CN1997403A - 靶向线粒体的抗氧化剂在治疗肝病和上皮癌中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向线粒体的抗氧化剂例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物在治疗和预防肝病和/或上皮癌中的用途。本发明也涉及用于此用途的含有所述抗氧化剂的药物组合物。本发明还涉及用于这种预防和治疗的含有所述抗氧化剂的药物的制备方法。

Description

靶向线粒体的抗氧化剂在治疗肝病和上皮癌中的用途
技术领域
本发明涉及一种靶向线粒体的抗氧化剂例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物在治疗和预防肝病和/或上皮癌中的用途。
背景技术
肝病范围从可逆的轻度脂肪肝到进行性慢性肝病不等，最终导致发展成为危及生命的肝硬化、肝衰竭和肝癌等疾病。
慢性肝病的主要原因是被乙型肝炎病毒或丙型肝炎病毒感染、过量饮酒和非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)。
乙型肝炎病毒(HBV)感染是全球性公共健康问题。它是世界范围内的肝硬化和肝细胞癌(HCC)的主要原因(Conjeevaram H.S.等，2003，Journal of Hepatology，38：90-103)。丙型肝炎病毒(HCV)是世界范围内与肝有关的发病率和死亡率的主要原因之一，并代表了其中一种主要的公共健康问题(Alberti A.和BenvegnùL.，Journal of Hepatology2003，38：104-118)。HCV感染经常引起慢性肝炎，这与肝硬化和HCC的发展有关(Cyong J.C.等，2002，Am J Chin Med，28：351-360)。
酒精性肝病(ALD)是西方世界最常见的肝硬化原因，占最常见死亡原因的十分之一。在美国，ALD至少影响两百万人，约占美国人口的1％。ALD的准确发生率，特别其较轻度的形式，可能相当巨大，原因是很多患者是无症状的并且可能从未引起医疗上的重视。ALD范围从最常见的脂肪肝(脂肪变性)(如果不是嗜烈性酒者的话)到脂肪性肝炎、胆汁郁积(特征为经肝排泄胆汁受阻)、纤维化和最终的肝硬化(Stewart S.F.和Day C.P.，2003，Journal of Hepatology，38：2-13)。虽然脂肪肝具有节制性的可逆性，但对持续饮酒，尤其是当罹患脂肪性肝炎时的患者，这是一个发展为纤维化和肝硬化的危险因素。
非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指各种各样的肝损伤，从单纯脂肪变性到脂肪性肝炎、胆汁郁积、晚期肝纤维化和肝硬化。脂肪性肝炎(非酒精性脂肪性肝炎)仅代表NAFLD范围内的一个阶段(Anguilo P.，2002，N Engl.J.Med.，346：1221-1231)。该病理图像类似于乙醇诱发的肝损伤图像，但是其出现在不滥用乙醇的患者中。NAFLD应当区别于脂肪变性，伴有或不伴有肝炎，由次要原因所引起，原因是这些病症具有明显不同的病原体和结果。这些脂肪肝疾病(脂肪变性)的次要原因中有营养性原因(例如蛋白质-热量营养不良、饥饿、完全胃肠外营养、体重快速减轻、肥胖症的胃肠道手术)、药物原因(例如糖皮质激素、合成雌激素、阿司匹林、钙通道阻滞剂、四环素、丙戊酸、可卡因、抗病毒药、非阿尿苷、干扰素α、甲氨蝶呤、齐多夫定)、代谢或遗传性原因(例如脂肪代谢紊乱、异常β脂蛋白血症、Weber-Christian病、半乳糖血症、糖原贮积病、急性妊娠脂肪肝)以及其它原因，例如糖尿病、肥胖症或高脂血症等疾病(AnguiloP.，2002，N Engl.J.Med.，346：1221-1231；MacSween R.N.M.等，2002，Pathology of the Liver，第四版，Churchill Livingstone，ElsevierScience)。
尽管慢性肝炎具有流行性，但目前尚无治疗这种最常见病的有效方法。
多种遗传性和获得性肝病都与肝细胞中间丝(IF)细胞骨架的改变有关。其中一个最常见的IF相关改变是马洛里小体(Mallory body，MB)，它在酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎(ASH和NASH)、慢性胆汁郁积、铜中毒和其它代谢性肝病的肝细胞中以及在某些肝细胞癌(HCC)中形成。MB由作为主要成分的聚集错折叠角蛋白以及若干涉及解折叠蛋白应答的蛋白质(HSP27、HSP70、p62和泛蛋白)组成。蛋白质的错折叠一般作为在细胞应激(尤其是氧化应激)情况下蛋白质修饰的结果出现。MB的化学组成表明角蛋白是应激情况下错折叠的优选靶标，因此MB可被认为是细胞对错折叠角蛋白防御性应答的结果(Denk等，2000，J.Hepatol.，32：689-702)。
最严重的非病毒性慢性肝病、酒精性脂肪性肝炎和非酒精性脂肪性肝炎(ASH和NASH)能以高频率导致肝硬化、肝衰竭和肝癌(例如HCC)。ASH和NASH在诊断病理实验室中无法通过形态学评价加以区别。然而，脂肪素因增加伴随纤维化、炎症和肝细胞形态学改变，说明会发生这些更严重的疾病。ASH和NASH中细胞的变化包括体积增大(肿胀)和出现细胞内聚集(例如MB)，一般认为，肝细胞病理学谱可作为这些疾病的诊断标准。
总体来讲，对ASH和NASH尚无被批准的特异性治疗方法，通过活组织检查来确诊很可能无法影响到对患者该病的处理。
在西方发达国家，虽然肝癌相对并不常见，但在世界范围内它却处于癌症的前列。与很多其它类型的癌症相反，肝癌的发生及死亡人数逐年增加。
从全球来看，原发性肝癌(例如HCC)属于最常见的恶性肿瘤，每年死亡人数估计有一百万人(Bruix，J.等，2004，Cancer Cell(5)：215-219)。
肝癌的主要危险因素是病毒、饮酒、被黄曲霉毒素类霉菌污染的食品和代谢性疾病。酒精中毒及乙型和丙型慢性肝炎的比率持续增加。因此，鉴于目前肝癌发生率稳定增加的状况，本领域迫切需要新的疗法。
原发性肝癌很难治疗。癌的手术切除和肝移植局限于小的癌，对大多数患者来说并不是一个可行的选择，原因是在诊断时，癌症常常处于晚期阶段。化学治疗有时用于不适于手术的肿瘤，但任何益处通常都是短期的。因此，原发性肝癌的存活率特别低。在肝癌的治疗中，常规疗法通常没有效果。
例如，对于HCC，除肝切除术和肝移植外，尚无有效的治疗选择，就是这些方法也仅适用于早期HCC，并且受限于肝捐献者，患者还要面临很大风险。另外，这些方法特别昂贵。这些癌症对化疗药反应极差，原因很可能是肝的正常解毒功能和输出有害化合物。几种其它的治疗选择，例如化疗栓塞、冷冻疗法和乙醇注射尚处于实验阶段，这些功效尚未确立。
因此，迄今尚未研制出满意的疗法以能干预肝病和其它上皮癌。
现已了解多种抗氧化剂可通过与亚烷基链的亲脂性阳离子共价结合而靶向线粒体(Smith R.A.J.等，1999，Eur.J.Biochem.，263：709-716；Kelso G.F.等，2001，J.Biol.Chem.，276：4588-4596；James A.M.等，2005，J.Biol.Chem.，280：21295-21312)。这种方法使抗氧化剂靶向细胞内的自由基和活性氧中间体的最初产生部位，而不是随机分布。
具体地讲，已经公开了维生素E和辅酶Q10衍生物(US6,331,532；WO99/26954、WO2005/016322和WO2005/016323)或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物(WO2004/014927)通过与三苯基离子结合而靶向线粒体。体外实验证明，溴化[2-(3，4-二氢-6-羟基-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)乙基]-三苯基(Mito Vit E)以及MitoQuinol溴化[10-(3，6-二羟基-4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)癸基]三苯基和MitoQuinone溴化[10-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基的混合物(MitoQ)(Kelso G.F.等，出处同上；Smith R.A.J.等，出处同上)或者其中阴离子是甲磺酸根的MitoQ化合物(James A.M.等，2005，J.Biol.Chem，280：21295-21312；WO2005/016322和WO2005/016323)在分离的细胞内被线粒体快速并选择性累积。
另外，还研制出靶向线粒体的自旋阱(spin trap)苯基-叔丁基硝酮(MitoPBN)衍生物(Smith R.A.J.，Bioenergetics Group Colloquium，2003，679th Meeting of the Biochemical Society：1295-1299)。
重要的是，与非靶向抗氧化剂相比，这些抗氧化剂通过线粒体的累积能更有效地保护它们免受氧化性损伤，表明线粒体内生物活性分子的累积确实能增强效果，同时还能降低毒副反应(Murphy M.P.和Smith R.A.J.，2000，Adv.Drug.Delivery Rev.，41：235-250)。
另外，已发现所述简单的烷基三苯基阳离子TPMP、Mito Vit E和MitoQ可安全长期喂给小鼠，并且能在小鼠脑、心脏、肝和肌肉内产生潜在的治疗有效浓度(Smith R.A.等，2003，PNAS，100(9)：5407-5412)。
已要求保护了这些化合物(US6,331,532、WO99/26954或WO2004/014927、WO2005/016322和WO2005/016323)在用于预防与神经变性性疾病有关的线粒体氧化应激升高中的工业应用，所述神经变性性疾病例如帕金森病(Parkinson′s disease)、弗里德赖希共济失调(Friedrich′s Ataxia)、威尔逊病(Wilson′s disease)、与线粒体DNA突变相关的疾病、糖尿病、运动神经元疾病、炎症和中风、心脏病发作、器官移植和手术中的缺血性再灌注组织损伤，以及与衰老有关的非特异性元气损伤。在提及的专利文献中，已要求保护了这些化合物作为预防药在移植过程中保护器官、缓解在手术中出现缺血性再灌注损伤、降低中风和心脏病发作后的细胞损伤或者作为易患脑缺血的早产儿的预防药的用途。
对抗氧化剂治疗在治疗酒精性肝炎(AH)中的潜在价值的关注，是越来越多证据持续增长的结果，这些证据与氧化应激在乙醇介导的肝毒性中作为关键的机理有关(Stewart S.F.和Day C.P.，2003，Journalof Hepatology，38：2-13)。最近，这些考虑因素已教导了一些试验，这些试验研究了在患有严重AH患者中添加抗氧化剂的作用(例如PhilipsM.等，2001，Journal of Hepatology，34：250A)。在最近的研究中(StewartS.F.等，2002，Journal of Hepatolology，36：16)，活性组依次接受负荷剂量150mg/kg、100mg/kg/天N-乙酰半胱氨酸1周，然后每天接受维生素A-E、生物素、硒、锌、锰、铜、镁、叶酸和辅酶Q共计6个月。这种抗氧化剂治疗单独使用或与类固醇联合使用都未显示出益处。概括来讲，根据迄今获取的数据来看，在严重AH患者中，高剂量抗氧化剂治疗并不能使存活率提高(Stewart S.F.和Day C.P.，出处同上)。
氧化应激也一直与非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)的发病机理有关。在对胆碱缺乏饮食喂养的大鼠的研究中，已知维生素E通过阻断宽范围氧化情形下的自由基反应的传播而与活性氧中间体(ROS)反应，但是，这既不能阻止脂肪肝的发展，也不能降低氧化应激(OliveiraC.P.等，2003，Nutr.J.，2(1)：9)。
在对患有肝硬化和丙型肝炎病毒(HCV)感染并经α-生育酚(VitE组)治疗的患者的研究中，已显示未出现肝功能的改善、肝癌发生的抑制，也未出现累计存活率的提高(Tagaki H.等，2003，Int.J.Vitam Nutr.Res.，73(6)：411-5)。
此外，在对随机涉及多个研究中心的120名经活组织检查证明感染慢性丙型肝炎的连续患者(这些患者对先前α-干扰素疗程无反应)的研究中，口服增补N-乙酰半胱氨酸(1200mg/天)和维生素E(600mg/天)并不能改善单独用α-干扰素再治疗的功效较差(Ideo，G.等，1999，Eur.J.Gastroenterol.Hepatol.，11(11)：1203-7)。
发明概述
本发明涉及一种靶向线粒体的抗氧化剂化合物在治疗或预防肝病和/或上皮癌中的用途，所述抗氧化剂化合物包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子。
发明详述
下面预料不到地发现了靶向线粒体的抗氧化剂，例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物模拟物，可用于治疗和预防肝病和/或上皮癌。
在本发明的最广义方面，本发明提供一种用于治疗和预防肝病和/或上皮癌的靶向线粒体的抗氧化剂，所述抗氧化剂包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子，其中所述抗氧化部分能够通过线粒体膜转运并在完整细胞的线粒体内积聚。特别是，本发明化合物防止线粒体内氧化应激(或自由基)导致的细胞损伤。
本发明所用术语“肝病”是指包括整体或局部、一过性、暂时、慢性或永久性地以病理方式影响肝脏的解剖学、生理学、代谢和/或遗传活性及影响新的肝细胞产生和/或肝脏再生的所有类别的疾病。
具体地讲，包括以下原因引起的肝病：酒精(例如ASH)、非酒精性脂肪肝变化(例如NAFLD，包括NASH)、营养介导的肝损伤(例如饥饿)、其它毒性肝损伤(例如通过药物诱发的非特异性肝炎，所述药物例如但不限于对乙酰氨基酚(扑热息痛)、氯化烃(例如CCl4)、胺碘酮(乙碘酮)、丙戊酸盐、四环素(仅静脉内)、isoniacid(Drug-inducedliver disease，2004，Lazerow SK，Abdi MS，Lewis JH.Curr OpinGastroenterol.，2005，21(3)：283-292)或者食物中毒引起的急性或慢性肝衰竭，例如由于食用含有黄曲霉毒素(优选B1黄曲霉毒素)的蘑菇或者摄入某些金属(例如铜或镉)或天然药物中的草药产品(hompeoatics，例如水飞蓟(Milk thistle)、Chaparral、Kawa-Kawa)、干扰胆红素代谢、肝炎样综合征、胆汁郁积、肉芽肿性病变、肝内血管病变和肝硬化)、外伤和手术(例如Pringle手法)、放射介导的肝损伤(例如放疗所引起的)。
还可将肝病理解为包括感染性肝病[例如乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)感染所引起的]和自身免疫介导的肝病(例如自身免疫性肝炎)。还包括由于脓毒病引起的肝损伤。
还可将肝病理解为包括遗传性肝病(例如血色素沉着病和α1抗胰蛋白酶缺乏症)和其它遗传性代谢性肝病[例如代谢性脂肪性肝炎(MSH)]。
可治疗的肝病的优选实例包括酒精性肝病(ALD)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、急性肝炎、慢性肝炎、血色素沉着病和α1抗胰蛋白酶缺乏症。
在本发明的含义中，本发明所用术语“肝病”还包括肿瘤(原发性肝肿瘤)以及肿瘤样肝病变(例如局灶性结节性增生，FNH)。
还可将肝病理解为包括肝肿瘤性疾病，例如肝脏良性肿瘤(例如肝细胞腺瘤)以及肝癌，例如肝细胞癌(HCC)。HCC还包含上述疾病各亚类，包括特征为细胞内蛋白质性包含体的肝癌、特征为肝细胞脂肪变性的HCC，以及纤维层状HCC。例如，还包括癌前病变，例如特征为肝细胞体积增大的病变(“大细胞”变化)和特征为肝细胞体积缩小的病变(“小细胞”变化)以及巨型再生性(增生性)结节(AnthonyP.，MacSween等编辑，2001，Pathology of the Liver，ChurchillLivingstone，Edinburgh，UK)。
本发明所用术语“上皮癌”包括除肝脏以外的器官的癌以及胃肠系统(例如胃、肾和结肠)的癌，所述器官选自肺、肾、胰腺、前列腺、皮肤和乳房。本发明的术语“上皮癌”是指上述器官的疾病，其中这些器官的组织中上皮细胞组分被转化而导致形成恶性肿瘤，恶性肿瘤是根据本领域技术人员熟知的标准诊断方法来确诊的。
一个优选的实施方案代表所述靶向线粒体的抗氧化剂化合物在治疗和预防肝病中的用途，所述抗氧化剂化合物包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子，其中所述肝病是选自以下的疾病：酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、营养介导的肝损伤、中毒性肝损伤、感染性肝病、脓毒病性肝损伤、自身免疫介导的肝病、血色素沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、放射介导的肝损伤、肝癌、肝脏良性肿瘤和局灶性结节性增生。
另一个优选的实施方案代表所述靶向线粒体的抗氧化剂化合物在治疗和预防肝病中的用途，所述抗氧化剂化合物包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子，其中所述肝病是选自以下的疾病：酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、营养介导的肝损伤、中毒性肝损伤、感染性肝病、脓毒病性肝损伤、自身免疫介导的肝病、血色素沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、放射介导的肝损伤。
本发明涉及一种靶向线粒体的抗氧化剂化合物在制备用于治疗或预防肝病和上皮癌的药物中的用途，所述抗氧化剂化合物包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子。
一个优选的实施方案代表本发明靶向线粒体的抗氧化剂化合物在制备用于治疗或预防肝病的药物中的用途，其中所述肝病是选自以下的疾病：酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、营养介导的肝损伤、中毒性肝损伤、感染性肝病、脓毒病性肝损伤、自身免疫介导的肝病、血色素沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、放射介导的肝损伤、肝癌、肝脏良性肿瘤和局灶性结节性增生。
另一个优选的实施方案是本发明靶向线粒体的抗氧化剂在制备用于治疗或预防肝病的药物中的用途，其中所述肝病是选自以下的疾病：酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、营养介导的肝损伤、中毒性肝损伤、感染性肝病、脓毒病性肝损伤、自身免疫介导的肝病、血色素沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、放射介导的肝损伤。
另一个优选的实施方案是本发明靶向线粒体的抗氧化剂化合物的用途，其中所述肝病是酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病。
再一个优选的实施方案代表本发明靶向线粒体的抗氧化剂化合物的用途，其中所述肝病是酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎。
又一个优选的实施方案是本发明靶向线粒体的抗氧化剂化合物的用途，其中所述肝病是酒精性脂肪性肝炎。
再又一个优选的实施方案是本发明靶向线粒体的抗氧化剂化合物的用途，其中所述肝病是非酒精性脂肪性肝炎。
本发明所用术语“本发明疾病”包括以上定义的肝病和上皮癌。
一个优选的实施方案代表所述靶向线粒体的抗氧化剂化合物用于预防或治疗本发明疾病的用途，其中所述亲脂性阳离子是三苯基阳离子。
可与本发明抗氧化剂以共价键偶合的其它亲脂性阳离子包括三苄基或三苯基铵阳离子或者所述三苄基或取代的三苯基阳离子。
在另一个优选的实施方案中，本发明的所述靶向线粒体的化合物具有如以下通式所示的式P(Ph)3 +XR·Z-，其中X为连接基，Z-为阴离子，R为抗氧化部分，亲脂性阳离子为三苯基阳离子，
Figure A20058002319300151
作为连接基的X可以是碳链、一个或多个碳环或其组合以及其中一个或多个碳原子被氧原子(形成醚或酯)和/或氮原子(形成胺或酰胺)置换的链或环。
虽然通常优选所述碳链是亚烷基，但是包括一个或多个双键或三键的碳链也包括在本发明的范围之内。带有一个或多个取代基(例如氧代、羟基、羧酸基或甲酰胺基)和/或一个或多个选自未取代或取代的烷基、烯基或炔基的侧链或支链的碳链也包括在内。
X优选为C1-C30碳链，更优选为C1-C20碳链，最优选为C1-C15碳链。
X优选为(CH2)n，其中n为1-20的整数，更优选为约1至约15的整数。
在某些特别优选的实施方案中，连接基X为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚癸基。
在一个特别优选的实施方案中，抗氧化部分R为醌。在另一个特别优选的实施方案中，抗氧化部分R为醌醇。醌和相应的醌醇是等同的，原因是它们分别通过还原和氧化可彼此转化。
在其它实施方案中，抗氧化部分R选自维生素E和维生素E衍生物；断链抗氧化剂，包括丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯；普通自由基清除剂，包括衍生化富勒烯(derivatised fullerene)、自旋阱，包括5，5-二甲基吡咯啉N-氧化物衍生物、叔丁基亚硝基苯衍生物和α-苯基-叔丁基硝酮衍生物；和相关化合物。
在另一个优选的实施方案中，抗氧化部分R为维生素E和维生素E衍生物。
在再一个优选的实施方案中，抗氧化部分R为丁基化羟基苯甲醚或丁基化羟基甲苯。
在又一个优选的实施方案中，抗氧化部分R代表衍生化富勒烯。
在某些特别优选的实施方案中，抗氧化部分R为5，5-二甲基吡咯啉N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、α-苯基-叔丁基硝酮和它们的衍生物。
Z-优选为药学上可接受的阴离子。这些药学上可接受的阴离子由有机酸或无机酸形成。合适的无机酸是，例如氢卤酸，例如盐酸、氢溴酸、硫酸或磷酸。合适的有机酸是，例如羧酸、膦酸、磺酸或氨基磺酸，例如乙酸、丙酸、辛酸、癸酸、十二烷酸、羟基乙酸、乳酸、富马酸、琥珀酸、己二酸、庚二酸、辛二酸、壬二酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、氨基酸例如谷氨酸或天冬氨酸、马来酸、羟基马来酸、甲基马来酸、环己基羧酸、金刚烷基羧酸、苯甲酸、水杨酸、4-氨基水杨酸、邻苯二甲酸、苯乙酸、扁桃酸、肉桂酸、烷基磺酸例如甲磺酸或乙磺酸、2-羟基乙磺酸、乙-1，2-二磺酸、芳基磺酸例如苯磺酸、2-萘基磺酸、1，5-萘-二磺酸、2-甲基苯磺酸、3-甲基苯磺酸、4-甲基苯磺酸、甲基硫酸、乙基硫酸、十二烷基硫酸、N-环己基氨基磺酸、N-甲基-氨基磺酸、N-乙基-氨基磺酸或N-丙基-氨基磺酸或者其它有机质子酸，例如抗坏血酸。
在一个优选实施方案中，Z-为卤离子。在另一个优选实施方案中，Z-为溴离子。
在另一个优选实施方案中，Z-为烷基或芳基磺酸的阴离子。在一个特别优选的实施方案中，Z-为甲磺酸根。
在另一个特别优选的实施方案中，在治疗和预防肝病和/或上皮癌中使用的靶向线粒体的抗氧化剂具有下列结构式：
Figure A20058002319300171
包括其所有的立体异构体，其中Z-为药学上可接受的阴离子，优选为Br-。该化合物在本文中称为“Mito Vit E”。
在另一个优选的实施方案中，在治疗和预防本发明疾病中使用的靶向线粒体的抗氧化剂具有下列通式：
Figure A20058002319300172
其中Z-为药学上可接受的阴离子，优选为卤离子，m为0-3的整数，各个Y独立选自具有给电子性质和接受电子性质的基团、链以及脂族环和芳族环，(C)n代表碳链，其任选带有一个或多个双键或三键并且任选包括一个或多个取代基和/或未取代和取代的烷基、烯基或炔基侧链，n为1-20的整数。
优选，各个Y独立选自烷氧基、烷硫基、烷基、卤代烷基、卤素、氨基、硝基、任选取代的芳基，或者当m为2或3时，两个Y与它们所连接的碳原子一起形成与芳环稠合的脂族碳环或杂环或芳族碳环或杂环。更优选，各个Y独立选自甲氧基和甲基。
(C)n优选为式(CH2)n的烷基链。
在一个特别优选的实施方案中，本发明的靶向线粒体的抗氧化剂具有下列结构式：
Figure A20058002319300181
其中Z-为药学上可接受的阴离子，优选为Br-，该化合物在本文中称为“MitoQuinol”，或该化合物的氧化形式(其中该结构式中的氢醌是醌)，在本文中将其称为“MitoQuinone”。不同量的MitoQuinol和MitoQuinone的混合物被称为“MitoQ”。
甚至更优选本发明的靶向线粒体的抗氧化剂具有下列结构式：
其中药学上可接受的阴离子Z-为甲磺酸根。在该实施方案中，不同量的MitoQuinol和MitoQuinone的混合物被称为“MitoS”。
本发明另一个优选的实施方案代表靶向线粒体的下式的自旋阱苯基-叔丁基硝酮衍生物：
在本文中将其称为“MitoPBN”。
在本发明的另一个实施方案中，靶向线粒体的抗氧化剂是谷胱甘肽过氧化物酶模拟物，例如含硒有机化合物，即含有至少一个硒原子的有机化合物。优选的含硒有机谷胱甘肽过氧化物酶模拟物包括苯并异硒唑啉酮类、二芳基二硒类和二芳基硒类。
具体地讲，所述谷胱甘肽过氧化物酶模拟物部分是：
在本文中将其称为“Ebelsen”(2-苯基-苯并[d]异硒唑-3-酮)。
优选的本发明化合物具有下列结构式：
Figure A20058002319300192
其中Z-为药学上可接受的阴离子，优选为Br-，L为单糖。
本发明一个特别优选的实施方案具有下列结构式：
Figure A20058002319300193
其中Z-和(C)n如上定义，W为O、S或NH，优选为O或S，n为1-20， 更优选为3-6。
另一方面，本发明提供一种适合治疗和/或预防患有肝病和/或上皮癌的患者的药物组合物，它包括有效量本发明的靶向线粒体的抗氧化剂以及一种或多种药学上可接受的载体或稀释剂，例如生理盐水溶液、脱矿质水、稳定剂(例如β-环糊精，优选比率为1∶2)和/或蛋白酶抑制剂。
本文所用术语“药学上可接受的”是指在合理的医疗判断范围内适用于接触所述患者组织(优选人体组织)而没有过度的毒性、刺激性、变态反应或其它问题或并发症、而且具有合理利益/风险比的化合物、组分、物质、组合物、剂量、形式等。各载体、稀释剂、赋形剂等还必须在与制剂中的其它组分相容的意义上是“可接受的”。
另一方面，本发明提供一种治疗或预防将受益于氧化应激降低的患有肝病和/或上皮癌的患者的方法，该方法包括给予所述患者如上定义的靶向线粒体的抗氧化剂的步骤。
本发明所用术语“治疗”是指短暂、短期(按小时至天的顺序)、长期(按周、月或年的顺序)或永久性地更适宜治愈患有至少一种本发明疾病的患者的治疗和/或改善患者与该疾病有关的一种或多种症状相关的病理病症的治疗，其中病理病症的改善在量值上可以是不变的、增加的、降低的、持续变化或波动的，只要与对照患者相比较能有明显的改善症状的总体效果即可。
此外，本文所用术语“治疗”在治疗肝病和/或上皮癌时，通常是指对人或动物(例如在兽医应用上)的治疗或预防，其中达到某些所要求的治疗效果，例如抑制病症的进展，包括病症的进展速率降低、病症的进展速率不变、病症缓解和病症治愈。
本发明的术语“治疗”包括联合治疗和疗法，其中将两种以上的治疗或疗法联合使用，例如序贯或同时使用。还包括预防性方法的治疗(即预防措施)。
本发明的治疗可按本领域技术人员通常已知的常规方式进行，例如通过口服给药或通过静脉注射本发明的药物组合物。
治疗功效和毒性，例如ED50和LD50，可以通过标准药理学方法，从细胞培养物或实验动物中测得。治疗效应和毒性效应之间的剂量比值为治疗指数，可以用LD50/ED50比值表示。优选呈现大治疗指数的药物组合物。该剂量必须根据所治疗的个别患者的年龄、体重和病症、以及给药途径、剂型和方案、所需治疗结果而确定，准确剂量自然应当由主治医生决定。
实际剂量根据所治疗疾病的性质和严重程度而确定，并在主治医生的判断力之内，并可以根据本发明的具体情况逐渐加大剂量以产生所要求的治疗效果。但是，本发明建议：个体化剂量包含约0.1-500mg/kg的活性成分，更优选约0.1-100mg/kg的活性成分，最优选约0.1-10mg/kg的活性成分的药物组合物适用于临床治疗。
本发明活性化合物的合适剂量范围通常为每天每千克患者体重约0.1mg至约250mg。
可将活性成分以每天一个或多个剂量给药。在某些情况下，按低至0.1mg/kg静脉内(i.v.)剂量和1mg/kg口服(p.o.)剂量给药可达到满意的效果。优选的范围为0.1mg/kg/天至约10mg/kg/天(i.v.)以及1mg/kg/天至约100mg/kg/天(p.o.)。
另外，本发明涉及采用将所述活性化合物与适当的药用载体混合或溶解的现有技术已知的标准方法，制备用于治疗和/或预防肝病和/或上皮癌的含有本发明抗氧化剂化合物的药物。这些方法包括将所述活性化合物与包含一种或多种助剂的载体混合的步骤。一般而言，通过将活性化合物与载体(例如液体载体、微细固体载体)充分均匀混合，必要时，将产品成型，从而制备本发明的制剂。本发明中使用的合适载体、稀释剂和赋形剂可参见标准药学教科书(参见例如《药物添加剂手册(Handbook for Pharmaceutical Additives)》，2001，第2版，M.Ash和I.Ash编著)。
本发明的抗氧化剂化合物，例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物，可根据诸如US6,331,532、WO99/26954、WO2004/014927或WO2003/016323中描述的制备那些化合物的任何已知的方法合成。
对本领域技术人员来说显而易见的是：可对本发明的组合物、方法和过程做各种修改。因此，只是这些修改和改变落入所附的权利要求书及其等同实施方案范围之内，本发明就包括这些修改和改变。本文引用的所有出版物均全文结合到本发明中作为参考。
为实际评价本发明靶向线粒体的抗氧化剂(例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物)对治疗和/或预防肝病的作用，在用和不用这些抗氧化剂治疗的情况下，在各种遗传和获得性肝病中，评价形态学改变如门静脉周围炎性细胞的存在与否(Glisson试验)以及对肝细胞损伤的程度(坏死、细胞骨架坍缩(实施例3，图1))，所述肝细胞损伤包括但不限于肝细胞肿胀、形成更致密角蛋白中间丝(TF)网络、角蛋白IF密度降低，代表最常见的一种IF相关细胞骨架改变的马洛里小体(MB)的存在(实施例2和3)。
所述形态学改变(包括MB)可通过用抑制真菌的抗微管药灰黄霉素(GF)或卟啉生成剂3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢三甲基吡啶(DDC)使小鼠慢性中毒而在小鼠中再现(Denk H.等，1975，Lab.Invest：773-776；Tsunoo C.等，1987，J.Hepatol.，5：85-97)。可通过喂给含有DDC-或GF的饮食，在小鼠肝脏内诱发MB形成(参见实施例1)。现推测所述甲基诱发的氧化性损伤是喂给DCC或GF的动物并患有ASH或NASH和人肝脏中常见的病理基础，其中自由基由细胞色素P450介导的乙醇的氧化所产生，而乙醛和游离脂肪酸过载引起的线粒体损伤是关键特征(Lieber C.S.，2000，J.Hepatol.，32：113-128；Anguilo P.，2002，N Engl.J.Med.，346：1221-1231)。
此外，现已接受：在DDC-或GF喂食的小鼠中，IF角蛋白细胞骨架改变以及MB的结构和化学组成与在人ASH和NASH中发现的所述改变极为类似(如果不同的话)(Denk H.等，2000，J.Hepatol.，32：689-702)。在这个内容中，值得注意的是，基于喂给含酒精饮食的酒精性肝病的其它小鼠模型再现脂肪代谢紊乱，并在一定程度上再现人ASH炎症，但不是角蛋白IF细胞骨架的改变，也不会导致MB形成。
在一种类型的实验(实施例2)中，采用常规免疫组织化学(例如苏木精&伊红染色)或免疫荧光显微镜标准方法，例如用抗p62蛋白的抗体SMI31的方法(Zatloukal K.等，2002，Am J Pathol.160(1)：255-63)，在6-10周中毒的实验小鼠中，测定一般出现在细胞核周围细胞质区内的大量MB。P62最初被确定为p56ck的SH2结构域的不依赖磷酸酪氨酸的配体以及细胞质非蛋白酶体泛蛋白-结合蛋白(Vadlamudi R.K.等，1996，J.Biol.Chem.，271：20235-20237)。由于p62表达因各种应激刺激、尤其是氧化应激而增加，所以意味着p62在细胞应激反应中的总作用(Ishii T.等，1996，Biochem.Biophys.Res.Comm.，226：456-460)。
中毒恢复后4周时，肝细胞已无细胞质角蛋白丝，但在与桥粒有关的细胞周缘还含有少量残留的MB。如果再将小鼠暴露于GF或DDC，在24-72小时内重新出现大量MB(Stumptner C.等，2001，J.Hepatol.，34：665-675)。再中毒后MB形成增加的解释与过敏反应类似，为一种中毒记忆效应。
为评价本发明抗氧化剂对早期DDC-或GF中毒小鼠肝形态学改变消退的影响，将阳性对照组动物(仅暴露于GF或DDC 3-7天)与分别用例如MitoQ(MitoQuinol溴化[10-(3，6-二羟基-4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)癸基]三苯基和MitoQuinone溴化[10-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基的混合物)或者Mito Vit E溴化[2-(3，4-二氢-6-羟基-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)乙基]-三苯基)再治疗3-7天的DDC-或GF中毒小鼠进行比较。给试验小鼠腹膜内(i.p.)或静脉内(i.v.)(尾静脉)注射包含本发明抗氧化剂化合物(例如Mito Q或MitoVit E)注射剂，然后将这些小鼠与注射溶媒的对照小鼠(增添足量DMSO以保持抗氧化剂溶解度的PBS)和其它合适的对照小鼠进行比较(实施例3)。
此外，在饮食中增添MitoQ或MitoQ衍生物，例如MitoS(MitoQuinol甲磺酸[10-(3，6-二羟基-4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)癸基]三苯基和MitoQuinone甲磺酸[10-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基的混合物)或者Mito Vit E。通过测量水和液体饮食消耗以及小鼠体重确定剂量(Smith R.A.J.等，2003，PNAS，100(9)：5407-5412)。
在另一类型试验中，将DDC-或GF中毒组动物同时用本发明的抗氧化剂(例如MitoQ或MitoS)治疗3-7天，然后与仅暴露于DDC或GF3-7天的对照组进行比较(实施例3)。
在另一组试验中，同时将3-12mg/kg的MitoQ腹膜内给予DDC中毒的小鼠3天，并与对照组动物比较。为实际评价在这些短期实验中，本发明靶向线粒体的抗氧化剂(例如MitoQ或MitoS)的作用，将门静脉周围炎性细胞的存在与否(Glisson试验)以及肝细胞损伤的程度(替代细胞肿胀和/或马洛里小体分析法(分别为长期暴露于DDC或GF的典型症状))，例如坏死、细胞骨架坍缩(参见图2和图3)，与适当的对照组比较(图1-3)。细胞肿胀和马洛里小体都不适于这些试验，原因是在所述短期暴露于DDC的时间内，它们不能形成统计学评价的程度。
总的来讲，在MitoQ治疗下，再次可看到由经窦状隙接壤的肝细胞股代表的正常结构。肝细胞的形态学在有关体积、细胞核的形态和细胞质的结构上均为正常。另外，炎性细胞(例如嗜中性粒细胞、淋巴细胞、吞噬细胞、巨噬细胞)的数目在用本发明的抗氧化剂治疗后明显减少(图1-3)。
在DDC中毒8-10周小鼠的长期试验中，测定治疗动物肝样本中细胞肿胀和马洛里小体(MB)的存在与否，并与对照组动物比较(实施例3，图4-6)。
为测定分别在DDC或GF中毒10周情形下，这些抗氧化剂在治疗或预防慢性肝代谢疾病和上皮癌的作用，连续7天口服或静脉内(尾静脉)给予试验小鼠包含本发明抗氧化剂化合物(例如MitoQ、MitoS或MitoVit E)的注射剂，然后与注射溶媒的对照小鼠和其它合适的对照小鼠进行比较(实施例3)。
另外，在DDC中毒10周后，连续7天内给予试验动物腹膜内注射MitoQ(1.25mg/kg)2次(对应周的第1天和第4天)，然后根据常规组织学方法分析(标准苏木精/伊红染色法，根据Luna L.G.，1968，Manual of Histologic staining methods of the Armed Forces Institute ofPathology，第三版，McGraw Hill，New York)。当与适当的对照组对比时，在MitoQ治疗的DDC中毒动物中，细胞肿胀程度和马洛里小体数量明显减少(实施例3，见图4-6)。
在其它组实验中，连续7-14天内，小鼠在DDC或GF中毒8-10周，在饮用水中喂给MitoQ、MitoS或MitoVit E(实施例3)。
在某些其它实验中，将本发明的抗氧化剂施用于DDC-或GF中毒6周，接着通过分别使用10-50％最大耐受剂量的MitoQ、MitoS或MitoVitE同时用MitoQ、MitoS或MitoVit E治疗连续4周的小鼠中，然后与仅DDC或GF中毒10周的对照组动物进行比较(参见实施例3)。
在其它组实验中，将DDC或GF中毒10周的小鼠进行4周的恢复。在该实验中，进一步表明通过同时用本发明抗氧化剂治疗，能降低或消除毒性记忆效应(作为再暴露于DDC或GF中毒24-72小时的结果)。
为评价所述抗氧化剂对本发明肝炎的预防作用，将一组DDC-或GF喂食的小鼠同时分别例如用10-50％的MitoQ、MitoS或MitoVit E的最大耐受量治疗，然后与仅暴露于DDC或GF10周的对照组动物进行比较(实施例3)。
另外，在最初恢复期内给予例如MitoQ、MitoS或MitoVit E4周，接着用DDC或GF中毒连续24-74小时，其中将用抗氧化剂治疗的小鼠与DDC-或GF暴露的2.5个月后未用所述抗氧化剂治疗的对照动物进行比较。
所述抗氧化剂(例如辅酶Q的衍生物、维生素E或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物)的应用使得DDC-或GF中毒动物肝脏内形态异常明显降低，所述形态异常如肝细胞肿胀、错折叠蛋白的细胞内包含体以及MB。这些结果(实施例3，图1-6)表明，这种细胞损伤通过本发明靶向线粒体的抗氧化剂化合物减轻。DDC-或GF中毒小鼠模型模拟在患有如NASH或ASH的患者中所做出的观测结果，并为研究抗氧化剂(例如辅酶Q10的衍生物和维生素E)在治疗或预防本发明疾病中的作用提供了强有力的体内和体外系统。
用这些靶向线粒体的抗氧化剂治疗或预防患有本发明肝病的患者能明显减轻肝病，因此本发明提供治疗这些疾病的有效治疗和/或预防方法。
为评价对照组与用或不用本发明抗氧化剂治疗的DDC中毒小鼠组中的氧化应激，对分离的肝线粒体(根据实施例3的方案制备所有试验动物组)内生育酚醌(TQ)含量进行测定(Gille L.等，2004，Biochemic.Pharmacology，68：373-381)。根据Staniek K.和Nohl H.，1999，Biochem.et Biophys.Acta，1413：70-80；Mela L.和Sietz S.，1979，Methods in Enzymology，Academic Press Inc.：39-46中所述的修改方案制备小鼠的肝线粒体，然后将TQ含量标准化为几种参数，包括蛋白质和细胞色素浓度和复合物I(NADH脱氢酶)、复合物II(琥珀酸脱氢酶)、复合物III(细胞色素bc1)和复合物IV(细胞色素氧化酶)的活性测试。总体来说，这些实验表明，当将对照与用MitoQ治疗的小鼠进行比较时，DDC中毒小鼠中TQ水平升高(实施例4)。
在另一评价氧化应激诱导的蛋白质的实验中，通过利用源自短期(3天，实施例5)暴露于DDC使之中毒并同时用MitoQ治疗的小鼠，使用血加氧酶(HO-1)表达水平的蛋白质印迹分析。HO-1(已知由活性氧中间体(ROS)诱发，Suematsu M.和Ishimura Y.，2000.Hepatology，31(1)：3-6)的DDC诱导的过量表达明显降低表明：本发明抗氧化剂能显著降低肝脏内的氧化应激(实施例5，图7)。
此外，代表肝细胞损伤的一种敏感标志的脂肪酸结合蛋白(FABP)的蛋白表达水平(Monbaliu D.等，2005，Transplant Proc，37(1)：413-416)显示：当与对照组比较时，在DDC中毒小鼠中FABP蛋白明显减少。在MitoQ治疗下的这组动物中，FABP蛋白表达几乎达到对照小鼠FABP的表达值，由此再次认定MitoQ在治疗或预防本发明疾病中的作用(实施例5)。
在另一组研究本发明的抗氧化剂对DDC-或GF中毒和对照小鼠的作用的实验中，按照例如提供一种作为本发明几种疾病特征的肝损伤(尤其是纤维化)的测定法的Actitest(Biopredictive，Houilles，法国)方法，监测肝特异性酶的血清水平(参见实施例6)。使用Poynard等在2003，Hepatology 38：481-492中所述的方法，按照实施例3的通用时间安排策略，从DDC-或GF中毒的动物、对照组动物和对应的也用所述靶向线粒体的抗氧化剂治疗的相应DDC-或GF的动物中，测定例如a2-巨球蛋白、肝球蛋白、γ-谷氨酰转肽酶、总胆红素、载脂蛋白A1和丙氨酸转氨酶的血清水平。
可类似地使用也用人血清进行的Actitest作为肝损伤(尤其是纤维化)的测定法，以此监测本发明抗氧化剂治疗患有这些疾病患者的效果。
另外，根据临床诊断的标准方案，利用市售的试剂盒，测定各实验动物组血清中表明肝损伤的下列参数：胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT/GPT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT/GOT)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)(实施例6)。用本发明化合物治疗的动物中血清肝酶的降低(例如丙氨酸-和天冬氨酸转氨酶，见图8)表明，在这些治疗的样本中肝损伤降低，为这些化合物在本发明疾病中的治疗功效提供了支持。
为评价活性氧中间体(ROS)的产生，可根据标准方法(例如Brandes R.P.等，2002，Free Radic Biol Med；32(11)：1116-1122)，例如应用二氢乙锭(DHE)染色的由对照动物和DDC-或GF中毒的动物制备的肝切片(例如冷冻切片)进行。该方法能够证实在源自DDC-或GF中毒的动物肝脏中体内诱导ROS的产生，这样模拟在患有本发明疾病的患者中所做出的观察结果(实施例7)。其它可能评价DDC或GF中毒小鼠中ROS形成的方法包括，例如光泽精化学发光测试(GoerlachA.等，2000，Circ.Res.，87(1)：26-32)。
本实验还适用于用本发明靶向抗氧化剂治疗的DDC-或GF-喂食的动物(实施例6)。受试动物的DDC-或GF中毒以及用所述抗氧化剂治疗的时间安排和剂量安排的通用策略与测定形态学异常所使用的实验方法类似，所述形态异常如错折叠蛋白的细胞内包含体以及实施例3的DDC-或GF中毒动物肝脏内的MB。
通过使用实施例7的通用方法，应用所述抗氧化剂(例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物)使得ROS形成明显降低，因此在本发明肝病中具有治疗益处(实施例8)。
任选在应用肝细胞瘤细胞系(例如HepG2或Hep3B)、源自肝细胞癌的SNU-398细胞系(ATCC No.CRL-2233，LGC Promochem，德国)、HUH-7人癌细胞(Japanese collection of Research Biosources JCRB0403)或Tib-73小鼠胚胎细胞系(American type collection，ATCC TIB73＝BNL CL2，源自BAL/c小鼠，MD，US)的体外实验中，测定DDC中毒肝细胞中ROS的产生(实施例9)。可用谷胱甘肽合成抑制剂L-丁硫氨酸-(S，R)-亚砜胺(L-buthionine-(S，R)-sulfoximine，BSO)作为评价内源性氧化应激的另一方法(Kito M.等，2002，Biochem Biophys ResCommun.，291(4)：861-867)。
由于近来已表明CoCl2能影响线粒体(Jung JY和Kim WJ.；2004，Neurosci Lett.，371：85-90)，为测定在分化细胞系中的ROS产生，HepG2(ATCC No.HB-8065，MD，US)的刺激另外可通过100μM CoCl2(Sigma)进行(Bel Aiba RS等，2004，Biol.Chem.385：249-57)。
另一种在培养细胞中(以及在分离的细胞器中或在完整组织中)建立的方法是根据Chem.Biol.Interact.2000年7月14日；127(3)：201-217测定由抗霉素A诱导的ROS产生(图10)或者通过使用光泽精化学发光试验由鱼藤酮诱导的ROS产生(Goerlach A.等，2000，Circ.Res.，87(1)：26-32)。
DDC(浓度＝50μg/ml培养基)、BSO(高达100μM)或抗霉素A(或鱼藤酮)或CoCl2(100μM)中毒最多3天的肝细胞培养物证实，在体外诱导了ROS产生，因此提供了另一种模拟在患有本发明疾病的患者中所作的观测结果的合适模型。
通过应用实施例9的标准方案，将DDC、BSO、抗霉素A(或鱼藤酮)或COCl2(100μM)中毒并同时分别用MitoQ或MitoVit E(根据Jauslin M.L.等，2003，FASEB J.，(13)：1972-4，浓度对应于MitoQ为EC50＝0.51nM，MitoVit E为EC50＝416nM)处理或者在后者情况下以浓度范围为0.5-10μM处理的分化细胞系(例如肝细胞)，得出ROS形成明显降低，因此进一步确证靶向线粒体的抗氧化剂的治疗益处(参见图9，实施例10)。
在慢性胆汁郁积(例如原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎)中也发现MB。为测定本发明靶向线粒体的抗氧化剂在治疗和/或预防慢性胆汁郁积症中的作用，对DDC-或GF中毒小鼠(实施例3)进行如上所述的治疗范例。将痊愈的准备给药的小鼠进行胆总管结扎(CBDL)或者喂给增添胆酸(CA)的饮食长达7天(Fickert P.等，2002，Am.J.of Pathology，161(6)：2019-2026)，同时分别用或不用MitoQ和MitoVit E治疗，然后与适当的对照组比较。
测定靶向线粒体的抗氧化剂在治疗和/或预防肝纤维化和肝硬化中的作用的通用策略是使用本发明抗氧化剂治疗的四氯化碳(CCl4)诱发的肝损伤的小鼠或大鼠模型(参见Arias I.M.等，1982，The LiverBiology and Pathobiology，Raven Press，New York)。
为测定本发明靶向线粒体的抗氧化剂在治疗和/或预防上皮癌中的作用，可通过例如以上对DDC-或GF中毒小鼠所述治疗范例，但使用带有人上皮细胞癌异种移植物的无免疫应答的小鼠(裸鼠肿瘤异种移植物，例如CD1 nu/nu小鼠来源于Charles Rivers Laboratories，USA)。根据现有技术已知的标准方法(Li K.等，2003，Cancer Res.，63(13)：3593-3597)皮下异种移植的肿瘤包括但不限于：结肠腺癌、乳腺的侵袭性导管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和胃癌。
对这些小鼠的治疗表明肿瘤生长降低、肿瘤坏死增加以及肿瘤异种移植物的血管化降低。类似地，如上所述监测裸鼠肿瘤异种移植物中的ROS水平，在用本发明抗氧化剂治疗的异种移植物肿瘤中，ROS水平降低(实施例11)。
当与治疗或预防肝病和肝癌和其它上皮癌的领域的情况对比时，本发明的治疗方法令人惊奇地提供一种改进的、持续的和更为有效的治疗法。
借助于下面的附图说明和实施例可进一步说明本发明，而附图说明和实施例代表本发明的优选实施方案和特征，但本发明并不局限于此。
附图简述
图1-3：MitoQ对短期(3天)暴露于DDC的小鼠肝内肝细胞损伤程度的影响。
图1：正常肝的特征为肝细胞大多数股状排列，所述各股朝向中央静脉(注释为三角形)，而窦状隙(C，原色为白色，带有一些代表红血球的红点)位于这些肝细胞的各股之间。肝细胞核(A，在H&E染料中为蓝色)巨大，不凝聚，大多呈现出一种显著的核仁，细胞质(注释为B，在H&E染色中被染色为相对均匀的粉色)。在门静脉(注释为星号)周围未检测到浸润淋巴细胞或粒细胞(放大倍数：200x)。
图2：DDC中毒3天后，肝结构严重受损：肝细胞的有序排列丧失。尤其是门静脉(注释为星号)周围有淋巴细胞浸润，并可见粒细胞(注释为箭头)。肝细胞呈现不同细胞损伤特征：细胞彼此结合疏松，细胞核凝聚以及细胞质变成表示细胞凋亡的蓝粉色。细胞体积增大(肿胀)，细胞质变得不均匀，可观察到成簇细胞角蛋白。另外，细胞与其胞质膜疏松，其是坏死的另一特征。符号A、B、C同图1。在门静脉(注释为星号)周围，检测到炎性细胞(注释为箭头)和损伤的肝细胞(无清晰的可分辨的细胞边界，细胞肿胀)。原卟啉的沉积(小棕色点)代表DDC-特异性作用于血红素铁裂解酶。符号A、B、C同图1(放大倍数：400x)。
图3：用MitoQ(MitoQ的PBS/1％DMSO(225nmol/动物/天，相当于6mg/kg)同时治疗后，可再次见到带有窦状隙边界的肝细胞股的正常结构。肝细胞的形态在体积、细胞核形态以及细胞质结构上均为正常(实施例3)。门静脉(注释为星号)周围无炎性细胞；除有轻微细胞肿胀和原卟啉沉积外，肝细胞看来正常。符号A、B、C同图1和图2(放大倍数：400x)。
图4-6：MitoQ对长期(10周)暴露于DDC的小鼠肝内肝细胞损伤程度的影响。
图4：在正常非DDC中毒小鼠(4月龄)中，肝结构通常与图1A中所示的年轻非DDC中毒小鼠的肝结构类似(参见A＝细胞核，B＝细胞质，C＝窦状隙)。门静脉(星号)周围无炎症；肝细胞以股状排列。细胞的细胞质有规律地被染色，并具平均体积；未发现细胞肿胀或马洛里小体形成(放大倍数：400x)。
图5：结构同图1-4中所示(参见A＝细胞核(原蓝色)，B＝细胞质(原粉色)，C＝窦状隙(原白色带红点))，D原棕色代表胆管中的色素(主要为原卟啉)。DDC中毒10周后，在连续1周不给予DDC的恢复期，肝细胞的排列仍受干扰。肝细胞呈现不同程度的细胞损损伤，范围从细胞骨架解体到细胞肿胀和马洛里小体(箭)形成。尤其是在胆管中发现原卟啉累积(箭头)，放大倍数：400x。
图6：DDC中毒10周后，在恢复期(无DDC 1周)内，用MitoQ注射2次进行治疗。恢复期间改善明显；肝细胞形态学仅有稍稍改变。肝细胞大多数看起来正常，没有细胞肿胀和/或马洛里小体形成。门静脉(星号)附近的胆管内的原卟啉累积也明显降低。结构同图1-5中所示(参见A＝细胞核(原蓝色)，B＝细胞质(原粉色)，C＝窦状隙(原白色带红点)，D原棕色代表色素(主要为原卟啉))。放大倍数：400x。
图7：诱导型血加氧酶(hemoxygenase，HO-1)在MitoQ治疗的DDC中毒小鼠中的表达
HO-1(32kDa，箭头所指)的蛋白质印迹分析表明，在DDC中毒情形下明显被诱导(第4、5、6道表示有DDC的溶剂对照)，而用MitoQ治疗(第7、8道＝112nmol/kg MitoQ但无DDC，第9、10道＝112nmol/kg MitoQ+DDC)，使得HO-1蛋白表达强烈降低。第1-3道表示无DDC的溶剂对照。使用低分子量蛋白标记物(22kDa、36kDa、55kDa、64kDa、98kDa和148kDa)。
为将第1-10道中的HO-1蛋白表达标准化，通过使用Chemimager5500软件(Alpha Innotech)与组成型表达的同种型HO-2(36kDa)比较，表明当与DDC中毒小鼠代表的对照组比较时，在用MitoQ治疗的DDC中毒小鼠中，HO-1降低7倍。总体来讲，在该组实验中，分析每天用MitoQ的PBS/1％DMSO溶液注射(腹膜内)的DDC中毒小鼠(3天)，并与适当的对照组比较。
图8：在MitoQ同时治疗下DDC中毒小鼠的血清参数
在Hitachi/Roche917分析仪上，利用市售的试剂盒(编号11552414、11876805216、11876848216，均购自瑞士Roche AG)，根据临床诊断的标准方案，测定各实验动物组血清中表明肝损伤的血清肝酶活性，即胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT/GPT；图中用白色条柱表示)、天冬氨酸转氨酶(ASAT/GOT；图中用黑色条柱表示)。
第1和2组分别表示非DDC中毒组动物和DDC中毒小鼠。第3-5组表示DDC中毒(3天)并同时用浓度为3mg/kg、6mg/kg和12mg/kg的MitoQ治疗的动物。酶活性的最显著降低表现为丙氨酸转氨酶(白色条柱表示ALT/GPT)和天冬氨酸转氨酶(黑色条柱表示AST/GOT)，而胆红素活性没有任何变化(数据未显示)。
图9：在同时用MitoQ处理的HepG2细胞中100μM CoCl2(0分钟、10分钟、20分钟、30分钟)诱导的ROS产生
5μM MitoQ能够降低未刺激细胞中的基础ROS产生(参见第2条柱)。5μM MitoQ降低CoCl2诱导的ROS产生(100μM CoCl2)。这些结果表明，5μM MitoQ能明显降低HepG2细胞中基础和CoCl2刺激的ROS水平(实施例10)。符号“A”(第4、5、6条柱)表示用CoCl2刺激的HepG2细胞。X轴表示MitoQ浓度范围[μM]，y轴表示相对DCF荧光[％]。*p＜0.05，相对于未刺激(0μM MitoQ)；#p＜0.05，相对于CoCl2。
图10：采用光泽精化学发光测试法用1μM抗霉素刺激HUH-1细胞
将HUH-7细胞在6孔板中孵育，然后在37℃下用浓度为0-25μM(0μM、1μM和5μM)的抗霉素A并同时与或不与溶解于DMEM(Gibco)中的浓度范围0-1000nmol的MitoQ刺激3小时。检测超氧化物和光泽精之间的光反应。X轴表示MitoQ浓度范围[nM]，Y轴表示标准化细胞计数器测定的细胞数后，表示为每分钟平均计数的化学发光信号[cpm]。大体来说，该图表明ROS形成明显降低，因此进一步确认本发明的靶向线粒体的抗氧化剂对肝病具有治疗益处。
实施例
实施例1：实验性诱发马洛里小体(MB)
可以通过用3，5-二乙氧基羰基-1，4-二氢三甲基吡啶(1，4-二氢-2，4，6-三甲基吡啶-3，5-二碳酸二乙酯，DDC，目录号13703-0，Sigma-Aldrich Steinheim，德国)或Griseofulvin(GF，目录号85，644-4，Sigma-Aldrich)经各种不同小鼠品系：例如瑞士雄性小白鼠：品系HimOF1 SPF(实验动物研究中心，维也纳大学，Himberg，奥地利)的慢性中毒，在小鼠肝脏内诱发产生MB。
含有2.5％GF或0.1％DDC的标准颗粒食物(Sniff SpezialditenGmbH，Soest，德国)由Sniff公司制造。
将动物饲养在常规笼中或者12小时昼夜循环的无菌隔离箱中。根据国家科学委员会制定并由美国国家卫生研究院出版；1985年修订的NIH出版的《实验动物的管理及使用指南》中所列举的标准，对实验动物进行人道管理。
给小鼠(8周龄)喂含有0.1％DDC或2.5％GF的标准食物2.5个月。
小鼠肝对DDC-或GF中毒第一个响应是肝细胞肿胀和较高密度角蛋白IF网络的形成。中毒大约6周后，肿胀的肝细胞显示角蛋白IF的密度降低，并可观察到早期MB为与角蛋白IF网络相关的纤细颗粒。持续的中毒致使出现一般位于核周围细胞质区的巨大MB。大多数含有巨大MB的肝细胞细胞质IF角蛋白网络明显减少或者甚至检测不到。在停止中毒后，数周内MB消失。在中毒恢复4周时，有大量无细胞质角蛋白丝的肝细胞，但在与细胞桥粒有关的细胞外周仍含有少量残留的MB。如果再将这些小鼠暴露于DDC或GF，在24-72小时内再次出现大量的MB(Stumptner C.等，2001，J.Hepatol.，34：665-675)。可将再次中毒后MB形成增加按类似于过敏反应来解释--即毒性记忆效应。
在中毒的不同时间点，通过颈部脱臼处死小鼠，取出肝脏放入液氮预冷的甲基丁烷中立即骤冷以供免疫荧光测定用，或者放在4％缓冲甲醛中固定以供常规组织学和免疫组织化学实验用。
实施例2：肝脏改变的评价；马洛里小体(MB)的检测
使用根据实施例1制备的肝样本进行利用如苏木精和伊红的简单组织学染色法(Luna L.G.，1968，Manual of Histologic stainingmethods of the Armed Forces Institute of Pathology，第3版，McGrawHill，New York)。另外，进行单标记免疫组织化学或双标记免疫荧光显微镜法检测试验动物的MB。
A)对石蜡包埋的切片进行单标记免疫组织化学检测：将切片(厚度4μm)在二甲苯中脱蜡，然后在分级乙醇(100％、90％、80％、70％、50％乙醇)和PBS(50mM磷酸钾，150mM NaCl，pH8.0-8.5)中再水合。为恢复抗原，将再水合的切片在室温下与0.1％蛋白酶XXEV型(SigmaSteinheim，德国)一起孵育10分钟(为泛蛋白Dako的第一抗体)，或者在750W的微波炉(具有能量控制的常规家用微波炉)中，在10mM柠檬酸盐缓冲液pH6.0内孵育10分钟(为多克隆K8/18抗体50K160、单克隆K8抗体K8.8[Neomarkers]、单克隆K18抗体DC-10[Neomarkers]和p62CT：对抗C-末端肽序列p62的多克隆豚鼠抗体；Zatloukal K.等，2002，Am.J.Pathol.，160：255-263)。在PBS中洗涤后，通过在1％H2O2(Merck)的甲醇液中孵育阻断内源性过氧化物酶，然后连续在PBS中洗涤。下一步中，在室温下，在湿度培养箱(Nunc)中，将切片与第一抗体一起孵育60分钟，再用PBS洗涤3次。然后在室温下，将所述切片与在PBS中以1∶100稀释的多关联猪抗-山羊、小鼠、兔免疫球蛋白(Dako)一起孵育30分钟，用PBS洗涤三次，然后与链霉抗生物素/生物素辣根过氧化物酶复合物ABC/HRP(Dako；Sol A1∶100和Sol B1∶100的PBS液)一起孵育30分钟。另一种方法，与在PBS中以1∶100稀释的缀合过氧化物酶的兔抗豚鼠免疫球蛋白第二抗体(Dako)一起孵育30分钟，用PBS洗涤三次。接着通过应用在扩增稀释液(TSATM Biotin System，NEN，Boston，MA，USA)中以1∶50稀释的生物素酪酰胺，进行酪酰胺扩增5分钟，用PBS洗涤三次，然后与链霉抗生物素-过氧化物酶溶液(1∶100的PBS液)一起孵育30分钟。
P62CT抗体的结合采用TSATM生物素测定系统测定。泛蛋白和K8/18抗体的再激活采用AB复合系统(Dako)测定，用自来水漂洗，接着用于用封固培养基Aquatex(Merck)覆盖载玻片的部分中。
为进行着色，与3-氨基-9-乙基卡唑(AEC，Dako)进行孵育5分钟，接着在PBS中洗涤3次，用Mayr′s haemalaun复染，接着用自来水漂洗，用带有Aquatex(Merck)的盖玻片封固。
B)对冷冻切片的双标记免疫荧光显微镜法检测：将冷冻切片(厚度3μm)用Cryocut(Leica CM3050，Leica，NuBloch，德国)切片，风干，在-20℃丙酮中固定10分钟。在室温下，将另外的(特别是如果需要保护核结构的)切片在PBS-缓冲的4％甲醛中固定15分钟，接着在-20℃下丙酮中固定5分钟。切片风干，然后固定或在PBS中漂洗。
接着，在室温下，在湿度培养箱(Bioassay plate，Nunc，Roshilde，丹麦)中，将最初的第一抗体p62CT(抗C端肽序列p62的多克隆豚鼠抗体(Zatloukal K.等，Am.J.Pathol.，2002，160：255-263))、K8抗体(Ks8.7，Progen，Heidelberg，德国)、K18抗体(Ks18.04，Progen)、K8/18抗体(50K160)和泛蛋白抗体(BD Labs Inc.，London，ON，，加拿大)孵育30分钟。或者，将各抗体在4℃下孵育过夜，然后用PBS洗涤3次5分钟。
在接下的步骤中，在室温下，在湿度培养箱中，将最初的第二抗体避光孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次5分钟。再将最初的第二抗体在室温下在湿度培养箱中避光孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次5分钟。然后再将最初的第二抗体在室温下在湿度培养箱中避光孵育30分钟，然后用PBS洗涤3次5分钟。在最后的抗体孵育后，将载玻片用蒸馏水漂洗，然后用乙醇漂洗数秒钟，风干。
可使用的第二抗体是例如异硫氰酸荧光素(FITC)-缀合的山羊抗小鼠IgG(Zymed，San Francisco，CA，USA)或Alexa 488nm-缀合的山羊抗小鼠IgG(Molecular Probes，Leiden，荷兰)和四甲基异硫氰酸罗丹明(TRITC)或FITC-缀合的猪抗兔Ig(Dako，Glostrap，丹麦)和TRITC-缀合的兔抗豚鼠Ig(Dako)。
最后，将样本用Mowiol(17％Mowiol 4-88[Calbiochem Nr.475904]，34％甘油的PBS液)或其它市售的封固培养基封固。
将所有的抗体用PBS稀释，然后分别用于后续孵育中。荧光染料缀合的抗体以16,000xg离心5分钟以除去聚集体，然后加到载玻片上。对于阴性对照，分别用PBS、免疫前血清或同种型匹配的免疫球蛋白代替最初的抗体。
免疫荧光样本的分析使用激光扫描显微镜(LSM510激光扫描显微镜，Zeiss，Oberkochen，德国)进行。使用多种不同方式获取共同定位点的分析(双标记)图像。合并的图片在共同定位的位点上显示出带有黄色的绿/红假定色。将载玻片在4℃下避光保存。
实施例3：本发明抗氧化剂对肝病的作用
为评价本发明抗氧化剂在早期DDC-或GF中毒小鼠肝脏内形态学改变消退的影响，将阳性对照组小鼠(仅暴露于DDC或GF 3-7天)与分别用MitoQ(MitoQuinol溴化[10-(3，6-二羟基-4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)癸基]三苯基和MitoQuinone溴化[10-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基的混合物)(由KeyOrganics Ltd，London，UK提供)或者MitoVit E溴化[2-(3，4-二氢-6-羟基-2，5，7，8-四甲基-2H-1-苯并吡喃-2-基)乙基]-三苯基)(由KeyOrganics Ltd，London，UK提供)再治疗3-7天的DDC或GF中毒小鼠进行比较。
为注射给药，可将MitoQ或MitoVit E溶解于增添了足以保持抗氧化剂溶解度的DMSO(优选1％)的PBS中。给各对小鼠腹膜内或静脉内(尾静脉)进行注射，并与注射溶媒的对照组比较。根据Smith R.A.J.等在2003，PNAS，100(9)：5407-5412中所述，这些对应着最大耐受剂量20mg MitoQ/kg/天(750nmol)和6mg MitoVit E/kg/天(300nmol)。
在饮食中增添MitoQ或MitoQ衍生物，例如MitoS(MitoQuinol甲磺酸[10-(3，6-二羟基-4，5-二甲氧基-2-甲基苯基)癸基]三苯基和MitoQuinone甲磺酸[10-(4，5-二甲氧基-2-甲基-3，6-二氧代-1，4-环己二烯-1-基)癸基]三苯基的混合物)或MitoVit E。通过测定水和液体饮食消耗以及小鼠体重确定剂量。根据Smith R.A.J.等在2003，PNAS，100(9)：5407-5412中所述，给小鼠在饮用水中喂3-7天，并无任何明显的被500μM或1mM MitoQ或MitoS(最大耐受剂量分别为232μmol/kg/天或346μmol/kg/天，500μM和1mM饮食对应的为154mg/kg/天和230mg/kg/天)或被500μM MitoVit E(最大耐受剂量分别为105μmol/kg/天，对应于60mg的MitoVit E/kg/天)中毒的迹象。
在另一试验中，将DDC-或GF中毒组动物同时用MitoQ(MitoS)或MitoVit E治疗3-7天，然后与仅暴露于DDC或GF3-7天的对照组进行比较。
在另一组试验中，同时将溶解于1％DMSO的PBS中的3-12mg/kg的MitoQ腹膜内给予DDC中毒的小鼠3天，并与对照组动物(阳性对照组表示DDC中毒小鼠而阴性对照表示无DDC中毒但注射溶媒的动物)比较。
为实际评价在这些短期实验中本发明靶向线粒体的抗氧化剂(例如MitoQ或MitoS)的作用，将门静脉周围炎性细胞的存在与否(Glisson试验)以及肝细胞损伤的程度(替代细胞肿胀和/或马洛里小体分析法(分别为长期暴露于DDC或GF的典型症状))，例如坏死、细胞骨架坍缩(参见图2和图3)，与阳性对照组进行比较。细胞肿胀和马洛里小体都不适于这些试验，原因是在所述短期暴露于DDC的时间内，它们不能形成统计学评价的程度。
总的来讲，在MitoQ治疗下，再次可看到由经窦状隙接壤的肝细胞股代表的正常结构。肝细胞的形态学在有关体积、细胞核的形态和细胞质的结构上均为正常。此外，炎性细胞(例如嗜中性粒细胞、淋巴细胞)的数目在用本发明的抗氧化剂治疗后明显减少。
在DDC中毒(8-10周)小鼠的长期试验中，测定治疗动物肝样本中细胞肿胀和马洛里小体(MB)的存在与否，并与对照组动物比较。
在一组实验中，DDC或GF中毒10周后，连续7天腹膜内或静脉内(尾静脉)给予试验动物各对注射MitoVit E或MitoQ(或MitoS)，然后与注射溶媒的对照小鼠比较。
在另一组实验中，在DDC中毒10周后，连续7天内给予试验小鼠腹膜内注射MitoQ(1.25mg/kg)2次(对应周的第1天和第4天)，然后根据常规组织学方法分析(标准苏木精/伊红染色法，根据LunaL.G.，1968，Manual of Histologic staining methods of the Armed ForcesInstitute of Pathology，第三版，McGraw Hill，New York)。当与适当的对照组对比时，在MitoQ治疗的DDC中毒动物中，细胞肿胀程度和马洛里小体数量明显减少(参见图4-6)。
在另一组实验中，连续7-14天内，小鼠在DDC或GF中毒8-10周，在饮用水中喂MitoQ(MitoS)或MitoVit E。
在另一组实验中，通过分别使用10-50％最大耐受剂量的MitoVitE或MitoQ(MitoS)，将MitoQ(MitoS)或MitoVit E施用于DDC-或GF中毒6周并同时再用DDC或GF连续治疗4周的小鼠中，然后与仅DDC或GF中毒10周的对照组动物比较。
在另一组实验中，将DDC或GF中毒10周的小鼠进行4周的恢复。接着同时用DDC或GF再中毒并用MitoVit E或MitoQ/MitoS治疗，表明通过用所述靶向线粒体的抗氧化剂治疗，能降低或消除毒性记忆效应(作为再暴露于DDC或GF中毒24-72小时的结果)。
为评价所述抗氧化剂对肝病的预防作用，将一组DDC-或GF喂食的小鼠同时分别用10-50％的MitoQ、MitoS或MitoVit E的最大耐受量治疗，然后与仅暴露于DDC或GF中毒10周的对照组动物比较。
在一组实验中，在最初恢复的期间(4周)内给予MitoQ、MitoS或MitoVit E，连续24-72小时用DDC或GF中毒，然后与未治疗的对照组动物比较。
本领域技术人员应清楚可对所述通用方案做各种修改。
总体来讲，在DDC或GF分别短期和长期中毒时，通过用本发明的抗氧化剂治疗或预防肝病和/或上皮癌，都能大大缓解或降低肝脏的显著改变。
实施例4：在源自DDC中毒的用或未用本发明抗氧化剂治疗的小鼠的分离的线粒体中测定氧化应激(测定生育酚醌含量)
4.1.小鼠肝线粒体(MLM)的分离
实施例3的大鼠心脏线粒体的方法(Staniek K.和Nohl H.，1999，Biochem.et Biophys.Acta，1413：70-80；Mela L.和Sietz S.，1979，Methods in Enzymology，Academic Press Inc.：39-46)适用于从不同动物中分离的小鼠肝(约为大鼠肝重量的10％)的方法。在4℃下进行肝的分离。将各肝切成片，然后放入液氮(N2)下急冻储存。在加入了预防生育酚氧化的10mg/L BHT(二叔丁基-羟基甲苯)和1mM二亚乙基三胺五乙酸(Fe螯合剂)的制备缓冲液(0.3M蔗糖、1mM EDTA、20mM三乙醇胺pH7.4)中融化后，将组织切成小块，用制备缓冲液洗涤4次，用带有Potter pistil的15ml缓冲液匀浆5次，稀释至30ml，然后以570g离心10分钟。将上清液通过两层粗棉布过滤。以7400g离心10分钟使线粒体沉淀，经手轻轻再悬浮于30ml缓冲液中，再按如上所述再沉淀和再洗涤，最后再悬浮于约200ml缓冲液中。用Biuret方法(以BSA为标准品，双测定至少需要200mg蛋白质)测定蛋白质浓度，期望得量为3-6mg。
为达到标准化目的，从用0.2％(v/v)Triton X-100溶解膜后，由连二亚硫酸盐还原光谱减去空气氧化光谱的差，计算细胞色素浓度(Aminco DW2000光度计，双测定需要约0.5-1mg线粒体蛋白质)(Williams J.N.，Jr.，1964，Archives of Biochemistry and Biophysics，107：537-543)；从大鼠肝线粒体外推(Wakabayashi T.等，2000，PathologyInternational，50：20-33)，在健康线粒体内，Cyt(a+a3)、Cytc、Cytc1和Cytb的各自浓度为0.1-0.3nmol/mg蛋白质。
作为对照，将一等份包含所有细胞膜的未处理的匀浆液(经第一次匀浆之后)保存。根据Murias M.等在2005，Biochemical Pharmacology，69：903-912中所述方法，将包含最轻部分(微粒体)的总膜在165000g下沉淀40分钟(超离心)，洗涤，再沉淀于5ml制备缓冲液中，最后再悬浮于约200ml缓冲液中。如上所述测定蛋白质浓度。
4.2.生育酚醌(TQ)的分析
可使用全MLM(参见第4.1.节)。将在1ml H2O中的量为2-5mg的蛋白质(线粒体，总膜或各部分)与5mM SDS和2nmol UQ6(辅酶Q-6，作为内标物)混合，用3ml无氧乙醇/己烷(2∶5)抽提。在氩气下，蒸发有机相，将残留物溶解于120ml乙醇中。40ml用于HPLC分析(每个样品进行双份分析)，使用Waters LC1模块，用C18柱。根据GrilleL.等在2004，Biochemical Pharmacology，68：373-381中所述方法，用50mM NaClO4的乙醇液/甲醇/乙腈/HClO4(400∶300∶300∶1)洗脱醌和生育酚，流速1ml/min，任选紫外法(TQ为268nm，UQ6、内源性UQ9和UQ10为275nm)或电化学法(+0.6V，生育酚和醌醇)检测；相对于生育酚或醌，在健康线粒体内期望的TQ含量为1-5％(Gille L.等，2004，Biochemical Pharmacology，68：373-381)。
大体来说，这些试验表明：当与对照组和用本发明抗氧化剂治疗的DDC小鼠相比时，在DDC中毒小鼠的线粒体内TQ水平升高。
4.3.小鼠肝线粒体(MLM)中另外的酶复合物的分析
根据Fato R.等在1996，Biochemistry，35：2705-2716中所述，将源自不同动物的MLM(参见实施例3的方案)冷冻，融化2-3次以打碎膜，准许使用各种试剂(参见下文)。在25℃下进行该光度测定试验(Aminco DW2000双波长光度计)，各测定实验需要约5-20mg线粒体蛋白质。
a)顺乌头酸酶(超氧化物破坏标记物)(James A.M.等，2005，JBC，于2005年3月23日出版，原稿M501527200)：该测试中含有0.6mM MnCl2、5mM 柠檬酸钠、0.2mM NADP+、0.1％Triton X-100 0.4U/ml异柠檬酸脱氢酶和50mM Tris pH7.4。接着在340-410nm处产生NADPH；根据Senft A.P.等在2002，Toxicology and AppliedPharmacology 178：15-21中所述，在健康线粒体内期望的活性约为每mg分离的线粒体为60nmol/min。
b)复合物I(NADH脱氢酶)(Estornell E.等，1993，FEBS，332，No.1，2：127-131的修改方法)：该测试中含有0.1mM NADH、0.05mM癸基辅酶Q、2mM KCN、20mM抗霉素A和20mM Tris pH7.5。接着在340-410nm处进行NADH衰减。用2mg/ml鱼藤酮抑制作用对非特异性醌还原进行校正；根据Stuart J.A.等在2005，Free RadicalBiology&Medicine，38：737-745和Barreto M.C.在2003，ToxicologyLetters，146：37-47中所述，在健康线粒体内期望的活性约为100-300nmol/(min·mg)。
c)复合物II(琥珀酸脱氢酶)(Gille2001的修改方法)：该测试中含有2mM琥珀酸盐、0.05mM癸基辅酶Q、2mM KCN、20mM抗霉素A和20mM Tris pH7.5。接着在275减去320nm处进行醌衰减。用25mM丙二酸抑制作用对非特异性醌还原进行校正；根据BarretoM.C.在2003，Toxicology Letters，146：37-47中所述，在健康线粒体内期望的活性约为每mg分离的线粒体70-100nmol/min。
d)复合物III(细胞色素bc1)(根据Stuart J.A.等，2005，Free RadicalBiology&Medicine，38：737-745的修改方案)：该测试中含有0.05mM癸基泛醌醇(由癸基泛醌通过连二亚硫酸盐还原和己烷抽提制备)、15mM Cytc、mM KCN和20mM Tris pH7.5。接着在550减去540nm处进行Cytc还原。用20mM抗霉素A抑制作用对非特异性醌醇氧化进行校正；根据Stuart J.A.等在2005，Free Radical Biology&Medicine，38：737-745中所述，在健康线粒体内的活性约为每mg分离的线粒体80nmol/min。
e)复合物IV(细胞色素氧化酶)(根据Stuart J.A.等，2005，FreeRadical Biology&Medicine，38：737-745的修改方案)：该测试中含有15mM还原的Cytc(通过连二亚硫酸盐还原和空气氧化过量的连二亚硫酸盐制备)和20mM Tris pH7.5。接着在550减去540nm处进行Cytc氧化；在健康线粒体内的活性约为每mg分离的线粒体1mmol/min(Stuart J.A.等，2005，Free Radical Biology&Medicine，38：737-745)。
实施例5：氧化应激诱导的蛋白(血加氧酶I)的评价
为评价已知的由氧化应激(Suematsu M.和Ishimura Y.，2000，Hepatology，31(1)：3-6)诱发的血加氧酶1(HO-1)蛋白表达，使用源自用MitoQ(稀释于1％DMSO的PBS中)或仅用溶媒本身同时治疗3天的DDC中毒小鼠的蛋白提取物进行标准蛋白质印迹分析(参见实施例3的方案)。
将肝组织再悬浮于增添2μg/ml亮抑蛋白酶肽、2μg/ml抑胃酶肽、2μg/ml抑酶肽、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和2mM二硫苏糖醇的冰冷却的RIPA-缓冲液(50mM Tris-HCl pH7.4、250mM NaCl、0.1％SDS、1％脱氧胆酸盐、1％NP-40)中，接着通过在冰上超声(5秒2次脉冲)匀浆。在冰上孵育20分钟后，通过在微量离心机中在4℃下以13000rpm经两个离心步骤离心15分钟，使裂解液澄清，然后收集上清液。通过Bradford试验(Biorad)，采用牛血清白蛋白作为标准品，测定蛋白质浓度。将等量蛋白质(一般为10-30μg)在12％SDS-PAGE凝胶上分离，然后通过半干转印仪(TE70，Amersham)电泳转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(Hybond-P，Amersham)上。室温下，在封闭溶液[在TBS-T(25mM Tris-HCl pH 7.4，137mM NaCl，3mM KCl，包含0.1％吐温(Tween)-20)中的5％乳]中，将膜封闭1小时，然后在4℃、搅拌下，与第一抗体溶液(在TBS-T/1％乳中制备)孵育过夜。使用对下列抗原特异性的抗体：与组成型表达的同种型HO-2(36kDa)交叉反应的HO-1(1∶1000稀释液；Stress Gene)以及β-肌动蛋白(1∶5000，Sigma)。除去第一抗体溶液并用TBS-T洗涤数次后，在室温下，将膜与HRP(辣根过氧化物酶)-缀合的第二抗体(兔抗小鼠，1∶1000；Dako)孵育1小时。在TBS-T中数次洗涤后，通过化学发光(ECL，Amersham)和对X-光胶片曝光进行检测(图7)。采用ChemiImager 5500软件(AlphaInnotech)光密度测定法分析谱带的强度，然后将各信号标准化为相应的HO-2的强度(当与DDC中毒组动物比较时，对MitoQ治疗，表现为降低7倍的HO-1)或者标准化为β-肌动蛋白的强度。
在MitoQ治疗下DDC诱发的血加氧酶1过量表达明显降低(图7)表明，本发明的抗氧化剂大大降低氧化应激。
在长期实验中，可评价已知在DDC中毒过程中在小鼠中增加的细胞角蛋白8的蛋白表达水平(Stumptner C.等，2001，Journal ofHepatology，34：665-675)和/或报导的在(N)ASH患者中降低的过氧化氢酶的蛋白表达水平(Videla L.A.等，2004，Clinical Science，106：261-268)。
测定代表肝细胞损伤的敏感标记物的脂肪酸结合蛋白(FABP)的蛋白表达水平(Monbaliu D.等，2005，Transplant Proc.37(1)：413-416)。当与正常小鼠比较时，蛋白质印迹分析表明，在DDC中毒小鼠中FABP蛋白明显降低。另外，在DDC中毒动物的MitoQ治疗下，FABP几乎达到对照小鼠FABP蛋白表达值(对照组代表仅用溶媒治疗的动物的未中毒组，参见实施例3)，由此表明MitoQ在治疗或预防本发明疾病中的作用。
通过现有技术已知的抗胱天蛋白酶(caspase)3免疫组织化学的标准方法(Brekken等，2003，The Journal of Clinical Investigation，111，4：487-495)并与适当的对照组比较，可将源自用本发明抗氧化剂治疗的DDC中毒小鼠的恒冷箱切片中的凋亡细胞的量半定量。
另外，采用荧光测定法(Stumptner C.等，2001，Journal ofHepatology，34：665-675)并与适当的对照组比较，可以测定用所述抗氧化剂治疗的DDC中毒小鼠的组织匀浆中的原卟啉水平。
实施例6：本发明抗氧化剂对血液参数的影响的评价
肝特异性酶的血清水平在提供一种本发明肝损伤的测定法的Actitest(Biopredictive，Houilles，法国)中监测。使用Poynard等在2003，Hepatology 38：481-492中所述的方法，按照实施例3的通用时间安排策略，从DDC-或GF中毒的动物、对照组动物和对应的也用所述靶向线粒体的抗氧化剂治疗的相应DDC-或GF暴露的动物中，测定a2-巨球蛋白、肝球蛋白、γ-谷氨酰转肽酶、总胆红素、载脂蛋白A1和丙氨酸转氨酶的血清水平。
可类似地使用也用人血清进行的Actitest作为肝损伤(尤其是纤维化)的测定法，以此监测本发明抗氧化剂治疗患有这些疾病患者的效果。
在Hitachi/Roche 917分析仪上，根据临床诊断的标准方案，利用市售的试剂盒(编号11552414、11876805216、11876848216、11929992，均购自瑞士Roche AG)，测定各实验动物组血清中表明肝损伤的下列参数：胆红素、丙氨酸转氨酶(ALT/GPT)、天冬氨酸转氨酶(ASAT/GOT)和谷氨酸脱氢酶(GLDH)。
用本发明化合物治疗的动物中血清肝酶的降低(例如丙氨酸转氨酶和天冬氨酸转氨酶，见图8)表明，在这些治疗的样本中肝损伤降低，为这些化合物在本发明疾病中的治疗功效提供了支持。
实施例7：组织切片中活性氧中间体(ROS)的测定
为测定DDC-或GF中毒组织和对照组织的肝样本内原位产生的ROS，根据标准方案(例如Brandes R.P.等，2002，Free Radic Biol Med；32(11)：1116-1122)用二氢乙锭(DHE，Molecular Probes)进行荧光显微照相法测定。DHE能自由穿透细胞，在O2存在下能被氧化为乙锭，其中通过嵌入DNA在细胞核内被捕获。乙锭在488nm处被激发，发射光谱为610nm。
将肝样本包埋在OTC Tissue Tek(Sakura Finetek Europe，Zoeterwonde，荷兰)中，然后用液氮冷却的异戊烷冷冻。将样本切成切片(5μm-30μm)，置于载玻片上。向各组织切片上加入二氢乙锭(5-20μmol/L)。然后将载玻片在37℃下避光的湿度培养箱中孵育30分钟，然后在37℃下用缓冲盐水溶液(PBS)洗涤(2-3次)。然后将切片盖上盖玻片。通过使用荧光显微镜或带有585nm长通道滤器的激光扫描共焦影像仪获得DHE的影像。
本领域已建立的另一种方法是，采用光泽精化学发光试验(Goerlach A.等，2000，Circ.Res.，87(1)：26-32)，测定DDC或GF中毒肝组织及对照肝组织中的ROS产生。将肝组织样本在装有1ml50mmol/L HEPES(pH7.4)、13.5mmol/L NaCl、1mmol/L CaCl2、1mmol/L MgCl2、5mmol/L KCl、5.5mmol/L葡萄糖和5μmol/L作为电子接受体的光泽精的小瓶中平衡。使用化学发光读数器检测超氧化物和光泽精之间的光反应。将化学发光信号表示为15-30分钟期间内所测得的每mg干组织每分钟平均计数。减去样本不存在下观察到的背景化学发光之后，获得化学发光信号数据。
该方法能够证实源自DDC或GF中毒小鼠肝脏内ROS的升高，这样模拟在患有本发明疾病的患者中所做的观察结果。
实施例8：本发明抗氧化剂对暴露DDC或GF的小鼠中活性氧中间体(氧化性损伤)的降低作用
受试动物的DDC-或GF中毒以及用所述抗氧化剂治疗的时间安排和剂量安排的通用策略与测定形态学异常所使用的实验方法(参见实施例3)类似。
本发明抗氧化剂(例如维生素E衍生物、辅酶Q10或谷胱甘肽过氧化物酶模拟物)的应用，使得暴露DDC或GF的肝脏内ROS水平明显降低。这种结果进一步表明，ROS在肝损伤中的效果，并表明该损伤通过例如MitoQ/MitoS或MitoVit E靶向线粒体(ROS的主要细胞源)而减轻。根据用靶向抗氧化剂治疗的实施例7的方法所测定ROS水平的降低表明，这些化合物对本发明疾病的治疗效果。
实施例9：肝细胞系中活性氧中间体(ROS)的测定
使用肝细胞瘤细胞系(例如HepG2或Hep3B)、源自SNU-398肝细胞癌的细胞系(ATCC No.CRL-2233，LGC Promochem，德国)、源自HUH-7人癌的细胞系(Japanese collection of Research BiosourcesJCRB 0403)或者Tib-73小鼠胚胎肝细胞系(ATCC TIB 73＝BNLCL2，源自BAL/c小鼠，MD，USA)的另一组试验来测定DDC中毒后这些细胞中的ROS产生。应用谷胱甘肽合成抑制剂L-丁硫氨酸-(S，R)-亚砜胺(BSO)作为评价内源性氧化应激的另一方法(Kito M.等，2002，Biochem Biophys Res Commun.，291(4)：861-867)。
由于近来已表明，CoCl2能影响线粒体(Jung JY和Kim WJ.，2004，Neurosci Lett.，371：85-90)，为测定在分化细胞系中的ROS产生，HepG2的刺激另外可通过100μM CoCl2(Sigma)进行(Bel Aiba RS等，2004，Biol.Chem.385：249-57)。
另一种在培养细胞中(以及在分离的细胞器官中或在整体组织中)建立的方法是根据Chem.Biol.Interact.2000年7月14日；127(3)：201-217测定由抗霉素A诱导的ROS产生(图10)或者通过使用光泽精化学发光试验由鱼藤酮诱导的ROS产生(Goerlach A.等，2000，Circ.Res.，87(1)：26-32)。
为测定在例如肝细胞瘤细胞系中ROS的产生，采用实施例8的标准实验方案。使试验的肝细胞癌细胞在96孔板中的培养基(增添10％FCS的DMEM，Gibco)中生长至80％汇合，接着用HBSS洗涤，然后在37℃下在暗处与DHE(10-50μM)孵育10分钟。然后将细胞用Hank氏平衡盐水溶液(HBSS，Gibco)洗涤2次以除去过量的染料。在荧光显微镜(Olympus，Hamburg，德国)下监测荧光。
另外，通过使用可被转化为荧光二氯荧光素的荧光探针5-(和-6)-氯甲基-2’，7’-二氯二氢荧光素二乙酸酯乙酰基酯(CM-H2DCFDA，Molecular Probes，Goettingen，德国)，测定ROS的产生(DCF；DjordjevicT.等，2004，Antioxidants&Redox Signaling，6：713-720)。为在微量滴定板读数器(Tecan，Crailsheim，德国)上测定DCF荧光，使细胞(例如HepG2、Hep3B或SNU-398)在96孔板中生长至80％汇合。然后将细胞用Hank氏平衡盐水溶液(HBSS，Gibco)洗涤2次，然后在37℃下在暗处，与溶解于含有N-ω-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME，10μM)的HBSS中的CM-H2DCFDA(8.5μM)孵育10分钟，以防止NO形成。用HBSS洗涤数次除去过量染料后，通过使用480nm激发波长和540nm发射波长监测荧光。根据制造商说明书(Biosource，Nivelles，比利时)，使用Alamar Blue实验，将DCF荧光标准化为活细胞的数量。简单地讲，在37℃下，在磷酸盐缓冲盐水(PBS)，pH7.4中，使细胞与Alamar Blue一起孵育，使得指示剂由氧化型(蓝色)变成全还原型(红色)。然后在580nm波长处测定吸光度。
任选通过流式细胞仪分析CM-H2DCFDA染色细胞评定ROS的产生。通过胰蛋白酶消化分离并收获细胞，经离心收集，然后以1×106细胞/ml的浓度再悬浮于HBSS中。然后在刺激前，在37℃下，在暗处将细胞用8.5μM CM-H2DCFDA负载15分钟。使用流式细胞仪(Partec，Muenster，德国)，使用480nm激发波长和540nm发射波长，通过分析10,000细胞，监测DCF荧光。
在增添DDC(EC50＝50μg/ml培养基)或带有高达100μM BSO的培养基(DMEM和10％FCS，Gibco)中孵育达72小时的肝细胞瘤细胞系，是另一种在患有本发明肝炎的患者中所做的模拟观察的合适体外模型。
实施例10：本发明抗氧化剂对DDC-、BSO-、抗霉素A-(或鱼藤酮-)中毒的或CoCl2诱导的培养细胞的氧化性损伤的降低的作用
通过应用标准方案并遵循实施例9的时间安排的通用策略，分别用DDC或BSO中毒并且同时用MitoQ/MitoS或MitoVit E(根据Jauslin M.L.等，2003，FASEB J.，2003，(13)：1972-1974，浓度对应的是MitoQ为EC50＝0.51nM，MitoVit E为EC50＝416nM)处理的人细胞系使得ROS形成明显降低。
在另一实验中，使用100μM CoCl2(Sigma)刺激的HepG2(Bel AibaR.S.等，2004，Biol.Chem.385：249-57)。遵循实施例9中所述建立的方法，将HepG2细胞接种到96孔板中，并在血清饥饿16小时之后进行实验。然后将HepG2用HBSS(Hank氏平衡盐溶液，Gibco)洗涤一次，再与浓度范围0.5-10μM的MitoQ或者各自对应量的DMSO(Sigma)一起培养。15分钟后，向细胞中加入DCF(终浓度为8μM)，将细胞与染料一起培养10分钟。除去加入的培养基后，加入包含MitoQ和CoCl2(100μM)的新鲜HBSS。0分钟、10分钟、20分钟和30分钟后，在读板器(Tecan Safire)上，测定荧光(Djordjevic T等，2005，Free Radic.Biol.Med.，38：616-30)。
用5μM MitoQ处理的未经刺激的细胞显示降低基础的ROS产生。5μM MitoQ使CoCl2刺激的ROS产生(100μM CoCl2)明显降低，表明本发明抗氧化剂能明显降低这些细胞中基础的和CoCl2刺激的ROS水平(图9)。
另一种方法是通过在例如HUH-7或Tib-73中使用光泽精化学发光试验(实施例9中建立的实验)，测定抗霉素A或鱼藤酮诱导的ROS产生。将HUH-7细胞在6孔板中孵育，然后在37℃下通过使用浓度为0-25μM(优选0μM、1μM和5μM)的抗霉素A并同时与或不与溶解于DMEM(Gibco)中的浓度范围0-1000nmol的MitoQ(或MitoS)刺激3小时。连续3次洗涤后，在包含1ml的50mmol/L HEPES(pH7.4)、135mmol/L NaCl、1mmol/L CaCl2、1mmol/L MgCl2、5mmol/LKCl、5.5mmol/L葡萄糖以及作为电子接受体的5μmol/L光泽精的平板中平衡细胞。使用化学发光读数仪(Lumistar，BMG laboratories，德国)检测超氧化物和光泽精之间的光反应。将化学发光信号表示为每分钟平均计数，并且标准化为根据细胞计数器(Casy TechnologyInstrument，Schrfe-System，德国)测定的细胞数。
大体来说，这些试验表明，ROS形成明显降低(图10)，因此进一步确认本发明的靶向线粒体的抗氧化剂对肝病具有治疗益处。
实施例11：抗氧化剂化合物对裸鼠的作用的评价
测定本发明靶向线粒体的抗氧化剂在治疗和/或预防上皮癌中的作用的通用策略遵循以上DDC或GF中毒小鼠所述的治疗范例(根据实施例2-7)，但是使用带有人上皮细胞癌异种移植物的无免疫应答的小鼠(应用于例如CD1 nu/nu小鼠上的裸鼠肿瘤异种移植物来源于Charles Rivers Laboratories，USA)。根据标准方法(Li K.等，2003，CancerRes.，63(13)：3593-3597)皮下异种移植的肿瘤细胞系或原发性肿瘤包括结肠腺癌、乳腺的侵袭性导管癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、前列腺肿瘤、胰腺肿瘤和胃癌。
收集对数期生长中的衍生肿瘤的细胞系(在DMEM/10％FBS中生长)，用PBS洗涤2次，再悬浮于1ml PBS(2.5×107细胞/ml)中，然后给裸鼠(Hsd：无胸腺nu/nu，Harlan Winkehnann；鼠龄5-6周)右胁按5×106细胞/小鼠(0.2ml)的量进行皮下注射。在指定期间(依据细胞类型而定)内，每隔一天监测肿瘤的生长。根据皮肤表面上两个垂直的直径和高度的乘积，求出肿瘤体积。
用例如MitoQ(MitoS)对这些小鼠的治疗表明肿瘤生长降低、肿瘤坏死增加以及肿瘤异种移植物的血管化降低。类似地，如上所述监测裸鼠肿瘤异种移植物中的ROS水平，在用本发明抗氧化剂治疗的异种移植物肿瘤中，ROS水平降低。
对于本领域技术人员显而易见的是，对本发明的组合物和方法可做各种修改。因此，本发明涵盖所有的这些修改和改变，前提是这些修改和改变都落入所附的权利要求书及其等同实施方案的范围之内。本文引用的所有出版物都全文结合到本发明中作为参考。

Claims (31)

1.一种靶向线粒体的抗氧化剂化合物在制备用于治疗或预防肝病和上皮癌的药物中的用途，所述抗氧化剂化合物包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子。
2.权利要求1的用途，其中所述亲脂性阳离子是三苯基阳离子。
3.权利要求1或2的用途，其中所述化合物具有下列结构式：
Figure A2005800231930002C1
其中X为连接基，Z-为阴离子，R为抗氧化部分。
4.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R为醌或醌醇。
5.权利要求4的用途，其中所述化合物具有下列结构式：
Figure A2005800231930002C2
6.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R为谷胱甘肽过氧化物酶模拟物。
7.权利要求6的靶向线粒体的化合物的用途，其中所述谷胱甘肽过氧化物酶模拟物部分是：
Figure A2005800231930003C1
8.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R选自维生素E和维生素E衍生物；断链抗氧化剂，包括丁基化羟基苯甲醚、丁基化羟基甲苯；普通自由基清除剂，包括衍生化富勒烯；自旋阱，包括5，5-二甲基吡咯啉N-氧化物衍生物、叔丁基亚硝基苯衍生物和α-苯基-叔丁基硝酮衍生物。
9.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R为维生素E或维生素E衍生物。
10.权利要求9的用途，其中所述化合物具有下列结构式：
11.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R为丁基化羟基苯甲醚或丁基化羟基甲苯。
12.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R为衍生化富勒烯。
13.权利要求3的用途，其中所述抗氧化部分R为5，5-二甲基吡咯啉N-氧化物、叔丁基亚硝基苯、α-苯基-叔丁基硝酮和它们的衍生物。
14.权利要求13的用途，其中所述化合物具有下列结构式：
Figure A2005800231930004C1
15.权利要求3的用途，其中所述连接基X为C1-C30碳链，其任选包括一个或多个双键或三键，并且任选包括一个或多个未取代或取代的烷基、烯基或炔基侧链。
16.权利要求15的用途，其中所述连接基X为(CH2)n，式中n为1-20的整数。
17.权利要求16的用途，其中所述连接基X为亚乙基、亚丙基、亚丁基、亚戊基或亚癸基。
18.权利要求3-17中任一项的用途，其中所述阴离子Z-为药学上可接受的阴离子。
19.权利要求18的用途，其中Z-为卤离子。
20.权利要求19的用途，其中Z-为溴离子。
21.权利要求18的用途，其中Z-为烷基或芳基磺酸的阴离子。
22.权利要求21的用途，其中Z-为甲磺酸根。
23.权利要求22的用途，其中所述化合物具有下列结构式：
24.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述肝病是选自以下的疾病：酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、营养介导的肝损伤、中毒性肝损伤、感染性肝病、脓毒病性肝损伤、自身免疫介导的肝病、血色素沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症、放射介导的肝损伤、肝癌、肝脏良性肿瘤和局灶性结节性增生。
25.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述肝病是选自以下的疾病：酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、脂肪变性、胆汁郁积、肝硬化、营养介导的肝损伤、中毒性肝损伤、感染性肝病、脓毒病性肝损伤、自身免疫介导的肝病、血色素沉着病、α1抗胰蛋白酶缺乏症和放射介导的肝损伤。
26.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述肝病是酒精性肝病或非酒精性脂肪性肝病。
27.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述肝病是酒精性脂肪性肝炎或非酒精性脂肪性肝炎。
28.权利要求1-23中任一项的靶向线粒体的抗氧化剂化合物的用途，其中所述肝病是酒精性脂肪性肝炎。
29.权利要求1-23中任一项的用途，其中所述肝病是非酒精性脂肪性肝炎。
30.权利要求1-29中任一项的靶向线粒体的抗氧化剂化合物用于治疗或预防肝病和上皮癌的用途，所述抗氧化剂化合物包含与抗氧化部分以共价键偶合的亲脂性阳离子。
31.一种治疗患有肝病或上皮癌的患者的方法，该方法包括给予需要这种治疗的患者治疗有效量的权利要求1-29中任一项的化合物。
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