MX2009000366A - Biarilcarboxiarilamidas como moduladores del receptor vanilloide-1. - Google Patents

Abstract

La presente invención proporciona compuestos de fórmula (I) (ver fórmula (I)) en donde A y Z son como se definen en la descripción, junto con métodos para preparar dichos derivados y su uso en el tratamiento de enfermedades inflamatorias tal como dolor neuropático.

Description

BIARILCARBOXIARILAMIDAS COMO MODULADORES DEL RECEPTOR VANILLOIDE-1 CAMPO DE LA INVENCION La presente invención se refiere a moduladores del receptor vanilloide, en particular a antagonista de TRPV1.

TECNICA ANTECEDENTE El receptor transitorio de vanilloide 1 potencial (TRPV1) se implica fuertemente en la génesis de la hiperalgesia térmica y mecánica y se ha propuesto que juegue un papel importante en diferentes condiciones patológicas que incluyen el dolor neuropático y trastornos urológicos. Los antagonistas del receptor vanilloide que contiene una porción biarilo son conocidos: WO 20?4/0567741 describe, entre otras, las siguientes arilamidas de ácido biaril-4-carboxílico sustituidas: DESCRIPCION DETALLADA DE LA INVENCION Se ha encontrado que al reemplazar la porción piridilo en los compuestos anteriores con un anillo isoquinolin-5-ilo, pueden obtenerse los antagonistas de TRPV1 con propiedades mejoradas. Asimismo, la invención proporciona moduladores del receptor vanilloide- mejorados de la fórmula general (I): en donde: A es CH o N; Z es un anillo fenilo o piridilo, opcionalmente sustituido con uno o dos grupos R, que pueden ser iguales o diferentes entre sí y se seleccionan de alquilo de Ci-C4l preferiblemente metilo, isopropilo o tere-butilo, haloalquilo de C-I-C4, preferiblemente trifluorometilo o halógeno. Para los propósitos de la presente descripción, el halógeno significa un átomo de halógeno seleccionado de flúor, cloro, bromo y yodo, preferiblemente cloro. Un primer grupo de compuestos preferidos de la invención es el de la fórmula (la) en donde Z es como se definió anteriormente. Un segundo grupo de compuestos preferidos de conformidad con la invención es el de la fórmula (Ib) en donde Z es como se definió anteriormente. En los compuestos de fórmula (la) y (Ib) Z preferiblemente es un anillo fenilo sustituido en la posición para con un grupo R diferente al hidrógeno, preferiblemente cloro. El compuesto más preferido de conformidad con la invención es N-(4-clorofenil)-6-(isoquinol¡n-5-il)pir¡din-3-carboxamida (de aquí en adelante mencionada como V394) Los compuestos de fórmula (I) pueden prepararse por medio de métodos convencionales, tal como la reacción de un compuesto de fórmula (II) en donde A es como se definió anteriormente y el grupo carboxi se activa como cloro con un compuesto de fórmula (III) z — NH2 (III) en donde Z es como se definió anteriormente. Preferiblemente, los compuestos de fórmula (I) pueden obtenerse por la reacción2 Suzuki entre un compuesto de fórmula (IV) (IV) en donde A y Z son como se definieron anteriormente y X es halógeno seleccionado de yodo y bromo y ácido borónico (V) Por ejemplo, el compuesto V394 se prepara convenientemente mediante la reacción Suzuki entre 6-bromo o 6-cloro-N-(4-clorofenil)piridin-3-carboxamida y ácido isoquinolin-5-il-5 borónico. Los compuestos de fórmula (I) modulan el receptor TRPV1 vanilloide; el compuesto V394 preferido mostró un valor K¡ de 15 nM (13-17) en médula espinal de rata y un valor Cl50 de 0.83 nM (0.74 - 0.93) en neuronas del ganglio de raíz dorsal de rata cultivadas. Asimismo, los compuestos de la invención pueden utilizarse para la preparación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de estados inflamatorios, tal como dolor crónico e hiperalgesia inflamatoria. Estas formulaciones pueden prepararse por métodos y excipientes convencionales, tal como los descritos en Remington's Pharmaceutical Science Handbook, XVII ed. Mack Pub., N.Y., U.S.A. La invención de aquí en adelante se ilustrará por medio del siguiente ejemplo.

EJEMPLO Materiales y métodos Todos los compuestos comercialmente disponibles fueron adquiridos de Aldrich y se utilizaron sin purificación adicional. Los cursos de reacción se monitorearon mediante cromatografía de capa delgada en gel de sílice (placas F254 Merck revestidas previamente), y se examinaron los puntos con luz UV y se visualizaron con KMn04 acuoso. La cromatografía instantánea se realizó utilizando gel de sílice Merck (malla 230-240). El espectro de H-RMN se registró en un espectrómetro Varían 400 MHz utilizando TMS como un estándar interno. Se obtuvieron espectros de masa con un espectrómetro Waters-Micromass ZMD. Los puntos de fusión fueron determinados en un aparato Buchi-Tottoli y no se corrigieron.

EJEMPLO 1 N-(4-clorofenil)-6-(-isoquinolin-5-il)piridin-3-carboxamida (V394) Etapa a) -6-cloro-N-(4-clorofenil)pirid¡n-3-carboxamida El cloruro 6-cloro- nicotínico comercialmente disponible (56.8 mmoles, 10 g) se disolvió en 50 mi de CH2CI2 anhidro y se agregó gota a gota a una solución de diisopropiletilamina (DIEA) (1.12 equivalentes, 68.2 mmoles, 1 .67 mi) y 4-cloroanilina (1.2 equiv., 68.2 mmoles, 8.70 g) en CH2CI2 de 50 mi a 0°C. La mezcla se agitó a temperatura ambiente durante 20 horas, posteriormente se diluyó con CH2CI2 (200 mi) y se lavó con agua (1 X 200 mi) y salmuera (1 X 100 mi). La capa orgánica se secó sobre sulfato de sodio y se concentró. El crudo se cristalizó de éter dietílico para dar 13 g de un sólido blanco. Rendimiento= 86%. 1H RMN (CDCI3, 200 MHz) d 7.35 (2H, d, J= 8.8 Hz), 7.47 (1 H, d, J= 8.2 Hz), 7.58 (2H, d, J= 8.8 Hz), 7.88 (1H, bs), 8.16 (1H, dd, J= 8.4 Hz, J'= 2.8 Hz), 8.84 (1H, d, J= 2.4 Hz).

Etapa b) Acido isoquinolin-5-il-5-borónico Una solución de 2.5 M de /7-BuLi (1.2 equiv., 3 mmoles, 1.2 mi) en 20 mi de THF nuevamente destilado, enfriado a -78°C se agregó con una solución de 5-bromoisoquinolina (2.5 mmoles, 520 mg) en 5 mi de THF. La mezcla resultante se dejó reaccionar a esta temperatura durante 45'. Una solución de triisopropilborato (1.2 equiv., 3 mmoles, 0.7 mi) entonces se agregó y la mezcla se agitó a la misma temperatura durante 5' y posteriormente se dejó calentar a temperatura ambiente y se agitó durante una hora adicional. La mezcla se extinguió mediante adición lenta de solución NaOH al 5% (30 mi). La capa acuosa se separó y se acidificó a pH 5/6 mediante adición de HCI al 10% a 0°C. La extracción con acetato de etilo, la evaporación de la fase orgánica y la cristalización de éter dietílico dio 250 mg de un sólido blanco. Rendimiento= 58%. H RMN (d6-DMSO, 200 MHz) d 7.66 (1H, t, J= 7.2 Hz), 8.07 (1 H, d, J= 5.8 Hz), 8.13 (1H, d, J= 8.0 Hz), 8.34 (1H, d), 8.47 (1H, d), 8.50 (2H, bs) 9.29 (1 H, s); [M+1] 174.1 (C9H8BN02 requiere 172.98) Etapa c) N-(4-clorofenil)-6-(-isoquinolin-5-il)piridin-3-carboxamida (reacción Suzuki) Una mezcla de ácido isoquinolin-5-il-5-borónico (1.5 equiv., 8.4 mmoles, 1.46 g), 6-cloro-N-(4-clorofenil)piridin-3-carboxam¡da (5.6 mmoles, 1.5 g), acetato de paladio (4% molar, 48 mg), trifenilfosfina (2 equiv., 2.94 g), Na2C03 al 15% (4 mi) EtOH (4 mi) y tolueno (50 mi) se calentaron a 80°C durante 16 horas. Después de la evaporación, se agregó una solución de bicarbonato de sodio saturada y el sólido precipitado se filtró y posteriormente se lavó con acetato de etilo. El residuo se cristalizó de metanol para obtener 1.4 g del compuesto V394 como un sólido blanco.

P f (éter dietílico) =258°C. Rendimiento= 69%. 1H RMN (d6-DMSO, 400 MHz) d 7.471 (2H, d, J= 8.8 Hz), 7.838 (1H, m), 7.852 (2H, d, J= 8.8 Hz), 9.953 (1 H, d, J= 8.0 Hz), 8.049 (1H, dd, J= 7.2 Hz), J'= 0.8 Hz), 8.085 (1 H, d, J= 6.0 Hz), 8.290 (1 H, d, J= 8.4 Hz), 8.490 (1H, dd, J= 8.4 Hz, J'= 2.2 Hz), 8.543 (1 H,d, J=6.0 Hz), 9.300 (1H, d, J= 1.6 Hz), 9.438 (1H, s), 10.695 (1 H,s); [M+1] 360.4 (C2iH14CIN30 requiere 359.81).

Prueba biológica Se utilizaron ratas Sprague-Dawley adultas y recién nacidas (-250 g) (Harlam, Italia). Todos los experimentos cumplieron con las pautas nacionales y fueron aprobados por el comité ético regional.

Prueba de unión a radioligando Se utilizaron ratas Sprague-Dawley macho con un peso corporal entre 250 a 350 g al momento de la prueba. Para las pruebas de unión las ratas fueron sacrificadas por decapitación bajo anestesia y se removió y se alteró la médula espinal utilizando un homogeneizador de tejido Polytron en un regulador de pH de hielo frío que contiene KCI 5 mM, NaCI 5.8 mM, CaCI2 0.75 mM, MgCI2 2 mM, sucrosa 320 mM, Hepes 10 mM, pH 8.65. El tejido homogeneizado se centrifugó a 1000 x g durante 10 minutos a 4°C y el sobrenadante se centrifugó de nueva cuenta a 35000 x g durante 30 minutos a 4°C (Beckman Avanti J25). La pella se resuspendio en el mismo regulador de pH como se describió anteriormente y se utilizó en experimentos de unión. En experimentos de saturación, 150 µ9 de proteína/muestra de las suspensiones de membrana se incubaron con [3H]-Resiniferatoxin ([3H]-RTX) (0.003-3 nM) en un regulador de pH de prueba que contiene 0.25 mg/ml de albúmina de suero de bovino libre de ácido graso a 37°C durante 60 minutos. En los experimentos de competencia, las membranas se incubaron a 37°C durante 60 min con [3H]RTX (0.4 nM) y con concentraciones incrementadas (de 0.1 nM a 3 µ?) de compuestos examinados. Se evaluó la unión no específica en presencia de RTX 1 µ?. Después de la incubación la mezcla de reacción se enfrió a 0°C y se incubó con glicoproteína de ácido cc1 de bovino (200 µg por tubo) durante 15 minutos para reducir la unión RTX no específica. RTX unido a membrana se separó de RTX libre mediante centrifugado de las muestras a 18500 x g durante 15 minutos. La punta del tubo de microcentrifugado que contiene la pella se cortó y la radioactividad se determinó por conteo de centelleo (Packard 2500 TR). La concentración de proteína se determinó de conformidad con el método Bio-Rad con albúmina de suero de bovino como una referencia estándar (Bradford, 1976). Los estudios de saturación y competencia se analizaron con el programa6 Ligand.

Mediciones de fluorescencia Ca en neuronas del ganglio de raíz dorsal de rata cultivadas Las ratas adultas se anestesiaron terminalmente y se decapitaron. Se removieron los ganglios de la raíz dorsal y se colocaron en una solución regulada de fosfato frío (PBS) antes de transferirse a la colagenasa (10 mg/ml), tripsina (5 mg/ml) y ADNsa (1 mg/ml) durante 35 min a 37°C. Los ganglios, colocados en DMEM frío se complementaron con suero de bovino fetal al 10%, L-glutamina 2 mM, penicilina 100 U/ml y estreptomicina 100 µg/ml, se disociaron en células individuales mediante varios pasajes a través de una serie de agujas de jeringa (23G hasta 25G). El medio y los ganglios fueron filtrados para remover los desechos, aumentados con 8 mi de un medio DMEM y se centrifugaron (200 x g a 5 min). La pella de célula final se resuspendió en un medio DMEM [complementado con 100 ng/ml del factor de crecimiento nervioso de ratón (ratón-NGF-7S) y una base libre de citocina-p-D-arabinofuranosida (ARA-C) 2.5 µ?]. Las células se colocaron en placas sobre cubreobjetos de vidrio de 25 mm revestidos con poli-L-lisina (8.3 µ?)- y laminina (5 µ?) y se mantuvieron durante 5 a 8 días a 37°C en una incubadora humidificada gasificada con CO2 al 5%, y aire, posteriormente agregado con Fura-2-AM-éster (3 µ?) en una solución reguladora de Ca2+ con la siguiente composición (mM): CaCk? 1.4, KCI 5.4, MgS04 0.4, NaCI 135, D-glucosa 5, HEPES 10 con BSA (0.1 %) a un pH de 7.4, durante 40 minutos a 37°C. Las células entonces de lavaron 2 veces con solución reguladora de Ca2+ y se trasfirieron a una cámara en la etapa de un microscopio Nikon eclipse TE300. El Fura-2-AM-éster fue excitado a 340 nM y 380 nM para indicar los cambios [Ca2+]¡ relativos mediante la relación F340/F380 registrados con un sistema de análisis de imagen dinámico (Laboratory Automation 2.0, RCS, Florencia, Italia) y se dejó que las células (al menos 10 minutos) lograran una fluorescencia estable antes de iniciar el experimento. Se realizó una curva de calibración utilizando el Fura 2-AM-éster que contiene el regulador y las concentraciones determinantes de Ca2+libre. Esta curva entonces se utilizó para convertir los datos obtenidos de la relación F340/F380 a [Ca2+]i (nM).8. Los efectos de tratamientos previos con capsazepina (CPZ), SB366791 y V394 en el incremento en [Ca2+]¡ producidos por capsaicina 0.1 µ? fueron estudiados.

Alodinia secundaria inducida por capsaicina en rata La capsaicina (20 nmoles/50 µ?/pata) fue inyectada en la superficie de la planta de la piel lisa de la pata derecha de ratas anestesiadas con éter dietílico (Chaplan et al., 1994). El compuesto V394 se administró oralmente (30 2 horas antes de la inyección de capsaicina. La alodinia táctil se evaluó 90 minutos después del desafío de capsaicina.

Fármacos y reactivos Lo fármacos y reactivos se obtuvieron r de compañías indicadas: [3H]-Resiniferatoxin (Perkin Elmer, Boston, MA), SB-366791 (Tocris, UK), capsaicina, capsazepina, ionomicina, laminina, poli-L-lisina, sustancia P (Sigma, Italia); ratones NGF-7S y colagenasa/dispasa (Roche Diagnostics, Italia); Dulbecco's Modified Eagle's médium (D EM), suero de bovino fetal (FBS) inactivado por calor, L-glutamina (200 mM), penicilina/estreptomicina (10,000 lU/ml ± 10,000 UG/ml), (Gibco, Italia); Fura-2-AM-éster (Societá Italiana Chimici, Italia). Las concentraciones de abastecimiento de capsaicina (10 mM), capsazepina (10 mM), (E)-3-(4-clorofenil)-N-(3-metoxifenil)acrilamida (identificada como SB-366791) (1 nM) y V394 se prepararon en DMSO al 50% y Tween 80 al 50%. El Fura-2-AM-éster y ionomicina se disolvieron en DMSO al 100%. Otros fármacos se disolvieron en agua destilada. Las diluciones apropiadas entonces se prepararon en solución reguladora de Krebs.

Resultados Prueba de unión a radioliqando La curva de saturación de [3H]-RTX a TRPV1 expresada en la médula espinal de rata mostró un valor Ko de 0.21 (0.16-0.27) y un valor BmáX de 57 (53-62) fmol/mg de proteína. La gráfica Scatchard fue esencialmente lineal y el análisis por computadora de los datos indicó que únicamente una clase de sitios de unión de alta afinidad estuvieron presentes. Los experimentos de unión por competencia [3H]-RTX revelaron que V394 y SB-366791 de referencia tuvieron un valor K¡ de 15 (13-17) nM y 36 (30-43) nM y nM respectivamente.

Fluorescencia de Ca La capsaicina (0.1 µ?) provocó un incremento en [Ca2+] en la mayor parte (95%) de las neuronas de ganglios de raíz dorsal, que se identificaron así como neuronas que expresan TRPV1. El valor CI5o de V394 que inhibió la movilización de [Ca2+]¡ evocada por capsaicina fue 0.83 nM (0.74 - 0.93). Los antagonistas TRPV1 de referencia, capsazepina y SB-366791 , inhibieron la respuesta de capsaicina con Cl50 de 948 (676-1330) nM y 8.7 (3.4-17.3) nM, respectivamente. Los resultados se expresan como la media y límites fiduciales al 95%.

Alodinia secundaria inducida por capsaicina en rata 90 minutos después del desafío de capsaicina, el compuesto V394 produjo un efecto preventivo importante (55%) contra el efecto pro-alodínico de capsaicina.

REFERENCIAS 1. Bakthavatchaíam, R.; Blum, C.A.; Brielmann, H.; Darrow, J.W.; De Lombaert, S.¡ Yoon, T.; Zheug, X. Neurogen Corporation WO 2004/056774, 170 pp. 2. Shieh, W.C.; Carlson, J.A.J. Org. Chem. 1992, 57, 379-381. 3. Zhang, J.; Assodi, J.; Charter, C; L'hermite, N.; Weston, J. Tetrahedron Lett. 2001 , 42, 6683-6686. 4. Meier, P.; Legraverant, S.; Mueller, S.; Schaub, J. Synthesis 2003, 4, 551-554. 5. a) Szallasi A. y Blunberg P.M. Neurosciences 1992, 8, 368. b) Szallasi A. y Blunberg P.M. Naunyn Schmiedeberg's Arch Pharmacol. 1993, 347, 84-91. 6. Munson, P.J.; Rodbard, D. Anal. Biochem. 1980, 107, 220-239. 7. Rigoni, M.; Trevisani, M.; Gazzieri, D.; Nadaletto, R.; Tognetto, M.; Cremínon, C; Davis, J.B.; Campi, B.; Amatesi, S.¡ Geppetti, P.; Harrison, S. Br. J. Pharmacol. 2003, 138, 977-985. 8. Kudo, Y.; Ozaki, K.; Miyakawa, A.; Amano, T.; Ogura, A. Jap. J. Pharmacol. 1986, 41, 345-351.

Claims (9)

NOVEDAD DE LA INVENCION REIVINDICACIONES

1.- Compuestos de fórmula general (I) en donde A es CH o N; Z es fenilo o un anillo piridilo, opcionalmente sustituido con uno o dos grupos R, que pueden ser iguales o diferentes entres sí y se seleccionan de alquilo de C C l haloalquilo de C1-C4 o halógeno.

2. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , caracterizado además porque R se selecciona de metilo, isopropilo, tere-butilo o trifluorometilo.

3. - El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , de la fórmula (la) en donde Z es como se definió en la reivindicación .

4.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 1 , de la fórmula (Ib) en donde Z es como se definió en la reivindicación 1.

5.- El compuesto de conformidad con la reivindicación 4, de fórmula:

6. - Los compuestos de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, para su uso como medicamentos.

7. - El uso de los compuestos de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, para la preparación de medicamentos para el tratamiento de enfermedades inflamatorias y trastornos urológicos.

8. - El uso como el que se reclama en la reivindicación 7, en donde la enfermedad inflamatoria es dolor neuropático.

9.- Las composiciones farmacéuticas que contienen compuesto de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, mezcla con portadores y/o excipientes farmacéuticamente aceptables.