KR20120008056A - 산화 스트레스 조절제(ｏｓｍ)를 포함하는 약제학적 활성 조성물, 신규한 화학 물질, 조성물 및 용도 - Google Patents

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콜비 파마수티컬 컴퍼니
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Abstract

제약학적 조성물 및 약제 및 이러한 제약학적 조성물 및 약제를 염증 및 암의 치료에서 사용하는 방법이 본 명세서에 기재된다.

Description

산화 스트레스 조절제(ＯＳＭ)를 포함하는 약제학적 활성 조성물, 신규한 화학 물질, 조성물 및 용도 {PHARMACEUTICALLY ACTIVE COMPOSITIONS COMPRISING OXIDATIVE STRESS MODULATORS (OSM), NEW CHEMICAL ENTITIES, COMPOSITIONS AND USES}
교차-참조
본 출원은 2009년 4월 17일자로 출원된 미국 가특허출원 일련번호 제61/170,555호에 대한 이익을 주장하며, 상기 문헌은 본 명세서에 전체가 참고문헌으로 포함된다.
발명의 분야
산화 스트레스 조절제(Oxidative Stress Modulator, OSM), 다양한 형태의 산화(oxidation)/환원(reduction) (산화환원(redox)), 질산화 또는 산화 스트레스-유발된 용태, 염증; 포유류 전립선, 신장, 간, 뇌, 입, 두경부, 인두, 식도, 위, 결장, 직장, 생식선, 유방, 폐, 및 췌장암종 그리고 혈액 및 줄기세포, 암 줄기세포 및 외배엽, 내배엽, 중배엽 원시세포에서 유래한 세포를 포함하는 다른 세포의 암을 포함하지만 이제 제한되지 않는 증식증 및 종양형성에서의 용도가 본 명세서에 개시된다. 화합물은 하나 이상의 특화된 퀴논, 하이드로퀴논, 디하이드로퀴논, 플라스토퀴논, 퀴놀, 크로만올, 크로마논 또는 특정한 다른 변형된 퀴논, 템폴, 트리테르펜, 디아민, 테트라사이클렌을 포함하는 최소한 하나 이상의 항산화제-유사 기능적 신호전달 모이어티 또는 관련된 기능적 신호전달 크로만-모이어티를 포함한다. 이들 화합물의 일부는 (a) 아무것도 가지지 않고, 또는 일부는 (b) 화학적으로-연결되고 규정된-길이로 공유적으로-결합된 화학적 링커를 가지고, 이들 중 일부는 (b1) 부착된 핵-수송(translocating) 화합물을 가지거나 대안으로 일부는 (b2) 미토콘드리아-수송 화합물을 가지며, 이 화합물은 (b2α) 하나 이상의 4차 양이온 모이어티를 포함하거나 (b2β) 하나 이상의 특정하게 규정된 프틸 사슬을 포함하거나 (b2γ) pH 민감성 카바마이드 링커를 포함하며, 이들 모두는 여러 다양한 공지된 탄소 원자 길이를 가진다. 산화 스트레스를 조절하는 조성물 및 용도가 청구된다.
본 개시는 또한 산화 스트레스 조절제(OSM)를 포함하는 약제학적 조성물 및 이를 이용하는 방법에 관련된다. 특히, 본 발명의 약제학적 조성물은 약제학적 활성 화합물 및 약제학적 활성 화합물의 생체 내 산화적 분해를 감소시키는 OSM을 포함한다.
발명의 배경
전형적으로, 산화 스트레스는 다음의 세 요인 중 하나의 결과로 세포에 부과된다: (1) 산화제 발생의 증가, (2) 항산화제 보호의 감소, 및/또는 (3) 산화적 손상 복구의 실패. 세포 손상은 반응성 산소 또는 질소 화학종(ROS)에 의해 유발된다. ROS는 산소 원자를 포함하는 반응성 음이온인 자유 라디칼이거나, 자유 라디칼을 생성할 수 있거나 자유 라디칼에 의해 화학적으로 활성화되는 산소 원자를 포함하는 분자이다. 예에는 하이드록실 라디칼, 수퍼옥사이드, 하이드로젠 퍼옥사이드, 퍼옥시니트라이트 등이 있다. 비록 ROS가 지방산의 과산화소체 β-산화, 외인성 화합물의 미소체 사이토크롬 P450 대사, 병원체 또는 지질다당류에 의한 식세포작용의 촉진, 아르기닌 대사, 및 조직 특이적 효소에 의해서도 역시 생산되지만, 생체 내 ROS의 주요 공급원은 유기 호흡이다. 보통의 조건에서, ROS는 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD), 카탈레이즈, 또는 글루타티온(GSH), 및 퍼옥시데이즈의 작용에 의해 세포로부터 제거된다. 세포의 주요 손상은 막 지질의 다불포화 지방산, 필수 단백질, 및 DNA와 같은 고분자의 ROS-유발된 변성에 기인한다. 또한, 산화 스트레스 및 ROS는 염증, 정신병, 신장 질환, 심혈관 질환, 식이-유발 비만 및 당뇨, 알츠하이머병, 파킨슨병, 루게릭병(ALs), 암, 섬유증, 및 노화와 같은 전염성 및 비전염성 질환 상태에 관련된다.
결과적으로, 이러한 질환들을 표적으로 하는 약제학적 활성 화합물(즉, 약물)은 생체 내 산화 또는 질산화 조건을 겪으며, 이에 의하여 최소한 일부분의 전구약물 또는 약물 또는 약물-관련 대사물질의 분해가 일어난다. 산화적 또는 질산화적 분해는 화학예방 또는 화학치료 용도로 이용가능한 약제학적 활성 화합물의 양을 효과적으로 감소시켜, 감소된 효과 또는 더 높은 투여 용량의 필요를 야기하고, 이는 생체 내에 존재하는 약제학적 활성 화합물의 더 많은 양으로 인한 원치 않는 부작용(들)의 발생 및/또는 강도를 증가시킬 수 있다.
약물 대사는 일반적으로 특화된 효소 시스템을 통한 약물의 대사, 약물의 생화학적 변형 또는 분해이다. 이것은 외인성 대사의 한 형태이다. 약물 대사는 흔히 친유성 화합물을 더욱 쉽게 배출되는 극성 생성물로 전환시킨다. 이의 속도는 약물의 약리학적 작용의 지속기간 및 강도의 중요한 결정요인이다. 약물 대사는 중독 또는 해독 - 화학 물질의 활성화 또는 비활성화를 야기할 수 있다. 두 가지가 함께 일어나기는 하지만, 대부분의 약물의 주요 대사물질은 해독 생성물이다.
약물은 거의 모두 외인성이다. 흔하게 사용되는 다른 유기 화학물질이 또한 외인성이고, 약물로서 동일한 효소에 의해 대사된다. 이는 약물-약물 및 약물-화학물질 상호작용 또는 반응에 대한 기회를 제공한다.
반드시 그럴 필요는 없지만, 제I상 반응이 보통 제II상보다 앞선다. 이들 반응 동안, 극체(polar body)가 도입되거나 노출되어, 본래의 화학물질의 (더욱) 극성인 대사물질을 생성한다. 약제학적 약물의 경우에, 제I상 반응은 약물을 활성화시키거나 아니면 또는 불활성화시킬 수 있다. 제I상 반응(비합성적 반응으로도 명명됨)은 산화, 환원, 가수분해, 고리화, 및 탈고리화 반응에 의해 일어날 수 있다. 약물 산화는 흔히 간에서 혼합 기능 옥시데이즈에 의해 수행되는 효소적 산소 첨가 또는 수소 제거를 수반한다. 이들 산화 반응은 전형적으로 사이토크롬 P450 모노옥시제네이즈(흔히 CYP로 약칭됨), NADPH 및 산소와 관련된다. 대사를 위해 이 방법을 사용하는 약제학적 약물의 부류에는 페노티아진, 파라세타몰, 및 스테로이드가 포함된다. 제I상 반응의 대사물질이 충분히 극성인 경우, 이들은 이 시점에서 쉽게 배출될 수 있다. 그러나, 많은 제I상 생성물은 빠르게 제거되지 않고, 내생성 기질이 새롭게 편입된 작용기와 조합하여 매우 극성인 결합체를 형성하는 후속 반응을 거친다. 보통의 제I상 산화는 C-H 결합이 C-OH로 전환되는 것을 포함한다. 이 반응은 때때로 약리학적으로 불활성인 화합물(전구약물)을 약리학적으로 활성인 약물로 전환시킨다. 마찬가지로, 제I상은 무독성 분자를 유독한 분자로 변화시킬 수 있다(독성화). 잘 알려진 한 예는 아세토니트릴, CH3CN이다. 위에서의 단순 가수분해가 아세토니트릴을 비교적 무해한 아세테이트 및 암모니아로 변환시킨다. 그러나 제I상 대사는 아세토니트릴을 HOCH2CN로 전환시키고, 이것은 포름알데히드 및 시안화수소로 빠르게 분리되는데, 이 두 가지는 모두 독성이다. 약물 후보의 제I상 대사는 비-효소 촉매를 이용하여 실험실에서 모의될 수 있다. 생체모방적 반응의 이러한 예는 흔히 제I상 대사물질을 포함하는 생성물의 혼합물을 제공하는 경향이 있다. 일반적으로 포합(conjugation) 반응(예를 들어, 글루쿠론산, 설포네이트(통상적으로 황산화(sulfation)로 공지임), 글루타티온 또는 아미노산과) 으로 공지인 제II상 반응은 일반적으로 사실상 해독이고, 제I상 대사물질의 극성 작용기의 상호작용을 포함한다. 포합 반응이 일어나는 약물 부위는 카르복실(-COOH), 하이드록실(-OH), 아미노(NH2), 및 설프하이드릴(-SH) 기를 포함한다. 포합 반응의 생성물은 증가된 분자량을 가지고, 흔히 활성 대사물질을 생성하는 제I상 반응과 달리 보통 비활성이다.
비록 모든 생물 조직이 약물을 대사하는 얼마간의 능력을 가지기는 하지만, 양적으로 간 세포의 활면소포체가 약물 대사의 주요 기관이다. 약물 대사에 대한 간의 기여의 원인인 요인에는 간이 큰 기관이고, 장에 흡수되는 화학물질에 의하여 관류되는 첫 번째 기관이며, 다른 기관에 비하여 간에 매우 높은 농도의 대부분의 약물-대사 효소 시스템이 존재한다는 것이 포함된다. 약물이 GI 관(여기서 약물이 간문맥을 통해 간 순환에 들어감)에 들어갈 경우, 약물은 잘 대사되고 초회 통과 효과(first pass effect)를 나타내는 것으로 전해진다. 다른 약물 대사 부위는 위장관, 폐, 신장, 및 피부의 상피 세포를 포함한다. 이러한 부위들은 보통 국지화된 독성 반응을 초래한다.
몇 가지의 주요 효소 및 경로가 약물 대사에 관여되고, 제I상 및 제II상 반응으로 나뉠 수 있으며,
·사이토크롬 P450 모노옥시제네이즈 시스템
·플라빈-함유 모노옥시제네이즈 시스템
·알코올 디하이드로제네이즈 및 알데하이드 디하이드로제네이즈
·모노아민 옥시데이즈
·퍼옥시데이즈에 의한 공산화
·전자 전달 연쇄, 대사, 호르몬, 화학물질, 및 다른 신호 전달 경로로부터의 퍼옥사이드 생성
에 의한 산화
또는
·NADPH-사이토크롬 P450 리덕테이즈
·환원된 (페러스) 사이토크롬 P450
에 의한 환원을 위한 시스템을 포함한다
환원 반응 동안, 화학물질이 자유-라디칼 전자를 획득한 다음 (수퍼옥사이드 음이온을 형성하기 위하여) 산소에 의하여 전자를 빠르게 잃는 무익 회로에 들어갈 수 있음에 유념해야 한다. 가수분해는 다음과 관련된다:
·에스터레이즈 및 아미데이즈
·에폭사이드 하이드롤레이즈
약물 대사에 영향을 미치는 요인은, 대부분의 친유성 약물의 약리학적 작용의 지속기간 및 강도가 친유성 약물이 비활성 생성물로 대사되는 속도에 의하여 결정된다는 것을 포함한다.
사이토크롬 P450 모노옥시제네이즈 시스템은 이런 점에서 가장 중요한 경로이다. 일반적으로, 약리학적으로 활성인 대사물질의 대사(예를 들어, 효소 유도)의 속도를 증가시키는 것은 어느 것이나 약물 작용의 지속기간 및 강도를 감소시킬 것이다. 반대 또한 참이다 (예를 들어, 효소 억제). 다양한 생리적 및 병리적 요인이 또한 약물 대사에 영향을 미칠 수 있다. 약물 대사에 영향을 미칠 수 있는 생리적 요인에는 연령, 개체 편차 (예를 들어, 약리유전학), 장간 순환, 영양, 장내 세균총, 또는 성별 차이가 포함된다.
일반적으로, 약물은 성인보다 태아, 신생아 및 나이든 인간 및 동물에서 더 느리게 대사된다. 유전적 변이(다형성)는 약물의 효과에서 변이성의 일부를 설명한다. 사이토크롬 P450 모노옥시제네이즈 시스템 효소가 또한 인종적 배경에 따라 개체마다 다를 수 있는데, 1 - 30%의 사람에서 결핍이 발생한다. 간, 신장, 또는 심장 질환을 포함하는 병리적 요인 또한 약물 대사에 영향을 미칠 수 있다. 컴퓨터 수행(In silico) 모델링 및 시뮬레이션 방법이 인간 대상에서 임상 연구를 수행하기 전에 가상의 환자 집단에서의 약물 대사가 예측되도록 할 수 있다. 이는 유해 반응으로부터 가장 위험한 상태에 있는 개체를 식별하기 위하여 이용될 수 있다.
질산화적 또는 산화 스트레스는 노화와 관련된 다양한 인간 병리 및 퇴행성 질환, 예컨대 파킨슨병, 암 및 알츠하이머병, 또한 헌팅턴 무도병, 식이-유발 비만, 당뇨병 및 프리드리히 운동실조, 그리고 감염, 염증 및 노화로써 축적된 비특이적 세포 손상에 기여하는 것으로 알려져 있다.
일부 기관의 세포 핵 및 세포질은 반응성 산소 화학종(Reactive Oxygen Species, ROS) 또는 반응성 질소 화학종(Reactive Nitrogen Species, RNS)으로부터 유래한 하이드로젠 퍼옥사이드, 수퍼옥사이드 음이온 및 하이드록실 라디칼의 대사적 공급원이다. 세포질, 미토콘드리아는 에너지 대사를 주로 담당하는 세포내 소기관이며, 또한 대부분의 세포 내에서 산화 스트레스 및/또는 손상을 초래하는 자유 라디칼 및 반응성 산소 화학종("ROS", 예컨대 하이드로젠 퍼옥사이드 및 수퍼옥사이드 라디칼 음이온(O2 -))에 기여하는 주요 세포질 ROS 공급원이다. 미토콘드리아는 항산화제 효소(퍼옥시레독신, 티오레독신, 및 GSH-의존성 퍼옥시데이즈)의 존재로 인한 하이드로젠 퍼옥사이드 해독을 위하여 대비된다. 전형적으로, 미토콘드리아 수퍼옥사이드(O2 -, O2의 하나의 전자 환원에 의하여 생성된 라디칼 음이온)은 아래 나타난 화학양론식에 따라, 미토콘드리아 기질 내에 배치된 망가니즈 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(manganese superoxide dismutase, MnSOD)에 의하여 불균등화된다.
Figure pct00001
그러나, 세포 RNS 또는 ROS 생성이 세포의 해독 능력을 초과할 경우, 산화적 손상이 일어날 수 있다. 이 손상은 미토콘드리아 기능 및 산화적 인산화를 붕괴시키고, 미토콘드리아, 다른 세포질 또는 핵 세포 단백질, DNA, RNA 및 인지질에 상당한 세포 손상을 일으켜 세포 손상, 산화, 염증, 증식증, 종양형성, 질환 및/또는 사망을 유발한다. 수퍼옥사이드는 또한 확산-제어 반응 속도로 일산화질소와 반응하여, 산화 및 질산화 반응을 통하여 단백질 및 DNA를 변형시킬 수 있는 퍼옥시니트라이트 및 퍼옥시니트릴과 같은 매우 강력한 산화제를 형성할 수 있다. 이러한 손상 및 병리적 역할 이외에도, ROS는 또한 산화환원 신호전달 분자(들)로서 작용하고, 급성 염증, 세포 증식, DNA 손상 회복, 유전적 오류 및 돌연변이를 촉진하여 만성 염증, 증식증, 또는 종양형성 및 암 또는 다른 질환을 유발한다.
자연적으로 발생하는 외생성 및 내생성 조직 반응성 산소 또는 질소 화학종(ROS)은 전립선, 결장, 림프종 및 췌장 발암에서 주요한 역할을 하는 것으로 공지이다. ROS는 티올-의존성 효소의 활성을 변화시키고, 세포 산화환원 균형을 바꾸며, 단백질을 공유적으로 변형시키고, DNA를 변형시키고 DNA에 돌연변이를 일으킨다. 고지방 식이를 하는 사람의 증가된 지질 과산화 및 비조절된 ROS의 생성이 개발도상국과 비교하여 선진국에서 전립선암이 더 많이 발생하는 주요 이유 중 하나임이 또한 나타났다. 최근 수년 간, 직접 실험 증거가 증가된 ROS 생성을 췌장 및 전립선 기관을 포함하는 다양한 조직에서 상응하는 돌연변이 및 종양 발생 증가와 연결시켰다. 예를 들어, Oberley 및 그의 동료들은 산화 스트레스 유발된 효소 및 악성 및 정상 인간 전립선 조직의 DNA 염기에 대한 산화성 손상을 모니터링했다. 악성 전립선 종양 조직은 정상 전립선 조직과 비교하여 현저하게 높은 산화 스트레스 및 ROS-유발 DNA 변형을 나타냈다. Ho 및 공동연구자들은 (Tarn et al, Prostate. 2006 Jan 1;66(1):57-69) 인간 전립선암의 잘 연구된 TRAMP(Transgenic Adenocarcinoma of Mouse Prostate) 전립선암 마우스 모델에서 발생하는 신생 전(pre-neoplastic) 병변에서 고 산화 스트레스 유발된 DNA 변형의 존재를 증명했다.
따라서, 개선된 약리학적 특성 및/또는 독성 프로파일을 가지는 전매(proprietary) 약물 또는 전구약물로서 항염증제, 항증식제, 항과형성제, 항퇴행제, 및/또는 항암제와 함께 핵 또는 세포질-외-미토콘드리아 또는 세포질-미토콘드리아-표적화된 항산화제 또는 유사한 조절제 약물에 대한 요구가 여전히 존재한다. 미토콘드리아에 표적화될 수 있거나 표적화될 수 없는 이러한 분자의 공급을 지향하는 것이, 아래에 개시되고 기재된 다양한 발명이 관련된 것이다.
동물 또는 인간 약물 요법에서 기능을 하기 위하여, 세포질-전달 및 외부-미토콘드리아-표적화된 또는 미토콘드리아-표적화된 분자는 바람직하게는 경구 투여 후에 환자의 세포 내에 전달되어야 한다. 외부-미토콘드리아 표적화에 있어서, 안드로겐 수용체의 리간드 결합 도메인(Ligand Binding Domain, LBD) (AR-LBD)이 핵으로 수송되는 막 또는 세포질 단백질이다. 표 I에 특정한 공지된 세포 시스템, 처리, 표적화된 테스트 화합물 및 시스템 결과가 기재된다.
표 1. 공지된 표적화 세포 시스템, 처리, 표적화된 테스트 화합물 및 시스템 결과
시스템 처리 화합물 결과
미토콘드리아 막 퍼옥시니트릴 MitoQ-C10 지질 과산화 감소
분리된 간 미토콘드리아 2가 철/아스코르베이트 MitoVE-C2 지질 과산화, 단백질 카르보닐 형성 감소 및 막전위 손실
분리된 간 미토콘드리아 2가 철/아스코르베이트 MitoQ-C10 지질 과산화 감소, 및 막전위 손실
분리된 간 미토콘드리아 2가 철/H2O2 MitoQ-C10 지질 과산화 감소
분리된 콩팥 미토콘드리아 수퍼옥사이드 MitoQ-C10 또는 MitoVE-C2 짝풀림(uncoupling) 단백질의 활성화 차단
저캇 세포 H2O2 MitoQ-C10 세포자멸 감소
저캇 세포 H2O2 또는 α-토코페릴 석시네이트 MitoQ-C10 세포자멸 감소
저캇 세포 H2O2 MitoVE-C2 세포자멸 감소
인간 제대 정맥 내피 세포 H2O2 MitoQ-C10 세포자멸 감소
돼지 대동맥 내피 세포 저산소증 MitoQ-C10 디클로로플루오레신 형광, 단백질 인산화 및 세포 증식 감소
소 대동맥 상피 세포 H2O2 MitoQ-C10 성장 인자 수용체 인산화 감소
소 대동맥 상피 세포 H2O2 또는 하이드로퍼옥시옥타데카디엔산 MitoQ-C10 또는 MitoVE-C2 복합체 I 및 아코니테이즈 억제, 세포자멸, 디클로로플루오레신 형광 감소.
트랜스페린 수용체 발현 및 철 흡수 감소. 미토콘드리아 및 프로테오솜 기능 보존
MRC-5 섬유모세포 과산소증 MitoQ-C10 디클로로플루오레신 형광, 및 텔로미어 단축 감소, 및 복제 수명 증가
정상 인간 일차 피부 섬유모세포 복합체 I의 부분적 억제 MitoQ-C10 미토콘드리아 지질 과산화 및 미토콘드리아 생성 감소
프리드리히 운동실조 환자 일차 피부 섬유모세포 글루타티온 고갈 MitoQ10 또는 MitoVE-C2 세포 사멸 감소
정상 레티날 색소 상피 세포주 (ARPE-19) 청색광 MitoQ-C10 디하이드로에티듐 산화 및 세포 사멸 감소
COS-7 세포 H2O2 MitoQ-C10 또는 MitoVE-C2 성장 인자 수용체 및 키네이즈 인산화 감소
래트 C6 신경아교종 세포주 망가니즈 클로라이드 MitoQ-C10 디클로로플루오레신 형광, 및 NF-κB 및 iNOS 발현의 지다당류 활성화의 MnCl2에 의한 향상 감소
인간 간모세포종 (Hep3B) 및 섬유육종 (HT1080) 세포주 저산소증 MitoQ-C10 저산소증-유발 가능 인자-1α의 안정화 및 디클로로플루오레신 형광 감소
래트 크롬친화세포종 (PC12) 세포주 혈청 제거 MitoQ-C10 세포자멸 감소
마우스 NIH/3T3 정상 마우스 세포주 외인성 인간 Mn-수퍼옥사이드 디스뮤테이즈의 유도 가능 발현 MitoQ-C10 내생성 Mn-수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 및 티오레독신-2의 유도 예방, 및 세포 성장 차단
일차 래트 심근세포 세로토닌 MitoQ-C10 비대 및 단백질 인산화 예방
마우스 N2O2 및 NeuD12 세포주 α-토코페릴 석시네이트 MitoQ-C10 세포자멸 감소
배아 래트 심장 세포주 (H9c2) 독소루비신 (아드리아마이신) 또는 H2O2 MitoQ-C10 세포자멸, 캐스페이즈 활성화, 디클로로플루오레신 형광 및 NFAT(활성화된 T 림프구의 핵 인자)의 핵 전좌 감소
마우스 대장세포 세포주 (YAMC) 도코사헥사엔산 및 부티레이트 MitoQ-C10 지질 과산화 및 세포자멸 감소
래트 일차 소뇌 과립 세포 에탄올 MitoVE-C2 디클로로플루오레신 형광 및 세포 사멸 감소
마우스 이자 샘꽈리 세포 콜레시스토키닌 MitoQ-C10 하이드로에티듐 산화 및 칼슘 진동 감소
HEK293 세포 및 래트 심근세포 리소포스파티딜콜린 MitoQ-C10 L-형 칼슘 흐름 활성화 감소
HeLa 세포 종양 괴사 인자-처리된 세포에 의해 생성된 H2O2 MitoQ-C10 종양 괴사 인자-처리된 세포에 가까운 세포의 사멸 감소
인간 결장암 세포주 (HCT116 및 RKO) 5-플루오로우라실 MitoQ-C10 또는 MitoVE-C2 5-FU 화학요법으로부터의 세포자멸 감소
발명의 요약
개시의 한 양태는 염증, 증식증, 종양형성, 질환 또는 이의 전조 장애를 가지는 것으로 진단된 포유류에게, 염증, 확대, 증식증, 종양형성, 질환 또는 이의 전조의 발생, 재발, 진행을 치료 또는 억제하기 위한 유효량으로, 항산화제와 조합으로 산화를 견딜 수 있는 화합물, 예를 들어, HDAC, 히스톤 디아세틸레이즈의 억제제 또는 독시루비신 또는 에토포시드와 같은 다른 항암 약물 또는 다른 약물을 투여하는 것으로 이루어진, 감염성 또는 비감염성 또는 진행성 질환 또는 암 또는 이의 전조 질환의 전이성 진행 또는 전이를 포함하는, 질환, 염증, 변성, 괴사, 증식증 또는 종양형성의 발생, 재발을 치료 또는 억제하기 위한 방법 및 조성물에 관한 것이다.
한 구체예는 HDAC 억제제 및 항산화제를 포함하는 복합물(combination)의 투여를 포함하는 암 치료 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 HDAC 또는 다른 억제제 내성 암 또는 다른 질환인 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 전립선암 또는 결장암에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 안드로겐-반응성 암, 생(live) 전립선 선암종 또는 간세포 암종인 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 반응성 산소 화학종의 증가된 수준을 특징으로 하는 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 예를 들어 세포에 의한 수퍼옥사이드 및/또는 하이드로젠 퍼옥사이드의 생성 속도 증가로부터 상승된 산화 스트레스 수준을 특징으로 하는 방법이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산에서 선택되는 방법이다.
또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 또는 비타민 E 유사체에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 전구약물, 플라스토퀴논 전구약물 또는 니트록사이드 전구약물에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 화학식 (I)의 화합물인 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 먼저 투여되는 방법이다. 또 다른 구체예는 비타민 E가 먼저 투여되는 방법이다.
항산화제 및 산화를 견딜 수 있는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 명세서에 기재된다. 한 구체예에서, 산화를 견딜 수 있는 화합물은 HDAC의 억제제이다. 한 구체예에서, 산화를 견딜 수 있는 화합물은 HDAC 억제제 및 항산화제 약물의 복합물을 포함하는 약제학적 조성물이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 또는 비타민 E 유사체, 플라스토퀴논 또는 플라스트퀴논 유사체, 템폴 또는 템폴 유사체, 또는 트리테르펜 또는 트리테르펜 유사체에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 약물 또는 전구약물로서 제형화된 비타민 E 또는 비타민 E 유사체에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예에서, 항산화제는 화학식 (I)의 화합물이다. 또 다른 구체예는 조성물이 단일 단위 투약형으로 포함되는 방법이다.
한 구체예는 항암제와 항산화제를 포함하는 복합물을 투여하는 것을 포함하는 암 치료 방법이다. 또 다른 구체예는 항암제가 반응성 산소 화학종에 의하여 산화될 수 있는 방법이다. 또 다른 구체예는 항암제가 도세탁솔, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴 설페이트, 에스트라머스틴 포스페이트, 수라민, 스트론튬-89, 부세렐린, 클로로트라니즌, 크로믹 포스페이트, 에토포시드 (VP 16), 시스플라틴, 사트라플라틴, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신, 테스토스테론 및 유사체, 스테로이드 및 유사체, 아스피린을 포함하는 비스테로이드성 항염증 약물, 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 포접 및 에스테르화된 에스트로겐, 에스트론, 에티닐 에스트라디올, 플록스유리딘, 고세렐린, 하이드록시우레아, 멜파란, 메토트랙세이트, 미토마이신, 프리드니손, 수베로일아닐라이드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 방법이다.
또 다른 구체예는 항산화제가 화학식 (I)의 구조
Figure pct00002
여기서:
i) A는 하이드로퀴논, 디하이드로퀴논, 퀴논, 플라스토퀴논, 퀴놀, 페놀, 디아민, 트리테르펜, 테트라사이클린, 크로만올, 크로마논, 크로만, 템폴, 템폴-H 또는 이들의 전구약물을 포함하고, 2 내지 30 개의 탄소 원자를 가지는, 최소한 하나의 항산화제 또는 환원된 항산화제로서 기능을 할 수 있는 기이고;
ii) L은 0 내지 50 개의 탄소 원자를 포함하는 연결기이고; 이는 pH 민감성 카르보디아미드 링커(linker)를 가지거나 가지지 않을 수 있고;
iii) E는 원자가 없거나 질소 또는 인이고;
iv) R1', R1'', 및 R1'''은 0 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 라디칼에서 각각 독립적으로 선택되고; 및
b) 화학식
Figure pct00003
를 가지는 최소한 하나의 음이온을 가지는 방법이고, 여기서 양이온 및 음이온이, 존재할 경우, 중성의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 존재한다.
또 다른 구체예는 A 기가 다음 화학식을 가지는 방법이고:
Figure pct00004
또는
Figure pct00005
여기서 Y는 선택적으로 존재하고, 다음에서 선택되는 하나 이상의 전자 활성화 모이어티일 수 있다:
i) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
ii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알킬;
iii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알콕시;
iv) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알콕시; 또는
v) -N(R2)2, 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬이고; m은 존재하는 Y 단위의 개수를 나타내고 m의 값은 0 내지 3이다.
Figure pct00006
또 다른 구체예는 A가 상기 화합물인 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 또는 비타민 E 유사체인 방법이다.
또 다른 구체예는 항암제가 HDAC 억제제인 방법이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산인 방법이다.
한 구체예는 항암제 및 항산화제의 복합물을 포함하는 약제학적 조성물이다. 또 다른 구체예는 항암제가 반응성 산소 화학종에 의하여 산화될 수 있는 약제학적 조성물이다. 또 다른 구체예는 항암제가 도세탁솔, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴 설페이트, 에스트라머스틴 포스페이트, 수라민, 스트론튬-89, 부세렐린, 클로로트라니즌, 크로믹 포스페이트, 시스플라틴, 사트라플라틴, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신 에토포시드, 스테로이드, 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 포접 및 에스테르화된 에스트로겐, 에스트론, 에티닐 에스트라디올, 플록스유리딘, 고세렐린, 하이드록시우레아, 멜파란, 메토트랙세이트, 미토마이신, 프리드니손, 수베로일아닐라이드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 약제학적 조성물이다.
또 다른 구체예는 항산화제가 화학식 (I)의 구조
Figure pct00007
여기서:
i) A는 하이드로퀴논, 디하이드로퀴논, 퀴논, 플라스토퀴논, 퀴놀, 페놀, 디아민, 트리테르펜, 테트라사이클린, 크로만올, 크로마논, 크로만, 템폴, 템폴-H 또는 이들의 전구약물을 포함하고, 2 내지 30 개의 탄소 원자를 가지는, 최소한 하나의 항산화제 또는 환원된 항산화제로서 기능을 할 수 있는 기이고;
ii) L은 0 내지 50 개의 탄소 원자를 포함하는 연결기이고;
iii) E는 원자가 없거나 질소 또는 인이고;
iv) R1', R1'', 및 R1'''는 0 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 라디칼에서 각각 독립적으로 선택되고; 및
b) 화학식
Figure pct00008
를 가지는 최소한 하나의 음이온을 가지는 약제학적 조성물이고, 여기서 양이온 및 음이온이, 존재할 경우, 중성의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 존재한다.
또 다른 구체예는 A 기가 다음 화학식을 가지는 약제학적 조성물이고:
Figure pct00009
또는
Figure pct00010
여기서 Y는 선택적으로 존재하고, 다음에서 선택되는 하나 이상의 전자 활성화 모이어티일 수 있다:
i) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
ii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알킬;
iii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알콕시;
iv) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알콕시; 또는
v) -N(R2)2, 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬이고; m은 존재하는 Y 단위의 개수를 나타내고 m의 값은 0 내지 3이다.
또 다른 구체예는 A가 다음 화합물인 약제학적 조성물이다.
Figure pct00011
또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 또는 비타민 E 유사체인 약제학적 조성물이다.
또 다른 구체예는 항암제가 HDAC 억제제인 약제학적 조성물. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산인 약제학적 조성물이다.
앞에서 기재된 예 및 구체예가 단지 설명의 목적을 위한 것이고, 이에 비추어 다양한 변형 또는 변화가 당업자에게 제안될 것이고 본 출원서의 사상 및 영역 및 첨부된 청구범위의 범위 내에 포함되어야 함이 이해된다.
이 명세서의 일부를 구성하고 이에 삽입된 첨부 도면이 아래에 기재된 몇 가지 양태를 설명한다. 같은 숫자는 도면 전반에 걸쳐 동일한 요소를 나타낸다.
도 1은 Hoechst 염료-DNA 형광 검사에 의하여 결정된, 인간 전립선 종양 LNCaP 세포의 증식 및 성장에 대한 다양한 농도의 MitoQ-C10의 억제 효과를 나타낸다.
도 2는 Hoechst 염료-DNA 형광 검사에 의하여 결정된, 안드로겐 비의존성 PC-3 세포의 증식 및 성장에 대한 다양한 농도의 Mito-Q의 억제 효과를 나타낸다.
도 3은 DCF 형광/Hoechst 염료-DNA 형광의 비율로 결정된, LNCaP 인간 전립선 종양 세포의 성장에 대한 다양한 농도의 Mito-Q-C10을 사용한 처리의 억제 효과를 나타낸다.
도 4는 DCF 형광/Hoechst 염료-DNA 형광의 비율로 결정된, LNCaP 인간 전립선 종양 세포에서 산화 스트레스에 대한 다양한 농도의 Mito-Q를 사용한 처리의 억제 효과를 나타낸다.
도 5는 DCF 형광/DNA 형광의 비율로 결정된, LNCaP 인간 전립선암 세포에서의 합성 안드로겐(메트리볼론(metribolone)) 처리-유발된 산화 스트레스가 10 nM Mito-Q를 사용한 세포의 사전-처리에 의하여 완전히 제거됨을 나타낸다.
도 6은 LC-MS로 결정된, LNCaP 세포에서의 Mito-Q의 세포 내 수준 및 세포 성장에 대한 이의 상관관계를 나타낸다.
도 7은 (a) SAHA로 처리되지 않은 세포에서의 DNA 형광의 퍼센트로서 표현된, SAHA 처리된 LNCaP 세포에서의 세포 성장의 측정으로서 상대적인 DNA-Hoechst 염료 형광이 (A) R1881로 처리되지 않은 세포; (B) 0.05 nM R1881로 처리된 세포; 및 (C) 2 nM R1881로 처리된 세포에서의 SAHA 농도에 대하여 도시되고; (b) DCF 형광: DNA 형광의 비율로서 측정된 세포 ROS 수준이 (A) R1881로 처리되지 않은 세포; (B) 0.05 nM R1881로 처리된 세포; 및 (C) 2 nM R1881로 처리된 세포에서의 SAHA 농도에 대하여 도시됨을 나타낸다.
도 8은 20 μM 비타민 E를 사용한 사전처리와 함께(
Figure pct00012
) 또는 사전처리 없이(
Figure pct00013
) 1 nM R1881을 사용하여 처리된 LNCaP 및 PC-3 세포 및 LNCaP 세포에서의 DCF 형광:DNA 형광의 비율로서 측정된 세포 ROS 수준을 나타낸다.
도 9는 (A) 20 μM 비타민 E가 있거나 없이 안드로겐 없이 성장하는 LNCaP 전립선암 세포, (B) 20 μM 비타민 E가 있거나 없이 1 nM R1881의 존재에서 성장하는 LNCaP 세포, (C) 20 μM 비타민 E가 있거나 없는 PC-3 전립선암 세포, 및 (D) 6 μM 비타민 E가 있거나 없는 HT-29 결장암 세포에서의 SAHA 농도에 대하여 도시된 대응하는 SAHA 비처리된 세포의 DNA 형광 퍼센트로서 표현된, 사전에 최적화된 무독성 농도의 비타민 E를 사용한 사전처리를 한(
Figure pct00014
), 사전처리를 하지 않은(
Figure pct00015
) SAHA의 성장 억제 효과를 나타낸다.
도 10은 20 μM 비타민 E로 처리된 LNCaP 세포(레인 #1), 2 μM HDAC 억제제 약물로 처리된 LNCaP 세포(레인 #2), 1 nM 안드로겐으로 처리된 LNCaP 세포(레인 #3), 1 nM 안드로겐 및 2 μM HDAC 억제제 약물로 처리된 LNCaP 세포(레인 M), 및 1 nM 안드로겐, 20 μM 비타민 E 및 2 μM HDAC 억제제 약물로 처리된 LNCaP 세포(레인 #5)에서 유래한 아세틸 히스톤 H4(Ac-히스톤 H4) 및 상응하는 β-액틴 단백질의 대표적인 웨스턴 블롯을 나타낸다.
도 11은 LC-MS 방법에 의하여 결정되고 SAHA 혼합 배지로부터 결정된 SAHA 표준 곡선으로부터 계산된, 2 μM SAHA 로 처리되거나 (
Figure pct00016
), 1 nM R1881에 이어 2 μM SAHA 로 사전처리되거나 (
Figure pct00017
), 20 μM 비타민 E + 1 nM R1881에 이어 2 μM SAHA로 처리된 (
Figure pct00018
) LNCaP 세포에서의 세포 내 SAHA 수준을 나타낸다.
상세한 설명
초기 인간 전립선암(CaP 또는 PCa가 전반적으로 상호교환적으로 사용됨)의 일반적인 모델은 LNCaP 세포주이다. 이는 안드로겐-반응성 인간 CaP 세포주이고, 좌측 쇄골상 림프절의 전이성 병변으로부터 확보되었다. 배지에서, LNCaP 세포가 안드로겐 차단 요법(androgen deprivation therapy, ADT)을 거치거나 거치지 않은 환자의 혈청 안드로겐 조건을 모의하기 위하여 여러 상이한 수준의 안드로겐 유사체 메트리볼론으로 처리될 수 있다. 1997년에 Ripple 등은 최초로, LNCaP 세포에서 메트리볼론을 사용한 처리가 DCFH-DA 염료 산화 검사로 결정된 바와 같이 수퍼옥사이드, 하이드록실 라디칼, 하이드로젠 퍼옥사이드 등과 같은 반응성 산소 화학종(ROS)을 다양한 수준으로 발생시킴을 보고했다. 1 nM 미만의 메트리볼론 농도, "저 안드로겐"으로 처리될 경우, LNCaP 세포는 1 nM 내지 10 nM 메트리볼론(R1881 합성 안드로겐), "보통 내지 고 안드로겐"으로 처리된 것과 비교하여 현저하게 더 낮은 세포 ROS를 나타냈다. 그러나, 1-10 nM 범위 내에서, 세포 성장 또는 메트리볼론 처리에 의하여 발생한 ROS의 양에서 현저한 차이가 발견되지 않았다.
DNA의 염색질 구조는 DNA 이중 가닥에 의하여 함께 연결된 다수의 뉴클레오솜으로 구성된다. 네 쌍의 히스톤 단백질이 DNA에 의하여 둘러싸여 뉴클레오솜을 형성한다. 이러한 히스톤은 염색질 구조 압축에 의하여 세포 증식 동안 유전자 전사 조절을 돕는다. 각각의 히스톤은 아세틸화에 의하여 변형될 수 있다. 염색질 구조가 압축됨에 따라, 유전자 전사의 빈도가 감소한다. 히스톤 디아세틸레이즈(HDAC)가 히스톤 H3 및 H4를 탈아세틸화하는, 대개 핵에 존재하는 효소의 부류임이 공지이다. 이 효소 활성은 세포 주기의 정지에 필요한 유전자의 전사를 막는다. HDAC가 억제될 경우, 세포 증식, 세포 사멸 및/또는 암 세포 분화의 정지가 특정 유전자의 발현으로 인하여 일어날 수 있다. 수베로일아닐라이드 하이드록삼산(SAHA)은 세포 증식 및 세포 사멸의 정지를 야기하는 HDAC 억제제이다. 이는 피부 T-세포 림프종(CTCL)에 대한 치료를 위하여 승인되고 또한 폐암 및 다른 특정 림프종에서도 기능을 한다. 다른 HDAC 억제제에는 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103가 포함된다.
비록 SAHA(Suberoylanilide hydroxamine acid, Vorinostat)가 피부 T-세포 림프종의 치료에서 성공적이기는 하지만, CaP, 결장암, 유방암 및 다른 특정 유형의 암의 치료에서 단독 요법으로서 임상적으로 효과적이지는 않다. 특정한 공지의 화학치료 약물 및 SAHA를 포함하는 HDAC 억제제에 대한 CaP 및 다른 인간 종양의 내성에 몇 가지 이유가 있을 수 있는데, 예를 들어, (i) 피부 T-세포 림프종 세포과 비교하여 CaP 및 결장 세포 세포는 더 높은 산화 스트레스를 가지므로, 산화 스트레스를 유발하여 세포 사멸을 유발할 수 있는 약물에 영향받지 않을 수 있고, (ii) CaP 또는 다른 인간 종양 세포에서의 높은 SOD 효소 활성이 SAHA에 의하여 발생되는 산화 스트레스를 중화할 수 있으며, (iii) SAHA가 전립선에서 생성된 높은 수준의 ROS에 의하여 고 안드로겐 농도 조건하에 산화될 수 있어 전립선 세포 사멸을 위하여 임상적으로 달성 불가능한 고 SAHA 약물 농도를 필요로 한다. 본 발명자들은 SAHA를 포함하는 특정 약물의 고 ROS를 가지는 CaP 세포에 대한 비활성이 SOD 활성 및 ROS에 대한 내성 변화 때문이 아니라, 높은 수준의 ROS를 가지는 세포에서 산화된 약물 또는 산화된 SAHA의 손실 때문임을 증명한다. 본 발명자들은 ROS 생성 경로에서 주요 효소의 휴지 또는 비타민 E 또는 비타민 E 유사체를 사용한 사전처리에 의한 ROS 수준의 감소가 CaP 세포에 대하여 SAHA를 활성화시킴을 발견했다.
본 발명자들은 세포 내 산화 스트레스가 산화된 SAHA 또는 다른 SOC 암 약물의 세포독성을 감소시킴을 발견했다. SAHA를 포함하는 특정 HDAC 억제제 약물은 산화적으로 스트레스 받은 인간 유방암 및 결장암 세포에 대하여 비활성이다. 상기 약물은 또한 종양 세포가 높은 산화 스트레스 수준에 있을 경우 인간 전립선암에 대해서도 비활성이다. 그러나 SAHA는 낮은 산화 스트레스 수준에 있을 경우 동일한 인간 전립선암 세포주 또는 원발성 종양의 성장을 현저하게 억제한다. 본 발명자들은 또한 특정 항산화제를 사용한 사전처리에 의한 세포 산화 스트레스의 감소가 높은 산화 스트레스를 가지는 전립선암, 결장암 및 유방암 세포를 SAHA 또는 다른 산화 민감성 항암 약물의 성장 억제 효과에 대하여 상승작용으로(synergistically) 민감화시킴을 발견했다. 그러나 항산화제 사전처리 또는 병용처리 프로토콜에서 항산화 수용성 크로만올, 매우 친유성인 ATCol(알파 토코페롤) 및 이들의 유사체 또는 다른 산화 스트레스 조절제(OSM) 약물은 낮은 산화 스트레스 수준에 있는 인간 암 세포 및 원발성 종양을 민감화하지 않았다.
이러한 데이터는 직접적으로 크로만올-기초 지용성 또는 친유성 비타민 E 또는 수용성 유사체를 특정 산화-민감성 항암 약물과 함께 첨가하는 것이 치료적으로 중요할 수 있음을 보여준다. 이는 SAHA와 같은 산화-민감성 약물 또는 특정한 다른 산화 민감성 HDAC 억제제 또는 산화에 의하여 비활성인 특정한 다른 화학치료 약물에 대하여 일반적으로 비반응성인 고 산화 스트레스를 가지는 인간 전립선암, 유방암, 결장암 및 다른 암의 치료를 위하여 SAHA와의 조합에 포함된다.
정의
개시가 상세히 기재되기 전에, 개시된 특정한 방법, 프로토콜, 세포주, 및 시약이 변할 수 있으므로 본 개시의 범위가 이들에 제한되지 않음이 이해된다. 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정 구체예를 설명하는 목적을 위한 것이며 첨부된 청구범위에 의해서만 제한될 개시의 범위를 제한하는 것으로 의도되지 않음이 또한 이해된다.
본 명세서 및 첨부된 청구범위에서 사용되는 단수형은 문맥상 명확하게 달리 언급하지 않으면 복수 언급을 포함함에 유념해야 한다. 따라서, 예를 들어, "세포"에 대한 언급은 복수의 이러한 세포 및 당업자에게 공지인 이의 균등물 등을 포함한다. 마찬가지로, 용어 "하나", "하나 이상의 " 및 "최소한 하나"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용될 수 있다. 또한 용어 "포함하는"("comprising"), "포함하는"("including") 및 "가지는"("having")이 상호교환적으로 사용될 수 있음에 유념해야 한다.
흔히, 범위는 "약" 하나의 특정 값, 및/또는 내지 "약" 또 다른 특정 값으로 표현된다. 이러한 범위가 표현될 경우, 또 다른 구체예가 한 특정 값 및/또는 내지 다른 특정 값을 포함한다. 유사하게, 값이 앞선 "약"의 사용에 의하여 근사값으로 표현될 경우 특정 값이 또 다른 구체예를 형성함이 이해될 것이다. 범위의 각각의 종점이 다른 종점에 관하여, 그리고 다른 종점에 독립적으로 모두 중요함이 또한 이해될 것이다.
"선택적인" 또는 "선택적으로"는 이후에 기재되는 사건 또는 상황이 일어날 수 있거나 일어나지 않을 수 있고, 기재가 사건 또는 상황이 일어나는 경우 및 일어나지 않는 경우를 포함함을 의미한다. 예를 들어, 구절 "선택적으로 치환된 저급 알킬"은 저급 알킬기가 치환될 수 있거나 치환되지 않을 수 있고 상기 기재가 치환되지 않는 저급 알킬 및 치환이 존재하는 저급 알킬을 모두 포함함을 의미한다.
세포는 시험관 내에 있을 수 있다. 대안으로, 세포는 생체 내에 있을 수 있고 대상에서 발견될 수 있다. "세포"는 박테리아 또는 포유류 세포를 포함하지만 이에 제한되지 않은 임의의 생물에서 유래한 세포일 수 있다.
전반적으로 사용된 "대상"은 개체를 의미한다. 따라서, "대상"은 고양이, 개 등과 같은 길들여진 동물, 가축 (예를 들어, 소, 말, 돼지, 양, 염소, 토끼 등), 실험실 동물 (예를 들어, 마우스, 토끼, 래트, 기니피그, 페럿, 밍크 등) 및 새를 포함할 수 있다. 한 양태에서, 대상은 영장류 또는 인간과 같은 더 고등한 포유류이다.
한 양태에서, 본 명세서에 기재된 화합물은 인지된 의학적 상태의 경감 또는 개선의 필요가 있는, 인간 또는 영장류, 쥐, 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소 또는 양 종 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는 동물을 포함하는 대상에게 투여될 수 있다.
명세서 및 끝맺는 청구범위에서, 조성물 또는 제품에서 특정 원소 또는 성분의 중량부에 대한 언급은, 중량부가 표현되는 조성물 또는 제품의 원소 또는 성분과 임의의 다른 원소 또는 성분 사이의 중량 관계를 나타낸다. 따라서, 2 중량부의 성분 X 및 5 중량부 성분 Y를 포함하는 화합물에서, X 및 Y는 2:5의 중량비로 존재하고, 추가 성분이 화합물에 포함되는지 여부에 관계 없이 이러한 비율로 존재한다.
성분의 중량 퍼센트는, 명확하게 달리 제시되지 않으면, 성분이 포함되는 제제 또는 조성물의 총 중량을 기준으로 한다.
용어 "모이어티"는 탄소 포함 잔기, 즉 최소한 하나의 탄소 원자를 포함하는 모이어티를 정의하고, 앞에서 정의된 탄소-포함 기를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유기 모이어티는 다양한 헤테로원자를 포함할 수 있거나, 산소, 질소, 황, 인 등을 포함하는 헤테로원자를 통하여 또 다른 분자에 결합될 수 있다. 유기 모이어티의 예는 알킬 또는 치환된 알킬, 알콕시 또는 치환된 알콕시, 일 또는 이치환된 아미노, 아미드 기 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유기 모이어티는 바람직하게는 1 내지 21 개의 탄소 원자, 1 내지 18 개의 탄소 원자, 1 내지 15 개의 탄소 원자, 1 내지 12 개의 탄소 원자, 1 내지 8 개의 탄소 원자, 또는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
달리 정의되지 않으면, 본 명세서에서 사용된 모든 기술 및 과학 용어가 당업자에 의하여 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 비록 본 명세서에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 개시의 실시 또는 실험에서 사용될 수 있기는 하지만, 이제 바람직한 방법 및 물질이 기재된다. 본 명세서에서 언급된 모든 간행물은 본 발명에 기재된 구체예와 관련하여 사용될 수 있는 간행물에 보고된 화학물질, 세포주, 벡터, 동물, 기구, 통계적 분석 및 방법을 기재하고 개시하려는 목적을 위하여 본 명세서에 참고문헌으로 포함된다.
용어 "알킬"은 1 내지 18 개의 탄소, 또는 바람직하게는 4 내지 14 개의 탄소, 5 내지 13 개의 탄소, 또는 6 내지 10 개의 탄소를 가지는 포화된, 선형 또는 분지형 탄화수소 잔기를 포함하는 모이어티를 나타낸다. 알킬은 비-사이클릭 알칸으로부터의 하나의 수소 제거 및 치환에 의하여 변형되고, 이에 따라 비-수소 기 또는 모이어티를 가지는 비-사이클릭 알칸 화합물과 구조적으로 유사하다. 알킬 모이어티는 분지형 또는 비분지형일 수 있다. 저급 알킬 모이어티는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 가진다. 알킬 모이어티의 예에는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, t-부틸, 아밀, t-아밀, n-펜틸 등이 포함된다.
용어 "치환된 알킬"은 하나 이상의 유기 또는 무기 치환기 모이어티로 치환된, 상기 정의와 유사한 알킬 모이어티를 나타낸다. 일부 구체예에서, 1 또는 2 개의 유기 또는 무기 치환기 모이어티가 사용된다. 일부 구체예에서, 각각의 유기 치환기 모이어티는 1 내지 4 개, 또는 5 내지 8 개의 탄소 원자를 포함한다. 적절한 유기 및 무기 치환기 모이어티는 하이드록실, 할로겐, 사이클로알킬, 아미노, 일치환된 아미노, 이치환된 아미노, 아실옥시, 니트로, 시아노, 카르복시, 카르보알콕시, 알킬카르복스아미드, 치환된 알킬카르복스아미드, 디알킬카르복스아미드, 치환된 디알킬카르복스아미드, 알킬설포닐, 알킬설피닐, 티오알킬, 티오할로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 할로알킬, 할로알콕시, 헤테로아릴, 치환된 헤테로아릴, 아릴 또는 치환된 아릴을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 하나보다 많은 치환기가 존재할 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 약어에는 다음이 포함된다:
본 명세서에서 사용된 용어 "알콕시"는 산소에 직접 부착되어 에테르 잔기를 형성하는, 앞에서 정의된 알킬 모이어티를 나타낸다. 예에는 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, t-부톡시, 이소-부톡시 등이 포함된다.
용어 "치환된 알콕시"는 하나 이상의 기, 그러나 바람직하게는 하나 또는 둘의 하이드록실, 사이클로알킬, 아미노, 일치환된 아미노, 이치환된 아미노, 아실옥시, 니트로, 시아노, 카르복시, 카르보알콕시, 알킬카르복스아미드, 치환된 알킬카르복스아미드, 디알킬카르복스아미드, 치환된 디알킬카르복스아미드, 알킬설포닐, 알킬설피닐, 티오알킬, 티오할로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시 또는 할로알콕시를 포함하는 치환기로 치환된 상기 정의의 알콕시 모이어티를 나타낸다. 하나보다 많은 기가 존재할 경우, 이들은 동일하거나 상이할 수 있다.
용어 "일치환된 아미노"는 알킬, 치환된 알킬 또는 아릴알킬에서 선택된 하나의 기로 치환된 아미노 (-NH2) 기를 나타내고, 여기서 상기 용어는 전반적으로 발견되는 동일한 정의를 가진다.
용어 "이치환된 아미노"는 아릴, 치환된 아릴, 알킬, 치환된 알킬 또는 아릴알킬에서 선택된 동일하거나 상이할 수 있는 두 모이어티로 치환된 아미노를 나타내고, 여기서 상기 용어는 전반적으로 발견되는 동일한 정의를 가진다. 일부 예에는 디메틸아미노, 메틸에틸아미노, 디에틸아미노 등이 포함된다.
용어 "할로알킬"은 트리플루오로메틸, 펜타플루오로에틸 등과 같은 하나 이상의 할로겐, 바람직하게는 플루오린으로 치환된, 앞에서 정의된 알킬 모이어티를 나타낸다.
용어 "할로알콕시"는 트리플루오로메톡시, 펜타플루오로에톡시 등을 포함하는, 산소에 직접 결합되어 할로겐화 에테르 잔기를 형성하는, 앞에서 정의된 할로알킬을 나타낸다.
용어 "아실"은 카르보닐 (C=O) 기를 포함하는 화학식 -C(O)-R의 모이어티를 나타내고, 여기서 R 모이어티는 카르보닐기에 결합된 탄소 원자를 가지는 유기 모이어티이다. 아실 모이어티는 1 내지 8 개 또는 1 내지 4 개의 탄소 원자를 포함한다. 아실 모이어티의 예는 포르밀, 아세틸, 프로피오닐, 부타노일, 이소-부타노일, 펜타노일, 헥사노일, 헵타노일, 벤조일 등을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
용어 "아실옥시"는 아세틸옥시, 프로피오닐옥시, 부타노일옥시, 이소-부타노일옥시, 벤조일옥시 등과 같은, 산소에 직접 부착된 앞에서 정의된 아실기의 1 내지 8 개의 탄소를 포함하는 모이어티를 나타낸다.
용어 "아릴"는 6 내지 18 개의 고리 탄소, 또는 바람직하게는 6 내지 12 개의 고리 탄소를 포함하는 불포화 및 공액화(conjugated) 방향족 고리 모이어티를 나타낸다. 많은 아릴 모이어티가 최소한 하나의 6-원 방향족 "벤젠" 모이어티를 가진다. 이러한 아릴 모이어티의 예에는 페닐 및 나프틸이 포함된다.
용어 "치환된 아릴"은 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 할로알킬, 하이드록실, 사이클로알킬, 치환된 사이클로알킬, 사이클로알케닐, 치환된 사이클로알케닐, 아미노, 일치환된 아미노, 이치환된 아미노, 아실옥시, 니트로, 시아노, 카르복시, 카르보알콕시, 알킬카르복스아미드, 치환된 알킬카르복스아미드, 디알킬카르복스아미드, 치환된 디알킬카르복스아미드, 알킬설포닐, 알킬설피닐, 티오알킬, 티오할로알킬, 알콕시, 치환된 알콕시 또는 할로알콕시, 아릴, 치환된 아릴, 헤테로아릴, 헤테로사이클릭 고리, 치환된 헤테로사이클릭 고리 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 유기 또는 무기 치환기 모이어티로 치환되거나 이에 융합된, 앞에서 정의된 아릴 고리 모이어티를 나타내고, 상기 용어는 본 명세서에서 정의된다. 치환된 아릴 모이어티는 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯 또는 그 이상의 치환기 모이어티를 가질 수 있다. 치환기 모이어티는 제한되지 않는 크기 또는 분자량이 아닐 수 있고, 각각의 유기 모이어티는 청구범위에 의하여 달리 명확하게 고려되지 않으면 15 개 이하, 10 개 이하, 또는 4 개 이하의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
용어 "헤테로아릴"은 방향족 고리의 탄소 중 최소한 하나가 질소, 산소, 및 황 원자를 포함하지만 이에 제한되지 않는 헤테로원자로 대체된, 앞에서 정의된 아릴 고리 모이어티를 나타낸다. 헤테로아릴 모이어티는 6 원 방향족 고리 모이어티를 포함하고, 또한 5 또는 7 원 방향족 고리, 또는 바이사이클릭 또는 폴리사이클릭 헤테로방향족 고리를 마찬가지로 포함할 수 있다. 헤테로아릴 모이어티의 예에는 피리딜, 바이피리딜, 퓨라닐, 및 티오퓨라닐 잔기가 포함된다. 헤테로아릴 모이어티가 선택적으로 치환된 아릴 모이어티에 대하여 앞에서 기재된 헤테로방향족 고리의 탄소 원자에 결합된 하나 이상의 유기 또는 무기 치환기 모이어티로 치환될 수 있음을 이해해야 한다. 치환된 헤테로아릴 모이어티는 본 명세서에 정의된 치환된 아릴 모이어티와 유사한 방식으로 하나, 둘, 셋, 넷, 다섯, 또는 그 이상의 치환된 유기 또는 무기 모이어티를 가질 수 있다. 치환기 모이어티는 제한되지 않은 크기 또는 분자량이 아닐 수 있고, 각각의 유기 치환기 모이어티는 청구범위에 의하여 달리 명확하게 고려되지 않으면 15 개 이하, 10 개 이하, 또는 4 개 이하의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
용어 "할로", "할라이드" 또는 "할로겐"은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 아이오도 원자 또는 이온을 지칭한다.
명세서 및 끝맺는 청구범위에서 사용되는 용어 "헤테로사이클" 또는 "헤테로사이클릭"은 3 내지 10 개의 고리 원자를 포함하는 닫힌 고리 구조를 가지는 모이어티를 지칭하고, 여기서 고리의 원자 중 최소한 하나가 예를 들어, 질소, 황, 산소, 규소, 인 등과 같은 탄소 이외의 원소이다. 5, 6, 또는 7 원의 고리를 가지는 헤테로사이클릭 화합물이 보통이고, 고리는 포화되거나, 부분적으로 또는 완전히 불포화될 수 있다. 헤테로사이클릭 화합물은 모노사이클릭, 바이사이클릭, 또는 폴리사이클릭일 수 있다. 헤테로사이클릭 화합물의 예에는 피리딘, 피페리딘, 티오펜, 퓨란, 테트라하이드로퓨란, 등이 포함되지만 이에 제한되지 않는다. 용어 "치환된 헤테로사이클릭"은 고리 원자 중 하나에 결합된 하나 이상의 유기 또는 무기 치환기 모이어티를 가지는 앞에서 정의된 헤테로사이클릭 모이어티를 지칭한다.
명세서 및 끝맺는 청구범위에서 사용되는 용어 "카르복시"는 카르복실산의 특징인 -C(O)OH 모이어티를 지칭한다. 카르복시 모이어티의 수소는 흔히 산성이고 (pH에 따라) 흔히 부분적으로 또는 완전히 해리되어, 산 H+ 이온 및 카르복실레이트 음이온(-CO2-)을 형성하며, 여기서 카르복실레이트 음이온은 또한 때때로 "카르복시" 모이어티로도 지칭된다.
카이랄 원자가 본 명세서에서 개시된 화합물에 존재할 경우, 별개의 거울상이성질체 두 가지 모두, 라세미 혼합물 및 거울상이성질체 초과량의 혼합물이 본 개시의 범위 내에 있음이 이해된다. 본 명세서에 정의한 바와 같이, 라세미 혼합물은 거울상이성질체 각각의 동일 비율이며, 여기서 거울상이성질체 초과량은 한 거울상이성질체의 퍼센트가 다른 거울상이성질체의 퍼센트보다 클 경우이고, 모든 퍼센티지가 본 개시의 범위 내에 있다. 더욱이, 하나 초과의 카이랄 원자가 화합물에 존재할 경우, 거울상이성질체, 라세미 혼합물, 거울상이성질체 초과량의 혼합물 및 부분입체이성질체 혼합물이 본 개시의 범위 내에 있다.
화합물
아래 기재된 화합물은 염이고, 본 명세서의 다른 부분에 개시된 다양한 질환의 치료에 유용할 수 있다. 당업자가 인식할 것과 같이, 염은 양전하 및 음전하의 총 수가 전기적으로 균형을 이루는 양이온과 음이온의 혼합을 포함한다. 그러나 더욱 구체적으로는 본 명세서에 개시된 염은 아래에 도시된 화학식 (I)을 가지는 하나 이상의 분자 또는 양이온,
a) 다음 화학식을 가지는 최소한 하나의 분자:
Figure pct00019
여기서:
i) A는 하이드로퀴논, 디하이드로퀴논, 퀴논, 퀴놀, 페놀, 디아민, 트리테르펜, 테트라사이클린, 크로만올, 크로마논, 크로만 템폴, 템폴-H 또는 이들의 전구약물을 포함하고, 2 내지 30 개의 탄소 원자를 가지는, 최소한 하나의 신호전달방지 또는 항산화제 또는 환원된 항산화제로서 기능을 할 수 있는 기이고;
ii) L 또는 L*은 0 내지 50 개의 탄소 원자를 포함하는 연결기이고, 이는 pH-민감성 *카르보디아미드 링커를 가지거나 가지지 않을 수 있고;
iii) E는 원자가 없거나 질소 또는 인이고;
iv) R1', R1 ", 및 R1 "'은 0 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 라디칼에서 각각 독립적으로 선택되고; 및
b) 화학식
Figure pct00020
를 가지는 최소한 하나의 음이온을 가지고, 여기서 양이온 및 음이온이, 존재할 경우, 중성의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 존재한다.
화학식 (I)의 화합물의 다양한 속, 아속 및 종이 적어도 앞에 기재된 특징을 공유하고, 관련된 기능 및 효용을 가지지만, 아래에 기재된 바와 같이 특정한 구조적 특징에서 상이할 수 있다.
"신호전달방지, 항산화 스트레스 조절 또는 항산화" = "A" 모이어티
일부 구체예에서, 본 개시의 화합물은 최소한 하나의 항산화 모이어티 "A"를 포함하고, A는 A 내에 또는 A에 결합된 최소한 하나 이상의 하이드로퀴논, 퀴논, 변형된 퀴닌, 플라스토퀴논, 퀴놀, 크로만올, 크로마논, 크로만, 페놀, 디아민, 트리테르펜, 템폴, 템폴-H 또는 카르보티오아미드를 포함한다.
하이드로퀴논 및 관련 퀴논은 아래에 나타나는 화학 구조를 가진다:
Figure pct00021
또는
Figure pct00022
하이드로퀴논 퀴논
한편 페놀의 예는 다음 화학식을 가지는 크로만 6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸-크로만-2-일이다:
Figure pct00023
따라서, 세포 내의 퍼옥사이드 라디칼 음이온을 환원시켜 세포 내의 항산화 방어 효소에 의하여 처리될 수 있는 하이드로젠 퍼옥사이드를 형성할 수 있는 하나 이상의 퀴논 모이어티를 포함하는, 본 명세서에 기재된 양이온 염의 "A" 모이어티는, 그러므로 "항산화제"로서 기능하는 구실을 한다. 퀴논 및 다른 모이어티는 더 큰 A 모이어티의 일부이고, 많은 구체에에서 4 내지 30 개의 탄소 원자, 또는 6 내지 24 개의 탄소 원자, 또는 7 내지 18 개의 탄소 원자, 또는 8 내지 12 개의 탄소 원자를 포함할 수 있다.
일부 구체예에서, A 모이어티는 다음 화학식을 가지고:
Figure pct00024
또는
Figure pct00025
여기서 Y는 선택적으로 존재하고, 다음에서 선택되는 하나 이상의 전자 활성화 모이어티일 수 있다:
i) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
ii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알킬;
iii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알콕시;
iv) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알콕시; 또는
v) -N(R2)2, 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬이다.
지수 m은 존재하는 Y 단위의 개수를 나타내고 m의 값은 0 내지 3이다.
한 구체예에서 Y는 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 및, tert-부톡시에서 독립적으로 선택되는 전자 활성화 모이어티이다.
한 구체예에서 Y는 1 내지 3 개의 메틸 및/또는 메톡시 단위에서 선택된다. 예에는 다음 화학식을 가지는 하이드로퀴논 및 퀴논 라디칼을 포함된다:
Figure pct00026
또는
Figure pct00027
암모늄 또는 포스포늄 양이온 모이어티
본 개시의 방법에서 유용한 화합물은 영 또는 하나 이상의 양이온 또는 다중 양이온 모이어티를 포함한다. 양이온 모이어티는 양전하를 보유하고, 이는, 비록 이론에 얽매이지는 않지만, 150-170 mV의 큰 미토콘드리아 막전위, 및 결과적인 정전기적 인력으로 인하여 미토콘드리아에서 결과적 화합물의 바람직한 선택적 축적을 일어키는 것으로 생각된다. 또한, 비록 이론에 얽매이지는 않지만, 양이온 모이어티가 비교적 큰 및/또는 친유성 유기 치환기 모이어티를 포함하여, 비록 A 기가 친유성이 아니더라도 결과적인 양이온 기가 전체로 보았을 때 비교적 친유성일 경우, 본 명세서에 개시된 양이온 염의 선택적 축적이 또한 개선됨이 밝혀졌다. 당업자는 비교적 친유성인 많은 양이온 기가 특히 질소 또는 인 원자를 포함하는 화합물로부터 합성될 수 있음을 인식할 것이고, 이러한 많은 양이온 모이어티가 항산화제 또는 환원된 항산화 A 모이어티에 다양한 방식으로 연결될 수 있고, 본 명세서에 기재된 방법의 실시에서 유용할 수 있는 양이온을 제공할 수 있음이 명백하다. 그러나 더욱 구체적으로는 화학식 (I)의 염 및/또는 양이온 화합물의 많은 구체예가 다음 화학식을 가지는 4차 암모늄 또는 포스포늄 모이어티를 가지고:
Figure pct00028
여기서:
E는 질소 또는 인 원자이고; R1', R1'', 및 R1'''는 각각 독립적으로 1 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 모이어티이다.
많은 구체예에서, 화학식 (I)의 화합물은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 아랄킬 모이어티에서 각각 독립적으로 선택된 R1', R1'', 및 R1'''를 가질 수 있고, 이는 치환돠지 않거나 하이드록실, 할로겐, 아미노, 아미노, 디메틸아미노, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕실알킬, 카르복시, 또는 카르복시알킬 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 또는 둘의 독립적으로 선택된 치환기 모이어티로 선택적으로 치환될 수 있다. R1', R1'', 및 R1'''을 위한 선택적인 치환기의 비제한적 예에는 다음이 포함된다:
i) C1-C4 선형 분지형 알킬; 예를 들어, 메틸(C1), 에틸(C2), n-프로필 (C3), 이소-프로필 (C3), n-부틸 (C4), sec-부틸 (C4), 이소-부틸 (C4), 및 tert-부틸 (C4);
ii) C1-C4 선형 또는 분지형 알콕시; 예를 들어, 메톡시 (Ci), 에톡시 (C2), n- 프로폭시 (C3), 이소-프로폭시 (C3), n-부톡시 (C4), sec-부톡시 (C4), 이소-부톡시 (C4), 및 tert-부톡시 (C4);
iii) 할로겐; 예를 들어, -F, -Cl, -Br, -I, 및 이들의 혼합;
iv) 아미노 및 치환된 아미노; 예를 들어, -NH2, -NH2, -NHCH3, -NHCH3, 및 -N(CH3)2;
v) 하이드록실; -OH;
vi) C1-C4 선형 또는 분지형 하이드록시알킬; 예를 들어, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, 및 -CH2CHOHCH3;
vii) C1-C4 선형 또는 분지형 알콕시알킬; 예를 들어, -CH2OCH3, -CH2CH2OCH3, -CH2CH2CH2OCH3, 및 -CH2CH(OCH3)CH3;
viii) 카르복시 또는 카르복실레이트, 예를 들어, -CO2H 또는 음이온성 균등 카르복실레이트 모이어티 -CO2 -; 및
xi) 카르복시알킬, 예를 들어, -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2CO2CH3, - CH2CH2CO2CH3, 및 -CH2CH2CH2CO2CH3.
관련 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 하나 또는 둘의 독립적으로 선택되는 하이드록실, 할로겐, 아미노, 디아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕실알킬, 카르복시, 또는 카르복시알킬 모이어티로 선택적으로 치환되는 알킬, 아릴, 또는 벤질 모이어티에서 각각 독립적으로 선택된다.
다른 관련 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 C4-C10 알킬 또는 페닐 모이어티에서 독립적으로 선택되고, 이는 하이드록실, 할로겐, 아미노, 디아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕실알킬, 시아노, 카르복시, 또는 카르복시알킬 모이어티를 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는 하나 또는 둘의 독립적으로 선택된 치환기 모이어티로 선택적으로 치환될 수 있다. 추가의 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 C4-C10 알킬 또는 페닐 모이어티에서 독립적으로 선택될 수 있다. 약간의 추가 구체예에서 R1', R1'', 및 R1'''은 C4-C10 알킬에서 독립적으로 선택된다. 또 다른 관련 구체예에서 R1', R1'', 및 R1'''은 각각 n-C4H9 모이어티이다.
포스포늄 양이온을 가지는 화학식 (I)의 화합물의 일부 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 각각 다음 화학식을 가지는 트리페닐 포스포늄 양이온을 생성하는 페닐 모이어티이다:
Figure pct00029
대안이지만 관련된 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 각각 다음 화학식을 가지는 트리벤질 포스포늄 양이온을 생성하는 벤질 모이어티이다:
Figure pct00030
화학식 (I)의 양이온의 다른 구체예는 4차 암모늄 양이온, 즉 E가 질소 원자인 것에 관한 것이다. 이러한 일부 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 또는 아랄킬 모이어티에서 각각 독립적으로 선택되고, 이는 하이드록실, 할로겐, 아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕실알킬, 시아노, 카르복시, 또는 카르복시알킬 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 또는 둘의 독립적으로 선택된 치환기 모이어티로 선택적으로 치환될 수 있다. R1', R1'', 및 R1''' 치환기의 비제한적 예에는 다음이 포함된다:
i) C1-C4 선형 분지형 알킬; 예를 들어, 메틸 (C1), 에틸 (C2), n-프로필 (C3), 이소-프로필 (C3), n-부틸 (C4), sec-부틸 (C4), 이소-부틸 (C4), 및 tert-부틸 (C4);
ii) C1-C4 선형 또는 분지형 알콕시; 예를 들어, 메톡시 (C1), 에톡시 (C2), n- 프로폭시 (C3), 이소-프로폭시 (C3), n-부톡시 (C4), sec-부톡시 (C4), 이소-부톡시 (C4), 및 tert-부톡시 (C4);
iii) 할로겐; 예를 들어, -F, -Cl, -Br, -I, 및 이들의 혼합;
iv) 아미노 및 치환된 아미노; 예를 들어, -NH2, -NH2, -NHCH3, -NHCH3, 및 -N(CH3)2;
v) 하이드록실; -OH;
vi) C1-C4 선형 또는 분지형 하이드록시알킬; 예를 들어, -CH2OH, -CH2CH2OH, -CH2CH2CH2OH, 및 -CH2CHOHCH3;
vii) C1-C4 선형 또는 분지형 알콕시알킬; 예를 들어, -CH2OCH3, - CH2CH2OCH3, -CH2CH2CH2OCH3, 및 -CH2CH(OCH3)CH3;
viii) 카르복시; 또는 카르복실레이트, 예를 들어, -CO2H 또는 음이온성 균등 카르복실레이트 모이어티 -CO2 -; 및
xi) 카르복시알킬, 예를 들어, -CH2CO2H, -CH2CH2CO2H, -CH2CO2CH3, - CH2CH2CO2CH3, 및 -CH2CH2CH2CO2CH3.
E가 질소인 화학식 (I)의 양이온의 추가 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 알킬 아릴, 또는 벤질 모이어티에서 각각 독립적으로 선택되고, 이는 하이드록실, 할로겐, 아미노, 디메틸아미노, 디에틸아미노, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕실알킬, 카르복시, 또는 카르복시알킬 모이어티를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 또는 둘의 독립적으로 선택된 치환기 모이어티로 선택적으로 치환될 수 있다.
또 다른 구체예에서 R1', R1'', 및 R1'''은 하나 또는 둘의 독립적으로 선택된 하이드록실, 할로겐, 아미노, 디메틸아미노, 알킬, 하이드록시알킬, 알콕시, 알콕실알킬, 카르복시, 또는 카르복시알킬 모이어티로 선택적으로 치환된 C4-C10 알킬 또는 페닐 모이어티에서 독립적으로 선택된다. 본 구체예의 한 추가 양태에서 R1', R1'', 및 R1'''은 C4-C10 알킬 또는 페닐 모이어티에서 독립적으로 선택되고; 한 추가 구체예에서 R1', R1'', 및 R1'''은 C4-C10 알킬에서 독립적으로 선택된다.
E가 질소인 양이온의 또 다른 구체예에서, R1', R1'', 및 R1'''은 각각 n-C4H9 모이어티이다.
"L" 또는 "L"링커 모이어티
화학식 (I)의 양이온은 "A" 모이어티 및 양이온 모이어티를 연결하는 링커 모이어티 "L"을 포함한다. L 모이어티의 정확한 구조 및 크기는 상당히 다양할 수 있고, L 모이어티의 많은 변형이 본 명세서에 개시된 구체예의 범위 내에 있다. 일부 L 모이어티는 흔히 유기 모이어티이고, 광범한 구조를 포함할 수 있다. 많은 구체예에서 L 모이어티가 A와 양이온 기 사이의 연결에서 약간의 공간 및/또는 유연성을 제공하기에 충분한 크기 및 특성이지만, 결과적인 양이온의 수용성 또는 막관통 흡수성(trans-membrane absorbability)을 손상시킬 정도로 큰 분자량은 아닌 것이 바람직하다.
따라서, 일부 구체예에서, L 모이어티는, 전체로서 간주될 경우, 4 내지 50 개의 탄소 원자, 또는 4 내지 30 개의 탄소 원자, 또는 4 내지 20 개의 탄소 원자를 포함한다. 일부 구체예에서, L 모이어티는 0 내지 18 개의 탄소 원자, 또는 8 내지 12 개의 탄소 원자를 포함한다.
한 구체예에서 L은 화학식:
-[C(R2a)(R2b)]j[W]k[C(R3a)(R3b)]n[Z]p[C(R4a)(R4b)]q-을 가지고
R2a, R2b, R3a, R3b, R4a, 및 R4b는 각각 독립적으로 다음에서 선택되고:
i) 수소;
ii) 치환되거나 치환되지 않은 C1-C12 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
iii) 치환되거나 치환되지 않은 C1-C12 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알케닐;
iv) 치환되거나 치환되지 않은 C1-C12 선형 또는 분지형 알키닐;
v) -C(O)OR5;
vi) -C(O)R6;
vi) -OR7;
viii) -N(R8a)(R8b);
ix) -C(O)N(R9a)(R9b);
x) -CN;
xi) -NO2;
xii) -SO2R10;
R5, R6, R7, R8, R9, 및 R10은 각각 독립적으로 다음에서 선택되고:
a) 수소;
b) 치환되거나 치환되지 않은 C1-C12 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
c) 치환되거나 치환되지 않은 C6 또는 C10 아릴;
W 및 Z는 각각 독립적으로 다음에서 선택되고:
i) -M-;
ii) -C(=M)-;
iii) -C(=M)M-;
iv) -MC(=M)-;
v) -MC(=M)M-;
vi) -MC(=M)C(=M)M-; 또는
vii) -MC(=M)MC(=M)M-;
여기서 각각의 M은 O, S, 및 NR11에서 독립적으로 선택되고; R11은 수소, 하이드록실, 또는 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬이고; 지수 j, n, 및 q는 각각 독립적으로 0 내지 30이고, 단 j + n + q가 4 내지 30이고; 지수 k 및 p는 독립적으로 0 또는 1이고;
L은 다음 화학식을 가지는 하나 이상의 단위를 포함할 수 있고:
Figure pct00031
;
E, R1', 및 R1''은 본 명세서에서 앞에서 정의된 바와 동일하다.
연결 단위의 한 구체예에서 지수 j, n, 및 q의 합계는 4 내지 24이다. 연결 단위의 또 다른 구체예에서 지수 j, n, 및 q의 합계는 5 내지 20이다. 연결 단위의 또 다른 구체예에서 지수 j, n, 및 q의 합계는 6 내지 16이다. 연결 단위의 또 다른 구체예에서 지수 j, n, 및 q의 합계는 7 내지 16이다. 연결 단위의 또 다른 구체예에서 지수 j, n, 및 q의 합계는 8 내지 12이다. 연결 단위의 또 다른 구체예에서 지수 j, n, 및 q의 합계는 10이다.
한 구체예에서, L은 다음 화학식을 가지고:
-[C(R3a)(R3b)]n-
R3a 및 R3b는 각각 독립적으로 다음에서 선택되고:
i) -H;
ii) C1-C4 선형 또는 분지형 알킬;
지수 n은 4 내지 30이다.
L 단위의 이 구체예는 다음 화합물을 제공한다:
Figure pct00032
;
Figure pct00033
;
Figure pct00034
;
Figure pct00035
;
Figure pct00036
;
Figure pct00037
;
Figure pct00038
;
Figure pct00039
;
Figure pct00040
;
Figure pct00041
;
Figure pct00042
;
Figure pct00043
;
Figure pct00044
;
Figure pct00045
.
일부 구체예에서, L 모이어티는 단지 메틸렌 또는 폴리메틸렌 모이어티, 즉 -(CH2)n- 모이어티를 포함한다. 일부 구체예는 4 내지 24 개의 탄소 사슬 원자, 예를 들어, 지수 n이 4 내지 24인 -(CH2)n-를 가지는 L을 제공한다. 다른 구체예는 5 내지 20 개의 탄소 원자, 6 내지 16 개의 탄소 원자, 7 내지 16 개의 탄소 원자, 및 8 내지 12 개의 탄소 원자를 가지는 L에 관련된다. 한 특정 구체예는 10 개의 탄소 원자를 가지는 L 단위 (n = 10), 예를 들어, 화학식: -CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2CH2-을 가지는 10 개의 메틸렌 단위에 관련된다.
또 다른 구체예에서 L은 다음 화학식을 가지고:
-[C(R2a)(R2b)]j[C(R3a)(R3b)]n[C(R4a)(R4b)]q-
이의 한 비제한적 예는 다음 화학식을 가지고:
-[CH2]2[C(R3a)(R3b)][CH2]q-
이에 의하여 다음 화학식을 가지는 화합물을 제공하고:
Figure pct00046
또는
Figure pct00047
여기서 q는 1 내지 20이고, R3a 및 R3b는 수소, 메틸, 에틸, 프로필 및 하이드록실에서 각각 독립적으로 선택된다.
비제한적인 예는 다음 화학식을 가진다:
Figure pct00048
;
Figure pct00049
;
Figure pct00050
및
Figure pct00051
비제한적 예는 다음 화학식을 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00052
;
Figure pct00053
;
Figure pct00054
;
Figure pct00055
; 및
Figure pct00056
.
그럼에도 불구하고, L 모이어티는 탄소 사슬에서 -O-, -S-, -S(O)-, -S(O)2-, -NH-, -NCH3-, -C(O)-, 또는 -C(O)O-에서 독립적으로 선택된 1 내지 10 개의 추가 원자 또는 기를 더욱 포함할 수 있다. 예를 들어, 일부 구체예에서, L은 폴리알킬렌 모이어티, 또는 다음 화학식을 가지는 폴리에틸렌 글리콜 모이어티일 수 있고:
-(CH2CH2O)nCH2CH2-
여기서 n은 0 내지 3의 정수이다.
X n - 음이온
화학식 (I)의 양이온을 포함하는 염 화합물은 또한 음이온 Xn -을 포함하며, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이고, 일가-음이온, 이가-음이온, 삼가-음이온, 및 사가-음이온에 대응한다. Xn -의 첫 번째 구체예는 무기 음이온 모이어티에 관련된다. 일가-음이온성 무기 음이온은 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 또는 아이오다이드와 같은 할라이드 임의의 음이온; 니트레이트, 하이드로젠 설페이트; 디하이드로젠 포스페이트, 등을 포함한다. 이가음이온성 무기 양이온은 카르보네이트, 설페이트 또는 하이드로젠 포스페이트를 포함할 수 있고, 삼가-음이온성 무기 음이온은 포스페이트를 포함한다.
Xn - 음이온의 다른 구체예에서, 음이온은 유기 음이온이다. 화학식 (I)의 양이온으로부터 염을 형성하기 위하여 사용될 수 있는 유기 음이온 모이어티의 비제한적 예는 메틸설포네이트(메실레이트), 트리플루오로메틸설포네이트(트리플레이트), 벤젠설포네이트, 톨루엔설포네이트(토실레이트)와 같은 유기설페이트, 또는 퓨마레이트, 말레이트, 말토레이트, 석시네이트, 아세테이트, 벤조에이트, 옥살레이트, 시트레이트, 또는 타르트레이트 음이온과 같은 유기산의 중화에 의하여 흔히 형성되는 순수하게 유기성인 음이온을 포함한다.
당업자는 화학식 (I)의 양이온 및 대응하는 Xn - 음이온 모두가 단리될 수 있고 본 명세서에 개시된 방법 및 조성물에서 사용될 수 있는, 단리되고 전기적으로 중성인 염 화합물을 생성하도록 적절한 비율로 조합되어야 함을 인식할 것이다. 따라서, 전체로서 염 화합물에 적용될 경우 전기적 중성의 상태를 표현하는 한 방식은 이러한 화합물이 다음 화학식을 가질 수 있음을 인식하는 것이다:
N[양이온]m+M[음이온]n+
여기서 지수 M, N, m 및 n은 각각 독립적으로 1 내지 4이고, 단 곱 (M x n) = (m x N)이어서 중성 염을 형성한다.
본 개시는 다음을 포함하는 화합물에 또한 관련된다:
a) 다음 화학식을 가지는 양이온:
Figure pct00057
또는
Figure pct00058
여기서
i) L은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 4 내지 30 개의 탄소 원자를 포함하는 연결기이고;
ii) E는 질소 또는 인이고;
iii) R', R", 및 R"'은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 1 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 라디칼에서 각각 독립적으로 선택되고;
iv) R5, R6, 및 R7은 본 명세서에서 정의된 바와 같이 각각 독립적으로 수소 또는 전자 활성화 모이어티이고;
b) 본 명세서에서 추가로 정의된 바와 같은 화학식 X를 가지는 최소한 하나의 음이온, 여기서 양이온 및 음이온은 중성의 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 존재한다.
본 개시의 한 구체예는 R5, R6, 및 R7이 각각 독립적으로 수소 또는 다음에서 독립적으로 선택되는 전자 활성화 모이어티인 화합물에 관련된다:
i) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
ii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알킬;
iii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알콕시;
iv) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알콕시; 또는
v) -N(R2)2, 각각의 R2는 독립적으로 수소 또는 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬이다.
한 구체예는 각각의 전자 활성화 모이어티가 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, sec-부틸, 이소-부틸, tert-부틸, 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 및 tert-부톡시에서 독립적으로 선택되는 화합물에 관련된다.
이 구체예의 특정 일반적 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00059
,
Figure pct00060
,
Figure pct00061
및
Figure pct00062
.
이 구체예에 따른 특정 화합물의 예는 다음을 포함한다:
Figure pct00063
,
Figure pct00064
,
Figure pct00065
,
Figure pct00066
.
또 다른 구체예는 다음 화학식을 가지는 화합물을 포함한다:
Figure pct00067
또는
Figure pct00068
여기서 지수 n은 4 내지 약 24이고, 또는 지수 n은 5 내지 20이고, 또는 지수 n은 6 내지 16이고, 또는 지수 n은 7 내지 16이고 또는 지수 n은 8 내지 12이다. 이 구체예의 한 예는 지수 n이 10인 화합물을 포괄한다.
한 구체예는 각각 독립적으로 다음에서 선택되는 R1', R1'', 및 R1''' 단위에 관련되고:
i) C6 또는 C10 치환되거나 치환되지 않은 아릴; 또는
ii) C7-C12 치환되거나 치환되지 않은 아릴알킬렌;
이들 각각은 독립적으로 다음에서 선택되는 하나 이상의 단위로 선택적으로 치환된다:
i) 메틸, 에틸, n-프로필, 이소-프로필, n-부틸, 또는 tert-부틸;
ii) 메톡시, 에톡시, n-프로폭시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 또는 tert-부톡시;
iii) 플루오로, 클로로, 브로모, 아이오도;
iv) -NH2, -NHCH3, -N(CHs)2 -NH(CH2CH3), -N(CH2CH3)2;
v) -C(O)OH, -CO2CH3, -CO2CH2CH3, -CO2CH2CH2CH3;
vi) -COCH3, -COCH2CH3, -COCH2CH2CH3;
vii) -C(O)NH2, -C(O)NH CH3, -C(O)N(CH3)2, -C(O)NH(CH2CH3), - C(O)N(CH2CH3)2;
viii) -CN;
ix) -NO2; 및
xii) -SO2OH, -SO2CH3; -SO2NH2.
이 구체예의 예는 치환된 페닐 또는 벤질에서 각각 독립적으로 선택되는 R', R", 및 R"' 단위를 포함한다. 이 구체예의 비제한적 예는 각각 페닐 또는 벤질인 R', R", 및 R"' 단위를 포함한다.
본 명세서에 개시된 화합물의 합성
다양한 방법 및/또는 전략이 문헌에 개시되었고, 앞에서 기재된 바와 같은 화학식 (I)의 양이온 및 Xn - 음이온을 가지는 염의 합성 또는 생성에서 사용될 수 있다. 몇 가지의 이러한 합성 방법 및/또는 전략이 본 명세서에서 아래에 개시될 것이다.
도식 I은 본 개시의 화합물 제조 과정을 개략한다.
도식 I
Figure pct00069
시약 및 조건: (a)(i) NaBH4, MeOH; (ii) (CH3)2SO4, NaOH.
Figure pct00070
시약 및 조건: (b)(i) n-BuLi, TMEDA; (II) CuCN, CH2=CH(CH2)n-2Br.
Figure pct00071
시약 및 조건: (c) 9-BBN
Figure pct00072
시약 및 조건: (d) CH3SO4Cl.
Figure pct00073
시약 및 조건: (e)(i) NaI; (ii) P(C6H5)3.
Figure pct00074
시약 및 조건: (f) Ce(NH4)2(NO3)6.
실시예 1
다음은 지수 n이 4 내지 20이고, 연결기가 메틸렌 단위를 포함하는 본 개시의 유사체를 제조하기 위한 일반적 절차이다.
출발 물질 1, 예를 들어, 2,3-메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴논은 Lipshutz, B.H. et al., (1998) Tetrahedron 54, 1241-1253의 절차에 따라 제조될 수 있고, 상기 문헌은 적절한 정도까지 본 명세서에 포함된다.
중간체 2는 출발 물질 1의 반응, 예를 들어 본 명세서에 전체가 참고문헌으로 포함되는 Carpino, L.A. et al., (1989) J. Org . Chem. 54, 3303-3310의 절차에 의하여 메탄올에 섞인 소듐 보로하이드라이드를 이용하여 2,3,4,5-테트라하이드록시톨루엔으로 2,3-디메톡시-5-메틸-1,4-벤조퀴논의 환원에 이어서, Lipshutz의 절차에 따른 NaOHZ(CH3)2SO4를 사용한 메틸화에 의하여 제조된다.
중간체 3의 제조: 건조 헥산(80 mL) 및 N,N, N' , N'-테트라메틸에틸렌디아민(8.6 mL)에 섞인 중간체, 2(30 mmol)의 용액을 비활성 분위기하에 건조 쉬링크(Schlenk) 튜브에 넣는다. n-부틸 리튬의 헥산 용액(1.6 M, 26.2 mL)을 실온에서 천천히 첨가하고, 이후 혼합물을 냉각하고 0℃에서 약 1 시간 동안 교반한다. 이후 용액을 -78℃로 냉각하고, 건조 테트라하이드로퓨란(250 mL)을 첨가한다. 이 시점에서 포뮬레이터(formulator)가 고리가 진행 전에 완전히 메탈레이트화(metalated) 되었는지를 결정하기 위하여 반응 용액을 분석할 수 있다. 이후 반응 용기의 내용물을 비활성 분위기하에 CuCN(6 mmol)을 수용하는 두 번째 쉬링크 튜브에 옮긴다. 이후 혼합물을 0℃로 10 분 동안 가온한 다음, -78℃로 재냉각한다. ω-브로모올레핀(ω-브로모올레핀의 반응성에 따라 25% 내지 50% 과량)을 첨가한다. 시약은 연결기, -[CH2]n-의 길이에 따라 다양할 가변적일 것이다. 지수 n이 10인 최종 화합물을 위하여, 10-브로모데크-1-엔이 이 단계를 위하여 사용된다. ω-브로모올레핀을 첨가하면, 용액은 가온되고 포뮬레이터가 반응이 완료됨을 결정할 때까지 실온에서 교반되도록 한다. 이후 반응을 10% 수성 NH4Cl(~75 mL)로 퀀칭(quenching)하고, 결과적인 용액을 용매로 수차례 추출한다. 조합된 용매 추출물을 조합하고 물, 10% 수성 NH4OH, 및 브라인(brine)으로 세척한다. 유기상을 임의의 적절한 건조제로 건조할 수 있고, 그 후 용매를 감압하에 제거한다. 이 시점에서, 포뮬레이터가 미정제 생성물을 정제하거나, 물질이 충분한 순도를 가지는 것으로 결정될 경우에 진행할 수 있다.
중간체 4: 건조 THF(45 mL)에 섞인 중간체 3(33 mmol)의 용액을 20 분에 거쳐 한 방울씩 THF(40 mmol)에 섞인 9-보라바이사이클로 [3.3.1]노난(9-BBN)의 교반되는 현탁액에 25℃에서 첨가한다. 결과적인 용액을 실온에서 교반한 다음, 필요한 경우 포뮬레이터가 반응이 완료된 것으로 결정할 때까지 약 60℃ 내지 약 65℃로 가열한다. 혼합물을 0℃로 냉각하고, 3 M NOH(~53 mL)를 한 방울씩 첨가한다. 첨가가 완료된 후, 30% 수성 H2O2 용액(~53 mL)을 첨가한다. 용액이 대략 30 분 동안 실온에서 교반되도록 한 다음, 수상을 NaCl로 포화시키고 THF로 수차례 추출한다. 유기상을 조합하고, 브라인으로 세척하고, 건조한다. 용매를 증발로 제거하여 미정제 중간체 4를 제공한다. 이 시점에서, 포뮬레이터가 미정제 생성물을 정제하거나, 물질이 충분한 순도를 가지는 것으로 결정될 경우에 진행할 수 있다.
중간체 5의 제조: 메틸렌 클로라이드(50 mL)에 섞인 중간체 4(15 mmol) 및 트리에틸아민(30 mmol)의 용액을 실온에서 교반한 다음 메틸렌 클로라이드(50 mL)에 섞인 메탄설포닐 클로라이드(15.75 mmol)를 대략 30 분에 걸쳐 한 방울씩 첨가하고, 그 후 반응이 완료된 것으로 판단될 때까지 교반되도록 한다. 반응 용액을 메틸렌 클로라이드(50 mL)로 희석하고, 유기층을 물, 이후 10% 수성 NaHCO3로 수차례 세척한다. 이후 용액을 건조하고 진공에서 농축하여 미정제 생성물을 제공한다. 이 시점에서 포뮬레이터가 미정제 생성물을 정제하거나, 물질이 충분한 순도를 가지는 것으로 결정될 경우에 진행할 수 있지만, 전형적으로 미정제 물질이 직접 사용될 수 있다.
중간체 6의 제조: 미정제 중간체 5(9.0 mmol)를 키맥스(Kimax) 튜브에서 트리페닐포스핀(15.6 mmol) 및 NaI(51.0 mmol)과 혼합하고, 아르곤하에 밀봉한다. 이후 혼합물을 자석 교반하며 약 3 시간 동안 70-74℃에서 유지시키는데, 그 시간 동안 혼합물에 용융된 액체로부터 유리질 고체로의 변화가 있다. 이후 튜브를 냉각하고, 잔류물을 메틸렌 클로라이드(30 mL)로 처리한다. 전형적으로 생성되는 현탁액을 여과하고, 여과액을 감압하에 증발시킨다. 결과적인 잔류물을 메틸렌 클로라이드(최소량)에 용해하고 포뮬레이터의 선택에 따라 디에틸 에테르 또는 펜탄으로 트리터레이션(trituration)한다. 침전물을 트리터레이팅 용매로 여과 세척하고, 건조하여 원하는 중간체 6을 제공한다.
최종 유사체의 제조: 메틸렌 클로라이드(80 mL)에 섞인 중간체 6(7.8 mmol)의 용액을 분별 깔때기에서 약 5 분 동안 10% 수성 NaNO3(50 mL)와 함께 흔든다. 유기층을 분리하고 건조하고 여과하고 진공에서 농축하여 중간체 6의 니트레이트 염을 제공한다 (전형적으로 이 전환은 100%이다). 염을 아세토니트릴과 물의 혼합물(7:3, 38 mL)에 용해하고 얼음조에서 0℃에서 교반한다. 피리딘-2,6-디카르복실산(39 mmol)을 첨가하고, 이어서 아세토니트릴/물(1:1, 77 mL)에 섞인 세릭 암모늄 니트레이트(39 mmol)의 용액을 약 5 분에 걸쳐 한 방울씩 첨가한다. 반응 혼합물을 차가운 가운데 약 20 분 동안 교반한 다음 실온에서 10 분 동안 교반한다. 이후 반응 혼합물을 물(200 mL)에 붓고 메틸렌 클로라이드(200 mL)로 추출한다. 유기층을 건조하고 여과하고 농축하여 최종 유사체를 니트레이트 염으로 제공한다. 니트레이트 염을 메틸렌 클로라이드(100 mL)에 용해하고 이를 20% 수성 KBr(50 mL)과 함께 흔들어 브로마이드 염을 형성한다. 유기층을 수집하고 건조하고 농축하여 최종 유사체를 브로마이드 염으로 제공한다.
실시예 2
[10-(2,5-디하이드록시-3,4-디메톡시-6-메틸페닐)데실]트리페닐포스포늄 브로마이드
2-(10-하이드록시데실)-5,6-디메톡시-3-메틸사이클로헥사-2,5-디엔-1,4-온(250 g, 740 mmol)을 메틸렌 클로라이드(2.5 L)에 용해하고, 이후 혼합물을 비활성 분위기하에 10℃로 냉각한다. 트리에틸아민(125 g, 1.5 mol)을 한 번에 첨가하고, 혼합물이 10℃로 재평형되도록 한다. 이후 메틸렌 클로라이드(500 mL)에 섞인 메탄설포닐 클로라이드(94 g, 820 mmol)의 용액을 대략 10-15℃의 내부 온도를 유지하도록 하는 속도로 차츰 첨가한다. 반응 혼합물을 추가 15-20 분 동안 교반한다. 이후 혼합물을 물(850 mL)로 세척하고 수성 소듐 바이카르보네이트 용액(850 mL)으로 포화시킨다. 유기층을 감압하에 40-45℃에서 적색 액체로 증발시킨다. 추가 2-4 시간 동안 고진공하에 주위 온도에서 건조한 후, 미정제 생성물을 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용한다.
10-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소사이클로헥사-1,4-디에닐)데실 메탄설포네이트(310 g, 740 mmol)를 MeOH(2L)에 용해한 다음, 혼합물을 비활성 분위기하에 0-5℃로 냉각한다. 소듐 보로하이드라이드(30 gm, 790 mmol)를 내부 온도가 약 15℃를 초과하지 않음을 보장하는 속도로 일부분씩 첨가한다. 반응의 완결은 적색에서 황색으로의 색상 변화를 동반한다. 반응 혼합물을 추가 10-30 분 동안 교반한 다음, 반응 완결도를 체크한다. 혼합물을 2 L의 2M HCl로 퀀칭하고 1.2 L의 메틸렌 클로라이드로 세 번 추출한다. 이후 조합된 유기상을 물(1.2 L)로 한 번 세척하고 건조한다. 그 후 그대로의 유기물을 감압하에 40-45℃에서 황색/갈색 시럽으로 증발시킨다. 이후 물질을 실온에서 추가 2-8 시간 동안 건조하여 304 g(98.9 % 수율)의 원하는 생성물을 제공하고, 이는 추가의 정제 없이 다음 단계에서 사용된다.
트리페닐포스핀(383 g, 1.46 mol)을 둥근바닥 플라스크 안의 10-(4,5-디메톡시-2-메틸-3,6-디옥소사이클로헥사-1,4-디에닐)데실 메탄설포네이트(304 g, 730 mmol)에 첨가한다. 이후 플라스크를 회전 증발기에 부착하고, 내용물을 80-85℃의 온도로 조(bath)에서 진공하에 가열한다. 혼합물이 용융물을 형성하고 탈기가 더 이상 분명하지 않으면, 진공을 비활성 분위기에 의하여 해제하고, 혼합물을 80-85℃로 설정된 조에서 대략 3 일 동안 부드럽게 회전시킨다. 이후 혼합물을 약 실온으로 냉각하고 메틸렌 클로라이드(800 mL)에 용해한다. 이후 에틸 아세테이트(3.2 L)를 온화한 가온과 함께 일부분씩 첨가하여 원하는 생성물을 과량의 트리페닐포스핀으로부터 침전시킨다. 용매 부피를 감소시키고, 이후 잔류 혼합물을 실온으로 냉각하고 따라낸다. 이후 남아 있는 시럽성 잔류물을 에틸 아세테이트(3.2 L)로 두 번 더 처리한 다음 고진공하에 건조하여 441 g(89.5% 수율)의 원하는 생성물을 제공한다.
앞에서 얻은 미정제 물질(440 g, 5.65 mol)을 메틸렌 클로라이드(6 L)에 용해하고, 플라스크를 산소로 퍼징(purging)한다. 플라스크의 내용물을 산소 분위기하에 30 분 동안 격렬하게 교반한다. 건조 디클로로메탄에 섞인 0.65 M NaNO2의 용액(100 mL, 2 mol% NaNO2)을 한 번에 빠르게 첨가하고, 혼합물을 산소 분위기하에 4-8 시간동안 실온에서 격렬하게 교반한다. [반응이 비완결인 것으로 간주될 경우 추가의 NaNO2를 첨가할 수 있다.] 용매를 감압하에 진공으로 제거하여 적색 시럽성 잔류물을 제공한다. 이 잔류물을 40-45℃에서 메틸렌 클로라이드(2 L)에 용해한다. 이후 에틸 아세테이트(3.2 L)를 온화한 가온과 함께 일부분씩 첨가하여 원하는 생성물을 침전시킨다. 오일성 잔류물을 고진공하에 건조하여 419 g(94% 수율)의 원하는 생성물을 적색 유리로 제공한다.
생물학적 활성
앞에 기재된 염은 인간 질환, 특히 양성 증식증 및 다양한 암을 포함하는 비제어 세포 증식 질환과 관련되거나 이들 대신인 다수의 시험관 내 생물학적 검사에서 강력한 화합물인 것으로 밝혀졌다.
본 명세서에 기재된 화합물의 생물학적 활성은 다양한 인간 종양 세포주 및 원발성 종양 세포 배양물의 성장을 억제하거나 죽이는 상대적인 능력에 대하여 염을 테스트하여 측정, 선별 및/또는 최적화될 수 있다.
이러한 테스트에 사용될 수 있는 종양 세포주는 암 및/또는 비제어 세포 증식 질환을 모델링하는 공지 세포주를 포함하지만 이에 제한되지 않으며, 예컨대 다음과 같다:
백혈병에 대하여: CCRF-CEM, HL-60 (TB), K-562, MOLT-4, RPMI-8226, 및 SR. 폐암: A549/ATCC, EKVX, HOP-62, HOP-92, NCI-H226, NCI-H23, NCI-H322M, NCI-H460, 및 NCI-H522.
결장암: COLO 205, HCC-2998, HCT-116, HCT-15, HT-29, KM-12, 및 SW-620.
CNS 암: SF-268, SF-295, SF-539, SNB-19, SNB-75, U-231, U-235 및 U-251.
흑색종: LOX-IMVI, MALME-3M, M-14, SK-MEL-2, SK-MEL-28, SK- MEL-5, UACC-257, 및 UACC-62.
난소암: IGR-OVI, OVCAR-3, OVCAR-4, OVCAR-5, OVCAR-8, 및 SK-O V-3.
신장암: 786-0, A-498, ACHN, CAKI-I, RXF-393, RXF-631, SN12C, TK-10, 및 U0-31.
전립선암: DU-145, PC-3 CWR22 전립선암: DU-145, PC-3 CWR22
유방암: MDA-MB-468, MCF 7, MCF7/ADR-RES, MDA-MB-231/ATCC, HS578T, MDA-MB-435, MDA-N, BT-549, 및 T-47D.
췌장암: PANC-I, Bx-PC3, AsPC-I.
선별될 화합물이 상기 암 세포주 중 하나 이상에 도포된 후, 일부 구체예에서 배지 내의 살아 있는 세포 수를 시간의 함수로 측정하기 위하여 당업자에게 공지인 다양한 검사 절차를 이용하여 항암 유효성이 측정된다.
공지된 한 절차는 죽은 세포로부터 살아 있는 세포를 구별하기 위하여 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디페닐테트라졸륨 브로마이드("MTT")를 이용한다. MTT 검사는 살아 있는 종양 세포 미토콘드리아의 활성 디하이드로제네이즈에 의한 암청색 포르마잔 생성물의 생성에 기초한다. 암 세포를 선별될 화합물에 고정된 날짜 동안 노출시킨 후, 단지 살아 있는 세포만이 활성 디하이드로제네이즈를 포함하며, MTT로부터 암청색 포르마잔을 생성하고 착색된다. 살아 있는 세포의 수는 595 nm에서 포르마잔에 의한 가시광선의 흡수에 의하여 측정된다. 일부 구체예에서 항암 활성이 플라시보로 처리된 배지의 종양 세포 성장의 퍼센트로서 기록된다. 이러한 MTT 검사 절차는 결과가 수주 또는 수개월을 필요로 하는 것과 반대로 일 주일 안에 획득된다는 점에서, 마우스와 같은 통상적인 실험실 동물을 사용하는 생체 내 검사보다 장점을 가진다.
이러한 MTT 항암 활성 선별 검사는 개별적 화합물의 일반적 세포독성에 관한 데이터를 제공한다. 특히, 본 명세서의 실시예에 기재된 바와 같이, 활성 항암 화합물은 종양 세포의 세포 성장을 억제하거나 종양 세포를 죽이도록, 예를 들어 백혈병, 폐암, 결장암, CNS 암, 흑색종, 난소암, 신장암, 전립선암, 유방암, 또는 췌장암과 같은 하나 이상의 배양된 인간 종양 세포주에 약 10 μM의 농도의 화합물을 가하여 식별될 수 있다.
본 개시의 일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 화합물은, 상기 암 세포주 중 하나의 배지에 약 10 μM 이하의 농도로 최소한 약 5 일의 기간 동안 도포될 경우, 본 개시의 화합물을 포함하지 않는 대조군과 비교하여 약 50% 이상의 정도까지 암 세포가 사멸하거나 암 세포의 성장이 억제된다면, 특정 암의 치료에 생물학적으로 활성인 것으로 간주된다.
DNA 검사를 위하여, 각각의 배양 플레이트가 해동되고 빛으로부터 보호되며 실온으로 평형된다. 이후 Hoechst 33258 또는 Hoechst 33342 염료를 각각의 웰에 200 ㎕의 고염 TNE 버퍼 (10 mM Tris, 1mM EDTA, 2 M NaCl [pH 7.4]) 중에 6.7 ㎍/mL의 최종 농도로 첨가했다. 실온에서 빛으로부터 보호하며 2 시간 동안 추가로 배양한 후, 배양 플레이트를 360/460 nm 필터 여기 및 방사 세트를 이용하여 CytoFluor 2350™ 스캐너에서 스캔했다. DNA 형광 강도를 세포 성장의 측정치로서 사용했다.
특히, 구조가 아래에 나타나는 두 가지 특정 염의 생물학적 활성을 전립선암 성장 억제 또는 치료에 대한 관련성에 대하여 검사했다.
Figure pct00075
"MitoQ-CIO"
Figure pct00076
실시예 3
4 일의 기간에 걸친 LNCaP 및 PC-3 세포의 성장에 대한 다양한 농도의 Mito-Q 약물의 효과를 앞에서 기재된 Hoechst 염료-DNA 형광 검사를 이용하여 검사했다. 이를 비롯하여 아래 기재된 모든 이어지는 세포 배양 연구에서, 각각의 데이터 점 및 이에 연관된 오차 막대가 각각 세 번의 개별적인 실험 세트에서 중복된 96-웰 플레이트 런의 여섯 웰로부터 얻은 데이터의 평균 값 및 표준 편차이다.
결과는 도 1에 나타난다. Mito-Q-C10 처리는 LNCaP 및 PC-3 세포 모두의 성장을 억제한다.
LNCaP 전립선 종양 세포에서 산화 스트레스 수준에 대한 Mito-Q-C 10의 억제 효과는 DCF 형광/Hoechst 염료-DNA 형광의 비율에 의하여 또한 결정될 수 있다 (Ripple MO, Henry WF, Rago RP, Wilding G. Prooxidant-antioxidant shift induced by androgen treatment of human prostate carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 1997 Jan 1;89(1):40-8). DCFH는 ROS에 의하여 DCF로 산화되어 DCF (6-카르복시-2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트) 염료의 녹색 형광에 의하여 모니터링되는, 쉽게 정량 가능한 ROS 수준을 산출한다.
1 nM의 안드로겐 유사체 메트리볼론으로 처리된 LNCaP 세포의 DCF 형광은, 개별적인 세포당 산화 스트레스 수준을 평가하기 위하여 동일한 세포에서 다양한 농도의 Mito-Q-C 10에서 Hoechst 염료-DNA 복합체의 청색 형광으로써 정규화되었다.
LNCaP 전립선 종양 세포에서 산화 스트레스 수준에 대한 Mito-Q-C 10의 억제 효과는 DCF 형광/Hoechst 염료-DNA 형광의 비율에 의하여 또한 결정될 수 있다 (Ripple MO, Henry WF, Rago RP, Wilding G. Prooxidant-antioxidant shift induced by androgen treatment of human prostate carcinoma cells. J Natl Cancer Inst. 1997 Jan 1;89(1):40-8). DCFH는 ROS에 의하여 DCF로 산화되어 DCF (6-카르복시-2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트) 염료의 녹색 형광에 의하여 모니터링되는, 쉽게 정량 가능한 ROS 수준을 산출한다.
1 nM의 안드로겐 유사체 메트리볼론으로 처리된 LNCaP 세포의 DCF 형광은, 개별적인 세포당 산화 스트레스 수준을 평가하기 위하여, 동일한 세포에서 다양한 농도의 Mito-Q-C10에서 Hoechst 염료-DNA 복합체의 청색 형광으로써 정규화되었다.
LNCaP 전립선 종양 세포에서 산화 스트레스 수준에 대한 MitoQ-C10의 억제 효과는 DCF 형광/Hoechst 염료-DNA 형광의 비율에 의하여 또한 결정될 수 있다. MitoQ 처리는 도 3에 나타난 DCF 형광/DNA 형광 검사에 의하여 결정된 바와 같이 LNCaP 세포의 산화 스트레스를 현저하게 감소시켰다. Mito-Q-C10 처리는 약 1-10 μM 이상의 농도에서 LNCaP 세포의 ROS 수준을 효과적으로 그리고 재현적으로 감소시켰다. Mito-Q-C10 처리 유발된, DCF 검사에 의하여 결정된 산화 스트레스의 감소 및 MTT 검사에 의하여 결정된 미토콘드리아 기능의 감소가, 도 4에 나타난 DNA 검사에 의하여 결정된 전립선 종양 세포 성장의 억제에서의 Mito-Q-C10의 효과와 유사함에 유념해야 한다. 이 산화 스트레스는 아마도 세포자멸성(apoptotic) 및/또는 괴저성(necrotic) 세포 사멸 동안 증가한 지질 과산화로 인한 것이다.
도 5에 나타난 결과는 준치사 용량(1 μM)의 Mito-Q-C10 사전처리가 LNCaP 세포에서 안드로겐(메트리볼론) 처리에 의하여 유발된 산화 스트레스를 또한 완전히 차단할 수 있음을 명백하게 증명한다. 이는 안드로겐이 전립선암 및 양성 전립선 증식증을 포함하지만 이에 제한되지 않는 다른 전립선 질환의 주된 야기 동인인 산화 스트레스 발생의 주요 원인임을 또한 증명했다. 따라서, Mito-Q-C10 처리의 항산화제 효과는 일반적으로 암, 암 진행 및 암 전이 및 구체적으로 전립선암을 야기하는 가장 중요한 대사 생성물 중의 하나를 제거할 수 있다.
도 6은 전립선암 세포가 Mito-Q-C10으로 처리될 경우, Mito-Q-C10의 세포 내 수준이 세포 생존과 반비례 관계임을 나타낸다.
Mito-Q-C10은 5 mg/kg i.p의 용량으로 동물에게 안전하게 주입될 수 있다. 이 용량에서, 처리의 처음 한 시간의 Mito-Q-C10의 혈청 수준은 10-20 mg/ml이고, 이는 전립선암 세포에서 안드로겐 유발된 산화 스트레스를 차단하기 위하여 필요한 Mito-Q-C10 농도보다 10-20 배 위이다. Mito-Q10은 750 nmol(약 20 mg/kg)에서 독성이 아니지만, 1000 nmol(약 27 mg/kg)에서는 독성이 분명하다. MitoQ10은 현재 제약으로서 개발되고 있다. 상용으로 만족스러운 제제를 위하여 메탄설포네이트 상대음이온을 가지는 화합물을 제조하는 것이 유리함이 밝혀졌고, 이는 취급, 장기 보관, 및 제조를 용이하게 하기 위하여, β-사이클로덱스트린에 흡착된다. 이러한 제제는 쉽게 정제로 제조되었고 10.6mg/kg의 수준에서 관찰 가능한 부작용이 없는 종래의 동물 독성 선별을 통과했다. 경구 생체이용성은 대략 10%에서 결정되었고, 소변 중의 주요 대사물질은 탈메틸화된 화합물과 함께 환원된 하이드로퀴논 형태의 설페이트 및 글루쿠로나이드이다. 제I상 인간 시험에서, MitoQ10은 혈장 Cmax = 33.15 ng/mL 및 Tmax 약 1hr을 야기하는 80 mg(1 mg/kg)의 경구 복용으로써 우수한 약동학적 거동을 나타냈다. 이 제제는 우수한 약제학적 특징을 가진다.
실시예 5a
PMCol은 배지에서 안드로겐-의존성(LNCaP 및 LAPC4) 또한 안드로겐-비의존성(DU-145) 인간 전립선 종양 세포의 성장을 억제할 뿐만 아니라, 자발적 TRAMP 마우스 종양의 성장도 억제한다. 액체 크로마토그래피-질량 분석(LC-MS) 해석을 이용한, 100 mg/kg PMCol p.o. 또는 5 mg/kg의 PMCol i.v. 투여된 마우스에서의 PMCol의 약동학적 (PK) 연구. 데이터는 경구 PMCol 투여 후 15 분 및 i.v. 주입 후 2 시간 내에, PMCol의 혈청 수준이 빠르게 하락하고 p.o. 투여 후 1 시간 또는 i.v. 투여 후 4 시간에 검출될 수 없음을 나타낸다. Mito-PMCol-C0-1 유사 Mito-VE-C2는 약 4 내지 약 6 mg/kg으로 300 nmol 정맥 내 투여에서 독성을 나타내지 않는다. Mito-PMCol, Mito-PMQ 또는 Mito-PMHQ가 정맥 내 주입에 의하여 마우스에게 투여될 경우, 이들은 혈장으로부터 제거되어 심장, 뇌, 골격근, 간, 전립선 및 신장 그리고 다른 기관에 축적될 수 있다. 이러한 실험은 혈류에서, 알킬TPP-크로만올 및 알킬TPP-하이드록실화 크로만, Mito-PMCol, Mito-PMQ 및 Mito-PMHQ 화합물이 각각 기관으로 빠르게 재분포되면; 마우스에게 삼중수소화 화합물을 공급하여 나타나는 바와 같이, TPP-유도된 Mito-PMCol, Mito-PMQ 및 Mito-PMHQ 또는 Mito-템폴 화합물이 마우스에게 경구적으로 생체 이용가능성임을 나타낸다. 설치류의 식수에 Mito-PMCol을 투여하는 것은 혈장으로, 그리고 혈장으로부터 심장, 뇌, 간, 신장, 및 근육으로의 흡수를 유발한다. Mito-PMCol은 대략 1.5 일의 반감기를 가지는 1차 반응에 의하여 유사한 속도로 모든 기관으로부터 제거되는 것으로 나타났다. 그러므로, 이러한 연구는 생물막을 통한 용이한 투과로 인하여 모든 기관에 분포하는 경구 투여된 알킬TPP 화합물에 부합한다.
전립선 종양 성장에 대한 PMCol의 억제 효과가 잘 특성화된 마우스 전립선의 유전자변형 선암종(TRAMP) 모델에서 테스트된다. 100 mg/kg의 PMCol 용량이 물질의 MTD이다. PMCol 처리된 동물에서의 종양 발생은 대조군 동물에 비하여 8 주 넘게 지연되었다.
마우스 혈청 경구 투여 후 15 분에 마우스 혈청에서 검출된 경구 투여된 PMCol에 대한 LC-MS 용리 프로파일이, PMCol 피크가 사라짐에 따라 혈장에서 주요한 새로운 피크가 나타남을 보여준다. 이 새로운 피크는 237의 분자 이온 질량(m+/z)을 가지는 약제를 포함하는데, 이는 문헌(28 및 관련 참고문헌)에 보고된 것과 동일하다. 이 PMCol 대사물질은 혈청에 최소한 24 시간 동안 잔류했는데, 24 시간은 PK 연구의 최후 시점이었다. 본 발명자들은 또한 PMCol이 37℃에서 12 h 동안 산화될 경우 동일한 체류 시간 및 m+/z가 나타남을 재현했다. 이러한 결과는 PMCol이 체내에서 하이드록실화-PMCol로 산화됨을 매우 강하게 나타낸다. 하이드록실화-PMCol(PMQ)의 용리 프로파일 및 물질 분열 패턴은 주요 산화 대사물질과 유사하다. 하이드록실화-PMCol 생성물은 문헌에서 보고되고 주요 체내에서 대사물질과 일치한다.
배지 또한 생체 내 모두에서 PMCol은 활성 물질이고 포유류 조직 및 기관에서 산화에 의하여 더욱 대사된다. PMCol은 안드로겐-의존성 및 안드로겐-비의존성 전립선 종양 세포 모두에 대하여 특이적으로 지향되는 현저한 활성을 나타낸다.
생체 내 전립선 종양의 성장 억제에서 PMCol-C2 또는 Mito-PMCol-C10의 효능을 테스트하기 위하여, PMCol 약물 제제가 표준화되고, 이의 투여 경로가 결정되며, 경구로 또는 i.v. 주입에 의하여 투여될 경우 최대내용량(maximum tolerated dose, MTD)이 결정되었다. PMCol 또는 Mito-PMCol-C2 또는 다른 유사체가 PEG-400에서 경구로 (p.o.) 또는 에탄올과 프로필렌 글리콜의 혼합물에서 정맥 내 (i.v.) 주입에 의하여 성인 종양 보유 마우스에 안전하게 투여될 수 있다. 이러한 조건하에, PMCol의 최대내용량(MTD)은 마우스에 각각 p.o. 또는 i.v.에 대하여 100 mg/kg 또는 7.5 mg/kg이다. PMCol은 래트에서 경구로 매일 주어진 2 그램/킬로그램/일의 DLT를 가진다.
Mito-Q-C10와 유사하게, Mito-PMCol-C2 및 Mito-PMCol-C10이 미토콘드리아의 내막을 향하여 ROS 생성을 차단할 수 있다. 일부 구체예에서, 임상적으로 유용한 CaP 화학치료 및 화학예방제로서 Mito-PMCol 분자의 개발을 위한 시험관 내 및 생체 내 연구가 결정되었다.
실시예 6
여기에는 PMCol, (그리고 이성질체 및 유사체), Mito-PMCol, Mito-PMQ, Mito-PMHQ 및 Mito-PMDHQ 및 PMCol 및 유사체의 아스코르베이트를 포함하는 제제의 설계, 아스코르베이트와 함께하는 재순환, 합성이 기재된다. 일부 구체예에서 이들은 배지에서 그리고 생체 내 포유류 전립선 종양의 치료적 처리에 대하여 CaP 세포를 억제하는 활성 물질이다. 다른 구체예에서, Mito-PMCol 기초의 약물이 전립선암에 대하여 예방적 또는 치료적이다. 이는 보조 요법으로서 원발성 전립선 종양의 치료를 위하여 수술 또는 방사선요법을 겪은 개체의 종양 재발을 지연시키거나 감소시킬 수 있다. Mito-PMCol은 위험이 있는 남성을 위한 CaP 화학예방 약물로서의 용도를 위하여 개발될 수 있다. Mito-PMCol 및 유사체의 효과적인 느리고 지연된 방출 및 다른 제제가 제제화되고, 이는 일부 구체예에서 Mito-PMCol의 임상 용도에 대하여 규명된 약동학 (PK) 데이터에 따라 개체에게 편리하게 투여된다.
Figure pct00077
Mito-PMQ 및 Mito-PMCol의 화학적 합성. 여기에 일부 구체예에서 강력한 항산화제 및 항종양 약물인 Mito-PMCol의 유도체의 합성을 기재한다. Mito-PMCol의 유사체가 또한 PMCol 세미퀴논 라디칼(SQ)을 안정화하고 퀴논, PMQ으로의 불균등화를 최소화하는 공지된 하위구조를 편입하여 항산화제 및 향상된 항산화제 활성을 나타낸다. 두 번째 접근법에서 향상된 생체이용성을 제공하고 Mito-PMCol의 적절한 제제, 염 및 농도를 표적 영역에 전달하는 개선된 약물 전달 시스템에 편입시키기 위한 Mito-PMCol 유사체를 설계하고 합성하고 특성결정한다.
여기에 임상적 치료 및 예방 용법에 대한 것을 포함하는 개체에서의 테스트에 적절한, 제제에서 증가된 항산화/환원 당량, 생체이용성 및 관련 치료적 활성을 가지는 신규한 비-표적화 또는 미토콘드리아-표적화 PMCol 유사체에 대한 합성 및 테스트를 기재한다. 상기 도식 1에서, Mito-PMCol의 항산화제 특성은 주위 라디칼 (R·)에 의한 H-원자 추출시 안정한 세미퀴논 라디칼(SQ)을 형성하는 크로만올 시스템의 디하이드로퀴논 모이어티의 능력에서 유래한다. 이후 PMCol 및 Mito-PMCol가 아스코르베이트(Asc) 또는 유비퀴놀과 세미퀴논 라디칼(SQ)의 반응에 의하여 재순환되어 이어지는 라디칼 퀀칭을 위한 추가의 라디칼 포획을 거칠 수 있다. 그러나, 항산화제 포획 특성을 가지지 않는 한 분자의 퀴논 PMQ 및 한 분자의 PMCol을 제공하는 두 세미퀴논 라디칼(SQ) 사이의 경쟁적인 불균등화 반응이 라디칼 포획제로서의 약물 비활성화에 대한 메커니즘이다. 그러나, PMQ-유사 유비퀴논은 퀴논 기초의 비-포획 항산화제 및 항암 및 다른 치료적 활성을 조절하는 미토콘드리아 산화적 인산화로 인하여 활성을 가질 수 있다.
불균등화로 인하여, 두 Mito-PMCol 분자마다 하나가 손실된다. 이러한 메커니즘에 기초하여, 불균등화의 최소화가 화합물의 항산화제 포획 수행의 수명을 증가시킨다.
실시예 7
"Mito-트윈 크로만올 및 Mito-트윈 크로마논" Mito-TwCHol)은 더 높은 등급의 항산화제 및 환원된 항산화제로서 식별된다. 일부 구체예에서, Mito-TwCHol 항산화제는 Mito-PMCol보다 항산화제 활성이 향상되고, 이는 세미퀴논 라디칼의 안정성 및 이의 낮은 불균등화 속도에 관련된다. 라디칼 불균등화 속도 감소는 융합된 PMCol 잔기의 메틸렌 가교에 의하여 유발된 스테아르산 환경 증가로 인한 것이다. 더욱이, TwCHol 및 Mito-TwCHol은 두 가지의 디하이드로퀴논 잔기가 모두 대응하는 퀴논, Mito-TwCHQ로의 산화를 거치기 때문에 PMcol 및 Mito-PMCol의 두 배의 환원 당량을 달성한다 (도식 2).
PMCol은 혈액 혈청에서의 생체이용성(경구 PMCol, 4 mg/kg; iv PMCol, 0.5 mg/kg), 및 혈청 반감기(경구 PMCol, 0.5 hr.; iv PMCol, 2.0 hr.)를 가진다. 또한, 100 mg/kg의 경구 PMCol MTD에서 항암 및 다른 치료적 활성에 대하여 생체 내 PMCol에 필요한 농도가 아마도 개체에게 투여한 후 비교적 짧은 시간-프레임 내에 현저하게 증가된 세포 내 미토콘드리아 농도를 달성하는 Mito-PMCol의 능력으로 인하여, Mito-PMCol 투여로써 감소될 수 있다. 관찰된 PMCol의 산 (pH 2.0) 불안정성은 경구 투여될 경우 PMCol의 생체이용성에 부합한다. Mito-PMCol은 PMCol과 마찬가지로 대사되고 빠르게 산화/하이드록실화될 수 있다. Mito-PMCol 산화된 대사물질은 고리-열린 PMQ로서의 PMCol 산화된 대사물질과 유사하게 고리-열린 Mito-PMQ이다.
PMQ에 상응하는 LC-MS 피크가 경구 투여 후 수분 내에 혈청에서 나타나고, 혈액 혈청에서 지속된다. Mito-PMCol, Mito-TwCHol 및 Mito-PMCol 이합체 유사체는, 이들의 비-포접 형태와 마찬가지로, 일부 구체예에서, 미토콘드리아 내막에서 격리된다. 전립선의 PMCol은 증가된 세포 흡수 및 세포질 미토콘드리아에서의 유지를 나타낸다. 다른 구체예에서 Mito-PMCol은 더욱 빠르게 편입되고 더 높은 농도이다.
Figure pct00078
다른 구체예에서 PMCol 유사체의 항산화 및 항암 및 다른 치료적 활성은 생체이용성, 혈청 안정성을 증가시켜, 포유류 기관 및 조직에 의한 흡수를 증가시켜 증가되거나, 앞에서 기재된 PMCol의 유사체에 의하여 증가된다. 신규한 Mito-트윈 PMCol 및 Mito-PMCol 이합체를 포함하는 더 우수한 항산화제 Mito-크로만올을 포함하는 임상적으로 적절하고 편리하게 제조된 신규한 약제학적 제제. 비-표적화된 형태는 1,3,4,8,9,11-헥사메틸-6,12-메타노-12H-디벤조[d,g][1,3]디옥소신-2,10-디올(여기서 TwCol 또는 트윈-크로만올 또는 TwCol로 지칭됨)로서 이의 비-Mito 형태로 지칭된다. Mito-TwCHol은 세포 유리 추출물에서의 미토콘드리아에서 모니터링된 바와 같이, Mito-PMCol의 두 배의 환원 당량을 전달할 수 있고, 산화 스트레스에 노출된 미토콘드리아의 생에너지 및 생화학 파라미터를 개선할 수 있다. 또 다른 구체예에서 최대 50 nmol의 TwCHol/mg 미토콘드리아 단백질 농도에서 독성이 없는 Mito-TwCHol. Mito-TwCol는 시험관 내 인간 세포 및 생체 내 포유류에서 치료적으로 활성이다. Mito-TwCol은 라디칼을 입체적으로 보호하고, 더 많은 중심에 걸쳐 라디칼을 편재화시켜 라디칼 불균등화를 정지시키며, Mito-TwCol 항산화, 항암, 및 다른 치료적 활성을 증가시킨다. 또 다른 구체예에서 Mito-PMCol은 안드로겐-의존성 및 안드로겐-비의존성 인간 전립선 종양 세포로써, 그리고 누드 마우스에서 성장하는 인간 종양 이종이식편 뿐만 아니라 자발적 전립선 종양으로써 항종양 치료적 활성을 가진다.
실시예 8
Mito -트윈 크로만올 및 다른 유도체의 합성 및 구조-활성.
Mito-TwCHol은 TwCHol에 대한 문헌 절차의 변형에 의하여 합성된다 (도식 3). 더욱이, Mito-TwCHol에 대한 구조-활성 연구가 불균등화의 감소된 속도의 원천을 해명한다. 전체 라디칼 안정성 및 항산화제 활성에 대한 메틸렌 가교의 역할을 평가하기 위하여 TwCHol 유사체가 합성된다. 도식 3에 도시되는 바와 같이, 일부 구체예에서 유사체 I-III가 2,3,5-트리메틸-1,4-디하이드로퀴논과 적절한 디카르보닐 화합물 또는 디아세탈의 축합에 의하여 제조된다.
트윈 크로만올 유사체 II는 고분자 합성 및 다른 산업적 응용을 위한 중간체로서 문헌에 이전에 보고되었다. 세 가지 유사체 I-III는 모두 TwCHol 및 Mito-TWCHol과 유사한 4 환원 당량을 가진다.
Mito - PMCol 및 Mito - PMQ 그리고 연결된- 이합체의 합성 및 구조-활성 연구.
Figure pct00079
TwCHol에 대하여 관찰된 향상된 항산화제 활성의 효과를 더욱 조사하기 위하여, 두 가지의 새로운 일련의 이합체 PMCol, Mito-PMCol 및 Mito-PMQ 그리고 유도체가 제조되었다. TwCHol과 마찬가지로, 표적 화합물은 PMCol의 두 배의 환원 당량을 가질 수 있다. 그러나 중간체 세미퀴논 라디칼이 전체 Mito-PMCol-이합체 시스템에 의하여 부여된 더 큰 공명 안정성의 결과로서 더 큰 안정성을 나타낼 수 있다. PMCol 이합체 유도체 V-X의 첫 번째 부류는 두 PMCol 모이어티 사이에 비닐-연결기를 가질 수 있다. 비닐 링커는 두 PMCol 단위에 의한 세미퀴논 라디칼의 공명 안정성의 도관으로서 작용할 수 있다. 이는 안정화 효과를 제공하고 불균등화에 대한 잠재성을 감소시킨다. PMCol-이합체의 합성은 쉽게 입수 가능한 하이드록시메틸 PMCol 유도체로부터 진행된다. 대칭 이합체 (각각의 단량체 단위에 대하여 동일한 PMCol 치환) 및 비대칭 이합체 (단량체 단위에 대하여 상이한 PMCol 치환) 모두가 제조될 수 있다. 비대칭 PMCol 이합체 VIII의 합성의 예가 도식 4에 도시된다.
Figure pct00080
8-하이드록시메틸 및 5-하이드록시메틸 유도체, XI 및 XII는 각각 문헌 절차의 변형을 이용하여 쉽게 입수 가능한 6-하이드록시크로만올로부터 직접적인 방식으로 제조된다. 5-하이드록시메틸 유도체 XII는 톨루엔에 섞인 트리페닐포스핀으로 부수적인 처리를 하며 브롬화에 의하여 포스포늄 염으로 재전환된다. 8-하이드록시메틸 유도체 XI는 Swern 산화에 의하여 알데하이드로 전환된다. 알데이드와 XII의 인 일리드의 Wittig 올레핀화가 원하는 PMCol 이합체 VIII 및 Mito-PMCol 이합체를 제공한다. 트랜스-이성질체가 주 생성물이다. 그러나, 일부 구체예에서 시스-이성질체가 수득되고 항산화제 활성을 가진다.
융합된 PMCol - 이합체 및 Mito - PMCol - 이합체의 합성 및 구조-활성 연구.
Figure pct00081
일련의 융합된 Mito-PMCol 이합체가 또한 항산화제로서 제조되었다. 융합된 PMCol-이합체 유사체 XIII 및 XIV는 융합된 방향족 시스템에 의하여 세미퀴논 라디칼에 제공된 더 큰 공명 안정성으로 인하여 TwCHol보다 더 큰 라디칼 안정성을 나타낸다. 더욱이, 이러한 융합된-이합체는 TwCHol 및 비닐-연결된 PMCol 유도체와 동일한 수의 환원 당량(4 당량)을 가진다.
도식 5에 도시되는 바와 같이, XIII의 합성이 상용화되어 입수 가능한 1,5-디하이드록시-나프탈렌으로부터 달성된다. 오르토-메틸화에 이어 Elb 산화가 원하는 융합된-디하이드로퀴논을 제공한다. 트리플루오로아세트산/물에서 2-메틸-3-부텐-2-올을 사용한 융합된-디하이드로퀴논의 처리가 우수한 수율로 융합된 이합체 XIII를 제공한다. XIV의 합성이 상응하는 1,5-디하이드록시안트라세로부터 유사한 방식으로 달성된다.
추가적인 구조-활성 연구가 Mito-PMCol의 벤조크로만올(XV) 및 나프토크로만올(XVI) 동속종(congener)에 초점을 맞춘다. PMCol의 항산화제 활성은 방향족 고리 시스템과 융합될 경우 현저하게 증가된다. 벤조크로만올 비타민 K1-크로만올은 α-토코페롤(비타민 E)보다 더 큰 항산화제 활성을 나타내는 것으로 보고되었다. XV는 PMCol보다 더 우수한 항산화제일 수 있다. 비록 화합물 XV 및 XVI가 PMCol과 동일한 수의 환원 당량을 가지기는 하지만, 세미퀴논 라디칼의 안정성이 융합된 방향족 시스템의 확장된 공액화(conjugation)로 인하여 증가된다. 이는 감소된 불균등화 속도 및 더 긴 활성 지속기간을 야기한다. 더욱이, 벤조크로만올(XV) 및 나프토크로만올(XVI) 고리 시스템의 치환이 최대 항산화 효율을 위한 디하이드로퀴논의 전자 최적화를 허용한다. 도식 6에 도시되는 바와 같이, 벤조크로만올(XV) 및 나프토크로만올(XVI) Mito-PMCol 동속종이 상응하는 1,4-나프틸디하이드로퀴논 및 1,4-안트릴디하이드로퀴논으로부터 각각 제조된다. 비록 벤조크로만올(XV)이 보고되었기는 하지만, 항산화제 활성이 이전에 생물학적으로 평가되고 과학 문헌에 보고되지 않았다.
Figure pct00082
실시예 9
PMCol 폴리 -(L- 글루타메이트 ) 및 Mito - PMCol 폴리 -(L- 글루타메이트 )의 연구에서 합성 및 활성.
효력(potency) 및 효능(efficacy)이 유지되는 PMCol 활성에서 증가되었음이 혈액 혈청 에스터레이즈 활성화된 PMCol 전구약물 시스템의 제조를 위하거나 약물 전달 골격(scaffold)에 대한 결합을 위한 작용기를 가지는 Mito-PMCol의 단량체 단위 제조에 의하여 측정된다. 하이드록시메틸-PMCol 유사체 XI, XII 및 XVII은 상응하는 6-하이드록시크로만올 유도체의 하이드록시-메틸화에 의하여 쉽게 합성된다 (도식 4 참조). 하이드록실 모이어티는 에스테르 포함 전구약물(석시네이트)을 위한 부착 지점 또는 거대분자 전달 시스템(폴리글루타메이트)에 대한 부착 지점 역할을 한다. 이러한 형태의 Mito-PMCol의 투여는 투약량의 현저한 증가 없이 종양 또는 다른 세포에서 더 큰 농도의 Mito-PMCol을 유발할 수 있다. 아미노메틸-PMCol 유사체 XVIIIa-c는 합성되어 아미드 PMCol-을 제공한다. 이러한 화합물은 상응하는 6-하이드록시크로만올 유도체의 아미노메틸화 또는 상응하는 알코올의 산화 및 환원성 아민화에 의하여 제조된다. 아미노 XVIIIa -c 유도체는 이들이 수성 매질에서 더 우수한 용해도를 제공하고 향상된 생체이용성을 제공하는 산염(HCl, 시트르산)으로 또한 전환될 수 있다는 장점을 제공한다.
Figure pct00083
강력한 항산화제 활성을 나타내는 Mito-PMCol의 알코올 및 아미노 유도체가 거대분자 약물 전달 시스템에서 연구된다. 활성 알코올 PMCol 유도체 XVII 뿐만 아니라 Mito-PMCol이 고분자 뼈대의 카르복실 잔기와 PMCol의 페놀 또는 유사체 XVII의 하이드록실기 사이의 에스테르 연결을 통하여 폴리-(L-글루타메이트) 골격에 부착된다 (도식 7).
Figure pct00084
대안으로, 일부 구체예에서 활성 아민 유사체 XVIII가 고분자 뼈대의 카르복실 잔기와 아미노기 사이의 아미드 연결을 통하여 폴리-(L-글루타메이트)에 부착된다 (도식 7). 폴리-(L-글루타메이트)는 약물 전달을 위한 유용한 골격인 것으로 보고되었다. 카르복실레이트 모이어티는 부착된 약물의 화학을 입체적으로 억제하지 않도록 폴리펩타이드 뼈대로부터 충분히 제거된다. 더욱이, 비결합 카르복실레이트 잔기가 폴리펩타이드-약물 복합체에 대하여 우수한 수용성을 제공한다. 수용성 폴리-(L-글루타메이트)-PMCol-Mito-T 시스템이 혈청 에스터레이즈가 효소적으로 에스테르 또는 아미드 결합의 가수분해를 일으키고 약물을 방출하는 혈액 혈청으로 도입된다. 그 다음 폴리-(L-글루타메이트) 골격이 이어서 무독성 L-글루탐산으로 대사된다. 폴리-(L-글루타메이트)-PMCol 시스템이 문헌에 따라 제조된다. 폴리-(L-글루타메이트)의 Mito-PMCol 부하가 폴리펩타이드 에스테르 연결의 완전한 가수분해에 의하여 측정되고 PMCol 또는 PMCol 유사체에 대한 HPLC 분석이 이어진다.
실시예 10
PMCol의 산화 및 NO 생성물:
Figure pct00085
Figure pct00086
α-토코페롤(α-Toc, ATCoI, 비타민 E, VE)은 생물 시스템에서 편재하는 항산화제이며 다양한 종류의 활성 산소에 의하여 유발되는 산화로부터 생물 분자를 보호한다. 이의 작용은 하나의 전자 환원과 함께 활성 산화제의 퀀칭으로부터 유도되며, 라디칼 사슬 반응이 이 과정에 의하여 종결된다. 산화 질소(NO)가 가장 중요한 생물 라디칼 분자 중 하나이고, 많은 생리학적 현상에서 매개물질로 공지이다. 더욱이, NO는 비교적 높은 농도로 발생될 경우 세포독성 활성을 초래하고, 분자 산소 또는 수퍼옥사이드와 반응하여 삼산화이질소(N2O3), 이산화질소(NO2), 또는 퍼옥시니트라이트를 제공한다. NO 자체의 약한 반응성에도 불구하고 이러한 고차(higher) 질소 산화물(NOx)이 큰 반응성 및 산화 활성을 가지는 것으로 공지이다. NO에서 유래한 이러한 활성 화학종은 신체에 산화적 손상을 입히고, 생물 시스템의 주요 항산화제 중 하나인 α-Toc와 상호작용할 수 있다. 반응 혼합물의 분석을 단순화하기 위하여, 공지 α-Toc 유사체인 2,2,5,7,8-펜타메틸-6-크로만올 (PMC)이 또한 기질이다. 높은 수율의 생성물이 NO 및 O2의 양 및 비율을 제어하여 수득되고, 생성물 분포가 두 기체의 비율 및 혼합 시간에 의하여 변화됨이 밝혀졌다. 반응이 디클로로에탄(DCE)에서 공기에서 PMC 1 및 등몰량의 NO를 이용하여 수행될 경우, 2-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-3,5,6-트리메틸-1,4-벤조-퀴논(PM퀴논, PMQ) (2)가 수득되었다. 구조가 2 및 2,2,7,8-테트라메틸크로만-5,6-디온(PMCred)으로 지정된 두 가지 주 생성물이 수득되었다. 다른 부 생성물 중에서, 두 가지의 화합물이 5-포르밀-2,2,7,8-테트라-메틸-6-크로만올 및 2,3-디하이드로-3,3,5,6,9,10,11a-헵타메틸-7a-(3-하이드록시-3-메틸부틸)-1H-피르-아노[2,3-a]잔텐-8(7aH),11(11aH)-디온으로서 식별되었다. 모든 반응은 세 번 수행되었고, 나타난 반응 수율은 평균값이다. 반응은 드물게 O2의 부재에서 PMC와 10 당량의 NO를 혼합하여 진행되었고, 따라서 PMC와 NO 사이에 상호작용이 존재하지 않는 것처럼 보인다. 그러나 1 당량의 NO의 경우에, 소량의 2의 형성과 동반하여 약 PMC의 절반 양이 소모되었다. 이러한 현상의 이유는 엔트리 1의 실험에서 약간의 산소 오염에 기인하며, 엔트리 1에서 내부 압력이 엔트리 5보다 낮았다. 생성물 분포는 PMC 및 NO가 O2의 첨가 전에 2 h 동안 교반하도록 허용될 경우 변화되었다. 결과는 문헌에 제안된 바와 같이 O2의 부재에서 PMC와 NO의 사이에 비-생성적 상호작용이 존재함을 나타낸다. 1 또는 2 당량의 NO가 사용되었을 경우, PMC가 0.5 당량의 O2의 존재에서 소모되어 거의 등몰량의 2 및 3을 제공했고, 수율은 더 적은 양의 NO를 사용하여 더 높게 되었다. 이러한 경우에, O2 첨가의 시기가 생성물 수율에 큰 영향을 미치고, 이는 또한 O2의 부재에서 NO와 PMC 사이의 직접 상호작용을 제안한다. NO 양을 감소시켜, 반응 시간을 더 길게 만들 필요가 있지만, 과량의 O2 사용이 상당한 PMC 소모를 야기했다. 이 경우에, 부 생성물 4 및 5가 이전의 조건하의 경우보다 더 많이 수득되었다. 반응성 비교를 위하여, 1 당량의 NO2가 NO 및 O2 대신에 사용되었다. 짧은 반응 시간(10 min) 후에, 2가 3의 상당한 형성 없이 41% 수율로 수득되었고, 3의 수율은 반응 시간의 연장에 따라 점차 증가했다. 비록 NO2를 사용하는 반응이 화학량론의 관점으로 NO 및 0.5 당량의 O2를 사용하는 반응에 상응하기는 하지만, 결과는 엔트리 14 및 10에 나타나는 바와 같이 상이했다. 따라서 이는 또한 NO 및 0.5 당량의 O2의 혼합물에서 NO2의 형성이 불완전함을 제시했다. 이는 다양한 양의 산소의 존재에서 NO와의 반응에 의하여 PMC의 네 가지 산화 생성물을 산출한다.
전체 생성물 수율이 최대 90%로 달성되었기 때문에, 결과는 전체 반응 메커니즘에 대한 추론 배경을 제공하는 것으로 생각된다. 비록 이러한 생성물을 제공하기 위하여 몇 가지의 경로가 존재해야 하기는 하지만, 제안된 반응 메커니즘 중 하나가 도식 2에 나타나는 바와 같다. NO가 O2와 반응하여 NO/O2의 비율에 따라 N2O3 또는 NO2를 형성함이 공지이다. 따라서, 화학량론에 기초하여, 반응에서 주요 반응성 화학종은 NO2 (+N2O3) +약간의 O2, N2O3 (+NO), NO2 및 NO2+O2 각각으로 간주되는데, 이러한 반응성 화학종이 반응 혼합물에서 서로 상호전환될 수 있기는 하다.
NO는 O2의 보조 없이 PMC와 상호작용하고, 따라서 NO가 페녹시 라디칼을 제공하기 위하여 PMC에 대한 반응성을 가져야 한다. 반응성 NO2 (또는 N2O3)의 존재에서, PM퀴논 2를 형성하기 위하여 6이 NO2 (또는 N2O3)에 의하여 더욱 산화되는 것으로 제안되었다.
활성 NOx가 감소될 경우, 이 과정은 더욱 느려져야 하고, 6을 산화시키기 위하여 산소 NOx를 대체할 수 있으며, 반응 경로가 PMCred 3 또는 4의 형성으로 변화되는 것으로 제안된다. NOx의 양이 추가로 적어질 경우, 산화가 6의 초기 형성 후 산소의 단독 참여를 통하여 진행될 수 있다. 5가 퀴노노이드 10 및 2의 Diels-Alder 반응의 생성물인 것으로 생각되었기 때문에, 반응이 과량의 2 존재에서 수행되었지만, 5의 수율이 증가되지 않았다. 그러므로, 도식 2에 나타나는 것 이외에 5의 형성을 위한 대안의 경로가 존재해야 한다. 심지어 0.25 당량의 NO의 존재에서, PMC가 과잉 O2 및 반응 시간의 연장에 의하여 소모되었다. 이러한 데이터는 NO2가 산화를 위하여 촉매적 방식으로 작용할 수 있는 경로가 있음을 제안한다. 하이드로퀴논이 과량의 산소 존재에서 촉매량의 NO2에 의하여 산화된다는 유사한 결과가 Kochi 등에 의하여 보고되었다. 다양한 양의 산소의 존재에서 생성물을 형성하기 위한 PMC 및 NO, 이들 중 네 가지가 식별되고 정량되었다. 산화된 생성물은 NO 및 산소의 양을 제한하여 우수한 수율로 수득되었다. 더욱이, 생성물 분포가 NO/O2 비율의 변화에 의하여 바뀌었다. 실험은 알파-토코페롤을 사용하는 반응이 여기에 제시된 것과 유사한 결과를 제공함을 나타냈다.
실시예 12
다수의 상이한 인간 암 세포가 정상 세포보다 상대적으로 더 산화적으로 스트레스를 받는다. 전립선 종양 세포의 세포 고 산화 스트레스가 HDAC 억제제 약물의 성장 억제 활성의 손실에 기인하는 것으로 가정되었다. 특정 인간 암 세포주 및 인간 원발성 종양의 고 산화 스트레스의 감소가 지용성/수불용성 비타민 E 제제를 포함하는 식이적 또는 약제학적 항산화제를 사용하는 사전처리에 의하여 또는 크로만올, 퀴논, 변형된 퀴닌, 플라스토퀴논, 테트라사이클렌, 템폴, 또는 다른 항산화제 약물을 포함하는 수용성 비타민 E 유사체인 약제학적 약물을 이용하여 성취되었다. 본 발명자들은 SAHA를 포함하는 HDAC 억제제, 또한 다른 산화 민감성 항염증 약물, 전립선 및 다른 공지 암 화학예방 또는 암 화학치료 약물에 대한 암 세포주 및 원발성 인간 및 동물 종양을 치료적으로 민감화하는 능력 및 효용에 대하여 이러한 항산화제 화합물의 치료적 유효성을 테스트했다. 인간 CaP 세포 LNCaP 및 PC-3, 결장암 세포 HT-29 및 HCT-115, 폐암 세포 A549 및 NCI-H460 그리고 유방암 세포 MDA-MB231를 American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 구했다. LNCaP 세포는 5% 열-비활성화된 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 100x 항생, 항진균 용액이 보충된 Dulbecco의 수정 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle medium, DMEM) (F5 배지)에 10 cm 지름 조직 배양 플레이트에서 37℃의 5% CO2 함유 습윤 공기에서 유지된다. PC-3 세포는 5% FBS를 포함하는 DMEM에서 유지되었다. 모든 다른 세포주는 10% FBS를 포함하는 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. 안드로겐 차단을 위하여 모든 실험에서 사용된 LNCaP 세포가 F5 배지에서 배양되고 4% 목탄 제거(charcoal stripped) FBS (CSS)에 더하여 1% 비제거(non-stripped) FBS (F1/C4 배지)를 포함하는 DMEM에서 "저" 안드로겐 조건으로 옮겨졌다. 이전의 연구에서, 이 배지는 충분한 안드로겐 고갈을 나타냈지만, 영양 결핍과 관련된 불리한 성장 효과를 나타내지 않았다. 옮긴지 이틀 후, 세포가 트립신 처리되고, 계수되고, F1/C4에 파종되었다. 파종 다음 날에, 세포를 특정 농도의 세포 배양 조건에서 안드로겐의 대용으로 널리 사용되는 안드로겐 유사체 R1881로 처리했다. 처리된 세포가 SAHA의 첨가 전에 37℃의 5% CO2를 포함하는 습윤한 공기에서 추가 24 시간 동안 배양되었다. 단계적 농도의 항산화제 또는 SAHA와 같은 HDAC 억제제가 F1/C4 배지에서 안드로겐 첨가 하루 후 또는 파종 이틀 후 (대조군 세포에 대하여) 세포에 첨가되었다. 실험에 따라, 테스트 약물이 연속 희석에 의하여 96-웰 조직 배양 플레이트에 첨가되거나 계산된 농도로 10 cm 조직 배양 플레이트에 첨가되었다. 첨가 후, 다양한 검사에 대비하여 세포가 3 일 동안 37℃의 5% CO2를 포함하는 습윤된 공기에서 배양되었다. 배양의 마지막에, 96-웰 플레이트의 세포가 다음의 공개된 프로토콜에 따라 2',7'-디클로로플루오레신 디아세테이트(DCF) 염료(Molecular Probes, Inc., Eugene, OR)를 사용하여 살아 있는 세포에서의 전체 ROS 생성에 대하여 검사되었다. 웰이 200 ㎕의 37℃로 미리 가온된 Kreb Ringer (KR) 버퍼로 세척되었다. 모든 웰에서, 미리 가온된 KR 버퍼 중의 100 ㎕ DCF가 20.5 μM의 최종 농도로 첨가되었다. 세포가 37℃의 5% CO2를 포함하는 습윤된 공기에서 45 분 동안 배양된 다음 DCF 염료 형광 측정을 위하여 480 nm 여기/530 nm 방사로 설정된 형광 플레이트 스캐너에서 판독되었다. 스캐닝 후, DNA 검사에 대비하여 플레이트가 -80℃에서 보관되었다. DNA 검사를 위하여, DCF 검사에서 이전에 사용된, 96-웰 조직 배양 플레이트에 파종된 테스트 세포가 실온에서 해동되었다. Hoechst 염료 (33258)가 공개된 절차를 따라 10 ㎍/ml의 최종 스탁 염료 농도를 만들기 위하여 0.05 M Tris (pH 7.5), 2 M NaCl, 1 mM 에틸렌디아민-테트라아세테이트 (고 염 TNE)에서 준비되었다. 각각의 웰은 200 ㎕의 Hoechst-TNE 스탁을 수용했다. 각각의 96-웰 조직 배양 플레이트가 360 nm 여기/460 nm 방사로 설정된 형광 플레이트 스캐너에서 Hoechst 염료의 전체 형광에 대하여 측정되어 DCF 염료 형광을 측정했다.
샘플 제조 및 세포 HDAC 억제제 약물(즉 SAHA) 측정을 위하여 LC-MS 세포가 트립신 처리되고, 계수되고, 펠렛화되고, PBS로 한 번 세척하고, 건조되고, 펠렛이 -70℃ 아래에서 저장되었다. 실험 당일에, 펠렛이 100 ㎕ 용해 버퍼(0.25 M 수크로오스, 0.06 M KCl, 0.05 M NaCl, 0.01 M 2-(N-모르폴리노) 에탄설폰산(MES), 0.01 M MgCl2, 0.001 M CaCl2, 0.0001 M 페닐-메틸-설포닐- 플루오라이드(PMSF), 1 mM EDTA 및 0.2% Triton X-100 (pH 6.5)에서 5 분 동안 얼음에서 보냉되었다. 열 부피의 냉각된 99.5% 아세토니트릴, 0.5% 아세트산이 모든 용해물에 첨가되고, 격렬하게 볼텍싱되고, SAHA가 유기 용매에 추출되도록 추가 5 분 동안 얼음에서 보냉되었다. 튜브가 5 분 동안 5,000g에서 원심분리되었고, 계산된 부피의 유기층(일반적으로 첨가된 전체 유기 용매의 80%)이 상부로부터 조심스럽게 흡인되었다. 유기 용매가 질소 흐름하에 탈수되고, 50 ㎕ 99.5% 아세토니트릴, 0.5% 아세트산에 재용해되었다. 10 ㎕의 각각의 추출물이 LC-MS 분석을 위하여 사용되었고, 검사가 세 번 반복되었다. 모든 데이터가 세포 추출물의 전체 부피에 대하여 정규화되었고 ng SAHA/106 세포로 표현되었다.
LNCaP 세포의 SAHA 수준의 크로마토그래피가 환자 혈청 중 SAHA를 결정하는 공개된 LC-MS 방법의 변형에 의하여 결정되었다. LC-MS 시스템은 Agilent (Palo Alto, CA) 1100 오토 샘플러 및 바이너리 펌프, Agilent 1100 컬럼 서모스타트 및 Agilent Zorbax 300SB - C18 컬럼(3.5 μM, 2.1x100 mm)으로 구성되었다. 이동상 용매 A는 아세토니트릴 및 아세트산(99.5%:0.5% v/v)이었고, 용매 B는 물 및 아세트산(99.5%:0.5% v/v)이었다. 용매 구배 및 유량이 적절하게 조정되었다. 10% 용매 A, 90% 용매 B에서의 5 분의 포스트-런(post-run) 컬럼 세척이 0.2 ml/min에서 유지되었다. 컬럼 서모스타트가 완전한 런을 위하여 25℃에서 유지되었다.
질량 검출을 위한 질량 검출기가 Agilent 1100 3000 V의 양이온 모드에서 전기분무 이온화되는 사극자 모멘트 벤치-탑(bench-top) 질량 분석기로써 수행되었다. 단일 이온 MS 및 스캐닝 MS/MS 모드 두 가지 모두에 대하여, 탈용매화 온도는 340℃였고 40 psig의 네불라(nebular) 압력에서 121/min의 건조 기체 유량이었다. 스캔 모드는 150 내지 300 m+/z였고, 단일 이온 검출 (SIM) 모드는 265.2, 232.2 및 172.2 m+/z로 설정되었다. 데이터 수집, 피크 검출 및 적분을 위한 Agilent 소프트웨어를 이용하여 모든 데이터가 수집되고, 저장되고, 분석되었다.
siSSAT로써 안정적으로 트랜스펙션(transfection)된 LNCaP 클론의 구성을 위하여, 클론이 다음의 공개된 절차에 따라 생성되었다. 요약하면, 휴지 SSAT에 대한 올리고뉴클레오타이드가 공개된 서열에 기초하여 설계되었다. 어닐링(annealing)된 올리고뉴클레오타이드가 pSFl 벡터(SBI; System Biosciences, Mountain View, CA)에 삽입되었다. pSIF-Hl-siSSAT 벡터를 안정적으로 발현하는 LNCaP 세포가 렌티바이러스 시스템을 이용하여 확립되었다. 이러한 세포에서 SSAT의 휴지는 qRT-PCR에 의하여 증명되었다.
HDAC 검사를 위하여 고 처리율 HDAC 검사가 제조업체 공급 프로토콜에 약간의 변형을 가하여 Biomol(Plymouth Meeting, PA) HDAC 검사 키트를 이용하여 표준화되었다. 요약하면, 약물 처리 마지막에, 96-웰 검사 플레이트의 배지가 버려지고, 세포가 25% PBS로 한 번 세척된 다음 30 ㎕ 탈이온된 재증류수에서 1 동안 실온에서 팽창되었다. 이후 플레이트가 -70℃ 이하에서 냉동되었다. 실험 당일, 플레이트가 4℃에서 30 분 동안 해동되었다. 15㎕의 세포 용해물이 96-웰 백색 둥근바닥 플레이트에 옮겨지고, 10 ㎕ HDAC 검사 버퍼(50 mM Tris-HCl, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 1 mM MgCl2, pH 8.0) 및 25 ㎕ 동일한 HDAC 검사 버퍼에 적절하게 희석된 제조업체 공급된 형광 표지된 HDAC 기질(KI-104, Biomol Inc.)과 함께 완전히 혼합되었다. 플레이트가 37℃에서 30 분 동안 배양되었다. 반응이 200 μM 트리코스타틴 A(TSA)을 포함하는 제조업제 공급된 현상제 용액(Developer I, 20x, Biomol Inc.)으로써 정지되었고, 플레이트가 150 mV 광전자증배관 전압 설정을 이용하여 Saphire(Tecan US, Inc., Durham, NC) 멀티모드 플레이트 판독기에서 360 nm 여기/460 nm 방사로 한 시간 내에 판독되었다. 남아 있는 15 ㎕의 세포 용해물이 앞에서 기재된 DNA 검사 프로토콜을 따라 85 ㎕ 탈이온된 재증류수 및 200 ㎕ Hoechst 33258 염료를 이용하여 DNA 검사에 사용되었다. 전체 세포 용해물의 DNA 판독을 결정하기 위하여 모든 DNA 형광 데이터가 두 배로 곱해졌다.
아세틸화 히스톤의 웨스턴 블롯 분석을 위하여 전체 세포 히스톤이 공개된 절차를 따라 분리되었다. 겔 로딩에 앞서, 1 M NaOH로써 pH가 7.2로 조정되었다. 각각의 샘플로부터의 10 ㎕ 분취물이 단백질 평가를 위하여 비축되었다. 샘플의 나머지는 로딩되었고 전기영동이 SDS-PAGE에서 수행되었다. 웨스턴 블롯 분석이 항-아세틸 H4 항체(Millipore, Temecula, CA)를 이용하여 공개된 절차를 따라 수행되었다. β-액틴이 단백질 로딩에 대하여 대조군으로서 사용되었다. 아세틸 히스톤 H4 밴드 강도가 계산되고 β-액틴 강도에 대하여 정규화되었다.
LNCaP 인간 전립선암 세포가 세포 반응성 산소 화학종(ROS)을 감소시키거나 증가시키는 두 가지 농도의 안드로겐 유사체 메트리볼론으로 사전처리되고, 이어서 단계적 농도의 SAHA로 처리된다. 96-웰 플레이트-기초 DNA 및 디클로르플루오레신-디아세테이트(DCF-DA) 형광 검사가 세포 성장 및 전체 세포 ROS를 각각 결정하기 위하여 사용된다. 액체-크로마토그래피-질량-분석법(LC-MS) 방법이 메트리볼론 사전처리되거나 처리되지 않은 대조군 LNCaP 세포의 세포 내 SAHA 수준을 측정하기 위하여 사용된다. 고 ROS 수준을 가지는 인간 전립선 및 결장암 세포에 대하여 지시된, 그리고 저 ROS 수준을 가지는 다른 폐암 세포에서의 SAHA의 세포 성장 억제 활성이 또한 세포 ROS를 감소시키는 준독성 용량의 항산화 테스트 물질을 사전처리된 세포에서 결정된다.
히스톤 디아세틸레이즈(HDAC)는 히스톤 H3 및 H4를 탈아세틸화하는, 주로 핵에 존재하는 효소의 부류이다. HDAC 활성은 세포 주기 정지에 필요하고 세포자멸을 유도하기 위한 유전자의 발현을 막는다. 그러므로, HDAC 억제는 세포 증식을 정지시키고 세포자멸, 세포 분화 및/또는 노화(senescence)를 야기한다. 수베로일아닐라이드 하이드록삼산(SAHA)은 세포 증식의 정지 및 세포 사멸을 야기하는 HDAC 억제제이다. 이는 림프종에 대하여 발전된 임상 시험을 거쳤고, 피부 T-세포 림프종(CTCL)의 치료에 대하여 승인되었다. 그러나 SAHA는 인간 전립선암, 유방암, 결장암 및 다른 암에 대하여 비활성이다.
LNCaP는 80년대 초기에 CaP 환자의 림프절의 전이성 병변으로부터 확립된 안드로겐-반응성 인간 CaP 세포주이다. 1997년에, Ripple 등은 최초로, 단계적 농도의 R1881, 안드로겐 유사체로 처리된 LNCaP 세포에서, DCF 염료 산화 검사에 의하여 결정되는 바와 같이 다양한 수준의 수퍼옥사이드, 하이드록실 라디칼, 하이드로젠 퍼옥사이드 등과 같은 반응성 산소 화학종(ROS)을 발생시키는 것으로 보고했다. 0.1 nM 미만의 R1881 농도, "저 안드로겐"으로 처리될 경우, LNCaP 세포가 1-10 nM R1881, "보통 내지 고 안드로겐"으로 처리된 것과 비교하여 현저하게 더 낮은 세포 ROS를 나타냈다. 그러나, 1-10 nM R1881 농도 내에서, LNCaP 세포 성장 또는 ROS 발생의 양에서 현저한 차이가 관찰되지 않았다. LNCaP 세포 이외에도, 다른 인간 전립선암, 결장암 및 일부 유방암 세포가 또한 고 ROS 수준을 가지는 반면; 인간 폐암 세포는 ROS가 현저하게 낮다.
비록 SAHA가 CTCL 림프종의 처리에 성공적이기는 했지만, 다수의 임상 시험이 전립선암, 결장암, 유방암 및 다른 유형의 인간 암에 대한 SAHA 의 효능을 보여주는 데 실패했다. SAHA에 대한 세포 내성에는 몇 가지 이유가 있을 수 있는데, 예를 들어; (i) SAHA는 산화 스트레스를 유발하여 세포를 죽일 수 있다. CTCL 림프종 세포와 같은 저 산화 스트레스를 가지는 세포와 비교하여, 고 산화 스트레스에 적응된 종양 세포를 가지는 다른 암은 MOA 유발 산화 스트레스에 의한 세포 사멸을 유발하는 약물에 의하여 영향받지 않을 수 있다; (ii) 이러한 세포에서의 높은 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈(SOD) 효소 활성이 SAHA에 의하여 발생되는 산화 스트레스를 중화할 수 있으며, 따라서 활성을 억제한다; (iii) SAHA는 전립선암, 결장암 또는 유방암 세포에서 생성된 높은 수준의 ROS에 의하여 산화될 수 있고, 이에 의하여 임상적으로 달성 불가능한 높은 약물 농도를 필요로 한다.
본 발명자들은 고 ROS를 가지는 CaP 세포에 대한 SAHA의 비활성이 SOD 활성 변화 또는 ROS에 대한 고유의 세포 내성으로 인한 것이 아니라, 고 ROS 수준을 가지는 세포에서의 세포 내 SAHA 농도의 급격한 감소로 인한 것임을 발견했다. ROS 생성 경로의 주요 효소의 휴지에 의한 ROS 수준의 감소는 CaP 세포에 대하여 SAHA를 활성화한다. 지용성/수불용성 비타민 E 또는 수용성 유사체, 크로말 및 다른 OSM 약물과 같은 항산화제를 사용한 사전처리에 의한 세포 ROS 감소가 또한 CaP, 결장암 및 유방암 세포의 SAHA 민감성을 상승적으로 증가시킬 수 있지만, 낮은 본질적 ROS를 가지는 특정 암 세포의 SAHA 민감성은 그렇지 않다. 따라서 항산화제와 조합의 SAHA 또는 다른 산화 민감성 화학치료 약물과 같은 HDAC 억제제 약물이 단일 약제로서의 SAHA 또는 이러한 다른 산화 민감성 약물에 대하여 완전히 비반응성인, 높은 하이드로젠 퍼옥사이드 생성 속도를 가지는 종양을 포함하여, 고 산화 스트레스를 가지는 다양한 여러 상이한 암에 대한 치료적 처치이다.
SAHA 는 단지 저 산화 스트레스에서만 전립선암 세포의 성장을 억제한다.
암 세포주의 핵의 DNA와 복합된 Hoechst 염료 (Hoechst 33258)의 형광 판독은 각각의 웰에 조재하는 세포의 수에 비례한다. R1881로써 사전처리한 후 이어서 SAHA의 농도를 0-10 μM로부터 증가시킨 LNCaP 세포의 DNA 형광이 도 1a에 나타난다. R1881 및 0.05 nM R1881로 사전처리되지 않은 LNCaP 세포에서, 세포 성장이 SAHA 농도의 로그 증가에 대하여 거의 선형으로 억제되었다 (각각 도 1a. A & 1a.B). 그러나 2 nM R1881로 사전처리된 LNCaP 세포에서, SAHA는 테스트된 모든 농도의 세포 성장에 대하여 무시할 만한 효과를 가진다 (도 1a. C). 안드로겐으로 처리되지 않거나 0.05 nM R1881으로 처리된 세포에서 1 μM 이상의 농도의 SAHA의 성장 억제 효과가 2 nM R1881로 사전처리된 세포에서 동등한 농도의 SAHA의 성장 억제 효과보다 현저하게 더 나타난다. 이러한 데이터는 보통 혈청 안드로겐(2 nM)에 노출된 LNCaP 세포가 저 또는 무 안드로겐에서 성장하는 세포와 비교하여 SAHA의 성장 억제 효과에 대하여 상대적으로 내성임을 제안한다.
SAHA 의 성장 억제 효과는 전립선암 세포에서의 세포 산화 스트레스에 의존성이 아니다.
산화된 DCF 염료의 형광은 총 세포 ROS에 비례한다. DCF 형광이 96-웰 플레이트의 동일한 웰로부터의 DNA 형광으로써 정규화될 경우, 비율 DCF 형광: DNA 형광은 셀당 발생한 ROS에 비례한다. 다양한 R1881 농도로 사전처리하거나 사전처리하지 않은 LNCaP 세포의 DCF/DNA 형광 비율 vs. 증가하는 SAHA 농도가 도 1b에 제시된다. R1881로 사전처리되지 않은 LNCaP 세포에서, ROS는 SAHA 농도 증가와 함께 증가한다 (도 1b.A). 그러나 0.05 nM 및 2 nM R1881로 사전처리된 LNCaP 세포에서 SAHA 농도 증가는 전체 세포 ROS 수준에 대하여 무시할 만한 효과를 가진다. 모든 SAHA 농도에서의 전체 세포 ROS 수준은 0.05 nM R1881로 처리된 세포에서보다 2 nM R1881로 처리된 세포에서 더 높다.
siSSAT LNCaP 세포에 대한 SAHA 의 효과.
스페르미딘/스페르민 아세틸 트랜스퍼레이즈(SSAT)는 LNCaP 세포의 안드로겐-유발 ROS 생성에서 주된 효소이다. 본 발명자들은 90% 초과(> 90%)로 SSAT 발현을 감소시키는, SSAT에 대하여 siRNA로 안정적으로 트랜스펙션된(siSSAT) LNCaP 세포 클론을 구성했다. R1881 처리는 뒤섞인 서열을 포함하는 대조군 벡터로써 트랜스펙션된 LNCaP 세포의 현저한 증가와 비교하여 siSSAT 클론의 ROS 생성에 대하여 현저한 효과를 가지지 않는다. 2 nM R1881 사전처리된 벡터 대조군 및 siSSAT 세포에 대한 SAHA의 성장 억제 효과는 적절한 농도의 R1881로 처리되지만 SAHA로 처리되지 않은 상응하는 세포의 DNA 형광의 % 대조군으로서 표현된다. SAHA의 성장 억제 효과는 벡터 대조군 세포에 대하여 관찰된 것과 비교하여 2 nM R1881 siSSAT 세포에서 현저하게 나타난다.
siSSAT 클론에서 HDAC 활성에 대한 SAHA 의 효과.
그 다음, 본 발명자들은 벡터 대조군 및 siSSAT 세포주에서 HDAC 활성에 대한 단계적 농도의 SAHA의 효과를 결정했다. HDAC 활성은 상대 형광 단위(FU)로 HDAC 생성물 형광/DNA 형광의 비율로서 표현된다. 모든 데이터는 SAHA로 처리되지 않지만 동일한 조건(R1881를 사용하거나 사용하지 않음)하에 성장하는 상응하는 세포에서 동일한 비율에 대하여 정규화되었다. 안드로겐으로 처리되지 않은 세포에서, SAHA는 벡터 대조군 및 siSSAT 세포주 모두에서 HDAC 활성 억제에서 거의 유사한 효율을 가진다. 그러나 농도 1 μM 초과(> 1 μM)의 농도에서, SAHA가 R1881 사전처리된 벡터, 대조군 세포에서 HDAC 활성을 억제하지 않지만, R1881 비처리된 siSSAT 세포에서와 유사한 정도까지 R1881에서 HDAC 활성을 억제한다. SAHA의 HDAC 억제 효과는 안드로겐-처리된 siSSAT 세포의 성장 정지에서 SAHA의 능력과 유사하고, 안드로겐-처리된 벡터 대조군 세포의 성장에 대해서는 그렇지 않다.
비타민 E 사전처리된 세포에서 SAHA 의 효과.
이 결과에 기초하여, 본 발명자들은 고 세포 ROS가 전립선암 세포에서 SAHA의 비활성화에 기인하는 것으로 가정한다. 그러므로, 세포 ROS 수준을 감소시키는 것으로 공지인 항산화제를 사용한 세포의 사전처리가 세포를 SAHA에 대하여 민감화하는지 아닌지를 테스트했다. 본 발명자들은 전립선암 세포 LNCaP (R1881로 처리된 것과 처리되지 않은 것 모두) 및 PC-3, 결장암 세포 HT-29, 유방암 세포 MDA-MB231 및 폐암 세포 A549 및 NCI-H460 세포를 α토코페롤 석시네이트(비타민 E)로 사전처리했다. R1881로 처리된 LNCaP 세포에 대하여, 비타민 E가 안드로겐 처리로 인한 임의의 과잉 ROS 생성을 중화하기 위하여 R1881 첨가 직전에 첨가되었다. 세포 성장에 대한 단계적 농도의 비타민 E를 사용한 96 시간 처리의 효과가 개별적으로 결정되었다. 이 연구로부터, 각각의 세포주에 대하여 무독성인 비타민 E 농도가 사전처리를 위하여 선택되었다. LNCaP(R1881로 처리된 것 및 처리되지 않은 것) 및 PC-3 전립선암 세포의 ROS 수준에 대한 무독성 용량의 비타민 E(20 μM)를 사용한 처리가 도 3에 나타난다. 비타민 E 처리는 LNCaP 및 PC-3 세포에서 ROS 수준을 현저하게 감소시킨다. 유사한 비타민 E에 의한 세포 ROS 감소가 산화적으로 스트레스 받은 유방암 및 결장암 세포에서 관찰되었다. 이러한 인간 폐암 세포의 매우 낮은 산화 스트레스 수준으로 인하여, 이러한 세포의 ROS 수준에 대한 비타민 E 처리의 효과가 정확히 결정될 수 없었다.
비타민 E 사전처리 및 비처리된 인간 암 세포의 성장에 대한 SAHA의 효과가 도 4에 나타난다. 모든 데이터는 비타민 E 단독으로 처리된 상응하는 세포의 DNA 형광의 % 대조군으로서 정규화된다. 안드로겐-비처리 및 처리 LNCaP 세포(각각 도 4A 및 4B) 모두 뿐만 아니라 PC-3 세포(도 4C)가 세포 산화 스트레스를 감소시키는 비독성 용량의 20 μM 비타민 E로 사전처리한 후 SAHA에 의하여 성장 억제에 대하여 현저하게 민감해진다. HT-29 및 MDA-MB231 세포의 SAHA 민감성은 또한 비타민 E 비처리된 세포와 비교하여 비타민 E 사전처리된 세포에서 더 높다. 민감성 증가는 Chou 및 Talalay에 의하여 개발된 형식을 이용하여 결정된 바와 같이 상승적이다(synergistic). 임상적으로 달성 가능한 1 μM의 SAHA 용량에서 이러한 세포주에 대한 SAHA의 성장 억제 효과의 현저한 차이가 존재함이 주목된다. 그러나 저 ROS 수준을 가지는 폐암 세포 A549 및 NCI-H460은 임의의 농도의 SAHA에서 비타민 E 사전처리 후 어떠한 분명한 SAHA 민감성 증가도 나타내지 않는다.
SAHA 유발된 아세틸 히스톤 수준 변화에 대한 비타민 E 사전처리의 효과.
20 μM 비타민 E 단독, 1 nM R1881 단독 및 2 μM SAHA 단독, R1881+SAHA 및 비타민 E+R1881+SAHA의 조합과 함께 처리된 LNCaP 세포의 아세틸 히스톤 수준의 웨스턴 블롯 분석이 항-아세틸 H4 항체를 이용하여 수행되었다. 단백질 로딩에 대하여 대조하기 위하여 β-액틴의 웨스턴 블롯이 사용된다. 대표적인 웨스턴 블롯이 도 5에 나타난다. 비타민 E 및 R1881은 아세틸-히스톤 H4 수준에 대하여 효과를 거의 가지지 않는다. SAHA 처리는 SAHA가 안드로겐의 부재에서 성장하는 LNCaP 세포의 HDAC 활성을 억제함을 나타내는, 작지만 현저한 아세틸-히스톤 수준 증가를 야기한다. R1881 사전처리된 세포의 아세틸-히스톤 H4 수준의 현저한 감소가 존재하며, 이러한 세포에서 SAHA의 HDAC 억제 활성의 상당한 손질을 암시한다. 비타민 E를 사용한 사전처리는 R1881 처리된 세포의 아세틸 히스톤 H4 수준을 거의 완전히 회복시키며, 비타민 E 처리된 세포의 SAHA의 HDAC 억제 활성의 회복을 나타낸다.
세포 내 SAHA 농도의 LC - MS 평가.
이 연구 동안 표준화된 절차를 이용하여 SAHA가 증가하는 농도의 SAHA가 섞인 LNCaP 세포 추출물에서 단일 피크로 검출된다. LNCaP 세포의 세포 SAHA 농도가 계산된 양의 SAHA가 섞인 LNCaP 세포 추출물을 이용하여 발생된 SAHA에 대한 표준 곡선을 이용하여 ng SAHA/106 세포로서 측정되었다. 1 nM R1881로 비처리 또는 사전처리된, 5 μM SAHA로 24 시간 동안 처리된 세포의 SAHA 농도가 결정되었다. 24 시간 내에, R1881로 사전처리된 LNCaP 세포의 SAHA 수준은 R1881 비처리된 세포의 절반 미만이다. 그러나 비타민 E 사전처리된 세포에서, 최소한 최초 24 시간 후에 세포 내 SAHA 수준에 현저한 감소가 없다.
데이터는 SAHA가 아마도 이러한 세포에서의 SAHA의 산화적 분해로 인하여 고 산화 스트레스를 가지는 암 세포에 대하여 특이적으로 비활성임을 나타낸다. 비타민 E 사전처리에 의한 이러한 세포에서의 산화 스트레스 감소가 SAHA의 성장 억제 활성에 대하여 다른 고 산화 스트레스를 가지는 SAHA 내성 암 세포를 민감화한다. 무 안드로겐 (F1/C4 배지) 또는 저 안드로겐 (0.05 nM R1881)로 처리된 LNCaP 세포에서, 세포 성장에 대한 측정치인 DNA 형광이 SAHA 농도의 로그 증가에 대하여 거의 선형으로 감소한다. 따라서, SAHA는 IC50 < 1 μM으로써 저 안드로겐 조건(< 0.05 nM R1881)에서 작용할 경우 LNCaP 전립선암 세포 성장을 억제한다. 그러나 보통 안드로겐 수준(1 nM R1881)에서 성장하는 LNCaP 세포에서, 심지어 10 μM SAHA에서도 세포 성장에 대한 효과가 거의 존재하지 않는다 (도 1a.C). 0.05 nM R1881의 R1881은 성장 자극을 가지며 1 nM 이상 농도의 R1881은 LNCaP 세포에 대하여 성장 억제 효과를 나타낸다. 이는 매우 낮은 SAHA 농도에서의 전체 DNA 형광 값에 반영된다. 증가하는 SAHA 농도와 함께하는 DNA 형광 변화는 SAHA가 저 안드로겐(0 nM 및 0.05 nM R1881)을 포함하는 배지에서 성장하는 LNCaP 세포의 성장을 억제하지만, 고 안드로겐(1 nM R1881)을 포함하는 배지에서는 그렇지 않음을 명백하게 증명한다.
ROS 변화가 SAHA의 성장 억제 활성에 영향을 미치는지를 테스트하기 위하여, 세포 ROS 수준이 저 및 고 안드로겐 조건하의 세포 성장과 비교된다. 안드로겐의 부재(F1/C4 배지)에서 성장하는 LNCaP 세포에서, 세포 ROS 수준은 세포 성장이 감소함에 따라 증가하고, SAHA에 의한 세포 성장 억제의 원인 중 하나로 가정된, SAHA 처리가 세포 ROS 수준을 증가시킨다는 공개된 관찰을 지지한다. 그러나 0.05 nM R1881에서 성장하는 LNCaP 세포에서, 매우 유사한 성장 억제가 임의의 상당한 ROS 수준 증가 없이 관찰되었다. 반면에, 보통 안드로겐 조건(1 nM R1881)의 존재에서 성장하는 높은 고유 ROS 수준을 가지는 LNCaP 세포는 SAHA에 내성이다. 이를 비롯한 다른 유사한 데이터가, SAHA의 성장 억제 효과가 SAHA 처리된 세포에서의 세포 ROS 수준 증가로 인한 것이 아님을 나타낸다. 결과는 또한 LNCaP 인간 전립선암 세포가 SAHA의 성장 억제 효과에 대하여 본질적으로 내성이 아니며 보통 혈청 안드로겐 수준에서 성장할 경우에만 SAHA 내성을 나타냄을 보여준다. 안드로겐-의존성 세포가 주로 초기의 CaP 재발에서 보통 혈청 안드로겐 수준을 가지는 환자에서 발견되므로, 대부분의 초기 전립선암 환자는 400 mg qd 용량의 임상적으로 허용된 경구 SAHA가 주어진 환자에 대하여 ~349 ng/mL(~1.3 μM)의 혈청 SAHA 수준에서 SAHA에 반응하지 않을 것이다. 반면, PC-3과 같은 안드로겐-내성 CaP 세포는 10 μM 아래에서 SAHA에 본질적으로 내성이다. 따라서, 저 혈청 안드로겐 수준을 가지는 환자의 진행된 전립선암 또한 SAHA에 반응하지 않을 것이다. 초기 또는 후기의 질환에서 SAHA로 CaP 환자를 치료하는 것이 가능할 수 있다.
SAHA는 ROS의 양 변화를 일으키고 이에 의하여 고 안드로겐 조건의 세포질 ROS 수준에 간접적으로 영향을 미쳐, 안드로겐의 존재에서 상이하게 수퍼옥사이드 디스뮤테이즈 (SOD) 효소 활성에 영향을 미칠 수 있다. 그러나, SOD 검사 데이터는 10 μM SAHA로 사전처리하기 전에 0.05 nM 또는 1 nM R1881로 사전처리한 LNCaP 세포의 SOD 활성에 현저한 차이가 없음을 나타낸다. 이를 비롯한 다른 유사한 결과는 안드로겐 유발된 SOD 활성 변화가 세포 산화 스트레스 변화, 그러므로 여러 상이한 안드로겐 농도에서 성장하는 세포의 SAHA 민감성 변화에 기인하는 가능성을 배제한다.
안드로겐 처리 시 ROS 발생이 불가능한 siSSAT LNCaP 클론에서, SAHA는 고 안드로겐 처리된 세포에서 현저한 성장 억제 효과를 가진다. 효과는 저 안드로겐 농도에서 성장하는 LNCaP 세포에 대한 SAHA 의 효과와 유사하다. 본 발명자들은 또한 세포 HDAC 활성이 siSSAT 벡터 또는 뒤섞인 서열을 가지는 대조군 벡터로 트랜스펙션된 LNCaP 세포에서 매우 유사한 것으로 결정했다. 1 nM R1881로 사전처리된 다음 증가하는 농도의 SAHA로 처리된 벡터 대조군 세포의 HDAC 활성이 초기 감소 후 증가한다. R1881 비처리 벡터 대조군 세포 뿐만 아니라 안드로겐-처리 및 비처리 siSSAT 세포에서의 HDAC 활성이 유사한 방식으로 감소한다 (도 2b.A 및 2b.B). 이러한 이례적인 안드로겐-처리된 벡터 대조군 LNCaP 세포에서의 HDAC 활성 증가는 아마도 이러한 세포에서의 SAHA 활성의 손실로 인한 것이다. 이러한 세포주 두 가지 모두가 동일한 모 LNCaP 세포로부터 유래하기 때문에, SAHA 흡수, 배설, 염색질 구조 변화 등에 대한 효과가 두 가지 세포주 모두에서 동일하게 유지되는 것으로 기대되고, 그러므로 이러한 두 가지 세포주에서의 SAHA의 차별적인 활성에 대한 가능성을 배제할 수 있다. 따라서, 고 ROS 함유 CaP 세포에서의 세포 내 SAHA 감소가 인간 CaP 세포에 대한 SAHA 활성 손실의 주된 이유이다.
SAHA의 성장 억제 활성에 대한 HDAC 억제 이외의 메커니즘이 고려되었다. 염색질 구조를 변형시키고 따라서 SAHA 활성을 바꾸는 siSSAT 세포의 세포 폴리아민 수준 변화의 가능성이 있을 만하다. 그러나 벡터 대조군과 siSSAT 세포주 사이의 세포 폴리아민 수준에 작은 변화만이 존재한다. 따라서, 염색질 구조에 영향을 미칠 수 있고 따라서 siSSAT 세포의 SAHA 민감성을 변화시키는 세포 폴리아민의 가능성이 배제된다.
이러한 결과에 기초하여, 고 ROS 함유 세포에서 SAHA의 산화적 손실이 이러한 세포에 대한 SAHA 활성 손실의 주요 원인이다. 따라서, ROS 지용성/수불용성 비타민 E 또는 수용성 VE 유사체와 같은 항산화제를 사용한 사전처리에 의한 세포 ROS의 감소가 고 ROS 수준을 가지는 인간 암 세포에 대하여 SAHA를 활성화할 수 있다.
본 발명자들은 항산화제 비타민 E를 사용한 사전처리를 하거나 하지 않으면서 고 산화 스트레스의 가지는 인간 전립선암, 결장암 및 유방암 세포 및 저 산화 스트레스의 폐암 세포에 대한 SAHA의 성장 억제 효과를 연구했다. 최적 농도가 비타민 E 또는 수용성 크로만올의 임의의 성장 억제 또는 세포독성 효과 없이 이러한 세포주 각각에서 ROS 수준 감소에 필요한 비타민 E 또는 수용성 크로만올-기초 유사체에 대하여 결정되었다. 이러한 인간 폐암 세포가 매우 낮은 ROS 수준을 가지므로, 이러한 세포의 ROS 수준에 대한 비타민 E의 효과는, 존재할 경우, 결정되지 않았다. 비록 ROS 수준이 LNCaP 세포와 비교하여 PC-3 세포에서 비교적 더 낮았지만, 이들은 모두 정상 전립선 상피 세포에서보다 더 높다. 모든 배양 조건하에 테스트된 모든 세포주의 ROS 수준은 인간 폐암 세포에서보다 비교적 더 높다. 항산화제 사전처리가 전립선암, 결장암 및 유방암 세포주에서와 유사한 정도까지 ROS 수준을 낮출 경우, 모든 세포주가 SAHA의 성장 억제 효과에 대하여 유사한 민감성을 나타냈다. 그러나 이미 SAHA에 민감성인 인간 폐암 세포는 비타민 E 사전처리 후 어떠한 분명한 SAHA 민감성 증가도 나타내지 않는다. 따라서, 폐암 세포를 제외하고, 테스트된 모든 인간 종양 세포주는 비타민 E 사전처리 후 상승적인 SAHA 민감성 증가를 나타냈다.
LC-MS 데이터는 24 시간의 처리 이내에, 1 nM R1881로 사전처리된 LNCaP 세포의 SAHA 수준이 R1881 비처리된 세포의 절반임을 나타낸다. 이는 안드로겐-처리된 LNCaP 세포에 존재하는 고 ROS 수준에 의한 SAHA의 산화, 또는 안드로겐-처리된 세포에서의 SAHA의 흡수 억제 또는 증가된 배설 또는 두 가지 모두로 인한 것일 수 있다. SAHA 활성이 벡터 대조군 클론에 대한 것보다 LNCaP 세포의 siSSAT 클론에 대하여 더 높기 때문에, SAHA 활성에 영향을 미치는 LNCaP 세포에서의 SAHA의 흡수/배설 역할이 배제된다. 이러한 관찰로부터, 산화적으로 매우 스트레스 받은 세포에서의 SAHA의 산화적 분해가 인간 전립선암, 결장암 및 유방암 세포의 SAHA 비민감성에 대한 원인인 듯하다.
도 4의 데이터는 임상적으로 달성 가능한 혈청 수준(~1.3 μM)의 SAHA가 비타민 E 또는 또 다른 유사한 항산화제로 처리되지 않은 모든 세포주에 대하여 비활성임을 증명한다. 유방암 및 결장암 세포 이외에도 안드로겐의 존재에서 성장하는 안드로겐-의존성 전립선암 세포 및 안드로겐의 부재에서 성장하는 안드로겐-비의존성 전립선암 세포가 비타민 E 및 다른 것과 같은 항산화제로 처리될 경우 세포 산화 스트레스를 낮추는 임상적으로 달성 가능한 혈청 수준보다 훨씬 아래의 농도의 SAHA에 매우 민감성이다. 그러므로, SAHA에 대하여 내성인, 산화적으로 매우 스트레스 받은 인간 종양은 SAHA가 비타민 E 또는 항산화제와 조합으로 주어진다면 민감성이 된다.
따라서, 전립선, 결장 및 유방암 세포에서:
·SAHA 유발된 세포 ROS 증가는 SAHA의 성장 억제 효과의 원인이 아니고;
·SAHA는 인간 전립선암, 결장암 또는 유방암 세포에 존재하는 고 ROS에 의하여 산화되고, 따라서 이러한 종양에 대한 활성을 손실한다.
·사전처리에서 비타민 E 또는 다른 항산화제 및 OSM 물질에 의한 세포 산화 스트레스의 저하가 SAHA의 성장 억제 효과에 대하여 안드로겐-의존성 뿐만 아니라 안드로겐-비의존성 CaP 세포 모두, 또한 인간 결장 및 유방암 세포를 민감화한다.
·이러한 데이터는 다른 경우에서는 SAHA 및 다른 유사한 산화-민감성 화학치료 약물에 비반응성인 인간 암의 치료적 약물 처리에서 산화 스트레스 조절제와 SAHA의 효과적인 새로운 병용 치료를 나타낸다.
화합물의 합성
다양한 Mito-VE, Mito-PMCol 및 Mito-퀴논 및 Mito-플라스토퀴논 유사체, 뿐만 아니라 Mito-PMHQ 및 Mito-템폴 및 Mito-카르바마이드-템폴 및 다른 Mito-템폴-H 유사체에 대한 신규한 약물 전달 시스템의 적용이 이전에 연구되지 않았다. 많은 표적 화합물의 합성은 통상적인 출발 물질 또는 중간체를 이용하고 상업적으로 실용적이며 매우 합리적인 비용으로 화합물 생성을 용이하게 한다. 모든 신규 화합물은 IR, UV 및 NMR 분광학을 이용하여 특성결정된다. 분광학적 특성결정이 수행되고, 최종 화합물의 순도가 원소 분석에 의하여 확립되며, 이러한 화합물이 생물 시스템에서 테스트된다.
Mito-PMCol 유사체 및 PMCol 클론원성(clonogenic) 검사에 의하여 측정된 바와 같은, 종양 세포 시스템에서의 상대적인 세포정지(cytostatic)/항증식 및 세포독성 그리고 치료적 활성에 대하여 비교되었고, 직접적인 살아 있는 세포 및 죽은 세포 계수가 본 발명자들의 연구실에서 확립된 반복적인 공개 절차를 따라 트리판 청색 염료 배제 검사 또는 DNA 형광 검사에 의하여 혈구계에서 수행된다. 배지에서 성장하는 LNCaP 및 DU-145 세포의 다양한 여러 상이한 농도의 PMCol 및 유사체 처리의 결과가 연구실에서 사용된 반복 절차를 이용하여 수행된다.
치료 방법
시험관 내 또는 생체 내 종양의 최소한 일부의 인간 암 세포주의 성장을 억제하는 능력의 관점에서, 본 명세서에 기재된 화합물이 암 또는 암 이전 질환과 같은 인간을 포함하는 포유류의 비제어 증식 질환을 예방, 완화 또는 치료하기 위하여 사용될 수 있다. 본 명세서에 기재된 화합물이 비제어 염증, 증식, 과형성 질화, 암, 및 전립선암 또는 결장암, 유방암, 췌장암, 간암, 두경부암 및을 포함하는 다른 암 및 상피 기원의 다른 고형 종양을 치료하기 위한 약제의 제조를 위하여 사용될 수 있다.
그러므로, 일부 구체예에서, 본 개시는 비제어 세포 염증, 증식 질환의 치료 방법에 관한 것이고, 여기서 상기 방법은 비제어 세포 염증 및/또는 증식 질환을 가지는 것으로 진단된 포유류에게, 본 개시의 화합물 또는 본 개시의 화합물 중 하나 이상을 포함하는 약제학적 조성물을, 비제어 세포 염증 및/또는 증식 질환의 치료에 대한 유효량으로 투여한는 것을 포함한다.
치료되는 비제어 세포 염증 및/또는 증식 질환은 암종, 림프종, 백혈병, 또는 육종 또는 바이러스 유발된, HCC, 자궁경부, H&B 또는 전립선 종양일 수 있다. 본 개시의 방법에 의하여 치료되는 암의 유형은 호지킨병, 골수성 백혈병, 다낭성 신장 질환, 방광암, 뇌암, 두경부암, 신장암, 폐암, 골수종, 신경모세포종/교모세포종, 난소암, 췌장암, 전립선암, 피부암, 간 암, 흑색종, 결장암, 자궁경부 암종,두경부암, HCC, 유방암, 상피성 암, 및 백혈병을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 조성물은 또한 비제어 염증 및/또는 증식 질환 및/또는 자궁경부 및 항문 형성이상, 다른 형성이상, 심각한 형성이상, 증식증, 비정형 증식증, 전립선 상피 내 신생물, 및 종양형성과 같은 암 이전 용태에서 조절제로서 사용될 수 있다.
본 개시의 화합물은 전립선암 및 췌장 선암종 또는 전립선 선암종을 포함하는 관련 종양형성의 치료, 및/또는 전립선암 및 관련 종양형성의 성장 또는 증식성 또는 만성 염증성 장애 억제에 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
일부 구체예에서, 본 명세서에 기재된 구체예는 암 이의 전조 염증성 종양형성을 가지거나 이에 걸리기에 쉬운 것으로 진단된 포유류에게, 암의 치료 또는 암의 발생, 재발, 진행, 또는 전이 또는 이의 전조 종양형성의 억제에 대한 유효량으로, 다음 화학식을 가지는 양이온을 가지는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것으로 구성되는, 염증, 암의 발생, 재발, 진행, 혈관신생, 또는 전이 또는 이의 전조 종양형성을 치료하거나 억제하는 방법에 관한 것이고,
Figure pct00087
여기서
a) A는 3 내지 16 개의 탄소 원자를 가지는, 퀴논, 플라스토퀴논,하이드로퀴논, 퀴놀, 크로만올, 템폴, 디아민, 트리테르펜, 테트라사이클린, 또는 크로마논 또는 다른 유사한 모이어티, 또는 이의 전구약물을 포함하는, 하나 이상의 화합물을 포함하는 항산화제 모이어티이고,
b) L은 4 내지 30 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 연결 모이어티이고,
c) E는 질소 또는 인 원자이고,
d) R1', R1", 및 R1"'은 각각 독립적으로 1 내지 12 탄소 개의 원자를 포함하는 유기 모이어티에서 선택되고, 여기서 E, R1', R1", 및 R1"'은 함께 4차 암모늄 또는 포스포늄 양이온을 형성하고;
여기서 염은 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 음이온 Xn -을 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 추가로 포함하고, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이다.
본 개시의 약제학적으로 허용 가능한 염은 특정 형태 또는 전립선암, 결장암, 위암, 신장암, 피부암, 두경부암, 뇌암, 췌장암, 폐암, 난소암, 자궁암, 간 암, HBV-유발된 HCC, 및 유방암 또는 고환암을 포함하지만 이에 제한되지 않는 암 치료에 특히 효과적인 것으로 밝혀졌다.
일부 구체예에서, 본 개시는 전립선암 또는 이의 전조 종양형성을 가지는 것으로 진단된 포유류에게, 암 치료 또는 전립선암의 발생, 재발, 만성 염증, 전이, 또는 전이 또는 이의 전조 종양형성 억제에 대하여 유효량으로, 화학식 (I)의 양이온을 포함하는 본 개시의 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 염을 투여하는 것으로 구성되는, 전립선암의 발생, 재발, 진행 또는 전이 치료 또는 억제 방법에 관한 것이다. 본 개시의 일부 바람직한 구체예에서, 약제학적으로 허용 가능한 염은 다음 화학식을 가지는 양이온을 가지고:
Figure pct00088
또는
Figure pct00089
여기서
e) E는 질소 또는 인 원자이고,
f) R1', R1'', 및 R1'''은 각각 독립적으로 1 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 모이어티에서 선택되고,
g) n은 8 내지 12의 정수이고,
h) Y는 전자 활성화 모이어티를 포함하는, 수소에 대한 치환기이고; 지수 m은 0 내지 3이고;
여기서 E, R1', R1'', 및 R1'''은 함께 4차 암모늄 또는 포스포늄 양이온을 형성하고;
염은 또한 약제학적으로 허용 가능한 염을 형성하기에 충분한 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 음이온 Xn -를 포함하고, 여기서 n은 1 내지 4의 정수이다.
한 구체예는 HDAC 억제제와 항산화제를 포함하는 복합물의 투여를 포함하는 암 치료 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 HDAC 억제제 내성 암인 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 전립선암 또는 결장암에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 안드로겐-반응성 암인 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 증가된 수준의 반응성 산소 화학종을 특징으로 하는 방법이다. 또 다른 구체예는 암이 상승된 수준의 산화 스트레스를 특징으로 하는 방법이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 또는 비타민 E 유사체 또는 Mito-Q에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E, Mito-비타민 E, Mito-퀴논 또는 Mito-템폴에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 화학식 (I)의 화합물인 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 먼저 투여되는 방법이다. 또 다른 구체예는 비타민 E 또는 수용성 항산화제가 먼저 투여되는 방법이다.
약제학적 조성물
비록 본 명세서에 기재된 화합물이 순수한 화학물질로서 단수로 또는 복수로 투여될 수 있기는 하지만, 기능식품 또는 약제학적 조성물로서 활성 성분이 나타나는 것이 바람직하다. 따라서, 본 개시의 또 다른 구체예는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체 및, 선택적으로, 다른 치료적 및/또는 예방적 성분과 함께 하나 이상의 화합물 및/또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 약제학적 조성물의 용도이다. 담체(들)는 조성물의 다른 성분과 상용성(compatible)이고 수용자에게 지나치게 해롭지 않다는 의미에서 "허용 가능"해야 한다. 약제학적 조성물은 비제어 세포 염증 및/또는 증식 질환에 대한 치료가 필요한 것으로 진단된 포유류에게, 본 명세서에 기재된 다양한 암 및 암 이전 용태와 같은 비제어 세포 염증 및/또는 증식 질환 치료에 대하여 유효량으로 투여된다.
항산화제 및 산화를 견딜 수 있는 화합물을 포함하는 약제학적 조성물이 또한 본 명세서에 기재된다.
한 구체예에서, 산화를 견딜 수 있는 화합물은 HDAC의 억제제이다. 한 구체예는 HDAC 억제제와 항산화제의 복합물을 포함하는 약제학적 조성물이다. 또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 방법이다.
또 다른 구체예는 HDAC 억제제가 수베로일아닐라이드 하이드록삼산에서 선택되는 방법이다. 보리노스타트 또는 수베로일아닐라이드 하이드록삼산(SAHA)이 히스톤 디아세틸레이즈(HDAC)를 억제하는 더 큰 부류의 화합물의 일원이다. 히스톤 디아세틸레이즈 억제제(HDI)는 광범한 후생적(epigenetic) 활성을 가진다. 보리노스타트는 다른 의약으로 치료하는 동안 또는 치료한 후에 질환이 지속되고, 나빠지고 또는 복귀될 경우 피부 T-세포 림프종(CTCL)의 치료를 위하여 제품명 졸린자(Zolinza)로 판매된다. 졸린자는 2006년 10월 6일에 CTCL의 치료에 대하여 미국 식품의약국(FDA)의 승인을 받았고, 뉴저지, 화이트 하우스 스테이션 소재의 Merck & Co., Inc.를 위하여 캐나다, 온타리오, 미시사우가 소재의 Patheon, Inc.에 의하여 판매된다. 졸린자는 CTCL과 가깝게 관련된 또 다른 유형의 림프종인 세자리 증후군 치료에 또한 사용된다. 최근의 연구는 보리노스타트가 또한 possesses 다형성 재발 교모세포종에 대하여 활성을 가져, 5.7 개월의 중앙 전체 생존을 야기함을 암시했다 (이전의 연구의 4 - 4.4 개월과 비교). 추가의 뇌 종양 시험이 계획되고, 여기서 보리노스타트가 Mito-템폴-C10을 포함하는 항산화제 약물과 조합될 것이다. 진행된 비-소-세포 폐암(NSCLC)의 치료에서 보리노스타트의 포함은 개선된 반응 속도 및 증가된 중앙 무진행 생존 및 전체 생존을 나타냈다 (비록 생존 개선이 P=0.05 수준으로 현저하지는 않기는 했다). 졸린자는 항산화제 약물을 사용하는 감염된 사람으로부터의 HIV 박멸에 있어서 후보 약물이고, 최근 잠복성으로 HIV 감염된 T-세포에 대하여 시험관 내 및 생체 내 효과를 모두 가지는 것으로 나타났다.
또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E 또는 수용성 또는 mito-표적화된 비타민 E 유사체에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예는 항산화제가 비타민 E, 템폴 또는 비-항생 항산화 활성의 테트라사이클렌에서 선택되는 방법이다. 또 다른 구체예에서, 항산화제는 화학식 (I)의 화합물이다. 또 다른 구체예에서, 항산화제는 템폴 또는 템폴-H(하이드록실아민)이다. 또 다른 구체예는 조성물이 단일 단위 투약형으로 포함되는 방법이다.
본 명세서에서 사용된 "약제학적 조성물"은 하나 이상의 약제학적으로-허용 가능한 담체의 적절한 조합과 함께 치료적 유효량의 약제학적으로 효과적인 화합물을 의미하고, 담체 중 다수가 당해 분야에 공지인데, 희석제, 보존제, 가용화제, 유화제, 및 어쥬번트, 집단적으로 초임계 유체 용매/반용매 제조에서 유래한 나노입자 제제를 포함한다.
본 명세서에서 사용된 용어 "유효량" 및 "치료적 유효량"은 독성, 자극, 또는 알르레기 반응과 같은 부적절한 불리한 부작용 없이 원하는 치료적 또는 예방적 반응을 일으키기에 충분한 활성 치료제의 양을 지칭한다. 특정 "유효량"은 치료되는 특정 용태, 환자의 건강 상태, 치료되는 동물의 유형, 치료의 지속기간, 공동 요법의 특징 (존재할 경우), 및 사용되는 특정 제제 및 화합물 또는 이의 유도체의 구조와 같은 인자에 따라 분명하게 변할 것이다. 이 경우에, 양은 다음 중 하나 이상을 야기할 경우 치료적 유효량인 것으로 간주될 것이다: (a) 안드로겐-매개, ADT-매개 염증, 또는 안드로겐-비의존성 장애(예를 들어, 전립선암)의 예방; 및 (b) 안드로겐-매개 또는 안드로겐-비의존성 장애(예를 들어, 전립선암)의 역전 또는 안정화. 최적 유효량은 반복 실험을 이용하여 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
약제학적 조성물은 액화 또는 동결건조 그렇지 않으면 건조될 수 있고, 다양한 버퍼 내용물의 희석물 (예를 들어, Tris-HCI, 아세테이트, 포스페이트), pH 및 이온 강도, 표면으로의 흡수를 막기 위한 알부민 또는 젤라틴과 같은 첨가제, 계면활성제 (예를 들어, Tween 20, Tween 80, Pluronic F68, 담즙 산 염), 가용화제 (예를 들어, 글리세롤, 폴리에틸렌 글리세롤), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 소듐 메타바이설파이트), 보존제 (예를 들어, 티오메살, 벤질 알코올, 파라벤), 증량(bulking) 물질 또는 삼투성 변형제 (예를 들어, 락토오스, 만니톨), 폴리에틸렌 글리콜과 같은 고분자의 단백질에 대한 공유성 부착, 금속 이온과의 복합체화, 또는 폴리락트산, 폴리글리콜산, 겔, 하이드로겔 등과 같은 고분자 화합물의 미립자 제조, 또는 리포솜, 미세유액, 미셀(micelle), 규정된 크기의 나노입자, 독특한 결정 다형체 등으로의 물질의 편입을 포함할 수 있다.
비수성 용매의 예는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 및 에틸 올레이트와 같은 주입 가능한 유기 에스테르이다. 수성 담체는 염 및 완충된 매질을 포함하여, 물, 알코올 용액/수용액, 유액 또는 현탁액을 포함한다. 비장관 비히클(vehicle)은 소듐 클로라이드 용액, Ringer 덱스트로오스, 덱스트로오스 및 소듐 클로라이드, 락테이트화 Ringer 및 고정 오일을 포함한다. 정맥 내 비히클은 Ringer 덱스트로오스에 기초한 것과 같은 유체 및 영양소 보충제, 전해질 보충제 등을 포함한다. 보존제 및 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 조합제(collating agent), 비활성 기체 등과 같은 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다.
본 개시에 따라 투여 가능한 제어 또는 지연 방출 조성물은 친유성 데포(depot)(예를 들어 지방산, 왁스, 오일) 중의 제제를 포함한다. 고분자(예를 들어 폴록사머 또는 폴록사민)으로 코팅된 미립자 조성물 및 항체 또는 핵 또는 조직-특이성 수용체, 리간드 또는 항원을 향하는 다른 편재화 단백질과 결합된 화합물 또는 조직-특이성 수용체의 리간드에 결합된 화합물이 본 개시에 의하여 또한 포함된다.
본 개시에 따라 투여되는 조성물의 다른 구체예는 미립자 형태, 보호성 코팅, 프로테이즈 억제제, 검 구아, 시트러스 펙틴, 갈락토만닌 또는 비장관, 폐, 경비 또는 경구를 포함하는 다양한 경로의 투여를 위한 투과 향상제를 포함한다.
폴리에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜과 폴리프로필렌 글리콜의 공중합체, 카르복시메틸 셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐 알코올, 폴리비닐피롤리돈 또는 폴리프롤린과 같은 수용성 고분자의 공유성 부착에 의하여 변형된 화합물이 상응하는 변형된 화합물보다 정맥 내 주입 후 혈액에서 실질적으로 더 긴 반감기를 나타내는 것으로 공지이다 (Abuchowski et al., 1981; Newmark et al. , 1982; 및 Katre et al., 1987). 이러한 변형은 또한 수용액에서 화합물의 용해도를 증가시키고, 응집을 제거하고, 화합물의 물리적, 화학적 안정성을 향상시키고, 화합물의 면역원성 및 반응성을 크게 감소시킬 수 있다. 그 결과로, 원하는 생체 내 생물학적 활성이 변형되지 않은 화합물보다 덜 빈번하게 또는 더 적은 용량으로 이러한 고분자-화합물 부가물을 투여하여 달성될 수 있다.
본 개시에 따른 또 다른 방법에서, 약제학적 조성물이 제어 방출 시스템에서 전달될 수 있다. 예를 들어, 물질이 정맥 내 주입, 매몰성 삼투 펌프, 경피 패치, 리포솜, 또는 다른 투여 방식을 이용하여 투여될 수 있다. 한 구체예에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer, supra; Sefton, CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14: 201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88: 507 (1980); Saudek et al., N. Engl. J. Med. 321 : 574 (1989) 참조). 또 다른 구체예에서, 고분자 물질이 사용될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 제어 방출 시스템이 치료 표적, 즉, 전립선에 근접하게 위치되어, 전신 용량의 일부만을 필요로 할 수 있다 (예를 들어, Goodson, in Medical Applications of Controlled Release, supra, vol. 2, pp. 115-138 (1984) 참조). 다른 제어 방출 시스템이 Langer의 리뷰에서 논의된다 (Science 249: 1527-1533 (1990)).
약제학적 제제는 항산화제 화합물을 단독으로 포함할 수 있거나, 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있고, 정제, 분말, 캡슐, 펠렛, 용액, 현탁액, 엘릭시르, 유액, 겔, 크림, 또는 직장 및 요도 좌약을 포함하는 좌약과 같은 고체 또는 액체 형태일 수 있다.
약제학적으로 허용 가능한 담체는 검, 녹말, 당, 셀룰로오스 물질, 및 이들의 혼합을 포함한다. 화합물을 포함하는 약제학적 제제는 예를 들어, 펠렛의 피하 이식에 의하여 환자에게 투여될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 펠렛은 일정 기간에 걸쳐 화합물의 제어 방출을 제공한다. 제제는 또한 액체 제제의 정맥 내, 동맥 내, 또는 근육 내 주입, 액체 또는 고체 제제의 경구 투여, 또는 국소 도포에 의하여 투여될 수 있다. 투여는 또한 직장 좌양 또는 요도 좌약 또는 양치 물약의 사용에 의하여 이루어질 수 있다.
비록 본 개시의 화합물, 및/또는 이의 약제학적 조성물의 소정의 단일 약제학적 유효량을 치료되는 질환 용태 모두에 대하여 각각 특정하는 것이 불가능하기는 하지만, 이러한 약제학적 유효량 결정이 통상적인 지식의 담당의 또는 임상의의 지식, 그리고 궁극적으로 이들의 재량 내에 있다. 일부 구체예에서, 본 개시의 활성 화합물이 전형적으로 약 0.1 내지 약 100 μM, 약 1 내지 50 μM, 또는 약 2 내지 약 30 μM의 활성 화합물의 피크 혈장 농도를 달성하도록 투여된다. 이는 예를 들어, 선택적으로 식염수에 섞인 활성 성분의 0.05% 내지 5% 용액의 정맥 내 주입에 의하여, 또는 약 0.5-500 mg의 활성 성분을 포함하는 볼루스로서 경구 투여되어 달성될 수 있다. 바람직한 혈액 수준은 약 0.01-5.0 mg/kg/hr를 제공하는 연속 주입, 또는 약 0.4-15 mg/kg의 본 개시의 활성 화합물을 포함하는 간헐적 주입에 의하여 유지될 수 있다.
약제학적 조성물은 경구, 장관, 비장관(근육 내, 피하 및 정맥 내 포함), 국소, 경비, 질, 눈, 설하, 경비 또는 흡입 투여에 적절한 것을 포함한다. 조성물은, 적절할 경우, 불연속 단위 투약 형태로 편리하게 제시될 수 있고, 약학 분야에 공지인 임의의 방법에 의하여 제조될 수 있다. 이러한 방법은 활성 화합물을 액체 담체, 고체 매트릭스, 반고체 담체, 미세하게 분할된 고체 담체 또는 이의 조합과 결합하는 단계, 이후 필요한 경우, 생성물을 원하는 전달 시스템으로 성형하는 단계를 포함한다.
본 개시의 화합물은 단독으로 또는 부형제의 존재에서 경구 복용 후 혈액 수준에 의하여 나타나는 경구 생체이용성을 가질 수 있다. 경구 생체이용성은 자가-투여 및 다른 투여 수단 투여에 비하여 감소된 비용의 장점을 가지는, 만성 질환에서의 이용을 위한 경구 복용을 가능하게 한다. 경구 투여에 적절한 약제학적 조성물은 각각 소정량의 활성 성분을 포함하는 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 카세(cachet) 또는 정제와 같은 불연속 단위 투약 형태로서; 분말 또는 과립으로서; 용액, 현탁액 또는 유액으로서 제시될 수 있다. 활성 성분은 또한 볼루스, 연질약(electuary) 또는 페이스트로서 제시될 수 있다. 경구 투여를 위한 정제 및 캡슐은 결합제, 충진제, 활택제, 붕해제, 또는 습윤제와 같은 종래의 부형제를 포함할 수 있다. 정제는 당해 분야에 공지인 방법에 따라, 예를 들어, 장용(enteric) 코팅으로써 코팅될 수 있다.
경구 액제 제제는 예를 들어, 수성 또는 오일성 현탁액, 용액, 유액, 시럽 또는 엘릭시르의 형태일 수 있거나, 사용 전에 물 또는 다른 적절한 비히클로써 구성되기 위한 건조 생성물로서 제시될 수 있다. 이러한 액체 제제는 현탁제, 유화제, 비수성 비히클 (이는 식용 오일을 포함할 수 있음), 또는 하나 이상의 보존제와 같은 종래의 첨가제를 포함할 수 있다.
본 개시에 의하여 투여 가능한 약제학적 제제는 공지의 용해, 혼합, 과립화 또는 정제 형성 공정에 의하여 제조될 수 있다. 경구 투여를 위하여, 화합물 또는 이의 염, 에스테르, N-옥사이드 등과 같은 생리적으로 허용된 유도체가 비히클, 안정제, 또는 비활성 희석제와 같은 이 목적을 위한 통상적인 첨가제와 혼합되고, 정제, 코팅된 정제, 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐, 수성, 알코올 또는 오일성 용액과 같은 투여에 적절한 형태로 종래의 방법에 의하여 전환된다. 적절한 비활성 비히클의 예는 아카시아, 옥수수녹말, 젤라틴과 같은 결합제, 옥수수녹말, 감자 녹말, 알긴산과 같은 붕해제, 또는 스테아르산 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 활택제와 조합의, 락토오스, 수크로오스, 또는 옥수수녹말과 같은 종래의 정제 베이스이다.
적절한 오일성 비히클 또는 용매의 예는 해바라기 오일 또는 생선-간 오일과 같은 식물 또는 동물 오일이다. 제조는 건조 및 습윤 과립 또는 초임계 제형화된 나노입자로서 수행될 수 있다.
화합물은 또한 비장관 투여(예를 들어, 주입, 예를 들어, 볼루스 주입 또는 연속 주입에 의한 것)를 위하여 제형화될 수 있고, 앰플, 사전 충전된 주사기, 소형 볼루스 주입 용기에 단일 용량으로 또는 첨가된 보존제와 함께 다회 용량 용기로 제시될 수 있다. 조성물은 오일성 또는 수성 비히클에 섞인 현탁액, 용액, 또는 유액의 형태를 취할 수 있고, 현탁제, 안정제 및/또는 분산제와 같은 제형화제를 포함할 수 있다. 대안으로, 활성 성분이 멸균 고체의 무균 분리 또는 용액으로부터의 동결건조에 의하여 수득된, 사용 전에 적절한 비히클, 예를 들어, 멸균 발열성물질 제거수로써 구성하기 위한 분말 형태일 수 있다.
비장관 투여(피하, 정맥 내, 동맥 내 또는 근육 내 주입)를 위하여, 화합물 또는 이의 염, 에스테르, N-옥사이드 등과 같은 생리적으로 허용된 유도체가 필요한 경우 이러한 목적에 통상적이고 적절한 물질, 예를 들어, 가용화제 또는 다른 보조제와 함께 용액, 현탁액, 또는 압출(expulsion)로 전환된다. 예는 계면활성제 및 다른 약제학적으로 허용 가능한 어쥬번트를 첨가하거나 첨가하지 않은 물 및 오일과 같은 멸균 액체이다. 예시적인 오일은 석유, 동물, 식물, 또는 합성 기원의 오일, 예를 들어, 낙화생 오일, 대두 오일, 또는 미네랄 오일이다. 일반적으로 물, 식염수, 수성 덱스트로오스 또는 관련 당 용액, 및 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜과 같은 글리콜이, 특히 주입 가능한 용액에 바람직한 액체 담체이다.
활성 성분을 포함하는 약제학적 조성물의 제조가 당해 분야에서 주지이다. 이러한 조성물은 비인강에 전달되는 에어로졸 또는 주입 가능한 액체 용액 또는 현탁액으로서 제조될 수 있지만; 주입 전에 액체 용액, 또는 현탁액에 섞이기에 적절한 고체 형태가 또한 제조될 수 있다. 제제는 또한 유화될 수 있다. 활성 치료적 성분은 흔히 약제학적으로 허용 가능하고 활성 성분과 상용성인 부형제와 혼합된다. 적절한 부형제는 예를 들어, 물, 식염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올, 등 또는 이의 임의의 조합이다.
게다가, 조성물은 활성 성분의 유효성을 강화시키는 습윤제 또는 유화제, pH 완충제와 같은 보조 물질을 소량 포함할 수 있다.
본 개시의 화합물은 약제학적으로 허용 가능한 음이온과 함께 약제학적으로 허용 가능한 염 형태의 양이온 항산화제를 포함한다. 약제학적으로 허용 가능한 염은 약제학적으로 허용 가능한, 플루오라이드, 클로라이드, 브로마이드, 또는 아이오다이드와 같은 할라이드, 트리베이직 포스페이트, 디베이직 수소 포스페이트, 모노베이직 디하이드로젠 포스페이트, 또는 아세테이트, 옥살레이트, 타르트레이트, 만델레이트, 석시네이트, 시트레이트, 등과 같은 약제학적으로 허용 가능한 유기 카르복실산의 음이온 형태를 포함한다. 이러한 약제학적으로 허용 가능한 염은 이온 교환 반응 및 당업자에게 공지인 기술에 의하여 화합물의 초기 합성에 사용되는 다른 염으로부터 쉽게 합성될 수 있다.
양이온 항산화제 모이어티상의 임의의 유리 카르복실기로부터 형성된 염이 또한 예를 들어, 소듐, 포타슘, 암모늄, 칼슘, 또는 페릭 하이드록사이드와 같은 무기 염기, 및 이소프로필아민, 트리메틸아민, 2- 에틸아미노 에탄올, 히스티딘, 프로카인 등과 같은 유기 염기로부터 유도될 수 있다.
의약에서 사용하기 위하여, 항산화, 항암 또는 화학-치료 또는 화학-예방 화합물의 염이 약제학적으로 허용 가능한 염일 수 있다. 그러나 다른 염이 본 개시에 따른 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염의 상업적 또는 실험실 제조에 유용할 수 있다. 화합물의 적절한 약제학적으로 허용 가능한 염은, 예를 들어 본 개시에 따른 화합물의 용액을 염산, 황산, 메탄설폰산, 푸마르산, 말레산, 석신산, 아세트산, 벤조산, 옥살산, 시트르산, 타르타르산, 카르본산 또는 인산과 같은 약제학적으로 허용 가능한 산의 용액과 혼합하여 형성될 수 있는 산 부가염을 포함한다.
더욱이, 본 명세서에 기재된 염이 기능 식품 조성물 형태로 제공될 수 있고, 여기서 비록 병 라벨이 하기 용어를 사용하지 않기는 하지만, 염의 항산화, 및 다른 바람직한 특성이 예를 들어, 전립선암을 포함하는 다양한 형태의 암의 발생 억제를 포함하여 다양한 용태 또는 장애를 안정화하거나 감소시키거나 발병을 예방한다. 이 명세서의 목적을 위한 용어 "기능 식품" 또는 "기능 식품 조성물"은 질환의 예방 및/또는 치료를 포함하는 의학적 건강 이점을 제공하는 음식 제품, 또는 음식 제품의 일부를 지칭한다. 본 개시에 따른 기능 식품 조성물은 활성 성분으로서 단지 본 개시에 따른 양이온 항산화제 화합물만을 포함할 수 있거나, 대안으로, 앞에서 언급한 양이온 항산화제 화합물과 혼합으로, 비타민, 조효소, 미네랄, 허브, 아미노산 등을 포함하는 식이 보충제를 추가로 포함할 수 있고, 이는 상기 물질의 전체 섭취를 증가시켜 식이를 보충한다.
그러므로, 본 개시는 화학식 I 또는 이의 약제학적으로 허용 가능한 염을 가지는 화합물을 포함하는 기능 식품 조성물을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는, 환자에게 기능 식품 이점을 제공하는 방법을 제공한다. 이러한 조성물은 일반적으로 "기능 식품-허용 가능한 담체"를 포함하고, 본 명세서에서 지칭되는 이것은 앞에서 언급한 약제학적으로-허용 가능한 담체를 포함하지만 이에 제한되지 않는 경구 전달에 적절한 임의의 담체이다. 특정 구체예에서, 본 개시에 따른 기능 식품 조성물은 면역 강화제, 항염증제, 항산화제, 또는 이들의 혼합을 포함하는, 기능 기반으로 규정된 식이 보충제를 포함한다.
비록 앞에서 나열된 보충제의 일부가 이들의 약리학적 효과에 대하여 기재되기는 했지만, 다른 보충제 또한 본 개시에서 사용될 수 있고, 이들의 효과가 과학 문헌에 잘 기록되어 있다.
일반적으로, 당업자 인간 종양 세포주가 접종된 흉선 누드 마우스와 같은 모델 생물에서 획득한 생체 내 데이터를, 인간과 같은 또 다른 포유류에게 어떻게 외삽하는지를 이해한다. 이러한 외삽은 단순히 두 생물의 체중에 기초하는 것이 아니라, 대사 속도의 차이, 약리학적 전달 차이, 및 투여 경로를 포함한다. 이러한 유형의 고려에 기초하여, 대안의 구체예에서 적절한 용량이 전형적으로 약 0.5 내지 약 10 mg/kg/day, 또는 일일당 약 1 내지 약 20 mg/kg의 체중, 또는 약 5 내지 약 50 mg/kg/day의 범위일 것이다.
원하는 용량이 단일 용량으로 또는 적절한 간격으로 투여되는 분할된 용량으로, 예를 들어, 일일당 둘, 셋, 넷 또는 그 이상의 하위 용량으로 편리하게 제시될 수 있다. 당업자에게 필요한 하위 용량은 그 자체가 더 분할될 수 있는데, 예를 들어, 불연속의 느슨한 간격의 투여의 수로 분할된다.
당업자는 이러한 전형적인 범위 밖의 투약 및 투약 형태가 테스트될 수 있고, 적절한 경우, 본 명세서에 제시된 방법에서 사용될 수 있음을 인지할 것이다.
병용
본 개시의 또 다른 양태에 따라, 앞에서 언급한 화합물 이외에, 추가의 치료제를 포함하는, 암의 치료에 유용한 물질의 약제학적 조성물이 제공된다. 이러한 제제는 화학치료제, 박리(ablation) 또는 다른 치료적 호르몬, 항신생제, 암 및 혈관신생에 대하여 유용한 단일클론 항체 및 다른 억제제일 수 있다. 다음의 논의는 이 점에 있어서 예시적이지만 제한적이지 않은 몇 가지 제제를 강조한다. 광범한 다른 효과적인 제제가 또한 사용될 수 있다.
호르몬 및 억제제 중에서, 디에틸스틸베스톨(DES), 류프롤라이드, 플루타미드, 하이드록시플루타미드, 비칼루타미드, 사이프로테론 아세테이트, 케토코나졸, 아베레테론(aberaterone) 아세테이트, MDV3100 및 아미노 글루테티미드가 본 발명의 화합물과 병용으로 사용될 수 있다.
다양한 항과형성제, 항암제 및 항염증제 중에서, 탁소티어(도세탁솔), 5-플루오로우라실, 빈블라스틴 설페이트, 에스트라머스틴 포스페이트, 수라민 및 스트론튬-89가 본 발명의 화합물과 병용으로 사용될 수 있다. 병용에 유용하고 본 개시의 범위 이내인 다른 화학치료는 부세렐린, 클로로트라니즌, 크로믹 포스페이트, 시스플라틴, 사트라플라틴, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신, 에토포시드, 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 포접 및 에스테르화된 에스트로겐, 에스트론, 에티닐 에스트라디올, 플록스유리딘, 고세렐린, 하이드록시우레아, 멜파란, 메토트랙세이트, 미토마이신, 프리드니손, 및 템폴 또는 이들의 전구약물이다.
본 명세서의 연구 및 개시된 구체예의 실시로부터 본 개시의 다른 구체예가 당업자에게 명백할 것이다. 본 명세서 및 실시예는 오로지 예시적인 것으로, 다음의 청구 범위에 의해 명시되는 것으로 의도되었다.

Claims (36)

  1. 항암제와 항산화제를 포함하는 복합물(combination)의 투여를 포함하는 암의 치료 방법.
  2. 제1항에 있어서, 항암제는 반응성 산소종 또는 질소종에 의해 산화되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  3. 제1항에 있어서, 항암제는 아스피린, 도세탁셀, 5-플루오로우라실, 젬시타빈, 빈블라스틴 설페이트, 에스트라머스틴 포스페이트, 수라민, 부세렐린, 클로로트라니즌, 크로믹 포스페이트, 시스플라틴, 사트라플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신, 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 포접 및 에스테르화된 에스트로겐, 에스트론, 에티닐 에스트라디올, 에토포시드, 플록스유리딘, 고세렐린, 하이드록시우레아, 멜파란, 메토트랙세이트, 미토마이신, 프리드니손, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  4. 제1항에 있어서, 항산화제는 화학식(I)의 구조를 가지며
    Figure pct00090

    여기서:
    i) A는 하이드로퀴논, 디하이드로퀴논, 퀴논, 플라스토퀴논, 템폴, 페놀, 디아민, 트리테르펜, 크로만올, 크로마논 또는 이의 전구약물을 포함하고, 2 내지 30개의 탄소 원자를 가지는, 항산화제 또는 환원된 항산화제로서 기능을 할 수 있는 최소한 하나의 기이고;
    ii) L은 0 내지 50개의 탄소 원자를 포함하는 연결기이고;
    iii) E는 원자가 없거나 질소 또는 인이고;
    iv) R1', R1'', 및 R1'''은 0 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 라디칼에서 각각 독립적으로 선택되고; 및
    b) 화학식
    Figure pct00091
    를 가지는 최소한 하나의 음이온을 가지며, 여기서 양이온 및 음이온이, 존재할 경우, 중성의 약제학적으로 허용가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  5. 제4항에 있어서, A 기는 다음 화학식을 가지며:
    Figure pct00092
    또는
    Figure pct00093

    여기서 Y는 선택적으로 존재하며, 다음에서 선택되는 하나 이상의 전자 활성화 모이어티일 수 있으며:
    i) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
    ii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알킬;
    iii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알콕시;
    iv) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알콕시; 또는
    v) -N(R2)2, 각각의 R2는 독립적으로 수소이거나 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬임; 그리고 m은 존재하는 Y 단위의 개수를 나타내며 m의 값은 0 내지 3인 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  6. 제4항에 있어서, A는
    Figure pct00094
    임을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  7. 제1항에 있어서, 항산화제는 비타민 E 또는 비타민 E 유사체인 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  8. 제4항에 있어서, 항암제는 HDAC 억제제인 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  9. HDAC 억제제와 항산화제를 포함하는 복합물의 투여를 포함하는 암의 치료 방법.
  10. 제9항에 있어서, 암은 HDAC 억제제 내성 암인 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  11. 제9항에 있어서, 암은 전립선암, 유방암 또는 결장암에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  12. 제9항에 있어서, 암은 안드로겐 수용체- 및/또는 안드로겐- 반응성 암인 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  13. 제9항에 있어서, 암은 증가된 수준의 반응성 산소종을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  14. 제9항에 있어서, 암은 높아진 수준의 산화 스트레스를 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  15. 제9항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, HDAC 억제제는 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  16. 제9항에 있어서, 항산화제는 비타민 E 또는 비타민 E 유사체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  17. 제16항에 있어서, 항산화제는 비타민 E에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  18. 제9항에 있어서, 항산화제는 제일 먼저 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  19. 제16항에 있어서, 비타민 E는 제일 먼저 투여되는 것을 특징으로 하는 암의 치료 방법.
  20. 항암제와 항산화제의 복합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  21. 제20항에 있어서, 항암제는 반응성 산소종에 의해 산화될 수 있는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  22. 제20항에 있어서, 항암제는 아스피린, 도세탁셀, 5-플루오로우라실, 빈블라스틴 설페이트, 에스트라머스틴 포스페이트, 수라민, 부세렐린, 클로로트라니즌, 크로믹 포스페이트, 시스플라틴, 사트라플라틴, 카보플라틴, 사이클로포스파미드, 덱사메타손, 독소루비신, 에스트라디올, 에스트라디올 발러레이트, 포접 및 에스테르화된 에스트로겐, 에스트론, 에토포시드, 에티닐 에스트라디올, 플록스유리딘, 고세렐린, 하이드록시우레아, 멜파란, 메토트랙세이트, 미토마이신, 프리드니손, 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  23. 제20항에 있어서, 항산화제는 화학식 (I)의 구조
    Figure pct00095

    여기서:
    i) A는 하이드로퀴논, 디하이드로퀴논, 퀴논, 플라스토퀴논, 퀴놀, 페놀, 디아민, 트리테르펜, 테트라사이클린, 크로만올, 템폴, 니트록사이드, 또는 이의 전구약물을 포함하고, 2 내지 30개의 탄소 원자를 가지는, 항산화제 또는 환원된 항산화제로서 기능을 할 수 있는 최소한 하나의 기이고;
    ii) L은 0 내지 50개의 탄소 원자를 포함하는 연결기이고;
    iii) E는 원자가 없거나 질소 또는 인이고;
    iv) R1', R1'', 및 R1'''은 0 내지 12 개의 탄소 원자를 포함하는 유기 라디칼 중에서 각각 독립적으로 선택되고; 및
    b) 화학식
    Figure pct00096
    를 가지는 최소한 하나의 음이온을 가지며, 여기서 양이온 및 음이온이, 존재할 경우, 중성의 약제학적으로 허용가능한 염을 형성하기에 충분한 양으로 존재하는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  24. 제23항에 있어서, A 기는 다음 화학식을 가지며:
    Figure pct00097
    또는
    Figure pct00098

    여기서 Y는 선택적으로 존재하며, 다음에서 선택되는 하나 이상의 전자 활성화 모이어티일 수 있으며:
    i) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알킬;
    ii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알킬;
    iii) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 알콕시;
    iv) C1-C4 선형, 분지형, 또는 사이클릭 할로알콕시; 또는
    v) -N(R2)2, 각각의 R2는 독립적으로 수소이거나 C1-C4 선형 또는 분지형 알킬임; 그리고 m은 존재하는 Y 단위의 개수를 나타내며 m의 값은 0 내지 3인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  25. 제23항에 있어서, A는
    Figure pct00099
    임을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  26. 제20항에 있어서, 항산화제는 비타민 E 또는 비타민 E 유사체인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  27. 제23항에 있어서, 항암제는 HDAC 억제제인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  28. HDAC 억제제와 항산화제를 포함하는 복합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  29. 제28항에 있어서, HDAC 억제제는 트리코스타틴 A, 트라폭신 B, 페닐부티레이트, 발프로산, 벨리노스타트/PXD101, MS275, LAQ824/LBH589, CI994, 및 MGCD0103에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  30. 제28항에 있어서, 항산화제는 비타민 E 또는 비타민 E 유사체에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  31. 제30항에 있어서, 항산화제는 비타민 E에서 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  32. 제20항에 있어서, 조성물은 단일 단위 투약형으로 포함되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  33. 제20항에 있어서, 항암제는 전립선암에 대해 치료적으로 유효한 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  34. 항산화제 및 전립선 질환 또는 장애의 치료를 위한 치료제의 복합물을 포함하는 약제학적 조성물.
  35. 제34항에 있어서, 전립선 질환 또는 장애는 전립선비대증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  36. 제34항에 있어서, 전립선 질환 또는 장애는 전립선의 염증인 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
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