MX2011001225A - Compuestos isoflavonoides 6-sustituidos y usos de los mismos. - Google Patents

Compuestos isoflavonoides 6-sustituidos y usos de los mismos.

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Michael James
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Abstract

La presente invención se refiere a compuestos isoflavonoides 6-sustituidos y composiciones que comprenden los mismos. La invención se refiere además al uso de compuestos isoflavonoides 6-sustituidos para el tratamiento de diversas enfermedades y condiciones.

Description

COMPUESTOS ISOFLAVONOIDES 6-SUSTITUIDOS Y USOS DE LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a compuestos isoflavonoides 6-sustituidos y composiciones que comprenden los mismos. La invención además se refiere al uso de compuestos isoflavonoides ß-sustituidos para el tratamiento de diversas enfermedades y afecciones.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Actualmente, los agentes anti-inflamatorios más comúnmente usados . son fármacos anti-inflamatorios no esteroidales (NSAIDs).. Mientras que los NSAIDs son efectivos en reducir la inflamación, su uso siempre se ha limitado por sus efectos secundarios gastrointestinales, tales como úlcera gástrica, perforación y sangrado, asi como insuficiencia renal aguda e hipertensión. Estas deficiencias se cumplieron en parte por el desarrollo de agentes que inhiben selectivamente el proceso inflamatorio impulsado por COX-2, pero dejan las funciones homeostáticas manejadas por COX-1 sin afectar - las COXIBs. La teoría fue que la prostaglandina PGE2 producida en respuesta a COX-1, y que proporciona protección del intestino permanecía, pero el PGE2 sintetizado en respuesta a COX-2 producido como parte de la . respuesta inflamatoria se suprimió.
Sin embargo, la consecuencia de inhibir COX-2 solo es que más PGH2 se pone disponible para la producción de otros eicosanoides derivados de COX-1, en particular tromboxano (TXA2) que causa agregación de plaquetas (Caughey et al. 2001) . Se ha establecido que hay un incremento en eventos cardiovasculares adversos asociados con inhibición selectiva de COX-2. También ahora hay evidencia clara de que todos los NSAIDs se asocian con algún riesgo cardiovascular (Fosslien 2005) .
Estos desarrollos acentúan las deficiencias en terapéuticos antiinflamatorios actualmente disponibles. Independientemente del isotipo COX inhibido y en que proporciones, inhibir la inflamación por medio de la trayectoria COX se acompaña por la complicación de efectos secundarios gastrointestinales, renales y cardiovasculares.
Diversas estrategias de protección de intestino se han empleado, por ejemplo co-terapia con inhibidores de bomba de protón o análogos PGE2 sintéticos tal como misoprostol. Los agentes 'más seguros' como NSAIDs que donan óxido nítrico (??-NSAIDs) y NSAIDs acoplados a una versión sintética de uno de los fosfolípidos en la capa mucosa del estómago, fosfatidilcolina (PC-NSAIDs) están todavía en desarrollo.
No obstante, el problema subyacente con agentes existentes, así como cualquiera de las estrategias para mejorar su perfil de seguridad, es que todos ellos inhiben COX . Los riesgos cardiovasculares asociados con inhibición de COX-2 selectivo parecen deberse a la interrupción de la homeostasis entre prostaciclina inducida por COX-2' (PGI2), que es anti-trombótico y vasodilatador, y TXA2 inducido por COX-1, que es protrombótico y vasoconstrictor (Caughey et al. 2001) . Por otra parte, los promotores TXA2 y PGI2 evitan el inicio y progreso de la ateroesclerosis a través de control de activación de plaquetas e interacción de , células endoteliales de leucocitos (Kobayashi et al. 2004)- Esta homeostasis se distribuye en diversos grados siempre que la trayectoria COX se inhiba, independientemente de la selectividad de isotipo COX, como bien se ha demostrado con los efectos secundarios cardiovasculares y gastrointestinales incrementados asociados con todos los NSAIDs.
Está claro que la énorme necesidad por agentes antiinflamatorios seguros permanece sin cambios. La evolución de la normatividad con respecto a cuestiones de seguridad y etiquetado de NSAEDs y COXIBs hacen la necesidad de nuevos agentes anti-inflamatorios aún más críticos. Un terapéutico anti-inflamatorio ideal poseería actividad anti-inflamatoria sin los riesgos cardiovasculares causados por la inhibición de COX.
Los presentes inventores han encontrado sorprendentemente que ciertos compuestos isoflavonoides 6-sustituidos poseen actividad anti-inflamatoria útil. Además, se ha descubierto que ciertos compuestos isoflavanoides 6-sustituidos pueden también proporcionar otros beneficios terapéuticos.
SUMARIO DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula . general (I): en donde: R2, R3 y R<i se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi, ORg/ 0C(0)Rg/ OSi(Rio)3, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C7, amino, aminoalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, tiol, COOH, alquiltio, ¦ nitro, ciano, halo, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 y heteroárilo, R6 es Rn (Ri2)N (CH2)n-, R7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, R9, C(0)R9, Si (Rio) 3 y cicloalquilo C3-C7, R8 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C7, arilo, arilalquilo, nitro, ciano y halo, g se selecciona del grupo que consiste de: alquilo C±-C 10 , haloalquilo, arilo, arilalquilo y alquilarilo, io se selecciona independientemente del grupo que consiste de: alquilo C1 - C10 y arilo, R11 Y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1 -C10 y -Y-CO2R13 , o Rn y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5, 6 ó 7 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C1 -C 10 , alquenilo C2-Ce, alquinilo C2 -Cs , COOH, COOR10 , halo, nitro, ciano y arilo, R13 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, cicloalquilo C3-C7, alquilo C 1 -C10 , alquenilo C2-C6 y alquinilo C2-C6, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 15 átomos de carbono que opcionalmente se pueden interrumpir por uno o más átomos de oxiqeno, nitrógeno o azufre, n es un entero entre 1 y 4, el dibujo " " representa ya sea un enlace sencillo o un enlace doble, y sales de los mismos.
El compuesto de la fórmula (I) se puede seleccionar del grupo que consiste de: (7) (8) En un segundo aspecto, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo,, como se define en el primer aspecto, y un portador farmacéuticamente aceptable, diluyente y/o excipiente.
En un tercer aspecto, la presente invención proporciona un método para la prevención y/o tratamiento de inflamación y/o una enfermedad inflamatoria o trastorno en un sujeto que necesita del mismo, el método comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, como se define en el primer aspecto.
En un cuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de inflamación y/o una enfermedad inflamatoria o trastorno.
En un quinto aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto, para usar en la prevención y/o tratamiento de inflamación y/o una enfermedad inflamatoria o trastorno.
En un sexto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto, como un antioxidante.
En un séptimo aspecto, la presente invención proporciona un método para la modulación del sistema inmunitario en un sujeto, el método comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) , o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto.
En un octavo aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto en la fabricación de un medicamento para la modulación del sistema inmunitario.
En un noveno aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto, para la modulación del sistema inmunitario.
La modulación del sistema inmunitario puede comprender inhibición o supresión de una respuesta inmunitaria.
La modulación del sistema inmunitario puede' comprender supresión de activación o producción de células T y/o células B.
En un décimo aspecto, la presente invención proporciona un método para inhibir la proliferación de células, el método que comprende poner en contacto las células con un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en- el primer aspecto.
En un undécimo aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I)., o una ' . sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto en la fabricación de un medicamento para inhibir la proliferación de células.
En un duodécimo aspecto, la . presente invención proporciona un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto, para usar en inhibir la proliferación de células.
En un decimotercer aspecto, la presente invención proporciona un método para la prevención y/o tratamiento de cáncer en un sujeto que necesita del mismo, el método comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto.
En un decimocuarto aspecto, la presente invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de cáncer.
En un decimoquinto aspecto, la presente invención proporciona un compuesto' de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto, para usar .en la prevención y/o tratamiento de cáncer .
El cáncer sé puede seleccionar del grupo que consiste de: cáncer de ovario, leucemia, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, glioma, melanoma y cáncer de pulmón .
En un decimosexto aspecto, la presente invención proporciona un método para la prevención y/o tratamiento de enfermedad cardiovascular en un sujeto que necesita del mismo, el método comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto.
En un decimoséptimo aspecto, la presente. . invención proporciona el uso de un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto en la fabricación de un medicamento para la prevención y/o tratamiento de enfermedad cardiovascular.
En un decimoctavo aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula (I), o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como se define en el primer aspecto, para usar en la prevención y/o tratamiento de enfermedad cardiovascular.
Definiciones A través de esta especificación y las reivindicaciones que siguen, a menos que. el contexto lo requiera de otra manera, la palabra "comprender", y variaciones tal como "comprende" o "que comprende", se entenderá que implica la inclusión de un entero indicado o etapa o grupo de enteros o etapas pero no la exclusión de cualquier otro entero o etapa o grupo de enteros o etapas.
En el contexto de esta especificación, los términos "tratamiento" y "tratar" se refieren a cualquiera y todos los usos que remedian una afección, enfermedad, trastorno o síntomas del mismo, o de otro modo prevenir, dificultar o retroceder la progresión de una afección, enfermedad, trastorno o síntomas del mismo, de cualquier manera. El tratamiento puede ser por un periodo de tiempo definido, o proporcionado en una base en desarrollo dependiendo de las circunstancias particulares de cualquier individuo determinado.
En el contexto de esta especificación, los términos "prevenir" y "prevención" se refieren a cualquiera y todos los usos que previenen el establecimiento o aparición de una afección, enfermedad, trastorno o síntomas del mismo de cualquier manera.
En el contexto de esta especificación, el término "cantidad terapéuticamente efectiva" incluye dentro de su significado una cantidad no tóxica de un compuesto de la fórmula (I) suficiente para proporcionar el efecto terapéutico deseado. La cantidad exacta variará de sujeto a sujeto dependiendo de la edad del sujeto, su salud general, la severidad del trastorno que se trata y el modo de administración. Por ello no es posible especificar una "cantidad terapéuticamente efectiva" exacta, sin embargo un experto en la técnica será capaz de determinar una "cantidad terapéuticamente efectiva" por ensayo y experimentación de rutina.
En el contexto de esta especificación, el término "sales de los mismos se entiende que incluye sales de adición ácida, sales aniónicas y sales zwiteriónicas , y en particular sales farmacéuticamente aceptables.
En el contexto de esta especificación, "sales farmacéuticamente aceptables" incluyen, pero no se limitan a, aquellas formadas de: ácido acético, ascórbico, aspártico, benzoico, bencensulfónico, cítrico, cinámico, etanosulfónico, fumárico, glutámico, glutárico, glucónico, clorhídrico, bromhídrico, láctico, maléico, mélico, metansulfónico , naftóico, hidroxinaftóico, naftalensulfónico, naftalendisulfónico, naftalenacrílico, oléico, oxálico, oxaloacético, fosfórico, pirúvico, p-toluensulfónico, tartárico, trifluoroacético, trifenilacético, tricarbálílico, salicílico, sulfúrico, sufámico, sulfanílico y succínico.
En el contexto de esta especificación, el término "alquilo Ci-C10" se toma para incluir grupos de hidrocarburos saturados monovalentes de cadena recta y cadena ramificada que tienen 1 hasta 10 átomos de carbono, tal como metilo, etilo, propilo, isopropilo, · butilo/ isobutilo, secbutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo, heptilo, octilo, nonilo, decilo y similares. .
En el contexto de esta especificación, el término "alquilo Ci-Ce" se toma para incluir grupos hidrocarburos saturados monovalentes de cadena recta y cadena ramificada que tienen 1 hasta 6 átomos de carbono, tales como metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, secbutilo, butilo terciario, pentilo, hexilo y similares.
En el contexto de esta especificación, el término "alquenilo C2-C6" se toma para incluir radicales de hidrocarburo monovalentes de cadena recta y cadena ramificada que tienen 2 hasta 6 átomos de carbono y al menos un enlace doble carbono-carbono, tal como vinilo, propenilo, 2-metil-2-propenilo, butenilo, pentenilo y similares. El grupo alquenilo puede contener desde 2 hasta 4 átomos de carbono.
En el contexto de esta especificación, el ; término "alquinilo C2-C6" se toma para incluir radicales de hidrocarburo monovalentes de cadena recta y cadena ramificada que tienen 2 hasta 6 átomos de carbono y al menos un enlace triple carbono-carbono, tal como etinilo, propinilo, butinilo, pentinilo, hexinilo y similares. El grupo alquinilo puede contener desde 2 hasta 4 átomos de carbono.
En el contexto de esta especificación, el término "cicloalquilo C3-C7" se toma para incluir grupos alquilo cíclicos que tienen 3 hasta 7 átomos de carbono tal como ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo y cicloheptilo .
El grupo alquilo, alquenilo, alquinilo o cicloalquilo se puede opcionalmente sustituir por uno o más de: aciloxi, hidroxi, halo, alcoxi, nitro o ciano.
En el contexto de esta especificación, el término "arilo" se toma para incluir radicales aromáticos monovalentes que tienen entre 6 y 30 átomos de carbono. El grupo arilo se puede seleccionar del grupo que consiste de: fenilo, bifenilo, naftilo, antracenilo y fenantrenilo . El grupo arilo puede ser no sustituido o sustituido opcionalmente por uno o más de: alquilo Ci-C6, halo, aciloxi, hidroxi, alcoxi, sililoxi, nitro o ciano.
En el contexto de esta especificación, el término "heteroarilo" se toma para incluir radicales aromáticos monovalentes que tienen entre 1 y 12 átomos, en donde 1 hasta 6, o 1 hasta 5, o 1 hasta 4, o 1 hasta 3, o 1 o 2 átomos son heteroátomos seleccionados de hidrógeno, oxígeno y azufre. El grupo heteroarilo se puede seleccionar del grupo que consiste de: furanilo, quinazolinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, indolilo, benzimidazolilo, pirazolilo, tetrazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, tiazolilo, tienilo, imidazolilo, pirazinilo, piridazinilo, .pirimidinilo, piridilo, triazolilo, benzotiazolilo, benzisotiazolilo, benzoxazolilo, benzisoxazolilo, benzimidazolilo y triazinilo. El grupo heteroarilo puede ser no sustituido o sustituido opcionalmente por uno o más de: alquilo, halo, aciloxi, hidroxi, halo, alcoxi, sililoxi, nitro o ciano.
En el contexto de esta especificación, el término "halo" se toma para incluir fluoro, cloro, bromo y yodo.
En el contexto de esta especificación, el término "aminoalquilo" se toma para incluir "alquilo" como se definió arriba, en donde uno o más átomos de hidrógeno se han reemplazado por uno o más grupos amino. Uno o dos átomos de hidrógeno se pueden reemplazar por uno o dos grupos amino. El grupo aminoalquilo puede ser aminometilo, aminoetilo, aminopropilo y similares.
En el contexto de esta especificación, el término "arilalquilo" se toma para incluir un grupo "arilo" como se definió arriba enlazado a la molécula por medio de un grupo alquileno divalente. Los ejemplos de grupos arilalquilo incluyen bencilo y fenetilo y similares. El término "alquileno" se toma para incluir un grupo divalente derivado de un grupo hidrocarburo saturado de cadena recta y ramificada por la remoción de dos. átomos de hidrógeno. Los grupos de alquileno representativos incluyen metileno, etileno, propileno, isobutileno, y similares.
En el contexto de esta especificación, el término "alquilarilo" se toma para incluir un grupo "alquilo" como se definió arriba enlazado a la molécula por medio de un grupo arileno divalente. Los ejemplos de grupos alquilarilo incluyen tolilo, etilfenilo, propilfenilo, butilfenilo y similares. El término "arileno" se toma para incluir un sistema de anillo aromático derivado de un grupo arilo como se definió arriba por la remoción ' de dos átomos de hidrógeno.
En el contexto de esta especificación, el término "haloalquilo" se toma para incluir grupos alquilo monohalogenados , dihalogenados y hasta perhalogenados . Los grupos perhaloalquilo preferidos son trifluorometilo y pentafluoroetilo .
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS Figura 1: Efecto del compuesto (1) (denotado como NV-17) en registros de articulaciones en artritis inducida por adyuvante de ratas.
Figura 2: Efecto de incubación con compuesto (1) en la proliferación de esplenocitos y producción de citoquinas .
Figura 3: Efecto de incubación con compuesto (1) en proliferación de esplenocitos y producción de citoquinas.
Figura 4: Efecto del compuesto (1) (denotado como NV-17) en la contractilidad aórtica inducida por noradrenalina . ' Figura 5: Efecto del compuesto (3) (denotado como NV-124) en la contractilidad aórtica inducida por noradrenalina.
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN En un primer aspecto, la presente invención proporciona un compuesto de la fórmula general (I): en donde: R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi, ORg, OC (0) Rg, OSi(Rio)3, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C7, amino, aminoalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, tiol, COOH, alquiltio, nitro, ciano, halo, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 y heteroarilo, R6 es Rn (Ri2)N (CH2)„-, ; R7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, R9, C(0)R9, Si (Rio) 3 y . cicloalquilo C3-C7, R8 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C 1 -C10 , cicloalquilo C3-C7, arilo, arilalquilo, nitro, ciano y halo, R9 se selecciona del grupo que consiste de: alquilo Ci~ C 10 , haloalquilo, arilo, arilalquilo y alquilarilo, Rio se selecciona independientemente del grupo que consiste de: alquilo C1 -C 10 y arilo, R11 y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1 -C 10 y -Y-CO2 R13 , o Rn y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5, 6 ó 7 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C1 -C10 , alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6, COOH, COOR10 , halo, nitro, ciano y arilo, R13 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, cicloalquilo C3-C7, alquilo Cx-Cio, alquenilo C2-C6 y alquinilo 2- 6, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 15 átomos de carbono que opcionalmente se pueden interrumpir por uno o más átomos de oxigeno, nitrógeno o azufre, n es un entero entre 1 y 4, el dibujo " --" representa ya sea un enlace sencillo o un enlace doble, y sales de los mismos.
R2, R3 y R se pueden seleccionar independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1-C10, halo, hidroxi, ORg, OC(0) R9 y OSi(Ri0)3. En una modalidad, al menos uno de R2, R3 y es hidroxi, en una modalidad alternativa, R2, R3 y se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno e hidroxi, en donde al menos dos de R2, R3 y R4 son hidrógeno y el sustituyente restante es hidroxi. El sustituyente hidroxi (cuando se presenta) se puede ubicar en la posición para.
R7 se puede seleccionar del grupo que consiste de: hidrógeno, C(0) Rg y alquilo C1-C10. ' ¦ RQ se puede seleccionar del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1-C10, arilo, arilalquilo y halo.
Rg se puede seleccionar del grupo que consiste de: alquilo C1-C10, haloalquilo y arilo.
Rio puede ser alquilo C1-C10.
R11 y R12 se pueden seleccionar independientemente del grupo que consiste de: -Y- C02Ri3, hidrógeno y alquiló ' C1-C10, o R11 y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 o 6 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C1-C10, COOH, COOR10 y halo.
Y puede ser una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 10, l y 9, l y 8, l y 7 o l y 6 átomos de carbono.
Ri3 puede ser alquilo Ci -Cio - n puede ser 1, 2 o 3.
R2, R3 y R4 se pueden seleccionar independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi y OR9.
R7 se puede seleccionar del grupo que consiste de: hidrógeno y alquilo C 1-C6.
R8 se puede seleccionar del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1 -C10 y halo.
Rg se pueden seleccionar del grupo que consiste de: alquilo C 1 -C 6 y haloalquilo.
Rio puede ser alquilo C1-C6.
R11 y R12 se pueden seleccionar independientemente del grupo que consiste de: -Y- CO2R13, hidrógeno y alquilo Ci -C6 , o R11 y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 o 6 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que es, sustituido opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C1 -C10 , COOH y halo.
Y puede ser una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 5 carbonos.
R13 puede ser alquilo C1-C6. n puede ser 1 ó 2.
R2, R3 y R4 se pueden seleccionar independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi y OMe.
R7 se puede seleccionar dél grupo que consiste de: hidrógeno y metilo.
Rg se puede seleccionar del grupo que consiste de: hidrógeno y alquilo Ci-C6.
Rg puede ser alquilo Ci-Ce.
Rn y R12 se pueden seleccionar independientemente del grupo que consiste de: -Y- CO2 13, hidrógeno y metilo, o RX1 y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con un sustituyente seleccionado del grupo que consiste de: metilo, COOH y halo.
Y puede ser una cadena de hidrocarburo que tiene 1 o 2 átomos de carbono.
R13 se puede seleccionar del grupo que consiste de metilo, etilo o propilo, [ n es 1.
En una modalidad, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi, OR9, OC(0)R9 y OSi(Ri0)3, 7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, C(0')Rg y alquilo C1.-C10, RB se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo Ci-C10, arilo, arilalquilo, y halo, R9 se selecciona del grupo que consiste de: alquilo C1-C10, haloalquilo y arilo, Rio es alquilo C 1 -C 10 , Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13/ hidrógeno y alquilo C1 -C10 , o R11 y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 o 6 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C 1 -C 10 , COOMe, COOH y halo, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 10 carbonos, R13 es alquilo Ci-Cio y n es 1, 2 o 3.
En otra modalidad, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno e hidroxi, en donde al menos uno de R2, R3 y R4 es hidroxi, R7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno y alquilo C 1- C 10 , Re se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C 1 -C 10 y halo, R y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13, hidrógeno y alquilo C 1 -C10 o Rn y Ri2 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C 1 -C 10 , COOMe y COOH, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 6 carbonos, R13 es alquilo C1-C6 y n es 1 o 2.
En una modalidad adicional, R2, R3 y 4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno e hidroxi, en donde al menos uno de ?¾, 3 y R-j es hidroxi, R7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno y alquilo C1-C6, R8 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno y alquilo Ci-??, Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-C02Ri3, hidrógeno y alquilo Ci-C6 o R11 y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo Ci -C 6 , COOH y COOMe, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 4 carbonos, R13 es alquilo C 1-C6, n es 1 o 2 y el enlace doble en la posición 3 está presente .
En otra modalidad, R2 , R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno e hidroxi, en donde al menos uno de R2 , R3 y 4 es hidroxi, R7 es hidrógeno, R8 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno y alquilo Ci -C6 , Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13, hidrógeno y alquilo C1-C6 o Rn y Ri2 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el anillo, el anillo heterociclico : que se sustituye opcionalmente con uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo Ci-Ce, COOH y COOMe, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 4 carbonos, Ri3 es alquilo Ci-C6, n es 1 o 2 y el enlace doble en la posición 3 está presente.- En aún otra modalidad, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno y hidroxi, en donde al menos uno de R2, R3 y 4 es hidroxi, R7 es hidrógeno, Rs es hidrógeno, Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13, hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo, isopropilo, n-butilo, t-butilo y s-butilo o Rn y Ri2 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el . anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con- uno o dos sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: metilo, etilo y COOH, Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 3 carbonos, R13 es metilo, etilo, isopropilo o propilo, n es 1 o 2 y el enlace doble en la posición 3 está presente.
Todavía en una modalidad adicional, R2, R3 y 4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno y hidroxi, en donde al menos dos de R2, R3 y R4 son hidrógeno y el sustituyente restante es hidroxi, R7 es hidrógeno, Rs es hidrógeno, Rn y . R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13/ hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo e isopropilo o R y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con COOH, Y es -CH2- o -CH2CH2-, R13 es metilo, etilo, isopropilo o propilo, n es 1 o 2 y el enlace doble en la posición 3 está presente.
En otra modalidad, R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno e hidroxi, en donde al menos dos de R2, R3 y R4 son hidrógeno y el sustituyente restante es hidroxi que se ubica en la posición para, R7 es hidrógeno, Ra es hidrógeno, Ru y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-C02R13, hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo y isopropilo o Ru y Ri2 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con COOH, Y es -CH2- o -CH2CH2-, Ri3 es metilo, etilo, isopropilo o propilo, n es 1 o 2 y el enlace doble en la posición 3 está presente.
En aún una modalidad adicional, R2, R3 y; R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno e hidroxi, en donde al menos dos de R2, R3 y R4 son hidrógeno y el sustituyente restante es hidroxi que ;se ubica en la posición para, R es hidrógeno, R8 es hidrógeno, Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13, hidrógeno, metilo, etilo, n-propilo y isopropilo, R13 es metilo, etilo, isopropilo o n-propilo, Y es -CH2-, n es 1 y el enlace doble en la posición 3 está presente .
En una modalidad de la invención, el compuesto de la fórmula (I) puede ser un compuesto en donde el anillo de fenilo colgante ubicado en la posición 3 del anillo de benzopirano es menos activo que el anillo de fenilo de la porción de benzopirano actual.
Los compuestos de la fórmula (I) pueden tener uno o más centros quirales. La presente invención incluye todos los enantiómeros y diaéstereoisómeros , asi como mezclas de los mismos en cualquiera de las proporciones. La invención también se extiende a enantiómeros aislados o pares de enantiómeros. Los enantiómeros y diaéstereoisómeros se pueden separar de acuerdo con métodos bien conocidos por aquellos expertos en la técnica.
Síntesis de compuestos de la fórmula (I) Los compuestos de la fórmula (I) se pueden preparar de materiales de partida conocidos- de acuerdo al Esquema de Reacción 1 por ejemplo.
(X) denota enlace sencillo .3, 4 (XI) denota enlace doble 3,4 Esquema de Reacción 1: Síntesis de compuestos de la fórmula (I) Como se muestra en el Esquema de Reacción. 1, un compuesto de la fórmula (X) o (XI) se puede tratar con un compuesto amino apropiadamente funcionali zado en la presencia de formaldehído para proporcionar un compuesto de la fórmula (I) que tiene un sustituyente que contiene amino en la posición 6. Aquellos expertos en la técnica se darán cuenta de que las vías sintéticas alternativas se pueden emplear con objeto de preparar compuestos de la fórmula (I) .
Los compuestos de la fórmula (X) y (XI) se pueden preparar de acuerdo a métodos estándares, tales como por ejemplo el método descrito en el Esquema de Reacción 2.
El acceso a diversos patrones de sustitución alrededor del anillo benzopirano y el anillo de fenilo colgante es posible al seleccionar correspondientemente fenoles R7 y R8 sustituidos (A) y materiales de partida de ácido R2-R4-fenil acético (B) de acuerdo con, por ejemplo, solicitudes Internacionales publicadas Nos. WO 98/08503 y WO 01/17986, y referencias citadas, en la presente, las descripciones de las cuales se incorporan en la presente como referencia.
Esquema de Reacción 2: Síntesis de compuestos de la fórmula (X) y (XI) Las reacciones de ciclización de anillo de los compuestos de la fórmula (C) se pueden realizar convenientemente con cloruro de metansulfonilo para dar compuestos de la fórmula (D) . La reacción de reducción para isoflavanoles de la fórmula (E) se puede llevar a cabo con Pd-C o Pd-alúmina en un solvente alcohólico en la presencia de hidrógeno. La deshidratación se puede efectuar con ácido o P2O5 por ejemplo para proporcionar compuestos de la fórmula (XI).
Las reacciones de hidrogenación y deshidratación generalmente funcionan mejor cuando grupos hidroxi presentes se protegen primero. La protección de los grupos hidroxi pueden llevarse a cabo por métodos bien establecidos en la técnica, por ejemplo como se describe en T. W. Greene, "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, New York, 1981. Los grupos de protección hidroxi incluyen, ésteres de ácido, carboxilico, por ejemplo, esteres de acetato, esteres de arilo tal como benzoato, acetales/cetales tales como acetónido y bencilideno, éteres tales como éteres de orto-bencilo y metoxi bencilo, éteres de tetrahidropiranilo y éteres sililo tales como éter de tert-butildimetil sililo. Los grupos de protección se pueden remover por, por ejemplo, hidrólisis catalizada por : ácido o base o reducción, por ejemplo, hidrogenación. Los éteres de sililo pueden requerir fluoruro de hidrógeno o fluoruro de tetrabutilamonio para escindirse.
Los compuestos de la fórmula (XI) se pueden además hidrogenar para proporcionar compuestos de la fórmula (X) , si es deseable para preparar compuestos de la fórmula (I) en donde el enlace doble opcional no está presente.
Las personas expertas en la técnica tendrán en cuenta que otros métodos estándares conocidos por aquellos expertos en la técnica se pueden usar para preparar compuestos de la fórmula (X) y (XI) .
Los compuestos de la invención incluyen lo siguiente: (3) Actividad anti-inflamatoria y otros usos de los compuestos de la fórmula (I) Los inventores han descubierto que compuestos1 de la fórmula (I), que tienen ya sea una funcionalidad amina o un anillo que contiene nitrógeno en una cadena lateral enlazada a la posición 6 del núcleo de isoflavano o isoflaveno, poseen actividad anti-inflamatoria . ¦ ,, - En consecuencia, los compuestos de la fórmula (I) son útiles en la prevención y/o tratamiento de inflamación y enfermedades inflamatorias o trastornos. Ejemplos de enfermedades inflamatorias y trastornos incluyen, pero no se limitan a: afecciones asociadas con altos niveles de estrógeno, psoriasis y otras enfermedades inflamatorias de la piel, lesiones inflamatorias, fibromialgia , sarcoidosis, esclerosis sistémica, enfermedad de Alzheimer, retinopatia proliferativa, hepatitis, ¦ artritis (que incluye por ejemplo, osteoartritis ) , enfermedad inflamatoria del intestino (que incluye, por ejemplo, formas de colitis tal como' colitis ulcerosa y enfermedad de Crohn) , diverticulitis , proctitis ulcerosa, trastornos autoinmunitarios (que incluyen, por ejemplo, lupus eritematoso sistémico, artritis reumatoide, glomerulonefritis y síndrome de Sjogren) , asma, enfermedades y trastornos que implican inflamación pulmonar y aterosclerosis . Los compuestos de la fórmula (I) pueden también ser útiles para la prevención y/o tratamiento de dolor, edema y/o eritema que se asocia con inflamación.
Los compuestos de la fórmula (I) tienen la ventaja de la prevención y/o tratamiento de inflamación, enfermedades inflamatorias y trastornos en que a concentraciones fisiológicamente importantes, no se asocian con eventos cardiovasculares adversos, como es el caso con un número de otros fármacos anti-inflamatorios actualmente en uso. De hecho, los compuestos de la fórmula (I) demuestran efectos cardioprotectores y por lo tanto pueden ser adecuados para la prevención y/o tratamiento de enfermedades cardiovasculares, que incluyen pero no se limitan a: infarto al miocardio, ateroesclerosis , enfermedad ¦ cerebrovascular , hipertensión, angina de pecho, isquemia, enfermedad de la arteria coronaria, insuficiencia cardiaca congestiva y enfermedades de los vasos sanguíneos.
Cuando se usa para la prevención y/o tratamiento de inflamación y enfermedades inflamatorias y trastornos, los compuestos de la fórmula (I) , y composiciones farmacéuticas que comprenden los mismos se pueden usar en combinación con, o incluyen uno o más de otros agentes terapéuticos, por ejemplo otros agentes anti-inflamatorios, agentes anticolinérgicos (particularmente antagonistas del receptor Mi, M2, M1/M2 o M3), agonistas de p2-adrenoreceptor, agentes antiinfecciosos (por ejemplo, antibióticos, antivirales), o antihistamínicos . Las combinaciones pueden comprender un compuesto o compuestos de la fórmula (I) ó sales farmacéuticamente aceptables, solvatos o derivados fisiológicamente funcionales ' del mismo, junto con un corticosteroide y/o un anticolinérgico y/o un inhibidor PDE-4.
Los agentes anti-inflamatorios adecuados incluyen corticosteroides y NSAIDs. Los corticosteroides adecuados, que se pueden usar en combinación con los compuestos de la fórmula (I) son aquellos corticosteroides orales o inhalados y sus pro-fármacos, que tienen actividad anti-inflamatoria . Los ejemplos incluyen metil prednisolona, prednisolona , dexametasona, propionato de fluticasona, éster de S-fluorometilo del ácido 6a, 9a, -difluoro-17 - [ ( 2-furanilcarbonil ) oxi] -11 -hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-1, -dien-17 -carbotióico, éster de S- ( 2-oxo-tetrahidro-furan-3S-il) del ácido 6a, 9a-difluoro-11 ß-hidroxi-l 6a-metil-3-oxo-17a-propioniloxi-androsta-l , 4-dien-17a-carbotióico, ésteres de beclometasona (por ejemplo, el éster 17-propionato o el éster 17 , 21-dipropionato) , budesonida, flunisolida, ésteres de mometasona (por ejemplo, el éster de furoato) , acetónido de triamcinolona, rofleponida, ciclesonida y propionato de butixocort. Los corticosteroides preferidos incluyen propionato de fluticasona, y 6a, 9a-difluoro-17a- [ (2-furanilcarbonil) oxi] -11 éster de S-fluorometilo del. ácido ß-hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-l, 4-dien-173-carbotióico, más preferiblemente éster de S-fluorometilo del ácido 6a, 9a-difluoro-17a- [ ( 2-furanilcarbonil ) oxi] -l^-hidroxi-16a-metil-3-oxo-androsta-l, 4-dien-17 -carbotióico.
Los NSAIDs adecuados incluyen cromoglicato de sodio, nedocromil sodio, inhibidores de fosfodiesterasa (PDE) (por ejemplo, teofilina, inhibidores PDE4 o inhibidores PDE3/PDE4 mezclados) , antagonistas de leucotrieno, inhibidores de síntesis de leucotrieno, inhibidores iNOS, inhibidores de triptasa y elastasa, antagonistas de b-2 integrina y antagonistas o agonistas del receptor de adenosina (por ejemplo, agonistas de adenosina 2a) , antagonistas de citoquina (por ejemplo, antagonistas de quimiocinas) o inhibidores de síntesis de citoquina.
La co-administr,ación de compuestos puede ser simultánea o secuencial. La administración simultánea se puede efectuar por los compuestos que están en la misma dosis unitaria, o en dosis unitarias individuales y discretas administradas al mismo tiempo o similar. La administración secuencial puede ser en cualquier orden como se requiera, y puede requerir un efecto fisiológico en curso del primero o compuesto inicial para ser actual cuando el segundo o último compuesto se administra, especialmente cuando se desea un efecto acumulativo o sinérgico.
Los inventores presentes también han descubierto que compuestos de la fórmula (I) poseen potentes propiedades que inhiben la oxidación. En consecuencia, los compuestos de la fórmula (I) pueden ser útiles en un intervalo amplio de aplicaciones como antioxidantes, y se pueden convenientemente incluir en productos alimenticios o bebidas y consumidos en consecuencia.
Los inventores también han encontrado que los compuestos de la fórmula (I) pueden ser útiles en la modulación del sistema inmunitario. Por ejemplo los compuestos de la fórmula (I) pueden ser inmunosupresores y asi encontrar utilidad en el tratamiento de afecciones asociadas con respuestas inmunitarias inapropiadas , por ejemplo enfermedad inflamatoria del intestino y artritis reumatoide.
Los inventores además han descubierto que los compuestos de la fórmula (I) pueden ser útiles en inhibir la proliferación de células, y por lo tanto benéficos en la prevención y/o tratamiento de enfermedades y trastornos asociados con proliferación celular aberrante, por ejemplo cáncer. Los ejemplos de cánceres que se pueden tratar o prevenir incluyen, pero no se limitan a: tumores gastrointestinales, cáncer del hígado y tracto biliar, cáncer pancreático, cáncer de próstata, cáncer testicular, cáncer de pulmón, cáncer de piel (por ejemplo melanoma) , cáncer de mama, cáncer de piel sin melanoma (por ejemplo carcinoma de células básales y carcinoma de células escamosas), cáncer de ovario, cáncer de útero, cáncer cervical, cáncer de cabeza y cuellos, cáncer de vejiga, sarcomas y osteosarcomas, sarcoma de Kaposi, Sarcoma Kaposi relacionado con AEDS, carcinoma renal, leucemia, cáncer colorrectal y glioma. El cáncer puede ser un cáncer primario o secundario.
En el tratamiento o prevención de cáncer, las ventajas terapéuticas se pueden obtener a . través de combinación de regímenes de tratamiento. Como tales, métodos de tratamiento de cáncer de acuerdo a la presente invención se pueden usar en conjunto con otras terapias, tal como radioterapia, quimioterapia, cirugía, u otras formas de intervención médica. Los ejemplos limitativos de agentes quimioterapéuticos adecuados y otros agentes anti-cáncer incluyen: taxol, fluorouracilo, cisplatino, oxaliplatino, o¡-interferon, vincristina, vinblastina, angioinhibinas , doxorubicina, bleomicina, mitomicina C, fenoxodiol, NV-128, metramicina, TNP-470, polisulfato de pentosano, tamoxifeno, LM-609, CM-101 y SU-101.
La co-administración de compuestos de la fórmula (I) y quimioterapéuticos y otros agentes anti-cáncer pueden ser simultáneos o secuenciales . La administración simultánea se puede efectuar por un compuesto de la fórmula (I) que está en la misma dosis unitaria como un quimioterapéutico u otro agente anti-cáncer, o el compuesto de la fórmula (I) y el quimioterapéutico u otros agentes anti-cáncer se. pueden presentar en dosis unitarias individuales y discretas administradas al mismo tiempo, o en un tiempo similar. La administración secuencial puede ser en cualquier orden como se requiera, y puede requerir un efecto fisiológico en curso del primero o compuesto inicial para ser actual cuando el segundo o último compuesto se administra, especialmente cuando el efecto acumulativo o sinérgico se desea.
Composiciones farmacéuticas y vías de administración Los compuestos de la fórmula (I) son útiles como agentes terapéuticos en el tratamiento o prevención de diversas enfermedades o afecciones en un sujeto. Los compuestos de la fórmula (I) se pueden administrar a un sujeto en la forma de composiciones farmacéuticas.
Las composiciones farmacéuticas incluyen aquellas adecuadas para administración oral, parenteral (que incluye subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa e intraarticular ) , por inhalación (que incluye uso de aerosoles presurizados de dosis medida, nebulizadores o insufladores ) , rectal y tópica (que incluye dermal, bucal, sublingual e infraocular) . La vía más adecuada puede depender .de, por ejemplo, la afección y trastorno del destinatario.
Las composiciones se pueden presentar convenientemente en forma de dosificación unitaria y se pueden preparar por cualquiera de los métodos bien conocidos en la técnica de farmacia. Todos los métodos incluyen la etapa de traer uno o más compuestos de la fórmula (I) en asociación con un portador que constituye uno o más ingredientes accesorios. En general, las composiciones se preparan al traer uniformemente e íntimamente en asociación uno o más compuestos de la fórmula (I) con un portador líquido o portador sólido finamente dividido, o ambos y luego, si es necesario, formar el producto en la composición deseada.
Generalmente, una dosificación efectiva de un compuesto de la fórmula (I) se espera que esté en el intervalo de alrededor de 0.0001 mg hasta alrededor de 1000 mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 0.001 mg hasta alrededor de 750 mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 0.01 mg hasta alrededor de 500mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 0.1 mg hasta alrededor de 500mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 0.1 mg hasta alrededor de 250mg por kg peso corporal por 24 horas, o alrededor dé 1.0 mg hasta alrededor de 250mg por kg peso corporal por 24 horas. Más típicamente, un intervalo de dosis efectiva se espera que este en el intervalo de alrededor de 1.0 mg hasta alrededor de 200mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 1.0 mg hasta alrededor de 100 mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 1.0 mg hasta alrededor de 50mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 1.0 mg hasta alrededor de 25 mg por · kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 5.0 mg hasta alrededor de 50mg por kg peso corporal por 24 horas; alrededor de 5.0 mg hasta alrededor de 20 mg por kg peso corporal por 24 horas, o alrededor de 5.0 mg hasta alrededor de 15mg por kg peso corporal por 24 horas.
Alternativamente, una dosificación efectiva puede ser hasta alrededor de 500mg/m2. Generalmente, una dosificación efectiva se espera que este en el intervalo de alrededor de 25 hasta alrededor de 500mg/m2, alrededor de 25 hasta alrededor de 350mg/m2, alrededor de 25 hasta alrededor de 300mg/m2, alrededor de 25 hasta alrededor de 250mg/m2, alrededor de 50 hasta alrededor de 250mg/m2, o alrededor de 75 hasta alrededor de 150mg/m2.
Las composiciones . adecuadas para administración bucal (sublingual) incluyen grageas que comprende un compuesto de la fórmula (I) en una base de sabor, usualmente sacarosa y acacia o tragacanto;, y pastillas que comprenden un compuesto de la fórmula (I) en. una base inerte tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia.
Las composiciones adecuadas para administración , oral se pueden presentar como unidades discretas tales como gelatina o cápsulas HPMC, sellos o comprimidos, cada uno contiene una cantidad predeterminada de un compuesto de la fórmula (I) como un polvo, gránulos, como una solución o una suspensión en un liquido acuoso o un liquido no acuoso, o como una emulsión liquida aceite en agua o una emulsión liquida agua en aceite. El compuesto de la fórmula (I) se puede también presentar como una pasta. .
Cuando los compuestos de la fórmula (I) se formulan como cápsulas, el compuesto se puede formular con uno o más portadores farmacéuticamente aceptables tales como almidón, lactosa, celulosa microcristalina , dióxido de silicio y/o un oligosacárido cíclico tal como ciclodextrina . Los ingredientes adicionales pueden incluir lubricantes tales como estearato de magnesio y/o estearato de calcio. Las ciclodex'trinas adecuadas incluyen a-ciclodextrina, ß-ciclodextrina, ?-ciclodextrina, 2-hidroxietil-p-ciclodextrina , 2-hidroxipropil-ciclodextrina, 3-hidroxipropil- -ciclodextrina y tri-met??-ß-ciclodextrina . La ciclodextrina puede ser hidroxipropil-p-ciclodextrina . Los Derivados adecuados de ciclodextriñas incluyen Captisol® un éter de sulfobutilo derivado de ciclodextrina y . análogos de los mismos como se describe en patente de E.U.A. No. 5,134,127.
Los comprimidos se pueden preparar por compresión o moldeado, opcionalmente con uno o más ingredientes accesorios. Los comprimidos condensados se pueden preparar al comprimir en una máquina adecuada el compuesto de la fórmula (I) en una forma de flujo libre tal como un polvo o gránulos, opcionalmente mezclados con un aglutinante, lubricante (por ejemplo estearato de magnesio o estearato de calcio) , diluyente inerte o una superficie activa/agente dispersante. Los comprimidos moldeados se pueden hacer al moldear una mezcla del compuesto en polvo de la fórmula (I) humedecido con un diluyente liquido inerte, en una máquina adecuada. Los comprimidos se pueden recubrir opcionalmente, por ejemplo, con una recubierta entérica y se pueden formular a fin de proporcionar liberación lenta o controlada del compuesto de la fórmula (I) en él.
Las composiciones para administración parenteral incluyen soluciones inyectables estériles acuosas y no acuosas que pueden contener anti-oxidantes, amortiguadores, bacteriostáticos y solutos que hacen la formulación isotónica con la sangre del destinatario, y que puede incluir agentes de suspensión y agentes espesantes. Una composición parenteral puede comprender un oligosacárido cíclico tal como hidroxipropil- -ciclodextrina . Las composiciones se pueden presentar en recipientes de dosis unitaria o dosis múltiple, por ejemplo ampolletas selladas y viales, y se pueden almacenar en una condición secado por congelado ( liofilizado) que requiere solamente la adición del portador líquido estéril, por ejemplo solución salina o agua para inyección, inmediatamente antes de usar. Soluciones de inyección extemporáneas y suspensiones se pueden preparar de polvos estériles, gránulos y comprimidos de la clase previamente descrita.
Las composiciones de polvo seco para liberación tópica al pulmón por inhalación pueden, por ejemplo, presentarse en cápsulas y cartuchos de, por ejemplo gelatina, o estuches o por ejemplo papel aluminio laminado, para usar en un inhalador o insuflador. Las composiciones generalmente contienen una mezcla en polvo para la inhalación de uno o más compuestos de la fórmula (I) y una base en polvo 'adecuada (sustancia de portador) tal como lactosa o almidón. El uso de la lactosa se prefiere. Cada cápsula o cartucho puede generalmente contener entre 20µ?-10p} de un compuesto de la fórmula (I), opcionalmente en combinación con otro ingrediente terapéuticamente activo. Alternativamente, el compuesto o compuestos de la fórmula (I) se pueden presentar sin excipientes. El empaquetado de la composición puede ser para liberación de dosis unitaria o dosis múltiple.
Las composiciones adecuadas para administración transdérmica se pueden presentar como parches discretos adaptados para permanecer en contacto intimo con la epidermis del destinatario durante un periodo de tiempo prolongado. Tales parches adecuadamente comprenden el compuesto de la fórmula (I) como una solución acuosa opcionalmente amortiguada de, por ejemplo, concentración 0.1 M hasta 0.2 M con respecto al compuesto.
Las composiciones adecuadas para administración transdérmica también se pueden liberar por iontoforesis , y típicamente tienen la forma de una solución acuosa opcionalmente amortiguada del compuesto activo. Las composiciones adecuadas comprenden citrato o solución amortiguadora Bis/Tris (pH 6) o etanol/agua y contienen desde 0.1 M hasta 0.2 M de un compuesto de la fórmula (I) .
Las composiciones en rocío para liberación tópica al pulmón por inhalación pueden, por ejemplo formularse como soluciones acuosas o suspensiones o como aerosoles, suspensiones o soluciones suministradas de envases presurizados, tal como un inhalador de dosis medida,, con el uso de un propelente licuado adecuado. Los · propelentes adecuados incluyen un fluorocarbono o un clorofluorocarbono que contiene hidrógeno o mezclas de los mismos, particularmente hidrofluoroalcanos , por ejemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometaño, diclorotetrafluoroetano, especialmente 1,1,1,2-tetrafluoroetano, 1, 1, 2, 2, 3, 3, 3-heptafluoro-n-propano , o una mezcla del mismo. El Dióxido de carbono u otro gas adecuado se puede también usar como propelente. La composición de aerosol puede ser libre de excipiente o puede opcionalmente contener excipientes de composición adicionales bien conocidos en la técnica, tales como tensoactivos por ejemplo, ácido oleico o lecitina y co-solventes por ejemplo, etanol. Las composiciones presurizadas generalmente se mantendrán en un bote (por ejemplo, un bote de aluminio) cerrado con una válvula (por ejemplo, una válvula dosificadora) y equipado en un activador proporcionado con una boquilla.
Los medicamentos para . administración por inhalación deseablemente tienen un tamaño de partícula controlado. El tamaño de partícula óptimo para inhalación en el sistema bronquial es usualmente 1-10 ym, preferiblemente 2-5 ym. Las partículas que tienen un tamaño por arriba de 20 ym son generalmente demasiado grandes cuando se inhalan para alcanzar las vías respiratorias pequeñas. Cuando el excipiente es lactosa típicamente se presentará como lactosa molida, en donde no más de 85% de partículas de lactosa tendrán un MMD de 60-90 ym y no menos de 15% tendrán un MMD de menos de 15 ym.
Las composiciones para administración rectal se pueden presentar como un supositorio con portadores tal como: manteca de cacao o polietilenglicol , o como un enema en donde el portador es un líquido isotónico tal como solución1 salina. Los componentes adicionales de las composiciones pueden incluir un oligosacárido cíclico, por ejemplo, una ciclodextrina, como se describió arriba, tal como hidroxipropil- -ciclodextrina , uno o más tensoactivos , sales amortiguadoras o ácido o álcali para ajustar el pH, agentes que ajustan la isotonicidad y/o anti-oxidantes .
Las composiciones adecuadas para administración tópica a la piel preferiblemente toman la forma de una pomada, crema, loción, pasta, gel, atomizador, aerosol, o aceite. Los portadores que se pueden usar incluyen vaselina, lanolina, polietilenglicoles , alcoholes, y combinación de dos o más del mismo. El compuesto de la fórmula (I) se presenta generalmente en una concentración, desde 0.1% hasta 5% p/p, o desde 0.5% hasta 2% p/p. Los ejemplos de tales composiciones incluyen cremas de la piel cosméticos.
Los compuestos de la fórmula (I) se pueden proporcionar en la forma de productos alimenticios, tales como que se agregan a, mezclados en, recubiertos, combinados o de otra manera agregados a un alimento. El término "alimento" se usa en su sentido más. amplio posible e incluye composiciones líquidas tales como bebidas, que incluyen productos lácteos y otros alimentos, tales como barras saludables, postres, etc. Las composiciones alimenticias que comprenden compuestos de la fórmula (I) se pueden preparar fácilmente de acuerdo a prácticas habituales.
La producción de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de las indicaciones terapéuticas en la presente descritas se preparan típicamente por la mezcla de los compuestos de la fórmula (I) con uno o más portadores y/o excipientes farmacéuticamente o veterinariamente aceptables como son bien conocidos en la técnica.
El portador debe, por supuesto, ser aceptable en el sentido de que es compatible con cualquiera de los otros ingredientes en la composición y no debe ser perjudicial para el sujeto. El portador o excipiente puede ser un sólido o un liquido, o ambos, y se formula preferiblemente con el compuesto como una dosificación unitaria, por ejemplo, un comprimido, que puede contener hasta 100% en peso del compuesto activo, preferiblemente desde 0.5% hasta 75% en peso del compuesto de la fórmula (I) .
La composición también se puede administrar o liberar a células objetivo en la forma de liposomas. Los liposomas se derivan generalmente de fosfolípidos u otras sustancias de lípidos, y se forman por cristales líquidos hidratados mono o multi-lamelares que se dispersan en un medio acuoso. Los ejemplos específicos de liposomas usados en administrar o liberar una composición a células objetivo son colesterol sintético (Sigma) , 1 , 2-diestearoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DSPC; Avanti Polar Lipids), 3-N- [ ( -metoxi poli(etilen glicol) 2000) carbamoil] -1, 2-dimires.tiloxi-propilamina (PEG-cDMA) , o 1, 2-di-o-octadecenil-3- (N , -dimetil ) aminppropano ( DODMA) .
Las composiciones también se pueden administrar en la forma de microparticulas . Las microparticulas biodegradables formadas de poli.lactido (PLA) , polilactido-co-glicólido (PLGA), y ?-caprolactona se han usado extensivamente como portadores de fármaco para incrementar vida media de plasma y de tal modo prolongar la eficacia (R. Kumar, M., 2000, J. Pharm. Pharmaceut. Sci. 3(2) 234-258).
Las composiciones pueden incorporar una matriz de liberación controlada que está compuesta de sacarosa acetato isobutirato (SABB) y solvente orgánico o mezclas de solvente orgánico. Los. aditivos de polímero se pueden agregar al vehículo como un modificador de liberación para incrementar además la viscosidad y retardar la velocidad de liberación. Un compuesto de la fórmula (I) se puede agregar al vehículo de liberación SAD3 para formar solución SAIB o composiciones de suspensión. Cuando la formulación se inyecta subcutáneamente, el solvente difunde de la matriz que' permite el fármaco SAIB o mezclas de polímero de fármaco SAIB para poner como un depósito de formación in situ.
La presente invención se describirá ahora con referencia a ejemplos específicos, que no se deben interpretar como que limita de cualquier forma el alcance de la invención.
EJEMPLOS Ejemplo 1 - Preparación de compuestos El compuesto (1) se sintetizó como sigue. Dehidroequol (6.5g, 27.1mmol) se pesó en un matraz de fondo redondo de 250 mL y disolvió en etanol absoluto (125 mL) . La solución se enfrió a 0°C después de lo cual ?,?,?',?'-tetrametildiaminometano (4.7mL, 34.9 ramol) se agregó, seguido por formaldehido (18 mL, 37% solución acuosa) . La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante la noche después de lo cual un precipitado blanco se había formado lo que se colectó por filtración de succión y se secó bajo alto vacío para proporcionar compuesto (1). Rendimiento 5.53 g, 69%. 1H RMN (400MHz, d6-DMSO) 2.22 (s, 6H, 2 x CH3) , 3.48 (s, 2H, -CH2-), 5.01 (d, 2H, J= 1.04 Hz, H2 ) , 6.21 (s, 1H, H4), 6.73 (s, 1H, H8), 6..77 (d, 2H, J= 8.7 Hz, H3 ' , H5 ' ) , 6.83 (s, 1H, H5), 7.32 (d, 2H, J= 8.7 Hz, ?2', H6').
El compuesto (2) se sintetizó como sigue. Dehidroequol (0.24 g, 1.0 mmol) se disolvió en etanol (ca. 10 mL) y se agitó en un baño de aceite. El matraz se selló con un septo para prevenir el escape de formaldehido. El clorohídrato de glicina metil éster (0.25 g, 2.0 mmol), trietilamina (0.28 mi, 2.0 mmol) y solución de formaldehido al 37% (0.35 mL, 4.0 mmol) se agregaron a la mezcla de reacción, y la mezcla se permitió para agitar durante 24 horas a temperatura ambiente.
El etanol se removió bajo vacio y el residuo resultante se procesó por cromatografía en sílice para proporcionar compuesto (2) (0.17g, 51%).
:H RMN (400MHz, d6-DMSO) d 3.64 (s, 3H, OCH3) , 3.92 (s, 2H, NCH2), 4.82 (s, 2H, NCH2) , 5.02 (s, 2H, H2), 6.22 (s, 1H, H8), 6.74 (s, 1H, H4 o H5) , 6.77 (s, 1H, H4 o H5) , 6.78 (d, 2H, J= 8.7 Hz, H3' y H5' ) , 7.34 (d, 2H, J= 8.7 Hz, H2' y H6' ) , 9.64 (br s, 2H, OH) .
El compuesto (3) se sintetizó como sigue. L-Prolina (0.46 g, 4.00 mmol) y formaldehído al 37% (0.31 mL, 4.16 mmol) en agua (ca. 20 mL) se agregó a una solución agitada de dehidroequol (0.50 g, 2.08 mmol) en etanol (ca. 40 mL) : La mezcla luego se puso a reflujo a 70-80°C durante ~7 horas. La mezcla se enfrió a temperatura ambiente antes de que la ¦ mezcla se concentrara in vacuo dejando un sólido color rosa. Este sólido se colectó bajo succión y el filtrado, se, evaporó hasta secarse para proporcionar un segundo cultivo (producción combinada de compuesto (3) 0.33 g, 92%), p.f. 240°C (grados) .
XH RMN (300MHz, DMSO-d5) : d 7.31 (d, 2H, J= 10.2, Hz, ?2', H6*), 6.98 (s, 1H> H5), 6.76 (d, 2H, J = 8.6 Hz, H3' , H5*), 6.72 (s, 1H, H4), 6.28 (s, 1H, H8), 5.02 (s, 2H, H2), 4.08 (d, 1H, J = 12.8 Hz, Ar-CHg-N.) 3.74 (d, 1H, J =13.2 Hz, Ar-CHb-N) 2.70 (dd, 1H, J = 9.4 Hz, J = 17.3 Hz, -CH-COOH) 2.18-2.08 (m, 1H, -N-CH2-CH2) 1.95-1.66 (m, 4H, -CH2-CH2-CH2-CH-COOH) . 13C RMN (75.6MHz~, D SO-d6) : d 171.99, -C=0; 157.59, ArC; 157.46, ArC; 154.22, ArC-OH; 129.11, ArCH; 128.30, ArC; 127.42, ArC; 126.10, ArCH; 116.67, ArCH; 115.88, ArCH; 115.05, ArC; 113.89, ArC; 102.79, ArCH; 72.65, Ar-CH2-0; -CH-COOH; 53.93, -N-CH2; 53.16, Ar-CH2-N; 28.98, -CH-CH2-CH2; 23.52, -CH2-CH2-CH2.
IR (KBr) : umax 3422, 3104, 1616, 1508, 1458, 1396, 1312, 1272, 1158, 1132 cnf1.
UV/Vis (CH3OH) : Xmax 336nm (e24101 cm"1 M"1) , 253nm (el7194 cm^M"1), 214nm (e26232 cm-.^"1) , 202nm (e27150 cm^M"1).
HRMS calculado d para C2iH21N05Na+ : 390.13119, encontrado 390.13192.
Microanálisis: Encontrado C: 67.79; H: 5.94; N: 3.74; calculado C: 67.68; H: 6.20; N: Ejemplo 2 - Actividad anti-inflamatoria 2.1 Efecto en la producción de NFKB en la linea celular de macrófago humano transfectado THP-1 NFKB es un factor central de transcripción ubicuo para respuestas celulares a estímulos tal como estrés, citoquinas proinflamatorias (por ejemplo, IL-1 o TNF- ) , radicales libres, irradiación ultravioleta, y antígenos bacterianos o virales. Su inhibición proporciona una estrategia antiinflamatoria .
Métodos El ensayo utiliza una linea celular THP-1 genéticamente modificada y tecnología para beta-lactamasa GeneBLAzer® (Invitrogen Corp). El monocito/macrófagos THP-1 humano contiene un gen reportero de beta-lactamasa transfectado establemente bajo control del elemento de respuesta NFkB. Responden a estimulación con TNFa, lo que lleva a activación de la trayectoria de señalización. La co-incubación de células con TNFa y material de prueba permite la determinación cuantitativa de la capacidad de material de prueba para inhibir producción de beta-lactamasa estimulada con TNFa. Un índice inflamatorio se calculó como la relación de producto de beta-lactamasa a sustrato de beta-lactamasa.
En resumen, las células THP-1 genéticamente modificadas se sembraron en pozos de una placa de 96 pozos (50 x 103 células/pozo) en la presencia de medio RPMI 1640 (70µ1). El TNFa se agregó a cada pozo (10 µ?) para dar una concentración final de 7.5 ng/ml. El suero de bovino dializado se agregó (10 µ?) . Los compuestos de prueba se disolvieron en DMSO (10 yL) (5 pozos). Cada placa contiene un control sin célula (4 pozos) , un control sin suero ' (4 pozos) y dos controles de suero. Las placas se incubaron - durante 5 h a 37°C para permitir la Producción de beta-lactamasa estimulada por NFkB. El sustrato LiveBLAzerTM FRET B/G Sustrato (CCF4-AM) se agregó luego al ensayo. El CCF4-AM es una Fórster transferencia de energía de resonancia (FRET) basado en sustrato para desarrollar beta-lactamasa por Invitrogen Corp. Una vez que CCFA-AM entra en una célula, esto se convierte a CCF4 . cargado negativamente por esterasas endógenas. La excitación de este sustrato en 409nm conduce a FRET eficiente entre las porciones de cumarina y fluoresceína, resultando en una fluorescencia verde detectable en 530nm. La presencia de beta-lactamasa conduce a desdoblamiento de CCF4 y resulta en una pérdida de FRET, resultando en una fuerte señal fluorescente azul detectable a 460nm. Así, la actividad de beta-lactamasa (un marcador de actividad de promotor NFkB) se mide como una relación, de producto a sustrato (relación de fluorescencia azul/verde: 460nm/530nm) . La determinación de índice inflamatorio tenía un CV dentro de la placa de 2.1% y un CV entre la placa de 8.9%.
Resul tados Como se muestra en la Tabla 1 abajo, el compuesto (1) significativamente reduce la actividad de promotor de ; NFKB en 10 µ? y 100 µ?. Esto se hizo en ausencia de citotoxicidad . El compuesto (2) fue activo en la concentración mayor solamente, y nuevamente en la ausencia de citotoxicidad .
Tabla 1: Efecto de compuestos de prueba en. actividad de promotor NFKB en células THP-1 Significativamente diferente de células de control incubadas sin compuesto: * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.
Estos resultados sugieren que ambos compuestos (1) y (3) poseen actividad integral para modular la inflamación. 2.2 Efecto en expresión de molécula de adhesión en células arteriales La inflamación implica el reclutamiento de células inflamatorias de la circulación y su migración transendotelial . Este proceso se actúa predominantemente por moléculas de adhesión celular, que se expresan en el endotelio vascular y en leucocitos circulantes en respuesta a diversos estímulos inflamatorios. La molécula 1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) induce la adhesión firme de células inflamatorias en la superficie vascular. Consecuentemente, la inhibición de VCAM-1 es un potencial objetivo terapéutico para el control de inflamación en general y artritis en particular. Métodos La inhibición de Activación celular endotelial estimulada por TNFa se evaluó al medir la expresión de superficie de moléculas de adhesión celular con un método ELISA. Las células endoteliales arteriales humanas (HAEC) en medio de crecimiento (Cell Applications Inc.) se sembraron en placas de 96 pozos en una densidad de 10,000 células por pozo. Las placas se incubaron durante la noche a 37°C en un incubadora humidificada para permitir a las células convertirse en confluente. En' la mañana del experimento, TNFa (??µ?, 2ng/ml) se agregó a cada pozo, lo que contenia ???µ? de medio. Los compuestos de prueba se diluyeron en medio que contiene DIVISO (DMSO al 2.5%) para dar una concentración de 100 y 300µ?. Estos se agregaron a pozos de manera que las concentraciones finales fueron 10 y 30µ?. El medio que contiene DMSO solo se agregó a pozos de control de concentración cero. Todas las muestras se midieron en cuadruplicado (4 pozos por tratamiento) .
Después de la incubación con un compuesto de la fórmula (I), el medio se removió y las células se probaron con ya sea anticuerpos de ratón especifico o- IgG no especifico (VCAM (BD Biosciences - 0.1 pg en. solución salina amortiguada 100yL con suero humano inactivado por calor al 10%)).
La expresión de molécula de adhesión se detectó por adición de anticuerpo anti-ratón de oveja/conjugado de peroxidasa de raíz de rábano. Las placas se permitieron para colocarse durante 30. minutos - las monocapas se lavaron luego, y el anticuerpo anti-ratón de oveja/conjugado de peroxidasa de raíz de rábano (1:500 en 100yL HBSS con suero humano inactivado por calor al 10% y Tween 20 al 0.05%) se agregó y dejó durante 30 minutos. Después de lavado adicional, 150 L sustrato ABTS (Kirkegaard and Perry Laboratories) se agregó a cada pozo y permitió desarrollarse durante 15 minutos. La densidad óptica se midió a 405nm con un lector ELISA (Titertek Multiscan, Flow Laboratories) .
Resultados Como se muestra abajo en las Tablas 2 y 3, los compuestos (1) y (3) significativamente inhiben expresión VCAM inducida por TNFOÍ en ambas concentraciones.
Tabla 2: Efecto del compuesto (1) en expresión VCAM-1 en HAECs Absorbancia ?µ? 10µ? 30µ? Vehículo 0.214±0.023 0.22810.011 Compuesto (1) 0.164±0.012** 0.208±0.008* Tabla 3: Efecto del compuesto (3) en la expresión de'VCAM-1 en HAECs Significativamente diferente de células de control incubadas sin compuesto: * P < 0.05; ** P < 0.01; *** P < 0.001.' .
Estos resultados sugieren que tanto los compuestos (1) y (3) pueden reducir el reclutamiento y migración de leucocitos implicados en la respuesta inflamatoria. 2.3 Efecto en lipoxigenasa Los leucotrienos (LTs) son eicosanoides , una familia de moléculas derivadas de ácido araquidónico (AA) . A diferencia de los PG y los TX, que son productos de la trayectoria COX, los LT son productos de la trayectoria 5-lipoxigenasa , (5-LO). Los LT juegan un papel en enfermedades alérgicas e inflamatorias, amplificando la inflamación provocando aumento de la permeabilidad vascular, vasodilatación y contracción del músculo liso. Además, son potentes agentes quimiotácticos . Por otra parte, la inhibición de 5-LO indirectamente reduce la expresión de inhibición TNFd de los LT es una estrategia anti-inflamatoria .
Métodos La trayectoria para síntesis LTB4 implica liberación inicial de AA de fosfolípidos por un PLA2 dependiente de Ca . El AA libre se oxigena luego en un 5-LO (que requiere activación de enzima por FLAP) para generar un intermediario de epóxido (LTA4) . LTA4 se convierte luego a LTB4 por hidrolasa LTA4. LTB4 se metaboliza (y desactiva) por un citocromo P-(CYP) 450 ?-hidrolasa para producir metabolitos 20-hidroxi y 20-carboxi. Estos metabolitos también se miden en el ensayo HPLC.
Los neutrófilos se aislaron de sangre venosa humana citrada a >90% de pureza por centrifugación a través de Ficoll, sedimentación de dextrano y lisis de eritrocitos (Boyum 1986) . Las células se lavaron en solución Hanks amortiguada con HEPES (HBHS) y luego se suspendió en 4.5 millones de células/mL en HBHS que contienen BSA al 0.1% (HBHS+BSA) .
Los experimentos se han llevado a cabo previamente para optimizar la estimulación de neutrófilos por ionóforo de calcio. A 37°C, 900yL de suspensión celular (4 millones de células) se incubaron con 3 ' , 7-dihidroxiisoflav-3-eno (o vehículo) en 10 L DMSO durante 5 min antes de la adición de 100 \i de 25 ng/uL ionóforo de calcio (forma de ácido libre, Sigma) con DMSO 0.5% en HBHS que contiene albúmina de suero de bovino al 0.1% (HBHS+BSA) . ¦ Las células se incubaron durante 10 min luego se . peletizaron por centrifugación a 1200x g a 4°C por 5min, y el sobrenadante libre de célula usado para cuantificar los niveles de LTB4 y sus metabolitos.
A cada alícuota 900 L del sobrenadante, 25pL de 2.5 ng/pL prostaglandina B2 (PGB2) en etanol se le agregó como estándar interno. La solución se acidificó a pH <3 con 2M ácido fórmico y la mezcla se extrajo con acetato de etilo 2 mL y agitación vigorosa. La capa orgánica se colectó y se secó bajo nitrógeno en un vial de vidrio antes 1 de ser reconstituida en 50pL de la solución de reconstitución ( agua : metanol : acetonitrilo . a 2:1 :1).
El análisis se llevó a cabo usando un sistema HPLC con una columna 125-4 LiChrospher®100 RP-18 (5pm) (Agilent Technologies) y un sistema de gradiente adaptado de un método publicado (Mita et al. 1988) para separar LTB4, sus productos de oxidación 20-hidroxi LTB4 (20-OH-LTB4) y 20-carboxi LTB4 (20-COOH-LTB,j) , así como PGB2. A una velocidad de flujo de lml/min, una combinación de tres diferentes soluciones de fase móvil se usaron. La absorbancia UV se monitoreó a 270nm, y LTB4 y sus metabolitos se cuantificaron por comparación de áreas de pico con ese de estándar interno y una curva estándar preparada anteriormente.
Resultados Como se muestra en la Tabla 4 abajo, el compuesto (1) fue activo en inhibir la síntesis de LTB4 y sus metabolitos. El IC50 para la producción de LTB4 fue 4.3µ?. Como también se muestra en la Tabla 4, el compuesto (3) fue activo en inhibir la síntesis de LTB4 y el . IC50 para su producción fue 5.4µ?. Mientras que se inhibe la producción de 20-OH-LTB4, la producción de 20-COOH-LTB4 se mejoró.
La liberación máxima de LTB4, 20-OH-LTB4 y 20-COOH-LTB4 producida por compuestos (1) y (3) se comparó para ese control de vehículo.
Tabla 4: Efecto de compuestos (1) y (3) en la síntesis de LTB4 y sus metabolitos En general, la viabilidad celular fue alrededor de- 75%-85%, usando una alícuota de la mezcla de reacción y células de incubación con los compuestos de prueba por 5 minutos. La viabilidad celular de neutrófilos incubada con compuestos de prueba fue similar a esa de los controles.
Estos resultados indican que. ambos compuestos ( ) y (3) poseen actividad inhibidora de lipoxigenasa . 2.4 Efecto en la producción de óxido nítrico El óxido nítrico (NO), un mensajero molecular sintetizado por sintasa de óxido nítrico (NOS) de L-arginina y oxígeno molecular, se implica en un número de procesos fisiológicos y patológicos. Tres isoformas estructuralmente distintas de NOS se han identificado: neuronal (nNOS) , endotelial (eNOS) e inducible (iNOS) . El exceso de NO producido por iNOS se ha implicado en inflamación. Por ejemplo, en articulaciones artríticas, NO causa apoptosis y desdiferenciación de condrocitos articulares por la modulación de cinasa regulada de señal extracelular (ERK) , quinasa p38, y quinasa C de proteína (PKC) . En contraste, el NO producido por eNOS tiene un' papel fisiológico en mantener el tono vascular. El NO derivado de eNOS también regula la expresión de moléculas de adhesión celular endotelial, adhesión de leucocitos, y aumentos significativos de extravasación en expresión constitutiva de moléculas de adhesión ICAM-1 y P-selectina, deslizamiento de leucocitos, adhesión, y extravasación se vieron en la vasculatura de tejidos de ratones agénicos eNOS comparados con sus controles tipo natural. En consecuencia, la inhibición selectiva de iNOS y sobre-regulación de eNOS seria una ventaja como una estrategia anti-inflamatoria , asi como proporciona un efecto cardioprotector .
Métodos La linea celular de macrófago de ratón RAW 264.7 se cultivó en DMEM complementado con suero de bovino fetal (FCS), glutamina 2mM y · 50U/ml penicilina/estreptomicina. Las células se trataron con cualquiera de los compuestos de la fórmula (I) (en DMSO 0.025%) o vehículo solo, y agregaron una hora antes de 50ng/ml LPS, que induce iNOS y la producción de NO. Después de la incubación por 16hrs, el medio de cultivo se colectó. La Concentración de nitrito es un indicador cuantitativo de producción NO y se determinó por la Reacción de Griess. Brevemente, 100 yL de reactivo Griess se agregó a 50 yL de cada sobrenadante en duplicado. La absorbancia en 550 nm se midió (Molecular Devices, SpectraMax 250 espectrofotómetro. de microplacas, CA, USA) , y concentración de nitritos se determinaron contra una curva estándar de nitrito de sodio.
Resultados Como se puede ver de la Tabla 5 abajo, los compuestos (1), (2) y (3) tienen algún efecto inhibidor en la síntesis de NO en una manera con respuesta de dosis. En el caso del compuesto (1), este efecto se puede haber influenciado por toxicidad en RAW 264.7, donde -el IC50 es 53.9 ± 1.2µ?.
Tabla 5: Efecto de compuestos de prueba en síntesis de NO en RAW 26 .7 2.5 Efecto en expresión de síntasa de óxido nítrico endotelial (eNOS) ' Métodos Los HCAEC se cultivaron como se describió arriba. Ya que la viabilidad celular fue menos de 100% en 30 y ???µ?, los experimentos eNOS se llevaron a cabo en una concentración (10 µ?) . Después de la incubación, el ARN total se extrajo usando reactivo TRI (Sigma, St Louis, MO, USA) , después del protocolo del fabricante. El ARN se cuantificó y normalizó a lOOng/µ? usando el ensayo SYBR Green II (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) antes de que fue inverso transcrito usando iScript (Bio-Rad, Hercules, CA, USA). eNOS (sentido 5'- CCA TCT ACA GCT TTC CGG CGC-3' y antisentido 5 ' -CTC TGG GGT GGC CTT CAG CA-3') y 18S (sentido 5 ' -CGG CTA CCA CAT CCA AGG AA-3' y antisentido 5'- GCT GGA ATT ACC GCG GCT-3') los niveles de mARN se determinaron por PCR en tiempo real usando iQ SYBR Green Supermix (Bio-Rad) en un sistema de detección de termociclador iCycler iQ RealTime (Bio-Rad Laboratories). Los parámetros de ciclo fueron 95°C por 30 segundos, 62°C por 30 segundos, y 72°C por 30 segundos por 40 ciclos, y datos en tiempo real se colectaron en cada ciclo. Hubo seis repeticiones.
Resul tados Los compuestos (1) y (3) se examinaron en una concentración sencilla de 10 µ?. En 10 µ? y durante el periodo de incubación de 24 hr, la viabilidad celular fue inafectada. Como se ve abajo en la Tabla 6, ambos compuestos significativamente incrementaron- la expresión de eNOS compuesto (1) por un promedio de 45% y compuesto (3) por 325%.
Tabla 6: Expresión relativa de mARN en eNOS 2.6 Actividad en el modelo de artritis inducida por adyuvante de rata La artritis inducida por adyuvante en roedores genéticamente susceptibles es un modelo animal bien aceptado de. inflamación de articulación crónica tal como ese experimentado en artritis reumatoide. Es sensible a agentes anti-inflamatorios e inmunosupresores .
Métodos Ratas macho Dark Agouti (DA) (DA.CD45.1) se alimentaron con ya sea alimento tratado con compuesto (1) o alimento tratado con placebo durante siete días antes de la inyección de adyuvante de Freund Completo (0.1 mi) en la base de la cola. Los alimentos tratados se continuaron durante todo el experimento. La artritis, gue se volvió evidente en el Día 8 se anotó subjetivamente cada día por un operador cegado a la identidad de tratamientos y usando un sistema de registro como sigue: • 0 (sin evidencia de artritis) ; • 1 (1 o 2 rojo, articulaciones inflamadas pero sin otra inflamación) ; · 2 (carpo o tarso inflamado o más de 2 pequeñas articulaciones inflamadas) ; • 3 (algunas articulaciones inflamadas rojas y carpo o tarso inflamado, pero sin inflamación global); ', • 4 (inflamación global severa de la pata completa).
Por lo tanto, la calificación de la enfermedad para ratas individuales osciló entre 0 y 16. Las ratas (n = 8 por grupo) se sacrificaron en el Día 12. Los datos se analizaron usando un ANOVA de dos vías (Prisma 4 para Windows, GraphPad Software Inc) .
Resultados Como se muestra abajo en la Tabla 7, el tratamiento con compuesto (1) causa una reducción estadísticamente importante (p = 0.008) en calificación de artritis cuando se compara con tratamiento con alimento de placebo (ver Figura 1) .
Tabla 7: Calificación de articulación día por día (media ± SD) 2.7 Actividad anti-inflamatoria en el ensayo de bolsa de aire de rata Un . ensayo alternativo usado para medir la eficacia antiinflamatoria es el modelo de bolsa de aire que implica la inyección subcutánea repetida de aire en el dorso de ratas seguido de 24h más tarde por la inyección intra-bolsa de un estímulo inflamatorio (Gilroy et al. 1998).
Métodos Las bolsas de aire se elevaron en el dorso de ratas Dark Agouti hembras, de aproximadamente siete semanas de edad. Para promover la formación de una membrana celular que reviste el interior de cada bolsa, los parches se mantuvieron por re-inflación en los días 2 y 5 después de la inyección inicial de aire. En la re-inflación, la bolsa se desinfla primero para asegurar que la aguja se colocó correctamente, antes de que se re-infló con 2 mL de aire estéril. Usando este protocolo, los parches permanecieron inflados hasta el uso en el día 7, cuando se inyectaron con 0.5 mi de ya sea compuesto de prueba o control de vehículo. Después de 15 min, las bolsas de aire se inyectaron con zimozan tratado con suero' (STZ - 500pg) . El lavado de la bolsa de aire (lavados 4 x 2ml) se realizó en 4h y los leucocitos se contaron, después de lo cual las ratas se sacrificaron, la bolsa dé aire se extirpó y procesó en formalina para histología. Las secciones se cegaron a la cuenta de la persona. Usando una retícula con 100 cuadrados y el objetivo 40x, el número de polimorfos (PMN) se contó en la bolsa que reviste en 10 sitios diferentes y no adyacentes. Los tamaños del grupo fueron 5-6 ratas. Los datos se analizaron para significación estadística dentro de cada experimento y usando una prueba t sin par. Los compuestos (1) y (3) se examinaron en este ensayo.
Resultados En las bolsas tratadas con compuesto (1), tanto el número de células de exudado en la cavidad de la bolsa como el número de PMN extravasado en la pared de la bolsa fueron más de 3 veces menos en las ratas tratadas comparadas con los controles (ver Tabla 8 abajo). Las diferencias fueron altamente significativas estadísticamente (P < 0.01), demostrando un efecto antiinflamatorio.
En el caso del compuesto (3), el número medio de células de exudado fue similar para tanto el grupo de tratamiento como el de control (ver la Tabla 8 abajo) . Hubo una disminución menor en el- número de PMN en la pared de la bolsa del grupo tratado, pero esto no fue estadísticamente significativo.
Tabla 8: Efecto de compuestos de prueba en el número de células en el exudado de la cavidad de bolsa de aire y en el número de PMN en la pared de la bolsa de aire aControl fue DMSO / PBS, el vehículo para los compuestos de prueba. La relación de DMSO/PBS fue 1:100. bmedia±SD. cprueba t sin par (2 colas) . 2.8 Actividad anti-inflamatoria en ensayo de inflamación de oído de murino Los compuestos (1) y (3) se examinaron por su capacidad para inhibir la inflamación del oído en ratones inducida por la aplicación tópica de diversos agentes de inflamación -ácido araquidónico (AA) y 4~ -forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) .
La respuesta inflamatoria debida AA, el precursor intermediario de los eicosanoides , es debida a la formación de metabolitos AA por medio de ambas de las vías COX y LO. AA induce un incremento temprano (10-15min) en ambas síntesis PGE2 y LTC4 que preceden el incremento en el espesor del oído.
La inflamación inducida por PMA implica la activación de quinasa C de proteína (PKC), una enzima de proteína dependiente de fosfolípido que juega un papel clave en un intervalo de procesos de inducción de señal. En otras palabras, PMA es un activador PKC. PKC media la activación de fosfolipasa A2, que resulta en la liberación de AA libre y la síntesis de leucotrienos (LTs) y prostaglandinas (PGs) posterior. La. inflamación está mediada principalmente por PGE2, como niveles de PGE2 pero no LTB4 y LTC/j se elevan en los oídos de ratones tratados con PMA.
Métodos Los grupos de 5-6 ratones hembras BALB/c (ARC, A, Australia) , que ' pesan 15-21 g se inyectaron intraperitonealmente (i/p) con compuestos seleccionados de la fórmula (1) en 25mg/kg liberados en polietilen glicol (PEG) 400: solución salina amortiguada con fosfato (PBS) 1:1 o etanol: propanodiol: PBS 4:9:7 ya sea 30 min anterior a o inmediatamente antes de que el agente inflamatorio se aplicó a los oídos. Los ratones se anestesiaron usando isoflurano y el espesor de línea base de ambos oídos se midió usando un micrómetro de primavera. Cada ratón recibió un total de 20uL de ya sea AA en etanol (50mg/ml o 200mg/ml) o PMA en ya sea etanol o acetona (0.2mg/ml) aplicado a las superficies interior y exterior de cada aurícula de la oreja (esto es 0.5mg o 2mg AA o 2pg PMA por oído). Los ratones se anestesiaron nuevamente para re-medir los oídos en 1 hr posterior a la aplicación de AA y 5 hr después de PMA.
La diferencia en inflamación de oído pre- y postaplicación de agente inflamatorio para cada oído se calculó, y el promedio para, los dos oídos de cada ratón tomado. La diferencia en inflamación media de cada grupo de prueba comparado' con el grupo determinado de vehículo solamente se calculó usando una ANOVA general usando prueba de Comparación Múltiple de Dunnett cuando los múltiples compuestos se probaron en un experimento o una prueba t no apareada de dos colas cuando solamente un compuesto sé probó (Prisma 4, Graphpad Software) .
Resultados Como se ve en las .Tablas 9 y 10, ninguno de los compuestos (1) no (3) significativamente inhiben la inflamación del oído inducida por la aplicación , de los agentes inflamatorios. Sin embargo, el compuesto (1) demuestra una tendencia, hacia inhibir la inflamación debido a ambos agentes inflamatorios.
Tabla 9: Cambio en espesor del oído en respuesta aplicación de AA Compuesto Cambio en % de Cambio Importancia espesor de oído comparado con (media ± SD, x vehículo 0.01 mm) (1) 2 .1+0.1 -7.0 ' NS vehículo 25.9±1.1 (3) 22.2±1.9 -5.9 NS vehículo 20.9+2.0 Tabla 10: Cambio en espesor del oído en respuesta aplicación de PMA Ejemplo 3 - Actividad Antioxidante Los procesos inflamatorios se ligan a daño celular oxidativo, y hay. amplia evidencia de los efectos antiinflamatorios de .antioxidantes. Se sabe poco alrededor de los mecanismos moleculares subyacentes, aunque una hipótesis es que inhiben la producción de citoquinas proinflamatorias y moléculas de adhesión. Los compuestos (1) y (3) han demostrado en un número de ensayos tener actividad antioxidante muy fuerte. 3.1 Efecto en recuperación de radicales libres Métodos La actividad de antioxidante (captura de radicales libres) de compuestos de prueba se evaluó usando el compuesto de radical libre estable 2 , 2-difenil-l-picrilhidrazil (DPPH). Una solución de reserva de DPPH se preparó en una concentración de 0.1 mM en etanol y mezcló durante 10 minutos antes de usar. El compuesto (1) se reaccionó con DPPH por 20 minutos, tiempo después de lo cual la absorbancia en 517nm se determinó. El cambio en absorbancia a 517nm se comparó con un blanco de reactivo (DPPH con etanol solo). El valor IC50 se estimó como la concentración del compuesto de prueba que causo un cambio 0.6 en absorbancia (con 1.2 unidades de absorbancia que representan recuperación total del radical DPPH) .
Resultados Como se muestra en la Tabla 11, ambos compuestos (1) y (3) exhiben potente actividad antioxidante.
Tabla 11: Capacidad de recuperación de radicales libres de compuestos de prueba - EC50 (µ?) 3.2 Efecto en la inhibición de la oxidación de lipoproteína de baja densidad (LDL) La lipoproteína de baja densidad oxidada (LDL) es pro-inflamatoria, esto puede causar disfunción endotelial y fácilmente se acumula, dentro de la pared arterial (Rosenson 2004). Las lipoproteinas oxidadas se cree que provocan un número de cambios en funciones celulares que promueven aterogénesis, por medio de una respuesta inflamatoria. Por lo tanto, la inhibición de la oxidación de LDL puede ser anti-aterogénica, anti-inflamatoria y cardioprotectora .
Métodos La sangre se recolectó por punción venosa y plasma separado por centrifugación. LDL se aisló luego de plasma usando un gradiente de densidad de cloruro de sodio de 4 etapas y se ultracentrifugó en 200,000 g por 20 horas a 4°C. La recolección de LDL se purificó al pasar a través de columna PD10 de filtración de gel para remover exceso de sal y EDTA, y se almacenó en la oscuridad a 4°C para prevenir la auto-oxidación y se usó con dos semanas de aislamiento. El contenido de colesterol LDL se midió usando un método enzimático estándar y concentración de proteina determinada por el método de Lowry usando BSA como el estándar.
En el día de cada experimento una alícuota 2mL de LDL se pasó a través de una segunda columna PD10 y diluyó con PBS tratado con Chelex (100 mM) para dar una concentración de proteína estándar de 0.1 mg/mL, esto es, concentración final por reacción. Las reacciones de oxidación se iniciaron por la adición de solución Cu2+ preparada frescamente, tal que la concentración final de CuS04 fue 5µ?. Para estudios de inhibición, LDL se pre-trató con cualquier compuesto ,(1) o compuesto (3), en concentraciones finales de 0.1, 1.0, 10 y ???µ?, por 2 minutos a temperatura ambiente antes de la adición de solución de cobre y posteriormente se incubó a 37°C. El grado de oxidación de lipoproteina se determinó al medir la formación de peróxidos de lipido en alícuotas removidas cada 30 minuto durante un periodo de 3 horas. Los peróxidos se determinaron en cada punto de tiempo por el ensayo de naranja de xilenol de oxidación ferrosa (FOX) usando curva de peróxido de hidrógeno estándar (5 hasta 200µ?) . El compuesto (1) se examinó en al menos, dos experimentos separados realizados en días separados.
El enlace no específico de compuesto (1) hasta- Cu++ se examinó también por duplicado en días diferentes. Una solución de reserva de compuestos de prueba se preparó en DMSO en una concentración de 5mM. El espectro de absorción UV/Vis se determinó luego entre 200 y 800 nm después de la dilución de compuestos de prueba a 25µ? en solución amortiguadora de fosfato (10 mM, pH 7.2, Chelex tratado). Las interacciones de los compuestos con Cu (II) se determinaron al explorar un segundo espectro de absorción de traslape sobre 200 hasta 800nm, en los cuales la solución de CUSC 25µ? se agregó a una solución 25µ? fresca de compuestos de prueba y mezcló durante 20 segundos.
Resultados La referencia a las Tablas 12 hasta 15 abajo demuestra que ambos compuestos (1) y (3) fueron muy activos en inhibir la oxidación de LDL. El periodo de retraso de oxidación LDL fue aproximadamente 60 minutos y la oxidación máxima se alcanzó por 120 - 180 minutos. La capacidad de los compuestos (1) y (3) para inhibir oxidación LDL incrementa con concentración incrementada de 0.01 hasta 10 µ?. La concentración en la cual 50% de la oxidación se inhibió, el IC5o se calculó como 0.58µ? por compuesto (1) y 0.5µ? por compuesto ( 3 ) .
No hubo cambios significativos para las bandas de absorbancia de compuestos de prueba con Cu2+ en una relación molar 1:1. Hubo un incremento muy pequeño y constante en las bandas de absorbancia de compuesto (1) con Cu2+comparado con los compuestos solos. De . estos resultados se puede concluir que el compuesto (1) no interactuó con Cu2+. Esto también indica que los mecanismos subyacentes de inhibición de oxidación LDL no son más probables debido a una interacción directa de iones Cu2+ con los compuestos de prueba.
Tabla 12: Datos en bruto para formación de peróxido lipido en curso temporal en la ausencia de compuesto (1) Tabla 13: Datos en bruto para formación de peróxido lipido en curso temporal en la presencia de compuesto (1) LDL 0.1 mg/ml + compuesto (1) + Cu++ 5 µ? Compuesto Tiempo 0.1 µ? 1.0 µ? 10 µ? 100 µ? (1) 100 (min) µ? + Cu++ 5 µ? 0 11.5411.96 11.31+1.95 11.54+1.96 13.86+1. 10.13+2. 77 82 30 14.50+0.28 12.83+2.28 16.77+2.55 29.7116. 32.09+11 85 .15 60 26.8610.65 13.11+2.70 19.56+4.55 39.57110 46.21+20 .67 .68 90 89. 3+17.03 1 .7811.06 20.8415.30 78.85+33 58.19+28 .54 .98 120 161.78+1.44 20.3912.95 22.80+3.39 54.24+9.5 69.46+35 8 ¦ .33 180 193.20+25.05 102.30+37.30 20.30+4.97 62.50+19 76.60+40 .58 ¦ 17 Tabla 14: Datos en bruto para formación de peróxido lipido en curso temporal en la ausencia de compuesto (3) Tabla 15: Datos en bruto para formación de peróxido lipido en curso temporal en la presencia de compuesto (3) LDL 0.1 mg/ml + compuesto (3) + Cut+ 5 µ? Compuesto Tiempo 0.1 µ? 1.0 µ? 10 µ? 100 µ? (3) 10 µ? (min) + Cu++ 5 µ? 0 5.5510.22 5.62+0.85 7.38+2.69 1.62+4.1 2.36+5.2 4 5 30 2.85±2.80 3.24+1.93 -2.0919.59 2.59+2.96 3.75+3.02 60 25.92113.53 18.89+7.84 7.2114.53 5.65+2.5 5 1.38+2.64 90 88.97+3.03 73.7911.40 7.13+3.76 4.40+1.1 3 0.8212.31 120 131.94+4.81 138.28+2.75 11.69+7.30 3.5712.23 2.48+2.55 180 137.86126.03 155.66+21.85 79.63127.82 4.15+2.8 7 6.2216.83 3.3 Efecto en lisis de glóbulos rojos inducida por radical peroxilo (RBC) Métodos La sangre venosa hep'arinizada recientemente recolectada (10 mi, en hielo) se formó alícuotas en tubos eppendorf estériles de 1.8 mi y se centrifugó por 10 minutos a 2600 rpm en 4°C. El plasma y las capas de capa leucocitaria se removieron (aproximadamente 900µ1) y los glóbulos rojos empacados (RBC) se lavaron luego por la adición de 900µ1 de PBS enfriado en hielo, estéril. Este procedimiento de ' lavado se repitió dos veces. Los RBC empacados se re-suspendieron por la adición de 900µ1 de PBS estéril, enfriado en hielo (y denominado solución de reserva RBC) . Las soluciones de reserva RBC se almacenaron a 4°C durante un máximo de tres días. Todas las suspensiones de trabajo de RBC se prepararon frescas diariamente al diluir 200µ1 de reserva RBC en 10ml de PBS estéril, enfriado en hielo y 50µ1 agregado a cada pozo.
Las soluciones de reserva de AAPH se' prepararon frescamente para experimentos individuales como sigue. AAPH (1.22 gm) se disolvió en 7.5 mi de PBS para proporcionar una solución de reserva 4 x en 600 mM y alícuotas 50 µ? (concentración final de 150 mM) se agregaron luego a cada pozo para iniciar el ensayo de lisis. Las soluciones de reserva de compuestos de prueba (40 mM en DMSO al 100%) se diluyeron en PBS estéril para proporcionar concentraciones finales de 100, 30 y ??µ? por pozo. Los controles apropiados se incluyeron en cada experimento. Las diluciones se ajustaron para dar concentraciones DMSO finales en cada pozo de 0.25%. Los ensayos de lisis RBC inducidos por per xilo se realizaron en placas de microtitulo de 96 pozos de fondo plano con un volumen total de 200µ1 por pozo. La turbiedad de las suspensiones RBC se monitoreó usando un lector de microplaca Tecan a 690 nm (37 °C) con agitación suave. Los ensayos se realizaron por cuadruplicado y las lecturas se tomaron cada 5 minutos durante 5 horas. Las curvas de lisis RBC se construyeron al trazar absorbancia (media de 4 lecturas) contra el tiempo. La · lisis a la. mitad del tiempo se calculó al tomar la lectura de absorbancia mayor (sin lisis) y la lectura de absorbancia menor (lisis máxima) . La suma de estas dos lecturas dividida por dos da la absorbancia en la mitad de lisis. El análisis de regresión simple se usó para calcular el tiempo en el cual absorbancia de la mitad de lisis ocurre.
Resultados Como se muestra abajo en la Tabla 16, el compuesto (1) demuestra la actividad antioxidante al retrasar el tiempo inducido por AAPH a la mitad de lisis de glóbulos rojos.
Tabla 16: Tiempo tomado para alcanzar la mitad de lisis después de la incubación con compuestos de prueba en ??µ? (min) Ejemplo 4 - Actividad inmunomoduladora La artritis reumatoide ¦ es un trastorno crónico, inflamatorio, multisistémico, autoinmunitario que usualmente se manifiesta con poliartritis. La patogénesis implica un 'ataque' mediado por células T en la membrana sonovial. La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) se considera que es una respuesta inmunitaria inapropiada en individuos genéticamente susceptibles como el resultado de una interacción compleja entre factores ambientales, factores microbianos, y el sistema inmunitario intestinal. Ambas enfermedades se tratan frecuentemente con una combinación de anti-inflamatorio y terapias inmunosupresoras . Los compuestos seleccionados de la invención por lo tanto se probaron con objeto de determinar si tienen actividad inmunosüpresora además de la actividad anti-inflamatoria .
Métodos Ratones machos Skh-1:HR1 (sin pelo), de aproximadamente seis semanas de edad se sacrificaron por dislocación cervical. Las suspensiones de célula sencillas se hicieron del bazo y los eritrocitos se Usaron en solución amortiguadora (0.14M NH4C1, 17mM Tris, pH 7.2). Los esplenocitos restantes se cultivaron en RPMI-1640 (Gibco) complementado con 10% (v:v) FBS , 200mM L-glutamina, penicilina/estreptomicina y 50mM 2-mercaptoetanol . Los esplenocitos se agregaron a pozos cuadruplicados que contienen ya sea concanavalina A (ConA, Sigma-Aldrich 0.4yg/pozo), LPS (Sigma-Aldrich -1 yg/pozo) o mitógeno 'no, también ??µ? de compuesto de prueba en DMSO. Las muestras se analizaron después de una incubación de 3 días a 37 °C en C02 al 5% en aire. El metiltiazoltetrazolio ( TT) se bio-reduce por células viables en un producto de color formazán que es soluble en DMSO. Asi la cantidad de producto formazán es directamente proporcional al número de células vivas en cultivo, y se pueden medir usando un espectrofotómetro a 570nm. MTT se agregó a cada pozo, se incubó por 4hrs adicionales y luego se desarrollo color con HC1 0.04N en isopropanol. Los sobrenadantes de cultivo se almacenaron después de la colección a -80°C y ambas células T y B se analizaron por ELISA (BD Biosciences) por IFN-? (una citoquina Th-1) y solo por células T, IL-6 (una citoquina Th-2) .
Resultados Los compuestos (1) y (3) se examinaron en dos ratones individuales cada uno. El compuesto (1) fue marcadamente y significativamente inmunosupresor a las células T y a un grado menor, células B. Este efecto se evidenció además por una reducción concomitante en la síntesis de INF-? y IL-6 en el sobrenadante (ver Figuras 2 y 3) .
En contraste, compuesto (3) tuvo poco efecto en: números de célula, pero si disminuyó las citoquinas producidas por células T en particular.
Ambos compuestos (1) y (3) por lo tanto parecen tener atributos inmunosupresores .
Ejemplo 5 - Actividad cardioprotectora Como se discutió arriba, la actividad anti-inflamatoria por medio de inhibición COX se asocia con un incremento en la ocurrencia de eventos cardiovasculares adversos. Esto se puede mediar por la inhibición de prostaciclina (PGI2) o la tendencia para la inhibición de COX-2 selectivo para proporcionar un incremento en PGH2, el sustrato para el tromboxano pro-trombótico A2. 5.1 Efecto en producción de prostaciclina El PGI2 es el principal producto COX de células endoteliales, producido de PGH2 por la acción de la sintasa de prostaciclina de enzima.
Sus acciones de vasodilatación e inhibición de agregación de plaquetas se pueden considerar antitrombóticas. El PGI2 adicionalmente protege de la enfermedad cardiovascular por efectos pleiotrópicos en células de músculo liso vascular (VSMC) . La eliminación genética del receptor de prostaciclina en ratones reduce el desarrollo de ateroesclerosis , hiperplasia intima y restenosis, posiblemente por medio de inhibición PGI2 de proliferación VSMC y migración. Su producción se inhibe indirectamente por NSAIDs, por medio de inhibición de COX, y es este efecto que contribuye al incremento en eventos cardiovasculares adversos asociados con todos los NSAID. Por lo tanto, un atributo cardioprotector deseable de un agente anti-inflamatorio seria la falta de inhibición de síntesis PGI2 endotelial.
Métodos Las células e.ndoteliales de vena umbilical' humana cultivada (HUVECs - . Vascular Biology Laboratory, Hanson Institute, Adelaide SA) se removieron cosechadas en tripsina-EDTA al 0.25%. Después de enfriar y además lavar en PMI- FCS al 10%, las células se re-suspendieron en medio fresco en células 1-1.5 x 105 por mi y colocaron en placas en pozos recubiertos de gelatina en 2 mi por pozo. Después de la incubación durante la noche en CO2 al 5% a 37°C, el medio se restauró y las células volvieron a la incubadora y se permitió equilibrar por aproximadamente 2h. Los compuestos de prueba en concentraciones de 0, 1, 10 o 100 µ se agregaron a las células, y 30 minutos más tarde, se estimularon por interleucina-1 ß (IL-1 ß - ??µ? de una solución 2 ng/ml). Después de incubación durante la noche a 37°C, los sobrenadantes se colectaron por centrifugación a 2000 rpm por 5min y almacenaron a -20 °C. La producción de prostaciclina después de la incubación durante la noche se midió por radioinmunoensayo (RIA) . Debido a que PGI2 es inestable en medio acuoso, el producto de hidrólisis estable 6-ceto PGFia se midió como un marcador indirecto. Los resultados se expresan como media ± SEM, n = 3. Las diferencias entre las medias se analizaron por ANOVA de una vía seguido por prueba de Tukey para comparaciones múltiples. Las diferencias entre las medias se consideraron como significativas cuando p < 0.05.
Un efecto en el crecimiento celular se observó microscópicamente en 100 µ? pero no en las dosis más bajas. Los HUVECs normales fueron predominantemente epitelioides pero incluyen algunas células en forma fusiforme. Las células fueron principalmente saludables y viables, como se indica por su apariencia translúcida y la adhesión a la placa de cultivo. Las células flotantes fueron supuestas no ; viables. El crecimiento confluente en la región central de los pozos resultantes en la apariencia de "empedrado" clásica. En áreas no confluentes, células adherentés tuvieron una apariencia "apariencia".
Resultados La referencia a la Tabla 17 abajo muestra que el compuesto (1) no tuvo efecto en ?µ?, pero una inhibición significativa se produjo en las concentraciones mayores de 10 µ? y 100 µ?, mientras que el Compuesto (3) no tuvo ningún efecto en cualquier concentración probada.
Tabla 17: Efecto de compuestos de prueba en síntesis 6-ceto PGFla en HUVECs estimulados por IL-?ß * significativamente diferente de control (?µ?) (P<0.05) Microscópicamente, las células probadas con compuesto (1) y compuesto (3) parecieron saludables. La implicación terapéutica es que en concentraciones fisiológicamente importantes, los compuestos (1) y (3) tendrían una actividad pro-trombótica mínima si es que la hay. 5.2 Efecto en tromboxano y síntesis de prostaglandina TXA2 producido en plaquetas activadas por TXS tienen propiedades pro-trombóticas por la estimulación de agregación de plaquetas y vasoconstricción. Inhibir TXS selectivamente podría por lo tanto ser anti-trombótico . Esto podría ser evidenciado por un cambio de vía de sustrato para permitir un incremento en la síntesis de PGE2 - El efecto de compuestos de • prueba se examinó en monocitos humanos y la línea celular de macrófago de murino, RAW.264.7. La actividad inhibidora COX sería evidente por la inhibición sustancial de tanto PGE2 como TXB2.
Método 1 - Monocitos humanos Las células U937 se descongelaron y re-suspendieron en RPMI y FCS al 10% en 2 x 105 células por mi. Las células se incubaron en C02 al 5% a 37 °C y expandieron en cultivo de crecimiento a al menos 6.4 x 107 células totales. Las células se re-suspendieron luego en medio fresco y cultivado con ácido retinoico 5µ? (RA) a 2 x 105 células por mi durante 3 días adicionales (72h) . Las células tratadas con RA se lavaron 2x en RPMI libre de suero y re-suspendieron en medio libre de suero a 5 x 106 células por mi. Las células se formaron alícuotas en tubos de Teflón en lml por tubo. Las soluciones de reserva de trabajo de compuestos (1) y (3) se prepararon a O.lmM, lmM y lOmM como se describió arriba. Para cada dilución de trabajo, 10 µ? se agregaron a lml de células para alcanzar una concentración final de 0 (solo DMSO) , 1, 10, y ???µ? para cada compuesto de prueba. Las células se incubaron por triplicado con cada concentración de compuesto de prueba por 15 min a 37°C. Después de 15 min de pre-incubación, cada tubo de lml de células recibió 5 µ? de una solución lOOmM del ionóforo de calcio A23187 (para alcanzar A23187 0.5µ?). La incubación a 37°C se continuó por 30 min adicionales. Después de la incubación, los sobrenadantes se colectaron por centrifugación a 2000rpm por 10 min y almacenaron a -20°C hasta que se requirió para el análisis.
Resultados La referencia a las Tablas 18 y 19 abajo muestran que en la dosis mayor de ???µ?, los compuestos (1) y (3) inhiben la síntesis de ambos eicosanoides , que fue probablemente debido a citotoxicidad . Sin embargo, en las concentraciones más bajas, los compuestos (1) y (3) tienden a incrementar la síntesis de PGE2, con poco efecto en TXB2. Así, se puede razonar que no tienen actividad inhibidora COX.
Tabla 18: Efecto de compuestos de prueba en síntesis PGE2 en células U937 estimuladas con RA Método 2 - Linea celular de macrófago de murino, RAW 264.7 La línea celular de macrófago de ratón RAW 264.7 se cultivó en DMEM complementado- con suero de bovino fetal (FCS) , glutamina 2mM y 50U/ml penicilina/estreptomicina. Las células se trataron con cualquiera de los compuestos de prueba (en DMSO 0.025%) o solo vehículo, y se' les agregaron una hora antes LPS 50ng/ml.
Después de la incubación por 16hrs, el medio de cultivo se colectó al medir PGE2 o TXB2 por ELISA (Cayman Chemical), y medición TNFa usando un ELISA (Becton Dickinson) .
Resultados Como se muestra en las Tablas 20 y 21 abajo, en ??µ?, compuesto (1) reduce la síntesis de PGE2. Sin embargo, este efecto se puede haber influenciado por toxicidad en RAW 264.7, donde el IC50 es 53.9 1 1.2µ?. De lo contrario, como con la línea celular monocítica humana, no hay evidencia de inhibición de COX por el compuesto (1). Los Compuestos (1) y (2) tienen poco efecto en la viabilidad de células RAW 264.7, y por lo que se puede concluir que mostraron evidencia de actividad inhibidora COX débil solamente, en este ensayo.
Tabla 20: Efecto de compuestos de prueba en síntesis PGE2 en RAW 26 .7 Compuesto PGE2 (pg/ml) ?µ? ?µ? 10µ (1) 2973.71±406.9 : 2601.37±153.53 847.961144.83 (2) 4522.7+116.43 3180.371127.29 2070.691168.81 (3) 3416.45±286.45 .2890.021320.91 2031.431261.59 Tabla 21: Efecto de compuestos de prueba en síntesis TXA2 en RA 264.7 Hubo poco efecto en la síntesis de TNFa como se muestra en la Tabla 22 abajo.
Tabla 22: Efecto de compuestos de prueba en síntesis TNFa en RAW 26 .7 5.3 Actividad vasodilatadora en la técnica ensayo de anillo aórtico La capacidad vasodilatadora de los compuestos de la fórmula (1) se examinó ex situ usando el ensayo de anillo aórtico de rata. La adición de noradrenalina al baño de prueba causa los anillos para contratar, y si esa vasoconstricción se inhibe por un agente de prueba esto es, antagoniza el efecto de noradrenalina, esto suguiere' que ese agente puede tener actividad vasodilatadora.
Métodos Las ratas Sprague-Dawley machos (250 ± 50g) se sacrificaron con C02 al 80%· y O2 al 20%. La aorta torácica se extirpó y rápidamente montó en baños de órgano como describe (Chin-Dusting et al. 2001). Curvas contráctiles de concentración completa se obtuvieron para noradrenalina ( 0. InM-lOmM) con y sin compuestos de prueba liberados en una concentración de lpg/ml. Los experimentos se repitieron en n = 5 diferentes anillos de 5 diferentes animales. Solamente un compuesto en cualquier concentración se probó en cualquier anillo de cualquier animal. Las curvas de respuesta de dosis sigmoidal se equiparon para los datos y el logECso calculado (Software Prisma 4, GraphPad) . La^ diferencia en estos valores entre la presencia y ausencia de compuesto de prueba se calculó usando una prueba t emparejada de dos colas. Los efectos de ß-estrodiol y vehículo solo se examinaron . como un control positivo y negativo respectivamente.
Resultados .El Compuesto (1) (p = 0.045) significativamente inhibe la respuesta contráctil (logEC50) del anillo aórtico a noradrenalina comparada con solo vehículo por 23% (ver Figura 4 y 5) .
Ejemplo 6 - Farmacocinética Métodos Los perfiles farmacocinéticos (PK) de compuestos (1) y (3) se examinaron después de la administración oral en PEG 400/PBS 1:1 en una dosis de 25mg/kg. Para cada experimento, tres animales se asignaron por punto de tiempo (15 min, 30 min, 60 min, 90 min, 4 hr y 24 hr) . Los ratones se sacrificaron usando dislocación cervical y suero recolectado por medio de punción cardiaca. La heces y la orina, cuando estuvieron disponibles, también se recolectaron. Las muestras se almacenaron a -80°C y analizaron por LC- S en alojamiento. El límite de detección fue 20ng/ml.
Resultados Como se ve en la Tabla 23 abajo, mientras que [max] ni tampoco AUC del compuesto .(1), para niveles libres o totales fueron particularmente altos en la circulación, la cantidad excretada en orina fue relativamente alta, sugiriendo que se absorbió bien pero rápidamente se excreta. La relación de conjugación es relativamente baja a 33%. También hubo una sugerencia de un pico bifásico, ' con el ' segundo en 90 min posterior a la administración, que sugiere la posibilidad de alguna circulación enterohepática .
En la Tabla 23 (y Tabla 24), "AUC" representa el área bajo la curva de concentración de suero ' contra tiempo, expresada como pM*hora/L. Este número evalúa la absorción y liberación en una forma relativa. Cuanto mayor sea el número, más del compuesto se absorbe y más largo ha permanecido en circulación. "AUCubre" se refiere al área bajo la curva para análogo sin conjugar o libre, mientras que "AUCtotai" se refiere al área bajo la curva para el análogo, libre y conjugado combinado. " [max] " se refiere a la concentración máxima observada en suero. Estas mediciones también dan algún entendimiento de' qué tan bien un compuesto se absorbe. Sin embargo, no tiene en consideración la rapidez con que ya sea se conjuga y/o excreta, de manera que un compuesto puede tener una muy baja concentración máxima, aunque todavía se absorbe bien.
La relación del AUCiibre al AUCtotai da una medida relativa de la cantidad del compuesto administrado esto es, 1 'libre' permanece ya sea en circulación comparado con cuanto del compuesto se conjuga. Por lo tanto, si la relación es relativamente alta, esto sugiere que ' mucho del compuesto permanece sin conjugar, mientras que si la relación es relativamente baja, se sugiere que la conjugación (y asi tal vez la excreción urinaria) ocurre rápidamente. "tl/2" es la vida media, esto es, el tiempo tomado para la concentración de suero para caer a la mitad. La eliminación de un fármaco es usualmente un proceso exponencial (logarítmico) , de modo que una proporción constante se elimina por tiempo de unidad. Estos datos se generaron por regresión no lineal, usando una ecuación para una fase de decaída exponencial. La primera se refiere a la tl/2 del análogo no conjugado y la segunda el tl/2 del análogo total (libre más conjugado).
Tabla 23: Perfil PK de compuesto (1) después de una dosis oral sencilla en ratones Los datos en la Tabla 24 abajo muestran que el compuesto (3) parece ser menos bien absorbido que el compuesto, (1), al menos cuando se libera ' en este vehículo . a ratones a pesar de que su AUCtotai es mayor que el del compuesto (1), la concentración máxima observada en circulación es mucho menor. Mientras que la relación de conjugación parece mayor, la vida media puede ser menor que la del compuesto (1).
Tabla 24: perfil PK del compuesto (3) después de una dosis oral sencilla en ratones Ejemplo 7 - Toxicidad en células normales Métodos Prepucio de fibroblastos neonatos humanos (NFF - un obsequio de Dr. Peter Parsons, Queensland Institute of Medical Research) o células de riñon de conejo (RK- 13 - un obsequio de Prof. Miller halley, Macquarie University) se sembraron en placas de 96 pozos y cultivaron en RPMI complementado con FCS al 10% (CSL, Australia), penicilina (100U/ml), estreptomicina (100mg/ml), L-glutamina (2mM) y bicarbonato de sodio (1.2 g/L) a 37°C y C02 al 5% por 24 horas hasta que las células han enlazado y entrado en la fase log de crecimiento. Los compuestos de prueba se agregaron en diluciones en serie de dos veces de 150µ? en triplicado e incubaron durante 5 días adicionales. MTT se agregó . luego a cada pozo, incubó por 3 horas a 37°C, después de le cual el medio se notificó completamente.. Después de la adición de DMSO, la absorbancia para cada pozo se leyó en un lector de placa. Los ensayos se repitieron al menos dos veces.
Resultados Como se muestra abajo en la Tabla 25 a continuación, los compuestos (1), (2) y (3) fueron sin toxicidad en RKs en la concentración mayor probada. El compuesto (1) demuestra toxicidad media a NFFs, mientras que los compuestos (2) y (3) se pueden considerar "no tóxicos".
Tabla 25: Efecto de los compuestos de prueba en viabilidad celular normal (IC5o_ uM) Compuesto NFF RK (1) 64.1±9.6 150.0±0 (2) 145.3±8.1 150.0+0" (3) 111.2167.1 150.0±0 Ejemplo 8 - Actividad en lineas celulares de cáncer Métodos La linea celular colorrectal humana HT-29 (HTB-38™) , lineas de próstata humanas PC-3 (CRL-1435™) y DU-145 (HTB-81™), y la linea de melanpma humana SK-Mel-28 (HTB.-72™) se cultivaron en medio RPMI 1640 (Gibco, Cat#21870-076) .
La linea celular de próstata humana LNCaP Clon FGC (CRL-1740™) , linea celular leucocémica humana CCRF-CEM™ (CCL-119™) linea celular adenocarcinoma colorrectal humana HCT-15 (CCL-225™) y las lineas celulares de cáncer de pulmón humanas NCI-H23 (CRL-5800™) y NCI-H460 (HTB-127™) se cultivaron en RPMI 1640, complementado para contener lOmM HEPES (Sigma, Cat#H0887), 4.5g/L Glucosa (Sigma, Cat#G8769) y 1 mM Piruvato de sodio (Sigma, Cat#S8636) .
La linea celular de melanoma humana MM200 se obtuvo como un obsequio del Prof. Peter Hersey (University of Newcastle) y se cultivó en medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) (Gibco, Cat#l 1960-069) .
Las lineas celulares de melanoma humanas MM96L se obtuvieron como obsequio del Profesor Peter Parsons (Queensland Institute of Medical Research) y se cultivó en RPMI 1640.
Las lineas celulares de cáncer de ovario humano A2780 y CP70 se obtuvieron como obsequios del Dr. Gil Mor (Yale University) . A2780 se cultivó en medio RPMI 1640. CP70 se cultivó en DMEM/Hams F-12 1:1 (Gibco, Cat#l 1320-082) complementado con lOmM HEPES, lx sin aminoácidos esenciales (Sigma, Cat#M7145), 5.0g/L bicarbonato de sodio (Sigma, Cat#S5761), y piruvato de sodio lmM.
La linea celular de cáncer de mama MDA-MB-468 (HTB-132™) se cultivó en DMEM/Hams F-12 1:1. La linea celular de cáncer pancreático humana, HPAC (CRL-2119™) se cultivo rutinariamente en DMEM/Hams F-12 1:1 y complementó con 15mM HEPES , 0.002 mg/ml insulina (Sigma, Cat#I9278), 0.005mg/ml transferrina (Sigma, Cat#T8158), 40ng/ml hidrocortisona (Sigma, Cat#H0135) y 10 ng/ml factor de crecimiento epidermal (Sigma, Cat#E4269) .
La linea celular de Glioma humana Hs 683 (HTB-138 ™) se cultivó en DMEM. | Todos los cultivos con la excepción de HPAC y CP70 se complementaron con 2mM L-Glutamina (Gibco, Cat#25030) Todos los cultivos se complementaron con FBS 10%; (Gibco, Cat#10099-158) , 5000 U/ml penicilina y 5mg/ml estreptomicina (Gibco, Cat# 15070), y cultivaron a 37°C en una atmósfera humificada de 5% C02. : Todas las lineas se adquirieron de ATCC (Maryland, USA) excepto donde se indique.
Los valores IC50 se determinaron para cada linea celular. Las células se sembraron en placas de 96 pozos' en una densidad celular apropiada como se determinó de análisis de cinéticos de crecimiento y · cultivaron por 5 días en la ausencia y presencia de los compuestos de prueba. La proliferación celular se evaluó después de la adición de 20 µ? de bromuro de tetrazolio 3-4,5 dimetiltiazol-2 , 5-difenilo (MTT, 2.5 mg/ml en PBS, Sigma) por 3-4hrs a 37°C de acuerdo a las instrucciones del fabricante. Los valores IC50 se calcularon de de parcelas semi-log de % de proliferación de control en el eje y contra dosis log en el eje x.
Resultados Como se muestra en la Tabla 26 abajo, compuesto (1) demuestra actividad (esto es, IC50 <20µ?) en un número de lineas celulares de cáncer. Los compuestos (2) y (3) fueron menos activos.
Tabla 26: Efecto de los compuestos de prueba en inhibición lineas celulares de cáncer Referencias Boyum, A. (1986) . "Separation of leukocytes from blood and bone marrow." Scand J Clin Invest 21: 77-89.
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Claims (22)

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención, se considera como novedad, y por lo tanto se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES
1. Un compuesto de la fórmula general (I) : caracterizado porque: R2, R3 y se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi, OR9, OC(0)R9, OSi(Rio) 3» alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C7, amino, aminoalquilo, arilo, arilalquilo, alquilarilo, tiol, COOH, alquiltio, , nitro, ciano, halo, alquenilo C2-C6, alquinilo C2-C6 y heteroárilo, Re es Rn (R12)N(CH2)n-, R7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, R9, C(0)R9, Si (Rio) 3 y cicloalquilo C3-C7, R8 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1-C10, cicloalquilo C3-C7, arilo, arilalquilo, nitro, ciano y halo, R9 se selecciona del grupo que consiste de: alquilo Ci- C ío , haloalquilo, arílo, arilalquilo y alquilarilo, Rio se selecciona independientemente del grupo que consiste de: alquilo C1 -C 10 y arilo, Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C 1 -C 10 y -Y-CO2R13, o Ru ' y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5, 6 o 7 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C1- C10 , alquenilo C2-Ce, alquinilo C2-Cs, COOH , COOR10 , halo, nitro, ciano y arilo, R13 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, cicloalquilo C3-C7, alquilo C1 -C 10 , alquenilo C2-C& y alquinilo C2~C 6 , Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 1.5 átomos de carbono que opcionalmente se pueden interrumpir por uno o más átomos de oxigeno, nitrógeno o azufre, n es un entero entre 1 y 4, el dibujo " " representa ya sea un enlace sencillo o un enlace doble, y sales de los mismos.
2. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo C1 - C10 , halo, hidroxi, OR9, OC(0)R9 y OSi(Ri0)3-
3. El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 o reivindicación 2, caracterizado porque R2, R3 y R4 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: hidrógeno, hidroxi y OR9.
4. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 3, caracterizado porque R7 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, C (O) Rg y alquilo C 1 -C 10 .
5. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 4, caracterizado porque R8 se selecciona del grupo que consiste de: hidrógeno, alquilo Ci~ C 10 y halo.
6. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 5, caracterizado porque R9 se selecciona del grupo que . consiste de: alquilo C1 -C 10 , haloalquilo y arilo.
7. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 6, caracterizado porque Rio es alquilo C1 -C10 .
8. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 7, caracterizado porque Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13, hidrógeno y alquilo C1 -C10 , o Rn y Ri2 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 o 6 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo Ci-Cio , COOH , COORio y halo.
9. El compuesto de conformidad con . la reivindicación 8, caracterizado porque ' Rn y R12 se seleccionan independientemente del grupo que consiste de: -Y-CO2R13, hidrógeno y alquilo C1-C6, o Ra y R12 junto con el nitrógeno al cual se enlazan forman un anillo heterociclico que comprende 5 o 6 miembros en el anillo, el anillo heterociclico que se sustituye opcionalmente con uno o más sustituyentes seleccionados del grupo que consiste de: alquilo C : -C i0 , COOH y halo.
10. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 9, caracterizado porque Y es una cadena de hidrocarburo que tiene entre 1 y 6 átomos de carbono .
11. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 10, caracterizado porque Ri 3 es alquilo C1-C6.
12. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 11, caracterizado porque n es 1, 2 o 3.
13. El compuesto de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 12, caracterizado porque al menos uno de R2, 3 y R4 es hidroxi.
14. Un compuesto de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque es compuesto (1), (2), (3), '(4),' (5), (6) , (7) u (8) .
15. Una composición farmacéutica caracterizada porque comprende un compuesto de la fórmula (I) de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, y un portador, diluyente y/o excipiente farmacéuticamente aceptable.
16. Un método para la prevención y/o tratamiento de inflamación y/o una enfermedad inflamatoria o trastorno en un sujeto que necesita del mismo, el método caracterizado porque comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
17. El uso de un compuesto de la fórmula . (I) de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como un antioxidante.
18. Un método para la modulación del sistema inmunitario en un sujeto, el método caracterizado porque comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) de conformidad' con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
19. Un método para inhibir la proliferación de células, el método caracterizado porque comprende poner en contacto las células con un compuesto de la fórmula (I) de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
. 20. Un método para la prevención y/o tratamiento de cáncer en un sujeto que necesita del mismo, el método caracterizado porque comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (I) de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
21. El método de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque el cáncer se selecciona del grupo que consiste de: cáncer de ovario, leucemia, cáncer de próstata, cáncer colorrectal, cáncer pancreático, glioma, melanoma y cáncer de pulmón.
22. Un método para la prevención y/o tratamiento de enfermedad cardiovascular en un sujeto que necesita del mismo, el método caracterizado ' porque comprende la administración al sujeto de una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto de la fórmula (!) de conformidad con una de cualesquiera de las reivindicaciones 1 hasta 14 o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.
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