MX2012007424A - Extractos de kibdelos porangium como agentes antibacterianos. - Google Patents

Abstract

La presente invención se relaciona con compuestos novedosos de fórmulas (I) y (II) y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos que son útiles en el tratamiento y/o prevención de infecciones bacterianas en humanos y animales y enfermedades y condiciones asociadas; composiciones que contienen tales compuestos; derivación de tales compuestos por fermentación y aislamiento, síntesis parcial y síntesis total; métodos de inhibición de crecimiento bacteriano; métodos para tratar, evitar o controlar infecciones bacterianas; cultivos biológicamente puros de cepas bacterianas a partir de los cuales se pueden elaborar los compuestos; y procedimientos para preparar composiciones que contienen tales compuestos. De fórmula I y de fórmula II: (Ver Formulas).

Description

EXTRACTOS DE KIBDELOS PORANGIUM COMO AGENTES ANT1BACTERIANOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con compuestos novedosos y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos; composiciones que contienen tales compuestos; derivación de los compuestos por fermentación y aislamiento, síntesis parcial y síntesis total, métodos para inhibir el crecimiento de bacterias; métodos de tratamiento, para evitar o controlar infecciones bacterianas; cultivos biológicamente puros de cepas bacterianas a partir de las cuales se pueden elaborar estos compuestos; y procedimientos para preparar composiciones que contienen los compuestos. Los compuestos novedosos de esta descripción, sus sales farmacéuticamente aceptables y composiciones que comprenden a los compuestos y sales farmacéuticamente aceptables son útiles para tratar y/o para evitar infecciones bacterianas y enfermedades y condiciones asociadas.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Las infecciones causadas por bacterias son una preocupación médica en aumento dado que muchos de los patógenos bacterianos se han vuelto resistentes a diversos antibióticos comunes. Estos microbios incluyen Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Streptococcus pneumoniae, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, Haemophilus influenzae, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Escherichia coli, Stenotrophomonas maltophilia, Clostridium difficile y otras bacterias patógenas. Véase, F. D. Lowy, Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, 1 1 1 (9) J. CLINICAL INVESTIGATION 1265 (2003); George Talbot et al., Bad Bugs Need Drugs: An Update on the Development Pipeline from the Antimicrobial Availability Task Forcé of the Infectious Disease Society of America, 42 CLINICAL INFECTIOUS DISEASES 657 (2006); Brad Spellberg et al., The Epidemic of Antibiotic-Resistant Infections: A Cali to Action for the Medical Community from the Infectious Disease Society of America, 46 CLINICAL INFECTIOUS DISEASES 155 (2007). Pese a la necesidad de compuestos antibacterianos nuevos la eficacia contra los organismos resistentes a medicamentos múltiples y los intensos esfuerzos realizados en este campo, muy pocos compuestos antibióticos han sido aprobados por la FDA.

De este modo, aún permanece la necesidad de potentes agentes antibióticos que inhiban el crecimiento de bacterias que incluyen bacterias que son resistentes a antibióticos conocidos.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se relaciona con compuestos que seleccionan del grupo que consiste de compuestos de fórmula I y fórmula II II y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde: R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y halógeno: y R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y grupos alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.

Estos compuestos son agentes antibióticos potentes con espectros de actividad amplios y se pueden utilizar contra patógenos asociados con infecciones bacterianas humanas y animales.

Los aspectos adicionales de la invención se relacionan con composiciones que comprenden mezclas de los compuestos de la invención y composiciones y formulaciones farmacéuticas que comprenden un compuestos de la invención. Además, los aspectos de la invención se relacionan con métodos para preparar un compuesto de la invención, con métodos para inhibir el crecimiento de bacterias, con métodos para tratar o evitar infección bacteriana en humanos y animales utilizando un compuesto de la invención y con métodos para controlar infección bacteriana en humanos y animales utilizando los compuestos de la invención.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS La figura 1 es el espectro RMN 3C del compuesto A. La figura 2 es el espectro RMN H del compuesto A. La figura 3 es el espectro RMN H del compuesto B.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Una primera modalidad de la presente invención se relaciona con compuestos purificados que se seleccionan de compuestos de fórmula I: I y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde: R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y halógeno; y R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. En todos los aspectos de la modalidad, todas las demás variables son como se describe en lo anterior en la fórmula general.

Una segunda modalidad de la presente invención se relaciona con compuestos purificados que se seleccionan de compuestos de fórmula II: II y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde: R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y halógeno; y R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono. En todos los aspectos de la modalidad, todas las demás variables son como se describe en lo anterior en la fórmula general.

En una tercera modalidad de la presente invención, R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y cloro. En todos los aspectos de la modalidad, todas las demás variables son como se describe en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera y segunda modalidades.

En una cuarta modalidad de la presente invención, R2 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y cloro. En todos los aspectos de esta modalidad todas las demás variables son como se describe en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a tercera modalidades.

En una quinta modalidad de la presente invención, R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, metilo y etilo. En aspectos particulares de esta modalidad, R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y metilo. En todos los aspectos de esta modalidad, todas las demás variables son como se describe en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a la cuarta modalidades.

En una sexta modalidad de la presente invención, el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de: y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.

En un primer aspecto de la sexta modalidad de la presente invención, el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una primera instancia de este primer aspecto, el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una segunda instancia de este primer aspecto, el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En un segundo aspecto de la sexta modalidad de la presente invención, el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En una primera instancia de este segundo aspecto, el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. En segunda instancia de este segundo aspecto, el compuesto purificado selecciona del grupo que consiste de y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. Una séptima modalidad de la presente invención se relaciona con extractos bacterianos purificados o purificados parcialmente que comprenden uno o más compuestos como se describe en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a la sexta modalidades.

Otras modalidades de la presente invención incluyen lo siguiente: (a) Una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos como se describe en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a la sexta modalidades y un portador farmacéuticamente aceptable. (b) Un método para inhibir el crecimiento de bacterias, el método comprende tratar con una cantidad eficaz uno o más compuestos de acuerdo con lo descrito con lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a la sexta modalidades, (c) Un método para tratar o evitar infecciones bacterianas en un sujeto mamífero, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos como se describe en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a la sexta modalidades. (d) El método de (c), en donde la infección bacteriana es causada por Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, , Escheríchia coli, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, u otra bacteria que incluye Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Stenotrophomonas maltophilia, o Clostrídium difficile. (e) Un método para controlar infección bacteriana en un sujeto mamífero, el método comprende administrar al sujeto una cantidad terapéuticamente eficaz de uno o más compuestos como se describen en lo anterior en la fórmula general o en una o más de la primera a la sexta modalidades. (f) El método de (e), en donde la infección bacteriana es causada por Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium, , Escheríchia coli, Streptococcus pneumoniae, Haemophilus influenzae, u otra bacteria que incluye Staphylococcus hemolyticus, Streptococcus pyogenes, Pseudomonas aeruginosa, Acinetobacter calcoaceticus, Stenotrophomonas maltophilia, o Clostridium difficile. (g) Un cultivo biológicamente puro de una cepa bacteriana de la familia Pseudonocardiaceae, género Kibdelosporangium sp. (MA7385) depositada ante la American Type Culture Collection como ATCC, designación de depósito de patente PTA-10354, o un cultivo biológicamente puro derivado del mismo. (h) un procedimiento para preparar la composición como se describe en lo anterior en al sexta modalidad, el procedimiento comprende cultivar y fermentar un cultivo de una cepa bacteriana de la familia Pseudonocardiaceae, género Kibdelosporangium sp. (MA7385) depositado ante la American Type Culture Collection como ATCC, designación de depósito de patente PTA-10354, o un cultivo biológicamente puro derivado del mismo.

La presente invención también incluye un compuesto de la presente invención: (i) para uso en, (ii) para uso como un medicamento para , o (iii) para uso en la preparación de un medicamento para: (a) inhibir el crecimiento bacteriano, o (b) evitar o tratar infección por bacterias. En estos usos, los compuestos de la presente invención opcionalmente se pueden utilizar en combinación con por lo menos un agente terapéutico adicional seleccionado independientemente a partir de agentes clínicamente útiles tales como a partir de beta-lactamas, quinolonas, oxazolidinonas, vancomicina, medicamentos sulfa y daptomicina.

Las modalidades adicionales de la invención incluyen las composiciones farmacéuticas, combinaciones y métodos que se establecen en (a) a (h) en lo anterior y los usos que se establecen en el párrafo precedente, en donde el compuesto de la presente invención utilizado en la presente es un compuesto de uno de las modalidades, aspectos, clases, subclases o características de los compuestos que se describen en lo anterior. En la totalidad de estas modalidades el compuesto opcionalmente se puede utilizar en forma de una sal farmacéuticamente aceptable según sea apropiado.

En las modalidades proporcionadas en lo anterior, deben entenderse que los compuestos de la fórmula I y de la fórmula II se pueden proporcionar en forma de una base libre, un ácido libre o una sal farmacéuticamente aceptable o como un hidrato o un solvato de los compuestos de fórmula I y de fórmula II en la medida en que la base libre, el ácido libre, la sal farmacéuticamente aceptable, hidrato o solvato proporcione un compuesto estable y concuerde con la descripción de las modalidades. De esta manera, cualquier referencia a "un compuesto de fórmula I" y/o "un compuesto de fórmula II", en la presente incluye referencia a su forma de base libre o forma de ácido libre así como a cualquier sal, hidratos o solvatos farmacéuticamente aceptables con la condición de que estas formas representen compuestos estables y concuerden con la descripción de las modalidades. También debe entenderse que cada modalidad se puede combinar con una o más modalidades adicionales en la medida en que la combinación proporciona un compuesto estable y concuerde con la descripción de las modalidades, incluso sino se establece o describe de modo específico. Un compuesto "estable" es un compuesto que se puede preparar y aislar y cuya estructura y propiedades permanecen o se pueden provocar que permanezcan esencialmente sin cambio durante un periodo de tiempo suficiente para permitir el uso del compuesto para propósitos descritos en la presente (por ejemplo administración terapéutica o profiláctica a un sujeto).

Se entiende adicionalmente que las modalidades de composiciones y métodos proporcionados como (a) a (h) en lo anterior se entiende que incluyen todas las modalidades de los compuestos, que incluyen modalidades tales que resulten de las combinaciones de las modalidades.

Como se utiliza en la presente, a menos que se indique en otro sentido, los siguientes términos tienen los significados indicados.

De la manera en que se utiliza en la presente, todos los intervalos son incluyentes y todos los intervalos secundarios se incluyen dentro de los intervalos, aunque no necesariamente se establezca de modo explícito. Además, el término "o", como se utiliza en la presente, indica alternativas que, cuando sea apropiado, se pueden combinar: es decir, el término "o" incluye a cada alternativa enumerada por separado así como sus combinaciones.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "alquilo" se refiere a cualquier grupo alquilo de cadena lineal o ramificada que tenga un número de átomos de carbono en el intervalo especificado. Así, por ejemplo, "alquilo de 1 a 6 átomos de carbono" (o "alquil de 1 a 6 átomos de carbono") se refiere a todos los isómeros de alquilo hexilo y alquilo pentilo así como las formas n-, iso-, sec- y ter-butilo, n- e isopropilo, etilo y metilo. Como otro ejemplo, "alquilo de 1 a 4 átomos de carbono" se refiere a n-, iso-, sec- y ter-butilo, n- e isopropilo, etilo y metilo.

Los términos "halógeno", "átomo de halógeno" y "halo'' se refieren a flúor, cloro, bromo y yodo (de manera alternativa se refieren a fluoro, cloro bromo y yodo).

Como un resultado de la selección de los sustituyentes y patrones de sustituyentes, algunos de los compuestos de la presente invención pueden tener centros asimétricos y pueden presentarse como mezclas de estereoisómeros o como diastereoisómeros individuales o enantiómeros. Todas las formas isoméricas de los compuestos reivindicados, aisladas o en mezclas, están dentro del alcance de la presente invención.

En los compuestos de fórmula I y de formula II, los átomos pueden presentar sus abundancias isotópicas naturales, o uno o más de los átomos pueden estar enriquecidos artificialmente en un isótopo particular que tenga el mismo número atómico pero una masa atómica o un número de masa diferente de la masa atómica o el número de masa que se encuentra de modo predominante en la naturaleza. La presente invención significa que incluye todas las variaciones isotópicas adecuadas de los compuestos de las formas genéricas de la fórmula I y fórmula II. Por ejemplo, las diferentes formas isotópicas de hidrógeno (H) incluye protio ( H) y deuterio (2H). El protio es el isótopo de hidrógeno predominante que se encuentra en la naturaleza. El enriquecimiento para deuterio puede proporcionar ciertas ventajas terapéuticas tales como incremento de la vida media in vivo o reducir los requerimientos de dosificación o puede proporcionar un compuesto útil como un estándar para caracterización de muestras biológicas. Los compuestos enriquecidos isotópicamente dentro de las formas genéricas de la fórmula I y la fórmula II se pueden preparar sin experimentación indebida por técnicas convencionales bien conocidas por aquellos expertos en el ámbito o por procedimientos análogos a los descritos en los ejemplos en la presente utilizando reactivos y/o intermediarios enriquecidos isotópicamente apropiados.

Como lo reconocen aquellos habitualmente expertos, en el ámbito, algunos de los compuestos de la presente invención puede existir como tautómeros. Para los propósitos de la presente invención una referencia a un compuesto de fórmula I y fórmula II es una referencia al compuesto por sí mismo, o a cualquiera de sus tautómeros por sí mismos o a mezclas de dos o más tautómeros.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "composición" se pretende que abarque un producto que comprende los ingredientes especificados así como cualquier producto que resulte, directa o indirectamente de combinar los ingredientes especificados.

Los compuestos de la invención se pueden obtener a partir de muestras biológicas como se describe más adelante, se pueden producir por modificación química de los compuestos obtenidos a partir de muestras biológicas o se pueden sintetizar químicamente. Los compuestos de la invención se pueden proporcionar como compuestos tal y como se producen de modo natural y mezclas de compuestos o se pueden aislar y purificar para producir compuestos "purificados". Los compuestos de la invención se pueden proporcionar como composiciones que contienen compuestos como se encuentran de modo natural y mezclas de compuestos o se pueden aislar y purificar para producir composiciones "purificadas".

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "purificado" se refiere a compuestos o composiciones en un ambiente que carece de uno o más componentes asociados normalmente con los compuestos deseados de fórmula I y de fórmula II en su estado original o natural. La referencia a "purificado" se relaciona con el ambiente del compuesto y no necesariamente requiere purificación. Los compuestos o composiciones purificados se pueden producir, por ejemplo, mediante aislamiento de una cepa productora, a través de medios sintéticos, mediante etapas de purificación o por una combinación de medios. Por ejemplo, una composición que comprende una mezcla de compuestos de fórmula I y de fórmula II se puede denominar como una composición "purificada" si se proporciona en una forma que carece sustancialmente de cualquiera de los componentes de fermentación diferentes a la mezcla reivindicada. De modo similar, una composición aislada de una muestra biológicamente pura de una cepa bacteriana puede ser una composición "purificada" si uno o más de los componentes se separan por un procedimiento de aislamiento o purificación. En las modalidades, el término "purificado" puede referirse a compuestos o composiciones que tienen 50%-99% de pureza como se define como el porcentaje de la masa de los compuestos o composiciones deseados en relación a la masa total presente. En modalidades particulares, los compuestos o composiciones pueden tener 50% de pureza, 60% de pureza, 75% de pureza, 90% de pureza, 95% de pureza, 98% de pureza o 99% de pureza.

De la manera en que se utiliza en la presente, el término "muestra biológicamente pura" de una cepa bacteriana se refiere a una muestra de una cepa bacteriana de interés que se proporciona en una forma no encontrada en la naturaleza; esto es, una muestra biológicamente pura de una cepa bacteriana contiene la cepa bacteriana de interés pero carece sustancialmente de cepas bacterianas, materiales bacterianos y/u otros materiales biológicos.

El término "sujeto" (denominado de manera alternativa en la presente como "paciente") como se utiliza en la presente, se refiere a un animal, preferiblemente un mamífero que ha sido objeto de tratamiento, observación o experimento. El término "mamífero", como se utiliza en la presente se pretende que incluya de manera más preferible en humanos así como en animales homeotérmicos que incluyen animales domesticados tales como gatos, perros, ganado y similares.

Los compuestos de fórmula I y de fórmula II y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, también denominados "ingredientes activos" en la presente se utilizan de manera más efectiva cuando se formulan en composiciones o formulaciones con un portador farmacéuticamente aceptable, de acuerdo con técnicas de elaboración de compuestos farmacéuticos convencionales. El término "composición" como en "composición farmacéutica" se pretende que abarque productos que comprenden uno o más ingredientes activos e ingredientes inertes que constituyen el portador. El término "composición" también se pretende que abarque cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la combinación, formación de complejos, agregación u otras interacciones de cualesquiera dos o más ingredientes activos y/o ingredientes inertes; cualquier producto que resulte, directa o indirectamente, de la disociación de uno o más de los ingredientes activos y/o ingredientes inertes y cualquiera de los productos que resulten de cualquier otro tipo de reacciones de uno o más de los ingredientes activos y/o los ingredientes inertes.

Las composiciones farmacéuticas contienen por lo menos una cantidad terapéuticamente eficaz antibiótica de uno o varios de los ingredientes activos. Una "cantidad terapéuticamente eficaz", como se utiliza en la presente, se refiere a una cantidad de un ingrediente activo suficiente para producir el efecto terapéutico deseado. Por ejemplo, una cantidad antibiótica terapéuticamente eficaz de un compuesto es una cantidad suficiente para demostrar actividad antibiótica y/o para inhibir el crecimiento de una o más cepas bacterianas. Las cantidades antibacterianas terapéuticamente eficaces de uno o varios de los ingredientes activos en composiciones farmacéuticas se pueden proporcionar en un intervalo de aproximadamente 10 mg de uno o varios ingredientes activos por kg de peso corporal del paciente a aproximadamente 1000 mg de uno o varios ingredientes activos por kg de peso corporal del paciente.

Mediante el término "farmacéuticamente aceptable" se quiere indicar que los ingredientes de la composición farmacéutica deben ser compatibles entre sí y no perjudiciales para el receptor de los mismos.

Los compuestos de la presente invención se pueden administrar en la forma de sales farmacéuticamente aceptables. El término "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que posee la eficacia del compuesto original y que no es indeseable biológicamente o en otro sentido (por ejemplo no es tóxica no es perjudicial en otro sentido al receptor de la misma). Las sales farmacéuticamente aceptables de los compuestos de fórmula I y de fórmula II incluyen, por ejemplo, sales de bases inorgánicas tales como sales de metal alcalino (por ejemplo sales de sodio y de potasio), sales de amonio y sales de bases orgánicas. Las sales de bases orgánicas adecuadas incluyen sales de amina tales como sales de tetraalquilamonio (por ejemplo tetrabutilamonio y trimetilcetilamonio), sales de trialquilamina (por ejemplo trietilamina), sales de dialquilamina (diciclohexilamina), bencilaminas opcionalmente sustituidas (por ejemplo fenilbencilamina y para-bromobencilamina), etanolamina, dietanolamina, N-metilglucosamina, N-metilpiperidina, piridina, piridinas sustituidas (por ejemplo colidina, lutidina y 4-dimetilaminopiridina) y sales de tri(hidroximetil)metilamina; y sales de aminoácidos (por ejemplo sales de lisina o de arginina).

El término "administración" y variantes del mismo (por ejemplo "administrar" un compuesto) con referencia a un compuesto de la invención significa proporcionar el compuesto o un precursor del compuesto al individuo en necesidad de tratamiento. Cuando un compuesto de la invención o un precursor del mismo se proporciona en combinación con uno o más agentes activos adicionales (por ejemplo, agentes útiles para tratar infecciones bacterianas), la "administración" y sus variantes se deben entender, cada una, que incluyen el suministro concurrente y secuencial del compuesto, sal, hidrato o solvato y otros agentes.

El término "cantidad eficaz", como se utiliza en la presente, significa una cantidad de compuesto activo o agente farmacéutico que induce la respuesta biológica o medicinal en un tejido, sistema, animal o humano que está analizado por un investigador, veterinario, doctor en medicina u otro miembro de un equipo de salud. En una modalidad, la cantidad eficaz es una "cantidad terapéuticamente eficaz" para el alivio de los síntomas de la enfermedad o condición que es tratada. En otra modalidad, la "cantidad eficaz es una "cantidad profilácticamente eficaz" para la profilaxis del los síntomas de la enfermedad o condición cuya probabilidad representación o gravedad está siendo reducida. El término también incluye en la presente la cantidad de compuesto activo suficiente pata inhibir el crecimiento bacteriano y de esta manera inducir la respuesta que se busca (es decir, una "cantidad eficaz de inhibición"). Cuando el compuesto activo (es decir, el ingrediente activo) se administra como la sal, las referencias a la cantidad del ingrediente activo van a ser la forma de ácido libre o de base libre del compuesto.

Las composiciones farmacéuticas se pueden preparar al mezclar de manera intima uno o más ingredientes activos con un portador y los componentes del portador se pueden seleccionar para proporcionar el medio deseado. Por ejemplo, una crema o loción formulada se puede proporcionar al mezclar uno o varios ingredientes activos en componentes de una crema o loción seleccionados apropiadamente para proporcionar uno o varios ingredientes activos en una concentración de aproximadamente 0.01 % y aproximadamente 99%.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con los aspectos de la invención se pueden formular como composiciones adecuadas para administración oral, tópica, parenteral (que incluye intraperitoneal (I.P.), subcutánea, intramuscular e intravenosa (I.V.)), nasal y administración por supositorios, o para administración por insuflación.

Para administración oral, las composiciones farmacéuticas de las modalidades se pueden formular como composiciones líquidas o sólidas. Las composiciones líquidas se pueden preparar al combinar uno o varios de los ingredientes activos con uno o varios portadores líquidos farmacéuticamente aceptables tales como agua, glicoles, aceites, alcoholes y similares. Para composiciones sólidas, uno o varios de los ingredientes activos se pueden combinar con uno o varios portadores sólidos farmacéuticamente aceptables tales como almidones, azúcares, caolín, etilcelulosa, carbonato de calcio, carbonato de sodio, fosfato de calcio, talco y lactosa. Uno o varios de estos portadores sólidos opcionalmente se pueden combinar como un lubricante tal como estearato de calcio y/o con un agente aglutinante-desintegrante o similar. Debido a que las tabletas y cápsulas se administran fácilmente, estas formas de dosificación pueden representar la forma de dosificación oral más ventajosa para algunas situaciones. Las composiciones en forma de dosificación unitaria también constituyen un aspecto de la invención.

Para administración por inyección, las composiciones farmacéuticas de las modalidades se pueden formular como suspensiones soluciones o emulsiones. Los portadores farmacéuticamente aceptables para composiciones inyectables pueden ser vehículos oleosos o vehículos acuosos tales como cloruro de sodio 0.85% en agua o dextrosa 5% en agua. Además, las composiciones inyectables pueden incluir agentes de formulación tales como agentes amortiguadores, agentes solubilizantes, agentes que mejoren la suspensión y/o agentes dispersantes. Los agentes amortiguadores así como los aditivos tales como solución salina o glucosa se pueden agregar para volver a las soluciones isotónicas. Para administración intravenosa por goteo, uno o varios de los ingredientes activos se pueden solubilizar en alcohol/propilenglicol o polietilenglicol. Las composiciones inyectables se pueden proporcionar como composiciones líquidas en forma de dosificación unitaria en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples, que opcionalmente contienen un conservador agregado. De modo alternativo, uno o varios de los ingredientes activos se pueden proporcionar en forma de polvo y se pueden reconstituir en un vehículo líquido adecuado antes de su administración.

El término "forma de dosificación unitaria", como se utiliza en la especificación y en las reivindicaciones se refiere a unidades físicamente separadas, cada una con una cantidad predeterminada de uno o varios de los ingredientes activos, calculados para producir un efecto terapéutico deseado, en asociación con un portador adecuado. Los ejemplos de las formas de dosificación unitarias incluyen tabletas, cápsulas, pildoras, paquetes de polvo, obleas, unidades medidas en ampolletas o en recipientes de dosis múltiples y similares.

Los compuestos descritos en la presente se pueden preparar por fermentación de una cepa bacteriana de la familia Pseudonocardiaceae, género Kibdelosporangium sp. (MA7385), o cepas bacterianas derivadas de las mismas y cultivos biológicamente puros de cepas bacterianas de los mismos, y extracción por solvente. En particular, los compuestos de la invención se pueden preparar por fermentación de Kibdelosporangium sp. (MA7385) o de su progenia, descendencia o cepas bacterianas mutantes de Kibdelosporangium sp. (MA7385). En modalidades, los compuestos obtenidos por fermentación de cepas bacterianas y extracción de solvente se puede modificar de manera sintética adicionalmente para proporcionar compuestos adicionales de la invención. Adicionalmente, los compuestos de la invención se pueden preparar de modo sintético.

Kibdelosporangium sp. (MA7385) ha sido identificado preliminarmente como una cepa de Streptomyces, pero se ha confirmado que es una cepa de Kibdelosporangium la cual ha sido aislada de una muestra de solo recolectada en el bosque de la República Centro Africana. Se ha depositado Kibdelosporangium sp. (MA7385) bajo el tratado de Budapest en la colección de cultivo de la American Type Culture Collection en 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 201 10-2209 el 23 de septiembre del 2009 y se le asignó la designación de depósito de patente ATCC PTA-10354.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Procedimiento de Fermentación La fermentación de Kibdelosporangium sp. (MA7385) se llevó a cabo al inocular varios tapones de agar con miscelios en un matraz de caldos de siembra (50 mi de medio en 205 mi de matraz con deflectores). La formulación del caldo de siembra es como sigue (gramos por litro, a menos que se especifique en otro sentido). almidón soluble 20.0 dextrosa 10.0 NZ amina tipo E 5.0 extracto de res 3.0 peptona 5.0 extracto de levadura 5.0 CaC03 1.0 H2O destilada hasta 1 Se ajusta el pH a 7.0 con NaOH antes de la adición de CaC03. Los matraces se incuban a 28°C, 80% de humedad relativa y se agitan en un agitador giratorio a 220 rpm.

Cuando los matraces de la etapa de siembra se han sometido a crecimiento durante 3 días, se utiliza una alícuota de 1 mi para inocular cada matraz de medio de producción FR23 (50 mi de medio en un matraz sin deflector 250). La formulación consiste (en gramos por litro) de: glucosa 5.0 almidón soluble 30.0 melasas de caña 20.0 farmamedia 20.0 H20 destilada hasta 1 Se ajusta el pH 7.0 con NaOH antes de la esterilización. Los matraces se incuban a 28°C, 80% de humedad relativa en un agitador giratorio a 220 rpm durante 7 días.

Procedimiento de aislamiento Se extrae 12 I de caldo de fermentación con 12 I de acetona mediante agitación en un agitador reciprocante durante más de 1 hora. El contenido micelial se filtra a través de Celite y el filtrado se concentra bajo presión reducida para eliminar la mayor parte de la acetona. Se extraen 12 I del extracto acuoso tres veces con 12 I cada una de metiletilcetona (MEK, por sus siglas en inglés). Los extractos de MEK se combinan y concentran bajo presión reducida a sequedad lo que proporciona una goma, la cual se disuelve en un volumen pequeño de metanol (-20 mi) y se somete a cromatografía en una columna SEPHADEX LH 20 de 450 ce. La columna se eluye con metanol y las fracciones que contienen los compuestos se acumulan y concentran bajo presión reducida a sequedad. Un tercio de la porción de la fracción LH20 se disuelve en un volumen mínimo de metanol y se diluye con cloruro de metileno en una relación de 90 partes de cloruro de metileno a 10 partes de metanol. Esta solución después se carga en un cartucho de gel de sílice (10 g) de 35 ce y se lava con 3-4 volúmenes de columna con 10, 20 y 30% de metanol en cloruro de metileno. Los compuestos de interés se eluyen en la fracción de metanol 10-20%. Este procedimiento se repite dos veces con el resto del material y las fracciones acumuladas de las tres columnas se concentran bajo presión reducida para proporcionar una goma café. El material enriquecido del gel de sílice se disuelve en 10 mi de metanol. Un quinto (2 mi) se somete a cromatografía sobre PRP-1 en fase inversa de 2.54 cm (una pulgada) (columna HPLC estable a pH Hamilton de 250 x 21.5 mm) utilizando un gradiente de elusion con metanol: amortiguador de fosfato de sodio 0.25 M (pH 7) 60:40 a 80:20 en 40 minutos a un caudal de 10 ml/min. La cromatografía se repite con el resto del material cuatro veces. Las fracciones que eluyen a 35-38, 39-40 y 41-44 de cada una de las cinco corridas cromatográficas se acumulan. Estas fracciones se trituran con 4-6 mi de metanol, tres veces. La solución contiene al compuesto, dejando detrás la mayor parte del amortiguador como un sólido. La solución de metanol de las fracciones 35-38 y 41-44 se concentra y se vuelve a cromatografiar en una columna ZORBAX RX C8 (250 x 21.5 mm) y se eluye con un gradiente lineal durante 50 minutos de metanol acuoso 50-100%. Los componentes principales de cada cromatografía se liofilizan para proporcionar las siguientes composiciones como polvos incoloros.

Composición A Compuesto A-l de fórmula I A-l 3-0-acetil-1 ,5-anhidro-4-0-carbamoil-6-desoxi-1-[(4Z)-4-[(5-{[2,6-didesoxi-3 -C-(1-{[(3,4-dicloro-5-metil-1 H-pirrol-2- il)carbonil]amino}etil)hexopiranosil]oxi}-2-metil-8-metiliden-1 , 2,4a, 5,6, 7,8 ,8a-octahidronaftalen-1-il)(hidroxi)metiliden]-5-oxo-6-(propan-2-il)-5,6-dihidro-4H-1 ,3-oxazin-2-il]-2-0-metilhexitol.

Compuesto A-ll de la fórmula II A-ll 5-[(Z)-[1-(3-0-acet'il-4-0-carbamoil-6-desoxi-2-0-metilhexopiranosil)-2,4-dioxo-5-(propan-2-il)pirrolidin-3-iliden](hidroxi)metil]-6-metil-4-metiliden-1, 2, 3,4,4a, 5,6, 8a-octahidronaftalen-1-il 2,6-didesoxi-3-C-(1-{[(3,4-dicloro-5-metil-1 H-pirrol-2-il)carbonil]amino}etil)hexopiranosido.

Las propiedades físicas de la composición A se determinan como sigue: La figura 1 es el espectro de resonancia magnética nuclear (RMN) de carbono 13 (13C) de la composición A; se observan picos característicos como se resume en el cuadro 1. Los espectros de RMN 13C se recolectan en un espectrómetro VARIAN INOVA 500 o 600 MHz que opera ya sea a 125 o 150 MHz para núcleos de 13C. Los desplazamientos químicos se basan con referencia a CD3OD residual (8C 49.0 ppm). Los datos se recolectan de manera uniforme a 25°C en tubos de RMN de 3 mm. Se utiliza una sonda de gradiente Z indirecto NORLAC de 3 mm H{CN} para todas las muestras. Las secuencias de pulso estándar VARIAN se utilizan para todas las recolecciones de datos.

La figura 2 es el espectro RMN H de la composición A; se observan picos característicos como se resume en el cuadro 1. Los espectros de RMN 1H se recolectan ya sea en un espectrómetro VARIAN INOVA 500 o 600 MHz que opera ya sea a 500 o 600 MHz para núcleos de 1H. Los desplazamientos químicos se basan con referencia a CHD2OD residual (6H 3.30 ppm). Los datos se recolectan de manera uniforme a 25°C en tubos de RMN de 3 mm. Se utiliza una sonda de gradiente Z indirecto de H{CN} de 3 mm NORLAC para todas las muestras. Las secuencias de pulso estándar VARIAN se utilizan para todas las recolecciones de datos.

El espectro de absorción ultravioleta (UV) de la composición A tomado en MeOH muestra bandas de absorción características de (log e) = 248 nm (sh) y 276 nm (4.42). El espectro UV se registra en un espectrómetro PERKIN ELMER LAMBDA 35 UV/Vis.

El espectro de absorción infrarrojo (IR) de la composición A, tomado utilizando ZnSe muestra bandas se absorción características de vmax = 3417, 2932, 1732, 1611 , 1537, 1454, 1376, 1313, 1233, 1159, 1079, 1004, 893, 830, 789, 745 cm"1. Los datos espectrales IR se obtienen utilizando un espectrómetro PERKIN ELMER SPECTRUM ONE al transferir una alícuota pequeña de la composición A disuelta en metanol sobre una placa de ZnSe.

El espectro de masa de alta resolución de la composición A produce HRESIFTMS (miz): observado para M+H = 939.3562, calculado para C44H60CI2N4Oi4+H = 939.3561. Los espectros de masa de alta resolución se obtienen en un espectrómetro THERMO FINNIGAN LTQ-FT, utilizando ionización de electroaspersión y una fuente FINNIGAN ION MAX con fuente de fragmentación sobre e igual a 18 voltios.

Composición B Compuesto B-l de fórmula I B-l 3-O-acetil-1 ,5-anhidro-4-O-carbamoil-6-desoxi-1-[(4Z)-4-[(5-{[2,6-didesoxi-3-C-(1-{[(3,4-dicloro-1 H-pirrol-2-il)carbonil]amino}etil)-hexopiranosil]oxi}-2-metil-8-metiliden-1 , 2,4a, 5, 6,7,8, 8a-octahidronaftalen-1 -il)(h¡droxi)metiliden]-5-oxo-6-(propan-2-il)-5,6-dihidro-4H-1 ,3-oxazin-2-il]-2-O-metilhexitol.

Compuesto B-ll de fórmula II 5-[(Z)-[1-(3-0-acet¡l-4-0-carbamo¡l-6-desoxi-2-0-metilhexopiranosN)-2,4-dioxo-5-(propan-2-N)p¡rrol¡din-3-¡l¡den](h¡drox¡)met¡l]-6-metil-4-metil¡den-1 ,2,3,4,4a,5,6,8a-octahidronaftalen-1-il 2,6-didesoxi-3-C-(1 -{[(3,4-dicloro-1 H-pirrol-2-¡l)carbonil]amino}etil)hexop¡ranosido.

La figura 3 es el espectro de RMN 1H de la composición B; se observan picos característicos como se resume en el cuadro 1. Los espectros de RMN 1H se recolectan ya sea en un espectrómetro VARIAN INOVA 500 o 600 MHz que opera ya sea a 500 o 600 MHz para núcleos de 1H. Los desplazamientos químicos se refieren a CHD2OD residual (6H 3.30 ppm). Los datos se recolectan de manera uniforme a 25°C en tubos de RMN de 3 mm. Se utiliza una sonda de gradiente Z indirecta de H{CN} de 3 mm NORLAC para todas las muestras. Las secuencias de pulso estándar VARIAN se utilizan para todas la recolección de datos.

El espectro de masa de alta resolución de la composición B produce HRESIFTMS (m/z): observado para M+H = 925.3410, calculado para C43H58Cli2N4014+H = 925.3405. Los espectros de masa de alta resolución se obtienen en un espectrómetro THERMO FINNIGAN LTQ-FT, utilizando ionización de electroaspersión y una fuente FINNIGAN ION MAX con fuente de fragmentación sobre e igual a 18 voltios.

CUADRO 1 Datos espectrales de RMN 3C y 1H EJEMPLO 2 Se prueba la composición A para actividad antibacteriana contra cepas Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escheríchia coli, Streptococcus pneumaniae y Haemophilus influenzae y se prueban las composiciones A y B contra un control de Candida albicans. Se prueba la composición B para actividad antibacteriana contra cepas de Staphylococcus aureus.

Medios y preparación de medio Se utilizaron los siguientes materiales en las pruebas de las composiciones A y B: placas de agar MIC SABOURAUD DEXTROSA (BBL); esferas MICROBANK (KRAMER SCIENTIFIC); inoculador de placa 2000 MICROTITER; placas de 96 pozos MICROTITER, tapas, bandejas de inóculo (DYNEX LABORATORIES); y pipeteador de canales múltiples de 8 canales 8- CHANNEL FINN MULTICHANEL, de volumen de 0.5-10 µ?. Todas las placas de agar recibidas se prepararon del fabricante.

Se utilizaron los siguientes medios en la prueba de las composiciones A y B: caldo MUELLER HINTON ajustado en cationes (MH; BBL); sangre de caballo lisada 50% (LHB; BBL) (almacenada congelada); RPMI 1640 (BIO WHITTAKER); suero humano (PEL-FREEZ), RPMI 1640 (BIO WHITTAKER); medio de prueba de Haemophilus (HTM, REMEL); caldo soya tripticasa (TSB, 5 ml/tubo; BBL); cloruro de sodio 0.9% (solución salina; BAXTER); soya tripticasa + 5% de placas de agar sangre de borrego (TSA; BBL); placas de agar chocolate (BBL); leche desnatada 2X (REMEL) y caldo soya tripticasa 2X (TSB, BBL) + 15% glicerol/suero de caballo 50%. Los medios se prepararon como sigue: Caldo de MUELLER HINTON ajustado en cationes: Se prepara de acuerdo con las instrucciones del fabricante (22 g disuelto en 1000 mi de agua; se somete a autoclave 22 minutos). Se almacena refrigerado. Se esteriliza por filtración antes de su uso utilizando un filtro de acetato de celulosa CORNING 0.45 Tm.

Sangre de caballo lisada 50%: La sangre de caballo desfibrinada se diluye 1 :1 con agua destilada estéril; se congela, se recalienta y se vuelve a congelar (por lo menos 7 veces) y posteriormente se centrifuga. Se almacena congelada a -20°C.

Caldo de MUELLER HINTON ajustado en cationes + 2.5% de sangre de caballo lisada: Se agregan asépticamente 5 mi de sangre de caballo lisada 50% a 100 mi de caldo de MUELLER HINTON ajustado en cationes. Se esteriliza por filtración antes de su uso mediante el uso de un filtro de acetato de celulosa CORNING 0.45 Tm.

Caldo de MUELLER HINTON ajustado en cationes + suero humano 50%: Se agregan asépticamente 50 mi de suero humano a 50 mi de caldo de MUELLER HINTON ajustado en cationes 2X. Se esteriliza por filtración antes de uso con un filtro de acetato de celulosa CORNING 0.45 Tm.

Medio de prueba de hemofilos: Se prepara recibido del fabricante. Se esteriliza por filtración antes de su utilización mediante el uso de un filtro de acetato de celulosa CORNING 0.45 Tm.

Cloruro de sodio 0.9%: Se recibe preparado del fabricante.

Leche desnatada 2X: Se recibe preparada del fabricante.

Selección y mantenimiento de aislados Las cepas utilizadas son aisladas de Merck Culture Collection; estos cultivos se mantienen como concentrados congelados a -80°C en: a) esferas MICROBANK o b) caldo soya TRYPTICASE 2X + glicerol 15%/suero de caballo 50%. En particular, las cepas son las siguientes: La cepa de Bacillus subtilis utilizada se obtiene de Merck Culture Collection y se identifica como MB964. El cultivo se mantiene congelado a -80°C en esferas MICROBANK.

Las cepas de Staphylococcus aureus utilizadas se obtienen de Merck Culture Collection y se identifican como MB2865 y MB5957. El cultivo se mantiene congelado a -80°C en esferas MICROBANK.

La cepa de Enterococcus faecalis utilizada se obtiene de Merck Culture Collection y se identifica como CL8516. El cultivo se mantiene congelado a -80°C en esferas MICROBANK.

La cepa Escherichia coli envA1 tolC utilizada es una cepa permeable a la pared celular obtenida de Merck Culture Collection y se identifica como MB5746. El cultivo se mantiene congelado a -80°C en esferas MICROBANK.

La cepa de Streptococcus pneumoniae utilizada se obtiene de Merck Culture Collection y se identifica como CL2883. El cultivo se mantiene congelado a -80°C en caldo soya tripticasa 2X + glicerol 15%/suero de caballo 50%.

La cepa de Haemophilus influenzae usada se obtiene de Merck Culture Collection y se identifica como MB4572. El cultivo se mantiene congelado a -80°C en caldo soya tripticasa 2X + glicerol 15%/suero de caballo 50%. La cepa de Haemophilus influenzae es un patógeno de ratón utilizado para pruebas in vivo en Merck.

La cepa de control de Candida albicans utilizada se obtiene de Merck Culture Collection y se identifica como MY1055. El cultivo se mantiene conglado a -80°C en esferas MICROBANK.

Preparación del inóculo Se subcultivan aislados seleccionados ya sea en soya tripticasa + 5% de placas de agar sangre de borrego (Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Streptococcus pneumoniae), placas de agar chocolate {Haemophilus influenzae) o agar dextrosa Sabouraud {Candida) y se incuba a 35°C. Streptococcus pneumoniae y Haemophilus se incuban en C02 5%; todos los demás aislados se inoculan en aire ambiente. Los aislados se subcultivan dos veces antes del análisis.

Las colonias se seleccionan de placas y se utilizan para preparar un inóculo que tiene una densidad equivalente a 0.5 estándar McFarland en caldo soya tripticasa; un inóculo con una densidad equivalente a un estándar McFarland 1.0 se prepara para Streptococcus pneumoniae. La densidad del inóculo para todos los cultivos es ~ 108 ufc/ml en TSB. este inóculo de TSB se diluye 1 :; 10 en solución salina estéril (4 mi de inóculo + 36 mi de solución salina; equivalente a ~107 ufc/ml) y se mantiene en hielo hasta que se utiliza para inocular placas de microtitulación.

Llenado de la placa Soluciones concentradas y diluciones del medicamento Se preparan placas de prueba para cada cepa, como sigue. A cada pozo de una placa de 96 pozos (con columnas 1-12 e hileras A-H) se agregan 100 µ? del medio de prueba apropiado {Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli - placas de caldo MUELLER-HINTON ajustadas en cationes; Streptococcus pneumoniae -caldo MUELLER HINTON ajustado en cationes + 5% de placas de sangre de caballo lisada; Haemophilus influenzae - placas de medio de prueba para hemofilus; Candida albicans - RPMI 1640) utilizando el surtidor Thermal-LabSystems MULTIDROP R. Se utiliza la fórmula del Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (anteriormente el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS)) para calcular la cantidad de dilución necesaria para una solución estándar.

Preparación de composición Las composiciones de prueba se preparan en una base en peso. Las composiciones de prueba se preparan a 2 mg/ml en DMSO 100%, después se diluyen a 1 mg/ml en una dilución 1 : 1 de DMSO/2x CAMHB (concentración final = 50% de DMSO/50% de CAMHB). Las composiciones de prueba se diluyen de manera seriada 1.1 en 50% de DMSO/50% de CAMHB eb placas de 96 pozos de polipropileno de pozo profundo BD Biosciences (concentración inicial, 1 mg /mi) como sigue: Al primer pozo de cada hilera, se agregan 100 µ? de las soluciones concentradas del compuesto (1 mg/ml) con pipeta de copia matriz multicanal. Los compuestos se diluyen de manera seriada de modo doble con un equipo de dilución Perkin Elmer CETUS PRO/PETTEMR o TECANMR (100 µ? se toman del primer pozo de cada hilera y se colocan en el segundo pozo y se mezclan con 100 µ? del segundo pozo de cada hilera tomado y se colocan en el tercer pozo y se mezclan, etc.) a través de la placa hasta la columna 11 (la columna 12 es el pozo de control de crecimiento sin medicamento) y al final los 100 µ? se desechan, lo que proporcionan concentraciones de compuesto de 64-0.00004 µ9/G??. Se prepara penicilina G y claritromicina, los compuestos control, como soluciones concentradas de 10 mg/ml en DMSO y se preparan en placa de microtitulación como se establece en lo anterior para los compuestos de prueba. Se incluye ciprofloxacina como un control para el análisis de unión de proteína de suero.

Análisis de dilución de microcaldo Utilizando un equipo FINN AUTOMATED MULTICHANNEL PIPETTE (0.5-10 µ? de volumne), se agregan 6.4 µ? de las soluciones de prueba a los pozos de las placas de microtitulación rellenadas (concentración de antimicrobiano en el primer pozo = 64 µg/ml; concentración de DMSO = 3.2%). Se agregan los antimicrobianos de esta manera para mantener constante la cantidad de DMSO en cada pozo (para mantener los compuestos solubilizados y para tomar en consideración la posibilidad de destrucción inespecífica por DMSO). La última hilera contiene un control de crecimiento de DMSO 3.2%.

Inoculación de la placa y determinación de actividad Todos los pozos de las placas de microtitulación se inocularon con cultivo (diluido en solución salina) utilizando el sistema MIC 2000, un dispositivo de inoculación de placa automatizado que suministra un inoculo de 1.5 TL por pozo. Las placas se incuban a 35°C a temperatura ambiente. También se incuba una placa uninoculada como una verificación de esterilidad. Los resultados se registran después de 18-24 horas de incubación. Las placas se leen hasta carencia de crecimiento.

La concentración inhibidora mínima (MIC-100) para todos los compuestos se determinó que es la concentración más baja del compuesto en el cual no es visible el crecimiento en comparación con crecimiento control sin medicamento, determinado después de un período de incubación de 22 a 24 horas. Las MIC se obtienen de acuerdo con las líneas de guía CLSI.

La composición A demuestra actividad antibacteriana contra diversas cepas de Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli y Streptococcus pneumoniae y Haemophilus influenzae. La composición B demuestra actividad antibacteriana contra diversas cepas de Staphylococcus aureus. Los valores de la concentración inhibidora mínima (MIC) los cuales varían de 0.1 a 64 µg/ml se observan para las composiciones A y B, como sigue.

CUADRO 2 Actividad antibacteriana Las composiciones a y B también demuestran actividad antibacteriana contra diversas especies que son resistentes a muchos antiobióticos conocidos tales como Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA), Enterococcus sp. resistente a vancomicina (VRE), Enterococcus faecium resistente a multimedicamentos, Staphylococcus aureus resistente a macrólidos y Staphylococcus epidermidis, y Staphylococcus aureus resistente a linezolida y Enterococcus faecium.

EJEMPLO 3 Se prueba la composición A para determinar actividad antibacteriana contra cepas de Clostrídium difficile. Las diluciones de medicamento y las placas de agar suplementadas con medicamento se preparan manualmente.

Medios y preparación de medios El crecimiento y los medios de prueba fueron los recomendados por el Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) para pruebas de crecimiento y susceptibilidad de anaerobios. Véase Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Susceptibility testing of Anaerobio Bacteria; Approved Standard-Seventh Edition. documento CLSI M11 -A7 [ISBN 1-56238-626-3]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2007.

El medio utilizado para el análisis MIC de dilución de agar es Agar Brucella (Becton Dickinson, Sparks, MD # 211086, Lote # 9020009) suplementado con hemina (Sigma #H9039-1G, lote #039K1 121), vitamina Ki (Sigma, lote #106K 523) y sangre de borrego lisada 5% (Cleveland Scientific, lote 41 1 13-6) (1 ). Este medio se denomina como agar Brucella suplementado (SBA).

El medio se prepara como sigue, se pesa agar Brucella y se agrega agua hasta el volumen final menos el volumen de la hemina, vitamina K y sangre de borrego lisada. El agar se disuelve por ebullición. Se agregan al agar 5 µg/ml de hemina y 1 µg/ml de vitamina K y se esteriliza en autoclave durante 23 minutos a 121°C. Se permite que el agar se enfríe a 50°C y se suministran 18.5 mi en tubos de vidrio estériles. Inmediatamente antes de verter las placas 1 mi de sangre de borrego lisada y 0.5 mi de la dilución de medicamento apropiado se agregan al tubo. Los contenidos del tubo se mezclan ligeramente por inversión del tubo y el agar suplementado con medicamento se vierte en una caja de petri. Se permite que las placas suplementadas con medicamento reposen sobre el gabinete hasta que solidifican y después se transfieren a una cámara anaérobica Bactron II (Sheldon Manufacturing Inc., Cornelius, OR; atmósfera de hidrógeno 5%, dióxido de carbono 5%, nitrógeno 90%) y se permite que pre-reduzca durante 2 horas antes de la inoculación.

Selección y mantenimiento de aislados Las cepas utilizadas son aislados clínicos o cepas de referencia adquirida de American type Culture Collection (ATCC). En particular, las cepas son Clostrídium difficile 4381 (ATCC 700057) y Clostrídium difficile 4822 (ATCC 43596). El cultivo se mantiene congelado a -80°C en caldo Brucella que contiene 5 g/ml de hemina, 1 µg/ml de vitamina K, 5% de sangre de caballo lisada y 20% de glicerol.

Preparación de inoculo Los aislados se subcultivan en placas de agar Brucella suplementadas (SBA) (Remel, Lenexa, Kansas; Cat. No. R01255) en una cámara anaérobica Bactron II (Sheldon Manufacturing, Cornelius, OR) y se incuban durante 48 h a 35-36°C en un incubador Bactron II antes de su uso en el análisis MIC.

Llenado de Placa Soluciones y diluciones concentradas de medicamento Se preparan placas de prueba para cada cepa como sigue. A cada pozo de una placa de 96 pozos (con columna 1-12 e hileras A-H), se agregan 100 µ? del medio de prueba apropiado utilizando el surtidor Thermal-LabSystems MULTIDROPMR. La fórmula de Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (anteriormente National Committee for Clinical Laboratory Standars (NCCLS)) se utiliza para calcular la cantidad de dilución necesaria para una solución estándar.

Preparación de composición La composición de prueba se preparó en una base en peso. La composición A se disolvió en DMSO y se utilizó para la prueba una concentración concentrada de 2560 µg/ml. Se prepararon metronidazol y vancomicina (ambos de Sigma, ST.Louis, MO), los compuestos control, a una concentración concentrada de 1280 g/ml en DMSO 100%.

Inoculación de Placa y Determinación de Actividad El análisis se llevó a cabo por el método de dilución de agar de referencia descrito por CLSI. Véase Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobio Bacteria; Approved Standard-Seventh Edition. documento CLSI M11-A7 [ISBN 1 -56238-626-3].

Los aislados de prueba y de referencia se subcultivaron en placas de agar SBA preparadas comercialmente (Cat. No. R01255; Remel, Lenexa, Kansas) en una cámara anaérobica Bactron II y se incubaron durante 48 horas a 35°C (en la cámara anaérobica Bactron II).

Los inóculos para el análisis MIC se prepararon dentro de la cámara anaérobica Bactron II como sigue. Se cosecharon colonias con un hisopo y se preparó una suspensión de células en caldo Brucella pre-reducido para igualar la turbidez de un estándar McFarland 0.5. Cada suspensión celular se carga en un pozo de un dispositivo de replicacion de inoculo (Melrose machine Shop, Woodlyn, PA) el cual suministra aproximadamente 1 a 2 µ? por puntos sobre la superficie de agar para un inoculo de aproximadamente 104 a 105 unidades formadoras de colonia por punto. La carga del dispositivo replicador de inoculo y la inoculación de las placas se llevó a cabo dentro de la cámara anaérobica. Se permitió que las placas de agar inoculado reposaran con el agar orientado hacia arriba hasta que los inóculos se absorbieron en el agar. Las placas de agar después se invirtieron e incubaron a 35°C durante 48 horas en el ambiente anaérobico de Bactron II (hidrógeno 5%, dióxido de carbono 5%, nitrógeno 90%). El MIC se lee por las líneas de guía CLSI.

Después de la inoculación, las placas suplementadas con medicamento se incubaron a 35°C durante 48 h en el ambiente anaérobico (hidrógeno 5%, dióxido de carbono 5%, nitrógeno 90%) de Bactron II. Las placas se leen hasta crecimiento nulo.

La concentración inhibidora mínima (MIC-100) para todos los compuestos se determinó como la concentración más baja de compuesto la cual no había crecimiento visible en comparación con el crecimiento control sin medicamento, determinado después de un período de inoculación de 22 a 24 horas. Se obtuvieron los MIC de acuerdo con las líneas de guía CLSI.

Procedimiento de Análisis MIC La composición A demostró actividad antibacteriana contra diversas cepas de Clostridium difficile. Los valores MIC de 0.12 g/ml se observaron para la composición A como se muestra en el cuadro 3. Para las combinaciones de organismo-medicamento, existen criterios de control de calidad de CLSI, los valores MIC derivados dentro de los intervalos de control de calidad publicados.

CUADRO 3 Actividad antibacteriana Se apreciará que diversos rasgos y funciones o alternativas de los mismos descritos en lo anterior u otros se pueden combinar de modo deseable en muchos otros sistemas o aplicaciones diferentes. Además diversas alternativas, modificaciones, variaciones o mejoras actualmente no previstas o no anticipadas respecto a la materia objeto descrita en lo anterior y reivindicada en este documento posteriormente se puede realizar por aquellos expertos en el ámbito y también se considera que están abarcadas por las siguientes reivindicaciones.

Claims (28)

1. NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES II y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos, en donde: R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y halógeno: y R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.
2. 2.- El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado porque el compuesto purificado es de fórmula I: I 0 una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y halógeno; y R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.
3. 3.- El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque el compuesto purificado es de fórmula II: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en donde: R1 y R2 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de hidrógeno y halógeno; y R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y alquilo de 1 a 6 átomos de carbono.
4. 4. - El compuesto purificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado además porque R1 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y cloro.
5. 5. - El compuesto purificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado además porque R2 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y cloro.
6. 6. - El compuesto purificado de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado además porque R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno, metilo y etilo.
7. 7. - El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 6, caracterizado además porque R3 se selecciona del grupo que consiste de hidrógeno y metilo.
8. 8.- El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado además porque el compuesto purificado se selecciona del grupo que consiste de: y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
9. 9.- El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de. y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
10. 10.- El compuesto purificado de conformidad reivindicación 9, caracterizado además porque el compuesto es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
11. 1 1.- El compuesto purificado de conformidad reivindicación 9, caracterizado además porque el compuesto es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
12. 12.- El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado además porque el compuesto se selecciona del grupo que consiste de: y sales farmacéuticamente aceptables de los mismos.
13. 13.- El compuesto purificado de conformidad reivindicación 12, caracterizado además porque el compuesto es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
14. 14.- El compuesto purificado de conformidad reivindicación 12, caracterizado además porque el compuesto es o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
15. 15.- El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 8, caracterizado además porque el compuesto tiene una fórmula molecular de C44H60CI2N4O14, un peso molecular de aproximadamente 939.35 y en donde el espectro de RMN 3C del compuesto tiene picos característicos de 152.2; 35.6; 35.3; 79.6; 49.9; 126.5; 133.7; 32.1 ; 48.0 br; 39.5; 198.0 br; 105.2 br; 196.6 br; 69.7 br; 32.0 br; 17.8; 17.7; 106.1 ; 18.9; 178.1 br; 77.5 br; 75.6; 69.9; 69.8; 71.4; 14.5; 96.8; 38.5; 76.4; 74.9; 71.7; 18.5; 52.4; 16.2; 161.7; 120.0; 112.4; 110.6; 129.4; 10.8; 158.4; 172.0; 21.0; y 57.5, y un espectro RMN 1H del compuesto tiene picos característicos de 2.26, m (eq); 2.12, m (ax); 2.25, m (eq), 1.26, m (ax); 3.56, dt, 4, 11 ; 1.82, dt, 2.5, 11 ; 5.92, dt, 10, 2; 5.62, ddd, 10, 4.5, 3; 2.65, m; 4.33, m; 2.26, m; 3.52, d, 2.5; 2.14, m; 0.97, d, 7; 1.07, d, 7; 4.57, s; 4.44, s; 0.80, d. 7; 5.02, brd, 9; 4.33, m; 5.88, t, 3; 4.91 , dd, 6, 3; 4.30, pent, 7; 1.39, d, 7; 4.94, dd, 10, 2; 1.79, dd, 13.5, 2 (eq) ; 1.57, dd, 13.5, 10 (ax); 3.17, d, 9; 3.67, dq, 9, 6; 1.26, d, 6; 4.37, q, 7; 1.24, d, 7; 2.21 , s; 2.11 , s; 3.28, s.
16. 16 - El compuesto purificado de conformidad con la reivindicación 1 o la reivindicación 8, caracterizado porque el compuesto tiene una forma molecular de C43H58CI2N 0 , un peso molecular de aproximadamente 925.34 y en donde un espectro de RMN H del compuesto tiene picos característicos de 2.26, m; 2.15, m; 2.25, m; 1.28, m; 3.56, m; 1.79, m; 5.93, dt, 10, 2; 5.62, ddd, 10, 4.5, 3; 2.65, brm; 4.36, m; 2.26, m; 3.52, d, 2.5; 2.15, m; 0.98, d, 7; 1.07, d, 7; 4.58, brs; 4.44, brs; 0.80, d, 7.5; 5.01 , brd, 9.5; 4.33, m; 5.89, t, 3; 4.91 , dd, 6, 3.5; 4.30, pent, 7; 1.39, d, 7; 4.95, brd, 10; 1.80, brd, 13.5; 1.58, dd, 13.5, 9.5; 3.18, d, 9; 3.67, dd, 9, 6; 1.27, d, 6; 4.38, q, 6.5; 1.25, d, 7; 6.98, s; 2.10, s; y 3.34, s.
17. 17.- Un extracto bacteriano purificado o purificado parcialmente que comprende uno o más compuestos que se seleccionan del grupo de compuestos de la reivindicación 1.
18. 18.- El extracto de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado además porque el extracto comprende uno o más compuestos que se seleccionan del grupo que consiste de: ??
19. 19. - Una composición farmacéutica que comprende uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16 y un portador farmacéuticamente aceptable.
20. 20. - Un método in vitro para inhibir el crecimiento de bacterias, el método comprende tratar con una cantidad eficaz de uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16.
21. 21. - El uso de uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la fabricación de un medicamento para tratar o evitar una infección bacteriana en un sujeto mamífero.
22. 22.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la infección bacteriana es causada por Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus pneumaniae o Haemophilus influenzae.
23. 23.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 21 , en donde la infección bacteriana es causada por Clostridium difficile.
24. 24 - El uso de uno o más compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la fabricación de un medicamento para controlar una infección bacteriana en un sujeto mamífero.
25. 25. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde la infección bacteriana es causada por Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Streptococcus pneumaniae o Haemophilus influenzae.
26. 26. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 24, en donde la infección bacteriana es causada por Clostridium difficile.
27. 27. - Un cultivo biológicamente puro de una cepa bacteriana de la familia Pseudonocardiaceae, género Kibdelosporangium sp. (MA7385) depositada ante la American Type Culture Collection como ATCC designación de depósito de patente PTA-10354, o un cultivo biológicamente puro derivado del mismo.
28. 28. - Un procedimiento para preparar el compuesto purificado de cualquiera de las reivindicaciones 14 a 16, y el extracto bacteriano purificado o purificados parcialmente de la reivindicación 17, el procedimiento comprende cultivar y fermentar un cultivo de una cepa bacteriana de la familia Pseudonocardiaceae, género Kibdelosporangium sp. (MA7385) depositada ante la American Type Culture Collection como ATCC designación de depósito de patente PTA-10354 o un cultivo biológicamente puro derivado del mismo.