde dichas etapas (b) (c) tienen lugar en menos de una hora. En un aspecto relacionado, pero separado, el método incluye (a) obtener una muestra biológica de un sujeto que ha sido inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula viral; (b) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; (c) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de la mezcla; y (d) determinar la concentración de un anticuerpo contra la partícula viral en dicha muestra biológica en base a los agrupamientos formados por la aglutinación de los eritrocitos, en donde la presencia de un agrupamiento de eritrocitos-partículas virales en la imagen indica la ocurrencia de la aglutinación y la falta de una cantidad detectable del anticuerpo, y en donde la ausencia del agrupamiento indica la falta de aglutinación y la presencia de una cantidad detectable del anticuerpo. En algunas modalidades, se obtiene una imagen de microscopio de la mezcla.

En las modalidades, los eritrocitos pueden prefijarse, por ejemplo, por tratamiento con glutaraldehído. Cuando se desee, los eritrocitos pueden incluir glóbulos rojos de pavo o eritrocitos de otros GRs no humanos.

Las partículas virales detectadas por cualquiera de los métodos en cuestión pueden incluir cualquier tipo de virus aglutinantes. Por ejemplo y sin limitación, pueden detectarse los virus de la hepatitis B (VHB), virus de hepatitis C (VHC), y cualquier cepa del virus de la influenza, por los métodos descritos en la presente. En algunos aspectos, los anticuerpos detectados por cualquiera de los métodos descritos en la presente pueden estar en contra de cualquier tipo de aglutinación de partículas, tales como virus aglutinantes. Por ejemplo y sin limitación, pueden detectarse los anticuerpos contra VHB, VHC y cualquier cepa del virus de la influenza.

La muestra biológica utilizada en cualquiera de los métodos descritos en la presente puede ser cualquier fluido corporal adecuado, procesado o no procesado, incluyendo, pero sin limitarse a sangre entera fresca o anti-coagulada, plasma y suero. En algunos casos, el plasma o suero es de un sujeto al que se le ha administrado una vacuna contra la partícula viral. Cuando se desee, la muestra biológica puede pre tratarse con neuraminidasa, por ejemplo, al incubar dicha muestra biológica con neuraminidasa, durante un período de tiempo adecuado tal como menos de 2 horas, 1 hora, 30 minutos, 20 minutos, 10 minutos, 5 minutos o incluso menos.

En algunas modalidades, las diversas etapas empleadas en un método descrito en la presente puede completarse dentro de aproximadamente 2 horas, 60 minutos, 45 minutos, 30 minutos o menos, o entre aproximadamente 30 a aproximadamente 60 minutos.

En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para analizar la aglutinación en base al análisis de imágenes. En una modalidad, los métodos de análisis de imagen se utilizan para analizar el movimiento en masa de los GRs o partículas de visualización en un ensayo de aglutinación en un pozo cónico o tubo. En otra modalidad, los métodos de análisis de imagen se utilizan para analizar las imágenes microscópicas de los GRs o partículas de visualización en suspensión en un ensayo de aglutinación, a fin de interrogar a la estructura fina de los GRs o la suspensión de partículas de visualización.

En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para el análisis de imágenes del movimiento en masa de los GRs y las partículas de visualización. En una modalidad, se proporciona un método para el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando ubicaciones designadas en un recipiente de reacción (por ejemplo, tubo de reacción o pozo). En una modalidad, se proporciona un método para el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando la exploración de las células empaquetadas de una reacción de aglutinación. En una modalidad, se proporciona un método para el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando la determinación de área y/o el perímetro de las células empaquetadas en una reacción de aglutinación. En algunos aspectos, las células empaquetadas incluyen una región de botón y/o lágrima.

En algunas modalidades, la presencia de la aglutinación se evidencia por la formación de agrupamientos de eritrocitos-partículas virales, y en donde dichos agrupamientos se capturan en una región de formación de imágenes de un dispositivo óptico. El dispositivo óptico puede incluir sin limitación una cámara, un microscopio, un escáner óptico, un sensor, un detector, o cualquier otro dispositivo de formación de imágenes adecuado. Cuando se desee, un análisis de la reacción de aglutinación puede realizarse mediante el cálculo del tamaño de dichos agrupamientos en base a la distancia de centro a centro de los eritrocitos individuales capturados en cada una de dichas imágenes.

En algunas modalidades, un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, puede incluir además la etapa de administrar una segunda dosis de la primera vacuna contra la partícula viral al sujeto si la concentración del anticuerpo en la muestra biológica es inferior a un nivel predeterminado.

Se proporciona además un equipo, que incluye: eritrocitos pre-fijados, una partícula viral, e instrucciones para que un usuario utilice el equipo para la detección de anticuerpos o viral. Estas instrucciones pueden transmitirse y ejecutarse de forma inalámbrica en sistemas automatizados.

En las modalidades, se proporciona en la presente un método de ensayo para la aglutinación de partículas en una mezcla, que comprende: generar una mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación en condiciones que permitan la aglutinación de las partículas de visualización a través de la interacción con las partículas de aglutinación; obtener al menos una imagen de la mezcla; y analizar la imagen para obtener una medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una partícula de visualización, la partícula de visualización es un GR o una microesfera.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una partícula de aglutinación, la partícula de aglutinación es un virus, partícula viral, o un anticuerpo.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de una imagen, la imagen se obtiene con un sensor de imagen CCD o CMOS.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de una imagen, la imagen se obtiene con un dispositivo óptico.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una partícula de aglutinación, la partícula de aglutinación se proporciona en una muestra biológica de un sujeto.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una muestra biológica, la muestra biológica comprende plasma o suero.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una partícula de aglutinación, la partícula de aglutinación es un virus.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una partícula de aglutinación, la partícula de aglutinación es un anticuerpo.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican un método de ensayo para la aglutinación de partículas en una mezcla que comprende una muestra biológica de un sujeto, el método permite la determinación de la cantidad de un virus o un anticuerpo en la muestra.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican un método de ensayo para la aglutinación de partículas en una mezcla que comprende partículas de aglutinación y partículas de visualización, la mezcla comprende además un anticuerpo que se une específicamente a la partícula de aglutinación e inhibe la interacción de la partícula de aglutinación con la partícula de visualización. En las modalidades, se proporciona el anticuerpo para la mezcla en una muestra biológica de un sujeto. En las modalidades, la muestra biológica comprende plasma o suero. En las modalidades, el método permite la determinación de la cantidad del anticuerpo en la muestra.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una mezcla que comprende partículas de aglutinación y partículas de visualización y la obtención de una imagen de la mezcla, la imagen se obtiene dentro de los 10 segundos, 30 segundos, 1 minuto, 2, minutos, 5 minutos, 10 minutos, 15 minutos, 20 minutos, 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 2 horas, 4 horas u 8 horas de la generación de la mezcla.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican el análisis de una imagen de una mezcla que comprende partículas de aglutinación y partículas de visualización para obtener una medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla, el análisis de la imagen comprende la identificación de una región de interés (ROI) en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican una ROI, la ROI comprende la información representada en imágenes de la mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la medición de la aglutinación de las partículas en una mezcla que comprende partículas de aglutinación y partículas de visualización, la medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla es una medición cualitativa de la aglutinación o no aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la medición de la aglutinación de las partículas en una mezcla que comprende partículas de aglutinación y partículas de visualización, la medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla es una medida cuantitativa del grado de aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de una imagen de una mezcla que comprende partículas de aglutinación y partículas de visualización, se obtienen dos o más imágenes de la mezcla.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de al menos una imagen de una mezcla que contiene partículas de aglutinación y partículas de visualización y el análisis de la imagen para obtener una medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla, el análisis de la imagen comprende la identificación de agrupamientos en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que involucran métodos que implican la identificación de los agrupamientos en una imagen, los métodos comprenden además determinar el tamaño o el número de agrupamientos en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la identificación de agrupamientos en una imagen, la identificación de los agrupamientos en la imagen comprende la determinación de la distancia entre las partículas de visualización en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la determinación de la distancia entre las partículas de visualización en la imagen, la determinación de la distancia entre las partículas de visualización comprende la determinación de la distancia de centro a centro entre las partículas de visualización en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de al menos una imagen de una mezcla que contiene partículas de aglutinación y partículas de visualización y el análisis de la imagen para obtener una medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla, el análisis de la imagen comprende la determinación de la distancia de centro a centro entre una primera partícula de visualización y una segunda partícula de visualización en la imagen. En las modalidades, el análisis de la imagen puede comprender además la determinación de la ubicación de la primera partícula de visualización y la segunda partícula de visualización en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican métodos que implican la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación en una imagen, la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación comprende la identificación de una primera partícula de visualización y una segunda partícula de visualización en donde la distancia de centro a centro entre la primera partícula de visualización y la segunda partícula de visualización no es mayor que 1, 1.1, 1.2, 1.3, 1.4, 1.5, 2, 2.5, 3, o 5 veces el diámetro de la primera o segunda partícula de visualización.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican métodos que implican la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación en una imagen, la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación comprende la identificación de una primera partícula de visualización y una segunda partícula de visualización, en donde la distancia de centro a centro entre la primera partícula de visualización y la segunda partícula de visualización no es mayor que 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 , 20, 25, 30, 35, 40, o 50 um.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican métodos que implican la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación en una imagen, la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación comprende la identificación de un agrupamiento de al menos tres partículas de visualización, en donde cada una de las tres partículas de visualización se coloca de tal manera que el centro de la partícula se ubica no más allá de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20 , 25, 30, 35, 40, o 50 um desde el centro de cada una de las otras dos partículas de visualización en el agrupamiento.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican métodos que implican la identificación de un agrupamiento que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación en una imagen, la identificación de los agrupamientos en la imagen comprende la selección de una distancia de valor de corte, en donde las partículas situadas a una distancia de la otra, que sea menor a la distancia de valor de corte se consideran estar asociadas entre sí.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la selección de una distancia de valor de corte, la selección de una distancia de valor de corte comprende calcular una función de distribución radial para dos o más partículas en la imagen.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de al menos una imagen de una mezcla que contiene partículas de aglutinación y partículas de visualización y el análisis de la imagen para obtener una medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla, el análisis de la imagen comprende la extracción de características a partir de una región de la imagen que comprende información de la formación de imágenes de la mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la extracción de características de una imagen, la extracción de características comprende analizar la textura de una mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican el análisis de la textura de una imagen que comprende la información de formación de imágenes de la mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación, el análisis de la textura de la mezcla comprende analizar la información de formación de imágenes con un operador de patrones binarios locales.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la extracción de características de una imagen, en donde la extracción de características comprende el análisis de la textura de una mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación, la extracción de características comprende además el análisis de la intensidad de señal en uno o más canales de color en una región de la imagen que comprende información de formación de imágenes de la mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican el análisis de la textura de una mezcla que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación, el análisis de la textura de la mezcla comprende introducir la información obtenida del operador de patrones binarios locales a un algoritmo que se ha preparado previamente con la información local de patrones binarios de una o más imágenes de una mezcla de estado de aglutinación conocido que comprende partículas de visualización y partículas de aglutinación.

En las modalidades, en las exposiciones proporcionadas en la presente que implican la obtención de al menos una imagen de una mezcla que contiene partículas de aglutinación y partículas de visualización y el análisis de la imagen para obtener una medición de la aglutinación de las partículas en la mezcla, el análisis de la imagen comprende comparar la información de extracción de características de la imagen de la mezcla con la información de extracción de características de una imagen de una mezcla de control del estado de aglutinación conocido que comprenden partículas de visualización y partículas de aglutinación.

Como se describe en este documento, los ensayos de aglutinación y los ensayos de inhibiciones de aglutinación son diferentes pero son ensayos relacionados. Por lo tanto, en las modalidades, las descripciones en la presente de los sistemas, reactivos, métodos para "ensayos de aglutinación" y lo similar pueden aplicarse a ambos ensayos de aglutinación y ensayos de inhibición de la aglutinación, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, en las modalidades, las descripciones en la presente de los sistemas, reactivos y métodos para "ensayos de inhibición de la aglutinación" y lo similar pueden ser aplicables a ambos ensayos de aglutinación y ensayos de inhibición de la aglutinación, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Por ejemplo, ambos ensayos de aglutinación y de inhibición de la aglutinación pueden implicar el análisis del grado de la aglutinación de las partículas de visualización en un ensayo, y por lo tanto, los sistemas, reactivos y métodos proporcionados en la presente para analizar el grado de aglutinación de las partículas de visualización puede ser aplicable tanto a los ensayos de aglutinación como a los ensayos de inhibición de la aglutinación.

Este Sumario se proporciona para introducir una selección de conceptos en una forma simplificada que se describen más adelante en la descripción detallada. Este Sumario no tiene por objeto identificar las características clave o características esenciales de la materia reivindicada, ni se destina a utilizarse para limitar el alcance de la materia reivindicada.

INCORPORACIÓN MEDIANTE LA REFERENCIA Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patentes mencionadas en esta especificación se incorporan en la presente mediante la referencia en la misma medida que si cada publicación, patente o solicitud de patente individual se indicara específica e individualmente para incorporarse mediante la referencia.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS En los dibujos, La Figura 1 representa la aglutinación de glóbulos rojos.

La Figura 2 ilustra el ensayo de granulación tradicional por el cual pueden distinguirse las muestras aglutinadas y no aglutinadas.

La Figura 3 ilustra el ensayo de granulación tradicional por el cual pueden distinguirse las muestras aglutinadas y no aglutinadas en tubos cónicos.

La Figura 4 representa A) la agregación mediada por virus de las células y B) la agregación mediada por anticuerpos de las células.

La Figura 5 representa la inhibición mediada por anticuerpos de la agregación mediada por virus de las células.

La Figura 6A-6B representa esquemas relacionados con el análisis del movimiento en masa de las partículas de visualización mediante el análisis de imágenes en ubicaciones designadas en un recipiente. La figura 6A representa el movimiento de las partículas de visualización a través de zonas en las muestras no aglutinadas, parcialmente aglutinadas y aglutinadas. La figura 6B representa las zonas que son más pequeñas que el área de las partículas de visualización.

La Figura 7 muestra una gráfica de muestras de la intensidad de señal vs. el número de zonas para las muestras representadas en la Figura 6A-6B.

La Figura 8 representa un eje a través de una región de botón y de lágrima de las células empaquetadas en el fondo de un recipiente, como pueden utilizarse para el análisis del movimiento en masa de partículas de visualización mediante el análisis de imagen utilizando el escaneado.

La Figura 9 muestra una gráfica de muestras de la intensidad de señal vs. el número posiciones a lo largo de un eje como se representa en la Figura 8 para muestras no aglutinadas, aglutinadas, y parcialmente aglutinadas. La línea marcada por triángulos es la muestra aglutinada, la línea marcada por cuadros es la muestra parcialmente aglutinada y la línea marcada por diamantes es la muestra no aglutinada.

La Figura 10 representa un esquema que muestra la identificación del perímetro del botón (Área A/1005) y el área de la lágrima (Área B/1010) de las partículas de visualización empaquetadas, como pueden utilizarse para el análisis del movimiento en masa de las partículas de visualización mediante el análisis de imágenes de las áreas o perímetro.

La Figura 11 muestra una gráfica de muestras que muestra un análisis como en la Figura 10, que representa la relación entre el % de área del Área A (1005) y el Área B (1010), el grado de aglutinación, y la proporción del Área B al Área A. La línea marcada por los diamantes es el Área A, la línea marcada por cuadros es el Área B, y la línea marcada por triángulos es la proporción del Área B/Área A.

La Figura 12 muestra imágenes de microscopio representativas para una muestra no agregada A) y una muestra agregada B).

La Figura 13A-13B muestra la distribución de tamaños de agrupamientos para seis muestras, muestras 1-5 y de control (gráfica izquierda) y el factor de asociación calculado para cada una de las seis muestras (gráfica derecha). Insertado en la gráfica de la derecha se encuentre una imagen macroscópica de las mismas muestras medidas utilizando el método de inclinación de la placa y la observación visual de las características de flujo de los glóbulos rojos empaquetados. La columna de la izquierda del inserto es una imagen de los pozos antes de la inclinación de la placa, y la columna de la derecha del inserto es una imagen de los pozos después de la inclinación de la placa.

La Figura 14A-14D muestra la comparación entre Fig.l4A) el análisis microscópico del factor de asociación, Fig.14B) la imagen macroscópica visual de ensayo de granulación, Fig.l4C) la imagen macroscópica escaneada de ensayo de granulación sometido a digitalización umbral, y Fig.l4D) el análisis de la imagen macroscópica escaneada del ensayo de la granulación. Fig.l4B) y Fig.l4C) contienen imágenes de las muestras analizadas en Fig.l4A) y Fig.l4D), respectivamente. Fig.l4B) y Fig.l4C) muestran imágenes del ensayo de granulación utilizando el método de inclinación de placa y observación de las características de flujo de los glóbulos rojos empaquetados. En las figuras 14B) y 14C), los pozos se numeran 1-6 desde la parte inferior a la parte superior, y los pozos adyacentes en cada uno de las filas derecha e izquierda, son duplicados de las mismas condiciones de ensayo. En Fig.l4D), la línea marcada por los diamantes es el área de las células en la columna de la derecha de Fig.l4C), la línea marcada por triángulos es el área de las células en la columna izquierda de Fig.l4C), la línea marcada por cuadrados es el perímetro de células en la columna derecha de Fig.l4C), y la línea marcada por cruces es el perímetro de las células en la columna izquierda de Fig.l4C).

La Figura 15 muestra la comparación entre el pretratamiento con el método tradicional de receptor-enzima destructora (RDE) (relleno con barras) y un método que utiliza la neuraminidasa proporcionada en la presente (relleno sólido).

La Figura 16 muestra la comparación del pre tratamiento de muestras de plasma, como se etiquetaron, con control, método RDE, y el método de neuraminidasa proporcionado en este documento.

La Figura 17 muestra los resultados del título de los anticuerpos de un método HAI de la exposición representada en gráfica contra los resultados del método HAI tradicional (inhibición del ensayo de hemaglutinación).

La Figura 18 muestra los resultados de titulación de anticuerpos de un método de HAI de la exposición representada en gráfica contra los resultados del método HAI tradicional, con tres diferentes antígenos virales H1N1, H3N2 y de influenza B.

La Figura 19 muestra una gráfica de una función de distribución radial ejemplar de las partículas en un ensayo de aglutinación, con la distancia r (en píxeles) en el eje X y g (r) en el eje Y.

La Figura 20 muestra un diagrama de flujo que proporciona etapas ejemplares para evaluar la aglutinación de una muestra de acuerdo con las modalidades de los métodos proporcionados en la presente.

La Figura 21A-21C muestra imágenes de las puntas ejemplares que contienen los ensayos de aglutinación las Figuras 21A, 2IB, y 21C muestran ensayos con muestras de diferentes sujetos.

DESCRIPCIÓN DETALLADA Se proporcionan en este documento composiciones, sistemas, dispositivos y métodos relacionados con ensayos para una partícula viral, partículas de aglutinación, antígeno o un anticuerpo para un antígeno en una muestra, al detectar la ocurrencia de la aglutinación de eritrocitos u otras partículas que puedan aglutinarse/agregarse selectivamente, tales como microesferas I, General A. Definiciones Los artículos "un", "unos" y "el" no son limitantes. Por ejemplo, "el método" incluye la definición más amplia del significado de la frase, que puede ser más de un método.

Un "sujeto" puede ser un ser humano o animal. El sujeto puede ser vivo o muerto. El sujeto puede ser un paciente, sujeto clínico o sujeto pre-clínico. Un sujeto puede estar siendo sometido a diagnóstico, tratamiento y/o prevención de enfermedades. El sujeto puede o no estar bajo el cuidado de un profesional de la salud.

Una "muestra sanguínea" es una muestra sanguínea o cualquier fracción de sangre, derivado de la sangre y lo similar. El plasma es un ejemplo de una fracción de sangre. La muestra sanguínea puede tener cualquier volumen adecuado, obtenerse por cualquier método adecuado, recolectarse de cualquier parte del sujeto en cualquier momento, recolectarse en cualquier recipiente adecuado, y lo similar. La sangre es un fluido corporal especializado en animales (incluidos los seres humanos) que suministra las sustancias necesarias, tales como nutrientes y oxígeno a las células y transporta los productos metabólicos de desecho lejos de esas mismas células. Las muestras sanguíneas pueden tener agregado cualquier material adecuado, opcionalmente uno o más anti-coagulantes. "Muestra sanguínea" también incluye muestras sanguíneas que se diluyen.

"Plasma" es el componente líquido de la sangre en el que las células sanguíneas de la sangre entera se suspenden normalmente. Este es el fluido intravascular parte del fluido extracelular (todo el fluido corporal fuera de las células). Es principalmente agua (aproximadamente 93% por volumen) y puede contener disueltas proteínas, glucosa, factores de coagulación, iones minerales, hormonas y dióxido de carbono (siendo el plasma el medio principal para el transporte del producto excretor). El plasma sanguíneo puede prepararse haciendo girar (centrifugación) un tubo de sangre que contiene un anticoagulante en una centrífuga hasta que las células sanguíneas se sedimenten en el fondo del tubo. El plasma sanguíneo entonces se aspira o extrae.

"Suero sanguíneo" es el plasma sanguíneo sin fibrina, fibrinógeno o los otros factores de coagulación (por ejemplo, sangre entera menos ambos factores celulares y de coagulación).

Las muestras sanguíneas pueden obtenerse mediante una "vía no venosa", lo que significa que la sangre no se extrae de las venas y arterias del cuerpo con una aguja. La vía no venosa no limita la muestra sanguínea a ser ya sea sangre venosa (sangre desoxigenada) o sangre arterial (sangre oxigenada). Tanto la sangre venosa como la sangre arterial son adecuadas. La obtención de la sangre de los capilares del cuerpo es un ejemplo de una vía no venosa.

Un "pinchazo en el dedo", "punción en el dedo", o lo similar es un ejemplo de un método adecuado para la obtención de una muestra sanguínea mediante una ruta no venosa. En la presente, una punta o borde afilados pueden usarse para penetrar la piel del dedo (o cualquier otra parte del cuerpo), haciendo que la sangre emane del cuerpo. Una punción en el dedo también puede realizarse en el talón, opcionalmente en el talón de un bebé, por ejemplo. La sangre se puede recolectar utilizando un tubo capilar, pipeta, torunda, gota, o cualquier otro mecanismo conocido en la téenica.

Por "aglutinación", "agregación", o equivalentes gramaticales de los mismos, en el presente documento significa el proceso por el cual las partículas tales como moléculas o células se agrupan en el espacio a través de un curso de tiempo. Los agregados resultantes tienen al menos algunas propiedades diferentes a las partículas no agregadas individuales, y los ensayos para detectar o medir estos agregados proporcionan información útil.

El término "partícula viral" incluye cualquier molécula o material que contenga un virus o componentes virales. El término incluye virus completos, así como partes de virus. Las partículas virales incluyen antígenos virales. Los antígenos virales incluyen, sin limitación, polipéptidos virales, ácidos nucleicos, y carbohidratos.

El término "eritrocito" incluye cualquier forma de un glóbulo rojo, de cualquier organismo. Por lo tanto, el término incluye, células frescas, sin alterar, glóbulos rojos, así como glóbulos rojos que se han sometido a un tratamiento químico o de otro tipo. El término incluye glóbulos rojos de los mamíferos, aves, reptiles, anfibios, peces, invertebrados, o cualquier otro tipo de organismo.

"Imágenes" son cualquier artefacto, por ejemplo una imagen bi-dimensional, un conjunto de imágenes, o un vídeo que tenga una apariencia similar a algún objeto físico. Las imágenes pueden implicar la captura de luz por una cámara.

Las imágenes pueden "pixelarse", es decir que comprenden píxeles.

Como se utiliza en la presente, ubicaciones de "punto de servicio" puede incluir lugares donde un sujeto puede recibir un servicio (por ejemplo, pruebas, monitoreo, tratamiento, diagnóstico, orientación, recolección de muestras, verificación de identidad, servicios médicos, servicios no médicos, etc..), y puede incluir, sin limitación, la casa de un sujeto, la empresa de un sujeto, la ubicación de un profesional de la salud (por ejemplo, médico), hospitales, salas de emergencia, quirófanos, clínicas, oficinas de profesionales de la salud, laboratorios, distribuidores [por ejemplo, farmacias (por ejemplo, farmacia al menudeo, farmacia clínica, farmacia hospitalaria), farmacias, supermercados, tienda de comestibles, etc.], vehículos de transporte (por ejemplo, coche, barco, camión, autobús, avión, motocicleta, ambulancia, unidad móvil, coche/camión de bomberos, vehículo de emergencia, vehículo aplicación de la lcy, coche de la policía, u otro vehículo configurado para transportar a un sujeto de un punto a otro, etc.), unidades de cuidados médicos en traslado, unidades móviles, escuelas, guarderías, lugares de inspección de seguridad, lugares de combate, residencias de permanencia con asistida de la salud, oficinas gubernamentales, edificios de oficinas, tiendas de campaña, sitios de adquisición de muestras de fluidos corporales (por ejemplo, centros de extracción de sangre), sitios en o cerca de una entrada a un lugar al que un sujeto puede desear tener acceso, sitios en o cerca de un dispositivo al que un sujeto puede desear tener acceso (por ejemplo, la ubicación de una computadora si el sujeto desea tener acceso a la computadora), un lugar en donde un dispositivo de procesamiento de muestras recibe una muestra, o cualquier otro punto de la ubicación del servicio descrito en este documento. En algunas modalidades, un punto de servicio es un punto de atención. Como se utiliza en la presente, un "punto de atención" se refiere a cualquier lugar en o cerca de un sujeto (por ejemplo, la casa o el trabajo de un sujeto, las tiendas de abarrotes, farmacias, clínicas, hospitales, escuelas, etc.) en donde un sujeto puede recibir cuidados relacionados con la medicina (por ejemplo, tratamiento, pruebas, monitoreo, diagnóstico, asesoramiento, toma de muestras, etc.) Imágenes de "Vídeo" son una serie de imágenes recolectadas secuencialmente a traves del tiempo. Las imágenes de vídeo pueden recolectarse a cualquier velocidad, incluyendo por ejemplo, al menos 1 cuadro/minuto, al menos 1 cuadro/10 segundos, al menos 1 cuadro/segundo, al menos 10 cuadros/segundo, al menos 20 cuadros/segundo, al menos 30 cuadros/segundo, al menos 40 cuadros/segundo, al menos 50 cuadros/segundo, al menos 100 cuadros/segundo, o al menos 200 cuadros/segundos.

B. Consideraciones generales Los ensayos de hemaglutinación han estado en uso durante muchos años con, complejos protocolos lentos. El carácter de la reacción de aglutinación es que las grandes estructuras se mantienen unidas por fuerzas relativamente débiles (interacciones proteína-proteína no covalentes).

Tales procesos responden a fuerzas mecánicas como la agitación y mezcla de la suspensión celular. El carácter de los aglutinados depende no sólo de los reactivos, sino también de la forma del recipiente en el que se produce la reacción. La temperatura, la composición del disolvente, la presencia de polímeros tales como proteínas, carbohidratos (por ejemplo, dextrano) y otros polímeros (por ejemplo, polietilenglicol) todos pueden tener efectos sobre la reacción. Un esquema general de una reacción de aglutinación se muestra en la Figura 1.

Para leer las reacciones de aglutinación, se utilizan actualmente varios métodos ópticos.

En el primer método, mostrado en la Figura 2, el recipiente de reacción es un tubo circular de lados rectos. Los glóbulos rojos aglutinados se asientan más rápidamente que las células no aglutinadas. Después de que haya pasado el tiempo suficiente, el producto de reacción de las células aglutinadas exhibe un sobrenadante claro con un sedimento de células aglutinadas, mientras que la reacción de células no aglutinadas sigue siendo turbia, con las células no aglutinadas quedando en suspensión.

El segundo método se ilustra en la Figura 3. Se ha encontrado que el uso de tubos cónicos puede causar que algunos glóbulos rojos aglutinados formen una retícula/malla distribuida en la parte inferior del tubo, mientras que algunos de los glóbulos rojos aglutinados permanecen suspendidos en solución. En contraste, la mayoría de las células no aglutinadas ruedan por los lados del tubo para formar un "botón" en la punta inferior angosta del tubo, pero en este botón se empaqueta de manera suelta. Con el fin de ayudar a identificar si las células en los tubos cónicos son aglutinadas o no aglutinados después de un ensayo de aglutinación, los tubos cónicos pueden inclinarse después de que a las células se les ha dado el tiempo suficiente para asentarse en el ensayo. Cuando tales tubos se inclinan a un ángulo como en la Figura 3, el botón de células no aglutinadas fluye para formar una "lágrima" masa conformada, mientras que las células aglutinadas exhiben significativamente menos flujo.

Los métodos, composiciones, sistemas y dispositivos proporcionados en la presente para ensayos de aglutinación tienen múltiples ventajas sobre las teenologías existentes.

En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de una partícula viral utilizando un ensayo de unión. Como se proporciona en más detalle en este documento, en un aspecto, en este ensayo, la partícula viral, si está presente, se une a los eritrocitos y forma agrupamientos de eritrocitos-partículas virales, y en consecuencia conduce a la aglutinación. Esto puede ser referido como un ensayo de hemaglutinación (HA). Ver Figura 4, panel A.

En un aspecto adicional, se proporciona un método para determinar la presencia de un anticuerpo utilizando un ensayo de unión. Como se proporciona en más detalle en este documento, en un aspecto, en este ensayo, el anticuerpo, si se encuentra presente, se une a los eritrocitos y formas agrupamientos de eritrocitos-partículas de anticuerpo, y en consecuencia conduce a la aglutinación. Esto también puede denominarse como un ensayo de hemaglutinación (HA). Ver Figura 4, panel B.

En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de anticuerpos utilizando un ensayo de competición. Como se proporciona en más detalle en este documento, en un aspecto, en este ensayo el anticuerpo, si se encuentra presente, se une a la superficie de una partícula viral, evitando de este modo que la partícula viral se una a los eritrocitos y forme agrupamientos de eritrocitos-partículas virales. Por lo tanto, el anticuerpo contra las partículas virales da como resultado la ausencia o la inhibición de la aglutinación. Esto puede referirse como un ensayo de inhibición de la hemaglutinación (HAI). Ver la Figura 5.

En un aspecto, los métodos proporcionados en la presente pueden reducir el tiempo de pre-tratamiento de la muestra para ensayos de aglutinación a tan poco como 30 minutos o menos. En un aspecto, esto puede lograrse mediante el uso de neuraminidasa durante el pre-tratamiento de la muestra.

En otro aspecto, los métodos proporcionados en la presente pueden simplificar el conjunto de reactivos del ensayo de hemaglutinación. Por ejemplo, en algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente emplean una sola preparación tipo estable de glóbulos rojos (o su equivalente, tal como microesferas) para todos los ensayos de heaglutinación. Un ejemplo de un tipo estable de preparación de glóbulos rojos son los glóbulos rojos de pavo estabilizados por fijación con glutaraldehído. Tales células fijadas son esencial e indefinidamente estables (en contraste con los glóbulos rojos frescos que deben prepararse diariamente y pueden variar de día a día). La fijación no inactiva los receptores de la superficie celular a los que la hemaglutinina viral u otras partículas de aglutinación se unen. Los glóbulos rojos frescos y las células de diferentes especies animales también pueden utilizarse en los métodos descritos.

En algunos aspectos, los métodos de la presente descripción incluyen la combinación de las etapas del ensayo. Aunque el método tradicional de HAI utiliza al menos dos incubaciones separadas (una reacción de la muestra tratada que contienen anticuerpos con antígeno viral, más una reacción con los glóbulos rojos, que totaliza aproximadamente 60 minutos), los métodos proporcionados en la presente pueden utilizar una sola incubación. Tal incubación puede ser significativamente más corta que en los métodos tradicionales, tal como tomar aproximadamente 45 minutos o menos, aproximadamente 30 minutos o menos, aproximadamente 25 minutos o menos, aproximadamente 20 minutos o menos, aproximadamente 15 minutos o menos, aproximadamente 10 minutos o menos, aproximadamente 5 minutos o menos , aproximadamente 4 minutos o menos, aproximadamente 3 minutos 0 menos, aproximadamente 2 minutos o menos, o aproximadamente 1 minuto o menos. En ciertas modalidades, también pueden utilizarse dos etapas.

En algunos aspectos, los métodos de la presente descripción aceleran las reacciones de aglutinación. Las reacciones de aglutinación son sensibles a la composición del medio de ensayo. Las interacciones carga-carga y las interacciones débiles con, por ejemplo, polímeros (proteínas, polímeros de carbohidrato, tales como dextrano) y lo similar todos pueden tener profundos efectos sobre la tasa de aglutinación y de punto final. En algunas modalidades, con los glóbulos rojos de pavo fijados con glutaraldehído, la albúmina puede acelerar la reacción de aglutinación por aproximadamente cuatro veces.

Los métodos de la presente descripción proporcionan además el análisis de objetivo del punto final de la aglutinación. El análisis de las imágenes puede utilizarse para leer los ensayos de hemaglutinación objetiva y cuantitativa sin la necesidad de titulación de la muestra. Ciertos métodos de análisis de imágenes se proporcionan en la Solicitud Provisional de E. U. No.61/435.250, presentada el 21 de enero de 2011, la cual se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

En una modalidad, se recolecta una imagen digital de un ensayo de aglutinación en un contenedor de reacción de tubo cónico. Esta imagen puede interpretarse para medir el grado de formación de la "lágrima" (longitud de la columna de glóbulos rojos). En otra modalidad, el "análisis de agrupamiento" de partículas de visualización puede realizarse como se describe en detalle a continuación. Este método permite que una reacción de aglutinación se lea después de muy corto tiempo.

Además, los métodos proporcionados en la presente pueden reducir el tiempo total del ensayo de aglutinación. La Tabla 1 proporciona una comparación del método tradicional y una modalidad del ensayo de inhibición de la aglutinación ejemplar de los métodos proporcionados en la presente. Como se muestra en la Tabla 1 a continuación, los métodos proporcionados en la presente pueden dar como resultado una reducción de más de 20 veces en el tiempo de ensayo y una reducción significativa en la complejidad del protocolo del ensayo de aglutinación.

Tabla 1 Los métodos descritos en la presente pueden eliminar además la necesidad de la dilución en serie de los reactivos mediante el uso de una lectura cinética de objetivo.

Una o más de las etapas del método pueden realizarse en el punto de servicio o punto de ubicación de los cuidados. La realización de los métodos describe en la presente un punto de la ubicación de los cuidados que puede permitir al personal médico tomar rápidamente una decisión de tratamiento para un sujeto en base a los datos de ensayos relacionados al sujeto específico.

II. Ensayos A. Ensayo de Hemaglutinación (Ensayo HA) En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos, composiciones, dispositivos y sistemas relacionados con ensayos de hemaglutinación (HA). Los ensayos de hemaglutinación pueden utilizarse como un método para la detección o cuantificación de virus, bacterias, anticuerpos u otras partículas hemaglutinantes por hemaglutinación.

La aglutinación de los eritrocitos puede referirse como hemaglutinación.

Como se utiliza en la presente, el término "partícula de visualización" se refiere a cualquier célula o partícula que pueda aglutinarse y detectarse macroscópica o microscópicamente. Las "partículas de visualización" incluyen, sin limitación, los eritrocitos, otras células, y microesferas.

Como se utiliza en la presente, el término "partícula de aglutinación" se refiere a cualquier molécula u organismo que puede unirse y causar la agregación de las células o partículas de visualización. "Partículas de aglutinación" incluyen, sin limitación, virus, partículas virales, y anticuerpos.

En algunos aspectos, cualquiera de los ensayos descritos en el presente documento como "ensayos de hemaglutinación" o "ensayos de inhibición de la hemaglutinación" también pueden llevarse a cabo con partículas de visualización no de glóbulos rojos (por ejemplo, microesferas, bacterias) que funciona en el papel de los GRs en un ensayo de HA o HAI, con partículas de aglutinación correspondientes adecuadas. Además, puede llevarse a cabo un ensayo de HAI para ensayar cualquier anticuerpo que pueda unirse a cualquier partícula de aglutinación, con el fin de inhibir la aglutinación de partículas de visualización mediante esa partícula de aglutinación.

En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos mejorados para detectar y medir la hemaglutinación, así como métodos mejorados para detectar y medir la inhibición de la hemaglutinación. Los ensayos para detectar o medir la hemaglutinación pueden referirse como ensayos HA. Los ensayos para detectar o medir la inhibición de la hemaglutinación pueden referirse como ensayos de HAI. La Figura 4 ilustra el proceso de hemaglutinación inducida por A) virus y B) anticuerpo. La hemaglutinación inducida por virus puede utilizarse, por ejemplo, para detectar la presencia o cuantificar la cantidad de un virus o partícula viral, también conocida como título viral. Puede utilizarse la aglutinación inducida por anticuerpos, por ejemplo, para determinar el tipo sanguíneo de los eritrocitos en una muestra.

En una modalidad, se proporciona en la presente un método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica, que incluye: (a) incubar una mezcla de eritrocitos y una muestra biológica sospechosa de contener la partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) detectar si se produce la aglutinación en la mezcla, en donde la presencia de la aglutinación indica la presencia de la partícula viral, y en donde las etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. La detección y el análisis de la aglutinación se llevan a cabo como se proporciona en la presente.

En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para determinar la presencia de una partícula de aglutinación en una muestra biológica, que incluye: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización y una muestra biológica sospechosa de contener la partícula de aglutinación, en condiciones que permitan la aglutinación de la partícula de visualización a través de la interacción con la partícula de aglutinación; y (b) detectar si dicha aglutinación se produce en dicha mezcla, en donde la presencia de dicha aglutinación indica la presencia de dicha partícula de aglutinación, y en donde las etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. La detección y el análisis de la aglutinación se llevan como se proporciona en la presente.

La detección de la aglutinación generalmente implica tomar imágenes de la aglutinación utilizando un dispositivo de formación de imágenes, tal como un escáner, una cámara, un detector o sensor, que pueda acoplarse a un microscopio.

En general, el ensayo se realiza utilizando un dispositivo que sea capaz de mantener las reacciones, tal como una placa de microtitulación de 96 pozos o su equivalente. Una muestra biológica pre-tratada que contiene la partícula viral o partícula de aglutinación a detectarse puede diluirse en serie en la placa con un amortiguador diluyente (por ejemplo, PBS con BSA). Entonces, los GRs o partículas de visualización en suspensión pre-fijados pueden agregarse, seguidos por un mezclado suave. La reacción se incuba durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, un total de aproximadamente 15 minutos. Sin embargo, un periodo total de incubación más corto o más largo de 15 minutos también puede utilizarse, tal como aproximadamente 10 o 5 minutos o menos, o 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 minutos, o más largo. La incubación puede llevarse a cabo a temperatura ambiente (es decir, 25°C), o a una temperatura que sea inferior o mayor a la temperatura ambiente, tal como aproximadamente 4, 8, 12, 14, 16, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 6655,, Oo 7700°°CC.. La temperatura y la duración de la incubación pueden optimizarse para lograr tanto velocidad como precisión de los ensayos. La placa puede leerse en un escáner y una imagen de punto extremo final puede tomarse de la placa, preferiblemente cuando la placa se inclina a 20 -75°, tal como a aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, o 75°.

En algunas modalidades, una imagen del ensayo de aglutinación se captura con un dispositivo óptico que incluye un microscopio. En estas modalidades, el ensayo se lleva a cabo en general como se describió anteriormente, excepto que después se agregan los GRs o partículas de visualización prefijados a la reacción, una pequeña muestra (por ejemplo 1-2pL) del pozo (u otra estructura que contenga la reacción) se transfiere directamente en una cubeta o punta, y se representa en imagen en un dispositivo óptico que contiene un microscopio. Las imágenes recolectarse y analizarse para calcular los factores de asociación como se describe en más detalle en este documento.

La duración para realizar el ensayo de aglutinación se optimiza en general para lograr tanto velocidad como precisión del ensayo. En algunas modalidades, realizar el ensayo y detectar la aglutinación tiene lugar en menos de una hora, tal como aproximadamente 10 o menos, 15 o menos, 20 o menos, 30 o menos, 40 o menos, 50 o menos, o 60 minutos o menos. En algunas modalidades, realizar el ensayo y detectar la aglutinación tiene lugar en más de una hora, pero menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 horas.

En algunas modalidades, un ensayo de HA se realiza utilizando una muestra conocida por no contener un virus aglutinante, para asegurar que la aglutinación observada es el resultado de virus aglutinantes o partículas aglutinantes (es decir, un control negativo). En algunas modalidades, un ensayo de HA se realiza utilizando una muestra conocida por contener un virus aglutinante, para asegurar que los eritrocitos o partículas de visualización utilizados en el ensayo son capaces de experimentar aglutinación (es decir, un control positivo).

B. Ensayo de inhibición de la hemaglutinación (Ensayo H?I) En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos, composiciones, dispositivos y sistemas relacionados con ensayos de inhibición de la hemaglutinación (HAI). Los ensayos de inhibición de la hemaglutinación miden la capacidad de una muestra para inhibir la hemaglutinación. Los ensayos de HAI son útiles, por ejemplo, para detectar o medir la presencia de anticuerpos capaces de unirse a un virus o una partícula de aglutinación e inhibir su capacidad para aglutinarse. La presencia de tal unión puede ser un indicador útil de la presencia de anticuerpos contra un virus o partícula de aglutinación.

Con referencia a la Figura 5, se representa un diagrama esquemático de la inhibición de la hemaglutinación. En algunas modalidades, un virus que contiene el reactivo se incuba con una muestra que puede contener anticuerpos que se unen selectivamente al virus. La unión del anticuerpo a una partícula viral puede interferir con la capacidad de la partícula viral para inducir la hemaglutinación. La inhibición de la hemaglutinación sirve así para indicar la presencia del anticuerpo. De esta manera, los ensayos de HAI pueden utilizarse para detectar o medir los anticuerpos en una muestra biológica.

En el procedimiento tradicional, el ensayo de HAI se realiza en al menos tres etapas: (1) pre-tratamiento de muestra sospechosa de contener un anticuerpo; (2) incubación de la muestra pretratada sospechosa de contener un anticuerpo con un virus (los anticuerpos contra el virus se unen a la hemaglutinina en las partículas virales, haciendo a la hemaglutinina inactiva) durante un máximo de 24 horas; y (3) el material de la etapa (2) se inactiva, y después se agrega una preparación de glóbulos rojos (recién producidos), y la mezcla se incuba durante un total de aproximadamente 2 horas.

En algunas modalidades, los métodos de la exposición mejoran sobre el método tradicional al eliminar la necesidad de tres etapas separadas. En algunas modalidades, las glóbulos rojos de reactivos y antígenos virales se combinan en un solo reactivo. En algunas modalidades, las partículas de aglutinación y partículas de visualización se combinan en un solo reactivo.

B 1. Detección de anticuerpos En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde el anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, y el método incluye: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral , y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; y (b) detectar si se produce la aglutinación en la mezcla, en donde la ausencia de la aglutinación indica la presencia de dicho anticuerpo, y en donde dichas etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. La detección y el análisis de aglutinación se llevan a cabo como se provee en la presente.

En un aspecto, se proporciona un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde el anticuerpo se une selectivamente a una partícula de aglutinación, y el método incluye: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización, la partícula de aglutinación y la muestra biológica sospechosa de contener el anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de las partículas de visualización a través de la interacción con la partícula de aglutinación; y (b) detectar si se produce la aglutinación en la mezcla, en donde la ausencia de la aglutinación indica la presencia del anticuerpo, y en donde los etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. La detección y el análisis de aglutinación se llevan a cabo como se provee en la presente.

En algunas modalidades, la partícula viral y la muestra biológica se incuban juntas antes de la adición de los eritrocitos. En algunas modalidades, la partícula de aglutinación y la muestra biológica se incuban juntas antes de la adición de las partículas de visualización.

B2. Detección de partículas virales o partículas hemoaglutinantes En otro aspecto, un ensayo de HAI se utiliza para detectar o medir una partícula viral específica o partícula de aglutinación. Una muestra sospechosa de contener una partícula viral específica o partícula de aglutinación se somete a ensayo para determinar la aglutinación, en presencia o ausencia de cantidades conocidas, fijas, de (reactivo) anticuerpos conocidos por unirse selectivamente a la partícula viral específica o partícula de aglutinación. Si la muestra aún induce la aglutinación en presencia de los anticuerpos, la muestra no contiene (o sólo contiene una baja cantidad) la partícula viral específica o partícula de aglutinación de interés (pero probablemente contiene una diferente partícula viral o de aglutinación). Si, por otro lado, se observa la aglutinación para ser inhibida por la presencia de los anticuerpos específicos, entonces la partícula viral o partícula de aglutinación en la muestra es un comparativo para el virus específico o partícula viral de interés.

En algunas modalidades, un ensayo de HAI se realiza sin titulación de la cantidad desconocida de virus o anticuerpo. El análisis objetivo de los métodos en la presente proporciona una alta sensibilidad a incluso pequeños cambios en el estado si se presenta la agregación de GRs. Esta alta resolución reduce la ambigüedad para determinar el punto de transición exacto entre la aglutinación/no aglutinación. Esto puede eliminar la necesidad de titulación, lo que simplifica en gran medida el protocolo de ensayo.

En algunas modalidades, un ensayo de HAI se lleva a cabo utilizando una muestra conocida por no contener un virus aglutinante o partícula de aglutinación, para asegurar que la aglutinación es el resultado de virus aglutinantes o partícula de aglutinación (es decir, un control negativo). En algunas modalidades, se realiza un ensayo de HAI utilizando una muestra conocida por contener un virus aglutinante o partícula de aglutinación, pero que carecen de anticuerpos, para asegurar que los eritrocitos o partículas de visualización utilizados en el ensayo son capaces de experimentar la aglutinación (es decir, un control positivo). Este control también ayuda a establecer una medida de referencia para la aglutinación a partir de la cual puede determinarse la inhibición inducida por anticuerpos.

C. Muestras biológicas En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para determinar la presencia de un anticuerpo, partícula viral, antígeno o partícula de aglutinación en una muestra biológica.

Por "muestra biológica" en el presente documento se entiende una muestra derivada de una fuente biológica. Los ejemplos de muestras biológicas incluyen, pero no se limitan a, sangre, suero, saliva, orina, fluido gástrico y digestivo, lágrimas, heces, semen, fluido vaginal, fluidos intersticiales derivadas de tejido tumoral, fluidos oculares, tejido corporal, o fluido espinal. Los ejemplos de muestras de tejido del sujeto pueden incluir, pero no se limitan a, tejido conectivo, tejido muscular, tejido nervioso, tejido epitelial, cartílago o hueso. La muestra puede proporcionarse de un ser humano o animal. La muestra puede recolectarse de un sujeto vivo o muerto. La muestra puede recolectarse fresca de un sujeto o pueden haber sufrido algún tipo de pre-procesamiento, almacenamiento o transporte.

En algunas modalidades, la muestra biológica comprende plasma o suero derivado de sangre.

En algunas modalidades, la sangre, plasma o suero se deriva de un sujeto (por ejemplo, un ser humano) al que se ha administrado una vacuna contra un antígeno. El antígeno puede ser por ejemplo, una partícula viral o partícula de aglutinación.

Un sujeto puede proporcionar una muestra, y/o la muestra puede recolectarse de un sujeto. Un sujeto puede ser un ser humano o animal. El sujeto puede ser vivo o muerto. El sujeto puede ser un paciente, sujeto clínico o sujeto pre clínico. Un sujeto puede estar siendo sometido a diagnóstico, tratamiento, monitoreo y/o prevención de enfermedades. El sujeto puede o no estar bajo el cuidado de un profesional de la salud. El sujeto puede ser una persona de cualquier edad, un infante, un niño, un adulto o un anciano.

Puede proporcionarse del sujeto cualquier volumen de la muestra. Los ejemplos de volúmenes pueden incluir, pero no se limitan a, aproximadamente 10 i o menos, 5 mi o menos, 3 mi o menos, 1 mi o menos, 500 ml o menos, 400 ml o menos, 300 m? o menos, 250 m? o menos, 200 m? o menos, 170 m? o menos, 150 m? o menos, 125 m? o menos, 100 m? o menos, 75 m? o menos, 50 m? o menos 25 m? o menos, 20 m? o menos, 15 m? o menos, 10 m? o menos, 9 m? o menos, 8 m? o menos, 7 m? o menos, 6 ml o menos, 5 ml o menos, 4 m? o menos, 3 m? o menos, 2 m? o menos, 1 m? o menos, 750 ni o menos, 500 ni o menos, 250 ni o menos, 100 ni o menos, 50 ni o menos, 20 ni o menos, 10 ni o menos, 5 ni o menos, 1 ni o menos, 500 ml o menos, 100 pl o menos, 50 pl o menos, o 1 pl o menos. La cantidad de muestra puede ser de aproximadamente una gota de una muestra. La cantidad de muestra puede ser la cantidad recolectada de una vía no venosa. La cantidad de muestra puede ser la cantidad recolectada de un dedo pinchado o punción en el dedo. Cualquier volumen, incluyendo los descritos en el presente documento, puede utilizarse en los métodos descritos en la presente.

Cl. Pretratamiento de Muestras Biológicas En algunas modalidades, la muestra biológica se pre-trata, para reducir los antecedentes no específicos.

El pre-tratamiento incluye en general tratamientos para reducir los antecedentes o mediciones de falsos positivos asociados con una muestra biológica. El suero y el plasma sanguíneo contienen frecuentemente factores [en particular glicoproteínas que no son anticuerpos para los virus] que se unen a la hemaglutinina viral y causan la inhibición de reacciones de aglutinación. La clase principal de tales glicoproteínas tienen cadenas de ácidos polisiálicos unidos covalentemente a la proteína. La presencia de tales proteínas puede elevar falsamente el título de los anticuerpos medidos en un ensayo de HAI, y puede falsamente disminuir el título de la partícula viral medida en un ensayo de HA. Para eliminar este problema, la muestra puede pretratarse para eliminar los factores interferentes antes de ejecutar el ensayo de HA o HAI.

Generalmente se utilizan dos enzimas para el pretratamiento de muestra de para reducir los antecedentes en las reacciones de aglutinación: (1) Enzima que destruye al receptor ( "RDE"), que descompone el ácido siálico unido a las glicoproteínas o glicolípidos (por ejemplo, filtrado de cólera; por ejemplo, Sigma -Aldrich, número de producto C8772, y (2) la neuraminidasa que descompone los ácidos exo o endo poli-siálicos (por ejemplo, Tipo III, de Vibrio cholera, 1-5 unidades/mg de proteína; por ejemplo, Sigma-Aldrich, número de producto N7885). El método de pre-tratamiento tradicional utiliza RDE durante aproximadamente 20 horas.

En algunas modalidades, la muestra biológica se pre-trata con neuraminidasa. La neuraminidasa se refiere a una clase de enzimas que son enzimas glicósido hidrolasa que descomponen los enlaces glucosídicos de los ácidos neuramínicos. Las enzimas de la neuraminidasa son una gran familia de enzimas, que se encuentran en una gama de organismos, incluyendo virus. Las neuraminidasas también se denominan sialidasas por su capacidad para catalizar la hidrólisis de residuos terminales de ácido siálico de las proteínas tales como los receptores. Las principales clases de neuraminidasas incluyen neuraminidasa viral, neuraminidasa bacteriana, neuraminidasas de mamíferos, sialidasa lisosomal, sialidasa citosólica, y sialidasa de membrana.

En algunas modalidades, el pre-tratamiento de una muestra biológica con una neuraminidasa proporciona una ventaja en la velocidad de reacción. En algunas modalidades, el pre-tratamiento de la muestra se lleva a cabo mediante la incubación de una muestra con neuraminidasa durante menos de 30 minutos.

Los ejemplos de tratamiento con neuraminidasa se proporcionan en el presente documento. En general, se agrega una cantidad apropiada de la neuraminidasa al suero o al plasma y se incuba a una temperatura que es adecuada para la reacción (por ejemplo, a aproximadamente 4, 8, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 37, 40, 45, 50, 55, 60, 65, O 70°C) durante un periodo de tiempo adecuado. La cantidad de neuraminidasa agregada a la reacción depende de la actividad de la enzima y la propiedad del suero. En algunas reacciones, aproximadamente 0.01, 0.05, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, 2, 2.2, 2.4, 2.6, 2.8, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 O 10 unidades (U) de neuraminidasa/litro se utiliza en la etapa de pre-tratamiento. La neuraminidasa puede prepararse en una solución amortiguadora adecuada (por ejemplo, acetato de sodio 100 mM, pH 5.5, 0.15 M NaCl 4 mM CaCl2). En algunas modalidades, el tratamiento se lleva a cabo mediante la incubación de la muestra biológica con neuraminidasa durante aproximadamente o menos de 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 90, o 120 minutos. Una reacción de neuraminidasa puede terminarse por la adición de una "solución de terminación", que es una solución que puede utilizarse para inactivar la enzima neuraminidasa, pero que no causa ningún o causa mínimo daño a la muestra. En un ejemplo, una solución de terminación es 1,5% de citrato de sodio en solución de fosfato de sodio, pH 8,2. En un ejemplo, una reacción de terminación que utiliza una solución de terminación es agregar 5 volúmenes de 1.5% de citrato de sodio en fosfato de sodio pH 8.2 a una reacción de neuraminidasa, e incubar la mezcla a 56°C durante 5 minutos.

En algunas modalidades, el pre-tratamiento se lleva a cabo mediante la incubación de la muestra biológica con neuraminidasa, y en donde la concentración final de la neuraminidasa en la mezcla es de aproximadamente 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1, 1.2, 1.4, 1.6, 1.8, o 2 U/litro, o más o menos.

Después de la inactivación, la reacción puede enfriarse a temperatura ambiente. En algunas modalidades, se diluye la muestra tratada (por ejemplo, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, o 1:10 de dilución) antes de utilizarse para los ensayos proporcionados en la presente.

Los ensayos pueden conducirse con diluciones en serie de una muestra biológica, un antígeno, eritrocitos, partículas virales, partículas de aglutinación, partículas de visualización, anticuerpos, o cualquier combinación de los mismos. Sin embargo, en algunas modalidades, la necesidad de dilución en serie se reduce o elimina mediante el uso de los métodos descritos en la presente para el rápido análisis del ensayo de aglutinación.

D. Analitos Objetivo Los métodos proporcionados en la presente se utilizan para detectar un analito objetivo en la muestra biológica. El analito objetivo puede ser, sin limitación, un anticuerpo, un antígeno, una partícula viral, una partícula bacteriana, o una partícula de aglutinación.

D 1. Analitos Objetivo de Anticuerpos En un aspecto, se proporcionan métodos para detectar y medir los anticuerpos en una muestra biológica. En algunas modalidades, los anticuerpos detectables se unen selectivamente a una partícula viral. En algunas modalidades, los anticuerpos detectables se unen selectivamente a una partícula de aglutinación.

En algunas modalidades, una muestra es cualquier antisuero que contiene anticuerpos que se unen a uno o más epítopos sobre una partícula viral que tiene la capacidad de aglutinar eritrocitos, o se sospecha que tiene la capacidad de aglutinar eritrocitos. Alternativa o adicionalmente, el antisuero puede ser cualquier antisuero que contiene anticuerpos que se unen a uno o más epítopos de una proteína hemaglutinina, o se sospecha que contiene anticuerpos que tienen la capacidad de unirse a uno o más epítopos de una proteína hemaglutinina. Alternativa o adicionalmente, el antisuero puede ser cualquier antisuero que contiene anticuerpos que se unen a uno o más epítopos presentes en una partícula de aglutinación. El antisuero puede ser suero obtenido de cualquier fuente viva, tal como un humano, pájaro, caballo, conejo, ratón, cabra, cerdo, cobayo, o rata. La fuente viva del antisuero puede haberse inmunizado con un antígeno particular, aunque la fuente viva no necesita haberse expuesto específicamente al antígeno. El antisuero puede ser también un suero producido in vitro para contener anticuerpos que se unen a un virus, una proteína hemaglutinina, o una partícula de aglutinación. Los anticuerpos pueden ser monoclonales o policlonales. Además, los anticuerpos pueden ser de longitud completa, o un fragmento de unión a antígeno, tales como Fab, F(ab)2, o fragmentos Fv y anticuerpos de cadena sencilla. Los anticuerpos también pueden ser anticuerpos de origen natural, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos. Cualquier anticuerpo que se una a un virus aglutinante, una proteína hemaglutinina, o partícula de aglutinación, cualquiera que sea la fuente, puede utilizarse en los ensayos. También pueden utilizarse otros tipos de reactivos que se unen específicamente a la hemaglutinina o partículas de aglutinación y bloquean o inhiben la aglutinación. Ejemplos de tales aglutinantes incluyen, sin limitación, aptámeros y lectinas.

En algunas modalidades, un plasma, suero o muestra de antisuero se deriva de un sujeto al que se le ha administrado una vacuna contra un virus aglutinante o partícula de aglutinación. Así también se proporcionan en la presente los métodos para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que puede valorarse al detectar y/o medir la presencia de anticuerpos contra un virus aglutinante o partícula de aglutinación en una muestra del sujeto utilizando un ensayo de HAI de la exposición.

El experto en la téenica entenderá que la concentración de los antisueros o anticuerpos utilizados en un ensayo particular dependerá de una variedad de diferentes factores, tales como la fuente de los antisueros, el tipo de anticuerpo en el antisuero, la afinidad de la anticuerpos en el antisuero, la concentración de componentes que no son anticuerpos de los antisueros, el volumen de muestra, y la fuente y concentración de los otros componentes que se utilizan en un ensayo. Además, la concentración de los antisueros a utilizarse en un ensayo puede ser en algunos casos en base al valor conocido de la dilución más baja de los antisueros a la que los anticuerpos en los antisueros pueden bloquear que se produzca la hemaglutinación en un ensayo de HAI convencional. Las concentraciones más altas y más bajas de los antisueros pueden utilizarse como puntos de inicio en un ensayo proporcionado en el presente documento sobre la base de esta dilución. Por ejemplo, si una dilución 1:128 es la dilución más baja de los antisueros a la puede bloquearse la hemaglutinación en un ensayo de HAI convencional, en las modalidades, las diluciones de 1:64, 1:128, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096 y 1:8192 pueden utilizarse con los métodos proporcionados en la presente. El experto en la téenica entenderá que puede utilizarse cualquier dilución del antisuero, o cualquier serie de diluciones, ya sea en base a un factor de 2, o algún otro número. En un aspecto, la concentración del anticuerpo en la mezcla final de un ensayo puede ser de aproximadamente, por ejemplo, 0.1, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10, 20, 30, 40, o 50 nM. En otro aspecto, la concentración del anticuerpo en la mezcla final de un ensayo puede ser de aproximadamente, por ejemplo, 2 ng/ml, 5 ng/ml, 10 ng/ml, 20 ng/ml, 50 ng/ml, 100 ng/ml, 200 ng/ml, 500 ng/ml, 2 mg/ml, 4 mg/ml, 6 mg/ml, 8 mg/ml, 10 mg/ml, o 20 mg/ml. En tales aspectos, la constante de disociación de los anticuerpos en el antisuero para un epítopo viral (KD) puede ser de aproximadamente 0.01, 0.05, 0.1, 0.5, 1, 5, 10, 20, 30, 40 o 50 nM. En un aspecto, la concentración de un virus en la mezcla del ensayo final puede ser de aproximadamente 5, 10, 15, o 20 unidades de hemaglutinación/ml. Las unidades de hemaglutinación (unidades HA) son la dilución más baja del virus a la que se produce la hemaglutinación en un ensayo de HA convencional.

Los métodos de la exposición proporcionan mejoras para la detección y/o medición de los anticuerpos en una muestra, y en algunas modalidades, la cantidad total de tiempo para llevar a cabo el método es de aproximadamente o menos de 500, 400, 300, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 90, 75, 60, 45, 40, 30, 25, 50, 15, 10, o 5 minutos. En algunas modalidades, la cantidad de tiempo total para llevar a cabo el método es de entre aproximadamente 30 a 60 minutos.

En las modalidades, en los ensayos de HAI para determinar la cantidad de un anticuerpo de interés en una muestra, una cantidad conocida de partícula viral u otra de aglutinante y/o una cantidad conocida de partículas de visualización se utilizan con una muestra que contiene una cantidad desconocida del anticuerpo de interés. El anticuerpo de interés puede unirse específicamente a la partícula viral u otra aglutinante de la cantidad conocida. En las modalidades, la medición del efecto de una muestra que contiene un anticuerpo de interés sobre la capacidad de la cantidad conocida de partícula viral u otra aglutinante para aglutinar partículas de visualización puede permitir la determinación de la cantidad del anticuerpo de interés en la muestra. La unión del anticuerpo de interés a la partícula viral u otra aglutinante puede inhibir la partícula de causar la aglutinación de partículas de visualización. En estos ensayos, la presencia de anticuerpos en una muestra contra una partícula viral u otra aglutinante puede reducir o eliminar la actividad aglutinante de la partícula.

D2. Analitos de partículas virales En otro aspecto, se proporcionan en la presente métodos para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica.

Muchos virus se unen a moléculas presentes en la superficie de los GRs. Una consecuencia de esto es que a ciertas concentraciones, las suspensiones virales pueden aglutinar los GRs mediante la unión a receptores de superficie o modificaciones de los receptores, incluyendo el ácido N-acetilneuramínico. La unión múltiple de una pluralidad de GRs a una sola partícula de virus o bacteria da como resultado la aglutinación de GRs (hemaglutinación). Los virus que promueven la aglutinación de esta manera se conocen como virus aglutinantes. En algunas modalidades, los métodos de la descripción se utilizan para detectar o medir los virus aglutinantes. En otras modalidades, los métodos de la descripción se utilizan para detectar o medir los anticuerpos contra los virus aglutinantes.

Virus aglutinante incluyen virus de muchos diferentes tipos, incluyendo, pero sin limitarse a, picornavirus, coronavirus, togavirus, flavirvirus, rabdovirus, paramixovirus, ortomixovirus, bunyavirus, arenavirus, reovirus, retrovirus, papilomavirus, parvovirus, herpesvirus, poxvirus, hepadnavirus y virus espongiforme. Otros virus aglutinantes pueden incluir influenza, virus del herpes simple 1 y 2, sarampión, dengue, viruela, poliomielitis, V1H, H1N1 en Islas Salomón, el virus H3N2 de Wisconsin, virus de Vietnam H5N1 aviar, virus de hepatitis B (VHB), virus de hepatitis C (VHC ), y cualquier cepa del virus de la influenza.

Además los virus aglutinantes incluyen virus de primates no humanos, cuyos ejemplos no limitativos son herpesvirus Aotine 1, herpesvirus Aotine 3, herpesvirus de Cercopithecine 1 (virus B, HV simiae), herpesvirus Cercopithecine 2 (SA8), herpesvirus Cercopithecine 3 (SA6 ), herpesvirus Cercopithecine 4 (SAIS), herpesvirus Cercopithecine 5 (citomegalovirus del mono verde africano), herpesvirus Cercopithecine 6 (virus del mono vervet Liverpool), Herpesvirus Cercopithecine 7 (HV de mono Patas; MMV o PHV de HV delta), herpesvirus Cercopithecine 8 (citomegalovirus de mono Rhesus), herpesvirus Cercopithecine 9 (HV de varicela de simio macaco LV de Medical Lake), herpesvirus Cercopithecine 10 (leucocitos Rhesus Asoc. cepa LV IT), herpesvirus Cercopithecine 12 (HV de babuino LV papio,), herpesvirus Cercopithecine 13 (herpesvirus cyclopis), herpesvirus Cercopithecine 14 (virus tipo EBV de mono verde africano), herpesvirus Cercopithecine 15 (HV tipo EBY de Rhesus), herpesvirus Ateline 1 (HV de mono de araña), herpesvirus Ateline 2 (HV Ateles), herpesvirus Callitrichine (HV saguíneo), herpesvirus Callitrichine (SSG, citomegalovirus de mono titi), herpesvirus Cebine 1 (HV Capuchino), herpesvirus Cebine 2 (HV Capuchino), herpesvirus Pongine 1 (HV de Chimpancé; HV pan), herpesvirus Pongine 2 (HV de orangután), herpesvirus Pongine 3 (HV de Gorilla), herpesvirus Saimiriine 1 (HV de mono tití, herpes T), tamarinus, HV platyrrhinae, (herpesvirus tipo Saimiriine 2) HV de mono ardilla, y HV saimirí.

Los virus aglutinantes también pueden referirse a virus de mamíferos incluyendo, pero sin limitarse a: herpesvirus bovino 1-5, herpesvirus ovino 1-2, herpesvirus Alcelaphine 1, Parvovirus (incluyendo el minúsculo virus de ratón, la enfermedad de visón aleutiano, parvovirus bovino, parvovirus canino, parvovirus de pollo, panleucopenia felina, parvovirus felino, parvovirus del ganso, parvovirus HB, parvovirus H-l, parvovirus lapino de rata Kilham, enteritis del visón) eritrovirus (incluyendo tipo adeno-asociado 1-5, adeno-asociado bovino, adeno-asociado canino, adeno-asociado equino, adeno-asociado ovino).

Ejemplos Adicionales no limitantes de virus aglutinantes pueden incluir: Mosaico de Coliflor, Badnavirus, Geminivirus, Retrovirus de Planta, Criptovirus, Rhabdoviridae, Mosaico de Tomate Manchado, Tenuivirus, Virus de Papa, Potiyviridae, Closterovirus, Mosaico de Nabo Amarillo, Mosaico de Tomate Espeso, Luteovirus, Sequiviridae, Mosaico de Tabaco, Mosaico de Caupí, Mosaico Enation Pea, Mosaico de las Nervaduras de Trébol Rojo, Mosaico de Bromo, Mosaico del Pepino, Mosaico de la Alfalfa, Mosaico de Cebada Amarilla, Vena Amarilla de Remolacha Necrótica, y los virus de ARN de doble cadena.

Los virus de las siguientes familias también se incluyen para su uso en los métodos de la descripción: Baculoviridae y Nudivirus, Polydnaviridae, Ascoviridae, Nodaviridae Tetraviridae, Tetraviridae, Tombusviridae, Coronaviridae, Flaviviridae, Togaviridae, Bromoviridae, Barnaviridae, Totiviridae, Partitiviridae, Hypoviridae, Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyavinrdae, Arenaviridae, Leviviridae, Picornaviridae, Sequiviridae, Comoviridae, Potyviridae, Calciviridae, Astroviridae, Nodaviridae, Inoviridae, Microviridae, Geminiviridae, Circoviridae, Parvoviridae, Haepadnaviridae, Retroviridae, Cystoviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Myoviridae, Siphoviridae, Podoviridae, Tectiviridae, Corticoviridae, Plasmaviridae, Lipothrixviridae, Fuselloviridae, Poxviridae, virus similares a la fiebre porcina africana, Iridoviridae, Phycodnaviridae, Baculoviridae, Herpesviridae, Adenoviridae, Papovaviridae, Polydnaviridae, Picornaviridae, Caliciviridae, Astroviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Arterivirus , Paramyxoviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae, Birnaviridae, Retroviridae, Hepadnaviridae, Circoviridae, Parvovíridos, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae, Poxviridae e Iridoviridae.

El experto en la téenica entenderá que la concentración del virus utilizado en un ensayo particular dependerá de varios diferentes factores, tales como la identidad del virus, volumen de la muestra, y la fuente y la concentración de los otros componentes que se utilizan en un ensayo. Además, la concentración del virus a utilizarse en un ensayo generalmente se basa en el valor conocido de la dilución más baja del virus en la que se produce la hemaglutinación en un ensayo de HA convencional. Esta dilución se considera ser 1 unidad de la hemaglutinación ("unidad de HA" o "HAU"). Las concentraciones más altas y más bajas de virus, en base a 1 HAU, pueden utilizarse como puntos de inicio en un ensayo. Por ejemplo, si una dilución 1:128 es la dilución más baja del virus en la que se produce la heaglutinación en un ensayo de HA convencional, en las modalidades, las diluciones de 1:64, 1:128, 1:256, 1:512, 1:1024, 1:2048, 1:4096 y 1:8192 pueden utilizarse con los métodos proporcionados en la presente. El experto en la materia comprenderá que cualquier dilución del virus puede utilizarse, o cualquier serie de diluciones, ya sea en base a un factor de 2, o algún otro número.

D3. Analitos Bacterianos En algunas modalidades, pueden utilizarse los métodos de la descripción para la detección de bacterias, que pueden tener la capacidad de unirse a moléculas de la superficie celular en GRs o partículas de visualización e inducir la agregación/aglutinación.

D4. Analitos de las Partículas de Aglutinación En algunas modalidades, los métodos de la descripción pueden utilizarse para detectar cualquier partícula que pueda unirse y causar la agregación de células o microesferas. Tales partículas se denominan en la presente como "partículas de aglutinación". Las partículas de aglutinación pueden incluir, sin limitación, virus, bacterias, partículas virales, alérgenos, y anticuerpos. En otros ejemplos, las partículas de aglutinación incluyen proteínas y carbohidratos que tienen especificidad de unión a la superficie de los GRs u otras células (por ejemplo, lectinas). Además, en el contexto de microesferas (que, como se trata más adelante, se pueden preparar para tener una amplia variedad de moléculas en su superficie), cualquier molécula que pueda unirse a una molécula en la superficie de una microesfera puede funcionar como una partícula de aglutinación.

E. Los eritrocitos En un aspecto, la descripción proporciona métodos para detectar y medir la aglutinación de los glóbulos rojos ( "GRs"), un término utilizado de manera intercambiable con "eritrocitos".

Los eritrocitos son células-que suministran oxígeno que contienen hemoglobina, una biomolécula que contiene hierro que puede unirse al oxígeno y es responsable del color rojo de la sangre. Los eritrocitos de diferentes organismos pueden utilizarse en los métodos descritos en el presente documento, siempre que las células tengan el potencial para aglutinarse en presencia de una partícula de aglutinación tal como un virus. Los eritrocitos adecuados incluyen, sin limitación, eritrocitos aviares, tales como glóbulos rojos de ganso, pollo, pato y pavo, y los eritrocitos de mamíferos, tales como eritrocitos humanos, eritrocitos de cobayo, eritrocitos de ratón, eritrocitos de rata, eritrocitos bovinos, eritrocitos equinos, eritrocitos de cabra y eritrocitos de oveja. Los eritrocitos humanos pueden ser de un donante de cualquier grupo sanguíneo, tales como eritrocitos del grupo A, eritrocitos del grupo B, eritrocitos del grupo AB, y eritrocitos del grupo O.

En algunas modalidades, los eritrocitos pueden ensayarse para la aglutinación, y la concentración de los eritrocitos puede seleccionarse de tal manera que se encuentren presentes en una concentración por debajo de aproximadamente 0.01% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 0.05% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 0.1% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 0.15% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 0.2% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 0.5% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 1% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 5% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 10% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 15% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 20% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 30% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 40% de hematocrito, por debajo de aproximadamente 50% de hematocrito.

El hematocrito (Ht o HCT) o el volumen de celulas empaquetadas (PCV) o la fracción de volumen de eritrocitos (EVF) es el porcentaje del volumen de sangre que está ocupado por los glóbulos rojos.

El. Fijación de eritrocitos.

En algunas modalidades, los eritrocitos que se ensayan utilizando los métodos proporcionados en la presente se pre-tratan.

El reactivo de glóbulos rojos utilizado en los métodos de hemaglutinación tradicionales debe prepararse en fresco utilizando un elaborado procedimiento de lavado. El procedimiento tradicional es laborioso, inconveniente y tardado. En contraste, en algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente utilizan una sola preparación de glóbulos rojos fijados estables, de manera que no se requiere ninguna preparación de reactivos en el momento de realizar el ensayo.

El pre-tratamiento puede incluir la pre-fijación de eritrocitos para producir eritrocitos pre-fijados. La pre fijación de eritrocitos puede proporcionar numerosas ventajas, incluyendo la reducción del tiempo del ensayo debido a la eliminación de la necesidad de preparar en fresco los eritrocitos de las muestras sanguíneas, y la reproducibilidad de los ensayos de aglutinación debido al uso de muestras de eritrocitos pre-fijadas uniformes. Los métodos para la fijación de los eritrocitos son conocidos en la téenica e incluyen los descritos en la Patente de E.U. No. 5.994.139.

En algunas modalidades, los eritrocitos se pre fijan mediante el tratamiento con un aldehido orgánico que incluye monoaldehídos tales como formaldehído, aldehidos tales como glutaraldehído, y formas poliméricas tales como paraformaldehído que se encuentran en equilibrio con el formaldehído. En algunas modalidades, los eritrocitos se pre-fijan mediante el tratamiento con glutaraldehído. Las células fijadas son esencia e indefinidamente estables (en contraste con los glóbulos rojos frescos que deben prepararse diariamente y pueden variar de día a día). La fijación no inactiva los receptores de la superficie celular a la que se une la hemaglutinina viral.

En algunas modalidades, los glóbulos rojos de los animales se producen a partir de GRs recién lavados de animal mediante una breve exposición a una solución de glutaraldehído-amortiguador y lavado exhaustivo en solución salina. Este tratamiento conserva en gran medida la antigenicidad original de los eritrocitos mientras hace a las células generalmente resistentes a la lisis por choque osmótico, congelación-descongelación o hemolisis inmune. Estos reactivos pueden utilizarse directamente en los procedimientos de hemaglutinación, o pueden estar acoplados con varias proteínas para las pruebas de hemaglutinación. Los GRs estabilizados con glutaraldehído generalmente se almacenan como suspensión celular en solución salina con 0.1% de azida de sodio.

Los glóbulos rojos estabilizados por la fijación con glutaraldehído se encuentran disponibles a partir de fuentes comerciales, tales como Fitzgerald Industries (Acton, MA), que proporcionan glóbulos rojos de animal estabilizados con glutaraldehído provenientes de bovino, gato, pollo, perro, cabra, cobayo, hámster, caballo, mono, ratón, cerdo, rata, oveja, pavo y conejo, todos los cuales pueden utilizarse en los métodos proporcionados en la presente.

En algunas modalidades, los eritrocitos son glóbulos rojos de pavo estabilizados por la fijación con glutaraldehído. En algunas modalidades, también pueden utilizarse los glóbulos rojos frescos y las células de diferentes especies de animales.

F. Otro tipo de células En algunas modalidades, puede utilizarse las células distintas a los glóbulos rojos para los métodos proporcionados en la presente, siempre y cuando estas células se aglutinen en presencia de una partícula viral, un anticuerpo, u otra partícula de aglutinación. 6. Microesferas En algunas modalidades, los métodos de la exposición se utilizan para medir la agregación de cualquier molécula o partícula no de célula, siempre que los agregados sean lo suficientemente grandes como para detectarse microscópicamente. Tales partículas se denominan en la presente como "microesferas". Así, en los ensayos proporcionados en el presente documento, los GRs pueden reemplazarse con microesferas, cuya superficie se acopla con un antígeno o anticuerpo que se une selectivamente a la partícula, anticuerpo, u otra partícula o sustancia aglutinante viral a detectarse.

Los ejemplos de microesferas adecuadas incluyen microesferas de látex y otras microesferas que se pueden unirse fácilmente a las partículas virales, anticuerpos, proteínas, carbohidratos, o antígenos, y aglutinarse. En una modalidad, las microesferas son perlas. En algunas modalidades, las microesferas contienen látex, oro, vidrio o sílice. En una modalidad, las microesferas son microesferas de látex recubiertas con un receptor que se une a una partícula viral. En una modalidad, las microesferas se encuentran recubiertas con proteína hemaglutinina o un antígeno de agrupamiento sanguíneo (por ejemplo, antígeno A, B, D, etc.).

En algunas modalidades, los métodos de la exposición emplean microesferas recubiertas de antígeno para las pruebas de aglutinación. No obstante el nombre, las microesferas puede ser de cualquier forma, incluyendo, sin limitación, esférica, cuboide, cilindrica, e irregular. Pueden comprender cualquier material adecuado para la unión al antígeno y su uso en ensayos de aglutinación.

El antígeno puede acoplarse a una tnicroesfera . Los métodos de unión de antígenos a las perlas de microesferas se conocen en la téenica. El acoplamiento puede ser a la superficie de la microesfera o a la superficie interna que es accesible desde la superficie exterior. Los antígenos pueden acoplarse a perlas, tales como las proporcionadas por Luminex Corporation (Austin, TX) mediante un proceso de carbodiimida de dos etapas de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. En algunas modalidades, el antígeno puede adsorberse o unirse covalentemente a la microesfera.

En algunas modalidades, puede utilizarse una pluralidad de antígenos, cada uno acoplado a microesferas separarse o a las mismas. Los antígenos utilizados para acoplar a las microesferas incluyen porciones antigénicas de los virus que pueden reconocerse por anticuerpos o partículas de aglutinación utilizando los métodos proporcionados en la presente. Las porciones antigénicas de los virus incluyen, pero no se limitan a, proteínas de membrana virales y proteínas no estructurales. En algunas modalidades, puede utilizarse una mezcla de microesferas, cada una acoplada a un diferente antígeno o anticuerpo.

H. Proteínas no específicas y otras moléculas En algunas modalidades, se agrega una proteína no específica a un ensayo de aglutinación para acelerar la reacción de aglutinación. La adición de una proteína no específica puede acelerar la reacción por aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 10 veces, 20 veces, o por más de 30 veces. Las proteínas no específicas adecuadas incluyen albúminas, incluyendo, pero sin limitarse a, albúminas de diferentes animales, tales como bovino, caballo, oveja, cabra, pollo y humano. Otros ejemplos no limitantes de albúminas incluyen albúmina de suero bovino, albúmina de suero humano, albúmina de huevo de pollo, lactoalbúmina bovina y la lactoalbúmina humana.

Además, tambien pueden utilizarse otras especies macromoleculares para acelerar la aglutinación, tales como polímeros sintéticos (por ejemplo, polietilenglicol (PEG), polietilenoxido (PEO)), polímeros de azúcar (por ejemplo, dextrano), sulfato de dextrano, di-etilaminoetil-dextrano (DEAE-dextrano) y polivinil piolidona.

La cantidad de aditivo no específica que se agrega al ensayo puede variar, y generalmente es aproximadamente cualquier cantidad entre 0.1-50 mg/ml. En ciertos métodos, 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 mg/ml de aditivo no específico se agrega al ensayo. En algunas modalidades, no más de 0.5, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, o 50 mg/ml de aditivo no específico se agrega al ensayo.

El aditivo no específico puede agregarse al amortiguador diluyente u otro amortiguador/reactivo utilizado en los ensayos. ión Las composiciones, métodos, sistemas y dispositivos descritos en la presente proporcionan múltiples diferentes ventajas para los ensayos de aglutinación sobre los ensayos de aglutinación convencionales.

II. Aumento de la sensibilidad En las modalidades, los métodos proporcionados en la presente pueden tener aumento de la sensibilidad para detectar la aglutinación sobre los ensayos de aglutinación convencionales. lia. Aumento de la sensibilidad - Análisis de Imágenes En una modalidad, la sensibilidad del ensayo de aglutinación puede aumentarse mediante el uso del análisis de imágenes para analizar las reacciones de aglutinación (tratadas más adelante). El uso del análisis de imágenes puede aumentar la sensibilidad del ensayo sobre ensayos de aglutinación convencionales por aproximadamente 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, o 100 veces.

Ilb. Aumento_ de_ la_ Sensibilidad_ -_ Etapas_ de Concentración/Dilución En otra modalidad, la sensibilidad del ensayo de aglutinación puede aumentarse mediante la concentración de una mezcla de reacción que contiene partículas de aglutinación (por ejemplo, partículas virales) y partículas de visualización (por ejemplo GRs o microesferas), seguida por la dilución del material concentrado y el posterior análisis de aglutinación. En este método, las partículas de aglutinación y las partículas de visualización se colocan en estrecha proximidad en la etapa de concentración para facilitar la unión de las partículas de aglutinación a las partículas de visualización. Después, en la etapa de dilución del material concentrado, sólo las partículas de visualización agregadas específicamente permanecen aglutinadas (es decir, las partículas de visualización que no se agregan específicamente durante la etapa de concentración no permanecen agregadas durante la etapa de dilución). Utilizando este método, pueden utilizarse menos partícula de aglutinación en el ensayo para producir la aglutinación detectable. De manera correspondiente, en los ensayos de HAI, se necesitará menos anticuerpo en la muestra para causar la inhibición de la aglutinación. Por lo tanto, ya que se necesita menos partícula de aglutinación y/o menos anticuerpos para causar la aglutinación o la inhibición de la aglutinación, este método puede aumentar la sensibilidad de los ensayos de aglutinación En una modalidad, la sensibilidad del ensayo de aglutinación puede incrementarse al realizar un ensayo de aglutinación con un método que incluye las siguientes etapas. En primer lugar, se mezcla una muestra biológica sospechosa de contener un anticuerpo de interés con una partícula de aglutinación y las partículas de visualización y se incuban. En algunos aspectos, la muestra biológica puede incubarse con la partícula de aglutinación antes de la adición de las partículas de visualización. En segundo lugar, la reacción que contiene las partículas de aglutinación, las partículas de visualización, y la muestra sospechosa de contener un anticuerpo de interés se centrifuga para generar un gránulo. Típicamente, la centrifugación con este método es suave (de cientos a pocos miles x g durante aproximadamente pocos minutos) a fin de no generar complejos que serían difíciles de resuspender. En tercer lugar, se retira el sobrenadante, y el sedimento se lava una o dos veces con un amortiguador que no interfiera con las partículas aglutinadas o las partículas de visualización. En cuarto lugar, el sedimento lavado se resuspende en el amortiguador. En quinto lugar, la mezcla de reacción resuspendida se analiza para la aglutinación.

En otra modalidad, en un ensayo de aglutinación utilizando anticuerpos como las partículas de aglutinación, la sensibilidad del ensayo puede aumentarse aún más al agregar a una reacción de aglutinación lavada un anticuerpo contra el tipo de anticuerpo de interés. En una modalidad, en una reacción de aglutinación que contiene las etapas de concentración/dilución descritas anteriormente, si el anticuerpo de interés es humano, cuando se resuspende el sedimento lavado, la globulina anti-humana (reactivo de Coombs) también se agrega al sedimento resuspendido. Después de la incubación del sedimento resuspendido con la globulina anti-humana, se analiza la reacción resuspendida para la aglutinación. En este método, la globulina anti-humana se une al anticuerpo de interés, que puede unirse a la partícula de visualización. Ya que la globulina anti-humana puede reunir múltiples anticuerpos de los anticuerpos de interés, y cada uno de estos anticuerpos pueden estar unidos a una o más partículas de visualización, la adición de la globulina anti humana puede aumentar la sensibilidad del ensayo de aglutinación. La especificidad de este método puede aumentarse aún más mediante el uso de IgM, IgG, o IgA anti humano, en lugar de la globulina anti-humana, a fin de identificar los tipos particulares de anticuerpos. 12. El aumento de velocidad En un aspecto, los ensayos proporcionados en el presente documento pueden proporcionar ventajas en términos de velocidad. Los ensayos de aglutinación tradicionales, requieren una etapa de pre-tratamiento con la incubación de al menos 12-18 horas. En algunos métodos de la descripción, la etapa de pre-tratamiento se realiza en menos de 15 minutos, menos de media hora, menos de una hora, o menos de dos horas. Además, los métodos de la exposición eliminan la necesidad de la preparación reciente de eritrocitos, un proceso que puede durar 4 horas utilizando procedimientos tradicionales. En los métodos tradicionales de ensayo de HAI, la incubación de una muestra que puede contener anticuerpos de interés con el antígeno viral y los eritrocitos se llevan a cabo en dos etapas separadas, pero en algunas modalidades descritas en la presente, el antígeno viral y los eritrocitos se agregan juntos a una muestra que puede contener los anticuerpos de interés en una sola etapa. En las modalidades, un ensayo de HA o un ensayo de HAI de la exposición se lleva a cabo en menos de una hora, menos de 1.5 horas, menos de 2 horas, a menos de 2.5 horas, o menos de 3 horas.

Los métodos de la exposición proporcionan mejoras para la detección y/o medición de los virus en una muestra, y en algunas modalidades, la cantidad de tiempo total para llevar a cabo el método es de menos de 500, 400, 300, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 90, 75, 60, 45, 30, 15, 10, o menos de 5 minutos. En algunas modalidades, la cantidad de tiempo total para llevar a cabo el método es de entre 30 a 60 minutos.

I2a. Aumento de velocidad - Análisis de Imágenes En una modalidad, la velocidad de ensayo de aglutinación puede incrementarse mediante el uso del análisis de imágenes para analizar las reacciones de aglutinación (tratadas más adelante).

I2b. Aumento de Velocidad- Reactivos y Etapas de Ensayo En otras modalidades, la velocidad del ensayo de aglutinación puede incrementarse con el uso de reactivos y/o etapas de ensayo mejorados para acelerar el rendimiento y/o análisis de las reacciones de aglutinación. Por ejemplo, como se describe en la presente en otra parte, las mejoras en cualquiera o más del pre-tratamiento de la muestra (por ejemplo, mediante el uso de neuraminidasa), el uso de GRs o microesferas pre-fijados, el uso de etapas del ensayo combinadas (por ejemplo, por la mezcla de partículas aglutinando , partícula de visualización, y la muestra que contiene el anticuerpo en una sola etapa de incubación, en lugar de incubar primero la partícula de aglutinación y la muestra que contiene anticuerpo antes de la adición de la partícula de visualización), y la mejora en la composición de medio de ensayo puede reducir el tiempo necesario para obtener los resultados precisos del ensayo de aglutinación. 13. Disminución de Volumen En un aspecto, los métodos proporcionados en la presente pueden proporcionar ventajas en términos del volumen de reacción. En algunas modalidades, los métodos del ensayo de aglutinación proporcionados en la presente pueden llevarse a cabo en un volumen de reacción de aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1 microlitros, o menos.

En algunas modalidades, los ensayos de aglutinación proporcionados en la presente pueden llevarse a cabo utilizando aproximadamente 50, 40, 30, 20, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0.1 microlitros, o menos de muestra sanguínea.

J. Ensayos General - de aglutinación La detección de la aglutinación generalmente implica tomar imágenes del producto de reacción de la aglutinación utilizando un dispositivo de formación de imágenes, tales como un escáner, una cámara, detector o sensor. En algunas modalidades, se acoplada un dispositivo de formación de imágenes a un microscopio.

En general, el ensayo se realiza utilizando un dispositivo que es capaz de mantener las reacciones, tal como una placa de microtitulación (por ejemplo, de 96 pozos, u otro formato), un tubo de ensayo, un tubo de microcentrífuga, un tubo capilar, una punta de pipeta u otro recipiente. Una muestra biológica pre-tratada que contiene el anticuerpo a detectarse se diluye opcionalmente en serie con un amortiguador diluyente (por ejemplo, PBS con BSA). A continuación, las partículas virales pueden agregarse a un recipiente y el contenido de cada recipiente se puede mezclar suavemente. Entonces, puede agregarse la suspensión de GRs prefijados, seguida por un mezclado suave. La reacción se incuba durante un periodo de tiempo adecuado, por ejemplo, un total de aproximadamente 15 minutos. Sin embargo, puede utilizarse también una incubación total más corta o más larga que 15 minutos, tal como aproximadamente 5, 10, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60 minutos, o más corto o más largo. La incubación puede conducirse a temperatura ambiente (es decir, 25°C), o a una temperatura que sea inferior o superior a la temperatura ambiente, tal como aproximadamente 4, 8, 12, 14, 16, 20, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, o 70°C. La temperatura y la duración de la incubación pueden optimizarse para lograr tanto velocidad como precisión de los ensayos. La placa se lee entonces en un escáner y se toma una imagen final de punto extremo de la placa, preferiblemente cuando la placa se inclina a 20 - 75°, tal como a aproximadamente 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 , 55, 60, 65, 70, o 75° respecto a la horizontal.

En algunas modalidades, la imagen del ensayo de aglutinación se captura con un dispositivo óptico que contiene un microscopio. En estas modalidades, el ensayo se lleva a cabo en general como se describió anteriormente, excepto que después que los GRs prefijados o partículas de visualización se agregan a la reacción, una pequeña muestra (por ejemplo 1-2m1) de los pozos se transfiere directamente a una cubeta, y se representa en imagen bajo un dispositivo óptico que contiene un microscopio. Las imágenes se recolectan y analizan para calcular los factores de asociación como se describe en más detalle en este documento.

La duración para realizar el ensayo de aglutinación se optimiza en general para lograr tanto velocidad como precisión del ensayo. En algunas modalidades, la realización del ensayo y la detección de la aglutinación tienen lugar en menos de una hora, tal como aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, o 60 minutos. En algunas modalidades, la realización del ensayo y la detección de la aglutinación tienen lugar en más de una hora, pero menos de 2, 3, 4, 5, 6, 7, u 8 horas.

En algunas modalidades, un ensayo de aglutinación puede realizarse en un sistema o dispositivo en donde una o más etapas del ensayo de aglutinación se encuentran automatizadas y/o controladas a través de una infraestructura de computación en nube. Por ejemplo, los ensayos de aglutinación como se describen en el presente documento pueden realizarse en un sistema o dispositivo como se describe en la Solicitud de E.U. No. 13/244.947 o la Solicitud de E.U. No.13/355.458, que se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad.

En una modalidad, un dispositivo incluye un componente capaz de agregar una partícula de aglutinación a una muestra bajo condiciones adecuadas para la aglutinación (y con ello iniciar un ensayo de aglutinación); un componente capaz de obtener un conjunto de imágenes del ensayo de aglutinación; y un componente capaz de analizar el conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra. El componente capaz de analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede ser parte del mismo aparato dentro del dispositivo como el componente que se configura para obtener más de una imagen del ensayo de aglutinación. El componente capaz de analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede integrarse en el dispositivo. El componente capaz de analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede configurarse para realizar múltiples tipos de análisis y/o puede utilizarse para múltiples aplicaciones en el dispositivo. Un componente capaz de analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede ubicarse de forma remota del dispositivo. Un componente capaz de analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra pueden ubicarse en una infraestructura de computación en nube (por ejemplo, computación en nube). Un componente capaz de analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede ubicarse en la nube, y el dispositivo puede configurarse para controlarse dinámicamente desde la nube. En algunas modalidades, el dispositivo se configura para afectar a un procedimiento secundario en base a los resultados de un análisis de ensayo de aglutinación. En algunas modalidades, un dispositivo capaz de realizar un ensayo de aglutinación tal como se describe en el presente documento puede configurarse como un dispositivo descrito en, por ejemplo, la E.U. No. de serie 13/244.947, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

En una modalidad, un sistema descrito en la presente puede incluir un dispositivo capaz de agregar una partícula de aglutinación a una muestra bajo condiciones adecuadas para la aglutinación, iniciando de este modo un ensayo de aglutinación; una cámara capaz de obtener un conjunto de imágenes de un ensayo de aglutinación; y una computadora capaz de analizar el conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra. La computadora configurada para analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede ser parte del mismo aparato dentro del sistema como la cámara que se configura para obtener un conjunto de más de una imagen del ensayo de aglutinación. La computadora configurada para analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede incorporarse en el sistema. La computadora configurada para analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede configurarse para realizar múltiples tipos de análisis y/o puede utilizarse para múltiples aplicaciones dentro del sistema. La computadora configurada para analizar un conjunto de imágenes para medir la aglutinación de la muestra puede ubicarse de forma remota desde una cámara configurada para obtener un conjunto de más de una imagen del ensayo de aglutinación. La computadora configurada para analizar un conjunto de imágenes de un ensayo de aglutinación puede ubicarse en la nube. La computadora configurada para analizar un conjunto de imágenes de un ensayo de aglutinación puede ubicarse en la nube, y el sistema puede configurarse para controlarse dinámicamente desde la nube. El sistema puede configurarse para afectar a un procedimiento secundario en base a los resultados de un análisis de ensayo de aglutinación. En algunas modalidades, un sistema capaz de realizar un ensayo de aglutinación tal como se describe en el presente documento puede configurarse como un sistema descrito en, por ejemplo, la E.U. No. de serie 13/244,947, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad.

III. Detección y Análisis de Imagen En un aspecto, la presente descripción proporciona ventajosos métodos objetivos para analizar la agregación, aglutinación, o la hemaglutinación en base al análisis de imagen.

En un ensayo de aglutinación tradicional en un tubo cónico o pozo (como en una placa de titulación), la aglutinación se determina mediante observación visual de ya sea la movilidad reducida de los GRs en la parte inferior de un pozo (en el caso de aglutinación), o por el limitado flujo de los GRs empaquetados bajo gravedad cuando se inclina la placa de titulación (en el caso de falta de aglutinación). La movilidad reducida de los GRs en el caso de aglutinación se debe a las fuerzas de atracción entre los GRs y una partícula de aglutinación.

Para leer las reacciones de aglutinación, se han utilizado varios métodos ópticos (visuales). Sin embargo, estos métodos existentes detectan la unión de los GRs entre sí mediante la observación de una propiedad del material en masa de la suspensión mediante simple inspección visual.

En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos para analizar la aglutinación en base al análisis de imágenes. En una modalidad, los métodos de análisis de imágenes se utilizan para analizar el movimiento en masa de los GRs o partículas de visualización en un ensayo de aglutinación en un pozo o tubo cónico. En otra modalidad, los métodos de análisis de imágenes se utilizan para analizar las imágenes microscópicas de los GRs o partículas de visualización en suspensión en un ensayo de aglutinación, a fin de cuestionar la estructura fina de los GRs o suspensión de partículas de visualización.

A. Análisis de Imágenes de Movimiento en Masa de GRs/Partículas de visualización En un aspecto, se proporcionan en este documento los métodos para el análisis de imágenes del movimiento en masa de los GRs y las partículas de visualización. Como se describió anteriormente y en la Figura 3, en un recipiente de reacción cónico (en forma de V) (por ejemplo, tubo o pozo de reacción), las células no aglutinadas generalmente se asientan en un "botón" empaquetado suelto en la parte inferior del recipiente, mientras que las células aglutinadas generalmente se adhieren más firmemente a otras células. Por consiguiente, si un recipiente de reacción cónico que contiene células aglutinadas se inclina, las células generalmente no dejarán el fondo del recipiente, ya que las células se adhieren relativamente fuertemente entre sí. En contraste, si un recipiente de reacción que contiene células no aglutinadas se inclina, algunas células generalmente se moverán lejos de la parte inferior del pozo bajo la gravedad, conduciendo a la formación de un sedimento celular que incluye la forma de "lágrima". Múltiples métodos para el análisis de imágenes de ensayos de aglutinación relacionados con los eventos anteriores se proporcionan en el presente documento.

Al. Movimiento en Masa - Análisis de Imágenes en Ubicaciones Designadas en los Recipientes de Reacción En una modalidad, se proporciona un método para el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando ubicaciones designadas en un recipiente de reacción (por ejemplo, un tubo o pozo de reacción). La Figura 6A-6B muestra diagramas esquemáticos relativos al método. En este método, las zonas 610 se incluyen en y/o junto a la parte inferior de un recipiente de reacción 600. La parte inferior del recipiente de reacción 600 puede contener un sedimento de células 605. Las imágenes del recipiente de reacción se pueden tomar antes, durante, y/o después de la inclinación del recipiente de reacción. La posición de las células puede determinarse con referencia a las zonas designadas en el recipiente de reacción, que pueden utilizarse para determinar el nivel de aglutinación de la muestra y/o para realizar los cálculos relacionados. En algunas situaciones, una "lágrima" de células 615 se puede formar al inclinar el recipiente de reacción. Las células que no se aglutinan pueden formar una forma de lágrima, mientras que las células que se aglutinan pueden no formar una forma de lágrima. Las células que se aglutinan pueden permanecer en un sedimento o en forma de "botón". En algunas situaciones, un ensayo puede dar como resultado la aglutinación parcial de las células. Las zonas 610 pueden tener contornos que abarcan las regiones que contienen las células de botón y/o células de lágrima y algunos de los antecedentes (Figura 6A), o las zonas pueden tener contornos más pequeños que sólo ocupan regiones que pueden contener células de botón o de lágrima (Figura 6B).

En una modalidad, el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando zonas designadas en un recipiente de reacción puede incluir uno o más de las siguientes etapas: En primer lugar, se toma una imagen digital de un pozo que contiene una mezcla de reacción.

En segundo lugar, la imagen se orienta utilizando téenicas de reconocimiento de patrones ya sea por referencia a las marcas de referencia en los pozos de ensayo o por reconocimiento del botón o lágrima.

En tercer lugar, la imagen se orienta con respecto a las zonas en el recipiente de reacción. La señal óptica puede medirse pixel por pixel sobre cada zona. La señal medida puede ser, por ejemplo, utilizando iluminación de luz blanca: a) % de luz transmitida (T) (escala de grises cuando la imagen se obtiene mediante la iluminación posterior), o b) % de luz reflejada (R) (escala de grises cuando la imagen es iluminación frontal). El porcentaje de luz transmitida puede determinarse al tomar la proporción de la transmisión de luz cuando las células se encuentran presentes a cuando no se encuentran presentes células en la trayectoria de la luz; el porcentaje de reflectancia puede determinarse en una manera análoga. Cada una de las mediciones del % T y el % R implica una fuente de iluminación y un detector. En el caso de la transmitancia, la muestra puede colocarse en un recipiente ópticamente transparente en línea y entre la fuente de iluminación y el detector. Si la luz que sale de la fuente de iluminación tiene una intensidad lo, y la luz que llega al detector (después de pasar a través de la muestra) tiene una intensidad I, la transmitancia puede calcularse utilizando T = I/Io.

En cuarto lugar, la transmisión (% de T) o reflectancia (% de R) puede convertirse en absorbancia (A), de acuerdo con la fórmula: (A = -LOG[% T]) (lcy de Beer) o K/S (en donde K = Absorbancia y S es la dispersión) (función Kubelka-Munk) respectivamente. La ley de Beer es la relación entre la absorbancia medida y la concentración del analito.

A y K/S se relacionan directamente con la concentración de especies absorbentes de la luz de la siguiente manera: A = concentración*sM*l*C (donde eM es el coeficiente de extinción molar, 1 es la longitud de la trayectoria de la muestra, y C es la concentración del analito de interés, que es la especie absorbente); K/S = (1-(0.OIR)2)/(2*0.OIR)), respectivamente. Para la dispersión, la fuente de iluminación se encuentra a un ángulo de aproximadamente 90 grados con respecto al detector. La intensidad de la dispersión es la intensidad de la luz (desde la fuente de iluminación) dispersada por la muestra (recolectada por el detector).

Como se muestra en la Figura 7, cuando la intensidad de señal (% T o¾ R) se representan una gráfica contra el número de zonas (de los esquemas de la Figura 6A), se obtiene una relación que indica la respuesta versus el grado de agregación (escala arbitraria).

Aunque las ecuaciones anteriores se aplican a una sola longitud de onda, si se utiliza luz blanca, los valores A o K/S representarán promedios a través de un rango de longitudes de onda. Estos aún proporcionan resultados aceptables para el análisis de aglutinación.

En algunas modalidades, utilizando la Absorbancia o K/S como la señal medida, la señal mayor al campo puede promediarse dentro de cada zona. Además, si la absorbancia o K/S es mayor que un umbral arbitrario, la señal se puede fijar en uno o cero si es menor al punto de corte para el análisis.

A2. Movimiento en Masa - Análisis de Imágenes Utilizando Escaneado En una modalidad, se proporciona un método para el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando escaneado de las células empaquetadas. Las células empaquetadas pueden incluir una región de botón y/o lágrima. La Figura 8 muestra un diagrama esquemático en relación con el método. En este método, una reacción de aglutinación se lleva a cabo en un recipiente cónico, y el recipiente de reacción se inclina después. A continuación, puede establecerse una zona de exploración a lo largo del eje grande del botón y/o lágrima. El eje para el análisis puede ser más corto o más largo que el botón, lágrima, o combinación de los mismos. Las posiciones a lo largo del eje pueden asignarse, tal como la Posición 0 siendo el inicio del eje, estando fuera del botón, y la Posición 20 siendo el extremo del eje, estando fuera de la lágrima. El número de posiciones puede seleccionarse de manera arbitraria, en base a la mejor combinación de velocidad y precisión. La longitud del eje puede cuestionarse por una señal óptica, tales como %T o %R. Las señales pueden representarse en gráfica contra las posiciones a lo largo del eje. La Figura 9 muestra una gráfica representativa de la intensidad de señal óptica vs. la posición para los múltiples tipos de muestras (aglutinadas (triángulos), parcialmente aglutinadas (cuadrados), y no aglutinados (diamantes)), a lo largo de un eje, como se muestra en la Figura 8. Las señales ópticas a lo largo de la longitud del botón y/o lágrima pueden utilizarse para determinar el nivel de aglutinación en la muestra y/o para realizar cálculos relacionados.

En una modalidad, el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando el escaneado del botón y/o lágrima puede incluir una o más de las siguientes etapas: Primera, se toma una imagen digital de un pozo que contiene una mezcla de reacción.

Segunda, la imagen se orienta utilizando téenicas de reconocimiento de patrones ya sea por referencia a las marcas de referencia en los pozos de ensayo o por el reconocimiento del botón o lágrima.

Tercera, una zona de escaneado a lo largo del eje longitudinal de la lágrima y/o botón se interroga para %T o %R.

Cuarta, la señal óptica (tal como se define anteriormente bajo "Movimiento en Masa - Análisis de imagen en las Ubicaciones Designadas en los Recipientes de Reacción") se mide píxel por píxel a lo largo del eje.

Quinta, la señal mayor al campo puede promediarse sobre varios píxeles hacia abajo y en ángulos rectos al eje.

Sexta, la señal se representa en gráfica contra las posiciones a lo largo del eje.

A3. Movimiento en Masa - Análisis de imágenes de Área o Perímetro En una modalidad, se proporciona un método para el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando la determinación del área y/o perímetro de las células empaquetadas de una reacción de aglutinación. Las células empaquetadas pueden incluir una región de botón y/o lágrima. En algunas modalidades, puede determinarse el área y/o perímetro de las regiones de botón y/o lágrima de células empaquetadas. La Figura 10 muestra un diagrama esquemático en relación con el método. En este método, una reacción de aglutinación se lleva a cabo en un recipiente cónico, y el recipiente de reacción se inclina después. A continuación, puede obtenerse una imagen de toda la muestra inclinada 1000. La señal óptica puede entonces medirse sobre la imagen. Entonces, pueden utilizarse los métodos de reconocimiento de patrones para identificar la región de botón y/o lágrima (si existe) de una muestra. En la Figura 10, la muestra tiene un área de botón 1005 (área A) y un área de lágrima 1010 (área B). El área y/o perímetro del botón y/o lágrima pueden entonces medirse. Esta información puede utilizarse para determinar el nivel de aglutinación en la muestra y/o para realizar cálculos relacionados.

En una modalidad, el análisis de imágenes de reacciones de aglutinación utilizando el análisis del área y/o perímetro del botón y/o lágrima puede incluir una o más de las siguientes etapas: Primera, se toma una imagen digital de un pozo que contiene una mezcla de reacción.

Segunda, la imagen se orienta utilizando téenicas de reconocimiento de patrones ya sea mediante la referencia a las marcas de referencia en los pozos de ensayo o por el reconocimiento del botón o lágrima.

Tercera, la imagen se orienta en relación a las zonas como se describe anteriormente bajo "Movimiento en Masa Análisis de imágenes en Ubicaciones Designadas en Recipientes de Reacción" Cuarta, la señal óptica (tal como se define anteriormente bajo "Movimiento en Masa - Análisis de imágenes en ubicaciones designadas en recipientes de reacción") se mide píxel por píxel a través de toda la imagen.

Quinta, los métodos de reconocimiento de patrones se utilizan para identificar las áreas que corresponden al botón, y, cuando está presente, la lágrima. Estas áreas tendrán significativamente mayor absorbancia que el campo. El área y/o perímetro del botón y/o lágrima se miden. En algunas modalidades, para cada ubicación de tubo conocida la segmentación de la imagen puede iniciarse en el centro del tubo. El área oscura formada por glóbulos rojos o partículas de visualización puede segmentarse por métodos de desarrollo de regiones o umbral adaptativo, generando una imagen binaria que contiene una región que corresponde a la presencia de células. La forma del área segmentada puede analizarse utilizando los autovalores de la distribución, o, alternativamente, al ajustar una forma paramétrica tal como una elipse, o al calcular otros parámetros de forma, tales como la excentricidad o momentos de inercia de la región. Además, la región segmentada puede sobreponerse al parche de imagen original, y puede calcularse la distribución de intensidad y otras estadísticas de intensidad de esa región.

Sexta, cuando el del área total de cada una de las regiones de botón y lágrima (Área A/(área A + área B) y área B/(área A + área B); la Figura 11, (línea marcada por diamantes y línea marcada por cuadrados, respectivamente) que se representa gráficamente contra el grado de aglutinación, se obtiene una respuesta clara capaz de calibrarse. La proporción de las áreas (B/A) (Figura 11, línea marcada por triángulos) puede dar una respuesta más sensible a la aglutinación. Alternativamente, el área total a través del umbral puede utilizarse como una medida de la aglutinación. También puede obtenerse una medida de la aglutinación al combinar la información de la forma e intensidad.

A4. Consideraciones Generales - Análisis de imágenes del Movimiento en Masa de GRs/Partículas de Visualización Al utilizar los métodos proporcionados en la presente para el análisis del movimiento en masa de los GRs o partículas de visualización, se puede lograr una detección más temprana y/o más precisa de la aglutinación en comparación con el análisis visual de las mismas reacciones por observadores humanos.

En algunas modalidades, las fuentes de luz pueden utilizarse para recolectar imágenes del movimiento en masa para cualquiera de los métodos proporcionados en la presente. Pueden utilizarse la iluminación frontal o posterior. Las fuentes de luz pueden ser, por ejemplo, luz blanca o LED (un solo color). Los detectores pueden ser de cualquier tipo de formación de imágenes, por ejemplo CCD o CMOS. Las imágenes pueden tomarse en un solo momento o puede hacerse una serie de imágenes de vídeo con las imágenes tomadas en varios intervalos. En vídeo, las imágenes pueden tomarse en cualquier intervalo, incluyendo 15/segundo, 10/segundo, 5/segundo, 1/segundo, 0.5/segundo, o 0.1/segundo. Los métodos de análisis descritos anteriormente son para el caso en donde se analiza una sola imagen a la vez. En algunos aspectos, cuando se hace la grabación de vídeo de un ensayo de aglutinación pueden cubrirse diversos parámetros de señal a tasas de cambio a través del tiempo (dS/dT).

En cualquiera de los métodos proporcionados en la presente, puede utilizarse promedios a través de muchos píxeles para reducir el ruido aleatorio. Los píxeles pueden promediarse tanto en la dirección x como y en donde x es la dirección de la fuerza gravitacional. En algunos aspectos, las filas o columnas de al menos cinco píxeles adyacentes o zonas cuadradas o rectangulares con lados, se promedian al menos cinco píxeles (25 píxeles para una zona cuadrada). En algunas imágenes ejemplares proporcionadas en la presente, existen cientos de píxeles en cada dimensión, de manera que el promedio aún proporciona datos con buena resolución espacial.

B. Análisis de Imágenes de Imágenes de Microscópicos de GRs/Partículas de Visualización En un aspecto, se proporcionan en la presente métodos de análisis de imágenes para analizar imágenes de microscopio de GRs o partículas de visualización en suspensión en un ensayo de aglutinación, a fin de interrogar la estructura fina de las células o partículas en suspensión o la textura de la suspensión. El análisis de estas imágenes puede proporcionar información con respecto a la aglutinación de células o partículas en la suspensión. En algunos aspectos, estos métodos pueden permitir la detección de aglutinación en una reacción antes que pueda detectarse por el análisis del movimiento en masa de las células o partículas. Estos métodos también pueden ser más confiables y adaptables a la automatización que los métodos tradicionales que dependen de la interpretación visual.

En algunas modalidades, el análisis de imagen incluye calcular el tamaño de los agrupamientos de eritrocitos-partículas de aglutinación en base a la distancia de centro a centro de los eritrocitos individuales capturados en cada una de las imágenes. La distancia de centro a centro de los eritrocitos individuales puede obtenerse en base a, por ejemplo, la calibración interna de la imagen con referencia al tamaño de los glóbulos rojos o partículas visualización. En otro ejemplo, puede obtenerse en base a la calibración absoluta del sistema óptico. Bajo el microscopio, los eritrocitos pueden aparecer como manchas circulares sólidas brillantes o anillos brillantes (dependiendo del esquema de iluminación). En cualquier caso, el centro de cada eritrocito puede determinarse al calcular el centroide del círculo. Una vez que se determina el centroide de cada círculo, puede calcularse la distancia de centro a centro.

La información del centro de los GRs puede utilizarse en conjunto con una distancia de "corte" para identificar las células que son atraídas entre sí. Una distancia de "corte" puede aplicarse sobre la base de la distancia de centro a centro entre dos células. Alternativamente, una "distancia de corte" puede aplicarse en base a otro parámetro medible en relación a la distancia entre dos células (por ejemplo, la distancia entre los límites exteriores de dos células en sus puntos más cercanos). Un "distancia de corte" es típicamente una distancia de uno a dos diámetros celulares, aunque puede variar. en algunas modalidades, la "distancia de corte es la distancia del diámetro celular (por ejemplo, una distancia de "corte" puede ser el diámetro de una partícula de visualización en ensayos de en donde las partículas de visualización se empaquetan más apretadas una junto a la otra en la aglutinación; las partículas de visualización empaquetadas apretadamente pueden estar inmediatamente adyacentes entre sí, de tal manera que una primera partícula empaquetada se encuentre en contacto directo con una segundo partícula empaquetada, y la distancia entre el centro de la primera partícula y la segunda partícula es equivalente al diámetro de una partícula de visualización). En algunas modalidades, la distancia de "corte" es de aproximadamente 0.5 veces el diámetro de un GR o menos, 1 vez el diámetro de un GR o menos, 2 veces el diámetro de un GR o menos, o 2.5 veces el diámetro de un GR o menos. La distancia de corte puede determinarse a partir de la calibración o por una estimación de la distancia a través de la cual los GRs experimentan la atracción en un ensayo.

En las modalidades, puede determinarse una distancia de corte al calcular una función de distribución radial (función de correlación par) para un grupo de partículas de visualización en una imagen. En las modalidades, una función g(r) de distribución radial cuantifica la probabilidad de encontrar una partícula de visualización a una distancia r de una partícula de referencia. Las funciones de distribución radial se describen, por ejemplo, en K. Younge et. al., American Journal of Physics, Vol. 72(9)pp. 1247 (2004), que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. En las modalidades, g(r) se calcula como promedio de todas las partículas en una imagen y sobre múltiples imágenes de una muestra de ensayo. g (r) vs. distancia r se puede graficar, por ejemplo, como en la Figura 19. En las modalidades, se selecciona la distancia de corte como el valor r del pico g(r) más alto. En las modalidades, el pico g (r) más alto puede denominarse como el pico gmax- En ensayos de aglutinación, típicamente, el valor r del pico g(r) más alto corresponde a la distancia entre dos partículas de visualización atraídas entre sí. Por lo tanto, la distancia r (o un valor cercano a la distancia r) pueden servir como una distancia efectiva de corte para la identificación de partículas de visualización que están asociadas. En las modalidades, la distancia de corte puede ser de 0.5 mm o menos, 1 pm o menos, 2 pm o menos, 3 pm o menos, 4 pm o menos, 5 pm o menos, 6 pm o menos, 7 pm o menos, 8 pm o menos, 9 pm o menos, 10 pm o menos, 11 pm o menos, 12 pm o menos, 13 pm o menos, 14 pm o menos, 15 pm o menos, 20 pm o menos, 25 pm o menos, 30 pm o menos, 35 pm o menos, 40 pm o menos, o 50 pm o menos.

Utilizando la distancia de corte y la información sobre la ubicación de las celulas, pueden identificarse los aglutinamientos de glóbulos rojos. Por "aglutinamientos" en la presente se entiende una distribución contigua de dos o más células, que están relacionados entre sí en base a la distancia de corte determinada. Aunque el tamaño del aglutinamiento que puede detectarse utilizando los ensayos descritos en la presente puede variar en base a los componentes utilizados en el ensayo, incluyendo la fuente de los eritrocitos, y la identidad del antisuero y el virus, un aglutinamiento de tan pocos como dos eritrocitos pueden detectarse utilizando los ensayos. En aspectos particulares, los aglutinamientos menores de aproximadamente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 25, 30, 50, 75, o 100 eritrocitos pueden detectarse utilizando los ensayos proporcionados en la presente. En las modalidades, los aglutinamientos de partículas de visualización pueden identificarse por métodos que implican un análisis por pares. Los métodos de análisis por pares pueden examinar, por ejemplo, si dos partículas de visualización dadas están colocadas de tal manera que la distancia de centro a centro entre las partículas está en o por debajo de una distancia de corte seleccionada. De ser así, las dos partículas de visualización dadas pueden clasificarse como parte del mismo aglutinamiento. Este proceso puede realizarse a través de todas las partículas de visualización de una imagen o una región de una imagen, y de este modo los aglutinamientos pueden identificarse. Por ejemplo, si se identifica un aglutinamiento de dos partículas de visualización, cada una de las partículas de visualización en el aglutinamiento identificado puede ser interrogada para determinar si la partícula de visualización se encuentra en proximidades de cualquiera otras partículas de visualización dentro de la distancia de corte seleccionada. Si es así, las otras partículas de visualización pueden identificarse como parte del mismo aglutinamiento como las dos primeras partículas. Este proceso puede repetirse hasta que una o más dimensiones completas del aglutinamiento están determinadas (por ejemplo, número de partículas de visualización en el aglutinamiento, área del aglutinamiento, etc.). En las modalidades, los aglutinamientos de partículas de visualización pueden identificarse por metodos que implican determinar la relación entre tres o más partículas de visualización. Por ejemplo, en algunas modalidades, una partícula de visualización dada puede clasificarse como estando dentro de un aglutinamiento determinado cuando la partícula dada se encuentra dentro de una distancia de corte seleccionada de al menos otras dos partículas de visualización en el mismo aglutinamiento dado. En las modalidades, los aglutinamientos pueden identificarse por la evaluación simultánea de la distancia entre múltiples partículas de visualización de una imagen, de tal manera que los aglutinamientos se identifican en una sola etapa. En otras modalidades, los aglutinamientos pueden identificarse por la evaluación secuencial de distancia entre diferentes partículas de visualización de una imagen, de tal manera que los aglutinamientos se identifican en un proceso de múltiples etapas.

En algunas modalidades, las partículas de un aglutinamiento pueden estar dispuestas en una orientación aleatoria o semi-aleatoria, de manera que el aglutinamiento no tiene una longitud o ancho constante. En otras modalidades, las partículas de un aglutinamiento pueden estar dispuestas en una orientación ordenada, por ejemplo, en donde el aglutinamiento tiene una longitud y/o ancho constante (por ejemplo, los aglutinamientos pueden contener partículas enlazadas en una cadena, en donde las cadenas tienen una ancho de una sola partícula y la longitud de entre 2 a 5, 10, 20, 50, 100, o más partículas).

En algunas modalidades, para una muestra dada, el número de aglutinamientos de dos o más partículas se pueden contar, y calcularse un histograma de tamaños de aglutinamientos. Para calcular un histograma de tamaños de aglutinamiento, pueden analizarse varias imágenes de la misma muestra de los aglutinamientos, y el histograma puede contener valores de aglutinamiento obtenidos a partir de o promediados en múltiples imágenes (por ejemplo, valores de tamaño de aglutinamiento de 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más imágenes de la misma muestra). A partir del histograma de tamaños de aglutinamiento, puede calcularse un tamaño de aglutinamiento media (Spr0medio) utilizando en donde Ni es el número de aglutinamientos de tamaño i donde i es el número de partículas en el aglutinamiento.

Una forma más conveniente de representar los tamaños de aglutinamientos es el así llamado "Factor de Asociación", definido como, en donde la normalización se realiza con respecto a un valor mínimo, que puede corresponder a, por ejemplo, una muestra de control. En un ensayo que implica varias diluciones de una muestra dada, el tamaño promedio del aglutinamiento puede trazarse contra el factor de dilución para todas las muestras para obtener un título.

Gráficas representativas del histograma del tamaño de aglutinamiento, así como el factor de asociación para un ensayo de HA con una muestra que contiene un virus aglutinante se muestran en la Figura 13A-13B. La gráfica en el panel A muestra la distribución de tamaños de aglutinamiento de cinco diluciones de la muestra y el control. La dilución de la muestra 1 contiene la mayor concentración de la muestra; números subsecuentes de dilución contienen cada uno la mitad del contenido de la muestra de la dilución anterior. La reacción de control no contiene ninguna muestra. El factor de asociación para todas las diluciones de la muestra se muestra en la Figura 13B. Se ve claramente que las diluciones de las muestras con altas concentraciones de virus (correspondientes a bajas diluciones de la muestra, muestras 1-2) muestran altos valores para el factor de asociación, mientras que las muestras 4, 5, y el control (correspondiente a altas diluciones de la muestra/sin muestra en absoluto) muestran valores disminuidos para el factor de asociación. La transición entre la muestra 2 y la muestra 4 es también bastante evidente. El recuadro en la Figura 13B muestra los resultados de un ensayo de HA en base a microtitulación típico con las mismas diluciones de la muestra, en donde la primera columna (izquierda) muestra imágenes de una placa de titulación no perturbado, y la segunda columna (derecha) muestra imágenes de una placa de titulación que se ha inclinado. Se puede observar que las muestras 1-3 muestran algo de aglutinación, mientras que las otras tres muestras exhiben el flujo de RBC, lo que sugiere por lo tanto la no aglutinación. A partir de estas imágenes, que se llegó a la conclusión de que la transición de la aglutinación de la no aglutinación sería Muestra # 3, que está muy cerca del punto de inflexión en la gráfica del factor de asociación. Esto demuestra la concordancia de los resultados por métodos proporcionados en la presente con los métodos de aglutinación existentes.

Por lo tanto, el análisis de imagen utilizando los métodos de la descripción puede incluir el cálculo del tamaño de los aglutinamientos en base a la distancia de centro a centro de los eritrocitos en las imágenes, y la presencia de una partícula viral o puede determinarse un anticuerpo en una muestra con base en el factor de asociación derivado de dichos tamaños de aglutinamiento.

La cuantificación de la concentración de partículas virales o anticuerpos puede llevarse a cabo mediante la realización de ensayos paralelos utilizando la muestra biológica a probarse y las partículas virales o anticuerpos con una concentración o título conocido (estándares de calibración). Los resultados se pueden representar como el estándar de calibración y pueden proporcionar la curva de calibración.

En las modalidades, la imagen o el análisis basado en la luz de las reacciones de aglutinación pueden incluir uno o más de las siguientes etapas. Una muestra de ensayo de aglutinación conteniendo partículas de visualización y partículas de aglutinación puede proporcionarse en una estructura a traves de la cual se puede obtener una imagen de la muestra de ensayo, tal como una pipeta de punta ópticamente transparente, tubo capilar, portaobjetos de microscopio, u otro recipiente o superficie. En algunas modalidades, un recipiente puede contener dos o más cavidades de fluídicamente separadas, de tal manera que dos o más muestras de ensayo diferentes se pueden introducir en el mismo recipiente para el análisis. Por ejemplo, un recipiente puede ser una cubeta que contiene pozos de plástico transparente y verticales suficientes para soportar 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 50, 100, o más de aglutinación ensayos separados. En las modalidades, la muestra de ensayo se introduce en un microcanal u otra estructura estrecha en un recipiente o superficie, de tal manera que las imágenes pueden obtenerse a partir de una pequeña cantidad de muestra de ensayo. Por ejemplo, la muestra de ensayo puede introducirse en una estructura tal que las imágenes pueden obtenerse a partir de una muestra de ensayo de 50 ml o menos, 40 ml o menos, 30 m? o menos, 25 m? o menos, 20 m? o menos, 15 m? o menos, 10 m? o menos, 9 m? o menos, 8 m? o menos, 7 m? o menos, 6 m? o menos, 5 m? o menos, 4 m? o menos, 3 m? o menos, 2 m? o menos, 1 m? o menos, 0.5 m? o menos, o 0.1 m? o menos. La estructura que soporta la muestra de ensayo de aglutinación se puede colocar cerca de un objetivo de microscopio, de tal manera que las partículas de visualización se llevan a foco en el microscopio. Para colocar la estructura cerca del objetivo del microscopio, la estructura puede moverse, el objetivo del microscopio puede moverse, o tanto la estructura como objetivo del microscopio pueden moverse. De manera similar, para enfocar el objetivo o cambiar el campo de visión en el objetivo, la estructura puede moverse, el objetivo del microscopio puede moverse, o tanto la estructura como el objetivo del microscopio pueden moverse. Puede obtenerse una o más imágenes de la muestra de ensayo. En las modalidades, las imágenes de las muestras de ensayo pufeden obtenerse con un CCD, CMOS u otro detector de imagen en o en comunicación óptica con un microscopio. En las modalidades, pueden obtenerse las imágenes de diferentes campos de visión de una sola muestra. Por ejemplo, pueden obtenerse las imágenes de 2 o más, 3 o más, 4 o más, 5 o más, 6 o más, 7 o más, 8 o más, 9 o más, 10 o más, 15 o más, 20 o más, 25 o más, 50 o más, 100 o más, 500 o más, o 1000 o más campos de visión de una sola muestra de ensayo. Una imagen puede analizarse para localizar la posición de las partículas de visualización (por ejemplo, GRs) en la imagen. En las modalidades, la imagen se analiza para determinar la posición de todas las partículas de visualización de la imagen, o en una región de interés de una imagen. Para cada partícula de visualización identificada, también puede determinarse el centro de la partícula de visualización. La imagen puede analizarse para identificar el aglutinamiento de las partículas de visualización. En las modalidades, los aglutinamientos pueden identificarse utilizando un método de cálculo que incluye un valor de "corte a distancia" como parte del cálculo, en donde el "distancia de corte" es un valor que sirve como punto de delineación, en donde, por ejemplo, dos partículas de visualización que se encuentran separadas por una distancia por debajo del valor de la "distancia de corte" pueden considerarse estar asociado con otro y parte del mismo aglutinamiento, y en donde, por ejemplo, dos partículas de visualización que se encuentran separadas por una distancia por arriba del valor de la "distancia de corte" pueden considerarse que no encuentran asociadas entre si y no necesariamente ser parte del mismo aglutinamiento se puede mover. Una distancia de corte puede determinarse o seleccionarse basándose en cualquier método descrito en la presente. Después de la selección de una distancia de corte, los aglutinamientos en una o más imágenes de la muestra pueden identificarse de acuerdo con métodos para la identificación de aglutinamientos descritos en la presente. En las modalidades, se puede determinar el número de aglutinamientos que contienen diferentes números de partículas de visualización (por ejemplo, en una imagen, puede haber 7 aglutinamientos que contienen 10 partículas de visualización cada uno, 3 aglutinamientos que contienen 15 partículas de visualización cada uno, etc.). En las modalidades, puede determinarse un histograma de tamaños de aglutinamientos en la muestra. En las modalidades, puede determinarse el tamaño promedio de aglutinamiento de los aglutinamientos en la muestra. En modalidades adicionales, un tamaño promedio de aglutinamiento de los aglutinamientos en una muestra se puede convertir a un Factor de Asociación, como se describe en otra parte de la presente. En las modalidades, los histogramas de tamaños de aglutinamientos de diferentes muestras, que significan tamaños de aglutinamientos de aglutinamientos de diferentes muestras, o los Factores de Asociación de diferentes muestras, puede utilizarse para determinar el nivel de aglutinación de las diferentes muestras. En las modalidades, basado en el nivel de aglutinación de diferentes diluciones de una muestra o el nivel de aglutinación de una muestra después de un período de tiempo dado de un ensayo de aglutinación, puede determinarse un anticuerpo, partícula viral, u otra partícula de interés en una muestra.

Los métodos proporcionados en la presente pueden utilizarse para determinar el título de partículas de aglutinación o partículas que inhiben las partículas de aglutinación (por ejemplo, anticuerpos contra las partículas de aglutinación) en una muestra. Por ejemplo, se pueden preparar múltiples diluciones diferentes de una muestra de interés, y las diferentes diluciones de muestras pueden ensayarse para la capacidad de inhibir o causar la aglutinación de partículas de visualización. Sobre la base de la combinación de la información de ensayo con información relativa a la dilución de la muestra, puede determinarse el título de las partículas de aglutinación o las partículas que inhiben las partículas de aglutinación en la muestra.

En algunas modalidades, en los métodos proporcionados en la presente en donde se determina una función de distribución radial g(r) para una muestra de interés, la intensidad/nivel del valor g(r) puede utilizarse para determinar el nivel de aglutinación de una muestra. Por ejemplo, una primera muestra que tiene un cierto valor relativamente alto g(r) en su pico más alto (primera muestra 9max) en una gráfica de g( r) vs. distancia r puede considerarse estar aglutinada, mientras que una segunda muestra que tiene un valor relativamente bajo g(r) en su pico más alto (segundo muestra gma) en una gráfica de g(r) vs. la distancia r puede ser considera que no se encuentra aglutinada. Esta determinación puede estar basada en el concepto, por ejemplo, que si un mayor número de partículas se encuentran dentro de una cierta distancia r de la otra en una primera muestra que en una segunda muestra (y resultado así en un valor g(r) más alto en el gmax en una gráfica de g(r) vs. la distancia r de la primera muestra que en una gráfica de g(r) vs. la distancia r de la segunda muestra), la primera muestra puede contener partículas que se aglutinaban más que las partículas en la segunda muestra.

En algunas modalidades, el análisis de imágenes puede incluir el análisis de la textura de los GRs o las partículas de visualización en suspensión en una imagen de un ensayo de aglutinación. La textura de las partículas en suspensión puede proporcionar información respecto a la aglutinación de las partículas en la suspensión. En general, la aglutinación de partículas de visualización en una suspensión da como resultado la suspensión que tienen una grumosidad, aspecto de textura más áspera correspondiente a una suspensión que contiene partículas no aglutinados. Las texturas de las suspensiones pueden analizarse en varias formas para obtener información relativa a la aglutinación de las partículas en la suspensión.

Durante o después del inicio de un ensayo de aglutinación que contiene partículas en suspensión, la suspensión puede transferirse a un recipiente o superficie a través de la cual pueden obtenerse imágenes de o la luz de la suspensión. Por ejemplo, un ensayo de aglutinación puede transferirse a una punta de pipeta, un tubo capilar, o un portaobjetos de microscopio. Puede obtenerse una o más imágenes del ensayo, a través de cualquier configuración óptica describe en otra parte en la presente. En las modalidades, las imágenes de un ensayo de aglutinación pueden obtenerse con la ayuda de un microscopio. En los ejemplos, las imágenes pueden obtenerse con un detector de imágenes CCD o CMOS. Los algoritmos de reconocimiento de imágenes (por ejemplo, protocolos de comparación de plantillas) pueden identificar regiones en un campo de visión o imagen que contiene un material de ensayo de aglutinación (por ejemplo, el interior de un recipiente), y las regiones en el campo de visión o imagen que no contienen material de ensayo (por ejemplo, las paredes de un vaso que soporta el ensayo).

Tras la captura de una o más imágenes de un ensayo de aglutinación conteniendo partículas en suspensión, la imagen puede someterse a análisis de textura de la imagen o regiones de las mismas. Cualquier método adecuado para el análisis de la textura de una imagen puede utilizarse con los métodos proporcionados en la presente. Por ejemplo, una imagen puede someterse a un operador de patrones binarios locales (LBP), operador de matriz de co-ocurrencia de niveles de gris (GLCM), identificación de características Gabor, o identificación de características de textura de Tamura. Los métodos para el análisis de la textura de una imagen se describen, por ejemplo, en T. Ojala et. al., Reconocimiento de Patrones, vol. 29, pp 51-59, M. Heikkila et al, Reconocimiento de Patrones 42 (3):425-436, P. Howarth y S. Ruger, Evaluación de Características de Textura para la Recuperación de Imágenes Basada en el Contenido. En: Tercera Conferencia Internacional, CIVR 2004, pp 326-334 (2004), y P. Howarth y S. Ruger, Características de Textura Robustas para la Recuperación de Imagen Fija. Visión, Imagen y Procesamiento de Señales, IEE Proceedings, vol. 152, número 6, que se incorpora en la presente mediante la referencia en su totalidad. En las modalidades, un método de análisis de imágenes puede incluir elementos MPEG-7 tales como descriptores MPEG-7, esquemas de descripción, lenguaje de definición de la descripción, o herramientas del sistema.

En las modalidades, un operador de patrones binarios local se puede utilizarse en el análisis de la textura de una imagen. Típicamente, un operador de patrones binarios locales implica la selección de una región de interés de una imagen. La región de interés puede ser la totalidad de la imagen o una o más porciones de la misma. Opcionalmente, una región de interés puede dividirse en dos o más celdas de un número seleccionado de píxeles (por ejemplo, 10 x 10, 12 x 12, 16 x 16, 18 x 18, 25 x25, 30 x 50 píxeles, etc.) Dentro una región de interés o celda, algunos o todos los píxeles puede ser interrogados para cada intensidad en relación a los píxeles que rodean el píxel sometido a interrogación. Por ejemplo, para un píxel dado, la intensidad del píxel se puede compararse con la intensidad de cada uno de sus 8 vecinos más cercanos (por ejemplo, el píxel dado está en el centro de una cuadrícula de píxeles 3-por-3, y el píxel dado se compara con cada uno de los píxeles restantes en la misma cuadrícula de 3-por-3). Al comparar la intensidad de un píxel dado a la intensidad de los vecinos del píxel dado, los vecinos del píxel dado pueden evaluarse en una dirección ordenada, tales como en el sentido de las agujas del reloj o en sentido antihorario alrededor del píxel dado. La comparación entre un píxel dado y sus píxeles vecinos puede convertirse en un código binario. Por ejemplo, cuando el píxel dado se compara con un píxel vecino, si el píxel dado tiene una mayor intensidad que el píxel vecino, se le puede asignar un número "1". En contraste, si el píxel dado tiene una intensidad más débil que el píxel vecino, puede asignársele un número "O". Así cuando un pixel dado se compara con múltiples vecinos, al pixel dado puede asignársele un número binario de múltiples dígitos, representando cada dígito del número binario una comparación entre el píxel dado y uno de sus píxeles vecinos. Por ejemplo, en el caso de un píxel dado en el centro de una cuadrícula de píxeles 3-por-3, al píxel dado puede asignársele un número binario de 8 dígitos, en base a la comparación secuencial del pixel dado del centro para cada uno de sus vecinos adyacentes en la misma cuadrícula 3-por-3. Opcionalmente, el número binario asignado a un píxel dado puede convertirse a un decimal. Tras la determinación de un valor de intensidad (por ejemplo, número binario o decimal) para múltiples píxeles en un área común (por ejemplo, la región de interés, celda), un histograma puede determinarse por el área común. El histograma puede contener información con respecto a la intensidad relativa de los diversos píxeles. En las modalidades, el histograma puede ser normalizado. En las modalidades, los histogramas de múltiples celdas pueden concatenarse. La concatenación de los histogramas de múltiples celdas de una región de interés puede proporcionar un vector de características para la región de interés. El vector de características puede procesarse por un algoritmo de aprendizaje en máquina, tal como una máquina de vectores de soporte con el fin de clasificar la imagen en base a su textura determinada.

Por lo general, los métodos proporcionados en la presente que implican el ensayo de aglutinación en base al análisis de imagen de la textura de un ensayo de aglutinación incluyen la comparación de la información de textura de un ensayo de interés para la información de textura generada a partir de las muestras del estado de aglutinación conocido (por ejemplo, aglutinados o no aglutinadas). Por consiguiente, los métodos proporcionados en la presente pueden incluir obtener las imágenes de muestras de estado de aglutinación conocidos que contienen partículas en suspensión, y el análisis de la textura de estas muestras. Esta información puede incluirse en o utilizarse con un algoritmo de aprendizaje en máquina, con el fin de ayudar en la clasificación del estado de aglutinación de una muestra de interés. En las modalidades, las imágenes de las muestras de estado de aglutinación conocido pueden utilizarse con los métodos y algoritmos proporcionados en la presente como parte de "conjuntos de formación" para utilizarse para ayudar en la clasificación de imágenes de muestras del estado de aglutinación desconocido.

Los métodos proporcionados en la presente pueden utilizarse tanto para la evaluación cualitativa y cuantitativa del estado de la aglutinación de una muestra. Por ejemplo, en las modalidades, los métodos proporcionados en la presente pueden utilizarse para clasificar cualitativamente las muestras de interés, ya sea aglutinadas o no aglutinadas. En otras modalidades, los métodos proporcionados en la presente pueden utilizarse para clasificar cuantitativamente la muestra de interés, tal como mediante la evaluación del grado de aglutinación de una muestra. Para soportar la evaluación cuantitativa de los niveles de aglutinación de una muestra, puede proporcionarse los conjuntos de formación que contienen muestras de diversos grados de aglutinación (por ejemplo débilmente aglutinadas, moderadamente aglutinadas, fuertemente aglutinadas, 10% aglutinas, 20% aglutinadas, etc.). En las modalidades, la evaluación cuantitativa de los niveles de aglutinación de un ensayo de aglutinación de una muestra puede permitir un título de un virus, anticuerpo u otra partícula de interés de una muestra que se determina con un menor número de diluciones de la muestra o en un período más corto de tiempo que se necesita para determinar el título de la muestra cuando ensayos de aglutinación sólo se evaluaron cualitativamente para determinar la aglutinación o no aglutinación.

En algunas modalidades, el análisis de la textura de una imagen puede utilizarse en conjunto con el análisis de una o más de otras características de la imagen. Por ejemplo, una imagen que se analiza para la textura también puede analizarse para la intensidad en una o más longitudes de onda o canales de color a través de la región de interés de la imagen. Además, una intensidad promedio o la desviación estándar de la intensidad en una longitud de onda o canal de color puede determinarse a través de la imagen o una porción del mismo. La medición de la intensidad de señal en un canal de color a través de la región de interés puede proporcionar información tal como, por ejemplo, la cantidad relativa de partículas en suspensión en el ensayo que es la imagen. Por ejemplo, si muchos glóbulos rojos se encuentran en suspensión en una muestra de ensayo (por ejemplo, en el caso de glóbulos rojos no aglutinadas), la imagen del ensayo puede tener una señal de relativamente alta en el canal rojo a través de la imagen. En contraste, si relativamente pocos glóbulos rojos se encuentran en suspensión en una muestra de ensayo (por ejemplo, en el caso de las glóbulos rojos aglutinados, con tendencia a aglutinarse y caer fuera de la suspensión), la imagen del ensayo puede tener una señal relativamente baja en el canal rojo a través de la imagen. La medición de la desviación estándar de la intensidad de canal de color a través de una imagen también puede proporcionar información relevante del estado de aglutinación del material de ensayo. Por ejemplo, si se aglutinó el material de ensayo, puede tener una desviación estándar mayor en un canal de color a través de la ROI que el material de ensayo que no se aglutinó, ya que el material aglutinado puede tener una mayor aglutinación, menos uniforme que el material no aglutinado. En otro ejemplo, una imagen analizada para la textura de un ensayo de aglutinación también puede analizarse para determinar la cantidad de partículas que se han establecido fuera de la suspensión del ensayo. Estas partículas pueden acumularse, por ejemplo, en el fondo de un recipiente (por ejemplo, una punta) que soporta los materiales de ensayo. La cantidad de partículas en el fondo de un recipiente puede determinarse, por ejemplo, mediante la identificación de regiones de interés que contiene partículas sedimentadas y determinar el tamaño y/o intensidad de estas regiones.

La Figura 20 es un diagrama de flujo que proporciona etapas ejemplares para la evaluación de la aglutinación de una muestra de acuerdo con las modalidades de los métodos proporcionados en la presente. Haciendo referencia ahora a la figura 20, una o más imágenes de un ensayo de aglutinación que contiene partículas en suspensión en un recipiente o superficie de soporte puede obtenerse de 2005. Las imágenes pueden someterse a un protocolo de comparación de plantillas 2015 u otro algoritmo de reconocimiento de imagen, con el fin de identificar porciones de la imagen que contiene o no una imagen del material de ensayo de aglutinación. Por ejemplo, una imagen puede procesarse para identificar cuales porciones de la imagen se corresponden con el recipiente de soporte, y que corresponden al material de ensayo. La imagen se puede procesar adicionalmente para identificar una región de interés (ROI) 2025 en la imagen para el análisis. Típicamente, la región de interés se encuentra dentro de la porción de la imagen que contiene la imagen del material de ensayo de aglutinación. Después de la identificación de la ROI en una imagen, la ROI puede analizarse para determinar características de la imagen del material de ensayo. Este proceso puede denominarse en la presente como "extracción de características" 2035. En las modalidades, durante la extracción de características, se puede analizarse la textura de la imagen de los materiales de ensayo u otras características del material de ensayo. Cualquier método descrito en la presente para el análisis de la textura puede utilizarse para analizar la textura de la imagen. En algunas modalidades, un operador de patrones binarios locales (LBP) puede utilizarse para analizar la textura de la imagen. Además, las características diferentes de la textura se pueden extraer de una imagen, tales como la intensidad de señal en un canal de color seleccionado a través de una región de interés. A continuación, la información obtenida con respecto a la textura de la imagen o de otras características puede utilizarse en al menos uno de dos o más formas diferentes. En primer lugar, si el ensayo de aglutinación se proporcionó como un ensayo de aglutinación de estado conocido, la información de textura analizada desde la imagen del ensayo puede utilizarse como parte de un conjunto de formación para desarrollar una máquina de vectores de soporte (SVM) clasificador modelo 2045. En segundo lugar, si el ensayo de aglutinación tenía un estado de aglutinación desconocido, y se proporciona para la determinación del estado de aglutinación, la información de textura analizada desde la imagen del ensayo puede utilizarse como parte de un conjunto de prueba proporcionado a un modelo clasificador SVM para producir una predicción de clasificador SVM 2055. La predicción SVM puede proporcionar información sobre el estado de aglutinación de la muestra en base a la textura de la imagen de ensayo. En las modalidades, la predicción SVM puede procesarse adicionalmente pueda obtener la información de salida 2065 que puede derivarse de los resultados de análisis de imagen. Por ejemplo, en los ensayos para determinar el tipo sanguíneo en base a la aglutinación, los resultados de aglutinación pueden procesarse para producir una salida del tipo sanguíneo de la sangre utilizada en el ensayo de aglutinación.

En las modalidades, las referencias en la presente a analizar la "textura" de una imagen de un ensayo y lo similar puede utilizarse indistintamente con referencias a analizar la "textura" de un ensayo y lo similar, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, En las modalidades, las imágenes descritas en la presente pueden describirse como conteniendo "información de formación de imágenes" con respecto a una o más características. Se puede entender que esta frase se refiere a un elemento/componente de una imagen más grande. Así, en las modalidades, puede entenderse que una imagen que contiene "información de formación de imágenes" con respecto a, por ejemplo, una partícula de visualización es una imagen que fue tomada de un campo de visión que incluye una partícula de visualización en el campo de visión.

C._ Consideraciones Generales - Captura y Análisis de Imágenes Los métodos de microscopía se conocen bien en la téenica, y se describen en la Publicación de Patente de E. U. NOS. 2009/0214114Al, 2011/0013821A1, 2008/0212865A1, y 2010/0183216A1, todas incorporadas en la presente mediante la referencia.

Los métodos de microscopía adecuado para utilizarse con los métodos de la descripción también se describen en la Solicitud Provisional No. 61/435,250, presentada el 21 de enero de 2011, que se incorpora en la presente mediante la referencia.

Una ventaja de los métodos proporcionados en la presente es ser capaz de utilizar un pequeño volumen de muestra. En algunas modalidades aproximadamente 1-1.5 ml de muestra se utiliza para el análisis. En algunas modalidades, aproximadamente o menos de l, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 o 50 ml de muestra se utiliza para el análisis.

En algunas modalidades, el dispositivo óptico comprende una cámara, sensor o detector. En algunas modalidades, el dispositivo óptico se acopla ópticamente a un microscopio o el dispositivo óptico comprende un sensor, detector, o una cámara acoplada ópticamente a un microscopio.

En algunas modalidades, la imagen se captura mediante una cámara CCD. La cámara CCD puede ser una cámara CCD USB. En algunas modalidades, la imagen se capta mediante una cámara CMOS. La platina del microscopio puede moverse a una imagen de campo de visión diferente a lo largo de un recipiente de reacción o canal en la misma, y la imagen.

En algunas modalidades, el análisis de la muestra y los productos de reacción de ensayo se realizan utilizando la imagen digital. Los recipientes de reacción de ensayo pueden alinearse para medir y escanear o formación de imágenes en una sola operación. En algunas modalidades, esto se logra automáticamente por componentes mecánicos. Los recipientes de reacción de ensayo pueden situarse en ubicaciones definidas en un cartucho, dispositivo o sistema y moverse a un escáner/cámara para formar imágenes y/o análisis. En algunas modalidades, la orientación de los recipientes de reacción se mantiene constante a medida que los recipientes de reacción se mueven a un escáner/cámara. En algunas modalidades, un escáner/cámara puede moverse a un recipiente de reacción.

En algunas modalidades, la región de formación de imágenes reside en un canal de microfluidos. En algunas modalidades, se toma la muestra y se introduce en una cubeta de microscopía que contiene un micro canal (también denominado en la presente como un canal de microfluidos). En algunas modalidades, el micro canal puede tener una sección transversal de aproximadamente 125mm x IOOOmpi y ser de aproximadamente 7 mm de largo. Sin embargo, también puede utilizarse el micro canal de otras dimensiones en los métodos proporcionados en la presente. El canal puede cargarse en un microscopio de campo claro estándar equipado con una fuente de luz de banda ancha y un objetivo (por ejemplo, un objetivo de lOx). El microscopio puede ajustarse de tal manera que el campo de visión se encuentra lejos de las paredes laterales del canal, y la imagen se encuentre en foco a fin de observar claramente los GRs individuales o partículas de visualización.

Tras el análisis de una muestra, pueden tomarse muestras adicionales (por ejemplo, con diferentes concentraciones de virus/anticuerpos) y cargarse en una nueva cubeta, y la adquisición de las imágenes repetidas. En algunas modalidades, se recolectan aproximadamente 10 imágenes para cada muestra. En algunas modalidades, se recolectan para cada muestra menos o más de 10 imágenes, tal como al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 50, o 100 imágenes por muestra. Las imágenes recolectadas pueden entonces procesarse, por ejemplo, para localizar con precisión las posiciones de RBC, con centros RBC detectados de todas las imágenes.

Las imágenes obtenidas mediante el escaneo o formación de imágenes puede ser una matriz bidimensional de píxeles, donde cada píxel comprende una pluralidad de valores de intensidad correspondientes a una distinta región espectral de detección.

El fondo iluminado puede emitir luz blanca de igual intensidad en toda su superficie. La salida de luz puede variar algo, produciendo una distribución normal de intensidades de píxeles según se detecta por el detector/formador de imágenes. El tiempo de exposición puede ser la cantidad de tiempo que se permiten los píxeles del detector para recolectar los fotones antes de que el valor se lea. Para una cantidad dada de luz, el valor de lectura puede ser mayor cuando el tiempo de exposición se hace más largo. Este control puede ser el control "grueso" para la aplicación. La ganancia puede ser el control ajustando la cantidad de amplificación aplicada a la señal del detector. Incrementar la ganancia puede incrementar el valor de la señal del detector. La ganancia puede ser el control de "fino".

El análisis puede llevarse a cabo utilizando una configuración óptica. La configuración óptica puede incluir una fuente de luz, una abertura, y un sensor o un detector. En algunas modalidades, la puesta en marcha puede incluir una cámara, en la que la cámara puede ser una cámara web, el detector de la cámara puede ser chip CCD, la lente puede ser de vidrio con una distancia Lente a Objetos de cualquier de 5 a 100 mm, y la fuente de luz puede ser una fuente de luz blanca.

En una modalidad, se describe en la presente un alojamiento del conjunto de lector de un conjunto de detección que incluye un sensor o detector para detectar ensayos de aglutinación, y opcionalmente, otros tipos de ensayo. El conjunto de detección puede estar por arriba de un recipiente de reacción o en una orientación diferente en relación con el recipiente de reacción basado en, por ejemplo, el tipo de ensayo que se lleva a cabo y el mecanismo de detección que se emplea. El conjunto de detección puede moverse en comunicación con el recipiente de reacción o el recipiente de reacción puede moverse en comunicación con el conjunto de detección.

El detector/sensor óptico puede ser cualquier tipo de detector de imagen, tal como los CCD. En algunas modalidades, un conjunto de detección podría incluir una pluralidad de cables de fibra óptica conectados como un paquete a un detector CCD. El paquete de fibras ópticas podría construirse de fibras separadas o de muchas pequeñas fibras fusionadas entre sí para formar un paquete sólido. Tales paquetes sólidos están disponibles comercialmente y fácilmente interconectados con detectores CCD.

Un detector/sensor también puede comprender una fuente de luz, tal como un bulbo o diodo emisor de luz (LED). La fuente de luz puede iluminar un ensayo para detectar los resultados. Las fuentes de iluminación pueden ser rayos láser, LED de colores individuales, luz de frecuencia ancha de lámparas fluorescentes o LEDs, matrices LED, mezclas de fuentes de luz roja, verde y azul, fósforos activados por un LED, tubos fluorescentes, luces incandescentes, y fuentes de arco, tal como un tubo flash. El detector también puede comprender óptica para suministrar la fuente de luz para el ensayo, tal como una lente o fibra óptica.

El área de imagen de una cubeta o recipiente de reacción puede diseñarse a fin de proporcionar un número suficiente de celdas para la aplicación de interés. Por ejemplo, contando los abundantes glóbulos rojos se puede requerir el recuento de sólo 1000-2000 celdas y por lo tanto una muestra diluida y sólo una pequeña área de formación de imagen en la cubeta.

Una cubeta puede diseñarse para recogerse por un mecanismo estándar de pipeteado de forma automatizada para permitir la transferencia de la cubeta a la plataforma de formación de imágenes. El expulsor de puntas del mecanismo de pipeteo puede expulsar la cubeta del mecanismo de pipeta sobre la plataforma de formación de imágenes. El registro de cubeta a la plataforma de formación de imágenes puede tener lugar en dos etapas. Tras la transferencia de la cubeta a la plataforma de formación de imágenes, las características de registro estáticas en la cubeta pueden interactuar con características de acoplamiento en la plataforma de formación de imágenes para alinear la cubeta en paralelo al eje óptico de la plataforma de formación de imágenes (registro X, Y). El registro puede entonces completarse por un mecanismo situado en la plataforma de formación de imágenes. Este mecanismo puede desviar la cubeta contra una superficie plana perpendicular al eje óptico (registro Z) de la plataforma de formación de imágenes, limitando de esta manera la muestra dentro del rango focal de la plataforma de formación de imágenes.

Los métodos de la exposición proporcionan diversos esquemas de iluminación: campo oscuro y campo claro. La naturaleza modular de la configuración también permite la integración del contraste de fase y el contraste diferencial de interferencia (DIC).

La iluminación de campo claro se puede lograr mediante el uso de una fuente de luz blanca junto con una etapa de condensador para crear la iluminación Koehler. Una platina del microscopio puede estar conectada a motores paso a paso controlados por computadora para permitir la translación en la direcciones X e Y (por ejemplo, las direcciones horizontales). En cada ubicación, puede capturarse el número deseado de imágenes y la etapa puede moverse a la siguiente posición XY.

En algunas modalidades, se proporciona en la presente métodos para determinar la presencia de un anticuerpo, partícula viral, o partícula de aglutinación, que incluye la captura de una imagen de aglutinación.

En una modalidad, se proporciona un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde el anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, incluyendo el método: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica sospechosa de contener el anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) detectar si se produce la aglutinación en la mezcla, en donde la ausencia de aglutinación indica la presencia de dicho anticuerpo, y en donde las etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora. La presencia de la aglutinación se evidencia por la formación de aglutinamientos de eritrocitos-partículas virales, en donde existen los aglutinamientos en una región de formación de imágenes (correspondiente a un volumen muy pequeño), y en donde la etapa de detección incluye: (i) la captura de una pluralidad de imágenes de aglutinamientos en diferentes lugares de la región de formación de imágenes con un dispositivo óptico; y (ii) detectar la ocurrencia de aglutinación en base al análisis de las imágenes. En algunas modalidades, la etapa (a) incluye la incubación de una mezcla de la partícula viral y la muestra biológica antes de agregar los eritrocitos.

En otro aspecto, se proporciona en la presente un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde el anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, y el método incluye: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica sospechosa de contener el anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) detectar si la aglutinación ocurre en la mezcla, en donde la ausencia de la aglutinación indica la presencia de dicho anticuerpo y si las etapas (a) - (b) tiene lugar en menos de una hora. La presencia de la aglutinación se evidencia por la formación de cúmulos de eritrocitos-partícula viral en donde los cúmulos existen en una región de formación de imágenes (correspondiente a un volumen muy pequeño y en donde la etapa de detección incluye: (i) capturar una pluralidad de imágenes de aglutinaciones en diferentes ubicaciones de la región de formación de imágenes con un dispositivo óptico; y (ii) detectar la ocurrencia del aglutinamiento en base al análisis de las imágenes. En algunas modalidades, la etapa (a) incluye la incubación de una mezcla de la partícula viral y la muestra biológica antes de agregar los eritrocitos.

En otra aspecto, se proporciona en la presente un método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica, que incluye: (a) incubar una mezcla de eritrocitos y una muestra biológica sospechosa de contener la partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de la mezcla, en donde la presencia de un aglutinamiento de eritrocitos-partículas virales en la imagen indica la ocurrencia de la aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de la partícula viral, y en donde la ausencia de aglutinamientos indica la falta de aglutinación y la falta de una cantidad detectable de la partícula viral.

En algunas modalidades, los métodos proporcionados en la presente pueden implicar la detección de luz transmitida, reflejada, o dispersa por una muestra. La luz procedente de las muestras puede detectarse, por ejemplo, mediante dispositivos ópticos que contienen detectores de imagen, tales como detector CCD o CMOS o detectores de luz, tales como tubos fotomultiplicadores (PMT) o fotodiodos.

En cualquiera de los métodos proporcionados anteriormente, el método puede practicarse también en donde se utiliza una partícula de visualización en lugar de eritrocitos, y/o en donde una partícula de aglutinación se utiliza en lugar de una partícula viral.

D. Análisis de Ensayos de Aglutinación por Detección de Luz del Ensayo En algunas modalidades, los ensayos de aglutinación y los ensayos de inhibición de aglutinación puede evaluarse midiendo el movimiento de luz a través o desde un ensayo. Por ejemplo, la luz de una fuente de luz puede llegar a un ensayo de aglutinación, y puede medirse la luz reflejada, transmitida, o dispersada por el ensayo. En las modalidades, cuando las partículas en suspensión se aglutinan, se instalan fuera de la suspensión con mayor rapidez que las partículas no aglutinadas. En consecuencia, la luz puede pasar de o a través de un ensayo en donde se ha producido la aglutinación de partículas de manera diferente a un ensayo en donde no se ha producido la aglutinación de partículas. Por ejemplo, las partículas aglutinadas pueden instalarse fuera de la suspensión con mayor rapidez que las partículas no aglutinadas. En consecuencia, con el tiempo, las regiones superiores de materiales de ensayo en donde se aglutinan las partículas pueden llegar a ser más claras más rápidamente que las regiones superiores de material de ensayo en donde las partículas no se aglutinan. El material de ensayo más claro puede transmitir más luz o dispersar menos luz que los materiales de ensayo correspondientes en donde las partículas no se aglutinan y se asientan. Del mismo modo, las regiones más bajas de los materiales de ensayo en donde las partículas se aglutinan pueden volverse más densas ópticamente más rápidamente que las regiones más bajas de material de ensayo en donde las partículas no se aglutinan. El material de ensayo más denso puede transmitir menos luz o dispersar más luz que los materiales de ensayo correspondiente en donde las partículas no se aglutinan y se asientan. La luz procedente de un ensayo se puede detectar, por ejemplo, con un detector de luz, tal como un PMT o fotodiodo. Cualquier fuente de luz, detector de luz, o dispositivo óptico descrito en otra parte en la presente puede utilizarse para medir el movimiento de la luz a través o desde un ensayo. En las modalidades, el movimiento de la luz a través o desde un ensayo puede medirse cuando el ensayo se soporta en un recipiente tal como una punta de pipeta o cubeta de múltiples pozos.

IV. Aplicaciones En algunas modalidades, los ensayos de hemaglutinación e inhibición de hemaglutinación proporcionados en la presente pueden utilizarse para medir los antígenos virales y anticuerpos anti-virales. El método de inhibición de hemaglutinación estándar de la OMS es excesivamente lento y tiene que ser interpretado visualmente. En un aspecto, se proporcionan en la presente ensayos rápidos, de lectura objetiva, y bien estandarizados que pueden utilizarse para obtener resultados del ensayo de aglutinación rápidos de modo que se puedan tomar medidas inmediatas para manejar poblaciones de pacientes en riesgo y su tratamiento.

Identificación de individuos sospechosos de infección En un aspecto, se proporciona un método para identificar un sujeto infectado con un patógeno y/o sus contactos, de manera que el sujeto y/o sus contactos pueden ser aislados por lo que la infección no se propague.

En algunas modalidades, un sujeto sospechoso de estar en contacto con un agente patógeno, tal como una partícula viral, se prueba utilizando los métodos proporcionados en la presente para determinar la presencia de la partícula viral o si contiene un anticuerpo que se une selectivamente a la partícula viral. Una muestra biológica, tal como suero o plasma se puede obtener del sujeto y se utiliza para la prueba.

Evaluación de las asignaturas y programas de inmunización La detección y/o medición de anticuerpos utilizando métodos de la descripción son útiles para determinar la inmunización efectiva de un sujeto. El término "inmunización efectiva" como se usa en la presente, significa un estado suficiente para inducir una respuesta inmune protectora en un sujeto. Un sujeto puede considerarse estar inmunizado de manera efectiva por la detección de anticuerpo contra un virus dado o antígeno viral en una muestra biológica derivada del sujeto. La evaluación de la inmunización efectiva se puede hacer al medir un cierto nivel de anticuerpos contra un virus dado o antígeno viral en una muestra biológica derivada del sujeto.

Los métodos proporcionados en la presente también pueden utilizarse para evaluar los programas de inmunización para la efectividad en inmunizar una población o grupo de sujetos. En algunos aspectos, el método proporcionado en la presente puede usarse para evaluar la inmunización de una población o grupo de sujetos en un punto de asentamiento para la prueba del servicio, tales como escuelas, lugares de trabajo o en casa de un sujeto.

En un aspecto, se proporciona en la presente un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que incluye: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto quien se ha inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula viral; (b) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; y (c) determinar la concentración de un anticuerpo contra el virus en la muestra en base a los aglutinamientos formados por la aglutinación de los eritrocitos, y en donde las etapas (b) - (c) tienen lugar en menos de aproximadamente una hora.

En un aspecto, se proporciona en la presente un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que incluye: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto quien se ha inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula viral; (b) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con la partícula viral; (c) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de la mezcla; y (d) determinar la concentración de un anticuerpo contra la partícula viral en la muestra biológica en base a los aglutinamientos formados por la aglutinación de los eritrocitos, en donde la presencia de un aglutinamiento de eritrocitos-partículas virales en la imagen indica la ocurrencia de la aglutinación y la falta de una cantidad detectable del anticuerpos, y en donde la ausencia del aglutinamiento indica la falta de aglutinación y la presencia de una cantidad detectable del anticuerpo.

En cualquiera de los métodos proporcionados anteriormente o en otra parte en la presente, el método también puede ponerse en práctica en donde se utiliza una partícula de visualización en lugar de eritrocitos, y/o donde una partícula de aglutinación se utiliza en lugar de una partícula viral. De manera similar, las referencias a "células" o "eritrocitos" en la presente también incluyen partículas de visualización, a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Del mismo modo, las referencias a "partículas virales" en la presente también incluyen partículas de aglutinación, a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Así, los métodos proporcionados en la presente pueden utilizarse para medir la efectividad de la vacunación en tiempo real y/o en el punto, y se puede ajustar la dosis de vacunación en consecuencia. Además, las vacunas alternativas, si se encuentra disponible pueden utilizarse para los sujetos quienes no responden a una vacuna bajo prueba. Por lo tanto, los proveedores de vacunas pueden optimizar los programas de vacunación y dosis.

Métodos para determinar el tipo sanguíneo Los métodos de la descripción también pueden ser útiles para determinar el tipo sanguíneo de una muestra que comprende eritrocitos. En algunas modalidades, los anticuerpos contra antígenos de diversos tipos de sangre pueden probarse para determinar su capacidad para inducir la hemaglutinación en una muestra que comprende eritrocitos, determinando de este modo el tipo sanguíneo de los eritrocitos.

En algunas modalidades, se proporcionan métodos para la determinación del tipo sanguíneo de una muestra que comprende sangre. Tipo sanguíneo se puede determinar utilizando anticuerpos estándar a antígenos A, B y Rh y la adición de una muestra sanguínea entera. Los anticuerpos específicos para antígenos A, B y Rh son muy conocidos, y se usan rutinariamente en las pruebas de sangre. Por ejemplo, si se agregan anticuerpos que se unen al grupo sanguíneo A y se produce la aglutinación, la sangre es ya sea del tipo A o AB. Para determinar entre el tipo A o el tipo AB, los anticuerpos que se unen al grupo B, se agregan en un ensayo separado y si no se produce la aglutinación, la sangre es tipo A. Los métodos de la descripción también se pueden aplicar a las pruebas de compatibilidad cruzada, para evaluar compatibilidad entre donante-receptor en la transfusión sanguínea. En pruebas cruzadas, se produce la aglutinación cuando los glóbulos rojos del donante y el suero o plasma del receptor se incubados juntos indica que la sangre del donante es incompatible para ese receptor particular.

Los métodos de la exposición proporcionan mejoras para la determinación del tipo sanguíneo en una muestra, y en algunas modalidades, la cantidad total de tiempo para llevar a cabo el método es menor a 500, 400, 300, 200, 180, 160, 140, 120, 100, 90, 75, 60, 45, 30, 15, 10, 5, 2, o 1 minuto, o 30, 20, 10, 5, 3, o l segundo. En algunas modalidades, la cantidad total de tiempo de la realización del método se encuentra entre 0.5 a 5 minutos.

En las modalidades, los métodos y reactivos proporcionados en la presente pueden utilizarse en ensayos de aglutinación para estreptozimas (anticuerpos anti-Streptococcus - específicamente, anticuerpos contra Streptococcus NADasa, DNasa, estreptoquinasa, estreptolisina O, y hialuronidasa) o de anticuerpos anti-glóbulos rojos.

V. Equipos En algunas modalidades, la exposición también proporciona un equipo que incluye: eritrocitos pre-fijados y / 141 una partícula viral. Los eritrocitos utilizados para los ensayos de HA y HAI pueden ser inestables, que requieren preparación fresca del tiempo y de trabajo intensivo que también contribuye a errores en la reproducibilidad del ensayo. En una modalidad, un equipo de la descripción proporciona eritrocitos pre-fijado y una partícula viral, adecuados para detectar o medir los anticuerpos para el virus sin necesidad de preparación reciente de los eritrocitos. En otra modalidad, un equipo de la descripción proporciona microesferas y una partícula viral, adecuadas para detectar o medir los anticuerpos para el virus. En otra modalidad, un equipo de la descripción proporciona partículas de visualización y partículas de aglutinación, adecuados para detectar o medir los anticuerpos para la partícula de aglutinación. Los equipos descritos en la presente también pueden proporcionar ventajas de reproducibilidad del ensayo mediante el uso de reactivos estandarizados.

Otros reactivos también pueden proporcionarse con el equipo, tales como los diversos amortiguadores y enzimas, BSA, y los controles (negativos y/positivos) que, por ejemplo, pueden ser partículas virales y/o anticuerpos que tiene título conocido. Además, las instrucciones para la realización de los ensayos pueden ser proporcionarse con el equipo.

EJEMPLOS Ejemplo 1 Metodo de Pretratamiento Materiales: Neuraminidasa 1U (Sigma N7885 -1UN, 3,78 U/g de proteína); Amortiguador A: Acetato de Sodio 100 mM pH 5.5, NaCl 0.15 M, y 4 mM CaCl2; Amortiguador B: 100 mM Fosfato de Sodio pH 8.2, 1.5% de Citrato de Sodio; Solución de Enzima Neuraminidasa [4 miliunidades (mü) de enzima Neuraminidasa en 5 mi de Amortiguador A, para una concentración final de 0.8 mU/ml].

Método: 1. Se agregan 4 volúmenes de solución de enzima Neuraminidasa a 1 volumen de suero (0,2 mi de Neuraminidasa + 0.05 mi de suero) 2. La mezcla se incubó a 37 ± 2°C durante 25 minutos 3. Se agregaron 5 volúmenes del amortiguador B a la mezcla 4. La mezcla se incubó a 56 ± 2°C durante 5 minutos para inactivar la Neuraminidasa 5. El suero se dejó enfriar a temperatura ambiente. La dilución final del suero era 1:10 (dilución inicial en la serie de dilución serial para la determinación del título de anticuerpos).

Ejemplo 2 Ensayo de Inhibición de la Hemoaglutinación - Comparación de Metodos de Análisis de Imagen Materiales: Influenza A H3N2/Brisbane/l0/07 (4 HA U/50 ml) partículas virales en amortiguador diluyente; Amortiguador Diluyente [salina con fosfato amortiguada pH 7.2, conteniendo 0.05% de azida de sodio y 0.05% de albúmina de suero bovino; (PBS/A/BSA)]; plasma humano conteniendo anticuerpos contra la Influenza B; y GR Turquía fijados en Glutaraldehído - (0.6% v/v) en amortiguador diluyente.

Método: 1) A una placa de microtitulación se agregaron a todos los pozos 25 ml de PBS/A/BSA, excepto para los pozos de control de GB y al primer pozo para la dilución en serie de la muestra tratada que contiene anticuerpo. 2) Para el primer pozo se agregaron 50 m? de la muestra tratada (suero o plasma) conteniendo anticuerpo (diluido 1/10 en amortiguador de tratamiento). 3) La muestra se diluyó en serie mediante la transferencia de 25 m? de la muestra del primer pozo al pozo adyacente conteniendo 25 m? de PBS/A/BSA. Las etapas se repitieron hasta el último pozo en la serie. Esta etapa es opcional y puede reemplazarse con un solo nivel de dilución. 4) Se agregó a todos los pozos conteniendo la muestra tratada, 25 m? del virus de Influenza B/Florida/4.6 diluido en PBS/A/BSA (4HA U/50 m?). 5) Se agregaron añadió 50 m? de PBS/A/BSA a los pozos de GR control. 6) El contenido de los pozos se mezcló golpeando suavemente las paredes laterales de la placa de microtitulación 7) Se agregaron a todos los pozos una suspensión de50 ml de GR Turquía-fijos en glutaraldehído (0.6%) preparado en PBS/A/BSA.

En el análisis del movimiento en masa de la reacción, se realizaron también las siguientes etapas (8-11): 8) El contenido de los pozos se mezcló golpeando suavemente las paredes laterales de la placa de microtitulación. 9) La placa se cubrió y se incubó a temperatura ambiente durante un total de aproximadamente 15 minutos. 10) A los 15 minutos se lcyó la placa en el escáner y una imagen de punto final terminal (Figura 14B) se tomó de la placa inclinada a 45 - 60°. 11) La imagen se escaneó (Figura 14C), y se calculó el área y la periferia de las regiones oscuras correspondientes a glóbulos rojos empaquetados.

En el análisis de imágenes de imágenes microscópicas, se llevaron a cabo las siguientes etapas después de la etapa 7): 12) Una pequeña muestra (~1 o 2m1) de los pozos se pipetearon directamente en una cubeta, y la imagen bajo el microscopio. 13) Se recogieron las imágenes y se analizaron para calcular los factores de asociación de los GRs, como se describe en la presente.

El uso de análisis de imágenes de las imágenes microscópicas, la gráfica de factor de asociación para las diferentes muestras se muestra en la Figura 14A. Utilizando el análisis de imagen de movimiento en masa, se muestra en la Figura 14D la gráfica del área o la periferia para las diferentes muestras de células empaquetadas. Las muestras están numeradas 1-6, y son por duplicado. La Figura 14B muestra una imagen visual de macroscópico de los pozos de ensayo granulados después de la inclinación. La Figura 14C muestra una imagen escaneada de la Figura 14B sometida a digitalización de umbral. Los pozos están numerados 1-6 a partir de la parte inferior de la figura, y las columnas de la derecha e izquierda son duplicados de los ensayos con el mismo nivel de dilución de la muestra. Como se muestra en la Figura 14A, las muestras con altas concentraciones de anticuerpos (diluciones bajas, muestras 1-3) muestran bajos valores para el factor de asociación, mientras que las muestras 4, 5, y 6 (concentraciones bajas de anticuerpos) muestran valores elevados del factor de asociación. La transición entre la muestra 3 y la muestra 4 también es bastante evidente. Como se muestra en la Figura 14D, las muestras con concentraciones elevadas de anticuerpos (diluciones bajas, muestras 1-3) muestran valores altos del perímetro y área de concentrado de eritrocitos (es decir, muchas células en la lágrima), mientras que las muestras 4-6 (concentraciones bajas de anticuerpos) muestran valores más bajos para la perímetro y área de concentrado de eritrocitos (es decir, un menor número de células en la lágrima). La transición entre la muestra 3 y la muestra 4 es también evidente. En la imagen visual macroscópico del ensayo de granulación (Figura 14B), se puede observar que las muestras 4-6 muestran aglutinación, mientras que las muestras 1-3 muestra el flujo de GR, lo que sugiere por lo tanto no aglutinación. De cada uno de los métodos anteriores, se puede concluirse que la transición de aglutinación a la no aglutinación se encuentra entre la muestra #3 y #4. Por lo tanto, estos datos demuestran concordancia entre los métodos de análisis de imagen proporcionados en la presente (tanto de análisis de imagen de las imágenes microscópicas (Figura 14A) y análisis de imágenes del movimiento en masa (Figura 14D) con el análisis tradicional basado en el examen visual de los pozos de ensayo de aglutinación (Figura 14B).

Ejemplo 3 Método Basado en Microscopía para Detección de Aglutinación de GR Una muestra biológica conteniendo un anticuerpo contra un virus de interés se incubó con el virus durante un período determinado de tiempo inferior o igual a 5 minutos. Después de la incubación, se agregaron glóbulos rojos a la muestra y se mezclaron. Una porción (aproximadamente 1-1.5 ml) de la muestra se tomó y se introdujo en una cubeta de microscopía conteniendo un microcanal. El microcanal tenía una sección transversal de 125 mm x lOOOpm y era de aproximadamente 7 mm de largo. El canal se cargó en un microscopio de campo claro estándar equipado con una fuente de luz de banda ancha y un objetivo lOx. Cada campo de visión corresponde a un área de ~700 mieras x 500pm. El microscopio se ajustó de tal manera que el campo de visión estaba lejos de las paredes laterales del canal, y la imagen estaba en foco con el fin de observar claramente los glóbulos rojos individuales. La imagen se capturó utilizando una cámara CCD USB. La platina del microscopio se movió a lo largo del eje, del canal a la imagen para un campo de visión diferente a lo largo del canal, y la imagen. Aproximadamente 10 campos de visión fueron capturados. Las imágenes de muestra se muestran en la Figura 12.

Las imágenes recolectadas se procesaron con precisión para localizar las posiciones de GR. Los centros de los GR se detectaron a partir de todas las imágenes. La Figura 12 muestra imágenes representativas de dos muestras; Muestra de control (izquierda, panel A), (que representa una muestra no aglutinada), y una muestra aglutinada (Derecha, panel B). Aunque a la inspección de las imágenes con el ojo sin ayuda, puede ser difícil diferenciar las dos muestras, cuando se utiliza la información del centro de GR en conjunto con una distancia "de corte", es posible identificar las células que están unidos entre sí.

Ejemplo 4 Comparación del Pretratamiento tradicional y un método de Pretratamiento de la Exposición A. Pretratamiento del Método Tradicional La fuente la enzima que destruye el receptor (RDE) fue el extracto crudo de Vibrio cholerae del Filtrado de Cólera C8772 de Sigma.

Se reconstituyó 0.1 Unidades RDE con 5 mi de agua destilada estéril. 1 mi de RDE reconstituida se diluyó a 20 mi con solución salina de calcio, pH 7.2. Cuatro volúmenes de RDE diluida se agregaron a 1 volumen de plasma humano con EDTA anticoagulada (0.4 mi RDE + 0.1 mi de plasma). Las muestras se prepararon por duplicado para cuatro muestras separadas. Para los ensayos de control (no tratadas), se agregaron 4 volúmenes de solución salina de calcio a 1 volumen de plasma (0.4 mi de solución salina de calcio + 0.1 mi de plasma).

Las mezclas se incubaron durante 30, 60, 360 minutos, y durante la noche (> 16 horas) a 37°C. El control se incubó durante la noche (> 16 horas) a 37°C.

Se agregaron 5 volúmenes de citrato de sodio 1.5% (0.5 mi) a cada muestra. Las muestras se incubaron a 56°C durante 30 minutos para inactivar la RDE. El suero se dejó enfriar a temperatura ambiente. La dilución final del suero tratado fue 01:10 (utilizado como la dilución de inicio en la serie de diluciones seriales para la determinación del título de anticuerpos).

B. Un Método de Pretratamiento de la Exposición La fuente Neuraminidasa fue 3.78 U/mg de proteína de Sigma. La Solución de Enzima Neuraminidasa fue 4 mü de la enzima Neuraminidasa en 5 mi de Amortiguador A: 100 mM de Acetato de Sodio pH 5.5, NaCl 0.15 M, y CaCl24 mM (0.8 mU/ml de concentración final).

Se agregaron cuatro volúmenes de solución de enzima neuraminidasa a 1 volumen de plasma (0.2 mi de Neuraminidasa + 0.05 mi de plasma), y la mezcla se incubó a 37°C durante 25 min. A continuación se agregaron 5 volúmenes de amortiguador B (1.5% de citrato de sodio en de Fosfato de sodio pH 8.2) (0.25 mi) y la mezcla se incubó a 56°C durante 5 min para inactivar la neuraminidasa. El plasma se dejó enfriar a temperatura ambiente. La dilución final del plasma fue de 1:10 (dilución inicial en la serie de diluciones seriales para la determinación del título de anticuerpos).

C. Comparación Los resultados del análisis comparativo se muestran en la Figura 15. Como se observa, la reacción no específica se eliminó con ambos métodos, pero el método de la neuraminidasa de la exposición (barras sólidas) fue mucho más rápido que el método tradicional (barras llenas reducidas). La Figura 16 muestra los resultados de un ensayo HAI siguiendo diversos métodos de pretratamiento como se describió anteriormente y se indica. Las muestras fueron control (barra en negro sólidas), tratados con RDE durante la noche (barra-reducida invertida), o tratados con neuraminidasa durante 25 minutos (barra reducida diagonal). Se probaron tres muestras de plasma y suero pareadas (cada una a partir de una sola muestra sanguínea). Las muestras 1 y 3 fueron negativas para el anticuerpo viral mientras que la muestra 2 fue positiva. Ambos métodos de pretratamiento de muestra eliminaron las reacciones positivas falsas, manteniendo la reacción positiva verdadera. Como puede observarse, el método de la descripción es igualmente efectivo tanto en la eliminación de reacción falsa positiva como la retención de reacción positiva verdadera, y el método descrito es mucho más rápido.

Ejemplo 5 Comparación de los Métodos de la Exposición con los Métodos HAI Tradicionales En este experimento, ciertos métodos de la descripción para la realización de ensayos de HAI se compararon con los métodos tradicionales para la realización de ensayos de HAI.

Ensayos HAI con un Solo Antígeno de Cepa Viral En un experimento se realizaron ensayos HAI utilizando Influenza A H1N1/California/04/2009 como la partícula viral, y el uso de la muestra biológica de los sujetos que habían sido vacunados contra el virus de H1N1.

Los ensayos se realizaron como sigue: Etapa de pretratamiento Para las muestras del método tradicional, el pretratamiento de muestras de plasma de los sujetos vacunados H1N1 se llevó a cabo conforme a lo dispuesto en el Ejemplo 4, parte A.

Para el método de las muestras de exposición, el pretratamiento de muestras de plasma de los sujetos vacunados H1N1 se realizó como se proporciona en el Ejemplo 4, parte B. Etapa del ensayo HAI Para las muestras del método tradicional, el ensayo HAI se llevó a cabo según lo dispuesto en las etapas 1-10 del Ejemplo 2. Los resultados del ensayo se determinaron por el ojo sin ayuda (visual) la inspección de pozos inclinados.

Para el método de las muestras de la exposición, el ensayo HAI se llevó a cabo según lo dispuesto en los etapas 1-7, más 12-13 del Ejemplo 2. Los resultados del ensayo se determinaron mediante el cálculo de factores de asociación de las muestras en base al análisis de imagen de las imágenes microscópicas de la reacción de aglutinación.

En base a la información de estos métodos, se determinó el título de cada muestra.

Análisis El registro de los títulos de anticuerpos para el método de las muestras de exposición se gráfico contra el título de registro de las muestras del método tradicional. Como puede observarse en la Figura 17, se obtuvo una excelente correlación y el valor de la pendiente y la intersección de la línea de regresión indica la congruencia de los resultados de los dos métodos. El valor R2 para la línea de correlación fue de 0.89, y N = 10 muestras de plasma de H1N1 de sujetos vacunados.

Ensayo HAI con Múltiples Antígenos de Cepa Viral En otro experimento, los ensayos se realizaron como anteriormente para el Ensayo HAI con un solo Antígeno de Cepa Viral, excepto que los ensayos también se realizaron con Influenza B (Influenza B/Florida/04/06) y de la influenza A (Influenza A/H3N2/Brisbane/10/07), además de los ensayos con la gripe A HINl/California/04/2009 como las partículas virales. Las muestras de plasma fueron de individuos vacunados con H1N1 (2009) virus pandémico, y que pueden haber tenido exposición previa al virus estacional de la Influenza B y H3N2. Como en lo anterior, tanto el método tradicional como los métodos de la descripción se utilizaron tanto para el pretratamiento como para las etapas del ensayo HAI.

Con referencia a la Figura 18, se utilizaron ensayos para tres antígenos de cepas virales para ensayar los anticuerpos correspondientes. Los resultados se graficaron de forma individual y después como un conjunto de datos agregados para todas las tres cepas. En todos los casos las estadísticas de regresión muestran la equivalencia de los dos métodos. Ninguna muestra (de 31) dio resultados más de un 2x dilución (el límite de la resolución del método de referencia) del método tradicional. Este experimento también indica que ambos métodos son precisos con una imprecisión promedio de mucho menos de un 2 x dilución. Las estadísticas de la comparación se dan en la Tabla 2 a continuación.

Tabla 2 Cuenta de Muedtras 31 Título del Registro máximo 2.81 Título del Registro mínimo 1.00 Título del Registro promedio 1.98 Rango, veces (Lineal o Registro 65 Diferencia del Registro promedio 0.16 Error Estándar de estimación de 8.2 Registro/media del registro (Equivalente a, veces) 1.46 Ejemplo 6 Determinación del tipo sanguíneo por la extracción de características de imagen En este experimento, la sangre se ha tipificado en las clases A, B, AB u O y Rh + o de acuerdo con los métodos de análisis de la extracción de imagen proporcionados en la presente, incluyendo análisis de textura.

Tres muestras sanguíneas tratadas con EDTA se obtuvieron de tres sujetos diferentes. Cada muestra sanguínea se mezcló y se centrifugó a 10.000 rpm para sedimentar los glóbulos rojos (eritrocitos). 20 microlitros de glóbulos rojos empaquetados de cada sujeto se diluyeron cada uno con una solución de 180 microlitros de solución salina, para producir suspensiones conteniendo 10% en volumen de glóbulos rojos. Por cada suspensión de GR, se prepararon cuatro tubos/ensayos: 1) anticuerpo anti-sangre del grupo A; 2) anticuerpo anti-sangre del grupo B; 3) anti-sangre grupo D (factor Rh); y 4) de control. 24 microlitros de diluyente (PBS + BSA al 0.1% + 0.1% de polisorbato 20) se agregó a cada uno de los tubos #s 1-3, y 30 microlitros de diluyente se agregaron al tubo # 4. 6 microlitros del anticuerpo respectivo se agregaron a cada tubo #s 1-3. Con una pipeta, se agregaron 20 microlitros de la suspensión de RBC 10% a cada uno de los tubos #s 1-4, y los reactivos se mezclaron para generar un ensayo de aglutinación en cada tubo. 10 microlitros de cada ensayo para cada suspensión de RBC se aspiró en una punta de la pipeta. Las puntas de pipeta se colocaron en un analizador conteniendo una de fuente de luz blanca y cámara CCD, y las imágenes de las puntas se obtuvieron 5 minutos y 10 minutos después del inicio de cada ensayo de aglutinación. Las imágenes de las puntas después de 5 minutos de incubación se muestran para cada uno de los ensayos de aglutinación (ensayos de "1", "2" , "3" y "4") para cada una de las 3 muestras diferentes (muestras "I", "II "y" III ") en la Figura 21 (la Figura 21A muestra la muestra I, la Figura 21B muestra la muestra II, y la Figura 21C muestra la muestra III). La imagen de cada punta se analizó mediante un método de análisis de textura de imagen tal como se describe en la presente. Brevemente, utilizando un algoritmo de comparación de plantillas, se identificó el extremo de la punta de la pipeta 2105 y el menisco del material de ensayo 2110. Basándose en la posición del extremo de la punta de la pipeta y el menisco de los materiales del ensayo, se determinó una región de interés (ROI) 2115 de la imagen conteniendo el material de ensayo. La región de interés 2115 se definió como una forma rectangular por debajo del menisco, sobre el extremo de la punta de la pipeta, y entre las paredes de la punta de la pipeta. Una ROI ejemplar 2115 se muestra en la punta para la muestra I, el ensayo 1 en la Figura 21A. A continuación, se realizó la extracción de características dentro de la ROI. Extracción de características incluye i) la determinación de la media y la desviación estándar de la intensidad del canal rojo en la ROI y ii) la determinación de patrones binarios locales (LBP). El operador LBP captura los patrones espaciales locales y el contraste de escala de grises. Las características extraídas de las imágenes se proporcionan a una máquina clasificadora de soporte vectorial. La máquina clasificadora de soporte vectorial se formó previamente con información de las imágenes de los ensayos del estado de aglutinación conocido (aglutinado o no aglutinado). Utilizando las características extraídas de las imágenes, la máquina de soporte vectorial clasifica cada ROI como conteniendo material de ensayo aglutinado o no aglutinado (como una clasificación binaria). Por último, se utilizó la información de clasificación para cada ROI de una muestra para identificar el tipo sanguíneo de la muestra. En general, si una muestra aglutinadas con anticuerpo contra un antígeno dado (A, B, o D), el ensayo indicó que la muestra era positiva para el antígeno correspondiente. En consecuencia, la Muestra I se identificó como sangre B Rh positivo ("B positiva") (las puntas 2 y 3 de la Figura 21A contienen material aglutinado, y por lo tanto la sangre contiene antígenos que se reconocen por el anticuerpo anti-sangre del grupo B y el anticuerpo antisangre del grupo D (Rh)), La muestra II se identificó como sangre Rh positivo (puntas 1 y 3 de la Figura 2IB conteniendo material aglutinado), y la muestra III se identificó como sangre O positivo (punta 3 de la Figura 21C conteniendo material aglutinado). El tipo sanguíneo de las muestras I, II, y III también se analizó utilizando un método de tipificación de sangre tradicional (Eldoncard). Los resultados del experimento proporcionados en la presente coinciden con los resultados del método de tipificación de sangre tradicional, confirmando así la exactitud del método proporcionado en la presente.

Aunque la anterior es una descripción completa de las modalidades preferidas de la presente invención, es posible utilizar diversas alternativas, modificaciones y equivalentes. Por lo tanto, el alcance de la presente invención se determinará no con referencia a la descripción anterior sino, en su lugar, se determinará con referencia a las reivindicaciones adjuntas, junto con el alcance completo de los equivalentes. Cualquier característica, si se prefiere o no, puede combinarse con cualquier otra función, si se prefiere o no. Las reivindicaciones adjuntas no se interpretarán como incluyendo limitaciones de los medios más función, a menos que dicha limitación se cite explícitamente en una reivindicación dada utilizando la frase "medios para". Debe entenderse que como se utiliza en la presente descripción y en todas las reivindicaciones que siguen, el significado de "un", "una" y "el" incluye la referencia al plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. Además, Como se utiliza en la presente descripción y a través de todas las reivindicaciones siguientes, el significado de "en" incluye "en" y "sobre" a menos que el contexto indique claramente lo contrario. También, como se utilizan en la descripción de este documento y a través de todas las reclamaciones siguientes, los términos "incluyen" y "contienen" son de composición abierta y no excluyen elementos no citados o etapas adicionales del procedimiento. Finalmente, como se utiliza en la presente descripción y en todas las reivindicaciones siguientes, el significado de "y" y "o" incluir tanto el conjuntivo y disyuntivo y puede utilizarse de forma intercambiable, a menos que el contexto indique expresamente lo contrario. Así, en contextos en donde se utilizan los términos "y" u "o", el uso de tales conjunciones no excluye un significado "y/o" a menos que el contexto indique expresamente lo contrario.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; y (b) detectar si dicha aglutinación ocurre en dicha mezcla, en donde la ausencia de dicha aglutinación indica la presencia de dicho anticuerpo, en donde dichas etapas (a) -(b) tienen lugar en menos de una hora.

2. El método de la reivindicación 1, en donde dichos eritrocitos son pre-fijados.

3. El método de la reivindicación 2, en donde dichos eritrocitos se pre-fijan mediante el tratamiento con glutaraldehído.

4. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-3, en donde dichos eritrocitos comprenden glóbulos rojos de pavo.

5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en donde dicha partícula viral comprende un virus de influenza.

6. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde dicha muestra biológica comprende plasma o suero.

7. El método de la reivindicación 6, en donde dicho plasma o suero es de un sujeto al que se le ha administrado una vacuna contra dicha partícula viral.

8. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en donde dicha muestra biológica se pre-trata con neuraminidasa.

9. El método de la reivindicación 8, en donde dicho tratamiento se lleva a cabo al incubar dicha muestra biológica con neuraminidasa, y en donde la concentración final de la neuraminidasa en la mezcla es de entre 0.1 y 1.5 U/1.

10. El método de la reivindicación 8, en donde dicho tratamiento se lleva a cabo incubando dicha muestra con neuraminidasa activa durante menos de 30 minutos.

11. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-10, en donde dicha muestra biológica se diluye en serie antes de la etapa (a).

12. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-11, en donde dichas etapas (a) - (b) tienen lugar entre aproximadamente 30 a 60 minutos.

13. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-12, en donde la presencia de dicha aglutinación se evidencia por la formación de agrupamientos de eritrocitos-partículas virales, y en donde dichos agrupamientos se capturan en una región de formación de imágenes de un dispositivo óptico, y en donde dicha etapa de detección comprende: (i) capturar una pluralidad de imágenes de dichos agrupamientos en diferentes ubicaciones de dicha región de formación de imágenes con el dispositivo óptico; y (ii) detectar la ocurrencia de dicha aglutinación en base al análisis de dichas imágenes.

14. El método de la reivindicación 13, en donde dicho dispositivo óptico comprende una cámara.

15. El método de la reivindicación 13 o 14, en donde dicho dispositivo óptico comprende un microscopio.

16. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-15, en donde dicha región de formación de imágenes reside en un canal microfluídico.

17. El método de cualquiera de las reivindicaciones 13-16, en donde dicho análisis comprende calcular el tamaño de dichos agrupamientos en base a la distancia de centro a centro de los eritrocitos individuales capturados en cada una de dichas imágenes.

18. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-17, en donde dicha etapa (a) comprende la incubación de una mezcla de dicha partícula viral y dicha muestra biológica antes de la adición de dichos eritrocitos.

19. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la presencia de un agrupamiento de eritrocitos-partícula viral en dicha imagen indica la ocurrencia de dicha aglutinación y la falta de una cantidad detectable de dicho anticuerpo, y en donde la ausencia de dicho agrupamiento indica la falta de dicha aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de dicho anticuerpo.

20. El método de la reivindicación 19, en donde la formación de dicho agrupamiento de eritrocitos-partícula viral se determina al evaluar la distancia de centro a centro entre los eritrocitos individuales capturados en dicha imagen.

21. El método de la reivindicación 19 o 20, en donde dicha etapa (a) comprende la incubación de una mezcla de dicha partícula viral y dicha muestra biológica antes de la adición de dichos eritrocitos.

22. Un método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica, que comprende: (a) incubar una mezcla de eritrocitos y una muestra biológica sospechosa de contener dicha partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; y (b) detectar si dicha aglutinación se produce en dicha mezcla, en donde la presencia de dicha aglutinación indica la presencia de dicha partícula viral, y en donde las etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora.

23. Un método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica, que comprende: (a) incubar una mezcla de eritrocitos y una muestra biológica sospechosa de contener dicha partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la presencia de un agrupamiento de eritrocitos-partículas virales en dicha imagen indica la ocurrencia de dicha aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de dicha partícula viral, y en donde la ausencia de dicho agrupamiento indica la falta de dicha aglutinación y la falta de una cantidad detectable de dicha partícula viral.

24. Un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto que ha sido inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula viral; (b) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y dicha muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; y (c) determinar la concentración de un anticuerpo contra dicho virus en dicha muestra en base a los agrupamientos formados por la aglutinación de los eritrocitos, y en donde dichas etapas (b) - (c) tienen lugar en menos de una hora.

25. Un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto que ha sido inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula viral; (b) incubar una mezcla de eritrocitos, dicha partícula viral, y dicha muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; (c) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla; y (d) determinar la concentración de un anticuerpo contra dicho virus en dicha muestra biológica en base a los agrupamientos formados por la aglutinación de los eritrocitos, en donde la presencia de un agrupamiento de eritrocitos-partícula viral en dicha imagen indica la ocurrencia de dicha aglutinación y la falta de una cantidad detectable de dicho anticuerpo, y en donde la ausencia de dicho agrupamiento indica la falta de dicha aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de dicho anticuerpo.

26. El método de la reivindicación 23 o 24, que comprende además la administración de una segunda dosis de dicha primera vacuna contra dicha partícula viral a dicho sujeto si la concentración de dicho anticuerpo es menor a un nivel predeterminado.

27. El método de la reivindicación 23 o 24, que comprende además la administración de una segunda vacuna contra dicha partícula viral a dicho sujeto si la concentración de dicho anticuerpo es menor a un nivel predeterminado.

28. Un equipo, que comprende: eritrocitos pre- fijados, una partícula viral, e instrucciones para que un usuario utilice dicho equipo para la detección del anticuerpo o la viral.

29. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19, 23, o 25, en donde dicha imagen es una imagen de microscopio.

30. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una partícula viral, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, la partícula viral, y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; (b) simultáneamente o después de (a), proporcionar la mezcla en un recipiente que tenga una abertura en la parte superior del recipiente y una forma cónica interior en el fondo del recipiente; (c) inclinar el recipiente de manera que después de la inclinación, al menos una porción de la mezcla se encuentre más cerca de la abertura en la porción superior del recipiente que antes de la inclinación, y en donde al menos una porción de la muestra permanece en el recipiente después de la inclinación; y (d) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la posición de los eritrocitos dentro del recipiente inclinado puede utilizarse para determinar la presencia o cantidad de dicho anticuerpo en la muestra.

31. Un método para determinar la presencia de una partícula viral en una muestra biológica, en donde dicha partícula viral puede unirse selectivamente por un anticuerpo, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de eritrocitos, el anticuerpo, y la muestra biológica sospechosa de contener dicha partícula viral, en condiciones que permitan la aglutinación de los eritrocitos a través de la interacción con dicha partícula viral; (b) simultáneamente con o después de (a), proporcionar la mezcla en un recipiente que tenga una abertura en la parte superior del recipiente y la forma cónica interior en el fondo del recipiente; (c) inclinar el recipiente de manera que después de la inclinación, al menos una porción de la mezcla se encuentre más cerca de la abertura en la parte superior del recipiente que antes de la inclinación, y en donde al menos una porción de la muestra permanece en el recipiente después de la inclinación; y (d) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la posición de los eritrocitos dentro del recipiente inclinado puede utilizarse para determinar la presencia o cantidad de dicha partícula viral en la muestra.

32. El método de las reivindicaciones 30 o 31, en donde una o más zonas para el análisis se encuentran presentes o establecidas dentro del recipiente, y en donde la señal óptica se mide en cada zona.

33. El método de la reivindicación 32, en donde la señal óptica medida sobre la una o más zonas puede utilizarse para determinar la cantidad de eritrocitos aglutinados o no aglutinados en la muestra.

34. El método de las reivindicaciones 30 o 31, en donde un eje para el análisis se encuentra presente o establecido dentro del recipiente, y en donde se mide la señal óptica a lo largo del eje.

35. El método de la reivindicación 34, en donde el eje es a través del centro de una porción de botón y, si se encuentra presente, una porción de lágrima de los glóbulos rojos empaquetados en el fondo del recipiente.

36. El método de la reivindicación 34 o 35, en donde la señal óptica medida a lo largo del eje puede utilizarse para determinar la cantidad de eritrocitos aglutinados o no aglutinadas en la muestra.

37. El método de las reivindicaciones 30 o 31, en donde de glóbulos rojos empaquetados en el fondo del recipiente se identifican, y el área o perímetro de los glóbulos rojos empaquetados se mide.

38. El método de la reivindicación 37, en donde el método comprende además utilizar un método de reconocimiento de patrones para identificar un botón y, opcionalmente, una región de lágrima de los glóbulos rojos empaquetados.

39. El método de la reivindicación 37 o 38, en donde el área o perímetro de los glóbulos rojos empaquetados pueden utilizarse para determinar la cantidad de eritrocitos aglutinados o no aglutinadas en la muestra.

40. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una partícula de aglutinación, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización, la partícula de aglutinación, y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de la partícula de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; y (b) detectar si dicha aglutinación se produce en dicha mezcla, en donde la ausencia de dicha aglutinación indica la presencia de dicho anticuerpo, en donde dichas etapas (a) - (b) tienen lugar en una hora.

41. El método de la reivindicación 40, en donde dichas partículas de visualización son microesferas.

42. El método de la reivindicación 40 o 41, en donde dicha partícula de aglutinación comprende un virus, prión, o bacterias.

43. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-42, en donde dicha muestra biológica comprende plasma o suero.

44. El método de la reivindicación 43, en donde dicho plasma o suero es de un sujeto al que se le ha administrado una vacuna contra dicha partícula de aglutinación.

45. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-44, en donde dicha muestra biológica se pre-trata con neuraminidasa.

46. El método de la reivindicación 45, en donde dicho tratamiento se lleva a cabo mediante la incubación de dicha muestra biológica con neuraminidasa, y en donde la concentración final de la neuraminidasa en la mezcla es entre 0.1 y 1.5 U/1.

47. El método de la reivindicación 46, en donde dicho tratamiento se lleva a cabo mediante la incubación de dicha muestra con neuraminidasa activa durante menos de 30 minutos.

48. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-47, en donde dicha muestra biológica se diluye en serie antes de la etapa (a).

49. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-48, en donde dichas etapas (a) - (b) tienen lugar entre aproximadamente 30 a 60 minutos.

50. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-49, en donde la presencia de dicha aglutinación se evidencia por la formación de agrupamientos de partículas de visualización-partículas de aglutinación, y en donde dichos agrupamientos se capturan en una región de formación de imágenes de un dispositivo óptico, y en donde dicha etapa de detección comprende: (i) capturar una pluralidad de imágenes de dichos agrupamientos en diferentes lugares de dicha región de formación de imágenes con el dispositivo óptico; y (ii) detectar la ocurrencia de dicha aglutinación en base al análisis de dichas imágenes.

51. El método de la reivindicación 50, en donde dicho dispositivo óptico comprende una cámara.

52. El método de la reivindicación 50, en donde dicho dispositivo óptico comprende un microscopio.

53. El método de cualquiera de las reivindicaciones 50-52, en donde dicha región de formación de imágenes reside en un canal microfluídico.

54. El método de cualquiera de las reivindicaciones 50-53, en donde dicho análisis comprende calcular el tamaño de dichos agrupamientos en base a la distancia de centro a centro de los eritrocitos individuales capturados en cada una de dichas imágenes.

55. El método de cualquiera de las reivindicaciones 40-54, en donde dicha etapa (a) comprende la incubación de una mezcla de dicha partícula viral y dicha muestra biológica antes de la adición de dichos eritrocitos.

56. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una partícula de aglutinación, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización, la partícula de aglutinación, y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de la partícula de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la presencia de un agrupamiento de partículas de visualización-partículas de aglutinación en dicha imagen indica la ocurrencia de dicha aglutinación y la falta de una cantidad detectable de dicho anticuerpo, y en donde la ausencia de dicho agrupamiento indica la falta de dicha aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de dicho anticuerpo.

57. El método de la reivindicación 56, en donde la formación de dicho agrupamiento de partículas de visualización-partículas de aglutinación se determina mediante la evaluación de la distancia de centro a centro entre las partículas de visualización individuales capturadas en dicha imagen.

58. El método de la reivindicación 56 o 57, en donde dicha etapa (a) comprende la incubación de una mezcla de dicha partícula de aglutinación y dicha muestra biológica antes de agregar dicha partícula de visualización.

59. Un método para determinar la presencia de una partícula de aglutinación en una muestra biológica, que comprende: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización y una muestra biológica sospechosa de contener dicha partícula de aglutinación, en condiciones que permitan la aglutinación de la partícula de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; y (b) detectar si dicha aglutinación se produce en dicha mezcla, en donde la presencia de dicha aglutinación indica la presencia de dicha partículas de aglutinación, y en donde las etapas (a) - (b) tienen lugar en menos de una hora.

60. Un método para determinar la presencia de una partícula de aglutinación en una muestra biológica, que comprende: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización y una muestra biológica sospechosa de contener dicha partícula de aglutinación, en condiciones que permitan la aglutinación de la partícula de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; y (b) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la presencia de un agrupamiento de partículas de visualización-partículas de aglutinación en dicha imagen indica la ocurrencia de dicha aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de dicha partícula de aglutinación, y en donde la ausencia de dicho agrupamiento indica la falta de dicha aglutinación y la falta de una cantidad detectable de dicha partícula de aglutinación.

61. Un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto que ha sido inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula de aglutinación; (b) incubar una mezcla de partículas de visualización, la partícula de aglutinación, y dicha muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de las partículas de visualización a través de la interacción con dichas partículas de aglutinación; y (c) determinar la concentración de un anticuerpo contra dicha partícula de aglutinación en dicha muestra en base a los agrupamientos formados por la aglutinación de las partículas de visualización, y en donde dichas etapas (b) - (c) tienen lugar en menos de una hora.

62. Un método para determinar la inmunización efectiva de un sujeto, que comprende: (a) obtener una muestra biológica de un sujeto que ha sido inmunizado con una primera dosis de una primera vacuna contra una partícula de aglutinación; (b) incubar una mezcla de partículas de visualización, dichas partículas de aglutinación, y dicha muestra biológica, en condiciones que permitan la aglutinación de las partículas de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; (c) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla; y (d) determinar la concentración de un anticuerpo contra dicha partícula de aglutinación en dicha muestra biológica en base a los agrupamientos formados por la aglutinación de las partículas de visualización, en donde la presencia de un agrupamiento de partículas de visualización-partículas de aglutinación en dicha imagen indica la ocurrencia de dicha aglutinación y la falta de una cantidad detectable de dicho anticuerpo, y en donde la ausencia de dicho agrupamiento indica la falta de dicha aglutinación y la presencia de una cantidad detectable de dicha anticuerpo.

63. El método de la reivindicación 61 o 62, que comprende además la administración de una segunda dosis de dicha primera vacuna contra dicha partícula de aglutinación a dicho sujeto si la concentración de dicho anticuerpo es menor a un nivel predeterminado.

64. El método de la reivindicación 61 o 62, que comprende además la administración de una segunda vacuna contra dicha partícula de aglutinación a dicho sujeto si la concentración de dicho anticuerpo es menor a un nivel predeterminado.

65. Un equipo, que comprende: partículas de visualización, una partícula de aglutinación, e instrucciones para que un usuario utilice dicho equipo para la detección del anticuerpo o partícula de aglutinación

66. El equipo de la reivindicación 65, en donde las partículas de visualización son microesferas.

67. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19, 23, 25, 56, 60, o 62 en donde dicha imagen es una imagen de microscopio.

68. Un método para determinar la presencia de un anticuerpo en una muestra biológica, en donde dicho anticuerpo se une selectivamente a una partícula de aglutinación, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización, la partícula de aglutinación, y la muestra biológica sospechosa de contener dicho anticuerpo, en condiciones que permitan la aglutinación de la partícula de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; (b) simultáneamente con o después de (a), proporcionar la mezcla en un recipiente que tenga una abertura en la parte superior del recipiente y la forma cónica interior en el fondo del recipiente; (c) inclinar el recipiente de manera que después de la inclinación, al menos una porción de la mezcla se encuentre más cerca de la abertura en la parte superior del recipiente que antes de la inclinación, y en donde al menos una porción de la muestra permanece en el recipiente después de la inclinación; y (d) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la posición de las partículas de visualización dentro del recipiente inclinado puede utilizarse para determinar la presencia o cantidad de dicho anticuerpo en la muestra.

69. Un método para determinar la presencia de una partícula de aglutinación en una muestra biológica, en donde la partícula de aglutinación puede unirse selectivamente por un anticuerpo, comprendiendo el método: (a) incubar una mezcla de partículas de visualización, el anticuerpo, y la muestra biológica sospechosa de contener dicha partícula de aglutinación, en condiciones que permitan la aglutinación de las partículas de visualización a través de la interacción con dicha partícula de aglutinación; (b) simultáneamente con o después de (a), proporcionar la mezcla en un recipiente que tenga una abertura en la parte superior del recipiente y la forma cónica interior en el fondo del recipiente; (c) inclinar el recipiente de manera que después de la inclinación, al menos una porción de la mezcla se encuentre más cerca de la abertura en la parte superior del recipiente que antes de la inclinación, y en donde al menos una porción de la muestra permanece en el recipiente después de la inclinación; y (d) capturar con la ayuda de un dispositivo óptico una imagen de dicha mezcla, en donde la posición de las partículas de visualización dentro del recipiente inclinado pueden utilizarse para determinar la presencia o cantidad de dicha partícula de aglutinación en la muestra.

70. El método de las reivindicaciones 68 o 69, en donde una o más zonas para el análisis se encuentran presentes o establecidas dentro del recipiente, y en donde la señal óptica se mide en cada zona.

71. El método de la reivindicación 70, en donde la señal óptica medida sobre las una o más zonas puede utilizarse para determinar la cantidad de partículas de visualización aglutinadas o no aglutinadas en la muestra.

72. El método de las reivindicaciones 68 o 69, en donde un eje para el análisis se encuentra presente o establecido dentro del recipiente, y en donde se mide la señal óptica a lo largo del eje.

73. El método de la reivindicación 72, en donde el eje es a través del centro de una porción de botón y, si se encuentra presente, una porción de lágrima de las partículas de visualización empaquetadas en el fondo del recipiente.

74. El método de la reivindicación 72 o 73, en donde la señal óptica medida a lo largo del eje puede utilizarse para determinar la cantidad de partículas de visualización aglutinadas o no aglutinadas en la muestra.

75. El método de las reivindicaciones 68 o 69, en donde las partículas de visualización empaquetados en el fondo del recipiente se identifican, y el área o el perímetro de las partículas de visualización empaquetadas se mide.

76. El método de la reivindicación 75, en donde el método comprende además utilizar un método de reconocimiento de patrones para identificar un botón y, opcionalmente, la región de lágrima de las partículas de visualización empaquetadas.

77. El método de la reivindicación 75 o 76, en donde el área o perímetro de las partículas de visualización empaquetadas puede utilizarse para determinar la cantidad de partículas de visualización aglutinadas o no aglutinadas en la muestra.

78. El método de cualquiera de las reivindicaciones 19, 23, 25, 30, 31, 56, 60, 62, 68, o 69, en donde se recolecta una pluralidad de imágenes, y dicha pluralidad de imágenes se recolecta por video.

79. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-27, 29-64, o 67-78, en donde el método se realiza en una ubicación de punto de servicio.

80. Un método de ensayo para determinar la aglutinación de partículas de visualización en una mezcla, que comprende: A) generar una mezcla que comprende las partículas de visualización y partículas de aglutinación en condiciones que permitan la aglutinación de las partículas de visualización a través de la interacción con las partículas de aglutinación; B) obtener al menos una imagen de la mezcla; y C) analizar la imagen para obtener una medición de la aglutinación de las partículas de visualización en la mezcla.

81. El método de la reivindicación 80, en donde las partículas de visualización son GRs o microesferas.

82. El método de la reivindicación 80 o 81, en donde las partículas de aglutinación son partículas virales o anticuerpos.

83. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-82, en donde la imagen se obtiene con un detector de imágenes CCD o CMOS.

84. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-83, en donde la imagen se obtiene con un dispositivo óptico.

85. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-84, en donde las partículas de aglutinación se proporcionan en una muestra biológica de un sujeto.

86. El método de la reivindicación 85, en donde la muestra biológica comprende plasma o suero.

87. El método de la reivindicación 85, en donde las partículas de aglutinación son partículas virales.

88. El método de la reivindicación 85, en donde las partículas de aglutinación son anticuerpos.

89. El método de cualquiera de las reivindicaciones 85-88, que comprende además la determinación de la cantidad de partículas virales o anticuerpos en la muestra.

90. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-89, en donde la mezcla comprende además un anticuerpo que se une específicamente a al menos una partícula de aglutinación de dichas partículas de aglutinación e inhibe la interacción de la partícula de aglutinación con una partícula de visualización de dichas partículas de visualización.

91. El método de la reivindicación 90, donde el anticuerpo se proporciona en la mezcla en una muestra biológica de un sujeto.

92. El método de la reivindicación 91, en donde la muestra biológica comprende plasma o suero.

93. El método de la reivindicación 91 o 92, que comprende además la determinación de la cantidad del anticuerpo en la muestra.

94. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-93, en donde la imagen de la mezcla se obtiene dentro de 1 hora de generar la mezcla.

95. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-94, en donde el análisis de la imagen comprende la identificación de una región de interés (ROI) en la imagen.

96. El método de la reivindicación 95, en donde la ROI comprende información de formación de imágenes de la mezcla, comprendiendo dicha mezcla partículas de visualización y partículas de aglutinación.

97. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-96, en donde la medición de la aglutinación de las partículas de visualización en la mezcla es una medida cualitativa de la aglutinación o no aglutinación de las partículas de visualización.

98. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-96, en donde la medición de la aglutinación de las partículas de visualización en la mezcla es una medición cuantitativa de grado de aglutinación de las partículas de visualización.

99. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-98, en donde se obtienen dos o más imágenes de la mezcla.

100. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-99, en donde la aglutinación se evidencia por la formación de agrupamientos que comprenden partículas de visualización y partículas de aglutinación, y la etapa de análisis de la imagen comprende la identificación de agrupamientos en la imagen.

101. El método de la reivindicación 100, que comprende además determinar el tamaño o número de agrupamientos en la imagen.

102. El método de la reivindicación 100, en donde la etapa de identificación de agrupamientos en la imagen comprende la determinación de la distancia entre las partículas de visualización en la imagen.

103. El método de la reivindicación 102, en donde la etapa de la determinación de la distancia entre las partículas de visualización en la imagen comprende la determinación de la distancia de centro a centro entre las partículas de visualización en la imagen.

104. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80 a 103, en donde la etapa de análisis de la imagen comprende la determinación de la distancia de centro a centro entre una primera partícula de visualización y una segunda partícula de visualización de la imagen.

105. El método de la reivindicación 104, que comprende además la determinación de la ubicación de la primera partícula de visualización y la segunda partícula de visualización en la imagen.

106. El método de cualquiera de las reivindicaciones 100-105, en donde la etapa de identificación de los agrupamientos comprende identificar una primera partícula de visualización y una segunda partícula de visualización, en donde la distancia de centro a centro entre la primera partícula de visualización y la segunda partícula de visualización no es mayor a 1.5 veces el diámetro de ya sea la primera o segunda partícula de visualización.

107. El método de cualquiera de las reivindicaciones 100-106, en donde la etapa de identificación de los agrupamientos comprende identificar una primera partícula de visualización y una segunda partícula de visualización, en donde la distancia de centro a centro entre la primera partícula de visualización y la segunda partícula de visualización no es mayor a 12 um.

108. El método de cualquiera de las reivindicaciones 100-105, en donde la etapa de identificación de los agrupamientos comprende la identificación de al menos tres partículas de visualización, en donde cada uno de las tres partículas de visualización se encuentra colocada de tal manera que el centro de la partícula de visualización se encuentra ubicado no más allá de 15 um desde el centro de cada una de las otras dos partículas de visualización.

109. El método de cualquiera de las reivindicaciones 100-108, en donde la etapa de identificación de los agrupamientos comprende la selección de una distancia de valor de corte, en donde las partículas de visualización situadas a una distancia una de la otra que es menor a la distancia de valor de corte se consideran estar asociadas entre si

110. El método de la reivindicación 109, en donde la etapa de selección de una distancia de valor de corte comprende calcular una función de distribución radial para dos o más partículas de visualización en la imagen.

111. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80-110, en donde la etapa de análisis de la imagen comprende la extracción de una característica de una región de la imagen de la mezcla.

112. El método de la reivindicación 111, en donde la etapa de extracción de la característica comprende analizar la textura de la mezcla.

113. El método de la reivindicación 112, en donde la etapa de analizar la textura de la mezcla comprende analizar la imagen con un operador de patrones binarios local.

114. El método de la reivindicación 112 o 113, en donde la etapa de extracción de la característica comprende analizar la intensidad de una señal en uno o más canales de color en una región de la imagen.

115. El método de la reivindicación 113, en donde el paso de analizar la textura de la mezcla comprende introducir información obtenida del operador de patrones binarios locales a un algoritmo que se ha formado previamente con información de patrones binarios locales de una o más imágenes de una mezcla de estados de aglutinación conocidos.

116. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80 a 115, en donde la etapa de análisis de la imagen comprende comparar la información de extracción de características de la imagen de la mezcla con la información de extracción de características de una imagen de una mezcla de control de estados de aglutinación conocidos, comprendiendo dicha mezcla de control partículas de visualización y partículas de aglutinación.

117. El método de cualquiera de las reivindicaciones 80 a 116, el donde las etapas A) - C) se realizan en una hora o menos.