JP2010520156A - オキサジニルイソフラボノイド化合物、薬物及び使用 - Google Patents

Abstract

本発明は、オキサジニルイソフラボノイド化合物、及びこれを含有する組成物、それらの調製法、並びに治療薬、特に心保護剤、抗炎症剤、抗酸化剤、及び、化学療法剤としてのそれらの使用を提供する。

Description

本発明は、オキサジニルイソフラボノイド化合物及びこれを含有する組成物に関する。本発明は、さらに、上記化合物を調製する方法、アテローム性動脈硬化、再狭窄及び関連の疾患及び状態 (condition) の治療又は防止において特別の有用性が見られる、治療薬、特に心保護剤、抗炎症剤及び抗酸化剤としてのその使用に関する。この化合物は、化学療法剤としての有用性も示す。

700を超える異なる天然イソフラボンが知られており、その幾つかは、潜在的な治療効果を伴なう生物学的特性を有する。しかしながら、イソフラボン及びその誘導体に関して十分な研究が為され、知識が蓄積されたにもかかわらず、治療的に有用なイソフラボノイド化合物及びその活性の全貌はいまだ理解されていない。また、様々な疾患及び障害の治療、予防、回復、防御及び／又は防止のために、新規の、改善した、又は少なくとも代替的な活性薬剤に対する継続的な需要が存在する。

したがって、動物、特にヒトの健康及び幸福に重要な生理学的特性を示す次世代の化合物に対する要求、並びに疾患の治療、回復及び予防にこれらの特性を利用する新規の方法を見つける要求が存在する。重要なことに、血管疾患及び炎症性疾患、特に血管インターベンションに関連した再狭窄の治療、回復又は予防のために、新規の、改善した、より良好な及び／又は代替的な医薬組成物、薬剤及びレジメンを同定する必要性が大いにある。心保護薬としての化合物、並びに内皮細胞における接着分子の発現及び関連の活動 (related activities) を阻害する方法を求めるさらなる要求が存在する。

癌及び関連疾患を含む細胞の増殖に対して活性がある化合物に対しても要求が存在する。既知の薬剤の望ましくない副作用の幾つかに対処する化学療法剤 (chemotherapeutic agents) がさらに必要である。多種多様の種類の癌に効き、現行の化学療法剤及び治療レジメンに対する増殖細胞の耐性の課題に取り組む治療に新たな選択肢を与える、医師が利用可能な異なる治療法も必要である。他の化学療法薬 (chemotherapeutics) と相乗的に (synergistically)
作用することができる薬剤が強く求められている。

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驚くべきことに、本発明者等は、強い抗炎症性活性及び抗酸化体活性 (anti-inflammatory and anti-oxidant activity) を含む重要な治療活性を示す、一般式 (I) の[6,7-e]-1,3-オキサジニルイソフラボノイド ([6,7-e]-1,3-oxazinyl isoflavonoid) 化合物の新規の群を発見した。したがって、本発明の化合物は、アテローム性動脈硬化、再狭窄、アテローム発生、冠動脈疾患及び関連の状態 (conditions) を治療することが示される。

このようにして、本発明の態様によれば、一般式 (I) のオキサジニルイソフラボノイド化合物が提供される：

式中、
R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、
R₂、R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₅は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₆は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₇は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
R₈は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₉は、アルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
R₁₀は独立して、アルキル又はアリールであり、
Xは、O、NR₁₂
(式中、R₁₂は、アルキル、アリール若しくはアリールアルキルである) 、又はS、好ましくはOであり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれる。

本発明のさらなる態様及び実施の形態によれば、本明細書中で以下に規定の下位式 (sub-formulae) (I-I) 及び (I-II) の化合物を含むオキサジニルイソフラボノイド化合物が提供される。

本発明の別の態様によれば、式 (I) の化合物を調製するプロセスが提供される：

式中、
R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、
R₂、R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₅は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₆は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₇は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
R₈は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₉は、アルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
R₁₀は独立して、アルキル又はアリールであり、
Xは、O、NR₁₂
(式中、R₁₂は、アルキル、アリール若しくはアリールアルキルである) 、又はS、好ましくはOであり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
式 (II) のイソフラボノイド化合物を反応させる工程を含む：

式中、R₂、R₃、R_4,、R₅、R₆、R₇、R₈及びXは、上記で規定されるようなものであり、「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
ホルムアルデヒド及び一級アミン、R₁-NH₂を有し、
式中、
R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、任意で置換することができ、
一般式 (I) の化合物を形成する。

本発明の別の態様によれば、疾患又は障害を治療、防止又は回復する方法が提供され、該方法は、任意で担体及び／又は賦形剤と共に、一つ又は複数の式 (I) の化合物、又はその薬剤的に許容可能な塩若しくは誘導体を被験者に投与することを含む。

本発明の別の態様によれば、疾患又は障害の治療用の薬物の製造における一つ又は複数の式 (I) の化合物、又はその薬剤的に許容可能な塩若しくは誘導体の使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、疾患又は障害の治療、予防又は回復用の薬剤が提供され、この薬剤は、一つ又は複数の式 (I) の化合物、又はその薬剤的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む。

本発明の別の態様によれば、一つ又は複数の医薬品の担体、賦形剤、助剤 (auxiliaries) 及び／又は希釈剤と共に、一つ又は複数の式 (I) の化合物、又はその薬剤的に許容可能な塩若しくは誘導体を含む医薬品組成物が提供される。

本発明の別の態様によれば、活性薬剤を送達する埋め込み式医療機器が提供され、該機器は、任意で一つ又は複数の付加的な活性薬剤と共に、本発明のオキサジニル化合物を含む。一実施の形態において、埋め込み式医療機器は、薬剤溶出ステントである。
本発明のこれらの及び他の側面は、添付の図面と共に明細書及び特許請求の範囲から明らかになる。

図1a及び図1bは、LPSで刺激されたヒト単球によるTNFαの合成に対する、化合物 (1) 及び化合物 (2) の効果を示す図である。 図2は、LPS刺激RAW264.7マウスマクロファージと10μMの試験化合物とをインキュベーションした場合の、媒体単独での処理と比較した、試験化合物による細胞生存率に対する効果を示す図である。 図3は、媒体単独での処理と比較した、試験化合物による、RAW264.7マウスマクロファージにおけるLPS誘導PGE2合成の平均変化を示す図である。 図4は、媒体単独での処理と比較した、試験化合物による、RAW264.7マウスマクロファージにおけるLPS誘導TXB2合成の平均変化を示す図である。 図5は、媒体単独での処理と比較した、試験化合物による、RAW264.7マウスマクロファージにおけるLPS誘導TNFα合成の平均変化を示す図である。 図6は、媒体単独での処理と比較した、試験化合物による、RAW264.7マウスマクロファージにおけるLPS誘導NO合成の平均変化を示す図である。 図7a、図7b及び図7cは、VCAM-1、ICAM-1及びE-セレクチンに関して、接着分子のmRNAの発現に対する化合物 (1) 及び化合物 (2) の効果を示す図である。 図8は、10μMの試験化合物とのインキュベーション後のHUVSMCの増殖に対する効果を示す図である。 図9a及び図9bは、それぞれ、ノルアドレナリンの収縮力に対する化合物 (1) 及び化合物 (2) の効果を示す図である。 図10は、T細胞増殖及びサイトカイン産生に対する、10μMの試験化合物とのインキュベーションの効果を示す図である。 図11は、B細胞増殖及びサイトカイン産生に対する、10μMの試験化合物とのインキュベーションの効果を示す図である。 図12は、非刺激リンパ球の増殖に対する、10μMの試験化合物とのインキュベーションの効果を示す図である。 図13a、図13b、図13c及び図13dは、1μMの濃度で試験した試験化合物のPPARγ活性を示す図である。データは、4つの別々のアッセイから得られる。Rosi＝0.1μMのロシグリタゾン。 図14は、ラットA7r5大動脈平滑筋細胞におけるカスパーゼ-3/7活性に対する、試験化合物の効果を比較する図である。 図15a、図15b及び図15cは、HUVSMCの増殖に対する、試験化合物の効果を比較する図である。 図16a及び図16bは、A7r5ラット大動脈平滑筋細胞の増殖に対する、試験化合物の効果を比較する図である。 図17a及び図17bは、ラット大動脈中膜(media of rat aorta) 由来のA10平滑筋細胞の増殖に対する、試験化合物の効果を比較する図である。 図18a、図18b及び図18cは、VCAM-1、ICAM-1及びE-セレクチンそれぞれの発現に対する、試験化合物の効果を比較する図である。 図19は、TNFa刺激THP-1単球／マクロファージにおけるNFκB-プロモータ活性に対する、30μMの試験化合物の効果を比較する図である。 図20は、TNFa刺激THP-1単球／マクロファージにおけるNFκB-プロモータ活性に対する、試験化合物の効果を比較する図である。 図21は、フリーラジカルスカベンジャーとしての試験化合物の活性を、2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (2,2-diphenyl-1-picrylhidrazyl,DPPH) と比較する図である。

本発明者等は、一般式 (I) の1,3-オキサジニルイソフラボノイド化合物類 (class) が、驚くべき予期せぬ生物学的且つ薬剤的な特性を示すことを見出した。

また本発明のオキサジニルイソフラボノイド化合物は、抗酸化剤、抗炎症剤、心保護薬として、及び再狭窄を含む血管疾患の治療のために有用性が見出される。

本明細書中で使用する場合、「狭窄 (stenosis) 」という用語はその最も広義に解釈し、身体の経路又は開口
(passage or orifice) (特に血管又は動脈等) の直径の狭小化又は収縮を意味し、一般的に血流を低減し、随伴性の血管閉塞の問題を引き起こす。典型的に狭窄は、脂質及び他の血液派生物 (blood derivatives) の局所的な蓄積及び沈着、並びに血管平滑筋細胞
(VSMC) を含む新生内膜増殖の結果として起こる。

「再狭窄
(restenosis) 」又は再-狭窄
(re-stenosis) 又は二次狭窄 (secondary stenosis) という用語はその最も広義で、典型的には、血管インターベンション、傷害又はバルーン血管形成術を含む手術後に狭窄を再発することを意味する。狭窄及び再狭窄は、身体全体の血管で起こる可能性があり、特に医学的に重要なのは、冠動脈における生命を脅かし且つ致死的な狭窄の影響である。

現在、血管バルーン損傷及びステント留置後の再狭窄に対する炎症プロセスが寄与する役割に関して明らかな証拠がある (Schiele 2005) 。急性の血管壁に対する炎症反応によって、新生内膜増殖を悪化させる単球浸潤 (monocyte infiltration) が起こる (Schober and
Weber 2005) 。

現在、核因子κB
(nuclear factor κB, NFκB) が関与する酸化体感受性調節経路 (oxidant-sensitive regulatory pathway) が、幾つかのアテローム性動脈硬化関連遺伝子の転写において中心的役割を果たすと考えられている。スーパーオキシドイオンへの曝露が、NFκB制御複合体
(regulatory complex) を活性化し、特定の白血球接着分子、化学誘引物質サイトカイン (chemoattractant
cytokines) 及び細胞外マトリックス代謝に影響を与え得る酵素をコードする遺伝子の転写を誘起する。実験的な動脈損傷はNFκBを活性化し、そのような遺伝子の発現を増大させる (Libby and Ganz 1997) 。NFκBの阻害が、内皮の活性化を抑制し、動脈硬化性病変 (atherosclerotic
lesions) 、及び血管形成術後に発生する新生内膜においてVSMCアポトーシスを誘導し得る (Weber and Erl 2000) 。

アテローム性動脈硬化 (atherosclerosis) は、主に脂質代謝異常
(dyslipidaemia) 及び他の危険因子に対する慢性炎症反応の具体例である。炎症性浸潤した細胞
(cells of inflammatory infiltrates) で生成したROSによって、又は浸潤するマクロファージ (infiltrating macrophages) によって生成されたリポキシゲナーゼ等の酵素によって、残留 (retained) リポタンパク質の酸化が起こり得る (Getz 2005) 。酸化リポタンパク質は、アテローム発生を促進する細胞機能において幾つかの変化を誘発すると考えられている。酸化した低密度リポタンパク質 (OxLDL) は炎症促進性 (pro-inflammatory) であり、内皮細胞機能不全 (endothelial dysfunction) を引き起こす可能性があり、動脈壁内で容易に集積する (Rosenson 2004) 。

血管形成術又はステント術後の初期には、酸化ストレスも起こる (Tardif et al. 2002) 。動脈損傷に応答して酸化体が放出されることについて、並びに、マクロファージ及びVSMC (血管形成術後の動脈硬化性病変にある主要な細胞型である) が、ROSを増大させると共に内皮細胞機能不全及びマクロファージ活性化を誘導し、その結果、マトリックス・リモデリング及び平滑筋細胞増殖を刺激するサイトカイン及び成長因子が放出される可能性があることについて、動物での研究によって証拠が得られた (Libby and Ganz 1997) 。抗酸化体プロブコール
(Probucol) が、臨床試験において、ステント術後再狭窄及び頸動脈アテローム性動脈硬化の進行を低減する強い活性を示した (Tardif 2005) 。

従って、ある化合物が抗酸化活性を有することは、その化合物がアテローム性動脈硬化及び再狭窄を低減する能力を持つことに寄与しうる。本発明の化合物は、その強い抗酸化体活性のために、フリーラジカルスカベンジャー及びLDL酸化の阻害剤として好適である。

初期アテローム性動脈硬化は、血行 (circulation) からの炎症細胞の動員及びその経内皮移動
(transendothelial migration) に関与する。このプロセスは大部分、幾つかの炎症性刺激に応じて血管内皮 (vascular endothelium) 及び循環白血球 (circulating
leukocytes) で発現する細胞接着分子によって媒介される。セレクチン (P、E及びL) は、血管壁上での白血球のローリング及び繋留 (tethering) に関与する。細胞内接着分子 (intercellular
adhesion molecules, ICAMs) 及び血管細胞接着分子 (vascular cell
adhesion molecules, VCAM-1) 、並びにインテグリン (integrins) の一部が、炎症細胞の血管表面での堅固な接着を誘導する。VCAM-1発現は、病変 (lesions) 及び病変素因性領域 (lesion-predisposed regions) に限定されるが、ICAM-1発現は、より広範であり、未関与の大動脈及び病変保護領域 (lesion-protected regions) に拡がる。

接着分子発現の増大が、再狭窄にも関与する。待期的な (elective) 経皮的冠動脈形成術 (percutaneous
transluminal coronary angioplasty, PCTA) を受けた46人の患者の前向き試験において、6ヶ月の追跡調査で冠動脈再狭窄を起こした患者には、再狭窄なしの患者に比べて、その循環単球
(circulating monocytes) の表面上で接着分子の有意な増大が見られた
(Navarro-Lopez et al. 2003) 。驚くべきことに、本発明の化合物が、細胞接着分子発現によって媒介されるアテローム性動脈硬化、再狭窄、炎症反応及びその他の疾患で活発であることが知られている多くのシグナルに応答して、内皮細胞表面接着分子 (特にE-セレクチン及びVCAM-1)
の誘導発現を阻害することも発見している。この結果は、この化合物が、再狭窄、冠動脈疾患、狭心症及び他の血管及び心血管の疾患、接着分子E-セレクチン及びVCAM-1によって媒介される炎症性疾患の治療又は予防に有用であることを示している。化合物が細胞接着分子発現を阻害するのに機能する具体的な分子機構は十分に理解されてはいない。

VSMC増殖は、アテローム硬化性プロセス (atherosclerotic process) における重要な段階、及びステントの留置と共に起こる血管損傷に対する応答の構成要素である (McNamara et al. 1996; Rivard and Andres 2000) 。結果として、VSMCの増殖を阻害する薬剤は、抗アテローム生成的 (anti-atherogenic)
な特性を有すると考えられる。本発明の化合物が、ヒトVSMCの細胞増殖を阻害することがさらに示されている。この活性は、この化合物が動脈硬化性病変の発生及び進行を妨げる潜在能力を示し、血管保護における潜在的な利益を提供する。

内皮は、生理的刺激に応答して、弛緩因子及び収縮因子 (relaxing and constricting factors) の産生によって、VSMC収縮性 (contractility) を調節する。内皮細胞機能不全 (endothelial dysfunction) は、内皮依存性血管拡張
(endothelium-dependent vasodilation, EDV) の機能障害
(impairment) 及び血液凝固促進性 (pro-coagulant) ／炎症促進性 (pro-inflammatory) の内皮の活動を特徴とする。そのためEDVの評価は、内皮機能を試験する一般的なパラメータである (Patti et al. 2005) 。内皮細胞機能不全は、おそらく非接着管腔側面
(nonadhesive luminal surface) を維持できないため (Nabel 1991) 、冠動脈ステント留置後の再狭窄の危険性の増大に関連している (Patti et al. 2005) 。DES留置 (DES implantation) は、BMS留置 (BMS implantation) に比べて、局所EDV (local EDV) に対して有害作用があると思われ、これは被覆ステント (coated stents) に関連する長期の問題に寄与し得る (Hofma et
al. 2006; Fuke et al. 2007) 。

本発明の化合物は、強力な血管調節能力を有することも示されている。したがって、この化合物は、収縮活性に拮抗すること、直接的な血管拡張に拮抗すること、及び、酸化した低密度リポタンパク質による内皮損傷に対して保護することができる。また、それらの活性は、その作用機構において独特のものであると思われる。したがってさらに、この化合物は、血管インターベンション後の再狭窄の治療、回復又は予防を含む心保護的な薬物療法としての使用に対する潜在能力を示す。

免疫系は、アテローム硬化性炎症の重要な構成要素である (Hansson and Libby 2006) 。Tリンパ球及びBリンパ球の両方が、それぞれ、主に、サイトカイン分泌及び免疫グロブリン産生を通じて、アテローム発生の進行を調整することができる (Vanderlaan and Reardon 2005) 。アテローム硬化性プラークはT細胞を多く含有する (その大部分がCD4+細胞であるが、より少数のCD8+細胞も検出されている) (Getz 2005; Hansson
and Libby 2006) 。CD4+細胞の中には、Th1細胞 (主に炎症誘発性サイトカイン、例えばINFγを分泌する) と、Th2細胞 (抗炎症性であり得て、かつ、INFγを産生しない) とを含む幾つかのサブグループがある。細胞及びサイトカイン関与のパターンは、動脈硬化性病変におけるTh1の優位 (dominance) を示唆する。INFγには、アテローム生成促進的な役割があると思われ、動脈硬化性病変は、INFγ^-/-マウス及び組換えINFγを高コレステロール血症マウスに注入する場合の両方で増大する (Getz 2005) 。IFNγは、マクロファージ (プラークで最も顕著な細胞型) を活性化し、それによって、マクロファージによるNO、炎症促進性サイトカイン、並びに血栓形成促進性及び血管作用性メディエータ
(pro-thrombotic and vasoactive mediators) の産生が増大する。

T細胞は、TNFα (NFκB経路を活性化することができるもう一つの炎症促進性サイトカイン) も産生し、これによりROSの産生が引き起こされる (Hansson et al. 2002) 。TNFαは、リポタンパク質リパーゼ (lipoprotein lipase) の抑制を含む顕著な代謝効果も有し、これによって血中に富トリグリセリドリポタンパク質 (triglyceride-rich lipoproteins) が集積される。リポタンパク質及びTNFαの両方の増大は、臨床研究において心疾患に関連していた (Hansson and
Libby 2006) 。

実験的には、遺伝的に又は脾摘出 (splenectomy) によってB細胞が取り除かれると、アテローム性動脈硬化が増大するため、B細胞はアテローム予防性 (atheroprotective) であることが示され、この作用は、α-OxLDL抗体の産生によるものかもしれない (Vanderlaan and
Reardon 2005) 。B細胞は、直接、サイトカイン分泌によっても免疫応答を調節することができる。或る特定の条件下で、B細胞は、かつてT細胞に限定されると考えられていた多種多様のサイトカイン (IL-6、IFN-γ及びTNFαを含む) を産生することができる。T細胞は実際のプラーク内で見られる；B細胞が存在することは稀であるが、隣接する外膜 (adventitia) にはよく見られる。

原発性アテローム性動脈硬化 (primary atherosclerosis) と同様に、ステント術後の再狭窄は、炎症性の活動及び免疫学的な活動 (inflammatory and immunological activity) にも関連する。再狭窄病変は、炎症細胞 (単球及びマクロファージ) 及びT細胞によって浸潤される (Navarro-Lopez et al. 2003) 。先に言及した待期的な
(elective) PCTAを受けた患者の前向き試験において、6ヶ月の追跡調査で冠動脈再狭窄を起こした患者は、ベースラインの数値 (baseline figures) に比べて循環細胞傷害性Tリンパ球 (circulating cytotoxic T-lymphocytes) の有意な増大も示し、再狭窄しなかった患者よりも高いレベルに達した (Navarro-Lopez et al. 2003) 。

IL-6は、急性期の (acute phase) 応答に関連する炎症促進性サイトカインである。IL-6レベルは、伝統的な危険因子とは独立に無症候性の動脈硬化性病変にも関連し、ICAM-1分泌に対するIL-6の影響は、この関連に役割を果たしているかもしれない (Amar et al. 2006) 。冠動脈閉塞／ステントの周りの領域からサンプリングしたIL-6レベルの増大は、経皮的冠動脈インターベンション (percutaneous
coronary intervention, PCI) 及びPCTA後の再狭窄にも関連している (Hojo et al. 2000; Funayama et al. 2006) 。同様に、再狭窄を起こした患者は、循環IL-6及びTNFαのレベルが増大している (Navarro-Lopez et al. 2003) 。

オキサジニルイソフラボノイド化合物を投与することにより、手術又は血管形成術では治療不可能な小血管疾患 (small vessel disease) 、又は手術が選択肢にない他の血管疾患を治療し、血行再建治療 (revascularisation therapy) の前及び後に患者を安定化させることもできる。臨床的に重要な再狭窄を現在引き起こす、異常増殖性の炎症反応 (abnormal proliferative and inflammatory response) を低減又は除去する手段として、冠状動脈形成術又は血管形成術 (coronary or vascular angioplasty) 等の血管インターベンションの直前及び直後の期間に活性化合物を投与することもできる。さらにこの化合物を、心臓移植の拒絶反応の治療、並びに血管グラフト及び移植法 (transplant procedures) に使用することもできる。

本発明の方法には、単に疾患の進行を阻害するように設計された既知の療法を凌ぐ、血管の状態及び疾患を治療するのに重要な進歩がある。予想外なことに、本明細書中で与えられる実験データでは、血管インターベンション又は血管形成術後の再狭窄が、様々な哺乳動物モデルにおいて阻害又は少なくとも顕著に低減されることが示されている。したがって、適切に使用した場合、イソフラボン化合物及びその誘導体が、再狭窄に医学的に対処して、新規の病変が発生するのを防ぎ、既存の病変を安定化又は退行させることによって、アテローム性動脈硬化を恐らくは治癒させる潜在能力を有することを本方法は実証している。

本発明の式
(I) の化合物には、正常細胞との都合の良い毒性プロファイル及び良好な生物学的利用能
(bioavailability) があることが示される。本発明の化合物は、現行の癌治療よりも有意に良好な、現行の癌治療と同程度の、又は少なくとも現行の癌治療に対する有用な代替法としての抗癌活性を示す。

式 (I) の化合物は、ヒト及び動物起源の広範の癌細胞に対して細胞増殖抑制性かつ細胞傷害性である。癌細胞とは、悪性特徴 (malignant characteristics) を示し、未制御
(unregulated) の成長及び挙動によって、非癌細胞と区別される細胞を意味し、通常、治療が成功しなければ、最終的に命にかかわる。

式 (I) の化合物に応答性があることが分かっている癌細胞は、上皮起源 (例えば、前立腺 (prostate) 、卵巣 (ovarian) 、子宮頸部 (cervical) 、乳 (breast) 、胆嚢 (gall-bladder) 、膵臓 (pancreatic) 、結直腸 (colorectal) 、腎臓 (renal) 、及び非小肺の (non-small lung) 癌細胞) のもの、間葉 (mesenchymal) 起源 (例えば、メラノーマ (melanoma) 、中皮腫 (mesothelioma) 及び肉腫の (sarcoma) 癌細胞) のもの、及び神経起源 (例えば神経膠腫の (glioma) 癌細胞) のものである。癌細胞に対するこのような強力な細胞毒性を示すが、ヒト包皮由来のケラチノサイト等の非癌細胞に対する毒性が低い、関連の化合物群を見出すことは、極めて珍しく且つ驚くべきことである。このような癌細胞選択性は、極めて珍しく且つ予想外のものである。

有益なことには、式 (I) の化合物は、標準的な抗癌剤に対する感受性が低いと既に十分に認識されている癌細胞に対する細胞毒性を示す。癌 (例えばメラノーマ、結腸腺癌 (colon adenocarcinoma) 並びに卵巣癌、乳癌及び肺癌) に対するこのような有力な活性を見出すことは、極めて珍しく且つ驚くべきことである。

したがって本発明は、該 (複数の) 化合物それぞれ単独での、及び／又は (複数の化合物のそれぞれを) 互いに併用した、及び／又は他の抗癌剤と併用した、及び／又は放射線療法と併用した療法を通じて、このような腫瘍の成長速度を低減させることによって、又はこのような腫瘍のサイズを減少させることによって癌患者を治療するための、式 (I) の化合物の使用も提供する。

単独での又は上記の併用療法における本発明の化合物の使用は、標準的な抗癌治療で治療した場合に患者が受けることが多い有害な副作用を低減し得る。本発明の化合物の使用は、そのような療法においてより低用量で用い得るということを意味し、それは癌に苦しむ人とって重大な進歩を意味する。

上記の特性は、重要な臨床的な利点を提供する。

本発明の好ましい実施形態において、一般式 (I-I) のオキサジニルイソフラボノイド (oxazinyl
isoflavonoid) 化合物が提供される：

式中、
R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、
R₂、R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₅は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₆は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₇は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
R₈は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₉は、アルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
R₁₀は独立して、アルキル又はアリールであり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれる。

より好ましくは、一般式 (I-II) の化合物が提供される：

式中、
R₁は、アルキル、アリールアルキル、アリール又はアルキルアリールであり、
R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
R₅は、水素、アルキル又はハロであり、
R₆は、水素又はアルキルであり、
R₇は、水素、アルキル又はアリールであり、
R₈は、水素、アルキル、又はハロであり、
R₉は、アルキル又はアリールアルキルであり、
R₁₀は独立して、アルキルであり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれ；
より好ましくは式中、
R₁は、アルキル、フェニルアルキル、フェニル、ナフチルアルキル、ナフチル又はアルキルフェニルであり、
R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、アルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、R₃及びR₄の少なくとも1つは水素ではなく、
R₅は、水素、アルキル又はハロであり、
R₆は、水素又はアルキルであり、
R₇は、水素又はフェニルであり、
R₈は、水素、アルキル、又はハロであり、
R₉は、アルキルであり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれ；

さらにより好ましくは式中、
R₁は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、フェニルメチル、1-フェニルエチル、フェニル、ナフチルメチル、ナフチル、又はアルキルフェニルであり、任意でアルキル、ハロ、ヒドロキシ、アセチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ニトロ若しくはシアノで置換され、
R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ及びメトキシであり、R₃及びR₄の少なくとも1つは水素ではなく、
R₅は、水素、メチル又はハロであり、
R₆は、水素、メチル又はエチルであり、
R₇は、水素、又はフェニルであり、任意でアルキル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ若しくはシアノで置換され、
R₈は、水素、メチル又はハロであり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれ；

より好ましくは式中、
R₁は、メチル、エチル、プロピル、フェニルメチル、1-フェニルエチル、フェニル、ナフチルメチル、又はメチルフェニルであり、任意でメチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ若しくはシアノで置換され、
R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ及びメトキシであり、R₃及びR₄の少なくとも1つは水素ではなく、
R₅は、水素であり、
R₆は、水素であり、
R₇は、水素、又はフェニルであり、任意でメトキシで置換され、
R₈は、水素であり、
「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれる。

好ましい実施形態において、ハロは、クロロ又はブロモである。

別の好ましい実施形態において、R₁は、ベンジル (フェニルメチル) である。

別の好ましい実施形態において、R₁は、1-フェニルエチルである。

別の好ましい実施形態において、R₁は、アルキル又はアルコキシアルキル、より好ましくはメチル、プロピル又は3-メトキシプロピルである。

別の好ましい実施形態において、R₁は、ニトロ、アルキル、アルコキシ、好ましくはメトキシ、又はハロ、好ましくはクロロで置換したフェニル又はベンジルである。

別の好ましい実施形態において、R₁は、ナフチルメチルである。

別の好ましい実施形態において、R₃は、ヒドロキシルである。

別の好ましい実施形態において、R₄は、ヒドロキシルである。

別の好ましい実施形態において、R₃及びR₄は、メトキシである。

別の好ましい実施形態において、R₈は、アルキル、より好ましくはメチルである。

別の好ましい実施形態において、R₈は、ハロ、より好ましくはブロモである。

別の好ましい実施形態において、「---」の描画は、二重結合を表す。

別の好ましい実施形態において、「---」の描画は、単結合を表す。

特に好ましい式
(I) の化合物は、化合物(1)〜化合物(32)である：
4-(3-ベンジル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (1)
4-(3-(1-フェニルエチル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (2)
4-(3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (3)
4-(3-メチル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (4)
7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (5)
4-(3-(4-メトキシベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (6)
4-(3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (7)
4,4'-(クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3,7(2H,4H,8H)-ジイル)ジフェノール (8)
7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(4-メトキシベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (9)
3-(3-ベンジル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (10)
3-(3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (11)
7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (12)
3-ベンジル-7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (13)
7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (14)
4-(3-(4-クロロベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (15)
4-(3-(3-メトキシプロピル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (16)
3-(3-(3-メトキシプロピル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (17)
4-(3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (18)
7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (19)
3-(3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (20)
4-(7-(3-ヒドロキシフェニル)クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3(2H,4H,8H)-イル)ベンゾニトリル (21)
4-(3-m-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (22)
4-(3-(3-ニトロフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (23)
4-(3-(4-クロロベンジル)-6-(4-メトキシフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (24)
4-(10-ブロモ-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (25)
3,4'-(10-メチル-クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3,7(2H,4H,8H)-ジイル)ジフェノール (26)
4-(8-エチル-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (27)
4-(3-(4-tert-ブチルフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (28)
4-(3-(4-tert-ブチルベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (29)
4-(3-(ナフト-1-イル-メチル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (30)
4-(3-(3,4-ジメチルフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (31)
4-(3-(4-メトキシフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (32)
又はそれらの薬剤的に許容可能な塩。

抗酸化剤及びフリーラジカルスカベンジャーとして特に好ましい本発明の化合物は、化合物 (1) 、 (2) 、 (3) 、 (8) 、 (16) 及び (17) である。

VSMCの阻害剤として特に好ましい本発明の化合物は、化合物 (1) 、 (7) 、 (8) 、 (17) 、 (18) 、 (19) 及び (20) である。

抗癌剤
(anticancer agents) として特に好ましい本発明の化合物は、化合物 (1) 、 (2) 、 (6) 、 (16) 及び (17) である。

PPARγアゴニストとして特に好ましい本発明の化合物は、化合物 (1) 、 (2) 、 (6) 、 (7) 、 (18) 、 (20) 、 (22) 、 (23) 、 (27) 及び (29) である。

本発明の式
(I) の化合物はキラル中心を有し得る。本発明は、鏡像異性体 (enantiomers) 及びジアステレオ異性体 (diastereoisomers) 、並びに任意の割合でのそれらの混合物を全て含む。本発明は、単離鏡像異性体又は鏡像異性体対にまで及ぶ。鏡像異性体およびジアステレオ異性体を分離する方法は、当業者に既知である。

本明細書中で使用する、「イソフラボン (isoflavone) 」又は「イソフラボノイド化合物 (isoflavonoid
compound) 」という用語は、特定の意味を意図しない場合、イソフラボン (isoflavones) としてイソフラベン (isoflavenes) 、イソフラバン (isoflavans) 、イソフラバノン (isoflavanones) 、イソフラバノール (isoflavanols) 等を含むように広域に解釈する。

「アルキル」という用語は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、セクブチル (secbutyl) 、三級ブチル、ペンチル (pentyl) 等の1〜6個の炭素原子を有する直鎖及び分岐鎖の飽和アルキル基を含むように解釈する。アルキル基は、好ましくは1〜4個の炭素原子、特にメチル、エチル、プロピル又はイソプロピルを含有するのがより好ましい。

シクロアルキルは、シクロプロピル、シクロブチル、シクロペンチル及びシクロヘキシル等の3〜6個の炭素原子を有する環状アルキル
(cyclic alkyl) 基を含む。

アルキル基、アルケニル基若しくはアルキニル基又はシクロアルキル基は任意で、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換してもよい。

「アリール」という用語は、フェニル、ベンジル、ビフェニル (biphenyl) 及びナフチルを含むように解釈し、任意でアルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換してもよい。

「ハロ」という用語は、フルオロ、クロロ、ブロモ及びヨード、好ましくはフルオロ及びクロロを含むように解釈する。例えば「ハロアルキル」に対する言及は、モノハロゲン化、ジハロゲン化及び最大でペルハロゲン化したアルキル基を含む。好ましくは、ペルハロアルキル基は、トリフルオロメチル及びペンタフルオロエチルである。

「シリルオキシ」基という用語は典型的に、トリメチルシリルオキシ又はt-ブチルジメチルシリルオキシ等のペルアルキルシリルオキシを表す。

本発明の化合物は、酸付加塩、アニオン塩及び双性イオン塩等のすべての塩を含み、特に、当業者にとって既知であるような薬剤的に許容可能な塩を含む。「薬剤的に許容可能な塩 (pharmaceutically acceptable salt) 」という用語は、電荷を保持し、かつ、 (例えば塩中で対カチオン (counter-cation) 又は対アニオン (counter-anion) として) 医薬品と共に投与することができる、有機又は無機部分 (organic or inorganic moiety) を表す。薬剤的に許容可能なカチオンは、当業者にとって既知であり、ナトリウム、カリウム、カルシウム、亜鉛及び4級アミンを含むが、これらに限定されない。薬剤的に許容可能なアニオンは、当業者にとって既知であり、塩化物、酢酸塩、トシレート (tosylate) 、クエン酸塩、炭酸水素塩 (bicarbonate) 及び炭酸塩を含むが、これらに限定されない。

薬剤的に許容可能な塩は、酢酸 (acetic acid) 、アスコルビン酸 (ascorbic acid) 、アスパラギン酸 (aspartic acid) 、安息香酸 (benzoic acid) 、ベンゼンスルホン酸 (benzenesulphonic acid) 、クエン酸 (citric acid)
、桂皮酸 (cinnamic acid) 、エタンスルホン酸
(ethanesulphonic acid) 、フマル酸 (fumaric acid) 、グルタミン酸 (glutamic acid) 、グルタル酸 (glutaric acid) 、グルコン酸 (gluconic acid) 、塩酸 (hydrochloric acid) 、臭化水素酸 (hydrobromic acid) 、乳酸 (lactic acid) 、マレイン酸 (maleic acid) 、リンゴ酸 (malic acid) 、メタンスルホン酸 (methanesulphonic acid) 、ナフトエ酸 (naphthoic
acid) 、ヒドロキシナフトエ酸 (hydroxynaphthoic acid) 、ナフタレンスルホン酸 (naphthalenesulphonic acid) 、ナフタレンジスルホン酸
(naphthalenedisulphonic acid) 、ナフタレンアクリル酸
(naphthaleneacrylic acid) 、オレイン酸 (oleic acid) 、シュウ酸 (oxalic acid) 、オキサロ酢酸 (oxaloacetic acid) 、リン酸 (phosphoric acid) 、ピルビン酸 (pyruvic acid) 、p-トルエンスルホン酸 (p-toluenesulphonic acid) 、酒石酸 (tartaric acid) 、トリフルオロ酢酸 (trifluoroacetic
acid) 、トリフェニル酢酸 (triphenylacetic acid) 、トリカルバリル酸 (tricarballylic acid) 、サリチル酸 (salicylic
acid) 、硫酸 (sulphuric acid) 、スルファミン酸 (sulphamic acid) 、スルファニル酸 (sulphanilic
acid) 及びコハク酸 (succinic acid) から形成されるものを含む。

「薬剤的に許容可能な誘導体 (pharmaceutically acceptable derivative) 」又は「プロドラッグ (prodrug) 」という用語は、レシピエントに投与する際、直接的に又は間接的に、親化合物 (parent compound) 又は代謝産物 (metabolite) を与えることができる、又は、それ自体が活性を示す活性化合物の誘導体を表す (例えばリン酸誘導体及び硫酸誘導体を含む) 。したがって誘導体は、溶媒和化合物、薬剤的に活性なエステル、プロドラッグ等を含む。これは、本発明の化合物又はその活性部分 (active moiety) を提供するように、生体内で切断することができる生理的に切断可能な脱離基を有する誘導体も含む。脱離基は、一つ又は複数のペンダントヒドロキシ基 (pendant hydroxy groups) を、アシル基、好ましくはアセチル基で保護する場合、アシル、リン酸塩、硫酸塩、スルホン酸塩を含んでいてもよく、好ましくはモノ-、ジ-及びペル-アシルオキシ置換化合物を含み得る。典型的には、本発明のアシルオキシ置換化合物は、対応するヒドロキシ置換化合物へと容易に切断可能である。

本発明の化合物及びそれらの出発材料の合成を助けるのに適切であれば、化学官能基の保護、脱保護、シントン及び当業者にとって既知の他の技法を使用してもよい。

例えばT. W.
Greene, Protective Groups in Organic Synthesis, John Wiley & Sons, New York, 1981に記載の当該技術分野において十分に確立された方法によって、本発明の化合物及び誘導体上の官能基の保護を行うことができる。

ヒドロキシル保護基は、カルボン酸エステル (例えば酢酸エステル) 、安息香酸塩等のアリールエステル、アセトニド (acetonide) 及びベンジリデン (benzylidene) 等のアセタール／ケタール、o-ベンジル及びp-メトキシベンジルエーテル、テトラヒドロピラニルエーテル (tetrahydropyranyl ether) 及びt-ブチルジメチルシリルエーテルのようなシリルエーテル等のエーテルを含むが、これらに限定されない。

例えば、酸又は塩基触媒した加水分解又は還元 (例えば水素付加) によって、保護基を取り除くことができる。シリルエーテルは、フッ化水素又はフッ化テトラブチルアンモニウムを切断する必要があり得る。

例えば、式
(I) の化合物が、一つ又は複数のヒドロキシル置換基を有し、アルコールをハロゲン化剤で処理することによって、これらの一つ又は複数の置換基をブロモ、クロロ又はヨード等のハロ置換基に変換することができる場合、式
(I) の化合物を他の式 (I) の化合物に変換することができることは、医薬品化学の技術分野の当業者にとって明らかである。ハロゲン化剤としては、NBS、臭化水素酸、塩素ガス等の化合物が挙げられる。ハロゲン化等のプロセスの間に、分子中の他の官能性 (functionality) を保護するのに保護基を使用することが必要であり得る。

フェノール類
(phenolic type) のヒドロキシルは、ハロゲン化剤による処理では、対応するハロゲン化合物に容易に変換することができない。しかしながら、例えば0℃等の低温条件、HClの存在下で、適切なアリールアミン出発材料をNaNO₂で処理することによって、所望のハロゲン化合物を調製し、対応するアジド塩 (azide salt) を生成することができる。引き続くCuCl、CuBr、KI又はHBF₄による処理を利用して、アジド (azide) を必要なハロ化合物 (halo-compound) に変換することができる。

式 (I) の化合物を調製する一般的方法は、式 (II) の化合物を処理する工程を含む：

式中、R₁、R₂、R₃、R_4,、R₅、R₆、R₇、R₈及びXは上記で規定したようなものであり、「---」の描画は、単結合又は二重結合、好ましくは二重結合を表し、
ホルムアルデヒド及び一級アミン、R₁-NH₂を有し、
式中、R₁は、任意で一般式 (I) の化合物を生成するように置換することができる、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールである。

これらの条件
(conditions) は一般的に、マンニッヒ反応と呼ばれ、イソフラボノイドA環上に1,3-オキサジン環を形成する閉環も伴う。Shigemasa, et
al.,Tetrahedron Letters,42 (2001) 7273-7275に記載のようなオキサジン合成をもたらすために、当該技術分野で既知の同様の方法及び変法を用いてもよい。

「---」の描画が二重結合を表す場合、対応するオキサジンイソフラバン化合物 (ここでは、「---」は単結合を表す) を作製するのに、水素及び触媒による標準的な水素付加法を使用してもよい。還元剤は、当業者にとって既知であり、水素化ホウ素及びアルカリ金属水素化ホウ素等の水素化物源を含み得るが、炭素上のパラジウム等の好適な触媒を使用することができる場合、触媒的水素付加における水素を含む。他の好適な水素化物源としては、トリアセトキシ水素化ホウ素ナトリウム (sodium triacetoxyborohydride) 、テトラブチルアンモニウム (tetrabutyl ammonium) 、トリアセトキシ水素化ホウ素
(triacetoxyborohydride) 及びシアノ水素化ホウ素ナトリウム (sodium
cyanoborohydride) が挙げられる。好ましくは、存在する場合、二重結合は炭素上パラジウム
(Palladium-on-Carbon) の上での水素付加によって減少する。

一般式
(III) のイソフラボン化合物へのアクセスは、当業者にとって容易に同定可能な任意の数の供給源から導き得る。例えば、ダイゼイン (4',7-ジヒドロキシイソフラボン) 及び類似体は、容易に利用可能であるか、又は以下のスキーム1で詳説され、国際公開第98/08503号パンフレット及び国際公開第01/17986号パンフレット、そこに言及される参考文献 (それらの開示は参照により本明細書中に援用される) に記載の一般的合成方法によって合成することができる。典型的な合成をスキーム1に示す：

様々な3-フェニル置換イソフラボンへのアクセスは、フェニル酢酸由来の基での置換パターンを変えること、又は当該技術分野で既知の保護基及びシントンによるそれらの化学修飾によって利用可能である。

同様に、5-置換イソフラボン及び／又は8-置換イソフラボンへのアクセスは、レゾルシノール基での置換パターンを変えることによって利用可能である。
イソフラブ-3-エン (isoflav-3-ene) 及び一般式 (II) のイソフラバン化合物へのアクセスは、以下のスキーム2で詳説され、国際公開第00/49009号パンフレット及び国際公開第01/17986号パンフレット、そこに言及される参考文献 (それらの開示は参照により本明細書中に援用される) に記載の一般的合成方法によって利用可能である。典型的な合成をスキーム2に示す：

水素付加反応及び脱水反応は一般的に、存在する場合、 (例えばアシルオキシ基又はシリルオキシ基等の) フェノール部分を初めに保護するとより良好に働く。それから、生成物を容易に脱保護して、対応するヒドロキシ置換化合物を生成することができる。

4-置換イソフラボノイド化合物へのアクセスは、以下のスキーム3で詳説され、国際公開第2006/032086号パンフレット、及びそこに言及される参考文献 (それらの開示は参照により本明細書中に援用される) に記載の一般的合成方法に従って、例えば保護4',7-ジシリルオキシジヒドロダイゼイン等のイソフラバン-4-オン化合物でのグリニャール反応によって利用可能である。典型的な合成をスキーム3に示す：

2-置換イソフラボノイド化合物へのアクセスは、例えば好適に保護したイソフラブ-3-エン化合物で利用可能である。トリチルヘキサフルオロリン酸塩 (trityl
hexafluorophosphate) によって、対応するイソフラビリウム塩中間体
(isoflavylium salt intermediate) を生成した後、求核付加を行う。求核試薬
(nucleophiles) は、トリメチルシリル (TMS) 誘導体、トリブチルスズ ((Bu)₃Sn) 誘導体、アルコール、アミン等を含み得る。一般的な合成をスキーム4に示す：

本明細書中で使用する場合、「治療 (treatment) 」、「予防 (prophylaxis) 」又は「防止 (prevention) 」、「回復 (amelioration) 」という用語等は、最も広義で解釈する。特に、「治療」という用語は、必ずしも完全に回復するまで動物を治療することを意図しない。したがって、「治療」は、特定の状態の症状若しくは重症度の回復、又は特定状態の発症の危険性を低減することを含む。

本発明による治療上の処置に必要となる一つ又は複数の式 (I) の化合物の量は、幾つかの要因によって変わり、これには具体的な用途、使用する特定の化合物の性質、治療する状態 (condition being treated) 、投与様式及び患者の状態が含まれる。

従来実施されるのと同様の様式及び量で、式 (I) の化合物を投与してもよい。例えば、Goodman and Gilman,「The pharmacological basis of therapeutics」,7th
Edition, (1985) を参照されたい。利用される具体的な投薬量は、治療する状態 (condition
being treated) 、被験者の状況、投与経路及び上記のような他の既知の要因によって変わる。概して、患者1人当たりの一日用量は、0.1mg〜5g、典型的に0.5mg〜1g、好ましくは50mg〜200mgの範囲であり得る。投与期間は、治療又は軽減する状態 (condition to
be treated or alleviated) の重症度に合わせて、必要に応じて1週間から何ヶ月、何年にもわたっての、1日若しくは2日に1回の単一投与から1日2回若しくは3回で与えられる投与までの範囲であり得る。

任意の特定の被験者では、個人の必要性、組成物の投与する人又は投与を監督する人の専門的判断に従って、具体的な投与レジメンを時間をかけて調整する必要があることがさらに理解される。

比較的短期間の活性化合物による治療は、癌の安定化 (stabilisation) 又は縮小 (shrinkage) 又は緩解 (remission) をもたらすのに使用することができる。長期間の治療は、ハイリスク患者における癌の発症を防ぐのに利用することができる。

本明細書中に記載の治療学的な適応症 (therapeutic indications) の治療に用いるための医薬品組成物の生産は、典型的には、本発明の化合物 (以下、便宜上「活性化合物」と表す) と、当該技術分野で既知のような一つ又は複数の薬剤的又は獣医学的に許容可能な担体及び／又は賦形剤との混合によって調製する。

当然ながら、担体は、製剤における任意の他の成分に適合性があるという意味で許容可能である必要があり、被験者にとって有害であってはならない。担体又は賦形剤は、固体若しくは液体、又は両方であってもよく、好ましくは単位用量 (unit-dose) (例えば錠剤) として化合物と配合し、活性化合物を最大100重量%、好ましくは活性化合物を0.5重量%〜59重量%含有し得る。

一つ又は複数の活性化合物を本発明の製剤に組み込んでもよく、これは、本質的に、構成要素 (任意で一つ又は複数の補助成分を含む) を混合することから成る既知の薬学技法のいずれかによって調製してもよい。薬剤組成物 (drug composition) 中の活性化合物の好ましい濃度は、薬剤の吸収率
(absorption rate) 、分布率 (distribution rate) 、不活性化率 (inactivation rate) 、及び排出率 (excretion rate)
、並びに当業者にとって既知の他の因子によって変わる。

本発明の製剤は、経口 (oral) 、直腸 (rectal) 、眼球 (ocular) 、頬側 (buccal) (例えば、舌下 (sublingual) ) 、非経口 (parenteral ) (例えば、皮下 (subcutaneous) 、筋肉内 (intramuscular) 、皮内 (intradermal) 、又は静脈内 (intravenous) ) 、又は経皮 (transdermal) 投与 (鼻
(nose) 、口 (mouth) 、膣 (vagina) 又は直腸 (rectum) を介した、及び吸入剤としての粘膜投与 (mucosal
administration) を含む) に適したものを含むが、いずれの場合においても最も好適な経路は、治療する状態の性質及び重症度、使用する特定の活性化合物の性質によって変わる。

経口投与に適した製剤は、カプセル、サシェ (sachets) 、ロゼンジ (lozenges) 、又は錠剤等の不連続単位 (discrete units) で与えられてもよく、それぞれは、粉末若しくは顆粒として、水性液体若しくは非水性液体における溶液若しくは懸濁液として、又は水中油型 (oil-in-water) エマルション若しくは油中水型
(water-in-oil) エマルションとして所定量の活性化合物を含有する。活性化合物と好適な担体 (これは、上記の一つ又は複数の補助成分を含有し得る) とを会合させる (bringing into association) 工程を含む任意の好適な薬学方法 (method of pharmacy) によって、このような製剤を調製してもよい。

概して、活性化合物と、液体若しくは細かく分割した固体担体、又は両方とを均一且つ密接に混合し、それから必要に応じて単位調剤を形成するように得られた混合物を成形することによって、本発明の製剤を調製する。例えば、 (任意で一つ又は複数の他の成分と共に) 活性化合物を含有する粉末又は顆粒を圧縮又は成形することによって、錠剤を調製してもよい。

任意で結合剤
(binder) 、潤滑剤 (lubricant) 、不活性希釈剤 (inert diluent) 、及び／又は表面活性／分散剤 (surface
active/dispersing agent(s)) と混合した粉末又は顆粒等の自由流動
(free-flowing) の化合物を、好適な機械で、圧縮することによって、圧縮錠剤 (compressed
tablets) を調製してもよい。好適な機械で、不活性液体結合剤 (inert liquid binder)
で湿潤させた粉末状化合物を成形することによって、成形錠剤 (moulded tablets) を作製してもよい。

頬側 (舌下) 投与に適した製剤としては、香味基材 (flavoured base) (通常スクロース及びアカシア又はトラガント) 中に活性化合物を含むロゼンジ；並びにゼラチン及びグリセリン又はスクロース及びアカシア等の不活性基材中に化合物を含むトローチ (pastilles) が挙げられる。

眼球投与に適した製剤としては、眼球で許容可能な担体又は希釈剤中に活性化合物を含む、液体、ゲル及びクリームが挙げられる。

非経口投与に適した本発明の組成物は、活性化合物の滅菌水性調製剤 (sterile aqueous preparations) を含むのが都合がよく、この調製剤は、対象のレシピエントの血液と等張 (isotonic) であるのが好ましい。これらの調製剤は静脈内投与するのが好ましいが、皮下注射、筋肉内注射、又は皮内注射によって投与を行っても効果が得られる。化合物と水又はグリシンバッファーとを混合し、得られた溶液を滅菌し、血液と等張にさせることによって、このような調製剤を便利に調製することが出来る。本発明に記載の注射製剤は、一般的に、活性化合物を0.1% (w/v) 〜60% (w/v) 含有し、0.1ml／分／kgの速度で投与することができる。

例えば、担体として生理食塩水と、シクロデキストリン又はその誘導体等の可溶化剤 (solubilising agent) とを用いて、注入用製剤を調製してもよい。好適なシクロデキストリンとしては、α-シクロデキストリン、β-シクロデキストリン、γ-シクロデキストリン、ジメチル-β-シクロデキストリン、2-ヒドロキシエチル-β-シクロデキストリン、2-ヒドロキシプロピル-シクロデキストリン、3-ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリン及びトリ-メチル-β-シクロデキストリンが挙げられる。より好ましくは、シクロデキストリンは、ヒドロキシプロピル-β-シクロデキストリンである。好適なシクロデキストリン誘導体としては、Captisol (登録商標) 米国特許第5,134,127号明細書に記載のシクロデキストリンのスルホブチルエーテル誘導体及びそれらの類似体が挙げられる。

直腸投与に適した製剤は、単位用量の坐薬として与えられるのが好ましい。膣投与に適した製剤は、単位用量のペッサリーとして与えられるのが好ましい。活性化合物と、一つ又は複数の従来の固体担体 (例えばココアバター) と混合した後、得られた混合物を成形することによって、これらを調製してもよい。

皮膚への局所投与
(topical administration) に適した製剤又は組成物は、軟膏、クリーム、ローション、ペースト、ゲル、スプレー、エアロゾル、又はオイルの形態をとるのが好ましい。使用し得る担体としては、バソリン
(Vasoline) 、ラノリン (lanoline) 、ポリエチレングリコール、アルコール、及びそれらの2つ以上の組合せが挙げられる。活性化合物は概して、0.1% (w/w) 〜5% (w/w) 、より詳細には0.5% (w/w) 〜2% (w/w) の濃度で存在する。このような組成物の例としは、皮膚クリーム化粧品
(cosmetic skin creams) が挙げられる。

経皮投与に適した製剤は、長期間レシピエントの表皮との密接な接触を維持するように適応させた分離パッチ (discrete patches) として与えられ得る。好適には、このようなパッチは、活性化合物の濃度が、例えば、0.1M〜0.2Mの任意で緩衝化した水溶液として、活性化合物を含有する。例えばBrown, L.,et al. (1998) を参照されたい。

経皮投与に適した製剤は、イオン泳動 (iontophoresis) (例えば、Panchagnula R,
et al., 2000を参照されたい) によって送達してもよく、典型的には、活性化合物の任意で緩衝化した水溶液の形態をとる。好適な製剤は、クエン酸塩又はビス／トリスバッファー (pH 6) 又はエタノール／水を含み、0.1M〜0.2Mの活性成分を含有する。

溶液、懸濁液又はエマルションの形態のスプレー組成物として、吸入に適した製剤を送達してもよい。吸入スプレー組成物はさらに、二酸化炭素若しくは亜酸化窒素 (nitrous oxide) 若しくは1,1,1,2-テトラフルオロエタン、1,1,1,2,3,3,3-ヘプタフルオロ-n-プロパンのような水素含有フッ化炭素 (hydrogen containing fluorocarbon) 、又はそれらの混合物等の薬剤的に許容可能な噴霧剤 (propellant) を含み得る。

食料品に添加するか、混合するか、被覆するか、組合せられるか、又は別の方法で添加するような食料品形態で、活性化合物を提供してもよい。食料品という用語は、可能な限り最も広範な意味で使用し、飲料 (乳製品を含む) のような液体製剤及び他の食品 (例えばヘルスバー、デザート等) を含む。標準的な慣行に従って、本発明の化合物を含有する食品製剤を容易に調製することができる。

治療の方法、使用及び組成物は、ヒト又は、伴侶及び飼育動物 (companion and domestic animals) (イヌ及びネコ等) 及び家畜 (livestock animals) (ウシ、ヒツジ、ブタ及びヤギ等) 、鳥類 (ニワトリ、シチメンチョウ、アヒル等) 、水産養殖の場でのものを含む海洋動物 (魚類、甲殻類及び貝類等) のような哺乳動物を含む他の動物への投与用であり得る。

活性化合物又は薬剤的に許容可能な誘導体プロドラッグ又はその塩を、所望の作用を損わない他の活性材料、又は抗生物質
(antibiotics) 、抗真菌薬 (antifungals) 、抗炎症薬 (antiinflammatories) 若しくは抗ウイルス化合物
(antiviral compounds) のような所望の作用を補う材料と同時投与
(co-administer) することができる。活性薬剤は、組合せて又は相乗的な混合物中に、2つ以上のイソフラボン又はその誘導体を含むことができる。プロブコール及びニコチン酸等の抗脂血症治療薬 (lipid lowering agents) ；アスピリン等の血小板凝集阻害薬；クマディン等の抗血栓薬；ベラパミル、ジルチアゼム及びニフェジピン等のカルシウムチャネル遮断薬；カプトプリル及びエナラプリル等のアンジオテンシン変換酵素 (ACE) 阻害薬、並びにプロパノロール (propanolol) 、テルブタロール (terbutalol) 及びラベタロール等のβ遮断薬 (β-blockers) と共に、活性化合物を投与することもできる。イブプロフェン、インドメタシン、アスピリン、フェノプロフェン、メフェナム酸、フルフェナム酸及びスリンダク等の非ステロイド性抗炎症薬 (nonsteriodal antiinflammatories) と併用して、化合物を投与することもできる。副腎皮質ホルモン又はゾフラン (登録商標) 等の制吐薬
(anti-emetic) と共に化合物を投与することもできる。

式 (I) の化合物は、シスプラチン、デヒドロエクオール (dehydroequol) 、タキソール (パクリタキセル) 、ゲムシタビン、ドキソルビシン、トポテカン及び／又はカンプトテシン等の抗癌剤の一つ又は複数と同時に投与するのに特に適していると考えられる。これによって、1つの薬物だけを利用した場合に比べて、例えば相乗効果の形で、治療における効果が改善され得る。特に、現在特許請求している本発明の化合物は、感受性増強剤 (chemosensitisers) であり、これと同時に投与する一つ又は複数の抗癌剤の細胞毒性を増大させると考えられる。このことは、上記抗癌剤が、多種多様の様々な機構で働く場合であったとしても変わらないと考えられる (例えばシスプラチンは、核DNAと相互作用することによって働くと考えられ、タキソールは、細胞周期のG2/M相で細胞を遮断することによって働き、細胞が正常な分裂装置を形成するのを防ぐと考えられ、ゲムシタビンは、細胞のDNAにゲムシタビン自体を組み込むことによって働き、最終的に分裂を防ぐと考えられ、ドキソルビシンは、トポイソメラーゼII阻害剤であり、このためDNAの複製及び転写を防ぐと考えられ、トポテカンは、トポイソメラーゼI阻害剤である) 。

興味深いことに、状況によっては、この癌性細胞に対する細胞毒性の増大は、非癌性細胞に対する毒性の対応した増加を伴わない。この知見は、多くの癌の治療に対して重要な意味があり、治療が極めて困難であるメラノーマ等の癌の治療には特に重要である。

同時投与
(co-administration) は、同時 (simultaneous) であっても又は順次 (sequential) であってもよい。当該複数の化合物が同一の単位用量であれ、又は同時に若しくは近接時間に投与される個別に分離した単位用量であれ、同時投与は効果が得られる。順次投与は、必要に応じて任意の順番であってもよく、典型的には特に累積 (cumulative) 効果又は相乗効果が望まれる場合、第1の又は初期の活性薬剤の持続する (ongoing) 生理学的効果が、第2の又は後期の活性薬剤を投与する際に現存している必要がある。

本発明は、併用療法を含む湿布 (pack) にまで及ぶ。

また本発明のオキサジニル化合物は、埋め込み式医療機器で使用する活性薬剤として特に適している。これらの埋め込み式医療機器は、血管での適用 (vascular applications) を含む様々な場で、及び、薬剤溶出ステントとして使用するように適応される。ステント及びカテーテルは特に、血管 (例えば冠動脈) 、胆管、食道、結腸、気管又は大気管支 (large bronchi) 、尿管及び尿道等の患者の体腔 (body lumen)
に埋め込むように適応される。ステントは、アテローム硬化性狭窄及び動脈瘤の治療に特に有用である。

ステントは、典型的には、収縮状態で血管又は管腔内に埋め込まれ、そして、血管を通して流体が流れるべく血管の開存性 (patency) を維持するように、血管内に配置したときに拡張させることができる。ステントは、要求される強度を得るために、金属構造等の支持構造を有し、多くの場合、外面をコーティングし、生体適合性及び／又は血液適合性の表面を得る。コーティングは、典型的には、周囲の血管又はその下流での作用のために特定の血管内部位に放出するための治療的活性薬剤を充填した、ポリマー材料である。

薬剤溶出ステント装置は、冠動脈疾患の治療に、具体的にはアテローム性動脈硬化によって狭窄した動脈における血流の再開及び修復に関して、かなり有望である。経皮インターベンション (percutaneous intervention) 中に薬剤溶出ステントを使用した後の再狭窄率は、裸金属ステント術 (bare metal stenting) 及びバルーン血管形成術に比べて有意に低くなる。

当業者によって認識されるように、本発明に従って使用した薬剤溶出ステントは実質的に、いかなる種類であってもよい。薬剤溶出ステントは、少なくとも部分的にステンレス鋼、白金、チタン、タンタル、ニッケル-チタン、コバルト-クロム、及びそれらの合金等の医療用グレード (medical grade) の金属材料で形成され得る。

ステントは生体吸収性 (bioabsorbable) 材料でできていてもよい。典型的にこれらのステントは、金属様足場材料 (metal-like scaffolding) を有する完全に分解吸収性
(resorbable) の構造体であり、一般的に標準的なバルーン展開を利用し、薬剤を充填させることができる。生体吸収性ステントを作製することができる材料の例は、ポリ乳酸 (polylactic acid, PLA) (生体分解性で熱可塑性の脂肪族ポリエステル (Ormiston et al. 2007) ) 又はポリ乳酸-コ-グリコール酸 (polylactic-co-glycolic acid,
PLGA) (生体分解性で生体適合性のコポリマー) である。別の例は、マグネシウムを用いて作製したステントである (Erbel et al. 2007) 。

薬剤放出プラットフォームを与える任意の手段によって、活性薬剤を埋め込み式医療機器の表面に付着させることができる。共有結合、イオン結合、又は他の分子相互作用 (水素結合及びファンデルワールス力を含む) によって、結合を達成することができる。コーティング法としては、析出 (precipitation) 、コアセルベーション (coacervation) 及び結晶化が挙げられるが、これらに限定されない。より典型的には、活性薬剤を好適な生体適合性ポリマーと複合体形成させる。それから、ポリマー-薬剤複合体は、当業者にとって既知の方法で、放出制御型
(controlled-release) 医療機器を形成するために使用され、予備成形した
(preformed) 医療機器に組み込まれ、又は医療機器をコーティングするのに使用される。液体ポリマー／溶剤マトリックス (solvent matrix) として、コーティング材料を塗布 (apply) することができる。パッド印刷、インクジェット印刷、ローリング、塗布、噴霧、微細噴霧、浸漬、ワイピング、静電沈着 (electrostatic deposition) 、蒸着 (vapour
deposition) 、エピタキシャル成長、それらの組合せによって液体コーティングを塗布することができ、活性薬剤による制御薬剤放出を達成する他の方法は、本発明の一部であるとして考慮される。

埋め込み式医療機器のコーティングに使用するのに適したポリマーの例としては、ポリ (エチレン-コ-ビニルアルコール) (poly(ethylene-co-vinyl alcohol) (EVAL)) 、ポリ (N-ビニルピロリドン)
(poly(N-vinylpyrrolidone) (PVP)) 、エチルセルロース (ethyl
cellulose) 、酢酸セルロース (cellulose acetate) 、カルボキシメチルセルロース (carboxymethyl cellulose) 、セルロース誘導体
(cellulosics) 、キチン (chitin) 、キトサン (chitosan) 、ポリ (ビニルアルコール) (poly(vinyl alcohol)) 、ヘパリン
(heparin) 、デキストラン (dextran) 、デキストリン (dextrin) 、硫酸デキストラン (dextran sulfate) 、コラーゲン (collagen) 、ゼラチン (gelatin) 、ヒアルロン酸 (hyaluronic acid) 、硫酸コンドロイタン (chondroitan
sulfate) 、グリコサミノグリカン (glycosaminoglycans) 、ポリ[ (2-ヒドロキシエチル) メチルメタクリレート] (poly[(2-hydroxyethyl)methylmethacrylate]) 、ポリウレタン (polyurethanes) 、ポリ (エーテルウレタン) (poly(ether urethanes)) 、ポリ (エステルウレタン) (poly(ester urethanes)) 、ポリ (炭酸ウレタン) (poly(carbonate urethanes)) 、熱可塑性ポリエステル (thermoplastic polyesters) 、溶媒可溶性ナイロン
(solvent soluble nylons) 、ポリ (アクリルアミド) (poly(acrylamide)) 、ポリ (アクリル酸) (poly(acrylic acid)) 、アクリル酸とアクリレートとのコポリマー (copolymers of acrylic acid and acrylates) 、ポリ (メタクリル酸) (poly(methacrylic acid)) 、メタクリル酸とメタクリレートとのコポリマー (copolymers of methacrylic acid and methacrylates) 、及びそれらの混合物が挙げられる。

当業者は、異なるポリマーが、医療機器コーティングの形成における異なる溶媒に、より良好に適合することを理解するであろう。好適な溶媒の例としては、アセトン (acetone) 、酢酸エチル (ethyl acetate) 、クロロホルム (chloroform) 、ジクロロメタン (dichloromethane) 、DMAC、DMSO、DMF、THF、ホルムアミド (formamide) 、N-メチル-2-ピロリドン
(N-methyl-2-pyrrolidone (NMP)) 、スルホラン (sulfolane) 、ベンジルアルコール (benzyl alcohol) 、シクロヘキサノール (cyclohexanol) 、フェノール (phenol) 、ギ酸 (formic acid) 、m-クレゾール (m-cresol) 、p-クレゾール (p-cresol) 、トリフルオロ酢酸 (trifluoroacetic acid)
、グリセロール (glycerol) 、エチレングリコール
(ethylene glycol) 、プロピレングリコール (propylene glycol) 、エタノール (ethanol) 、プロパノール (propanols) 、及びそれらの混合物が挙げられる。活性薬剤は、ポリマー／溶媒混合物に適切に可溶性又は分散性であり、コーティングプロセス中でその活性を保持する必要がある。

浸漬、噴霧、ワイピング、及びブラッシング等の当該技術分野で既知の従来の金属-ポリマー接着法を用いて、ポリマーをステントに接着 (adhere) させる。これらのプロセスの後に、送風又は回転を含み得るウェブクリーニング操作 (web clearing operations) と、蒸発、加熱及びコーティング材料を減圧して溶媒を除去することを含む乾燥操作を行い、ポリマーを含有する薬剤を構築し得る。ポリマーコーティング材料は、約1ミクロン〜約10ミクロン以上の範囲の厚さを有することができ、プライマーコーティング (primer coatings) 及び保護層コーティング (protective
layer coatings) を含む2つ以上のコーティングが望まれるかもしれない。

活性薬剤の充填は典型的に、薬剤-ポリマー層を作製するのに使用する製剤の全質量の約0.1質量%〜約10質量%である。薬剤は、保存剤や安定剤等として患者に治療的若しくは予防的な効果を与えることができるか又は薬剤送達の増大に使用する、付加的な物質を含むことができる。

本発明のオキサジニル化合物は特に、活性薬剤として、埋め込み式医療機器に適している。活性薬剤は、炎症、血管再狭窄を含む再狭窄、アテローム性動脈硬化、肥厚化 (hyperplasia) 並びに他の疾患及び状態を含む一つ又は複数の状態に対して治療的効果を生む。オキサジニル化合物は、単独で又は付加的な活性薬剤と組合せて存在し得る。付加的な活性薬剤は、特に、抗血小板薬 (antiplatelets) 、抗凝固薬 (anticoagulants) 、抗フィブリン薬 (antifibrins) 、抗炎症薬 (antiinflammatories) 、抗トロンビン薬 (antithrombins) 、免疫抑制薬 (immunosuppressives)
及び抗増殖薬 (antiproliferaties) から選択され得る。

ステント上への同時適用に適した治療薬は、単独で又は本明細書中で言及する任意の治療薬と組合せて、パクリタキセル及びラパマイシンを含む抗増殖薬 (antiproliferatives including paclitaxel and rapamyacin) 、抗トロンビン薬 (antithrombins) 、シロリムスを含む免疫抑制薬
(immunosuppressants including sirolimus) 、抗脂質剤
(antilipid agents) 、抗炎症剤 (anti-inflammatory agents) 、抗新生物薬 (antineoplastics) 、抗血小板薬 (antiplatelets) 、血管形成薬 (angiogenic agents) 、血管新生阻害剤
(anti-angiogenic agents) 、ビタミン剤 (vitamins) 、有糸分裂阻害薬 (antimitotics) 、メタロプロテイナーゼ阻害剤
(metalloproteinase inhibitors) 、NOドナー (NO donors) 、エストラジオール (estradiols) 、硬化阻害剤及び血管作用剤 (anti-sclerosing agents and vasoactive agents) 、内皮成長因子 (endothelial growth factors) 、エストロゲン
(estrogen) 、β遮断薬 (beta blockers) 、AZ遮断薬 (AZ blockers) 、ホルモン剤 (hormones) 、スタチン (statins) 、インスリン成長因子 (insulin growth factors) 、抗酸化剤
(antioxidants) 、膜安定剤 (membrane stabilizing agents) 、カルシウムアンタゴニスト (calcium antagonists) 、レチノイド (retenoid) 、ビバリルジン (bivalirudin) 、フェノキソジオール (phenoxodiol) 、エトポシド (etoposide) 、チクロピジン (ticlopidine) 、ジピリダモール (dipyridamole) 及びトラピジル (trapidil) を含むが、これらに限定されない。例を幾つか挙げると、治療薬には、ペプチド (peptides) 、リポタンパク質 (lipoproteins) 、ポリペプチド (polypeptides) 、ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド
(polynucleotides encoding polypeptides) 、脂質 (lipids) 、タンパク質-薬剤 (protein-drugs) 、タンパク質共役体薬剤 (protein conjugate drugs) 、酵素 (enzymes) 、オリゴヌクレオチド及びその誘導体 (oligonucleotides and their derivatives) 、リボザイム (ribozymes) 、他の遺伝的材料 (other genetic
material) 、細胞 (cells) 、アンチセンス・オリゴヌクレオチド (antisense oligonucleotides) 、モノクローナル抗体
(monoclonal antibodies) 、血小板 (platelets) 、プリオン (prions) 、ウイルス (viruses) 、細菌 (bacteria) 、並びに内皮細胞等の真核細胞 (eukaryotic cells
such as endothelial cells) 、幹細胞 (stem cells) 、ACE阻害剤 (ACE inhibitors) 、単球／マクロファージ (monocyte/macrophages) 又は、血管平滑筋細胞 (vascular
smooth muscle cells) も含まれる。治療薬は、プロドラッグであってもよく、宿主に投与すると所望の薬剤へと代謝する。さらに治療薬は、治療用層 (therapeutic layer) に組み込む前に、マイクロカプセル、ミクロスフェア、マイクロバブル、リポソーム、ニオソーム (niosomes) 、エマルション、分散剤 (dispersions) 等として予め配合してもよい。治療薬は、放射性同位元素であってもよく、又は何らかの他の形態のエネルギー (光エネルギー若しくは超音波エネルギー等) によって又は全身投与することができる他の循環分子によって活性化される薬剤であってもよい。治療薬は、血管形成、再狭窄、細胞増殖、血栓症、血小板凝集、凝固及び血管拡張を調整することを含む複数の機能を遂行し得る。抗炎症薬 (anti-inflammatories) としては非ステロイド性抗炎症薬
(non-steroidal anti-inflammatories, NSAID) が挙げられる (アリール酢酸誘導体 (例えばジクロフェナク) ；アリールプロピオン酸誘導体 (例えばナプロキセン) ；及びサリチル酸誘導体 (例えばアスピリン及びジフルニサル) 等) 。抗炎症薬には、デキサメタゾン、プレドニゾロン及びトリアムシノロン等の糖質コルチコイド (ステロイド) も含まれる。組織の抗増殖薬への反応を軽減させるために、抗増殖薬と組合せて抗炎症薬を使用してもよい。

本明細書中に記載の薬剤の幾つかを、その活性を保存する添加剤と組合せてもよい。例えば界面活性剤、制酸剤、抗酸化剤及び洗浄剤 (detergents) を含む添加剤を、タンパク質薬剤の変性及び凝集を最小限にするのに使用してもよい。アニオン性洗浄剤、カチオン性洗浄剤又は非イオン性洗浄剤を使用してもよい。非イオン性添加剤の例としては、糖類 (ソルビトール、スクロース、トレハロースを含む) ；デキストラン (デキストラン、カルボキシメチルデキストラン (carboxy methyl (CM)
dextran) 、ジエチルアミノエチルデキストラン (diethylamino ethyl (DEAE)
dextran;) を含む) ；糖誘導体 (D-グルコサミン酸 (D-glucosaminic acid) 及びD-グルコースジエチルメルカプタル (D-glucose diethyl mercaptal) を含む) ；合成ポリエーテル (ポリエチレングリコール (polyethylene glycol (PEO) ) 及びポリビニルピロリドン (polyvinyl pyrrolidone (PVP)) を含む) ；カルボン酸 (D-乳酸 (D-lactic acid) 、グリコール酸 (glycolic acid) 及びプロピオン酸 (propionic acid) を含む) ；疎水性界面に対して親和性がある洗浄剤 (n-ドデシル-β-D-マルトシド
(n-dodecyl-β-D-maltoside) 、n-オクチル-β-D-グルコシド (n-octyl-β-D-glucoside) 、PEO-脂肪酸エステル (PEO-fatty acid esters ) (例えばステアリン酸塩
(stearate (myrj 59)) 又はオレイン酸塩 (oleate) ) 、PEO-ソルビタン-脂肪酸エステル
(PEO-sorbitan-fatty acid esters) (例えばTween 80、PEO-20モノオレイン酸ソルビタン (PEO-20 sorbitan
monooleate) ) 、ソルビタン-脂肪酸エステル
(sorbitan-fatty acid esters) (例えばSPAN60、モノステアリン酸ソルビタン (sorbitan monostearate) ) 、PEO-グリセリル-脂肪酸エステル (PEO-glyceryl-fatty acid esters) を含む) ；グリセリル脂肪酸エステル (glyceryl fatty acid
esters) (例えばモノステアリン酸グリセリル (glyceryl monostearate)
) 、PEO-炭化水素-エーテル (PEO-hydrocarbon-ethers) (例えばPEO-10オレイルエーテル (PEO-10 oleyl ether) ) ；トリトンX-100；及びルブロール (Lubrol) が挙げられるが、これらに限定されない。イオン性洗浄剤の例としては、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム及びステアリン酸亜鉛を含む脂肪酸塩；レシチン及びホスファチジルコリンを含むリン脂質；CM-PEG；コール酸；ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) ；ドクセート (AOT) ；並びにタウロコール酸 (taumocholic acid) が挙げられるが、これらに限定されない。

神経、頸動脈、冠動脈、腎臓、大動脈、腸骨、大腿部又は他の末梢の血管系を含む血管系の任意の部分で、本発明の薬剤溶出ステント及びカテーテルを利用してもよい。ステントは、活性薬剤を埋め込み部位又はその部位の下流まで送達することができる。

薬剤溶出ステントは、独立して作製した複数の層を有することができ、個々の化学的組成物自体及び薬物動態学的特性を各層に付与することができる。各層は、層毎で同じ又は異なる割合で一つ又は複数の薬剤を含んでいてもよい。層間の薬剤濃度の変化を利用して、所望の送達プロファイルを達成することができる。例えば、約24時間の減少性の薬剤放出を達成することができる。別の例において、初期噴出
(initial burst) 後に、約1週間の一定放出を達成することができる。他の例は、数日から数ヶ月のような持続期間にわたって、薬剤を送達することができる。数時間から数ヶ月の期間にわたって実質的に一定の放出速度を達成することができる。層は、固体であるか、多孔質であるか、又は他の薬剤若しくは賦形剤等で充填してもよい。

理論で縛るつもりはないが、本発明の化合物は、動物細胞内で多種多様のシグナル伝達プロセスを調節し、これらのシグナル伝達プロセスが、動物細胞の生存及び機能に必須の幅広い機能に関与していると考えられている。したがって、これらの化合物は、ヒトを含む動物において幅広く重要な健康的利点 (health benefits) を有し、特に重要且つ一般的なヒト疾患、障害及び機能を防止及び治療する潜在力があり、相当の予想だにしない利点を示す。

以下の非限定的な実施例及び添付の図面によって、本発明をさらに説明する。

[1.0. 合成]
基となる2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン構造で以下に示されるような付番方式
(numbering system) は、本明細書を通じて一貫して使用する。

実施例1: 4-(3-ベンジル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-Benzyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (0.47g、1.97
mmol) をエタノール (約40mL) に溶解し、80℃〜90℃まで加熱した。ベンジルアミン (0.44mL、3.5 mmol) 及び37%ホルムアルデヒド (0.35mL、12.7
mmol) のエタノール溶液 (約20mL) をデヒドロエクオール (dehydroequol) 溶液に添加した。反応混合物を約7時間還流させ、室温まで冷ました後、減圧中で容量を濃縮した。混合物を冷蔵庫に入れ、結晶化させた。吸引しながら、黄色の固体を回収し、濾液を減圧乾固して、表題の化合物の第2の収穫物 (crop) を得た (混合収率0.17g、23%) 。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
7.3 (7H, m), 6.75( 2H, d, 7Hz), 6.71(1H, s), 6.70(1H, s) 6.22(1H, s), 5.0(2H,
s), 4.80(2H, s) 3.80(2H, s), 3.77(2H, s).

実施例2: 4-(3-(1-フェニルエチル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(1-Phenylethyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (0.45g、1.87
mmol) をエタノール (約40mL) に溶解し、80℃〜90℃まで加熱した。メチルベンジルアミン (0.44mL、4.03 mmol) 及び37%ホルムアルデヒド (0.35mL、12.7
mmol) のエタノール溶液 (約20mL) をデヒドロエクオール溶液に添加した。反応混合物を約7時間還流させ、室温まで冷ました後、減圧中で容量を濃縮した。混合物を冷蔵庫に入れ、結晶化させた。吸引しながら、黄色の固体を回収し、濾液を減圧乾固して、表題の化合物の第2の収穫物 (crop) を得た (混合収率0.17g、23%) 。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
7.4 (7H, m), 6.75( 2H, d, 7Hz), 6.65(1H, s), 6.63(1H, s) 6.22(1H, s), 5.0(2H,
s), 4.99(1H, d, 6Hz), 4.81(1H, d, 6Hz), 4.01(1H, d, 8Hz), 3.95(1H, q, 7Hz),
3.55(1H, d, 8Hz), 1.44(3H, d, 7Hz).

実施例3: 4-(3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール (4-(3-Propyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (503mg、2.09
mmol) をエタノール (20ml) に溶解した。プロピルアミン (0.25ml、3.04 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (362mg、53%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
0.89 (3H, t, J = 7.2Hz, CH₃), 1.55 (2H, m, CH2CH₃), 2.66
(2H, t, J = 7.2 Hz, NCH₂CH₂), 3.88 (2H, s, NCH₂Ar),
4.80 (2H, s, NCH₂O), 5.04 (2H, s, H8), 6.16 (1H, s, H10), 6.71 (1H,
bs, H6), 6.72 (1H, s, H5), 6.85 (2H, d, J = 8.8Hz, H3′, H5′),
7.35 (2H, d, J = 8.8Hz, H2′, H6′).

実施例4: 4-(3-メチル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール (4-(3-Methyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (507mg、2.11
mmol) をエタノール (20ml) に溶解した。メチルアミン溶液 (0.6ml、4.82 mmol、エタノール中、33wt%) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%) とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (490mg、79%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
2.44 (3H, s, CH₃), 3.78 (2H, s, NCH₂Ar), 4.70 (2H, s, NCH₂O),
4.99 (2H, s, H8), 6.18 (1H, s, H10), 6.74 (4H, m, H4, H5, H3′, H5′),
7.31 (2H, d, J = 8.8Hz, H2′, H6′), 9.58 (1H, bs, OH).

実施例5: 7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン
(7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-propyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazine)

7-ヒドロキシ-3',4'-ジメトキシイソフラブ-3-エン (99mg、3.48 mmol) をエタノール (10ml) に溶解した。プロピルアミン (0.1ml、4.25 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.4ml、5.37 mmol、37wt%) とを添加した。反応液を室温で8日間撹拌した。沈殿物を回収し、表題の化合物 (6mg、1%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 0.89 (3H, t, J = 7.4 Hz, CH₃), 1.53 (2H, m, CH₂CH₃),
2.66 (2H, t, J = 7.4 Hz, NCH₂CH₂), 3.81 (3H, s, OCH₃),
3.85 (3H, s, OCH₃), 3.89 (2H, s, NCH₂Ar), 4.81 (2H, s,
NCH₂O), 5.06 (2H, s, H8), 6.17 (1H, s, H10), 6.74 (1H, s, H6), 6.79
(1H, s, H5), 6.95 (1H, d, J = 8.4 Hz, H5′), 7.00 (1H, dd, J = 2.4 Hz, 8.4 Hz, H6′),
7.13 (1H, d, J = 2.4 Hz, H2′)

実施例6: 4-(3-(4-メトキシベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(4-Methoxybenzyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (501mg、2.09
mmol) をエタノール (15ml) に溶解した。4-メトキシベンジルアミン (0.35ml、2.68 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (555mg、66%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 2.78 (3H, s, OCH₃), 3.82 (2H, s, NCH₂Ar), 3.84 (2H, s,
NCH₂Ar), 4.83 (2H, s, NCH₂O), 5.06 (2H, s, H8), 6.22 (1H,
s, H10), 6.71 (2H, bs, H4, H5), 6.85 (2H, d, J = 8.8 Hz, H3′, H5′),
6.89 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 7.25 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 7.35 (2H, d, J =
8.8 Hz, H2′, H6′), 8.59 (1H,
bs, OH)

実施例7: 4-(3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-Phenyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (501mg、2.09
mmol) をエタノール (15ml) に溶解した。アニリン
(0.25ml、2.74 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で3日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (53mg、7%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 4.60 (2H, s, NCH₂Ar), 5.04 (2H, s, H8), 5.40 (2H, s, NCH₂O),
6.19 (1H, s, H10), 6.72 (1H, s, H6), 6.85 (3H, m, H5, H3′, H5′),
7.14 (2H, m, ArH), 7.22 (3H, m, ArH), 7.35 (2H, d, J = 8.8 Hz, H2′, H6′), 8.49 (1H, s, OH).

実施例8: 4,4'-(クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3,7 (2H,4H,8H)-ジイル) ジフェノール (4,4'-(Chromeno[6,7-e][1,3]oxazine-3,7(2H,4H,8H)-diyl)diphenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (509mg、2.12
mmol) 及び4-アミノフェノール (307mg、2.81 mmol) をエタノール (15ml) に溶解した。ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
を添加して、反応液を室温で3日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (178mg、79%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 4.46 (2H, s, NCH₂Ar), 5.03 (2H, s, H8), 5.27 (2H, s, NCH₂O),
6.18 (1H, s, H10), 6.70 (3H, m, H4, ArH), 6.80 (1H, s, H5), 6.85 (2H, d, J =
8.8 Hz, H3′, H5′), 6.99 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 7.35 (2H, d, J = 8.8 Hz, H2′, H6′), 7.91 (1H, bs, OH), 8.46 (1H, bs,
OH).

実施例9: 7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(4-メトキシベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン
(7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-(4-methoxybenzyl)-2,3,4,8-tetrahydro-chromeno[6,7-e][1,3]oxazine)

7-ヒドロキシ-3',4'-ジメトキシイソフラブ-3-エン (152mg、0.53 mmol) をエタノール (2ml) に溶解した。4-メトキシベンジルアミン (0.1ml、0.77 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で2日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (102mg、43%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 3.80 (15H, m, NCH₂Ar, NCH₂Ar, OCH₃, OCH₃,
OCH₃), 4.83 (2H, s, NCH₂O), 5.08 (2H, s, H8), 6.23 (1H,
s, H10), 6.71 (1H, s, H6), 6.79 (1H, s, ArH), 6.89 (2H, d, J = 8.4 Hz, ArH),
6.94 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 7.00 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 7.14 (1H, s,
ArH), 7.25 (2H, d, J = 8.4 Hz, ArH).

実施例10: 3-(3-ベンジル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(3-(3-Benzyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

3',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (100 mg、0.42
mmol) をエタノール (4 ml) に溶解した。ベンジルアミン (0.14 ml、1.28 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.42ml、5.59 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。反応混合物を水
(50ml) に注いだ後、酢酸エチル (3×30ml) で抽出し、混合した有機層を還元した。100%ジクロロメタンを使用して、固体をフラッシュクロマトグラフィにかけた。画分6〜画分12を組合せて還元し、表題の化合物を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 3.85 (2H, s, NCH₂Ar), 3.89 (2H, s, NCH₂Ph), 4.85 (2H,
s, NCH₂O), 5.06 (2H, s, H8), 6.25 (1H, s, H10), 6.72 (1H, s, ArH), 6.80
(1H, m, H6), 6.95 (2H, m, ArH), 7.19 (1H, t, J = 8.0 Hz, H5′), 7.34 (5H, m, ArH).

実施例11: 3-(3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(3-(3-Phenyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

3',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (175mg、0.73
mmol) をエタノール (1ml) に溶解した。アニリン
(0.08ml、0.88 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で3日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (160mg、61%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 4.61 (2H, s, NCH₂Ar), 5.04 (2H, s, H8), 5.42 (2H, s, NCH₂O),
6.20 (1H, s, H10), 6.78 (1H, m, ArH), 6.82 (1H, s, H6), 6.89 (1H, s, H5), 6.95
(1H, m, ArH), 7.05 (2H, m, ArH), 7.18 (5H, m, ArH).

実施例12: 7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン
(7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-3-phenyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazine)

7-ヒドロキシ-3',4'-ジメトキシイソフラブ-3-エン (148mg、0.52 mmol) をエタノール (2ml) に溶解した。アニリン (0.6ml、0.66 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%) とを添加した。反応液を室温で3日間撹拌した。沈殿物を回収し、表題の化合物 (11mg、5%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 3.81 (3H, s, OCH₃), 3.85 (3H, s, OCH₃), 4.61 (2H, s,
NCH₂Ar), 5.06 (2H, s, H8), 5.41 (2H, s, NCH₂O), 6.19 (1H,
s, H10), 6.80 (1H, s, H6), 6.86 (1H, s, ArH), 6.94 (1H, d, J = 8.0 Hz, ArH),
7.00 (1H, dd, J = 2.2 Hz, 8.2 Hz, H6′), 7.14 (3H, m, ArH), 7.21 (3H, m, ArH).

実施例13: 3-ベンジル-7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン
(3-Benzyl-7-(3,4-dimethoxyphenyl)-10-methyl-2,3,4,8-tetrahydro-chromeno[6,7-e][1,3]oxazine)

7-ヒドロキシ-3',4'-ジメトキシ-8-メチルイソフラブ-3-エン (155mg、0.52
mmol) をエタノール (2.5ml) に溶解した。ベンジルアミン (0.07ml、0.23 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で2日間撹拌した。沈殿物を回収し、表題の化合物 (33mg、15%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 2.02 (3H, s, CH₃Ar), 3.82 (3H, s, OCH₃), 3.86 (5H, s,
OCH₃, CH₂Ph), 3.89 (2H, s, NCH₂Ar), 4.91 (2H,
s, NCH₂O), 5.11 (2H, s, H8), 6.58 (1H, s, H6), 6.79 (1H, s, ArH),
6.95 (1H, d, J = 8.4 Hz, ArH), 7.01 (1H, dd, J = 2.0 Hz, 8.4 Hz, H6′), 7.15 (1H, d, J = 2.0 Hz, ArH),
7.30 (5H, m, ArH).

実施例14: 7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン
(7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-10-methyl-3-propyl-2,3,4,8-tetrahydro-chromeno[6,7-e][1,3]oxazine)

7-ヒドロキシ-3',4'-ジメトキシ-8-メチルイソフラブ-3-エン (159mg、0.53
mmol) をエタノール (2.5ml) に溶解した。プロピルアミン (0.05ml、0.61 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で2日間撹拌した。沈殿物を回収し、表題の化合物 (7mg、3%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 0.90 (3H, t, J = 7.4 Hz, CH₃), 1.54 (2H, m, CH₂), 1.98
(3H, s, CH₃Ar), 2.66 (2H, t, J = 7.4 Hz, NCH₂), 3.82 (3H,
s, OCH₃), 3.86 (3H, s, OCH₃), 3.89 (2H, s, NCH₂Ar),
4.86 (2H, s, NCH₂O), 5.09 (2H, s, H8), 6.61 (1H, s, H6), 6.78 (1H,
s, H5), 6.96 (1H, s, ArH), 7.00 (1H, dd, J = 2.4 Hz, 8.4 Hz, H6′), 7.14 (1H, d, J = 1.6 Hz, ArH).

実施例15: 4-(3-(4-クロロベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(4-Chlorobenzyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (506mg、2.11
mmol) をエタノール (8ml) に溶解した。4-クロロベンジルアミン (0.33ml、2.70 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で4日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (748mg、88%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 3.86 (2H, s, CH₂Ph), 3.90 (2H, s, NCH₂Ar), 4.86 (2H, s,
NCH₂O), 5.06 (2H, s, H8), 6.23 (1H, s, H10), 6.72 (2H, bs, H4, H5),
6.85 (2H, d, J = 8.8Hz, H3′, H5′), 7.37 (m, 6H, H2′, H6′, H2″, H3″, H5″, H6″).

実施例16: 4-(3-(3-メトキシプロピル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(3-Methoxypropyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (509mg、2.12
mmol) をエタノール (8ml) に溶解した。3-メトキシプロピルアミン (0.28ml、2.74 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で4日間撹拌した。沈殿物を回収し、表題の化合物 (657mg、88%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 1.76 (2H, m, CH₂), 2.77 (2H, t, J = 7.4Hz, NCH₂), 3.24
(3H, s, OCH₃), 3.39 (2H, t, J = 6.4Hz, OCH₂), 3.89 (2H,
s, NCH₂Ar), 4.81 (2H, s, NCH₂O), 5.04 (2H, s, H8), 6.17
(1H, s, H10), 6.72 (1H, s, H6), 6.74 (1H, s, H5), 6.86 (2H, d, J = 8.8 Hz, H3′, H5′),
7.35 (2H, d, J = 8.8Hz, H2′, H6′).

実施例17: 3-(3-(3-メトキシプロピル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(3-(3-(3-Methoxypropyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

3',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (198mg、0.82
mmol) をエタノール (3ml) に溶解した。3-メトキシプロピルアミン (0.11ml、1.08 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で4日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (69mg、24%) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-acetone)
d 1.76 (2H, m, CH₂), 2.77 (2H, t, J = 7.6Hz, NCH₂), 3.24
(3H, s, OCH₃), 3.39 (2H, t, J = 6.4Hz, OCH₂), 3.91 (2H,
s, NCH₂Ar), 4.82 (2H, s, NCH₂O), 5.05 (2H, s, H8), 6.18
(1H, s, H10), 6.79 (3H, m, ArH), 6.94 (2H, m, ArH), 7.18 (1H, t, J = 8Hz, ArH).

実施例18: 4-(3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-p-Tolyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (499mg、2.08
mmol) 及びp-トルイジン (290mg、2.71 mmol) をエタノール (8ml) に溶解した。ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
を添加し、反応液を室温で2日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (167mg、22%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
2.16 (3H, s, CH₃), 4.50 (2H, s, NCH₂Ar), 4.98 (2H, s,
H8), 5.36 (2H, s, NCH₂O), 6.15 (1H, s, H10), 6.72 (1H, s, ArH), 6.75
(2H, d, J = 8.8Hz, ArH), 6.83 (1H, s, ArH), 7.00 (4H, d, J = 3.6 Hz, ArH), 7.31
(2H, d, J = 8.8 Hz, ArH).

実施例19: 7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン
(7-(3,4-Dimethoxyphenyl)-10-methyl-3-p-tolyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazine)

7-ヒドロキシ-3',4'-ジメトキシ-8-メチルイソフラブ-3-エン (173mg、0.58
mmol) 及びp-トルイジン (167mg、1.56 mmol) をエタノール (2ml) に溶解した。ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
を添加し、反応液を室温で2日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (36mg、14%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
1.90 (3H, s, CH₃Ar), 2.16 (3H, s, CH₃ArN), 3.74 (3H, s,
OCH₃), 3.79 (3H, s, OCH₃), 4.50 (2H, s, NCH₂Ar),
5.04 (2H, s, H8), 5.41 (2H, s, NCH₂O), 6.74 (1H, s, H6), 6.84 (2H,
m, ArH), 6.92 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 6.97 (1H, d, J = 2 Hz, ArH), 7.00 (2H, d,
J = 2.4 Hz, ArH), 7.10 (1H, d, J = 2 Hz, ArH).

実施例20: 3-(3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(3-(3-p-Tolyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

3',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (196mg、0.82
mmol) 及びp-トルイジン (130mg、1.21 mmol) をエタノール (1ml) に溶解した。ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
を添加し、反応液を室温で2日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (99mg、30%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
2.16 (3H, s, CH₃), 4.51 (2H, s, NCH₂Ar), 4.99 (2H, s,
H8), 5.37 (2H, s, NCH₂O), 6.17 (1H, s, H10), 6.69 (1H, dd, J = 1.4
Hz, 8.2 Hz, H6′),
6.83 (2H, bs, H4, ArH), 6.90 (1H, s, ArH), 6.99 (5H, m, ArH), 7.16 (1H, t, J =
8 Hz, H5′).

実施例21: 4-(7-(3-ヒドロキシフェニル) クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3 (2H,4H,8H)-イル) ベンゾニトリル
(4-(7-(3-Hydroxyphenyl)chromeno[6,7-e][1,3]oxazin-3(2H,4H,8H)-yl)benzonitrile)

3',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (196mg、0.82
mmol) 及び4-アミノベンゾニトリル (120mg、1.02 mmol) をエタノール (1ml) に溶解した。ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
を添加し、反応液を室温で2日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (23mg、7%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
4.67 (2H, s, NCH₂Ar), 5.00 (2H, s, H8), 5.51 (2H, s, NCH₂O),
6.24 (1H, s, H10), 6.70 (1H, dd, J = 2.0 Hz, 8.4 Hz, ArH), 6.84 (1H, m, ArH),
6.85 (1H, bs, H6), 6.91 (1H, d, J = 7.6 Hz, ArH), 7.16 (1H, t, J = 8 Hz, H5′), 7.25 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH),
7.65 (2H, d, J = 9.2 Hz, ArH), 9.47 (1H, bs, OH).

実施例22: 4-(3-m-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-m-Tolyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (522mg、2.17
mmol) をエタノール (8ml) に溶解した。m-トルイジン (0.3ml、2.77 mmol) 及びホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
を添加し、反応液を室温で3日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (386mg、48%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
2.22 (3H, s, CH₃), 4.54 (2H, s, NCH₂Ar), 4.98 (2H, s,
H8), 5.38 (2H, s, NCH₂O), 6.17 (1H, s, H10), 6.65 (1H, d, J = 7.6
Hz, ArH), 6.73 (1H, bs, H6), 6.75 (2H, d, J = 8.8 Hz, H3′, H5′),
6.85 (1H, s, ArH), 6.88 (1H, dd, J = 2.0 Hz, 8.0 Hz, ArH), 6.93 (1H, bs, ArH),
7.08 (1H, t, J = 7.6 Hz, H5″), 7.31 (2H, d, J = 8.8 Hz,
H2′, H6′), 9.60 (1H, bs, OH).

実施例23: 4-(3-(3-ニトロフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール (4-(3-(3-Nitrophenyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (527mg、2.19
mmol) 及び3-ニトロアニリン (333mg、2.41 mmol) をエタノール (8ml) に溶解した。ホルムアルデヒド溶液 (2ml、0.03mol、37wt%)
を添加して、反応液を室温で3日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (35mg、4%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
4.68 (2H, s, NCH₂Ar), 4.99 (2H, s, H8), 5.51 (2H, s, NCH₂O),
6.22 (1H, s, H10), 6.75 (3H, m, H4, H3′, H5′), 6.90 (1H, s, H5), 7.32 (2H, d, J =
8.8 Hz, H2′, H6′), 7.51 (1H, t,
J = 8.0 Hz, H5″), 7.60 (1H, dd, J = 2.0 Hz, 8.0 Hz,
ArH), 7.67 (1H, dd, J = 1.4 Hz, 7.8 Hz, ArH), 7.87 (1H, t, J = 2.2 Hz, ArH),
9.61 (1H, bs, OH).

実施例24: 4-(3-(4-クロロベンジル)-6-(4-メトキシフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(4-Chlorobenzyl)-6-(4-methoxyphenyl)-2,3,4,8-tetrahydro-chromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシ-4-(4-メトキシフェニル) イソフラブ-3-エン (205mg、0.59
mmol) をエタノール (1ml) に溶解した。4-クロロベンジルアミン (0.09ml、0.74 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (0.6ml、8.06 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で3日間撹拌した。得られた沈殿物を回収し、表題の化合物 (90mg、30%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-benzene) d
3.29 (3H, s, OCH₃), 3.47 (2H, s, CH₂Ph), 3.62 (2H, s, NCH₂Ar),
4.56 (2H, s, NCH₂O), 5.06 (2H, s, H8), 6.37 (2H, d, J = 8.4 Hz,
ArH), 6.72 (1H, s, H10), 6.77 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 6.85 (2H, d, J = 8.4
Hz, ArH), 6.96 (2H, d, J = 8.8 Hz, ArH), 7.02 (1H, s, H5), 7.15 (4H, dd, J =
2.2 Hz, 8.6 Hz., ArH).

実施例25: 4-(10-ブロモ-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(10-Bromo-3-propyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

8-ブロモ-4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (198mg、0.62 mmol) をEtOH
(1ml) に溶解した。プロピルアミン (0.1ml、1.22
mmol) 及びホルムアルデヒド溶液 (0.3ml、4.03
mmol、37wt%) を添加し、反応液を室温で24時間撹拌した。沈殿物を回収し、表題の化合物を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-DMSO) d
0.84 (3H, t, J = 7.3Hz, CH₃), 1.48 (2H, m, CH₂2CH₃),
2.57 (2H, t, J = 7.3 Hz, NCH₂CH₂), 3.88 (2H, s, NCH₂Ar),
4.92 (2H, s, NCH₂O), 5.13 (2H, s, H8), 6.74 (1H, s, H6), 6.77 (2H,
d, J = 8.8 Hz, H3′,
H5′), 6.78 (1H, s, H5), 7.34 (2H, d, J = 8.8 Hz, H2′, H6′), 9.62 (1H, bs, OH).

実施例26: 3,4'-(10-メチル-クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3,7 (2H,4H,8H)-ジイル) ジフェノール (3,4'-(10-Methyl-chromeno[6,7-e][1,3]oxazine-3,7(2H,4H,8H)-diyl)diphenol)

3',7-ジヒドロキシ-8-メチルイソフラブ-3-エン
(204mg、0.802 mmol) 及び4-アミノフェノール (103mg、0.944 mmol) をEtOH (1ml) に溶解して、ホルムアルデヒド溶液 (0.3ml、4.03 mmol、37wt%) を添加した。反応液を室温で3日間撹拌したが、その後沈殿は起こらなかった。反応混合物を急速に撹拌した蒸留水
(10ml) に注ぎ、得られた沈殿物を回収して、表題の化合物 (143mg) を得た。
¹H NMR (400 MHz , d₆-DMSO) d
1.91 (3H, s, CH₃), 4.41 (2H, s, NCH₂Ar), 5.02 (2H, s,
H8), 5.31 (2H, s, NCH₂O), 6.53-7.19 (10H, m, Ar, H5, H6), 8.93 (1H,
bs, OH), 9.45 (1H, bs, OH).

実施例27: 4-(8-エチル-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(8-Ethyl-3-propyl-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシ-2-エチルイソフラブ-3-エン
(390mg、1.45 mmol) をエタノール (20ml)
に溶解した。プロピルアミン (0.16ml、1.95
mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (4ml、0.054mol、37wt%) とを添加した。反応液を室温で16時間撹拌した。吸引しながら黄色の沈殿物を回収し、表題の化合物 (217mg、43%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
9.56 (1H, br s, OH), 7.35 (2H, d, J = 8.7 Hz, H-2',6'), 6.76-6.73 (3H, m,
H-3',5', H5), 6.67 (1H, s, H6), 6.18 (1H, s, H10), 5.15 (1H, dd, J = 3.0 Hz,
9.5 Hz, H8), 4.81-4.76 (2H, m, NCH₂O), 3.31 (2H, s, NCH₂Ar),
1.65-1.38 (6H, m, CH₂CH₂CH₃, CH₂CH₃),
0.91 (3H, t, J = 7.3 Hz, CH₂CH₃), 0.84 (3H, t, J = 7.3
Hz, CH₂CH₂CH₃).

実施例28: 4-(3-(4-tert-ブチルフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール (4-(3-(4-tert-Butylphenyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (500mg、2.08
mmol) を無水エタノール (10mL) に溶解した。4-tert-ブチルアニリン (311mg、2.08 mmol) と、その後ホルムアルデヒド溶液 (6mL、0.04mol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (134mg、15%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
1.22 (9H, s, CH₃, CH₃, CH₃), 4.53 (2H, s, CH₂Ar),
5.00 (2H, s, H8), 5.39 (2H, s NCH₂O), 6.18 (1H, s, H10), 6.78 (2H,
d, J = 8.6 Hz, ArH), 6.86 (1H, s, H6), 7.04 (2H, d J = 8.7 Hz, ArH), 7.24 (2H,
d, J = 8.7 Hz, ArH), 7.33 (2H, d, J = 8.6 Hz, ArH), 9.63 (1H, s, OH).

実施例29: 4-(3-(4-tert-ブチルベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(4-tert-Butylbenzyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (500mg、2.08
mmol) を無水エタノール (10mL) に溶解した。4-tert-ブチルベンジルアミン (340mg、2.08 mmol) と、その後ホルムアルデヒド (6mL、0.09 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (407mg、43%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
1.28 (9H, s, CH₃, CH₃, CH₃), 3.80 (4H, s, CH₂Ar,
NCH₂Ar), 4.84 (2H, s, NCH₂O), 5.03 (2H, s, H8), 6.24 (1H,
s, H10) 6.73 (1H, s, ArH), 6.76 (1H, s, H6), 6.78 (2H, d, J = 8.7, ArH), 7.24
(2H, d, J = 8.1, ArH), 7.33 (2H, d, J = 8.7, ArH), 7.36 (2H, d, J = 8.2, ArH),
9.63 (1H, s, OH).

実施例30: 4-(3-(ナフト-1-イル-メチル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール4-(3-(Naphth-1-yl-methyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (500mg、2.08
mmol) を無水エタノール (10mL) に溶解した。1-ナフタレン-メチルアミン (327mg、2.08
mmol) と、その後ホルムアルデヒド (6mL、0.09
mmol、37wt%) とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。白色沈殿物を回収し、表題の化合物 (337mg、38%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) δ 3.87 (2H, s, CH₂Ar),
4.27 (2H, s, NCH₂Ar), 4.90 (2H, s, NCH₂O), 5.05 (2H, s,
H8), 6.30 (1H, s, H10), 6.76 (1H, s, ArH), 6.78 (1H, s, H6), 7.39 (1H, d, J =
6.8, ArH), 7.47 (1H, dd, J = 7.6, 7.6, ArH), 7.54 (2H, m, ArH), 7.89 (1H, d, J
= 8.1, ArH), 7.94 (1H, m, ArH), 8.22 (1H, m, ArH), 9.64 (1H, s, OH).

実施例31: 4-(3-(3,4-ジメチルフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(3,4-Dimethylphenyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (500mg、2.08
mmol) を無水エタノール (10mL) に溶解した。3,4-ジメチルアニリン (293mg、2.08 mmol) と、その後ホルムアルデヒド (6mL、0.09 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。淡桃色
(light pink) の沈殿物を回収し、表題の化合物 (166mg、21%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
2.10 (3H, s, CH₃), 2.15 (3H, s, CH₃), 4.52 (2H, s, NCH₂Ar),
5.00 (2H, s, H8), 5.37 (2H, s, NCH₂O), 6.18 (1H, s, H10), 6.78 (1H,
s, H6), 6.81 (1H, dd, J = 8.2, 2.4, ArH), 6.85 (1H, s, ArH), 6.93 (1H, d, J =
2.0, ArH), 6.97 (1H, d, J = 8.2 ArH), 7.33 (1H, d, J = 8.6), 9.63 (1H, s, OH).

実施例32: 4-(3-(4-メトキシフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル) フェノール
(4-(3-(4-Methoxyphenyl)-2,3,4,8-tetrahydrochromeno[6,7-e][1,3]oxazin-7-yl)phenol)

4',7-ジヒドロキシイソフラブ-3-エン (500mg、2.08
mmol) を無水エタノール (10mL) に溶解した。4-メトキシアニリン (271mg、2.08 mmol) と、その後ホルムアルデヒド (6mL、0.09 mmol、37wt%)
とを添加した。反応液を室温で1日間撹拌した。桃色 (pink)
沈殿物を回収し、表題の化合物 (71mg、9%) を得た。
¹H NMR (400 MHz, d₆-DMSO) d
3.67 (3H, s, OCH₃), 4.48 (2H, s, NCH₂Ar), 5.01 (2H, s,
H8), 5.33 (2H, s, NCH₂O), 6.18 (1H, s, H10), 6.75 (1H, s, H6), 6.78
(2H, d, J = 8.6, ArH), 6.81 (2H, d, J = 9.0, ArH), 6.85 (1H, s, ArH), 7.05 (2H,
d, J = 9.0, ArH), 7.33 (2H, d, J = 8.6, ArH), 9.63 (1H, s, OH).

上記の一般的方法において、構造体は任意で適切な置換体、又はシントン (synthons) 若しくはそれらの誘導体で置換するか、又はこれらで保護してもよい。熟練した合成化学者が特定できる如く、及び本明細書中の上記で一般的に記載される如く、化合物は、例えば、それらの塩、酢酸塩、ベンジル誘導体又はシリルオキシ誘導体として存在してもよい。ヒドロキシ基は、容易にアルキル化 (MeI/塩基) 、アシル化 (Ac₂O/Py)
又はシリル化 (Cl-SiR₃/塩基) でき、さらに当該技術分野で既知の標準的な方法によって脱保護することができる。

[2.0 抗炎症性活性]
[2.1 ヒト単球におけるエイコサノイド合成に対する効果]
<方法>
U937細胞を解凍し、2×10⁵細胞／mlで、RPMI及び10%FCS中で再懸濁した。細胞を37℃、5%CO₂でインキュベートし、総細胞数が少なくとも6.4×10⁷個になるまで成長培養液 (growing culture) 中で拡張させた。それから、細胞を新たな培地中で再懸濁し、2×10⁵細胞／mlで、5μMのレチノイン酸 (RA) と共にさらに3日間 (72時間) 培養した。RA処理細胞を無血清RPMIで2回洗浄し、5×10⁶細胞／mlで、無血清培地中で再懸濁した。テフロン試験管に、1個の試験管当たり1mlで、細胞を分注した (aliquotted) 。上記のように、各試験化合物の作業ストック溶液
(working stock solutions) を0.1 mM、1 mM及び10 mMで調製した。各作業希釈液の各試験化合物について、10μlを細胞1mlに添加して、各試験化合物の最終濃度を0μM (DMSO単独) 、1μM、10μM及び100μMにさせた。細胞は試験化合物と37℃で15分間インキュベートした (それぞれの濃度につき3重にした (in triplicate) ) 。15分の前インキュベーション後、細胞の入った1ml容の試験管のそれぞれに、100 mMのカルシウムイオノフォアA23187の溶液5μlを入れた (A23187が0.5μMに達した) 。37℃でのインキュベーションをさらに30分間続けた。インキュベーション後、2000rpmで10分間の遠心分離によって、上清を回収し、アッセイで必要になるまで-20℃で保存した。

<結果>
以下の表1及び2は、RA刺激U937細胞におけるPGE₂合成及びTXA₂合成に対する試験化合物 (1) 及び (2) の効果を示している。化合物 (2) は、PGE₂合成を阻害することが示される一方で、化合物 (1) 及び化合物 (2) の両方が、100μMでTXA₂合成を阻害することが示された。

^aは、対照 (0用量) とは有意に異なる。

^aは、対照 (0用量) とは有意に異なる。

[2.2 ヒト単球におけるTNFα合成に対する効果]
<方法>
単核細胞
(mononuclear cells) のリンフォプレップ (lymphoprep) 勾配分離と、その後の向流遠心水簸 ( counter-current centrifugal elutriation) によって、バフィーコートからヒト末梢血単球を単離した (Demasi et al. 2000) 。試験化合物をDMSOに溶解し、新鮮な単球に添加し、濃度を0μM、10μM及び100μMにさせた。30分後、LPSを添加し、最終濃度を200
ng/mlにさせた。1時間後、上清を除去し、以前に記述されたELISA
(Demasi et al. 2003) によってTNFαを測定した。ANOVAと、その後のニューマン-クール多重比較検定を使用して、用量と対照値との間の差を調べた。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) は、LPSで刺激したヒト単球によってTNFαの合成を低減させることが示された (図1a及び図1bを参照されたい) 。

[2.3 マウスのマクロファージ細胞株RAW264.7における抗炎症性効果]
<方法>
マウスマクロファージ細胞株RAW264.7をウシ胎仔血清 (FCS) 、2 mMのグルタミン及び50 U/mlのペニシリン／ストレプトマイシンを補充したDMEM中で培養した。細胞を試験化合物 (0.025%DMSO中) 又は媒体単独のいずれかで処理し、その1時間前に50 ng/mlのLPSを添加した。24時間のインキュベーション後、ELISA (Cayman Chemical) によるPGE₂又はTXB₂の測定、及びELISA (Becton
Dickinson) を使用したTNFα測定のために、細胞培地を回収した。

亜硝酸塩
(nitrite) 濃度は、NO産生の定量的な指標であり、グリース反応 (Griess Reaction) によって求めた。要するに、グリース試薬100μLを各上清 (2重にした (in
duplicate) ) 50μLに添加した。550nmの吸光度を測定し (Molecular Devices, SpectraMax 250 マイクロプレート分光光度計, CA, USA) 、亜硝酸ナトリウムの検量線に対して、亜硝酸塩濃度を求めた。亜硝酸塩阻害 (nitrite inhibition) 百分率を以下のように算出した：

[100− (試料の亜硝酸塩濃度／媒体対照LPS細胞の亜硝酸塩) ×100]。

<結果>
試験化合物を10μMの濃度で調べた。図2から、幾つかの化合物が、幾らかの毒性を示すことが分かり、このことが様々な分析物に引き起こした阻害量に影響したであろう。従って、様々な分析物に対する試験化合物の効果を評価するために、以下の式を用いて、細胞生存率を考慮した：

試験化合物の実際の効果＝測定効果− (細胞生存率に対する効果×測定効果)

RAW264.7マウスマクロファージに対する媒体単独での処理と比較して、化合物を調べた。LPS誘導PGE₂合成の平均変化を図3に示し、化合物 (2) 、 (9) 、 (14) 、 (12) 、 (23) 及び (24) で最も大きい阻害を示している。LPS誘導TXB₂合成の平均変化を図4に示し、化合物 (2) 、 (8) 、 (9) 、 (14) 、 (23) 及び (24)
で最も大きい阻害を示している。LPS誘導TNFα合成の平均変化を図5に示し、化合物 (1) 、 (4) 、 (6) 、 (17) 及び (22) で最も大きい阻害を示している。LPS誘導NO合成の平均変化を図6に示し、化合物 (3) 、 (4) 、 (7) 、 (14) 、 (19) 、 (22) 、 (23) 及び (24) で最も大きい阻害を示している。

[2.4 形質移入 (transfected) ヒトマクロファージ細胞株、THP-1におけるNFκB産生に対する効果]
<方法>
アッセイは、遺伝子操作したTHP-1細胞株及びGeneBLAzer (登録商標) β-ラクタマーゼ法
(Invitrogen社) を利用する。ヒトTHP-1単球／マクロファージは、NFκB応答エレメントの制御下で、安定にトランスフェクトしたβ-ラクタマーゼレポーター遺伝子を含有する。これらは、TNF-αによる刺激に応答し、これによって、NFκBシグナル経路が活性化する。細胞と、TNF-α及び試験材料との同時インキュベーション (co-incubation) によって、試験材料がTNFa刺激β-ラクタマーゼ産生を阻害する能力の定量的測定が可能になる。炎症指標 (Inflammatory index) を、β-ラクタマーゼ産物と、β-ラクタマーゼ基質との比として算出する。

手短に言えば、RPMI
1640培地 (70μl) の存在下で、遺伝子操作したTHP-1細胞を96-ウェルプレートのウェル (50×10³細胞／ウェル) に播種した。TNFαを各ウェルに加え
(10μl) 、7.5 ng/mlの最終濃度を得た。透析ウシ血清を加えた (10μl) 。それから、DMSO
(10μL) に溶解した化合物を加えた (各化合物に対して5個のウェル) 。各プレートは、非細胞対照 (4個のウェル) 、非血清対照 (4個のウェル) 及び2つの血清対照を含有していた。プレートを37℃で5時間、インキュベートし、NFκB刺激β-ラクタマーゼを産生させた。それから、LiveBLAzerTM FRET B/G Substrate (CCF4-AM) 基質をアッセイに加えた。CCF4-AMは、Invitrogen 社で開発された、β-ラクタマーゼに対する蛍光共鳴エネルギー転移 (Forster resonance
energy transfer) (FRET) ベースの基質である。CCFA-AMが細胞に入ると、内因性エステラーゼによって負に帯電したCCF4に変換する。409nmでのこの基質の励起によって、クマリン部分とフルオレセイン部分との間で効率的なFRETが起こり、530nmで検出可能な緑色蛍光が生じる。β-ラクタマーゼの存在によって、CCF4が切断され、FRETの喪失が起こり、460nmで検出可能な強い青色蛍光シグナルが生じる。このように、β-ラクタマーゼ (NFκB-プロモータ活性のマーカー) の活性を、産物と基質との比として測定する (青色／緑色の蛍光比：460nm/530nm) 。炎症指標の測定では、プレート内CVが2.1%であり、プレート間CVは8.9%である。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) をこのアッセイで調べた。30μMは、試験化合物のNFκB-阻害活性を比較するのに最適な濃度であったことを見出した。表3から見られるのと同様に、50μM及び100μMの化合物によって、細胞生存率が低減した。30μMの試験化合物とのインキュベーション後のデータを示す。

[3.0 抗酸化体活性]
酸化リポタンパク質は、アテローム発生を促進する細胞機能において幾つかの変化を誘発すると考えられている。酸化した低密度リポタンパク質 (LDL) は、炎症促進性であり、これは内皮細胞機能不全を引き起こす可能性があり、動脈壁内で容易に蓄積する (Rosenson 2004) 。動物における研究によって、動脈損傷に応答した酸化体の放出の証拠が与えられ、血管形成術後に動脈硬化性病変に残る主な細胞型であるマクロファージ及び平滑筋細胞が両方とも、活性酸素種を産生する可能性がある (Libby and Ganz 1997) 。結果として、化合物がLDLの酸化を阻害する能力は、全体としてアテローム性動脈硬化を低減する能力に寄与し得る。幾つかのアッセイで、化合物 (1) 及び化合物 (2) には、強い抗酸化活性があることが実証されている。

[3.1 フリーラジカル除去に対する効果]
<方法>
安定なフリーラジカル化合物2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) を使用して、試験化合物の抗酸化 (フリーラジカル捕捉) 活性を評価した。エタノール中、0.1 mMの濃度で、DPPHのストック溶液を調製し、使用の10分前に混合した。濃度が100μMの試験化合物をDPPHと20分間反応させた後、517nmでの吸光度を測定した。初回のスクリーニングは100 mMで行った。517nmでの吸光度の変化を、試薬ブランク (エタノール単独でのDPPH) と比較した。ここで、化合物は、100μMで有意なフリーラジカル除去活性
(Δ_Abs > 0.3) を有することを見出し、用量応答曲線を作成した。IC₅₀値は、0.6の吸光度変化を引き起こす試験化合物の濃度と推定した (DPPHラジカルの総除去 (total scavenging) を表す吸光単位が1.2である) 。

<結果>

[3.2 低密度リポタンパク質 (LDL) の酸化の阻害に対する効果]
<方法>
静脈穿刺によって血液を回収し、遠心分離によって血漿を分離した。それから、4段階ナトリウム塩化物密度勾配を用いて、血漿からLDLを単離し、4℃で20時間、200,000gで超遠心分離した。回収LDLは、ゲル濾過PD10カラムを通すことで精製し、過剰な塩及びEDTAを除去し、4℃暗所で保存して、自己酸化 (auto-oxidation) を防ぎ、2週間の単離に使用した。標準的な酵素法を用いてLDLコレステロール含量を測定し、また、標準としてBSAを使用したローリー法によってタンパク質濃度を求めた。

各実験日に、LDLのアリコート2mLを第2のPD10カラムに通し、キレックス処理PBS (100 mM) で希釈し、0.1 mg/mlの標準的なタンパク質濃度、即ち1つの反応当たりの最終濃度を得た。CuSO₄の最終濃度が5μMになるように、新たに調製したCu²⁺溶液を添加することによって酸化反応を開始した。阻害研究のために、室温で2分間、5つの化合物 (最終濃度が0.1μM、1.0μM、10μM及び100μM) でLDLを前処理した後、銅溶液を添加し、続いて37℃でインキュベートした。3時間にわたって30分毎に取り出して、アリコートでの脂質−過酸化物の形成を測定することによって、リポタンパク質の酸化の程度を求めた。標準過酸化水素曲線 (standard hydrogen peroxide curve) (5μM〜200μM) を使用した第一鉄酸化-キシレノールオレンジアッセイ (ferrous oxidation-xylenol
orange (FOX) assay) によって、各時点で過酸化物を求めた。別々の日に行った少なくとも2つの別個の実験において、化合物 (1) 及び化合物 (2) を調べた。

また異なる日において二重で (in duplicate) 、試験化合物とCu²⁺との非特異的結合を調べた。DMSO中、5 mMの濃度で試験化合物のストック溶液を調製した。それから、リン酸バッファー (10 mM、pH 7.2、キレックス処理) 中で25μMまで試験化合物を希釈した後、200nm〜800nmでUV/Vis吸収スペクトルを測定した。200nm〜800nmで二次オーバーレイ吸収スペクトルを精査することによって、化合物と銅 (II) との相互作用を求めた (そのために、25μMのCuSO₄溶液を新たに25μMの試験化合物溶液に添加し、20秒間混合した) 。

<結果>
LDL酸化遅延期間 (lag period) は、およそ60分であり、120−180分までに最大酸化が達成された。0.01μM〜10μMと濃度が増加するとともに、試験化合物がLDL酸化を阻害する能力が増大した。酸化の50%が阻害された濃度、EC₅₀を、化合物 (1) では0.61μM及び化合物 (2) では0.63μMと算出した。

1:1のモル比においてCu²⁺と試験化合物の吸収バンド (absorbance
bands) への有意なシフトはなかった。化合物単独と比較して、Cu²⁺と各化合物の吸収バンドには、非常に小さく、且つ一貫した増大が存在した。これらの結果から、試験化合物がCu²⁺と相互作用しなかったと結論付けることができる。このことはまた、LDL酸化の根底にある阻害機構はおそらく、Cu²⁺イオンと試験化合物との直接的な相互作用によるものではないことを示している。

[3.3 過酸化ラジカル誘導赤血球 (RBC) 溶解に対する効果]
<方法>
新たに回収したヘパリン化静脈血 (heparinised venous blood) (10ml、氷上) を1.8ml容の滅菌エッペンドルフ管に等分し、4℃で10分間、2600rpmで遠心分離した。血漿及び軟膜層を除去した後 (およそ900ml) 、滅菌氷冷PBS
900mlを添加することによって、濃縮 (packed) 赤血球 (RBC) を洗浄した。この洗浄手順を2回繰り返した。滅菌氷冷PBS 900mlを添加することによって、濃縮RBCを再懸濁した (RBCストックと名付けた) 。RBCストックを最大で3日間、4℃で保存した。RBCストック200mlを滅菌氷冷PBS 10mlに希釈して、各ウェルに50ml添加することによって、全てのRBC作業懸濁液を毎日新たに調製した。

個々の実験に対して以下のように、AAPHストックを新たに調製した。AAPH (1.22gm) をPBS 7.5 mlに溶解し、600 mMの4×ストックを得た後、アリコート50ml (最終濃度150 mM) を各ウェルに加え、溶解アッセイを開始した。試験化合物のストック溶液
(100%DMSO中、40 mM) を滅菌PBSで希釈し、1つのウェル当たりの最終濃度を100 mM、30 mM及び10 mMにさせた。各実験で適切な対照が含まれていた。各ウェルにおける最終DMSO濃度が0.25%になるように、全ての化合物希釈を調整した。総容量が1つのウェル当たり200mlの96-平底ウェルマイクロタイタープレートで、ペルオキシ誘導RBC溶解アッセイを行なった。ゆっくりとボルテックスしながら、690nm (37℃) でTecanマイクロプレートリーダーを使用して、RBC懸濁液の濁度をモニタリングした。アッセイを四重で (in
quadruplicate) 行い、5時間にわたって5分毎に読み取った。時間に対して、吸光度
(4つの読み取りの平均) をプロットすることによってRBC溶解曲線 (lysis curves) を構築した。最も高い吸光度 (溶解なし) 及び最も低い吸光度 (最大溶解) を読み取ることによって、半溶解 (half-lysis) までの時間を算出した。これらの2つの読み取りの合計を2で割り、半溶解での吸光度を得た。単純回帰分析を用いて、半溶解の光吸収 (half-lysis absorbance) が起こる時間を算出した。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) をこのアッセイで調べた。赤血球の半溶解までのAAPH誘導時間を遅延させることによって、両方の化合物が抗酸化活性を有することを見出した。

[4.0 抗アテローム生成活性 (Anti-atherogenic activity) ]
[4.1 動脈細胞における接着分子発現に対する効果]
<方法>

ELISA法により細胞接着分子の表面発現を測定することによって、化合物によるTNFα刺激内皮細胞活性化 (TNFα-stimulated
endothelial cell activation) の阻害を評価した。成長培地 (growth
medium, Cell Applications 社) 中のヒト動脈内皮細胞 (human arterial endothelial cells, HAEC) を、1つのウェル当たり10,000個の細胞の密度で96ウェルプレートに播種した。加湿インキュベータにおいて、プレートを37℃で一晩インキュベートし、細胞をコンフルエントにさせた。実験の朝に、培地100μlを含有した各ウェルにTNFα (10μl、2 ng/ml) を加えた。化合物をDMSO含有培地 (2.5%DMSO) で希釈し、化合物の濃度が100μM及び300μMとなるようにした。最終濃度が10μM及び30μMになるように、化合物をウェルに加えた。DMSO含有培地単独を、濃度が0の対照ウェルに加えた。全てのサンプルを四重で測定した (1つの処理当たり4つのウェル) 。

化合物とのインキュベーション後、培地を除去し、非特異的IgG又はE-セレクチン、ICAM若しくはVCAMに対する特異的なマウス抗体 (BD Biosciences-10%熱失活ヒト血清を有する緩衝生理食塩水100μL中、0.1μg) のいずれかで細胞をプロービングした。ヒツジ抗マウス抗体／ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役体 (conjugate) の添加によって、接着分子発現を検出した。プレートを30分間静置させた後、単層 (monolayers) を洗浄し、ヒツジ抗マウス抗体／ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役体 (10%熱失活ヒト血清及び0.05% Tween 20を有するHBSS 100μL中で1:500) を添加し、30分間置いた。さらに洗浄した後、ABTS基質 (Kirkegaard and Perry Laboratories) 150μLを各ウェルに加え、15分間発色 (develop) させた。ELISAリーダー (Titertek Multiscan, Flow
Laboratories) によって405nmで光学密度を測定した。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) をこのアッセイで調べた。100μMで、試験化合物はHAEC生存率に顕著に影響を与えた。化合物によっては、HAEC生存率は、30μMで80%未満であった。このようにして、10μMが、このアッセイで (複数の) 化合物の活性を比較するのに最も適切な濃度であったことを見出した。

両方の化合物は、TNFα誘導されたVCAM、ICAM-1及びE-セレクチン発現を阻害する有意な能力を有していた (図7を参照されたい) 。

[4.2 血管平滑筋細胞 (vascular smooth muscle cells) の増殖に対する効果]
<方法>
ヒト臍帯静脈平滑筋細胞 (human umbilical vein smooth muscle cells, HUVSMC) に対する試験化合物の効果を調べた。1つのウェル当たり1.6×103個の細胞の低播種率で細胞を96ウェルプレートに播種し、24時間付着できるようにした。それから、細胞をFCS無し培地で2回洗浄し、FCS無し培地で20時間インキュベートし、これらを血清飢餓させた。20μMで、FCS無し培地において類似体
(analogue) を調製し、プレートに加え、1時間インキュベートした。したがって、最終類似体濃度は10μMであった。それから、培地+20%FCSを添加することによって細胞を刺激し、最終FCS濃度を10%にさせた。対照細胞 (即ちFCSを有するが、化合物を有しないもの) がちょうどコンフルエントになるまで (5日) 、細胞をインキュベートした。MTTアッセイを行い、類似体処理細胞における吸光度の対照との差を以下の式を用いて算出した：

試験／対照*100-100。

<結果>
HUVSMCの増殖に対する試験化合物の効果は、化合物 (1) 、 (2) 、 (7) 、 (8) 、 (17) 、 (18) 、 (19) 及び (20) が、10μMでFCSによって誘導される増殖を有意に阻害したことを示した (図8を参照されたい) 。

[5.0 マウス耳炎症における抗炎症性活性]
幾つかのインフラモーゲン (inflammogens)-アラキドン酸 (AA) 及び4-β-ホルボール 12-ミリスチン酸 13-酢酸 (4-β-phorbol
12-myristate 13-acetate, PMA) の局所投与によって誘導された、マウスにおける耳介腫脹 (ear swelling) を阻害する能力に関して、化合物を調べた。

エイコサノイドの直前の前駆物質であるAAによる炎症反応は、シクロオキシゲナーゼ (cyclooxygenase, COX) 経路及びリポキシゲナーゼ (lipoxygenase, LOX) 経路の両方を介したAA代謝産物の形成によるものである (Young et al. 1984) 。耳の厚さの増大に先立ち、AAは、PGE₂及びLTC4両方の合成の初期 (10分〜15分) 増大を誘導する (Opas et al. 1985；Chang et al. 1986) 。

PMAによって誘導される炎症は、幅広いシグナル誘導プロセスに重要な役割を果たすリン脂質依存性タンパク質酵素 (phospholipid-dependent protein enzyme) であるプロテインキナーゼC (PKC) の活性化を伴う (Silvan et al. 1996；Bermejo et al. 1998) 。言い換えれば、PMAは、PKC活性化因子である (Kuchera et al. 1993) 。PKCは、ホスホリパーゼA2の活性化を媒介し、遊離AAを放出させ、その後ロイコトリエン (leukotrienes, LTs) 及びプロスタグランジン (prostaglandins, PGs) を合成する。炎症は主に、LTB₄のレベルとしてではなく、PGE₂のレベルとして、PGE₂によって媒介され、PMA処理マウスの耳でLTC₄は上昇する (Ashendel and Boutwell 1979；Bermejo et al.
1998；Alexandre-Moreira et al. 1999) 。

<方法>
体重が15g〜21gの5〜6匹の雌のBALB/cマウス群 (ARC, WA, オーストラリア) に、インフラモーゲンを耳に適用する30分前又は直前に、25mg/kgの試験化合物を腹腔内 (i/p) 注射した (ポリエチレングリコール (PEG) 400：リン酸緩衝生理食塩水 (PBS) 1:1又はエタノール：プロパンジオール：PBS 4:9:7に入れて送達した) 。イソフルラン (isoflurane) を使用して、マウスに麻酔をし、スプリングマイクロメータを使用して、両方の耳のベースラインの厚さを測定した。各マウスは総量で20μLのエタノール中AA (50
mg/ml又は200 mg/ml) 、又はエタノール若しくはアセトン中PMA (0.2 mg/ml) のいずれかを、受け取った (各耳介 (pinna) の内面及び外面に適用した) (即ち1つの耳当たりAA 0.5mg若しくは2mg又はPMA 2μg) 。再びマウスに麻酔をし、AA適用後1時間及びPMA後5時間で、耳を再び測定した。

各耳に対してインフラモーゲンの適用前及び適用後の耳介腫脹 (ear swelling) の差を算出し、各マウスの2つの耳で平均をとった。複数の化合物を1つの実験で調べる場合はダネット多重比較検定 (Dunnett's Multiple
Comparison test) を、又は1つだけの化合物を調べる場合は両側の対応のないt検定 (two-tailed unpaired t-test)
(Prism 4, Graphpad Software) を用いた一般的なANOVAを使用して、媒体単独を与えた群と比較した各試験群の平均腫脹の差を算出した。

浮腫の平均阻害百分率としてデータを図で表し、以下のように算出した：

[1-[ (試験群の耳の厚さの平均％変化／対照群の耳の厚さの平均％変化) ×100]]。

<結果>
試験化合物による処理が、AA誘導及びPMA誘導された耳浮腫を阻害した相対量を以下の表9及び表10で表す。

[6.0 ラット大動脈輪 (aortic ring) アッセイにおける血管拡張性活性]
ラット大動脈輪アッセイを用いて、ex situで試験化合物の血管拡張能を調べた。試験槽へのノルアドレナリンの添加によって、大動脈輪が収縮し、そして、試験薬剤によって血管収縮が阻害される場合、即ち試験薬剤がノルアドレナリンの効果に拮抗する場合、この薬剤が血管拡張活性を有し得ることが示唆される。

<方法>
雄のスプラーグドーリーラット (Sprague-Dawley rats) (250±50g) を80%CO₂及び20%O₂で安楽死させた。胸部大動脈を切除し、迅速に記載 (Chin-Dustinget al. 2001) の臓器槽
(organ-baths) にマウントした。試験化合物を使用して (1μg/mlの濃度で送達した) 、また使用せずに、ノルアドレナリン (0.1nM〜10 mM) に対して、完全な濃度-収縮曲線を得た。5匹の異なる動物由来のn=5の異なる大動脈輪で実験を繰り返した。任意の一動物由来の任意の一大動脈輪で、任意の一濃度の化合物を1つだけ調べた。S字型の用量応答曲線をデータにフィットさせ、logEC₅₀を算出した (Prism 4, GraphPad
Software) 。両側の対応のあるt検定を用いて、試験化合物の有無の間でのこれらの値の差を算出した。β-エストラジオール (β-oestrodiol)
及び媒体単独の効果をそれぞれ、正の対照及び負の対照として調べた。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) をこのアッセイで調べた。化合物 (1) (p=0.0252) 及び化合物 (2) (p=0.0115) が、媒体単独と比較して、ノルアドレナリンに対する大動脈輪の収縮応答 (logEC₅₀) を有意に阻害した (図9を参照されたい) 。これらのデータが、化合物 (1) 及び化合物 (2) は、心保護的であることに加えてさらに、心血管性の活性 (cardiovascular activity) を有することを示している。

[7.0 免疫調節活性]
<方法>
およそ6週齢の雄のSkh-1:HR1 (無毛) マウスを頚椎脱臼によって屠殺した。脾臓から単細胞懸濁液 (single cell suspensions) を作製し、赤血球をバッファー中で溶解した (0.14MのNH₄Cl、17 mMのトリス、pH 7.2) 。残存する脾細胞を10% (v:v) FBS、200 mMのL-グルタミン、ペニシリン／ストレプトマイシン及び50 mMの2-メルカプトエタノールを補充したRPMI-1640 (Gibco) 中で培養した。四つ組の (quadruplicate) ウェルに脾細胞を加えた。ウェルは、コンカナバリンA
(concanavalin A, ConA、Sigma-Aldrich−0.4μg/ウェル) 、LPS (Sigma-Aldrich−1μg/ウェル) のいずれかを含有するか、或いは、分裂促進因子を含有しない。ウェルは、また、DMSO中で10μMの試験化合物も含有する。空気中5%CO₂、37℃で3日のインキュベーション後、試料を分析した。生存細胞により、メチルチアゾールテトラゾリウム (methylthiazoletetrazolium, MTT) は、DMSOに可溶性の着色ホルマザン (formazan) 産物へと生還元 (bioreduce) される。したがって、ホルマザン産物の量は、培養液中の生細胞の数に直接的に比例し、570nmでの分光光度計を使用して測定することができる。MTTを各ウェルに加え、さらに4時間インキュベートした後、イソプロパノール中で0.04NのHClで発色させた。培養上清を-80℃で回収した後保存し、IFN-γ (Th-1サイトカイン) 及びT細胞単独、IL-6 (Th-2サイトカイン) についてELISA (BD Biosciences) によって分析した。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) を4匹の個々のマウスで調べた。両方の化合物は、T細胞及びB細胞の両方に対して顕著に且つ有意に免疫抑制性であった。この効果は、さらに、上清へのINF-γ及びIL-6の合成の随伴性の減少 (concomitant reduction) によって証明された。分裂促進的な刺激が無いと生存細胞数がおよそ50％低減したので、この免疫抑制のいくらかは、試験化合物による直接的な細胞毒性によるものであると考えられる。1匹のマウスのデータは、図10、図11及び図12に示す。

[8.0 ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体活性]
ペルオキシソーム増殖因子活性化受容体 (PPAR) は、核内ホルモン受容体スーパーファミリーメンバーである転写因子である。リガンドによるPPARγの活性化によって、特異的遺伝子が調節され、その効果は、例えばLPS及びサイトカイン刺激に応答した様々な炎症メディエーター (例えばNO、TNFα、IL-1、IL-2、IL-6及びCOX-2) の産生阻害である。PPARγの活性化は、抗炎症性であり (Oates et al. 2002) 、内皮細胞機能不全を制限すること、アテローム発生を減少させること及び再狭窄を防止することによって血管保護 (vasculoprotective) 効果を発揮すると考えられるが、同時に且つ好ましくアディポカイン (adipokin) 発現及び脂質代謝を調整する (Verma and Szmitko
2006) 。蓄積した証拠によると、血管壁への直接的な影響と、全身性炎症及びインスリン感受性への間接的な影響との両方によって、PPARアゴニストが強力な抗アテローム硬化性の性質を有することが示唆される。PPARアゴニストは、メタボリック症候群、脂質代謝異常、インスリン耐性及び糖尿病を治療するのにも使用される (Meerarani et al. 2006) 。

<方法>
GAL4タンパク質のDNA結合ドメインと融合したPPARγリガンド結合ドメイン (GAL4-PPARγ融合タンパク質) で安定して形質移入したヒトHEK293細胞は、PPARγリガンドとインキュベートすると、β-ラクタマーゼを産生する。形質移入したヒト腎臓胚細胞 (human kidney
embryonic cells, Invitrogen 社, Carlsbad, CA) を96ウェルプレート内のマトリゲル上に播種し、一晩接着させた。次の日、媒体単独
(DMSO) 又は1μM、5μM及び10μMの様々な濃度で試験化合物を細胞に添加し、16時間〜18時間インキュベートした。それから、細胞にFRETベース蛍光基質を充填し、β-ラクタマーゼ活性を評価した。細胞を光から保護し、室温で2時間インキュベートした。蛍光プレートリーダーで、409nmの励起波長、並びに460nm及び530nmの発光波長を用いてプレートを読み取った。バックグラウンド (細胞無含有対照ウェル) を差し引いた後のこれらの2つの波長間の比として、結果を表した。このようにして、PPARγ活性は、蛍光産物の基質に対する比で評価したβ-ラクタマーゼ活性を測定することにより求めた。

<結果>

PPARγの活性化は、培地だけの対照で見られるものを超えるβ-ラクタマーゼ活性の増大によって測定する。化合物 (1) 、 (2) 、 (6) 、 (7) 、 (18) 、 (20) 、 (22) 、 (23) 、 (27) 及び (29)
でこれが起こり、これらの化合物がPPARγアゴニスト活性を有することが示唆された。データを図13に示す。

本発明の化合物が、PPARγアゴニストであることが示される。即ち、本発明の化合物は、メタボリック症候群、インスリン耐性、糖尿病、脂質代謝異常及び関連の活性を示すことが示される。

[9.0 細胞毒性]
[9.1 抗癌活性]
<方法>
ヒト膵臓癌細胞株HPAC
(CRL-2119) を、HEPES (15 mM) 、インスリン (0.002 mg/ml) 、トランスフェリン (0.005 mg/ml) 、ヒドロコルチゾン (40 ng/ml) 、上皮成長因子 (10 ng/ml) を含有する、DMEM (Sigma) ＋Ham's F12 (Sigma) 培地の1:1混合物中で通常通り培養した。卵巣癌細胞株CP70は、Dr. Gil Mor (エール大学) からの寄贈で入手し、DMEM＋Ham's F12培地の1:1混合物中で培養した。乳癌細胞株MDA-MB-468は、リーボビッツL-15培地 (Leibovitz's L-15 medium) 中で培養した。メラノーマ細胞株MM200は、Peter Hersey (University of Newcastle) からの寄贈で入手し、DMEM培地中で培養した。大細胞肺癌 (large cell lung cancer) 細胞株NCI-H460を、4.5 g/Lのグルコースをさらに補充し、10 mMのHEPESで緩衝化したRPMI
1640培地中で培養した。結腸腺癌 (colon adenocarcinoma) 細胞株HT-29をマッコイ5a (McCoy's 5a) 培地中で培養した。全ての培養物に、10%FCS (CSL, Australia) 、ペニシリン (100 U/ml) 、ストレプトマイシン (100 mg/ml) 、L-グルタミン (2 mM) 及び炭酸水素ナトリウム (1.2 g/L) を補充し、5%CO₂の加湿雰囲気下、37℃で培養した。他に記載がない限り、全ての細胞株をATCC (Maryland, USA) から購入した。

各細胞株に対して、IC₅₀値を求めた。成長動態分析から決定されるとおりに、適切な細胞密度で細胞を96ウェルプレートにおいて播種し、試験化合物の非存在及び存在下で、5日間培養した。製造業者の取扱説明書に従って、37℃で3〜4時間、臭化3-4,5ジメチルチアゾール-2,5-ジフェニルテトラゾリウム (3-4,5 dimethylthiazol-2,5-diphenyl tetrazolium bromide) (MTT、PBS中2.5 mg/ml、Sigma)
20μlを添加した後、細胞増殖を評価した。x軸上の対数用量に対するy軸上の対照増殖の％の片対数プロットから、IC₅₀値を算出した。

<結果>
化合物 (1) 及び化合物 (2) の両方が、調べた全ての癌細胞株に対する活性を示した (約5μM〜20μMのIC₅₀) 。全ての癌細胞株に対して調べてはいないが、化合物 (6) 、 (15) 、 (17) 、 (24) は、CP70、HPAC及び MM200細胞株に対して活性であった。化合物 (16) 及び化合物 (17) は、調べた各細胞株に対して最も強力な活性を示した (約1μM〜5μM) 。調べたものについては、化合物 (9) は、癌細胞に対して中程度の毒性を示した。化合物 (3) は、 MM200メラノーマ細胞株に対して選択的に毒性であった。

[9.2 正常細胞に対する毒性]
<方法>
新生児包皮線維芽細胞 (neonatal foreskin fibroblasts, NFF) は、Dr.
Peter Parsons (Queensland Institute of Medical Research) からの寄贈であった。ウサギの腎臓 (RK-13) 細胞は、Miller Whalley (Macquarie
University) から入手した。10%FCS (CSL, Australia) 、ペニシリン (100 U/ml) 、ストレプトマイシン (100 mg/ml) 、L-グルタミン (2 mM) 及び炭酸水素ナトリウム (1.2 g/L) を補充したRPMI中で両方の細胞株を培養し、5%CO₂の加湿雰囲気下、37℃で培養した。IC₅₀値を上記のように求めた。

<結果>
化合物は、選ばれた正常な形質転換していない細胞に対して低度から中程度の毒性を示す。化合物 (1) は、正常な線維芽細胞株に対して幾らか毒性を示すが (約15μM) 、化合物 (2) は、NFF及びRK-13細胞 (NFFs
and RK-13 cells) に対して遥かに低い毒性であった (IC₅₀>30μM) 。

[10.0 薬剤溶出ステント]
<方法>
約3 mm×17 mmの展開サイズを有する薬物送達ステントに、以下のように化合物 (1) を充填する。ステントをマンドレル (mandrel) 上に配置し、迅速分解障壁層 (fast degrading
barrier layer) をステントにおける開口部に沈着させる (deposited) 。障壁層は、管腔側に提供される低分子量PLGAであり、充填中にステント開口部の管腔側を密封する。ここで記載される層は、滴下で沈着させ、DMSO、NMP、又はDMAc等の好適な有機溶媒を使用して、液体形態で送達する。それから、化合物 (1) の複数の層及び低分子量PLGAマトリックスを開口部に沈着させ、虚血傷害 (ischemic injury) の低減のために薬剤インレー (inlay) を形成する。化合物 (1) 及びポリマーマトリックスを組合せて、所望の薬剤送達プロファイルを達成するように沈着させる。迅速分解ポリマーである低分子量PLGAのキャップ層は、活性薬剤層の上に沈着し、保存中、輸送中、及び埋め込み部位へと送達する間に活性薬剤を保護する。埋め込み後、比較的迅速に活性薬剤が送達されるように、キャップ層の分解速度を選択する。ステント上の総投与量は、約10μg〜約600μgであり、必要に応じてより多くともよい。当業者は、使用する活性薬剤及び所望の治療効果に応じて、他の好適な用量を決定することができる。

同様の方法において、薬剤溶出ステントは、オキサジニル化合物 (2) 、 (3) 、 (7) 、 (8) 、 (16) 、 (17) 、 (18) 、 (19) 及び (20)
を用いて形成する。

別の方法において、多層薬剤溶出ステントは、化合物 (1) 及びシロリムスを用いて形成する。さらに別の方法において、多層薬剤溶出ステントは、化合物 (1) 及びパクリタキセルを用いて形成する。またさらに別の方法において、多層薬剤溶出ステントを化合物 (1) 及びデヒドロエクオールを用いて形成する。

アームストロングヒト伏在静脈モデル (Armstrong human saphenous vein model) を用いて、これらのステントの放出プロファイルを生体外 (ex vivo) で観察する。被覆ステントを静脈に送達し、バルーンカテーテルで拡張させ、培養培地中に入浴させた。特定のステント及びポリマー／薬剤マトリックスコーティングの放出プロファイルを求めるための培養培地の分析によって、経時的な活性薬剤の浸出が観察される。

[11.0 比較例]
イソフラボノイド化合物ゲニステイン及び3',7-ジヒドロキシ-イソフラブ-3-エン (37-DHE) に対する幾つかの研究において、本発明のオキサジニルイソフラボノイド化合物の生物学的活性を評価した。

[11.1 血管平滑筋細胞におけるアポトーシスに対する効果]
アポトーシス (プログラム細胞死) は、血管組織の健康及び疾患において決定的役割を果たす。アポトーシスは、細胞が自分自身の死滅 (「細胞自殺」) に積極的に関係する者である場合に、正常な生理的条件下で起こる細胞死の一つの様式である。アポトーシスは、細胞質の収縮 (cytoplasmic shrinkage) 、核凝縮 (nuclear
condensation) 、及びDNA断片化 (DNA
fragmentation) を特徴とする (Jacobson et al. 1997) 。今では、VSMC成長の調節の変化と死との間の平衡が、血管の統合性 (integrity) 及び病変形成の重要な決定因子であることは明らかである (Wang et al. 1999) 。したがって、VSMCアポトーシスの誘導は、ステント再狭窄を含む新生内膜増殖性疾患の治療に重要な治療方針 (therapeutic strategy) である。

<方法>
カスパーゼカスケードの活性化は、アポトーシス経路において不可欠な (integral) 出来事である。カスパーゼ-3は、重要な「実行因子 (executioner) 」カスパーゼ酵素のうちの1つであり、細胞の秩序だった崩壊 (breakdown) を引き起こす多くのタンパク質の切断を誘起する。カスパーゼ-3活性化の検出は、アポトーシスの陽性マーカーとして使用することが多い。均質な発光カスパーゼ-3/7アッセイであるカスパーゼ-GloTM 3/7 アッセイ (Promega 社) を使用して、カスパーゼ活性化の極めて感度が高い測定が出来た。VSMCを異なる濃度 (0μM[媒体単独]、10μM、50μM及び100μM) の試験化合物とインキュベートした。このアッセイは、カスパーゼ-3及び-7によって認識されるDEVD配列を含有する発光前駆基質 (proluminescent substrate) を使用した。カスパーゼ-GloTM
3/7試薬は、カスパーゼ-3/7活性の量に正比例する発光を生じた。蛍光は、カスパーゼ濃度4桁の幅、及び広範の細胞密度にわたって線形 (linear) である。

<結果>
A7r5ラット動脈SMC細胞株において、カスパーゼ-3/7活性の誘導で実証されるように、化合物 (1) は一貫してアポトーシスを誘導した。化合物37-DHEは、このアッセイでは活性がなかった。データを図14に示す。

これらのアッセイでは、ゲニステインを調べなかった。また、手に入る血管平滑筋細胞でアポトーシスを誘導するゲニステインに関する文献中の報告はない。

[11.2 ヒト臍帯静脈平滑筋細胞]
<方法>

ヒト臍帯静脈平滑筋細胞 (human umbilical vein smooth muscle cells, HUVSMC) に対する試験化合物の効果を調べた。男児の新生児の組織外殖片 (tissue explants) である細胞 (HRI-継代2) を、1つのウェル当たり1×10³個の細胞で96ウェルプレートに播種し、24時間、付着させた。それから、それを2回洗浄し、24時間〜48時間、ウシ胎仔血清
(FCS) を有しない培地中でインキュベートし、それらを血清飢餓させた。試験化合物をFCS無し培地中で調製し、当該プレートに加え、1時間インキュベートした。最終濃度が10%になるように、FCSを有する培地を添加し、対照がちょうどコンフルエントになるまで、4日〜5日間プレートをインキュベートした。

<結果>
化合物 (1) は、HUVSMCの増殖の阻害について、37-DHE又はゲニステイン (同様の活性を有していた) よりも効果的であった。3つの異なるアッセイにわたって化合物 (I) の平均IC₅₀は、15μMであった。データを図15に示す。

[11.3 ラット大動脈平滑筋細胞株 (rat aortic smooth muscle cell lines) ]
ラット大動脈平滑筋細胞株 (A7r5) 及びラット大動脈中膜 (media of rat aorta) 由来の別の細胞株 (A10) に対する試験化合物の効果を調べた。その方法は、細胞を3日間化合物で処理したのを除いて、HUVSMCのための方法と同じであった。

<結果>
化合物 (1) 及び37-DHEは、増殖の阻害に効果的であり、化合物 (1) はより強力であった。IC₅₀は、A7r5細胞ではそれぞれ、23μM及び45μMであり、A10細胞ではそれぞれ、11μM及び31μMであった。ゲニステインは調べなかった。データを図16及び図17に示す。

[11.4 動脈細胞における接着分子発現に対する効果]
再狭窄は、血行
(circulation) からの炎症細胞の動員及びその経内皮移動 (transendothelial
migration) に関与する。このプロセスは大部分、幾つかの炎症性刺激に応じて血管内皮 (vascular
endothelium) 及び循環白血球 (circulating leukocytes) で発現する細胞接着分子によって媒介される。セレクチン (P、E及びL) は、血管壁上での白血球のローリング及び繋留 (tethering) に関与する。細胞内接着分子 (intercellular
adhesion molecules, ICAMs) 及び血管細胞接着分子 (vascular cell
adhesion molecules, VCAM-1) 、並びにインテグリン (integrins) の一部が、炎症細胞の血管表面での堅固な接着を誘導する。VCAM-1発現は、病変 (lesions) 及び病変素因性領域 (lesion-predisposed regions) に限定されるが、ICAM-1発現は、より広範であり、未関与の大動脈及び病変保護領域 (lesion-protected regions) に拡がる。

接着分子発現の増大は、再狭窄において役割を果たす。待期的な (elective) 経皮的冠動脈形成術 (percutaneous
transluminal coronary angioplasty, PCTA) を受けた46人の患者の前向き試験において、6ヶ月の追跡調査で冠動脈再狭窄を起こした患者には、再狭窄なしの患者に比べて、その循環単球
(circulating monocytes) の表面上で接着分子の有意な増大が見られた
(Navarro-Lopez et al. 2003) 。

<方法>
成長培地
(Cell Applications 社) 中のヒト動脈内皮細胞 (HAEC) を1つのウェル当たり10,000個の細胞の密度で96ウェルプレートに播種した。プレートを37℃で一晩インキュベートし、コンフルエンスを達成した。TNFα (10μl、2 ng/ml) を各ウェル (培地100μlを含有した) に加えた後、10μM及び30μMの化合物を添加した。全てのサンプルを四重で測定した (1つの処理当たり4つのウェル) 。

4時間の化合物とのインキュベーション後、培地を除去し、細胞を非特異的IgG又はVCAM、ICAM若しくはE-セレクチン (BD Biosciences) に対する特異的マウス抗体のいずれかでプロービングした。プレートを30分間静置させ−、それから単層を洗浄し、ヒツジ抗マウス抗体／ホースラディッシュペルオキシダーゼ共役体 (10%熱失活ヒト血清及び0.05% Tween 20を有するHBSS 100μL中、1:500) を添加し、30分間置いた。さらに洗浄した後、ABTS基質 (Kirkegaard and Perry Laboratories) 150μLを各ウェルに加え、15分間発色 (develop) させた。ELISAリーダー (Titertek Multiscan, Flow
Laboratories) によって405nmで光学密度を測定した。

<結果>
100μMで、試験化合物は、HAEC生存率に有意に影響を与えた。化合物によっては、HAEC生存率は、30μMで80%未満であった。このようにして、10μMが、このアッセイで (複数の) 化合物の活性を比較するのに最も適切な濃度であったことを見出した。

化合物 (1) は、VCAM発現及びE-セレクチン発現を、50%を超えて顕著に阻害した。それのICAM発現に対する効果は、10%〜50%阻害であった。37-DHEの効果は、あまりはっきりせず、ゲニステインのものと同様であった。データを図18に表す。

[11.5 NFκB産生に対する効果]
<方法>
上記の2.4節の実施例で詳説したアッセイ法に従って、この比較研究を行った。

<結果>
30μMは、試験化合物のNFκB-阻害活性を比較するのに最適な濃度であったことを見出した。50μM及び100μMで、化合物は細胞生存率を低下させた。

化合物 (1) 、37-DHE及びゲニステインは全て、NFκBを阻害した。化合物 (1) は、37-DHE又はゲニステインのいずれかよりも非常に強く阻害した。化合物 (1) をまた、1つのアッセイで10μM及び30μMでのゲニステインと比較した。データを図19及び図20に示す。

[11.6 フリーラジカル除去 (free radical scavenging) に対する効果]
安定なフリーラジカル化合物2,2-ジフェニル-1-ピクリルヒドラジル (DPPH) を使用して、試験化合物の抗酸化 (フリーラジカル捕捉) 活性を評価した。エタノール中、0.1 mMの濃度で、DPPHのストック溶液を調製し、使用の10分前に混合した。100μMの濃度での試験化合物の初回スクリーニングはDPPHと20分間反応させ、その後、517nmでの吸光度を求めた。吸光度の変化を試薬ブランク (エタノール単独を有するDPPH) と比較した。ゲニステインではなく、37-DHE及び化合物 (1) が、100μMでフリーラジカル除去活性 (ΔAbs
> 0.3) を有することを見出し、用量応答曲線を作成した。IC₅₀値は、0.6の吸光度変化を引き起こす試験化合物の濃度と推定した (DPPHラジカルの総除去を表す吸光度単位が1.2である) 。

ゲニステインは、このアッセイで抗酸化活性を有せず、100μMより低い濃度では調べなかった。しかしながら、化合物 (1) 及び37-DHEの両方は、強力なフリーラジカル除去能を示した (表13を参照されたい) 。

[11.7 過酸化ラジカル誘導赤血球 (RBC) 溶解に対する効果]
<方法>
上記の3.3節の実施例で詳説したアッセイ法に従って、この比較研究を行った。

<結果>
化合物 (1) 及び37-DHEの両方、並びにゲニステインが、赤血球が半溶解するまでのAAPH誘導時間を遅延させることにより、抗酸化活性を示した。化合物 (1) は、半溶解の光吸収に達するまでのより長い遅延によって明らかなように、最も活性があるフリーラジカルスカベンジャーであった (表14を参照されたい) 。

読者が、過度に実験せずに本発明を実施することができるように、幾つかの好ましい実施形態を参照して本発明を本明細書中に記載した。しかしながら、当業者は、本発明の範囲を逸脱することなく、多くの構成要素及びパラメータが或る程度、変動し得るか又は修正され得ることを容易に認識するであろう。さらに、表題、見出し等は、本明細書の読者の理解を高めるように与えられ、本発明の範囲を限定するように解釈されるべきではない。

本明細書中で言及した全ての出願、特許及び公報は、ある場合には、参照により取り込まれる。

本明細書及び続く特許請求の範囲を通して、文脈上必要な場合以外は、単語「含む (comprise) 」、及び「含む (comprises) 」又は「含んでいる (comprising) 」等の変化形は、述べられた整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を含むことを意味すると理解されるが、任意の他の整数若しくは工程、又は整数若しくは工程の群を排除すると理解されるわけではない。

当業者は、本明細書中で記載の本発明が、具体的に記載されたもの以外の変形及び修正を許容することができることを理解するであろう。本発明がこのような変形及び修正を全て含むことを理解するべきである。本発明は、個々に又は集合的に言及される又は示される、全ての工程、特徴 (features) 、組成物及び化合物、並びに任意の2つ以上の該工程又は特徴の任意の全ての組合せも含む。

本願明細書におけるいかなる先行技術への言及も、その先行技術が、探求に係る分野における共通の一般的知識の一部を形成することを自認するものでもなければ、何らかの形で示唆するものでもないし、そのように受け取られるべきでもない。

Claims (22)

1. 以下の条件を満たす、一般式 (I) のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
   式中、
   R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、
   R₂、R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₅は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₆は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₇は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
   R₈は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₉は、アルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
   R₁₀は独立して、アルキル又はアリールであり、
   Xは、O、NR₁₂ (式中、R₁₂は、アルキル、アリール若しくはアリールアルキルである) 、又はS、好ましくはOであり、
   「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
   任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
   化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれる。
2. 以下の条件を満たす、一般式 (I-I) の請求項1に記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
   式中、
   R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、
   R₂、R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₅は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₆は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₇は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
   R₈は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₉は、アルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
   R₁₀は独立して、アルキル又はアリールであり、
   「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
   任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
   化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれる。
3. 以下の条件を満たす、一般式 (I-II) の請求項2に記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
   式中、
   R₁は、アルキル、アリールアルキル、アリール又はアルキルアリールであり、
   R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
   R₅は、水素、アルキル又はハロであり、
   R₆は、水素又はアルキルであり、
   R₇は、水素、アルキル又はアリールであり、
   R₈は、水素、アルキル、又はハロであり、
   R₉は、アルキル又はアリールアルキルであり、
   R₁₀は独立して、アルキルであり、
   「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
   任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
   化合物には、それらの薬剤的に許容可能な塩が含まれる。
4. 以下の条件を満たす、請求項3に記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
   式中、
   R₁は、アルキル、フェニルアルキル、フェニル、ナフチルアルキル、ナフチル又はアルキルフェニルであり、
   R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、アルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、R₃及びR₄の少なくとも1つは水素ではなく、
   R₇は、水素又はフェニルであり、
   R₉は、アルキルであり、
   任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができる。
5. 以下の条件を満たす、請求項4に記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
   式中、
   R₁は、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、フェニルメチル、1-フェニルエチル、フェニル、ナフチルメチル、ナフチル、又はアルキルフェニルであり、任意でアルキル、ハロ、ヒドロキシ、アセチルオキシ、メトキシ、エトキシ、ニトロ若しくはシアノで置換され、
   R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ及びメトキシであり、R₃及びR₄の少なくとも1つは水素ではなく、
   R₅は、水素、メチル又はハロであり、
   R₆は、水素、メチル又はエチルであり、
   R₇は、水素、又はフェニルであり、任意でアルキル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ若しくはシアノで置換され、
   R₈は、水素、メチル又はハロである。
6. 以下の条件を満たす、請求項5に記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
   式中、
   R₁は、メチル、エチル、プロピル、フェニルメチル、1-フェニルエチル、フェニル、ナフチルメチル、又はメチルフェニルであり、任意でメチル、ハロ、ヒドロキシ、メトキシ、ニトロ若しくはシアノで置換され、
   R₅は、水素であり、
   R₆は、水素であり、
   R₇は、水素、又はフェニルであり、任意でメトキシで置換され、
   R₈は、水素である。
7. 式中、R₁がフェニル (phenyl) 、フェニルメチル (phenylmethyl) 、1-フェニルエチル (1-phenylethyl) 、ナフト-1-イル (naphth-1-yl) 、ナフタ-1-イルメチル (naphtha-1-ylmethyl) 、4-メトキシフェニルメチル (4-methoxyphenylmethyl) 、4-ヒドロキシフェニル (4-hydroxyphenyl) 、4-クロロフェニルメチル (4-cholorphenylmethyl) 、4-メチルフェニル (4-methylphenyl) 、4-シアノフェニル (4-cyanophenyl) 、3-メチルフェニル (3-methylphenyl) 、3-ニトロフェニル (3-nitrophenyl) 、4-tert-ブチルフェニル (4-tert-butylphenyl) 、4-tert-ブチルフェニルメチル (4-tert-butylphenylmethyl)
   、3,4-ジメチルフェニル
   (3,4-dimethylphenyl) 、4-メトキシフェニル (4-methoxyphenyl) 又は、4-メトキシフェニルメチル (4-methoxyphenylmethyl) である、請求項1から6のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
8. 式中、R₁がメチル、プロピル又は3-メトキシプロピルである、請求項1から6のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
9. 式中、R₃又はR₄ がヒドロキシである、請求項1から8のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
10. 式中、R₃及びR₄がメトキシ又はヒドロキシである、請求項1から8のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
11. 式中、R₇が水素又は4-メトキシフェニルである、請求項1から10のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
12. 式中、ハロがクロロ又はブロモである、請求項1から11のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
13. 式中、「---」の描画が二重結合を表す、請求項1から12のいずれかに記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
14. 化合物(1)乃至(32)から選択される、請求項1に記載のオキサジニルイソフラボノイド化合物。
    4-(3-ベンジル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (1)
    4-(3-(1-フェニルエチル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (2)
    4-(3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (3)
    4-(3-メチル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (4)
    7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (5)
    4-(3-(4-メトキシベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (6)
    4-(3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (7)
    4,4'-(クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3,7(2H,4H,8H)-ジイル)ジフェノール (8)
    7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-(4-メトキシベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (9)
    3-(3-ベンジル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (10)
    3-(3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (11)
    7-(3,4-ジメトキシフェニル)-3-フェニル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (12)
    3-ベンジル-7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (13)
    7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (14)
    4-(3-(4-クロロベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (15)
    4-(3-(3-メトキシプロピル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (16)
    3-(3-(3-メトキシプロピル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (17)
    4-(3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (18)
    7-(3,4-ジメトキシフェニル)-10-メチル-3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン (19)
    3-(3-p-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (20)
    4-(7-(3-ヒドロキシフェニル)クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3(2H,4H,8H)-イル)ベンゾニトリル (21)
    4-(3-m-トリル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (22)
    4-(3-(3-ニトロフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (23)
    4-(3-(4-クロロベンジル)-6-(4-メトキシフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (24)
    4-(10-ブロモ-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (25)
    3,4'-(10-メチル-クロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-3,7(2H,4H,8H)-ジイル)ジフェノール (26)
    4-(8-エチル-3-プロピル-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (27)
    4-(3-(4-tert-ブチルフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (28)
    4-(3-(4-tert-ブチルベンジル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (29)
    4-(3-(ナフト-1-イル-メチル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (30)
    4-(3-(3,4-ジメチルフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (31)
    4-(3-(4-メトキシフェニル)-2,3,4,8-テトラヒドロクロメノ[6,7-e][1,3]オキサジン-7-イル)フェノール (32)
    又はそれらの薬剤的に許容可能な塩。
15. 式 (I) の化合物を調製するための方法。
    式中、
    R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、
    R₂、R₃及びR₄は独立して、水素、ヒドロキシ、OR₉、OC(O)R₉、OSi(R₁₀)₃、アルキル、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、チオール、アルキルチオ、ニトロ、シアノ又はハロであり、
    R₅は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
    R₆は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
    R₇は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
    R₈は、水素、アルキル、シクロアルキル、アリール、アリールアルキル、ニトロ、シアノ又はハロであり、
    R₉は、アルキル、アリール又はアリールアルキルであり、
    R₁₀は独立して、アルキル又はアリールであり、
    Xは、O、NR₁₂ (式中、R₁₂は、アルキル、アリール若しくはアリールアルキルである) 、又はS、好ましくはOであり、
    「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
    任意で炭化水素置換基は、アルキル、ハロ、アシルオキシ、ヒドロキシ、ハロ、アルコキシ、シリルオキシ、ニトロ及びシアノの一つ又は複数で置換することができ、
    式 (II) のイソフラボノイド化合物を反応させる工程を含む：
    式中、
    R₂、R₃、R_4,、R₅、R₆、R₇、R₈及びXは、上記で規定されるようなものであり、「---」の描画は、単結合又は二重結合を表し、
    ホルムアルデヒド及び一級アミン、R₁-NH₂を有し、
    式中、
    R₁は、アルキル、シクロアルキル、アリールアルキル、アルケニル、アルキニル、アリール又はアルキルアリールであり、任意で置換することができ、
    式 (I) の化合物を形成する。
16. 一つ又は複数の医薬品の担体、賦形剤、助剤及び／又は希釈剤と共に、請求項1に規定される式 (I) の一つ又は複数の化合物を含む医薬品組成物。
17. 請求項1に規定される式 (I) の一つ又は複数の化合物を含む、疾患又は障害の治療、予防、又は回復のための薬剤。
18. 心保護剤、抗炎症剤、抗酸化剤、又は、化学療法剤である、請求項17に記載の薬剤。
19. 任意で担体及び／又は賦形剤と共に、請求項1に規定される式 (I) の一つ又は複数の化合物を被験者に投与することを含む、疾患又は障害を治療、防止又は回復する方法
20. 疾患又は障害の治療のための薬物の製造のための、請求項1に規定される式 (I) の一つ又は複数の化合物の使用。
21. 請求項1に規定される式 (I) の一つ又は複数の化合物を、任意で一つ又は複数の追加の活性薬剤と共に含む、活性薬剤を送達するための埋め込み式医療機器。
22. ステントである、請求項21に記載の埋め込み式医療機器。