CN1646119A - 涉及异黄－3－烯和异黄烷结构的治疗方法和组合物 - Google Patents

Abstract

本发明描述了利用通式(I)的异黄－3－烯和异黄烷化合物治疗与异常细胞存活、异常细胞增殖、异常细胞迁移、异常血管生成、雌激素/雄激素失衡、功能不良或异常类固醇生成、退化包括血管壁退化性改变、炎症或免疫失调相关疾病的方法。还描述了涉及异黄－3－烯和异黄烷化合物的组合物及其用途。

Description

涉及异黄-3-烯和异黄烷结构的治疗方法和组合物

发明领域

本发明涉及基于异黄-3-烯和异黄烷结构的化合物及其衍生物的细胞机制调节。尤其是，本发明涉及使用基于异黄-3-烯或异黄烷结构的化合物调节与哺乳动物细胞内信号转导过程密切相关的一系列靶分子的方法，涉及这类化合物在制备用于调节细胞机制的药物中的用途以及涉及含有这类化合物的细胞机制调节组合物。

发明背景

脱氢牛尿酚是化合物4’，7-二羟基异黄-3-烯的通用名[也称为3-(4-羟基苯基)-7-羟基-2H-1-苯并呋喃和Haginin E]，一种天然存在的异黄-3-烯和异黄酮的代谢物。其化学结构为式I：

1995年，Joannou等[1]最先将脱氢牛尿酚描述为一种假定的异黄酮的细菌发酵产物，大豆黄酮。脱氢牛尿酚完全是推测，因为其存在并没有得到证实而且既没有分离得到该化合物也没有对其进行化学表征。

后来，有记载脱氢牛尿酚天然存在于植物Lespedeza homoloba中，被命名为“Haginin E”[2]。

1997年，发明名称为涉及异黄酮的治疗方法和组合物(therapeuticmethods and compositions involving isoflavones)专利申请WO98/08503首先认为脱氢牛尿酚对包括人类的动物的健康有益。该专利说明书教导了脱氢牛尿酚属于初级的异黄酮类环结构的化合物族，该族的一些成员对动物显示出雌激素的、抗癌、心血管的以及抗炎的种种健康益处。没有发现异黄酮类环结构为动物体内的内在的生物活性结构，因为该族的大量的成员在动物体内不显示出已知的生物活性或显示了生物毒副性质。

脱氢牛尿酚和专利申请WO98/08503中引用的该化学族其它成员的生物活性的生物化学基础尚无定论。因为对其生化活性缺乏全面的理解，因此脱氢牛尿酚潜在的健康益处的范围还属未知，尽管已有其它植物雌激素(phytoestrogens)及其代谢物或衍生物推测的或已知的活性。

本申请现描述了异黄-3-烯和异黄烷成分，尤其是脱氢牛尿酚的新的治疗适应症，因此延伸了异黄-3-烯、异黄烷及其衍生物已知的生物作用和健康益处。本发明是基于上述化合物的完全出乎意料的生物活性，因为申请人出乎意料地发现脱氢牛尿酚及其衍生物调节哺乳动物细胞内广泛的靶分子，并发现这些靶分子与一些信号转导过程密切相关，这些信号转导过程是关键细胞过程如细胞生长、分化、转移和死亡的基本步骤。因此，可见这些出乎意料的生化效果对包括人类的动物的健康具有广泛且重要的意义。本文描述了本发明的这些和其它的优选目的。

本专利延伸了脱氢牛尿酚及其衍生物的生物效应和健康益处

本发明具体涉及异黄-3-烯和异黄烷化合物，尤其是4’，7-二羟基异黄-3-烯。已发现这类化合物能出乎意料地调节动物细胞内的各种信号转导过程，并发现这些信号转导过程涉及对所有动物细胞的存活和机能至关重要的一系列功能，因此这些化合物对包括人类的动物具有广泛且重要的健康益处。

本发明的具体益处在于(a)所述化合物靶向的广泛的信号转导过程，(b)对这些不同过程的调节，包括对某些过程的增量调节和其它过程的减量调节，以及(c)对信号转导过程的这样广泛且多样的作用同时还伴随对新陈代谢和类固醇生成中一系列重要酶具有独立的作用。

非常出乎意料的是，本发明的化合物尤其是脱氢牛尿酚具有如此广泛生化效应，因而对动物的健康具有潜力，特别是具有预防和治疗人类重要和常见的疾病、病症和功能障碍的潜力。

涉及本发明各方面的化合物为通式II的异黄-3-烯和异黄烷化合物：

其中：

R₁、R₂、R₃和R₄独立为氢、羟基、OR₉、OC(O)R₁₀、OS(O)R₁₀、CHO、C(O)R₁₀、COOH、CO₂R₁₀、CONR₁₁R₁₂、烷基、卤烷基、芳烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、烷芳基、烷氧芳基、硫基、烷硫基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、硝基或卤素，或

R₃和R₄如前定义，且R₁和R₂与其所连接的碳原子一起形成选自下面的五元环：

R₁和R₄如前定义，且R₂和R₃与其所连接的碳原子一起形成选自下面的五元环：

或

R₁和R₂如前定义，且R₃和R₄与其所连接的碳原子一起形成选自下面的五元环：

且

其中

R₅、R₆和R₇独立为氢、羟基、OR₉、OC(O)R₁₀、OS(O)R₁₀、CHO、C(O)R₁₀、COOH，CO₂R₁₀、CONR₁₁R₁₂、烷基、卤烷基、芳烷基、链烯基、炔基、芳基、杂芳基、硫基、烷硫基、氨基、烷氨基、二烷基氨基、硝基或卤素，

R₈为氢，羟基，烷基，芳基，氨基，硫基，NR₁₁R₁₂，CONR₁₁R₁₂，C(O)R₁₃，其中R₁₃是氢，烷基，芳基，芳烷基或氨基酸，或CO₂R₁₄，其中R₁₄是氢，烷基，卤烷基，芳基或芳烷基，

R₉是烷基、卤烷基、芳基、芳烷基、C(O)R₁₃其中里R₁₃如前定义、或Si(R₁₅)₃，其中各R₁₅独立为氢、烷基或芳基，

R₁₀是氢，烷基，卤烷基，氨基，芳基，芳烷基，氨基酸，烷基氨基或二烷基氨基，

R₁₁是氢，烷基，芳烷基，链烯基，芳基，氨基酸，其中R₁₃如前定义的C(O)R₁₃，或其中R₁₄如前定义的CO₂R₁₄，

R₁₂是氢，烷基或芳基，或

R₁₁和R₁₂与其连接的氮原子一起构成吡咯烷基或哌啶基，

代表单键或双键，优选双键，

T独立是氢，烷基或芳基，并且

X是O，NR₁₂或S，优选O，

上述化合物包括其药学上可接受的盐及衍生物。

本发明一方面提供治疗、预防或改善与异常细胞存活、异常细胞增殖、异常细胞迁移、异常血管生成、雌激素/雄激素失衡，功能不良或异常类固醇生成、包括血管壁内退化性改变的退化、炎症及免疫失调相关疾病的方法，该方法包括给予患者一种或多种任选地与载体和/或赋形剂结合的式II化合物。

本发明另一方面提供式II化合物在制备治疗、预防或改善与异常细胞存活、异常细胞增殖、异常细胞迁移、异常血管生成、雌激素/雄激素失衡、功能不良或异常类固醇生成、包括血管壁内退化性改变的退化、炎症和免疫失调相关疾病的药物中的用途。

本发明另一方面提供一种在表达异常前存活(prosurvival)表型的细胞中诱导凋亡的方法，该方法包括使一种或多种任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物与所述细胞接触。

本发明另一方面提供一种抑制具有异常细胞迁移表型的细胞迁移的方法，该方法包括使一种或多种任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物与所述细胞接触。

本发明另一方面提供一种在表达异常血管生成表型的组织中抑制血管生成的方法，该方法包括使一种或多种任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物与所述组织接触。

本发明另一方面提供了一种抑制哺乳动物体内拓扑异构酶II的方法，该方法包括给予哺乳动物治疗有效量的任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物的步骤。

本发明另一方面提供一种治疗、预防或改善哺乳动物癌症的方法，该方法包括使式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物与患肿瘤的哺乳动物体内的癌组织接触的步骤，这样所述癌组织的肿瘤发展被阻滞或阻止。

在一个优选的实施方案中，肿瘤发展通过式II化合物稳定了可裂解的DNA拓扑异构酶II复合体而被阻滞或阻止。

本发明另一方面提供一种治疗、预防或改善哺乳动物癌症的方法，该方法包括使式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物与患肿瘤的哺乳动物体内的癌组织接触，其中式II化合物抑制与癌组织相关的tNOX，这样所述癌组织的肿瘤发展被阻滞或阻止。优选地，式II化合物，如脱氢牛尿酚，通过抑制tNOX诱导凋亡。

另一个优选的实施方案中，式II化合物与已知的拓扑II毒剂协同给药。在另一个实施方案中将式II化合物应用到已对另一种拓扑II毒剂或其它化疗活性成分产生耐受性或抵抗力的患者。

本发明另一方面提供一种在表达DNA拓扑异构酶II细胞中诱导凋亡的方法，该方法包括使一种或多种任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物与所述细胞接触。

本发明另一方面提供一种通过使式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物与DNA拓扑异构酶II可裂解的复合体接触以稳定可裂解的复合体从而抑制DNA拓扑异构酶II的方法。

本发明另一方面提供式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物在制备治疗哺乳动物癌症的药物中的用途。

本发明另一方面提供式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物作为DNA拓扑异构酶II毒剂的用途。

本发明另一方面提供式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物作为tNOX抑制剂的用途。式II化合物可用于制备抑制与肿瘤细胞相关的tNOX的药物。

本发明另一方面提供含有式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物和药学上可接受的载体和/或稀释剂的用于治疗癌症的药物组合物。

本发明另一方面提供协同作用的药物组合物，其含有式II化合物与另一种化疗活性剂，优选另一种拓扑II毒剂。在一实施方案中，式II化合物与另一种拓扑II毒剂存在于试剂盒中。

本发明另一方面提供一种、包含式II化合物和一种或多种其它药学活性剂的药物组合物。

在下面的整个说明书和权利要求书中，除非文中另有说明，词语“包括”及其变化形式应理解为包括所述整数或步骤、或整数或步骤的集合，但并不排除任何其它的整数或步骤、或整数或步骤的集合。

附图简述

图1表示测定脱氢牛尿酚对拓扑II催化活性影响的开结测试。用2单位纯化的拓扑II在不存在脱氢牛尿酚(泳道1)或存在100、80、60、40、20和10μg/ml脱氢牛尿酚(泳道3-8)时孵育底物P4 DNA。泳道2，10μg/ml VP-16(阳性对照)。通过将打结的P4 DNA(K)转化为开结的(U)形式来测定拓扑II的活性。

图2表示测定脱氢牛尿酚对拓扑I催化活性影响的松弛测试。用2单位纯化的拓扑I(泳道2-8)与喜树碱(泳道3)或不同浓度的脱氢牛尿酚(泳道4-8)孵育底物超螺旋的pUC8 DNA；泳道1，超螺旋的pUC8 DNA，对照组(不含拓扑I)；泳道2，松弛的pUC8 DNA；泳道3，10μg/ml喜树碱(阳性对照)；泳道4，100μg/ml脱氢牛尿酚；泳道5，80μg/ml脱氢牛尿酚；泳道6，60μg/ml脱氢牛尿酚；泳道7，40μg/ml脱氢牛尿酚；泳道8，20μg/ml脱氢牛尿酚。通过将超螺旋的pUC8 DNA(SC)转化成其松弛形式(REL)而测定拓扑I活性。

图3表示测定脱氢牛尿酚对双链DNA裂解影响的测试。用10单位人类拓扑II(泳道2-6)在不存在脱氢牛尿酚(泳道1)或存在10、30、或100μg/ml的脱氢牛尿酚(泳道2-4)，或30μg/ml金雀异黄素(泳道5)，或10μg/ml VP-16(泳道6)时孵育pRYG DNA。泳道7，线性pUC8 DNA标记物。通过将松弛的(REL)或超螺旋的(SC)pRYG DNA转化为线性(LIN)形式来测定双链DNA的断裂。

图4表示测定脱氢牛尿酚对单链DNA裂解影响的测试。在下面方法部分中所述的条件，用10单位的人拓扑I(泳道2-6)或不使用人拓扑I(泳道1)孵育pUC8 DNA。泳道2，不含抑制剂；泳道3，10μg/ml的脱氢牛尿酚；泳道4，100μg/ml的脱氢牛尿酚；泳道5，10μg/ml的喜树碱；泳道6，100μg/ml的喜树碱；通过将松弛的(REL)或超螺旋的(SC)pUC8 DNA转化为切口(NIC)的形式而测定单链DNA断裂。

图5

a)脱氢牛尿酚(□)和金雀异黄素(■)抑制LNCaP细胞的增殖潜力。

b)脱氢牛尿酚(De)抑制小鼠体内人异种移植物的生长。自接种LNCaP细胞开始口服脱氢牛尿酚(■)或赋形剂(□)，每周5天，并在58天中评价肿块。

c)与对照孔(C)比较脱氢牛尿酚体外抑制Ras转换的NIH 3T3细胞的转化灶形成。

图6

脱氢牛尿酚对内皮细胞增殖、迁移和体外血管生成的抑制。

a)在各种浓度的脱氢牛尿酚(■)或DMSO载体(▲)存在下的EC增殖。给出了一个试验结果，这里各组平行试验四次，代表了4个同样的试验。给出了均值±SEM。

b)18小时内，在DMSO(C)或脱氢牛尿酚(De)存在下，EM自伤口前沿(白条)的迁移。每一试验进行两次，每次试验时各组中有两孔完全一致，显示了其中一孔中有代表性的结果。

c)在DMSO(C)或脱氢牛尿酚(De)存在下的体外血管生成。每一试验进行三次，每次试验时各组中有两孔完全一致，显示了其中一孔中有代表性的结果。

d)使用脱氢牛尿酚(De)或DMSO对照(C)处理EC 18小时，EC中基质金属蛋白酶-2(MMP-2)的RNA印迹。上面的图是MMP-2，下面的图是GAPDH.

图7

a)内皮细胞上E选择蛋白的表达。1组，未受刺激的；2组，TNF刺激4小时；3组，DMSO处理18h后使用TNF刺激；4组，脱氢牛尿酚处理18h后使用TNF刺激；

b)内皮细胞上VCAM-1的表达。1组，未受刺激的；2组，TNF刺激4h或18h；3组，DMSO处理18h后使用TNF刺激；4组，脱氢牛尿酚处理18h后使用TNF刺激；

给出的每一试验代表了各组进行的3-6次试验。

c)在载体DMSO或脱氢牛尿酚(De)存在下，未受刺激的(NIL)或经TNF刺激的内皮细胞的IL-8的分泌。进行的三次试验之一中平行的三次测定的均值±SEM。*p＜0.01

图8

与对照(C)孔相比，脱氢牛尿酚(De)抑制经TNF(a，b)，PMS(b)或IL-1(C)刺激后的内皮细胞中鞘氨醇激酶(SK)的活性。试验1至3的结果显示于此，这里各组平行进行两次(均值±SEM)。*p＜0.01。

发明详述

细胞的所有活动均受源于远端细胞(内分泌信号)、邻近细胞(旁分泌信号)或同一细胞内(自分泌信号)的多种信号的控制。这些不同信号主要是通过刺激细胞基因组(DNA)从而启动相应的细胞应答来工作的。信号传递到基因组的过程称为信号转导。在此我们称为途径，通常涉及不同的蛋白质，一种蛋白质的激活催化另一种蛋白质的应答，最终导致特定基因或基因套组的转录。体内平衡，我们称为导致健康的细胞、组织和器官的整合功能，是连续进入身体细胞的数百甚至数千不同信号的最终结果。

根据信号作用的环境，可粗略地将信号分为涉及“特定功能”的信号和涉及细胞存活和活动的基本能力的信号。“特定功能”的例子有神经细胞的痛觉、免疫细胞产生抗体、肝细胞的排毒反应或肾细胞形成尿液。“基本功能”的例子有细胞存活或细胞死亡、细胞增殖、细胞迁移和血管生成。可见调节细胞能否实现“特定功能”的关键是对细胞“基本功能”的调节。

在出乎意料且重大的发现中，申请人发现了式II化合物，尤其是脱氢牛尿酚，能调节细胞的许多“基本功能”。此发现是出乎意料的，(a)因为迄今尚认为单一化合物对如此多的涉及细胞内基本调节机制的靶点具有如此综合的作用是不可能的，以及(b)脱氢牛尿酚调节这类靶分子的作用方式是全新的，仅在这类些靶分子功能障碍时才改变其活动。此外，它是一个重大发现，还因为具有这样生物效果的化合物对细胞整个活动范围的活动能力具有明显的和重要的意义，并对动物的一般健康具有重要的意义。

在下面的描述中，具体提到脱氢牛尿酚。然而，这些描述应被理解为适用于其它的式II化合物。

下面是本发明人出人意外地发现的受脱氢牛尿酚和其它的式II化合物调节的“基本功能”的一些例子。

1.细胞存活/死亡

为了持续活动，包括对特定功能的应答，细胞需要持续激活前存活(pro-survival)信号转导机制。前存活机制在两个主要方面起作用-有效地促进存活和有效地抑制细胞死亡(凋亡)。

前存活机制包括许多不同的信号转导过程，最终导致某些基因的转录，其结果是促进细胞存活。这些不同的过程包括但不限于如MER、ERK和NFκB的靶分子。已发现脱氢牛尿酚在一系列的这些过程中起作用。特别实例是酶，鞘氨醇激酶。鞘氨醇激酶使底物鞘氨醇磷酸化形成鞘氨醇-1-磷酸酯。鞘氨醇-1-磷酸酯是前存活机制的重要刺激物，它在一系列的细胞寿命增加的疾病中过度表达。脱氢牛尿酚能减量调节鞘氨醇激酶的活性。

下面的许多机制可导致凋亡

(a)一种机制涉及被称为“死亡受体”的受体。这些受体包括如Fas/Mort、TGF和TNRF受体。受体的激活一般通过阻止蛋白如C-flip的生成被抑制。已发现脱氢牛尿酚可阻止C-flip的生成，这样能促进细胞的死亡。

(b)另一种机制涉及称为“caspases”的蛋白水解酶的激活。一旦激活，此酶使细胞自溶。已发现脱氢牛尿酚可增量调节caspases的活性。

(c)另一种机制涉及线粒体的破裂，导致各种前死亡因子的生成。已发现脱氢牛尿酚通过对线粒体产生直接和新的作用而促进这种破裂。

从上面的描述可以看出，脱氢牛尿酚能通过许多不同的途径综合地诱导细胞死亡。单一化合物的具有如此广泛且互补的作用的能力是很新颖。但更为令人惊奇的发现是脱氢牛尿酚仅在异常细胞中发挥这样的前死亡作用。

这就是说，在正常的健康细胞中，脱氢牛尿酚对这些调节过程没有明显的影响。这些调节过程中表现除出异常活性的细胞包括但不限于与这些疾病有关的细胞：如癌症、心血管疾病、自身免疫疾病以及与免疫的、炎症的或过度增殖成分有关的疾病。

2.细胞增殖

对生长信号产生应答而进行分裂的能力是正常健康细胞所需的另一项基本功能。显然鞘氨醇-1-磷酸酯对促进细胞的分裂能力起关键作用。

细胞分裂行为涉及下面许多不同的酶：

(a)拓扑异构酶(I和II)的激活，其任务是在有丝分裂前组织DNA；

(b)细胞周期蛋白依赖性的激酶(CDK)的激活，其任务是在有丝分裂不同阶段中移动基因组；

(c)细胞周期蛋白依赖性的激酶抑制物(CDKI)的失活，CDKI的任务是通过抑制CDK从而抑制有丝分裂。

脱氢牛尿酚出乎意料地抑制所有上述3种成份，即抑制拓扑异构酶II、CKD和CDKI。尽管分别抑制各种成分的各种药物已有报道，但单一药物可抑制所有三种明显不同的酶系统的概念是新颖且出乎意料的。

其新颖性和出乎意料之处在于仅抑制行为异常的细胞中的这些酶系统，尤其是表达异常的前存活表型或异常细胞增殖的细胞。

3.细胞迁移

已经知道细胞迁移以及与其邻近细胞相互作用的能力是健康和痰病的基础。鞘氨醇激酶和基质-金属蛋白酶是此重要细胞机能的关键调节因子。脱氢牛尿酚独特地减量调节这两种酶系统，因而减弱了病态细胞的迁移能力。

4.血管生成

已知形成新血管的能力是许多引起与增生相关的疾病的关键过程。鞘氨醇激酶是该过程的关键促进子。脱氢牛尿酚通过减量调节该酶从而选择性削弱与疾病伴生的血管生成，而不削弱健康组织内的血管生成。

脱氢牛尿酚对信号转导机制的广泛影响出乎意料地通过对大量的酶的抑制作用而得以补充，一般认为这些酶不是信号转导过程的一部分，而是通常条件下机体内生理的一部分。这些作用包括：

5.类固醇生成

脱氢牛尿酚抑制许多与类固醇生成相关的酶。这些酶包括但不限于类固醇脱氢酶、5-α-还原酶和芳香酶。本领域技术人员知道这些作用将对类固醇激素，包括雄激素、雌激素和皮质激素的生成产生巨大的影响。本领域一些技术人员认为这些作用将对雄性和雌性生殖组织包括乳房、卵巢、子宫、子宫内膜、宫颈、阴道、前列腺和阴茎的功能产生巨大影响。

总之，发明人出乎意料地发现脱氢牛尿酚调节许多独特的的酶，这些酶涉及通常的代谢和生理功能相关以及信号转导途径，这些信号转导途径在细胞存活、细胞生长、细胞分化和细胞对炎症和免疫调节剂的反应中起关键作用。通过对这类酶的调节，本发明化合物具有如下能力(a)预防或治疗许多形式的疾病，而不管这些疾病是何种病因引起的，和(b)影响机体组织的全部生物活性和疾病、年龄、环境影响以及其它药物影响那些活性的方式。

此外，非常出乎意料的和新的是发现一种化合物，这种化合物可导致人乳腺癌细胞凋亡或死亡，还具有如此多样的作用：抗高血压、矫正炎性肠病引起的免疫和炎症失衡、逆转I型糖尿病以及逆转男人型脱发。尚不知一些或所有的这些病症之间病因的联系，这使得脱氢牛尿酚能显示出这些健康益处完全出人意料。

对脱氢牛尿酚在机体内广泛的生物活性中的重要作用没有偏见，但仍可以容易地看出此化合物在预防和治疗如下的各种疾病和病症中将特别相关。

A.与对生长信号的异常应答、异常细胞增殖、功能障碍性凋亡以及异 常迁移模式(迁移)相关的疾病和病症

这些包括：

1.机体各种组织内所有形式的癌症(癌前的、良性的和恶性的)。在这方面，化合物可以作为单一抗癌治疗形式使用或与其他抗癌治疗形式，包括但不限于放疗和化疗联合使用；

2.丘疹结节性皮肤损伤，包括但不限于肉瘤、血管肉瘤、卡波济氏肉瘤(Kaposi′s肉瘤)、法布里病；

3.丘疹鳞状皮肤损伤，包括但不限于牛皮癣、Bowen病和Reiter病；

4.骨髓增殖性病症，包括但不限于巨幼细胞疾病、骨髓发育不良综合征、真性红细胞增多症、血小板增多症和骨髓纤维化；

5.生殖道增生性疾病，包括但不限于良性前列腺增生、子宫内膜易位、子宫平滑肌瘤和多囊卵巢疾病。

B.与异常血管生成相关的疾病和病症

这些包括：

1.与影响机体内任何组织的异常血管生成相关的疾病和病症，包括但不限于转移癌、牛皮癣、血管瘤和毛细血管扩张

C.与异常炎症/免疫应答相关的疾病或病症

这些包括：

1.与任何机体组织内异常或延长性质的炎症反应相关的疾病和病症，包括但不限于类风湿关节炎、腱炎、炎性肠病、溃疡性大肠炎、科罗恩病、硬化性胆管炎；

2.与血管壁内退化性变化相关的疾病和病症，包括但不限于通常称为心血管疾病的综合征(包含动脉粥样硬化病、粥样斑、冠状动脉病、中风、心肌梗塞、血管成形术后的再狭窄、高血压性血管疾病、恶性高血压、血栓闭塞性脉管炎、纤维肌性发育异常)；

3.与异常免疫应答相关的疾病和病症，包括但不限于皮肌炎和硬皮病；

4.免疫失衡，包括与H.I.V.或其它病毒性感染因素或细菌感染因素相关的免疫缺陷以及与未成熟或衰老相关的免疫缺陷。

D.与细胞功能降低相关的疾病或病症，包括对生长信号降低的反应和 增加的细胞死亡率

这些包括：

1.表征为皮内退行性改变的光化损伤，包括但不限于日光角质化、光过敏性疾病和起皱；

2.表征为异常免疫应答的自身免疫疾病，包括但不限于多发性硬化症、I型糖尿病、系统性狼疮红斑病和胆汁性肝硬变；

3.表征为神经系统结构退化性改变的神经退化性疾病和病症，包括但不限于帕金森病、阿耳茨海默氏病、肌肉发育不良、Lou-Gehrig病、运动神经原疾病；

4.与眼内的退行性改变相关的疾病和病症，包括但不限于白内障、黄斑变性、视网膜萎缩。

E.与类固醇生成和生殖激素功能障碍或异常相关的疾病和病症

这些包括：

1.与雌激素/雄激素失衡相关的女性疾病，包括但不限于周期性的乳腺痛、痤疮、痛经、子宫纤维瘤、子宫内膜异位、卵巢囊、月经前综合征、急性绝经期综合征、骨质疏松、老年痴呆、不孕；

2.与异常雌激素/雄激素失衡相关的男性疾病，包括但不限于良性前列腺肥大、不育、男子乳腺发育、遗传性脱发和其它各种形式的脱发。

在研究的重要领域中，本发明人一直在研究细胞增殖和影响细胞有丝分裂能力的因素。一个与有丝分裂相关的重要酶族为拓扑异构酶，其任务是在有丝分裂前组织DNA。

更具体地说，DNA拓扑异构酶构成一族保守的必需酶，这些酶能解决DNA复制、转录和重组过程中的拓扑问题。哺乳动物的I型酶(或拓扑I)是不依赖ATP的DNA单链核酸内切酶和连接酶，其主要在转录过程中起作用。哺乳动物II酶(或拓扑II)的代表是两种同工型(α和β)，它们是ATP依赖性的DNA双链核酸内切酶和连接酶。拓扑IIα是染色体基质的主要成分，它在DNA复制过程中解开双链DNA。拓扑IIα的表达是细胞周期调节性的和增殖依赖性的，而拓扑I和拓扑IIβ的表达在整个细胞周期中相对恒定且不依赖于增殖[3]。

拓扑II的抑制通常发生于(a)稳定拓扑II酶与DNA之间的瞬时反应中间体(称为可裂解的复合体)或(b)阻碍其形成[4]。能稳定可裂解的复合体的拓扑II抑制剂称为拓扑II毒剂，有代表性的抑制剂为抗肿瘤药物如VP-16(依托泊甙)和阿霉素。不能稳定可裂解的复合体的拓扑II抑制剂称为催化性抑制剂，其代表有如阿柔比星和merbarone的试剂，这些试剂可能作为癌症治疗剂应用或不能作为癌症治疗剂应用。

拓扑II毒剂由于产生逃避修复过程的双链裂解而具有细胞毒性作用。含有高水平拓扑II的肿瘤细胞对拓扑II毒剂的细胞毒性作用较通常含极低水平拓扑II的正常的、非分裂中的细胞更为敏感[5-8]。

以前，曾将大豆异黄酮金雀异黄素确定为拓扑II毒剂，因为它能抑制拓扑II的催化活性并能稳定可裂解的复合体[4，9-13]。在这方面，当浓度较高时金雀异黄素可用作抗肿瘤药物[14]，而且与许多其它抗肿瘤药物一样它会促进人白血病的形成[15]。

因此，仍需要寻找对哺乳动物，尤其是人的健康具有重要的生理活性的新的或改进的化合物和组合物，以及寻找利用这些性质来治疗、改善以及预防疾病的新方法。

本发明人出乎意料地发现脱氢牛尿酚是一种有效的拓扑II毒剂，它与拓扑异构酶/DNA可裂解的复合体上的新位点结合。这提供了脱氢牛尿酚及其衍生物在肿瘤化疗的新应用以及提高已知的拓扑II毒剂的抗肿瘤效果中的用途。

完全预料不到本发明的异黄-3-烯和异黄烷化合物，尤其是脱氢牛尿酚，会如此特异地和有效地通过与可裂解的复合体新的结合构型抑制DNA拓扑异构酶II，由此显示了它们在预防或治疗相关的哺乳动物疾病、病症和机能方面的潜力。

现在申请人第一次表明了脱氢牛尿酚是拓扑II特异性毒剂。已发现脱氢牛尿酚既不抑制拓扑I的催化活性也不俘获拓扑I-可裂解复合体。脱氢牛尿酚对拓扑II的特异性使其与以拓扑II为靶点的最广泛的处方抗肿瘤药归于同一类别[16]。正常细胞和肿瘤细胞中拓扑I的水平相对一致。相反，快速分裂的肿瘤细胞中拓扑II的水平高出很多。因此，作为拓扑II毒剂的物质的细胞毒作用主要针对于肿瘤细胞，而兼为拓扑I和II毒剂的试剂可能对正常细胞也具有细胞毒作用。这与申请人观测到的脱氢牛尿酚对正常健康组织的低毒性相一致。

脱氢牛尿酚在体外通过稳定可裂解的复合体而促进拓扑II介导的DNA断裂的能力与目前用于癌症化疗的其它拓扑II毒剂的效果相当。其中一种药物是VP-16，它用于治疗小细胞肺癌物，使70％患者的症状缓解，并被认为是“纯”拓扑II毒剂[17]。

申请人出乎意料地发现脱氢牛尿酚在20μg/ml的浓度时产生了可检测到的拓扑II介导的线性质粒DNA。其浓度低于能产生同样的DNA裂解的金雀异黄素的浓度(30μg/ml)。脱氢牛尿酚的效果与VP-16相似。

拓扑II毒剂，包括VM-26、VP-16、阿霉素、安丫啶和几种食物中的生物类黄酮，代表了一类将正常酶(拓扑II)转化为细胞毒剂的拓扑II抑制剂。拓扑II、DNA和药物形成的三元复合体，最初可由DNA重新连接或DNA修复逆转[4]。细胞对累积的三元复合体的处理激活了形成大小为300-600kb结合蛋白质的DNA片段的不可逆步骤[18]。这一不可逆步骤后，caspase3被激活，引起特征为核酸内切性DNA裂解的凋亡。这样，DNA复制或转录后，这些拓扑II毒剂将可裂解的复合体转化成致命的损伤[17，19]。肿瘤细胞对拓扑II抑制剂的敏感性与核内拓扑II水平密切相关[5，7，8]。由于快速分裂的肺癌、乳腺癌、卵巢癌和恶性淋巴瘤细胞通常表达的拓扑II水平较正常的非分裂的细胞高出很多，因此前者对拓扑II毒剂的毒害作用更敏感。此外，降低的拓扑II活性与细胞分化相关[4，9]。基于脱氢牛尿酚对拓扑II活性的影响，期望该试剂诱导肿瘤细胞分化以及激活凋亡途径。脱氢牛尿酚的生物作用与其抑制拓扑II并导致双链DNA裂解的能力一致。

拓扑II的催化性循环可分为六个不连续的步骤：1)拓扑II与DNA结合，2)双链DNA的裂解，3)双链在断点穿过，4)裂解的DNA重新连接，5)ATP水解，和6)酶周转[20]。

拓扑II毒剂的临床应用取决于催化性循环中被抑制的确切步骤。申请人在本专利中已确定脱氢牛尿酚俘获可裂解的复合体，但是仍不清楚是通过增强裂解的步骤、通过抑制重新连接的步骤还是通过两个步骤的结合来实现该行为的。还不清楚脱氢牛尿酚是与拓扑II、DNA结合，还是与拓扑II/DNA复合体相结合。

拓扑II毒剂如柔红比星、阿霉素、安丫啶、玫瑰树碱和米托蒽醌是DNA嵌入剂[21]。其它拓扑II毒剂如VP-16、VM-26、clerocidin和salvicine并不嵌入DNA[21，22]。脱氢牛尿酚及其衍生物的临床应用包括与其它化疗剂的协同组合物和它在治疗对目前给予的化疗试剂产生耐药性的患者中的用途。也就是说，脱氢牛尿酚与拓扑II的结合位点不同于已知的拓扑II毒剂，如VP-16，已发现将它用于治疗表达拓扑II变异形式的肿瘤，这种肿瘤不与已知的拓扑II毒剂结合并因此能面受其细胞毒作用。

例如，NAD(P)H氧化酶(NOX)蛋白在Morre等(2002)Biochemistry，Vol.41 No.40，11941-11945[24]中作了描述。动物细胞外表的这样的NADH氧化酶显示了具有与时钟相关的、可携带的和24分钟的温度补偿周期的稳定的和重现的振动模式。这些蛋白的特征是具有以往的生化文献中从未提及的独特的两种生化活性：对苯二酚(NAD(P)H)氧化以及蛋白质的二硫化物-硫醇形式的交替变化(Morré等见上)。这样的蛋白因其细胞表面的位置可称为ECTO-NOX蛋白，(Morré，D.J.(1995)Biochim.Biophys.Acta.1240，201-208[25])。组成型的ECTO-NOX，命名为CNOX，对激素有反应，而对醌-位点抑制剂不起反应。与肿瘤细胞相关的NOX(tNOX)是不受激素和生长因子调节和起反应，而对抑制剂有反应(Morré，D.J.(1998)，Plasma Membrane Redox Systems and Their Role inBiological Stress and Disease(Asard等编辑)，121-156页，KluwerAcademic Publishers，Dordrecht，the Netherlands[26])。CNOX蛋白广泛分布并表现出周期为24分钟活性振动。另一方面，tNOX蛋白是癌细胞所特有的，并表现出周期为22分钟的活性振动，较CNOX短了2分钟(Wang等(2001)Biochim.Biophos.Acta.1539，192-204[27])。

NOX蛋白的二硫化物-硫醇之间的相互变化活性使细胞增大，当这被抑制时导致凋亡。本发明人已表明了式II化合物，如脱氢牛尿酚，是阻滞tNOX的二硫化物-硫醇之间相互交换从而阻滞细胞增大的强效抑制剂。所得的小细胞不能分裂、经历G1细胞周期停滞从而导致凋亡。式(II)化合物，如脱氢牛尿酚选择性地抑制tNOX，而不抑制tNOX。在治疗包括实体瘤和转移瘤的癌症中，此选择性被认为具有特殊的治疗意义。

申请人已发现式(II)化合物，包括脱氢牛尿酚，可抑制基质降解酶，如金属蛋白酶，尤其是基质金属蛋白酶。与疾病，如肿瘤生长及炎症相关的血管生成依赖于基质金属蛋白酶的合成和分泌。因此，本发明化合物在治疗与血管生成和炎症相关的疾病中可用于抑制基质金属蛋白酶。

本发明的异黄-3-烯和异黄烷化合物以上述的通式II表示。本发明优选的化合物为通式III：

其中

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆、R₇和R₈定义如上；

更优选地

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇独立为氢，羟基，OR₉、OC(O)R₁₀、C(O)R₁₀、COOH、CO₂R₁₀，烷基，卤烷基，芳烷基，芳基，硫基，烷硫基，氨基，烷氨基，二烷基氨基，硝基或卤素，

R₈是氢，羟基，烷基，芳基，其中R₁₃如前定义的COR₁₃，或其中R₁₄如前定义的CO₂R₁₄，

R₉是烷基，卤烷基，芳烷基，或其R₁₃如前定义的C(O)R₁₃，且

R₁₀是氢，烷基，氨基，芳基，氨基酸，烷基氨基或二烷基氨基，

更优选地

R₂是羟基，OR₉、OC(O)R₁₀或卤素，

R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇独立是氢，羟基，OR₉、OC(O)R₁₀、C(O)R₁₀、COOH、CO₂R₁₀，烷基，卤烷基，或卤素，

R₈是氢，

R₉是烷基，芳烷基，或其中R₁₃如前定义的C(O)R₁₃，且

R₁₀是氢或烷基，

且更优选地

R₂是羟基，甲氧基，苄氧基，乙酰氧基或氯，

R₁、R₃、R₄、R₅、R₆和R₇独立是氢，羟基，甲氧基，苄氧基，乙酰氧基，甲基，三氟甲基或氯，且

R₈是氢，

其中上述化合物包括其药学上可接受的盐。

此外本发明特别优选的化合物选自1至40的异黄-3-烯化合物：

在本发明最优选的实施方案中的化合物为化合物1，脱氢牛尿酚。

本发明更优选的化合物如通式IV：

其中

R₁、R₂、R₃、R₄、R₅、R₆，R₇和R₈定义如上。

在更特别优选实施方案中本发明的化合物为通式IV的异黄烷化合物，其与上述的异黄-3-烯相似物直接相对应。这些编号为41至80的化合物中，化合物1至40的3-烯吡喃环中的双键现在分别变成单键。

本发明优选的化合物还包括所有衍生物和前药，其具有可在体内生理环境中可从其所连接的异黄烯、异黄烷或衍生物分子上裂解的离去基团。离去基团包括酰基，磷酸，硫酸，磺酸，以及优选地单-，二-或全-酰基氧基取代的化合物，其中一个或多个侧羟基被酰基，优选乙酰基保护。典型地酰氧取代的异黄烯及其衍生物易于裂解成相应的羟基取代的化合物。此外，对本发明的异黄烯化合物和衍生物的官能团的保护可按照文献例如T.W.Greene，Protective Groups in Organic Synthesis，John Wiley& Sons，New York，1981中描述的方法进行。

本发明化合物包括一种或多种此类化合物。本发明化合物的用途包括此类化合物自身的、与赋形剂和/或稀释剂合用的、和/或与一种或多种另外的活性剂合用的用途。

术语“烷基”包括碳原子数为1至10，优选1至6的直链、支链和环状(5个或更多的碳原子)饱和的烷基，如甲基，乙基，丙基，异丙基，丁基，异丁基，仲丁基，叔丁基，戊基，环戊基等。烷基优选甲基，乙基，丙基或异丙基。烷基任选地被一个或多个氟，氯，溴，碘，羧基，C₁-C₄-烷氧羰基，C₁-C₄-烷氨基羰基，二-(C₁-C₄-烷基)-氨基-羰基，羟基，C₁-C₄-烷氧基，甲酸基，C₁-C₄-烷基-羰氧基，C₁-C₄-烷硫基，C₃-C₆-环烷基或苯基取代。

术语“链烯基”包括碳原子数为2至10，优选2至6的直链、支链和环状(5个或更多的碳原子)的至少有一个双键的烃，如乙烯基，1-丙烯基，2-丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，2-甲基-1-丙烯基，2-甲基-2-丙烯基等。链烯基可任选地被一个或多个氟，氯，溴，碘，羧基，C₁-C₄-烷氧羰基，C₁-C₄-烷氨基羰基，二-(C₁-C₄-烷基)-氨基-羰基，羟基，C₁-C₄-烷氧基，甲酸基，C₁-C₄-烷基-羰氧基，C₁-C₄-烷硫基，C₃-C₆-环烷基或苯基取代。

术语“炔基”包括碳原子数为2至10优选2至6的直链或支链的至少有一个三键的烃，如乙炔基，1-丙炔基，2-丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基等。炔基更优选乙炔基，1-丙炔基或2-丙炔基。炔基可任选地被一个或多个氟，氯，溴，碘，羧基，C₁-C₄-烷氧羰基，C₁-C₄-烷氨基羰基，二-(C₁-C₄-烷基)-氨基-羰基，羟基，C₁-C₄-烷氧基，甲酸基，C₁-C₄-烷基-羰氧基，C₁-C₄-烷硫基，C₃-C₆-环烷基或苯基取代。

术语“芳基”包括苯基，联苯基和萘基，可任选被一个或多个C₁-C₄-烷基，羟基，C₁-C₄-烷氧基，羰基，C₁-C₄-烷氧羰基，C₁-C₄-烷羰氧基或卤素取代。

术语“杂芳基”包括环中含有至少一个氧、硫或氮的五元和六元环，其中，该环可任选与其它芳环或杂芳环稠合，这类芳环或杂芳环包括但不限于呋喃基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、咪唑基、四氮唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、喹啉基、异喹啉基、嘌呤基、吗啉基、噁唑基、噻唑基、吡咯基、黄嘌呤基、嘌呤、胸腺嘧啶基、胞嘧啶基、尿嘧啶基和异噁唑基。杂芳基可任选地被一个或多个氟、氯、溴、碘、羧基、C₁-C₄-烷氧羰基、C₁-C₄-烷氨基羰基、二-(C₁-C₄-烷基)-氨基-羰基、羟基、C₁-C₄-烷氧基、甲酸基、C₁-C₄-烷基-羰氧基、C₁-C₄-烷硫基、C₃-C₆-环烷基或苯基取代。如果需要，杂芳基可部分或全部氢化。

术语“卤”包括氟，氯，溴和碘，优选氟和氯，更优选氟。例如“卤烷基”包括单卤代，双卤代以直至全卤代的烷基。优选的卤烷基是三氟甲基和五氟乙基。

本文中所用术语“药学上可接受的盐”是指负载电荷的有机或无机基团，且可与药物试剂一同给药，例如作为盐中的对应-阳离子或对应-阴离子。药学上可接受的阳离子为本领域技术人员已知的阳离子，包括但不限于钠、钾、锌和季铵。药学上可接受的阴离子为本领域技术人员已知的阴离子，包括但不限于氯离子、乙酸根、柠檬酸根、碳酸氢根和碳酸根。

术语“药学上可接受的衍生物”或“前药”是指应用于受试者时能直接或间接提供母体化合物或代谢物的活性化合物的衍生物，或其自身显示活性的化合物。

本文中所用的术语“治疗”、“预防”或“防止”，“改善”等应被认为具有其最广泛的含义。特别地，术语“治疗”并不一定意味着治疗动物至完全康复。因此，“治疗”包括改善具体的疾病的症状或严重程度或防止或以其它方式降低具体疾病发展的危险。

一种或多种本发明的式II化合物的治疗量依赖于许多因素，包括具体的应用、所用具体化合物的特性、所治疗的疾病、给药的方式以及患者的病情。式II化合物可以按实践中的常规方式和剂量给药。例如，参见Goodman和Gilman，等(1995)The Pharmacological Basis ofTherapeutics第8版。所用的具体剂量取决于治疗的病情、患者的状态、给药途径和上面所述的其它因素。通常，每一患者的日剂量为0.1mg至5g；典型地为0.5mg至1g；优选地为50mg至200mg。在一周至数月至数年的治疗期间，给药的时间根据需要而定，可从每天或每两天单剂量给药一次到每天两次或三次。这取决于治疗或缓解的病情的严重程度。进一步可理解为，对于具体的患者，具体的剂量方案应根据个体需要和服用该组合物和监督该组合物服用的人的专业判断随时进行调整。

用活性化合物进行相对短时间的治疗可引起无法经血管成型术或外科手术治疗的冠状动脉病变稳定或收缩。较长时间的治疗可用于预防高危患者的晚期病变的发展。

生产用于治疗本文中描述的适应症的药物组合物，典型的是通过将本发明的化合物(为了方便，此后称为“活性化合物”)与一种或多种本领域熟知的药学上或兽药学上可接受的载体和/或赋形剂混合制备。

当然，从相容的角度讲载体必需为制剂中任何其它成分所接受，必需对患者无害。载体或赋形剂可以是固体或液体，或既有固体也有液体，优选地与化合物配制成单位剂量，例如，含高至100％重量的活性化合物，优选0.5％至59％重量的活性化合物的片剂。可将一种或多种活性化合物混合于本发明制剂中，可用任何已知的药学技术制备，这些技术基本上为混合各成分，任选地包括一种或多种辅助成分。药物组合物中活性化合物的优选浓度取决于药物的吸收、分布、失活，和排泄速率，以及其它本领域技术人员已知的因素。

本发明的制剂包括适于经口、直肠、眼部、口腔(例如，舌下)、胃肠道外(例如，皮下、肌内、真皮下或静脉内)以及透皮给药的剂型，尽管任一特定情况下最适宜的途径取决于所治疗的病情的特性和严重程度以及所用的具体活性化合物的特性

适于口服的制剂可以为分散单元，如胶囊、药囊、锭剂或片剂，每个单元均含预定量的活性化合物；粉末或颗粒；水或非水液体中的溶液或混悬液；或水包油或油包水的乳剂。这些制剂可用任何适当的制药方法制备，这些方法包括将活性化合物与适宜载体(可包含一种或多种上述的辅助成分)结合的步骤。通常，制备本发明制剂时，将活性化合物与液态载体或细分的固态载体或两者均匀密切地混合，然后，如果需要将所得混合物塑形形成单位制剂。例如，制备片剂时，将包含活性化合物的粉末或颗粒及任选地一种或多种辅助成分压缩或模压。制备压制片时，可在适宜的机器中压制自由流动的化合物，如粉末或颗粒，任选地与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂，和/或表面活性剂/分散剂混合。制备模压片时，可在适宜的机器中将惰性液态粘合剂润湿的粉末状化合物模压。

适于口腔(舌下)给药的制剂包括在通常为蔗糖和阿拉伯胶或西黄耆胶的甜味基质中含有活性化合物的锭剂(lozenge)，和在如明胶和甘油或蔗糖和阿拉伯胶的惰性基质中含有化合物的锭剂(pastille).

适于方便地胃肠外给药的本发明的组合物含有活性化合物的无菌水溶液制剂，这些制剂优选为接受者血液的等渗溶液。尽管这些制剂经皮下、肌内或真皮内注射也有效，但优选静脉内给药。这样的制剂可通过将化合物与水或甘氨酸缓冲液混合并使得所得溶液无菌且与血液等渗而方便的制备。本发明注射剂通常含0.1％至60％ w/v的活性化合物，以0.1ml/min/kg的速度给药。

适于直肠给药的制剂优选为单位剂量的栓剂。可通过将活性化合物与一种或多种常规的固体载体，例如可可油混合然后将所得化合物成形而制备。

适于局部给药于皮肤的制剂或组合物优选采用软膏、乳膏、洗剂、糊剂、凝胶剂、喷雾剂、气雾剂或油的形式。可使用的载体包括凡士林、羊毛脂、聚乙二醇、乙醇，及其中两种或多种的混合物。通常，活性化合物的浓度为0.1％至5％w/w，更特别地自0.5％至2％w/w。这样的组合物的例子包括化妆用的皮肤乳膏。

适于透皮给药的制剂可为分散的贴剂，其适于与接受者外皮在较长时间内紧密接触。这样的贴剂合适地包含任选缓冲的水溶液(例如0.1M至0.2M浓度)的形式存在的活性化合物。

适于透皮给予的制剂还可通过离子电渗透法(参见，例如，Panchagnula R等，2000 Transdermal iontophoresis revisited CurrentOpinion Chemical Biology Vol 4，Issue 4，468-473页)输送，典型地采用活性化合物的任选缓冲的水溶液的形式。适宜的制剂含有柠檬酸或Bis/Tris缓冲液(pH 6)或乙醇/水并含0.1M至0.2M的活性成分。

适于吸入的制剂可以溶液、混悬液或乳液的喷雾组合物的方式输送。该吸入性喷雾组合物还可含有药学上可接受的推进剂，如二氧化碳或一氧化二氮。

活性化合物可以食物的形式提供，如加入、混入、包被、合并或以其它方法加至食物中。术语食物使用了其最广泛的含义，包括液体形式，如饮料(包括乳酪产品)和其它食物，如健康面包条(health bars)、甜点等。包含本发明化合物的食物制剂可通过常规的操作轻易地制备。

治疗方法，用途和组合物可应用到人或动物，包括哺乳动物如宠物和家养动物(如狗和猫)以及家畜动物(如牛、绵羊、猪和山羊)、鸟类(如鸡、火鸡、鸭子)等。

活性化合物或其药学上可接受的衍生物前药或盐还可与不损害其所需作用的其它药学上的活性物质，或与能增补所需作用的物质，如抗菌、抗真菌、抗炎或抗病毒化合物共同给药。活性制剂的合用或协同混合物中可含有两种或多种异黄酮或其衍生物。活性化合物还可与如下试剂合用：降脂试剂，如普罗布考和烟酸；血小板凝集抑制剂，如阿司匹林；抗血栓剂，如香豆素；钙通道阻滞剂，如维拉帕米，地尔硫卓，和硝苯地平；血管紧张素转化酶(ACE)抑制剂，如卡多普利和依那普利，以及β-阻滞剂，如萘心安、特布他林和拉贝洛尔。这些化合物还可与非甾类抗炎药，如布洛芬、吲哚美辛、阿司匹林、非诺洛芬、甲芬那酸、氟灭酸和舒林酸联合给药。这些化合物还可与皮质激素合用。

在本发明的一个重要方面中，将式II化合物与另一种细胞毒剂或化疗试剂，和，特别是还可稳定可裂解的复合体或阻碍其形成的物质复合。优选的物质为VP-16(依托泊甙)和阿霉素试剂，然而本发明的这方面并不必限于这两种已知的物质。这些化合物被认为显示了抗癌细胞和肿瘤协同活性。不希望受理论的限制，此协同被认为是基于本发明化合物与新的拓扑II位点结合的能力。这样，式II化合物应用于其细胞表达对现有的拓扑II毒剂有耐药性的突变体形式拓扑II的癌症治疗。

联合给药可以同时进行或相继进行。同时给药由同时或近乎同时给予的同一单位剂量或各自不同单位剂量的化合物的实现。相继给药应根据需要以任何顺序给药，典型地将需要首次或最初的活性试剂的生理效果持续到给予第二次或后一次活性试剂时，这里尤为需要累积的或协同的效果。

合成

式II化合物的合成可采用多种路线。具体参考了国际专利申请WO00/49009和其中引用的参考文献，在此全部引入作为参考。此国际申请描述了由简单易得的起始原料制备异黄烯的改进方法。方便的起始原料是通过已知的合成路线易于得到的大豆黄素。

在常规的合成中，将大豆黄素以其二-乙酯的形式保护，然后脱氢得到几乎定量的四氢大豆黄素二乙酯。这种通用的合成方法通过将相应的异黄酮氢化，可得到干净且几乎定量的其它异黄烷-4-醇化合物。

使用标准试剂，如强酸或P₂O₅等使异黄烷-4-醇脱氢生成本发明的不饱和的异黄-3-烯。该脱氢反应可直接对氢化产物进行，也可在对其去保护的衍生物进行。

脱氢牛尿酚(I)的合成可通过在温和条件下去除乙酰氧保护基来实现。其它异黄-3-烯衍生物可据相似的方法制备。

本发明所用的异黄烷可通过将异黄-3-烯或异黄酮氢化或根据文献中已知的其它方法轻易地制备。

本发明所用的异黄-3-烯还可以由本领域技术人员易于确认的任何来源的异黄酮合成。优选地，它们自植物源的浓缩物或提取物的形式中获得。而且，本领域技术人员能轻易地鉴定合适的植物种属，例如本发明中具有使用的植物包括豆科植物。更优选地，异黄酮提取物来源于鹰嘴豆、扁豆、菜豆、红三叶草或地下三叶草属等。

现在将参照下面的非限定性实施例描述本发明。

实施例1

材料和方法

对脱氢牛尿酚作为拓扑异构酶的潜在抑制剂进行了评价，通过松弛和缺刻测试鉴定拓扑I抑制剂，通过开结和DNA裂解测试鉴定拓扑II抑制剂。脱氢牛尿酚以剂量依赖的方式抑制拓扑II的催化活性并稳定拓扑II介导的可裂解复合体，表明该试剂是一种拓扑II毒剂。脱氢牛尿酚的拓扑II抑制活性与其它抗肿瘤试剂，如VP-16相当，且强于金雀异黄素。脱氢牛尿酚不抑制拓扑I的催化活性也不稳定拓扑I介导的可裂解复合体。这些结果表明脱氢牛尿酚是拓扑II特异性毒剂并证明了其可应用于癌症化疗。

脱氢牛尿酚抑制拓扑II而非拓扑I的催化活性

逐步去除DNA结(开结)需要短暂的双链断裂，之后链通过断点并重新连接。II型拓扑异构酶独特地催化此反应。脱氢牛尿酚对拓扑II催化活性的影响示于图1。来源于突变体噬菌体(P4 Virl dell0)的开结DNA用作移动为污斑的反应底物(因为可变的结数)。在拓扑II存在下，拓扑DNA结消除，反应产物(开结的DNA)以单一条带移动。脱氢牛尿酚以剂量依赖的方式抑制该反应，如图1所示。显然100μg/ml的脱氢牛尿酚完全抑制该反应。根据对开结条带的密度测量可确定脱氢牛尿酚50％抑制浓度(IC₅₀)约为20μg/ml。脱氢牛尿酚的效果与用作阳性对照的VP-16效果相当。

为了确定脱氢牛尿酚是否是拓扑II的选择性抑制剂，在不含ATP的拓扑I介导的质粒DNA松弛试验中对其效果进行了评价。拓扑II也可松弛超螺旋的质粒DNA，但需要ATP。图2显示了纯化的人拓扑I能松弛超螺旋的质粒DNA(泳道2)。喜树碱，一种已知的拓扑I抑制剂，阻止pUC8 DNA松弛(泳道3)，但浓度高达100μg/ml的脱氢牛尿酚并不抑制这种拓扑I催化的反应(泳道4-8)。这些结果表明脱氢牛尿酚不抑制拓扑I，因此是拓扑II的特异性抑制剂。

脱氢牛尿酚诱导拓扑II介导的双链DNA断裂但不诱导拓扑I介导的单链DNA断裂

采用线性化测试法确定脱氢牛尿酚是否拓扑II毒剂。双链断裂生成线性DNA。在拓扑II存在下，使用脱氢牛尿酚并接着使用蛋白激酶K/SDS处理，有效地生成线型质粒DNA(图3，泳道2-4)，表明其稳定了可裂解复合体。在10μg/ml明显出现此效果，在30μg/ml达到峰值。在不含拓扑II(泳道2)或蛋白激酶K/SDS(未显示)时，脱氢牛尿酚不生成线性DNA。脱氢牛尿酚对拓扑II介导的DNA链断裂的此作用出乎预料的较金雀异黄素(泳涎5)强许多，并与用作阳性对照的VP-16相当(泳道6)。既然释放DNA断裂必需使酶变性或消化，这些数据表面了脱氢牛尿酚诱导的DNA断裂由拓扑II介导。

拓扑I毒剂捕获酶-DNA反应中间体，消化这些酶后，产生单链DNA断裂(缺口)。在示于图4的试验种所用的电泳条件下，共价键闭合的环状(超螺旋态或松弛态)质粒DNA迁移到凝胶的底端。在稳定可裂解复合体的拓扑I毒剂存在下，并随后使用蛋白激酶K/SDS使酶变性或降解，所得的缺口DNA迁移到凝胶的顶端。20和100μg/ml的脱氢牛尿酚没有生成缺口的DNA(泳道3和4)。喜树碱，一种已知的拓扑I抑制剂，如所期望地生成由增加的缺口形式的DNA显示的单链DNA裂解片(泳道5和6)。这些结果表明脱氢牛尿酚不具备抑制拓扑I的作用，因此是拓扑Ⅱ的特异性毒剂。

材料

噬菌体P4 Virl dell O如前所述分离[23]。pUC8 DNA通过碱水解的方法自大肠杆菌分离。试剂，测试缓冲液，人拓扑I，人拓扑Ⅱ，以及pRYGDNA购自Topogen(Columbus，OH)。脱氢牛尿酚由Novogen(North Ryde，NSW)提供。金雀异黄素购自Indofine Chemical Co.(Somerville，NJ)。其它所有试剂，化学品，和药物购自Sigma Chem.Co.(St.Louis，MO)。贮液在浓度为20mg/ml的DMSO中制备，在-20℃贮存，在测试前使用蒸馏水稀释。

拓扑I介导的质粒松弛测试

为了测定拓扑异构酶(拓扑)I的催化活性，使用pUC8 DNA作为底物，反应液体积为20μl，包含：10mM Tris-HCl，pH 7.9，1mM EDTA，150mM NaCl，0.1％BSA，0.1mM亚精胺，5％甘油，和2单位纯化的人拓扑I。操作时，抑制剂按照说明加入，反应自加入酶起始。在37℃下反应30分钟。在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中以4V/cm速度进行5小时凝胶电泳。为了定量测定拓扑I活性，扫描照相底片。确定代表超螺旋DNA，在凝胶底端以单带迁移的区域。抑制50％超螺旋DNA转化为松弛DNA的抑制剂的浓度(IC₅₀值)经至少三次试验的平均值确定。

拓扑I介导的质粒-切断测试

拓扑I毒剂在由酶的提供者(Topogen，Inc.)提供的反应条件下增强拓扑I介导的pUC8 DNA断裂。简言之，20μl的反应混合物包含10mMTris-HCl，pH 7.5，1mM EDTA，100mM NaCl，测试试剂(或溶剂)1μl，0.5μg的pUC8，和10单位的人拓扑I(最后加入)。于37℃下孵育30分钟后，加入SDS-蛋白激酶K，于37℃下孵育30分钟后，使用CHCl₃-异丙醇提取样品并在包含0.5μg/ml溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上进行电泳。对凝胶照相，并扫描照相底片。

拓扑II介导的P4开结测试

为了测定拓扑异构酶(拓扑)II的催化活性，使用自噬菌体P4Virldell 0的无尾病毒壳体中分离的打结的DNA作为底物。反应混合物包含50mM Tris-HCl，pH 8.0，120mM KCl，10mM MgCl₂，0.5mM ATP，和0.5mM二硫苏糖醇。加入2单位的人拓扑II之前加入拓扑II抑制剂。反应(终体积为20μl)自加入0.6μg的打结DNA开始，在37℃下反应30分钟。加入5ml包含5％SDS，50mM EDTA，25％菲科林，和0.05mg/ml溴酚蓝的停止液终止反应。样品加样于0.8％的琼脂糖凝胶上，在Tris-硼酸-EDTA缓冲液中以4V/cm速度进行5小时凝胶电泳。凝胶经溴化乙锭染色，退色，在UV光源下照相。为了定量测定拓扑II活性，经密度测量法扫描照相底片。采用此方法测量以单带迁移到凝胶顶端的开结DNA。抑制50％底物(打结DNA)转化为反应产物(开结DNA)的抑制剂的浓度(IC₅₀值)自标准曲线确定。平均三至四次同样试验确定IC₅₀值。

拓扑II介导的质粒直线化测试

拓扑II毒剂增强拓扑II介导的DNA断裂并在由酶的提供者(Topogen，Inc.)提供的反应条件下进行确定。简言之，20μl的反应混合物中包含30mM Tris-HCI，pH 7.6，3mM ATP，15mM(β-巯基乙醇)，8mM MgCl₂，60mM NaCl，1μl的测试物(或溶剂)，0.3μg的pRYG，和10单位的人拓扑II(最后加入)。于37℃下孵育15分钟后，加入SDS-蛋白激酶K，于37℃下孵育15分钟后，使用CHCl₃-异丙醇提取样品并在包含溴化乙锭的1％琼脂糖凝胶上进行电泳。对凝胶照相，并扫描照相底片。

实施例2

tNOX抑制、肿瘤细胞周期阻滞和凋亡

使用包含存在于二硫基二吡啶底物中的人宫颈癌(HeLa)的96孔板测试。脱氢牛尿酚以10μm的浓度存在时显示出抑制tNOX的活性从而导致HeLa细胞凋亡。后来的临床研究表明了式I和II化合物的治疗益处和活性。

实施例3

苯氧二醇(脱氢牛尿酚)有效的抗肿瘤和抗血管生成的性质

此实施例描述了作为式II化合物代表的脱氢牛尿酚的有效抗肿瘤/抗癌、抗血管生成活性以及抗炎活性。

方法

细胞：按前述方法制备并培养人脐静脉内皮细胞(HUVEC)³⁰。在所有试验中使用第2次传代与第6次传代之间的细胞。人前列腺瘤细胞株LNCaP购自American Tissue Type Collection并按照供应商的说明保存。

测试：

增殖测试：每一明胶包被的微量滴定孔中接种3×10³个HUVEC细胞，并在完全培养基中培养3天。平板接种3小时后加入脱氢牛尿酚(De)。通过MTT测试法(Promega，WI，USA)测量增殖，并给出3天后各组重复测定4次的增殖率±SBM。使用MTT测试法测定LNCaP细胞的增殖。每一微量滴定孔中播种2.5×10³个细胞。平板接种4天后加入De，再经过5天的生长后进行测试。细胞的生存能力用相对于对照组中未处理的细胞的百分率表示。

迁移测试：每一包被明胶的6孔盘中平铺5×10⁵个HUVEC细胞并在48小时内生长汇合。在单层培养基上划一道伤，洗涤细胞3次并加入含有或不含De的(终浓度为10μg/ml)新鲜完整的培养基。在随后的18-72小时内观察迁移。

体外导管测试：基本上按Gamble等描述的方法在胶原凝胶中形成毛细管。在肿瘤促进剂佛波豆蔻酸乙酸酯(PMA)和抗β₁整合素抗体RMACII的存在下形成管。在将细胞平铺在凝胶上时加入De(终浓度为10μg/ml)。

无胸腺小鼠异体移植测试：LNCaP人前列腺细胞皮下移植入无胸腺的Balb/c小鼠，并自接种细胞时开始口服给予De(2mg uid)，每周5天。移植后58天杀死动物并根据NCI中所用的公式(宽度²×长度)/2计算瘤重(mg)。

鞘氨酸激酶活性测试：按以前描述的方法，通过用10μM鞘氨酸-BSA复合体和[γ³²P]ATP(lmM，0.5mCi/ml)将胞质级分于37℃孵育15分钟，体外测定SK活性⁴²。使用TNFα(1ng/ml)(rhTNF-α；R&D Systems，Minneapolis MN USA)、PMA(100ng/ml)和IL-1β(100单位/ml)(hrEL-1β；Immunex，Seattle WA USA)刺激10分钟。在刺激之前使用De或作为对照的DMSO载体处理细胞18小时。

转化灶形成测试：用人ras基因(Ras)或空载体(Vect)对照品转染低传代(Low passage)NIH 3T3细胞¹⁹。两天后将转染的细胞播种于6孔板中。汇合后，细胞在载体DMSO或De(终浓度为10μg/ml)中培养3周，每3-4天更换培养基(±De)。经0.5％结晶紫染色后记录转化灶数。显示了两次试验之一的结果。

RNA印迹分析：每个25cm²烧瓶平铺1×10⁶的HUVEC，使其生长48小时。经DMSO载体或De(终浓度为10μg/ml)处理18小时后，采集全部RNA并根据生产商的方案使用TRIZOL试剂(Invitrogen-LifeTechnologies，Groningen，Netherlands)纯化RNA。使用8μg转移于Hybond-N膜(Amersham Biosciences，Buckinghamshire，England)上的全部RNA进行RNA印迹分析，使用Strip-EZ PCR stripAble PCR Probe合成和去除试剂盒(Ambion，TX，USA)用人MMP-2、GAPDH cDNAs进行探测。

E选择蛋白和VCAM-1测试：每个6孔盘中平铺5×10⁵个HUVEC。加入TNFα(1ng/ml)之前用DMSO载体或De(终浓度为10μg/ml)处理细胞18小时。4或8小时后，用PBS洗涤细胞并用抗E选择蛋白(Mab49-1B11)或VCAM-1(Mab51-10C9)抗体孵育30分钟。然后加入山羊F(ab’)2片段小鼠-IgG(H+L)FITC抗体(Immunotech，Marseille，France)孵育30分钟。然后使细胞受胰蛋白酶作用并在Coulter Epics^RXL-MCL(BeckmanCoulter)上进行FACS分析。结果用相对于FITC荧光平均强度的任意单位表示。

IL-8测试：使用“Quantikine人IL-8免疫测试”进行IL-8测试(R& D Systems，Minneapolis MN USA)。

结果

脱氢牛尿酚(″De″)表现出对白血病细胞株K562和HL60(IC₅₀分别是3.0和1.5μg/ml)、乳腺癌株MCF7(IC₅₀为1.5μg/ml)、结肠癌株HT29和CaCo-2(IC₅₀分别是15.0和1.0μg/ml)以及前列腺癌株DU145，PC3和LNCaP(IC₅₀分别是3.0，2.0和1.5μg/ml)有抗增殖的效果。De作为细胞毒剂对这些细胞株的效力较金雀异黄素强5-20倍。De与金雀异黄素对LNCaP的比较数据示于图1a中。De对LNCaP的体外细胞毒测试显示IC₅₀(μM)为4.4(n＝3独立试验)。前列腺癌株LNCaP的异体移植测试表明De能有效地抑制肿瘤生长(49％肿瘤生长抑制p＜0.0003；De处理组与对照组相比)(图5b)

Ras癌基因通过使正常基因过度表达或突变而与许多人癌症的发展有关^28，29。De处理Ras转化的NIH 3T3细胞完全抑制了克隆的发展，而仍维持正常NIH 3T3细胞的存活能力(图5c)。这表明De特异性地以高增殖的Ras转化的细胞为靶点，而对正常细胞作用很小或没有作用。

实体瘤的生长不仅依赖于转化细胞逃脱控制细胞存活和增殖的正常机制的能力，而且依赖于细胞刺激血管生成过程中血管腔隙扩张的能力。为了确定De除具有抗肿瘤生成的活性外是否具有抗血管生成的能力，在证明体外血管生成的内皮细胞(EC)增殖、迁移和毛细管形成测试中对De进行测试。结果表明De抑制EC功能的所有这些方面(图6a，b和c)。结果以单次试验的结果给出，但是在进行的多次试验中De的抑制作用是一致的。例如10μg/ml De在进行的五次试验中显示了91％±3％的增殖抑制率。结果还表明De对正常EC没有细胞毒性，这是由于在迁移测试中即使在De存在下不在伤口附近的EC仍保持活力72小时。此外，在增殖测试中，De抑制细胞增殖的潜力但并不导致细胞死亡。

在胶原凝胶测试中，使用载体对照处理的细胞显示出在凝胶的不同地方形成典型的大毛细管，这与我们以前的报道相似。然而，对用De处理过的细胞进行形态评价的结果表明De可抑制细胞侵入凝胶，这是因为细胞仍保持圆形，并且在许多小时后仍能在凝胶顶部观察到。EC侵入凝胶以及体内新生血管生成依赖于基质降解酶，如金属蛋白酶的合成和分泌^32，33。基质金属蛋白酶MMP-2是“血管生成开关”所必需的，且抑制它的活性能阻止血管生成³⁴。因此，MMP-2是研究的靶点。使用10μg/ml De处理的内皮细胞的RNA印迹分析的结果表明对MMP-2的RNA水平的抑制(图6d)。在进行的两次试验中，MMP-2的mRNA的水平降低了68.3％和46.7％。

血管生成通常与炎症相关，此时两者似乎表现出协调调节^35，36。炎症的例证有在内皮上粘连分子的表达和影响炎症细胞自循环系统外出的趋化性细胞因子的分泌。炎症细胞，如嗜中性粒细胞、淋巴细胞和单核细胞是许多强效血管生成因子，如血管内皮细胞生长因子的源头³⁵。De抑制了粘连分子E选择蛋白和VCAM-1对内皮上TNF和IL-1的诱导，还抑制了IL-8的分泌(图7a和b)。然而，De没有对EC显示通常的抑制作用，因为De处理后，根据流式细胞仪分析测定(没有显示数据)PECAM-1或VEGF受体2的表达水平没有观察到改变。这样，De既抑制血管生成的过程本身又抑制了增强血管生成的炎症成分。

高度保守的脂质激酶，鞘氨醇激酶(SK)能使鞘氨醇磷酸化产生鞘氨醇-1-磷酸酯，它能促进细胞的存活、生长和转化^37-40，在癌基因如Ras的功能中SK也是调控EC激活和增殖的关键媒介体^42-44。鞘氨醇-1-磷酸酯还涉及血管生成过程^45～47，最近研究表明还涉及VEGF信号传导途径⁴⁸。为了测试De是否至少潜在地通过抑制SK途径而发挥其作用，在存在或不存在De时对SK的活性进行了评估。结果表明(图4)De以剂量依赖的方式抑制由TNF(a)、肿瘤促进子佛波醇豆蔻酸酯乙酸酯(PMA)(b)和IL-1(c)刺激EC产生的SK。De与SK抑制剂N，N-二甲基鞘氨醇抑制活性相当。De对基线水平的SK活性无效，表明了对酶的激活相具有特异作用。De不影响TNF-激活的鞘磷脂酶的活性(未显示数据)，表明De不影响鞘磷脂的代谢途径。

该实施例描述了脱氢牛尿酚(De)强效的抗肿瘤和抗血管生成作用。最惊人的发现是在测量与血管生成相关的内皮功能测试范围内脱氢牛尿酚的效能。这些效能包括对内皮迁移和分解基质所需的酶的表达、增殖、粘连分子的表达以及体外管形成。同样惊人的是在所用的剂量下脱氢牛尿酚对静息的内皮细胞和未转化的3T3细胞缺乏毒性。根据该药物的这些性质可预测它具有强效抗肿瘤作用但只有有限的一般毒性，在这些研究中的确已观察到这样的效果。

引起该药物多种作用的机理尚未完全阐明。然而，它是至少三种相关酶系的强效抑制剂(直接或间接)⁴⁹。前两种酶系，蛋白酪氨酸激酶和拓扑异构酶，长期以来被认为涉及细胞的激活和增殖。我们现在此报道对第三种酶系，脂质激酶鞘氨醇激酶的抑制，最近认为它涉及内皮激活和增殖以及癌生成。我们注意到De的主要作用是抑制由TNF和IL-1等产生的SK的激活。这一结果解释了该试剂的选择性，表现为对转化的瘤细胞和涉及血管生成过程的EC的强烈抑制作用，而对正常细胞，如NIH 3T3或EC的生存能力影响很小或没有影响。这样，De可特异性地以活化相SK为靶点，如在Ras诱导转化过程中发生的或血管生成所必需的EC活化中。这些结果使De作为有效的安全的抗癌剂的前景更显著。

尽管有令人兴奋的抗血管生成的癌症疗法，但许多试验的结果并不令人满意，表明抗血管生成治疗应与其它抗癌方式联合应用。因此，注意到De在体外和体内对几种类的癌细胞具有直接的抑制作用具有重大的意义，这就表明了在一种药物中将抗血管生成和抗癌的性质结合起来了。

为了使读者不需过多的试验就可实施，在此对本发明进行了描述，并提到了某些优选的实例。但是，本领域普通技术人员将很容易地意识到许多成分和参数在不偏差本发明的范围内可作一定程度的变化或改变。此外，提供名称、标题等是为了增强读者对本文的理解，而不应视为对本发明范围的限制。

本文引用的所有申请、专利和出版物的全部公开在此引入作为参考。

本领域技术人员会理解，可对此处描述的本发明是可变化和改变的，除具体的描述外。应理解为本发明包括所有的这类变化和改变。本发明包括在说明书中个别地或整体地提到或指明的所有这些步骤、特征、组合物和化合物，以及任何两个或多个所述步骤或特征的任何和全部的组合。

此说明书前文中任一参考没有，也不应被当作承认了或是暗示了前文是此项工作领域的常规知识。

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Claims (21)

1.一种治疗、预防或改善与异常细胞存活、异常细胞增殖、异常细胞迁移、异常血管生成、雌激素/雄激素失衡、功能不良或异常类固醇生成、包括血管壁内的退化性改变的退化、炎症或免疫失调相关疾病的方法，该方法包括将式II化合物(如本文中定义的)或其药学上可接受的盐或衍生物施用于患者。

2.式II化合物或其药学上可接受的盐和衍生物在制备治疗、预防或改善与异常细胞存活、异常细胞增殖、异常细胞迁移、异常血管生成、雌激素/雄激素失衡、功能不良或异常类固醇生成、包括血管壁内的退化性改变的退化、炎症或免疫失调相关疾病的药物中的用途。

3.一种在表达异常细胞存活表型的细胞中诱导凋亡的方法，该方法包括使任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物或其药学上可接受的盐与所述细胞接触。

4.一种抑制具有异常细胞迁移表型的细胞迁移的方法，该方法包括使任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物或其药学上可接受的盐与所述细胞接触。

5.一种在表达异常血管生成表型的组织中抑制血管生成的方法，该方法包括使任选地与载体或赋形剂结合的式II化合物或其药学上可接受的盐与所述组织接触。

6.一种抑制哺乳动物体内拓扑异构酶II的方法，该方法包括将治疗有效量的式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物施用于哺乳动物。

7.一种治疗、预防或改善哺乳动物癌症的方法，该方法包括使式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物与患肿瘤的哺乳动物体内的癌组织接触的步骤，使得所述癌组织的肿瘤发展被阻滞或阻止。

8.权利要求7的方法，其中肿瘤的发展是通过式II化合物稳定DNA拓扑异构酶II的可裂解复合体而被阻滞或阻止的。

9.一种在表达DNA拓扑异构酶II的细胞中诱导凋亡的方法，该方法包括用任选地与载体或赋形剂结合的一种或多种式II化合物接触所述的细胞。

10.一种抑制DNA拓扑异构酶II的方法，包括使式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物与DNA拓扑异构酶可裂解的复合体接触从而稳定可裂解的复合体。

11.式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物在制备用于治疗哺乳动物癌症的药物中的用途。

12.式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物作为DNA拓扑异构酶II毒剂的用途。

13.一种治疗癌症的药物组合物，包含式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物和药学上可接受的载体和/或稀释剂。

14.一种协同的药物组合物，包含与另一种化疗活性剂，优选另一种拓扑II毒剂混合的式II化合物。

15.试剂盒，包含式II化合物和另一种化疗活性剂，优选另一种拓扑II毒剂。

16.权利要求1和3-10中任一项的方法或权利要求2、11和12中任一项的用途，其中式II化合物是脱氢牛尿酚。

17.权利要求13或14的药物组合物或权利要求15的试剂盒，其中式II化合物是脱氢牛尿酚。

18.一种治疗、预防或改善哺乳动物癌症的方法，该方法包括使式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物与患肿瘤的哺乳动物体内的癌组织接触，其中式II化合物抑制与所述癌症组织相关的tNOX，这样所述癌组织的肿瘤发展被阻滞或阻止。

19.式II化合物或其药学上可接受的盐或衍生物作为tNOX抑制剂的用途。

20.式II化合物在制备用于抑制与肿瘤细胞相关的tNOX的药物中的用途。

21.一种含有式II化合物与一种或多种其它药学活性成分的药物组合物。

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