KR20120120175A - 항박테리아제로서의 킵델로스 포란기움 유래의 추출물 - Google Patents

항박테리아제로서의 킵델로스 포란기움 유래의 추출물 Download PDF

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데이비드 브라이언 올센
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Abstract

본 발명은 인간 및 동물의 박테리아 감염 및 연관된 질환 및 상태의 치료 및/또는 예방에 유용한 하기 화학식 I 및 화학식 II의 신규한 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염; 그러한 화합물을 함유하는 조성물; 발효 및 단리, 부분 합성 및 전합성에 의한 그러한 화합물의 유도; 박테리아 성장의 억제 방법; 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 제어 방법; 그러한 화합물을 생성할 수 있는 박테리아 균주의 생물학적 순수 배양물; 및 그러한 화합물을 함유하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure pct00041

<화학식 II>
Figure pct00042

Description

항박테리아제로서의 킵델로스 포란기움 유래의 추출물{EXTRACTS FROM KIBDELOS PORANGIUM AS ANTIBACTERIAL AGENTS}
본 발명은 신규한 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염; 그러한 화합물을 함유하는 조성물; 발효 및 단리, 부분 합성 및 전합성에 의한 그러한 화합물의 유도; 박테리아 성장의 억제 방법; 박테리아 감염의 치료, 예방 또는 제어 방법; 그러한 화합물을 생성할 수 있는 박테리아 균주의 생물학적 순수 배양물; 및 그러한 화합물을 함유하는 조성물의 제조 방법에 관한 것이다. 본 개시내용의 신규한 화합물, 그의 제약상 허용되는 염, 그러한 화합물 및 제약상 허용되는 염을 포함하는 조성물은 박테리아 감염 및 연관된 질환 및 상태의 치료 및/또는 예방에 유용하다.
박테리아에 의해 야기되는 감염은 고조되고 있는 의학적 관심사이며, 그 이유는 많은 박테리아 병원체가 다양한 통상의 항생제에 내성을 갖게 되었기 때문이다. 그러한 미생물은 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코쿠스 에피데르미디스 (Staphylococcus epidermidis), 스타필로코쿠스 헤모리티쿠스 (Staphylococcus hemolyticus), 스트렙토코쿠스 파이오게네스 (Streptococcus pyogenes), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae), 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 엔테로코쿠스 파에시움 (Enterococcus faecium), 헤모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae), 슈도모나스 아에루기노사 (Pseudomonas aeruginosa), 아시네토박터 칼코아세티쿠스 (Acinetobacter calcoaceticus), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 스테노트로포모나스 말토필리아 (Stenotrophomonas maltophilia), 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile) 및 기타 병원성 박테리아를 포함한다. 문헌 [F. D. Lowy, Antimicrobial resistance: the example of Staphylococcus aureus, 111(9) J. CLINICAL INVESTIGATION 1265 (2003)]; [George Talbot et al., Bad Bugs Need Drugs: An Update on the Development Pipeline from the Antimicrobial Availability Task Force of the Infectious Disease Society of America, 42 CLINICAL INFECTIOUS DISEASES 657 (2006)]; [Brad Spellberg et al., The Epidemic of Antibiotic-Resistant Infections: A Call to Action for the Medical Community from the Infectious Disease Society of America, 46 CLINICAL INFECTIOUS DISEASES 155 (2007)]을 참조한다. 그러한 다중 약물 내성 유기체에 대하여 효과적인 새로운 항박테리아 화합물에 대한 필요성 및 이 분야에 가해진 굉장한 노력에도 불구하고, 극소수의 새로운 항생제 화합물이 FDA에 의해 승인되었다.
따라서, 공지된 항생제에 대하여 내성을 갖는 박테리아를 비롯한 박테리아의 성장을 억제하는 강력한 항생제에 대한 필요성이 남아있다.
발명의 개요
본 발명은 하기 화학식 I 및 화학식 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure pct00001
<화학식 II>
Figure pct00002
상기 식에서,
R1 및 R2는 수소 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
R3은 수소 및 C1-C6 알킬 기로 이루어진 군으로부터 선택된다.
이들 화합물은 활성 범위가 넓은 강력한 항생제이며, 인간 및 동물 박테리아 감염과 연관된 병원체에 대하여 사용될 수 있다.
본 발명의 추가의 측면은 본 발명의 화합물들의 혼합물을 포함하는 조성물 및 본 발명의 화합물을 포함하는 제약 조성물 및 제제에 관한 것이다. 게다가, 본 발명의 측면은 본 발명의 화합물의 제조 방법, 박테리아 성장의 억제 방법, 본 발명의 화합물을 이용한 인간 및 동물에서의 박테리아 감염의 치료 또는 예방 방법, 및 본 발명의 화합물을 이용한 인간 및 동물에서의 박테리아 감염의 제어 방법에 관한 것이다.
도 1은 화합물 A의 13C NMR 스펙트럼이다.
도 2는 화합물 A의 1H NMR 스펙트럼이다.
도 3은 화합물 B의 1H NMR 스펙트럼이다.
본 발명의 제1 실시양태는 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된 정제된 화합물에 관한 것이다.
<화학식 I>
Figure pct00003
상기 식에서, R1 및 R2는 수소 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; R3은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태의 모든 측면에서, 모든 다른 변수는 당해 화학식에서 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 제2 실시양태는 하기 화학식 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된 정제된 화합물에 관한 것이다.
<화학식 II>
Figure pct00004
상기 식에서, R1 및 R2는 수소 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며; R3은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태의 모든 측면에서, 모든 다른 변수는 당해 화학식에서 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 제3 실시양태에서, R1은 수소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태의 모든 측면에서, 모든 다른 변수는 당해 화학식에서 또는 제1 및 제2 실시양태 중 하나 이상에서 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 제4 실시양태에서, R2는 수소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태의 모든 측면에서, 모든 다른 변수는 당해 화학식에서 또는 제1 내지 제3 실시양태 중 하나 이상에서 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 제5 실시양태에서, R3은 수소, 메틸 및 에틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태의 특정 측면에서, R3은 수소 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된다. 이 실시양태의 모든 다른 변수는 당해 화학식에서 또는 제1 내지 제4 실시양태 중 하나 이상에서 상기에 기재된 바와 같다.
본 발명의 제6 실시양태에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00005
Figure pct00006
본 발명의 제6 실시양태의 제1 측면에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00007
이러한 제1 측면의 제1 예에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00008
이러한 제1 측면의 제2 예에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00009
본 발명의 제6 실시양태의 제2 측면에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00010
이러한 제2 측면의 제1 예에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00011
이러한 제2 측면의 제2 예에서, 정제된 화합물은 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
Figure pct00012
본 발명의 제7 실시양태는 당해 화학식에서 또는 상기 제1 내지 제6 실시양태 중 하나 이상에서 기재된 하나 이상의 화합물을 포함하는 정제된 또는 부분적으로 정제된 박테리아 추출물에 관한 것이다.
본 발명의 다른 실시양태는 하기를 포함한다:
(a) 당해 화학식에서 또는 상기 제1 내지 제6 실시양태 중 하나 이상에서 기재된 하나 이상의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
(b) 당해 화학식에서 또는 상기 제1 내지 제6 실시양태 중 하나 이상에서 기재된 바에 따른 하나 이상의 화합물의 유효량으로 처리하는 단계를 포함하는, 박테리아 성장을 억제하는 방법.
(c) 당해 화학식에서 또는 상기 제1 내지 제6 실시양태 중 하나 이상에서 기재된 하나 이상의 화합물의 치료 유효량을 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 대상체에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
(d) (c)에 있어서, 상기 박테리아 감염이 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 파에시움, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 헤모필루스 인플루엔자에, 또는 스타필로코쿠스 헤모리티쿠스, 스트렙토코쿠스 파이오게네스, 슈도모나스 아에루기노사, 아시네토박터 칼코아세티쿠스, 스테노트로포모나스 말토필리아 또는 클로스트리디움 디피실레를 포함하는 기타 박테리아에 의해 야기되는 것인 방법.
(e) 당해 화학식에서 또는 상기 제1 내지 제6 실시양태 중 하나 이상에서 기재된 하나 이상의 화합물의 치료 유효량을 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 대상체에서 박테리아 감염을 제어하는 방법.
(f) (e)에 있어서, 상기 박테리아 감염이 바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 스타필로코쿠스 에피데르미디스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 엔테로코쿠스 파에시움, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에, 헤모필루스 인플루엔자에, 또는 스타필로코쿠스 헤모리티쿠스, 스트렙토코쿠스 파이오게네스, 슈도모나스 아에루기노사, 아시네토박터 칼코아세티쿠스, 스테노트로포모나스 말토필리아 또는 클로스트리디움 디피실레를 포함하는 기타 박테리아에 의해 야기되는 것인 방법.
(g) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 ATCC 특허 기탁명 PTA-10354로 기탁된 슈도노카르디아세아에 (Pseudonocardiaceae)과, 킵델로스포란기움 (Kibdelosporangium) 속의 종의 박테리아 균주 (MA7385)의 생물학적 순수 배양물 또는 그로부터 유래된 생물학적 순수 배양물.
(h) 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 ATCC 특허 기탁명 PTA-10354로 기탁된 슈도노카르디아세아에과, 킵델로스포란기움 속의 종의 박테리아 균주 (MA7385)의 배양물 또는 그로부터 유래된 생물학적 순수 배양물을 배양 및 발효하는 것을 포함하는, 상기 제6 실시양태에서 기재된 조성물을 제조하는 방법.
또한 본 발명은 (i) (a) 박테리아 성장 억제 또는 (b) 박테리아에 의한 감염의 예방 또는 치료에 사용하기 위한, (ii) (a) 또는 (b)를 위한 의약으로 사용하기 위한, 또는 (iii) (a) 또는 (b)를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 본 발명의 화합물을 포함한다. 이들 용도에서, 임의로 본 발명의 화합물은 임상적으로 유용한 작용제로부터, 예컨대 베타-락탐계, 퀴놀론계, 옥사졸리디논계, 반코마이신, 술파계 약물 및 답토마이신으로부터 선택된 적어도 하나의 추가의, 독립적으로 선택된 치료제와 조합되어 이용될 수 있다.
본 발명의 추가의 실시양태는 상기 (a) 내지 (h)에 나타낸 제약 조성물, 조합 및 방법과, 전술한 단락에 나타낸 용도를 포함하며, 이때, 거기서 이용된 본 발명의 화합물은 상기에 기재된 화합물의 실시양태, 측면, 부류, 하위부류 또는 특징 중 하나의 화합물이다. 이들 실시양태 모두에서, 적절할 경우 화합물은 임의로 제약상 허용되는 염의 형태로 이용될 수 있다.
상기에 제공된 실시양태에서, 화학식 I 및 화학식 II의 화합물은 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 유리 염기, 유리 산, 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물이 안정한 화합물을 제공하고 실시양태들의 설명과 일치하는 경우에 한해, 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 유리 염기, 유리 산 또는 제약상 허용되는 염의 형태로, 또는 수화물 또는 용매화물로서 제공될 수 있음이 이해되어야 한다. 따라서, 본원에서 "화학식 I의 화합물" 및/또는 "화학식 II의 화합물"에 대한 임의의 언급은 유리 염기 형태 또는 유리 산 형태에 대한 언급을 포함하고, 이외에도 임의의 제약상 허용되는 염, 수화물 또는 용매화물에 대한 언급을 포함하되, 단, 이들 형태는 안정한 화합물을 나타내고 실시양태들의 설명과 일치해야 한다. 각각의 실시양태는, 조합이 안정한 화합물을 제공하며 심지어 구체적으로 나타내지 않거나 언급하지 않는 경우에도 실시양태들의 설명과 일치하는 경우에 한해 하나 이상의 다른 실시양태와 조합될 수 있음이 또한 이해되어야 한다. "안정한" 화합물은 제조 및 단리될 수 있고 그의 구조 및 특성이 본원에 기재된 목적을 위하여 화합물을 사용하는 것 (예를 들어, 대상체에의 치료적 또는 예방적 투여)을 허용하기에 충분한 시간 기간 동안 본질적으로 변화되지 않은 채 남아있거나 또는 본질적으로 변화되지 않은 채 남아있게 할 수 있는 화합물이다.
상기 (a) 내지 (h)로서 제공된 조성물 및 방법의 실시양태는 실시양태들의 조합으로부터 생긴 실시양태들을 비롯하여 화합물의 모든 실시양태를 포함하는 것으로 이해되어야 함이 추가로 이해되어야 한다.
본원에서 사용될 때, 달리 나타내지 않으면 하기 용어는 나타낸 의미를 갖는다.
본원에서 사용될 때, 모든 범위는 포괄적이며, 모든 하위 범위는 그러한 범위 내에 포함되지만, 반드시 명백하게 나타낼 필요는 없다. 게다가, 본원에서 사용될 때, "또는"이라는 용어는 적절할 경우 조합될 수 있는 대안을 나타내며, 즉, "또는"이라는 용어는 각각의 열거된 대안을 별도로 포함하고 이외에도 그의 조합을 포함한다.
본원에서 사용될 때, "알킬"이라는 용어는 특정 범위 내의 다수의 탄소 원자를 갖는 임의의 선형 또는 분지쇄 알킬 기를 나타낸다. 따라서, 예를 들어 "C1 -6 알킬" (또는 "C1-C6 알킬")은 n-, 이소-, sec- 및 tert-부틸, n- 및 이소프로필, 에틸 및 메틸뿐만 아니라 모든 헥실 알킬 및 펜틸 알킬 이성질체를 나타낸다. 또 다른 예로서, "C1 -4 알킬"은 이소-, sec- 및 tert-부틸, n- 및 이소프로필, 에틸 및 메틸을 나타낸다.
"할로겐", "할로겐 원자" 및 "할로"라는 용어는 플루오린, 염소, 브로민 및 아이오딘 (별법으로 플루오로, 클로로, 브로모 및 아이오도로도 칭해짐)를 나타낸다.
치환기 및 치환 패턴의 선택의 결과로서, 본 발명의 특정 화합물은 비대칭 중심을 가질 수 있으며, 입체이성질체들의 혼합물로서, 또는 개개의 부분입체이성질체 또는 거울상이성질체로서 나타날 수 있다. 청구된 화합물의 모든 이성질체 형태는, 단리되든지 또는 혼합물 형태이든지 간에 본 발명의 범주 이내이다.
화학식 I 및 화학식 II의 화합물에서, 원자들은 그의 천연 동위원소 풍부성을 나타낼 수 있거나, 또는 원자들 중 하나 이상은 동일한 원자 번호를 갖지만 자연에서 주로 발견되는 원자 질량 또는 질량 번호와 상이한 원자 질량 또는 질량 번호를 갖는 특정 동위원소에 있어서 인공적으로 풍부해질 수 있다. 본 발명은 일반적인 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 모든 적합한 동위원소 변형체를 포함하고자 한다. 예를 들어, 수소 (H)의 상이한 동위원소 형태는 경수소 (1H) 및 중수소 (2H)를 포함한다. 경수소는 자연에서 발견되는 주된 수소 동위원소이다. 중수소의 풍부화는 특정한 치료적 이점, 예컨대 생체내 반감기 증가 또는 투여량 요건 감소를 산출할 수 있거나, 또는 생물학적 샘플의 특성화에 있어서의 표준물로서 유용한 화합물을 제공할 수 있다. 일반적인 화학식 I 및 화학식 II 내의 동위원소 풍부화 화합물은 당업계의 숙련자에게 공지된 통상적인 기법에 의해 또는 적절한 동위원소 풍부화 시약 및/또는 중간체를 이용한 본원의 실시예에 기재된 것과 유사한 방법에 의해 과도한 실험 없이 제조될 수 있다.
당업계의 숙련자에 의해 인식되는 바와 같이, 본 발명의 특정 화합물은 호변이성질체로서 존재할 수 있다. 본 발명의 목적상, 화학식 I 및 화학식 II의 화합물을 언급하는 것은 화합물 그 자체, 또는 임의의 하나의 그의 호변이성질체 그 자체, 또는 2가지 이상의 호변이성질체의 혼합물을 언급하는 것이다.
본원에서 사용될 때, "조성물"이라는 용어는 특정한 성분을 포함하는 생성물과, 특정한 성분들의 조합에서 직접적으로 또는 간접적으로 생성되는 임의의 생성물을 포함하고자 한다.
본 발명의 조성물은 하기에 기재된 바와 같이 생물학적 샘플로부터 수득될 수 있거나, 생물학적 샘플로부터 수득된 화합물의 화학적 변형에 의해 생성될 수 있거나, 또는 화학적으로 합성될 수 있다. 본 발명의 화합물은 천연 발생 화합물 및 화합물들의 혼합물로서 제공될 수 있거나, 또는 "정제된" 화합물을 생성하기 위하여 단리 및 정제될 수 있다. 본 발명의 화합물은 천연 발생 화합물 및 화합물들의 혼합물을 함유하는 조성물로서 제공될 수 있거나, 또는 "정제된" 조성물을 생성하기 위하여 단리 및 정제될 수 있다.
본원에서 사용될 때, "정제된"이라는 용어는 원래의 상태 또는 자연 상태의 화학식 I 및 화학식 II의 요망되는 화합물과 보통 회합된 하나 이상의 성분이 결여된 환경 중의 화합물 또는 조성물을 나타낸다. "정제된"에 대한 언급은 화합물의 환경을 나타내며, 정제를 반드시 필요로 하는 것은 아니다. 정제된 화합물 또는 조성물은 예를 들어 생산 균주로부터의 단리를 통하여, 합성 수단을 통하여, 정제 단계를 통하여, 또는 수단들의 조합을 통하여 생성될 수 있다. 예를 들어, 화학식 I의 화합물과 화학식 II의 화합물의 혼합물을 함유하는 조성물은 청구된 혼합물 이외의 임의의 발효 성분이 실질적으로 결여된 형태로 제공될 경우 "정제된" 조성물로 칭해질 수 있다. 이와 유사하게, 박테리아 균주의 생물학적 순수 샘플로부터 단리된 조성물은 하나 이상의 성분이 단리 또는 정제 공정에 의해 제거될 경우 "정제된" 조성물일 수 있다. 실시양태들에서, "정제된"은 존재하는 총 질량과 비교하여 요망되는 화합물 또는 조성물의 질량의 백분율로서 정의할 때 순도가 50%-99%인 화합물 또는 조성물을 나타낼 수 있다. 특정 실시양태에서, 화합물 또는 조성물은 50% 순도, 60% 순도, 75% 순도, 90% 순도, 95% 순도, 98% 순도 또는 99% 순도를 가질 수 있다.
본원에서 사용될 때, 박테리아 균주의 "생물학적 순수 샘플"이라는 용어는 자연에서는 발견되지 않는 형태로 제공되는 관심있는 박테리아 균주의 샘플을 나타내며, 즉, 박테리아 균주의 생물학적 순수 샘플은 관심있는 박테리아 균주를 함유하지만 박테리아 균주, 박테리아 물질 및/또는 기타 생물학적 물질이 실질적으로 결여되어 있다.
본원에서 사용될 때, "대상체" (별법으로는 본원에서 "환자"로도 칭해짐)라는 용어는 동물, 바람직하게는 치료, 관찰 또는 실험의 대상인 포유동물을 나타낸다. 본원에서 사용될 때, "포유동물"이라는 용어는 가장 바람직하게는 인간, 이뿐 아니라 가축화된 동물, 예컨대 고양이, 개, 가축 등을 비롯하여 온혈 동물을 포함하고자 한다.
본원에서 "활성 성분"으로도 불리우는 화학식 I 및 화학식 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염은 통상적인 제약학적 배합 기법에 따라 제약상 허용되는 담체를 이용하여 조성물 또는 제제로 제제화할 때 가장 효과적으로 이용된다. "제약 조성물"에서와 같은 "조성물"이라는 용어는 하나 이상의 활성 성분(들)과, 담체를 구성하는 불활성 성분(들)을 포함하는 생성물을 포함하고자 한다. 또한 "조성물"이라는 용어는 임의의 2가지 이상의 활성 성분(들) 및/또는 불활성 성분(들)의 조합, 복합, 응집 또는 기타 상호작용으로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생기는 임의의 생성물; 하나 이상의 활성 성분(들) 및/또는 불활성 성분(들)의 해리로부터 직접적으로 또는 간접적으로 생기는 임의의 생성물; 및 하나 이상의 활성 성분(들) 및/또는 불활성 성분(들)의 임의의 다른 유형의 반응에서 생기는 임의의 생성물을 포함하고자 한다.
제약 조성물은 적어도 치료상 유효한 항생성의 양의 활성 성분(들)을 함유한다. 본원에서 사용될 때, "치료 유효량"은 요망되는 치료 효과를 생성하기에 충분한 활성 성분의 양을 나타낸다. 예를 들어, 화합물의 치료상 유효한 항생성 양은 항생제 활성을 나타내기에 및/또는 하나 이상의 박테리아 균주의 성장을 억제하기에 충분한 양이다. 제약 조성물 중 활성 성분(들)의 치료상 유효한 항박테리아성 양은 환자 체중 1 kg당 약 10 mg의 활성 성분(들) 내지 환자 체중 1 kg당 약 1000 mg의 활성 성분(들)의 범위로 제공될 수 있다.
"제약상 허용되는"이라는 것은 제약 조성물의 성분들이 서로 상용성이어야 하고 그의 수용자에 유해하지 않아야 함을 의미한다.
본 발명의 화합물은 제약상 허용되는 염의 형태로 투여될 수 있다. "제약상 허용되는 염"이라는 용어는 모 화합물의 유효성을 보유하며 생물학적으로 또는 다르게 바람직하지 못한 것이 아닌 (예를 들어, 그의 수용자에 대하여 유독하거나 다르게 유해하지 않음) 염을 나타낸다. 화학식 I 및 화학식 II의 화합물의 적합한 제약상 허용되는 염은 예를 들어 무기 염기 염, 예컨대 알칼리 금속염 (예를 들어, 나트륨 및 칼륨 염), 암모늄 염 및 유기 염기 염을 포함한다. 적합한 유기 염기 염은 아민 염, 예컨대 테트라-알킬-암모늄 염 (예를 들어, 테트라부틸암모늄 및 트리메틸세틸암모늄), 트리알킬아민 염 (예를 들어, 트리에틸아민), 디알킬 아민 염 (디시클로헥실아민), 임의로 치환된 벤질아민 (예를 들어, 페닐벤질아민 및 파라-브로모벤질아민), 에탄올아민, 디에탄올아민, N-메틸글루코사민, N-메틸피페리딘, 피리딘, 치환된 피리딘 (예를 들어, 콜리딘, 루티딘 및 4-디메틸아미노피리딘), 및 트리(히드록시메틸)메틸아민 염; 및 아미노산 염 (예를 들어, 리신 또는 아르기닌 염)을 포함한다.
본 발명의 화합물에 관한 "투여"라는 용어 및 그의 변이형 (예를 들어, 화합물을 "투여하는")은 당해 화합물 또는 화합물의 전구약물을 치료를 필요로 하는 개체에게 제공함을 의미한다. 본 발명의 화합물 또는 그의 전구약물이 하나 이상의 다른 활성제 (예를 들어, 박테리아 감염 치료에 유용한 작용제)와 조합되어 제공될 때, "투여" 및 그의 변이형은 각각 당해 화합물, 염, 수화물 또는 용매화물 및 기타 작용제의 동시 및 순차적 제공을 포함하는 것으로 이해된다.
본원에서 사용될 때, "유효량"이라는 용어는 연구자, 수의사, 의사 또는 기타 임상의가 추구하고 있는, 조직, 시스템, 동물 또는 인간에 있어서 생물학적 또는 의약적 반응을 이끌어 내는 활성 화합물 또는 제약 제제의 양을 의미한다. 일 실시양태에서, 유효량은 치료되는 질환 또는 상태의 증상의 경감을 위한 "치료 유효량"이다. 또 다른 실시양태에서, 유효량은 발병 가능성 또는 중증도가 감소되고 있는 질환 또는 상태의 증상의 예방을 위한 "예방적 유효량"이다. 또한 상기 용어는 본원에서 박테리아 성장을 억제시킴으로써 추구되는 반응을 야기하기에 충분한 활성 화합물의 양을 포함한다 (즉, "억제 유효량"). 활성 화합물 (즉, 활성 성분)이 염으로서 투여될 때, 활성 성분의 양에 대한 언급은 화합물의 유리 산 또는 유리 염기 형태에 대한 것이다.
제약 조성물은 하나 이상의 활성 성분(들)을 담체와 친밀하게 혼합함으로써 제조될 수 있으며, 담체의 성분은 요망되는 매질을 제공하도록 선택될 수 있다. 예를 들어, 제제화된 크림 또는 로션은 활성 성분(들)을 적절하게 선택된 크림 또는 로션 성분과 혼합하여 약 0.01% 내지 약 99%의 활성 성분(들) 농도를 제공함으로써 제공될 수 있다.
본 발명의 측면에 따른 제약 조성물은 경구, 국소, 비경구 (복강내 (I.P.), 피하, 근육내 및 정맥내 (I.V.)를 포함함), 비강 및 좌제 투여, 또는 취입에 의한 투여에 적합한 조성물로서 제제화될 수 있다.
경구 투여에 있어서, 실시양태들의 제약 조성물은 액체 또는 고체 조성물로서 제제화될 수 있다. 액체 조성물은 활성 성분(들)을 제약상 허용되는 액체 담체(들), 예컨대 물, 글리콜, 오일, 알콜 등과 조합함으로써 제조될 수 있다. 고체 조성물에 있어서, 활성 성분(들)은 제약상 허용되는 고체 담체(들), 예컨대 전분, 당, 카올린, 에틸 셀룰로스, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 인산칼슘, 활석 및 락토스와 조합될 수 있다. 이들 고체 담체(들)는 임의로 윤활제, 예컨대 스테아르산칼슘과 조합되고/되거나 결합제-붕해제 등과 조합될 수 있다. 정제 및 캡슐은 용이하게 투여되기 때문에, 이들 투여 형태는 일부 상황에 있어서 가장 유리한 경구 투여 형태를 대표할 수 있다. 단위 투여 형태의 조성물도 또한 본 발명의 측면을 구성한다.
주사에 의한 투여에 있어서, 실시양태들의 제약 조성물은 현탁액, 용액 또는 에멀젼으로서 제제화될 수 있다. 주사가능 조성물을 위한 제약상 허용되는 담체는 유성 비히클 또는 수성 비히클, 예컨대 물 중 0.85% 염화나트륨 또는 물 중 5% 덱스트로스일 수 있다. 추가로, 주사가능 조성물은 제제화제, 예컨대 완충제, 가용화제, 현탁화제 및/또는 분산제를 함유할 수 있다. 완충제, 이뿐 아니라 염수 또는 글루코스와 같은 첨가제도 용액이 등장성이 되도록 하기 위하여 첨가될 수 있다. 정맥내 점적 투여에 있어서, 활성 성분(들)은 알콜/프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜에 가용화될 수 있다. 주사가능 조성물은 첨가된 보존제를 임의로 함유하는, 앰플 또는 다중용량 용기 중 단위 투여 형태의 액체 조성물로서 제공될 수 있다. 별법으로, 활성 성분(들)은 분말 형태로 제공될 수 있으며, 투여 이전에 적합한 액체 비히클 중에 재구성될 수 있다.
본 명세서 및 특허청구범위에서 사용될 때, "단위 투여 형태"라는 용어는 허용되는 담체와 회합된, 요망되는 치료 효과를 생성하도록 계산된 예정량의 활성 성분(들)을 각각 함유하는 물리적으로 분리된 단위를 나타낸다. 그러한 단위 투여 형태의 예는 정제, 캡슐, 환제, 분말 패킷 (packet), 웨이퍼, 앰플 또는 다중용량 용기 중의 측정된 단위 등을 포함한다.
본원에 기재된 화합물은 슈도노카르디아세아에과, 킵델로스포란기움 속의 종의 박테리아 균주 (MA7385), 또는 그로부터 유래된 박테리아 균주 및 그로부터 유래된 박테리아 균주의 생물학적 순수 배양물, 및 용매 추출물의 발효에 의해 제조될 수 있다. 특히, 본 발명의 화합물은 킵델로스포란기움 종 (MA7385) 또는 킵델로스포란기움 종 (MA7385)의 자손, 후손 또는 돌연변이 박테리아 균주의 발효에 의해 제조될 수 있다. 실시양태들에서, 박테리아 균주 및 용매 추출물의 발효에 의해 수득된 화합물은 본 발명의 추가의 화합물을 생성하도록 추가로 합성에 의해 변형될 수 있다. 부가적으로, 본 발명의 화합물은 합성에 의해 제조될 수 있다.
킵델로스포란기움 종 (MA7385)은 예비적으로 스트렙토미세스 (Streplomyces) 균주로 동정되었지만 킵델로스포란기움 균주인 것으로 확인되었는데, 이는 중앙 아프리카 공화국의 숲에서 수집된 토양 샘플로부터 단리되었다. 킵델로스포란기움 종 (MA7385)은 부다페스트 조약 하에 2009년 9월 23일에 미국 20110-2209 버지니아주 매너서스 유니버시티 불러바드 10801의 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션의 균주 보존 기관에 기탁되었으며, ATCC 특허 기탁명 PTA-10354로 배정되었다.
실시예
실시예 1
발효 절차
킵델로스포란기움 종 (MA7385)의 발효는 균사를 함유한 몇몇 한천 플러그를 접종 브로쓰 플라스크 (250 mL의 배플 (baffled) 플라스크 중 50 mL의 배지) 내에 접종함으로써 달성하였다. 접종 브로쓰의 제형은 하기와 같았다 (달리 특정되지 않으면 리터당 g):
가용성 전분 20.0
덱스트로스 10.0
NZ 아민 타입 E 5.0
쇠고기 추출물 3.0
펩톤 5.0
효모 추출물 5.0
CaCO3 1.0
증류수 1 리터가 되게 하는 양
pH를 NaOH를 이용하여 7.0으로 조정한 후 CaCO3을 첨가하였다. 플라스크를 28℃, 80% 상대 습도에서 인큐베이션하고, 회전 진탕기에서 220 rpm에서 진탕시켰다.
접종기 플라스크를 3일 동안 성장시켰을 때, 1 mL 분취물을 이용하여 FR23 생성 배지의 각각의 플라스크 (250 비배플 플라스크 중 50 mL의 배지)에 접종하였다. 이 제형은 하기로 이루어졌다 (리터당 g):
글루코스 5.0
가용성 전분 30.0
당밀 20.0
파마메디아 (Pharmamedia) 20.0
증류수 1 리터가 되게 하는 양
pH를 NaOH를 이용하여 7.0으로 조정한 후 멸균하였다. 플라스크를 220 rpm의 회전 진탕기에서 28℃, 80% 상대 습도에서 7일 동안 인큐베이션하였다.
단리 절차
12 L의 발효 브로쓰를 1시간 초과의 시간 동안 왕복 진탕기에서 진탕시킴으로써 12 L 아세톤으로 추출하였다. 균사체 내용물을 셀라이트 (CELITE)를 통하여 여과시키고, 여과물을 감압 하에 농축시켜 대부분의 아세톤을 제거하였다. 수성 추출물 (12 L)을 12 L의 각각의 메틸 에틸 케톤 (MEK)으로 3회 추출하였다. MEK 추출물을 합하고, 감압 하에 농축 건조시켜 검을 생성하고, 이를 적은 부피의 메탄올 (대략 20 mL)에 용해시키고, 450 cc 세파덱스 (SEPHADEX) LH 20 칼럼에서 크로마토그래피하였다. 칼럼을 메탄올로 용리시키고, 당해 화합물을 함유하는 분획물을 풀링하고, 감압 하에 농축 건조시켰다. LH20 분획물 중 1/3 부분을 최소 부피의 메탄올에 용해시키고, 90 부의 메틸렌 클로라이드 대 10 부의 메탄올의 비가 되도록 메틸렌 클로라이드로 희석시켰다. 그 후 이 용액을 35 cc (10 g) 실리카 겔 카트리지에 충전시키고, 메틸렌 클로라이드 중 10, 20, 30% 메탄올로 3-4배 칼럼 부피로 세척하였다. 관심있는 화합물은 10-20% 메탄올 분획에서 용리되었다. 이 공정을 나머지 물질을 이용하여 2회 반복하고, 3개의 칼럼으로부터의 풀링 분획물을 감압 하에 농축시켜 갈색 검을 생성하였다. 실리카 겔로부터의 풍부화 물질을 10 mL 메탄올에 용해시켰다. 1/5 (2 mL)을, 10 mL/min의 유량으로 40분 내에 60:40에서 80:20의 메탄올:0.25 M 인산나트륨 완충제 (pH 7)를 이용한 구배 용리를 사용하여 1 인치의 역상 PRP-1 (해밀턴 pH 안정성 (Hamilton's pH stable) HPLC 칼럼, 250 x 21.5 mm)에서 크로마토그래피하였다. 나머지 물질을 이용하여 크로마토그래피를 4회 반복하였다. 5회의 크로마토그래피 진행 각각으로부터 35-38, 39-40 및 41-44에서 용리되는 분획물을 풀링하였다. 이들 분획물을 4-6 mL의 메탄올로 3회 연화처리하였다. 용액은 당해 화합물을 함유하였으며, 대부분의 완충제는 고체로서 뒤에 남겨졌다. 분획물 35-38 및 41-44로부터의 메탄올 용액을 농축시키고, 조르박스 (ZORBAX) RX C8 (250 x 21.5 mm) 칼럼에서 재크로마토그래피하고, 50-100% 수성 메탄올의 50분간의 선형 구배로 용리시켰다. 각각의 크로마토그래피로부터의 주요 성분을 동결건조시켜 하기 조성물을 무색 분말로서 제공하였다.
조성물 A
화학식 I의 화합물 A-I
Figure pct00013
3-O-아세틸-1,5-안히드로-4-O-카르바모일-6-데옥시-1-[(4Z)-4-[(5-{[2,6-디데옥시-3-C-(1-{[(3,4-디클로로-5-메틸-1H-피롤-2-일)카르보닐]아미노}에틸)헥소피라노실]옥시}-2-메틸-8-메틸리덴-1,2,4a,5,6,7,8,8a-옥타히드로나프탈렌-1-일)(히드록시)메틸리덴]-5-옥소-6-(프로판-2-일)-5,6-디히드로-4H-1,3-옥사진-2-일]-2-O-메틸헥시톨.
화학식 II의 화합물 A-II
Figure pct00014
5-[(Z)-[1-(3-O-아세틸-4-O-카르바모일-6-데옥시-2-O-메틸헥소피라노실)-2,4-디옥소-5-(프로판-2-일)피롤리딘-3-일리덴](히드록시)메틸]-6-메틸-4-메틸리덴-1,2,3,4,4a,5,6,8a-옥타히드로나프탈렌-1-일 2,6-디데옥시-3-C-(1-{[(3,4-디클로로-5-메틸-1H-피롤-2-일)카르보닐]아미노}에틸)헥소피라노시드.
조성물 A의 물리적 특성을 하기와 같이 결정하였다:
도 1은 조성물 A의 탄소-13 (13C) 핵 자기 공명 (NMR) 스펙트럼이며, 특징적인 피크가 표 1에 요약된 바와 같이 관찰되었다. 13C NMR 스펙트럼을 바리안 이노바 (VARIAN INOVA) 500 또는 600 MHz 분광측정계에서 수집하였는데, 상기 분광측정계는 13C 핵에 있어서 125 또는 150 MHz에서 작동되었다. 화학적 이동은 잔류 CD3OD (δC 49.0 ppm)를 기준으로 하였다. 데이터를 3 mm NMR 튜브에서 25℃에서 균일하게 수집하였다. 놀락 (NORLAC) 3 mm H{CN} 간접 Z-구배 프로브를 모든 샘플에 대하여 사용하였다. 바리안 표준 펄스 시퀀스 (sequence)를 모든 데이터 수집에 사용하였다.
도 2는 조성물 A의 1H NMR 스펙트럼이며, 특징적인 피크가 표 1에 요약된 바와 같이 관찰되었다. 1H NMR 스펙트럼을 바리안 이노바 500 또는 600 MHz 분광측정계에서 수집하였는데, 상기 분광측정계는 1H 핵에 있어서 500 또는 600 MHz에서 작동되었다. 화학적 이동은 잔류 CHD2OD (δH 3.30 ppm)를 기준으로 하였다. 데이터를 3 mm NMR 튜브에서 25℃에서 균일하게 수집하였다. 놀락 3 mm H{CN} 간접 Z-구배 프로브를 모든 샘플에 대하여 사용하였다. 바리안 표준 펄스 시퀀스를 모든 데이터 수집에 사용하였다.
MeOH에서 취한 조성물 A의 자외선 (UV) 흡수 스펙트럼은 λmax (logε) = 248 nm (sh) 및 276 nm (4.42)의 특징적인 흡수 밴드를 나타냈다. UV 스펙트럼을 퍼킨 엘머 람다 (PERKIN ELMER LAMBDA) 35 UV/Vis 분광측정계에서 기록하였다.
ZnSe를 사용하여 취한 조성물 A의 적외선 (IR) 흡수 스펙트럼은 νmax = 3417, 2932, 1732, 1611, 1537, 1454, 1376, 1313, 1233, 1159, 1079, 1004, 893, 830, 789, 745 cm-1의 특징적인 흡수 밴드를 나타냈다. IR 스펙트럼 데이터는 메탄올에 용해시킨 조성물 A의 소량의 분취물을 ZnSe 플레이트 상으로 옮김으로써 퍼킨 엘머 스펙트럼 원 (PERKIN ELMER SPECTRUM ONE) 분광측정계를 사용하여 수득하였다.
조성물 A의 고해상도 질량 스펙트럼은 하기의 HRESIFTMS (m/z)를 생성하였다: 실측치: M+H = 939.3562, 이론치: C44H60Cl2N4O14 +H = 939.3561. 고해상도 질량 스펙트럼은 전기분무 이온화 및 피니간 이온 맥스 (FINNIGAN ION MAX) 소스를 이용하여 소스 단편화 (fragmentation)를 18 볼트로 작동시켜 서모 피니간 (THERMO FINNIGAN) LTQ-FT 분광측정계에서 수득하였다.
조성물 B
화학식 I의 화합물 B-I
Figure pct00015
3-O-아세틸-1,5-안히드로-4-O-카르바모일-6-데옥시-1-[(4Z)-4-[(5-{[2,6-디데옥시-3-C-(1-{[(3,4-디클로로-1H-피롤-2-일)카르보닐]아미노}에틸)헥소피라노실]옥시}-2-메틸-8-메틸리덴-1,2,4a,5,6,7,8,8a-옥타히드로나프탈렌-1-일)(히드록시)메틸리덴]-5-옥소-6-(프로판-2-일)-5,6-디히드로-4H-1,3-옥사진-2-일]-2-O-메틸헥시톨.
화학식 II 의 화합물 B- II
Figure pct00016
5-[(Z)-[1-(3-O-아세틸-4-O-카르바모일-6-데옥시-2-O-메틸헥소피라노실)-2,4-디옥소-5-(프로판-2-일)피롤리딘-3-일리덴](히드록시)메틸]-6-메틸-4-메틸리덴-1,2,3,4,4a,5,6,8a-옥타히드로나프탈렌-1-일 2,6-디데옥시-3-C-(1-{[(3,4-디클로로-1H-피롤-2-일)카르보닐]아미노}에틸)헥소피라노시드.
도 3은 조성물 B의 1H NMR 스펙트럼이며, 특징적인 피크가 표 1에 요약된 바와 같이 관찰되었다. 1H NMR 스펙트럼을 바리안 이노바 500 또는 600 MHz 분광측정계에서 수집하였는데, 상기 분광측정계는 1H 핵에 있어서 500 또는 600 MHz에서 작동되었다. 화학적 이동은 잔류 CHD2OD (δH 3.30 ppm)를 기준으로 하였다. 데이터를 3 mm NMR 튜브에서 25℃에서 균일하게 수집하였다. 놀락 3 mm H{CN} 간접 Z-구배 프로브를 모든 샘플에 대하여 사용하였다. 바리안 표준 펄스 시퀀스를 모든 데이터 수집에 사용하였다.
조성물 B의 고해상도 질량 스펙트럼은 하기의 HRESIFTMS (m/z)를 생성하였다: 실측치: M+H = 925.3410, 이론치: C43H58C12N4O14 +H = 925.3405. 고해상도 질량 스펙트럼은 전기분무 이온화 및 피니간 이온 맥스 소스를 이용하여 소스 단편화를 18 볼트로 가동시켜 서모 피니간 LTQ-FT 분광측정계에서 수득하였다.
Figure pct00017
Figure pct00018
실시예 2
조성물 A를 바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 및 헤모필루스 인플루엔자에 균주에 대한 항박테리아 활성에 대하여 시험하고, 조성물 A 및 B를 칸디다 알비칸스 (Candida albicans) 대조군에 대하여 시험하였다. 조성물 B를 스타필로코쿠스 아우레우스 균주에 대한 항박테리아 활성에 대하여 시험하였다.
배지 및 배지 제조
하기 물질을 조성물 A 및 B의 시험에서 사용하였다: MIC 사브로 (SABOURAUD) 덱스트로스 한천 플레이트 (비비엘 (BBL)); 마이크로뱅크 (MICROBANK) 비드 (크레이머 사이언티픽 (KRAMER SCIENTIFIC)); 2000 마이크로타이터 (MICROTITER) 플레이트 접종기; 96웰 마이크로타이터 플레이트, 뚜껑, 접종 트레이 (다이넥스 래보러토리즈 (DYNEX LABORATORIES)); 및 8-채널 핀 멀티채널 (8-CHANNEL FINN MULTICHANNEL) 피펫터, 0.5-10 μL 부피. 모든 한천 플레이트는 제조업자로부터 제조된 것을 받았다.
하기 배지를 조성물 A 및 B의 시험에서 사용하였다: 양이온 조정된 뮐러 힌톤 브로쓰 (CATION-ADJUSTED MUELLER HINTON BROTH) (MH; 비비엘); 50% 용해 말 혈액 (LHB; 비비엘) (냉동 보관); RPMI 1640 (바이오휘태커 (BIOWHITTAKER)); 인간 혈청 (펠-프리즈 (PEL-FREEZ)); RPMI 1640 (바이오휘태커); 헤모필루스 시험 배지 (Haemophilus Test Medium) (HTM, 레멜 (REMEL)); 트립티카제 대두 브로쓰 (TRYPTICASE Soy Broth) (TSB, 5 mL/튜브; 비비엘); 0.9% 염화나트륨 (염수; 박스터 (BAXTER)); 트립티카제 대두 + 5% 양 혈액 한천 플레이트 (TSA; 비비엘); 초콜릿 한천 플레이트 (비비엘); 2X 탈지유 (레멜); 및 2X 트립티카제 대두 브로쓰 (TSB, 비비엘) + 15% 글리세롤/50% 말 혈청. 배지를 하기와 같이 제조하였다:
양이온 조정된 뮐러 힌톤 브로쓰: 제조업자의 지시에 따라 제조하였다 (1000 mL의 물에 22 g을 용해시키고; 22분간 오토클레이브함). 냉장 보관하였다. 코닝 (CORNING) 0.45 Tm 셀룰로스 아세테이트 필터를 이용하여 사용 전에 여과 멸균하였다.
50% 용해 말 혈액: 섬유소를 제거한 말 혈액을 멸균 증류수로 1:1로 희석시키고, 냉동시키고, 해동시키고, 재냉동시키고 (7회 이상), 그 후 원심분리하였다. -20℃에서 냉동 보관하였다.
양이온 조정된 뮐러 힌톤 + 2.5% 용해 말 혈액: 5 mL의 50% 용해 말 혈액을 100 mL의 양이온 조정된 뮐러 힌톤 브로쓰에 무균적으로 첨가하였다. 코닝 0.45 Tm 셀룰로스 아세테이트 필터를 이용하여 사용 전에 여과 멸균하였다.
양이온 조정된 뮐러 힌톤 + 50% 인간 혈청: 50 mL의 인간 혈청을 50 mL의 2X 양이온 조정 뮐러 힌톤 브로쓰에 무균적으로 첨가하였다. 코닝 0.45 Tm 셀룰로스 아세테이트 필터를 이용하여 사용 전에 여과 멸균하였다.
헤모필루스 시험 배지: 제조업자로부터 제조된 것을 받았다. 코닝 0.45 Tm 셀룰로스 아세테이트 필터를 이용하여 사용 전에 여과 멸균하였다.
0.9% 염화나트륨: 제조업자로부터 제조된 것을 받았다.
2X 탈지유: 제조업자로부터 제조된 것을 받았다.
단리체의 선발 및 유지
사용한 균주는 머크 컬쳐 콜렉션 (Merck Culture Collection)으로부터의 단리체였으며, 이들 배양물은 a) 마이크로뱅크 비드 또는 b) 2X 트립티카제 대두 브로쓰 + 15% 글리세롤/50% 말 혈청에서 -80℃에서 냉동 스톡 (stock)으로서 유지하였다. 특히 균주는 하기와 같았다.
사용한 바실루스 서브틸리스 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하였으며, 이는 MB964로 동정되었다. 배양물을 마이크로뱅크 비드에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
사용한 스타필로코쿠스 아우레우스 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하였으며, 이는 MB2865 및 MB5957로 동정되었다. 배양물을 마이크로뱅크 비드에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
사용한 엔테로코쿠스 파에칼리스 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하였으며, 이는 CL8516으로 동정되었다. 배양물을 마이크로뱅크 비드에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
사용한 에스케리키아 콜라이 envA1 tolC 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득한 세포벽 투과성 균주였으며, 이는 MB5746으로 동정되었다. 배양물을 마이크로뱅크 비드에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
사용한 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하였으며, 이는 CL2883으로 동정되었다. 배양물을 2X 트립티카제 대두 브로쓰 + 15% 글리세롤/50% 말 혈청에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
사용한 헤모필루스 인플루엔자에 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하였으며, 이는 MB4572로 동정되었다. 배양물을 2X 트립티카제 대두 브로쓰 + 15% 글리세롤/50% 말 혈청에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다. 헤모필루스 인플루엔자에 균주는 머크에서 생체내 시험에 사용한 마우스 병원체였다.
사용한 칸디다 알비칸스 대조군 균주는 머크 컬쳐 콜렉션으로부터 획득하였으며, 이는 MY1055로 동정되었다. 배양물을 마이크로뱅크 비드에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
접종물 제조
선발된 단리체를 트립티카제 대두 + 5% 양 혈액 한천 플레이트 (바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 에스케리키아 콜라이 및 스트렙토코쿠스 뉴모니아에), 초콜릿 한천 플레이트 (헤모필루스 인플루엔자에) 또는 사브로 덱스트로스 한천 (칸디다) 상에 계대 배양하고, 35℃에서 인큐베이션하였다. 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 및 헤모필루스를 5% CO2에서 인큐베이션하고, 모든 다른 단리체를 주위 공기 중에 인큐베이션하였다. 단리체를 2회 계대 배양한 후 검정하였다.
콜로니를 플레이트로부터 선발하고, 이를 사용하여 트립티카제 대두 브로쓰 중 0.5 맥팔란드 (McFarland) 표준물과 동등한 밀도를 갖는 접종물을 제조하였으며, 1.0 맥팔란드 표준물과 동등한 밀도를 갖는 접종물을 스트렙토코쿠스 뉴모니아에에 대하여 제조하였다. 모든 배양물의 접종물 밀도는 TSB 중 대략 108 CFU/mL이었다. 이러한 TSB 접종물을 멸균 염수에서 1:10으로 희석시키고 (4 mL 접종물 + 36 mL 염수; 대략 107 CFU/mL과 동등함), 이를 사용하여 마이크로타이터 플레이트에 접종할 때까지 얼음 상에서 유지하였다.
플레이트 충전
약물 원액 및 희석물
시험 플레이트를 하기와 같이 각각의 균주에 대하여 준비하였다. 96웰 플레이트 (칼럼 1-12 및 열 A-H를 가짐)의 각각의 웰에, 100 μL의 적절한 시험 배지 (바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 에스케리키아 콜라이 - 양이온 조정된 뮐러 힌톤 브로쓰 플레이트; 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 - 양이온 조정된 뮐러 힌톤 브로쓰 + 5% 용해 말 혈액 플레이트; 헤모필루스 인플루엔자에 - 헤모필루스 시험 배지 플레이트; 칸디다 알비칸스 - RPMI 1640)를 서멀-랩시스템즈 (Thermal-LabSystems) 멀티드롭 (MULTIDROP)TM 디스펜서를 이용하여 첨가하였다. 미국 임상 검사 표준 연구소 (Clinical Laboratory Standards Institute, CLSI) (이전에는 미국 국립 임상 검사 표준 위원회 (National Committee for Clinical Laboratory Standards, NCCLS))의 제형을 이용하여 표준 용액에 필요한 희석물의 양을 계산하였다.
조성물 제조
시험 조성물을 중량 기준으로 제조하였다. 시험 조성물을 100% DMSO 중 2 mg/mL로 제조하고, 그 후 DMSO/2x CAMHB의 1:1 희석물 (최종 농도 = 50% DMSO/50% CAMHB) 중 1 mg/mL로 희석시켰다. 시험 조성물을 하기와 같이 비디 바이오사이언시즈 (BD Biosciences)의 딥 웰 (Deep Well) 폴리프로필렌 96웰 플레이트에서 50% DMSO/50% CAMHB에서 1:1로 연속적으로 희석시켰다 (1 mg/mL의 출발 농도):
각각의 열의 제1 웰에 100 μL의 화합물 원액 (1 mg/mL)을 다중채널 매트릭스 피펫으로 첨가하였다. 플레이트를 가로질러 칼럼 11 (칼럼 12는 약물이 없는 성장 제어 웰이었음)로 화합물을 퍼킨 엘머 세투스 프로/페트 (CETUS PRO/PETTE)TM 희석자 또는 테칸 (TECAN)TM을 이용하여 2배로 연속 희석시키고 (100 μL를 각각의 열의 제1 웰로부터 취하여, 제2 웰 내에 넣고 혼합하고, 각각의 열의 제2 웰의 100 μL를 취하여, 제3 웰 내에 넣고 혼합하는 등), 마지막 100 μL를 버려서 64 - 0.00004 μg/mL의 화합물 농도를 생성하였다. 대조군 화합물인 페니실린 G 및 클라리트로마이신을 DMSO 중 10 mg/mL의 원액으로 제조하였으며, 이는 시험 화합물에 대하여 상기한 바와 같이 마이크로타이터 플레이트에서 제조하였다. 시프로플록사신 (Ciprofloxacin)을 혈청 단백질 결합 검정용 대조군으로서 포함시켰다.
마이크로브로쓰 희석 검정
핀 자동 다중채널 피펫 (FINN AUTOMATED MULTICHANNEL PIPETTE) (0.5-10 μL 부피)을 이용하여 6.4 μL의 시험 용액을 충전된 마이크로타이터 플레이트의 웰에 첨가하였다 (제1 웰 중 항미생물제의 농도 = 64 μg/mL; DMSO의 농도 = 3.2%). 항미생물제를 이러한 방식으로 첨가하여 각각의 웰 중 DMSO의 양을 일정하게 유지하여 화합물을 가용화 상태로 유지하고 DMSO에 의한 비특이적 살해의 가능성을 고려하였다. 마지막 열은 3.2% DMSO의 성장 대조군을 함유하였다.
플레이트 접종 및 활성 측정
웰당 1.5 TL의 접종물을 전달하는 자동 플레이트 접종 장치인 MIC 2000 시스템을 이용하여 마이크로타이터 플레이트의 모든 웰에 (염수 희석시킨) 배양물을 접종하였다. 플레이트를 주위 공기 중 35℃에서 인큐베이션하였다. 비접종 플레이트를 멸균성 체크로서 또한 인큐베이션하였다. 18-24시간의 인큐베이션 후 결과를 기록하였다. 성장이 없을 때까지 플레이트를 판독하였다.
모든 화합물의 최소 억제 농도 (MIC-100)는 22 내지 24시간의 인큐베이션 기간 후 결정할 경우 약물이 없는 성장 대조군과 비교하여 가시적인 성장이 없는 화합물의 최저 농도로 결정하였다. MIC는 CLSI 가이드라인에 따라 수득하였다.
조성물 A는 바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 및 헤모필루스 인플루엔자에의 다양한 균주에 대하여 항박테리아 활성을 보였다. 조성물 B는 스타필로코쿠스 아우레우스의 다양한 균주에 대하여 항박테리아 활성을 보였다. 하기와 같이, 0.1 내지 64 μg/mL의 범위의 최소 억제 농도 (MIC) 값이 조성물 A 및 B에 대하여 관찰되었다:
Figure pct00019
조성물 A 및 B는 또한 메티실린 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 (MRSA), 반코마이신 내성 엔테로코쿠스 종 (VRE), 다중약물 내성 엔테로코쿠스 파에시움, 마크로라이드 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 및 스타필로코쿠스 에피데르미디스와, 리네졸리드 내성 스타필로코쿠스 아우레우스 및 엔테로코쿠스 파에시움과 같이 많은 공지된 항생제에 대하여 내성을 갖는 다양한 종에 대하여 항박테리아 활성을 보였다.
실시예 3
조성물 A를 클로스트리디움 디피실레 균주에 대한 항박테리아 활성에 대하여 시험하였다. 약물 희석물 및 약물 보충된 한천 플레이트를 수동으로 준비하였다.
배지 및 배지 제조
성장 및 시험 배지는 혐기성균의 성장 및 민감성 시험용의, 미국 임상 검사 표준 연구소 (CLSI)가 권장한 것이었다. 문헌 [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard-Seventh Edition. CLSI document M11-A7 [ISBN 1-56238-626-3]. Clinical and Laboratory Standards Institute, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA, 2007]을 참조한다.
한천 희석 MIC 검정에 이용한 배지는 헤민 (시그마 (Sigma) #H9039-1G, 로트 #039K1121), 비타민 K1 (시그마, 로트 #106K1523), 및 5% 용해 양 혈액 (클레블랜드 사이언티픽 (Cleveland Scientific), 로트 41113-6) (1)이 보충된 브루셀라 (Brucella) 한천 (벡톤 디킨슨 (Becton Dickinson), 미국 메릴랜드주 # 211086 스팍스, 로트 #9020009)이었다. 이 배지를 보충 브루셀라 한천 (Supplemented Brucella Agar, SBA)으로 칭하였다.
배지를 하기와 같이 제조하였다: 브루셀라 한천을 칭량하고, 헤민, 비타민 K, 및 용해 양 혈액의 부피를 뺀 최종 부피가 되도록 물을 첨가하였다. 한천을 끓임으로써 용해시켰다. 헤민 (5 μg/ml) 및 비타민 K (1 μg/ml)를 한천에 첨가하고, 이것을 121℃에서 23분 동안 오토클레이브하였다. 한천을 50℃로 냉각시키고, 18.5 ml을 멸균 유리 튜브 내로 분배하였다. 플레이트에 붓기 직전에, 1 ml의 용해 양 혈액 및 0.5 ml의 적절한 약물 희석물을 상기 튜브에 첨가하였다. 튜브를 거꾸로 함으로써 튜브의 내용물을 온건하게 혼합하고, 약물 보충 한천을 페트리 디쉬 내에 부었다. 약물 보충 플레이트를 고체가 될 때까지 벤치에서 정치시키고, 그 후 박트론 (Bactron) II 혐기성 챔버 (쉘던 매뉴팩츄어링 인크. (Sheldon Manufacturing Inc.), 미국 오레곤주 코넬리우스; 5% 수소, 5% 이산화탄소, 90% 질소의 분위기) 내로 옮기고, 2시간 동안 사전 환원시킨 후 접종하였다.
단리체의 선발 및 유지
사용한 균주는 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (ATCC)으로부터 획득한 기준 균주 또는 임상적 단리체였다. 특히, 균주는 클로스트리디움 디피실레 4381 (ATCC 700057) 및 클로스트리디움 디피실레 4822 (ATCC 43596)였다. 배양물은 5 μg/ml의 헤민, 1 μg/ml의 비타민 K, 5%의 용해 말 혈액 및 20%의 글리세롤을 함유하는 브루셀라 브로쓰에서 -80℃에서 냉동 상태로 유지하였다.
접종물 제조
단리체는 박트론 II 혐기성 챔버 (쉘던 매뉴팩츄어링, 미국 오레곤주 코넬리스)에서 보충 브루셀라 한천 (SBA) 플레이트 (레멜 (Remel), 미국 캔자스주 레넥사; 카탈로그 번호 R01255)에서 계대 배양하고, 박트론 II 인큐베이터에서 35-36℃에서 48시간 인큐베이션한 후 MIC 검정에서 이용하였다.
플레이트 충전
약물 원액 및 희석물
하기와 같이 시험 플레이트를 각각의 균주용으로 준비하였다. 서멀-랩시스템즈 멀티드롭 (MULTIDROP)TM 디스펜서를 이용하여 96웰 플레이트 (칼럼 1-12 및 열 A-H를 가짐)의 각각의 웰에 100 μL의 적절한 시험 배지를 첨가하였다. 미국 임상 검사 표준 연구소 (CLSI) (이전에는 미국 국립 임상 검사 표준 위원회 (NCCLS))의 제형을 이용하여 표준 용액에 필요한 희석물의 양을 계산하였다.
조성물 제조
시험 조성물을 중량 기준으로 제조하였다. 조성물 A를 DMSO에 용해시키고, 원액 농도가 2560 μg/mL인 것을 시험에 사용하였다. 대조군 화합물인 메트로니다졸 및 반코마이신 (둘 모두 미국 미주리주 세인트루이스의 시그마로부터의 것임)을 100% DMSO 중 1280 μg/mL의 원액 농도로 제조하였다.
플레이트 접종 및 활성 측정
CLSI가 기재한 기준 한천 희석법에 따라 검정을 행하였다. 문헌 [Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI). Methods for Antimicrobial Susceptibility Testing of Anaerobic Bacteria; Approved Standard-Seventh Edition. CLSI document M 11-A7 [ISBN 1-56238-626-3]]을 참조한다.
시험 및 기준 단리체를 박트론 II 혐기성 챔버에서 상업적으로 제조한 SBA 한천 플레이트 (카탈로그 번호 R01255; 레멜, 미국 캔자스주 레넥사)에서 계대 배양하고, (박트론 II 혐기성 챔버에서) 35℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다.
하기와 같이 MIC 검정용 접종물을 박트론 II 혐기성 챔버 내부에서 제조하였다. 콜로니를 면봉으로 수거하고, 0.5 맥팔랜드 표준물의 탁도와 동일하도록 사전 환원시킨 브루셀라 브로쓰에서 세포 현탁물을 제조하였다. 각각의 세포 현탁물을 접종물 복제 장치 (멜로즈 머신 숍 (Melrose Machine Shop), 미국 펜실베이니아주 우드린)의 웰 내로 로딩하였는데, 상기 장치는 스폿당 대략 104 내지 105 콜로니 형성 단위의 접종물에 있어서 한천 표면 상으로 스폿당 대략 1 내지 2 μL를 전달하였다. 접종물 복제 장치의 로딩, 및 플레이트의 접종은 혐기성 챔버 내부에서 일어났다. 접종된 한천 플레이트는 접종물이 한천 내로 흡수될 때까지 한천을 위로 하여 정치시켰다. 그 후 플레이트를 거꾸로 하고, 박트론 II의 혐기성 환경 (5% 수소, 5% 이산화탄소, 90% 질소)에서 35℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. MIC를 CLSI 지침에 따라 판독하였다.
접종 후, 약물 보충된 플레이트를 박트론 II의 혐기성 환경 (5% 수소, 5% 이산화탄소, 90% 질소)에서 35℃에서 48시간 동안 인큐베이션하였다. 성장이 없을 때까지 플레이트를 판독하였다.
모든 화합물의 최소 억제 농도 (MIC-100)는 22 내지 24시간의 인큐베이션 기간 후 결정할 경우 약물이 없는 성장 대조군과 비교하여 가시적인 성장이 없는 화합물의 최저 농도로 결정하였다. MIC를 CLSI 지침에 따라 수득하였다.
MIC 검정 절차
조성물 A는 클로스트리디움 디피실레의 다양한 균주에 대하여 항박테리아 활성을 보였다. 0.12 μg/ml의 MIC 값이 조성물 A에 대하여 관찰되었으며, 이는 표 3에 나타낸 바와 같았다. CLSI 품질 제어 기준이 존재하는 유기체-약물 조합에 있어서, 유도된 MIC 값은 공개된 품질 제어 범위 내에 있었다.
Figure pct00020
1 CLSI 품질 제어 범위
다양한 상기에 논의된 특징 및 기능 및 기타의 특징 및 기능, 또는 그의 대안이 바람직하게는 많은 다른 상이한 시스템 또는 응용으로 조합될 수 있음이 인식될 것이다. 또한, 상기에 기재된 주제 및 본원에 청구된 주제에 대한 다양한 현재 예견되지 않은 또는 예기되지 않은 대안, 변형, 변이 또는 개선이 당업계의 숙련자에 의해 후속적으로 이루어질 수 있으며 이는 하기 특허청구범위에 또한 포함시키고자 한다.
ATCC PTA-10354 20090923

Claims (28)

  1. 하기 화학식 I 및 화학식 II의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로부터 선택된 정제된 화합물.
    <화학식 I>
    Figure pct00021

    <화학식 II>
    Figure pct00022

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 수소 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 정제된 화합물.
    <화학식 I>
    Figure pct00023

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 수소 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  3. 제1항에 있어서, 하기 화학식 II의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 정제된 화합물.
    <화학식 II>
    Figure pct00024

    상기 식에서,
    R1 및 R2는 수소 및 할로겐으로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되며;
    R3은 수소 및 C1-C6 알킬로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 수소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 정제된 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 수소 및 염소로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 정제된 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 수소, 메틸 및 에틸로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 정제된 화합물.
  7. 제6항에 있어서, R3이 수소 및 메틸로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 정제된 화합물.
  8. 제1항에 있어서, 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 정제된 화합물.
    Figure pct00025
  9. 제8항에 있어서, 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 정제된 화합물.
    Figure pct00026
  10. 제9항에 있어서, 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 정제된 화합물.
    Figure pct00027
  11. 제9항에 있어서, 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 정제된 화합물.
    Figure pct00028
  12. 제8항에 있어서, 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 정제된 화합물.
    Figure pct00029
  13. 제12항에 있어서, 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 정제된 화합물.
    Figure pct00030
  14. 제12항에 있어서, 하기 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염인 정제된 화합물.
    Figure pct00031
  15. 제1항 또는 제8항에 있어서, 분자식이 C44H60Cl2N4O14이며, 분자량이 약 939.35이고, 13C NMR 스펙트럼이
    Figure pct00032

    Figure pct00033
    의 특징적인 피크를 가지며, 1H NMR 스펙트럼이
    Figure pct00034

    Figure pct00035

    Figure pct00036
    의 특징적인 피크를 갖는 정제된 화합물.
  16. 제1항 또는 제8항에 있어서, 분자식이 C43H58Cl2N4O14이며, 분자량이 약 925.34이고, 1H NMR 스펙트럼이
    Figure pct00037

    Figure pct00038

    Figure pct00039
    의 특징적인 피크를 갖는 정제된 화합물.
  17. 제1항에 따른 화합물 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 정제된 또는 부분적으로 정제된 박테리아 추출물.
  18. 제17항에 있어서, 하기 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 화합물을 포함하는 추출물.
    Figure pct00040
  19. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하는 제약 조성물.
  20. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물의 유효량으로 처리하는 단계를 포함하는, 박테리아의 성장을 억제하는 방법.
  21. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물의 치료 유효량을 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 대상체에서 박테리아 감염을 치료 또는 예방하는 방법.
  22. 제21항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 바실루스 서브틸리스 (Bacillus subtilis), 스타필로코쿠스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 엔테로코쿠스 파에칼리스 (Enterococcus faecalis), 에스케리키아 콜라이 (Escherichia coli), 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 (Streptococcus pneumoniae) 또는 헤모필루스 인플루엔자에 (Haemophilus influenzae)에 의해 야기되는 것인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 클로스트리디움 디피실레 (Clostridium difficile)에 의해 야기되는 것인 방법.
  24. 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화합물의 치료 유효량을 포유동물 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는, 포유동물 대상체에서 박테리아 감염을 제어하는 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 바실루스 서브틸리스, 스타필로코쿠스 아우레우스, 엔테로코쿠스 파에칼리스, 에스케리키아 콜라이, 스트렙토코쿠스 뉴모니아에 또는 헤모필루스 인플루엔자에에 의해 야기되는 것인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 상기 박테리아 감염이 클로스트리디움 디피실레에 의해 야기되는 것인 방법.
  27. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션 (American Type Culture Collection)에 ATCC 특허 기탁명 PTA-10354로 기탁된 슈도노카르디아세아에 (Pseudonocardiaceae)과, 킵델로스포란기움 (Kibdelosporangium) 속의 종의 박테리아 균주 (MA7385)의 생물학적 순수 배양물, 또는 그로부터 유래된 생물학적 순수 배양물.
  28. 아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션에 ATCC 특허 기탁명 PTA-10354로 기탁된 슈도노카르디아세아에과, 킵델로스포란기움 속의 종의 박테리아 균주 (MA7385)의 배양물, 또는 그로부터 유래된 생물학적 순수 배양물을 배양 및 발효하는 것을 포함하는, 제14항 내지 제17항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 제조하는 방법.
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