MX2008014007A

MX2008014007A - Acido ribonucleico de interferencia corto (siarn) para administracion oral.

Info

Publication number: MX2008014007A
Application number: MX2008014007A
Authority: MX
Inventors: Francois Jean-Charles Natt
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 2006-05-04
Filing date: 2007-05-02
Publication date: 2008-11-12
Also published as: ES2398680T3; AU2007247458A1; EP2759596A1; IN2014DN10849A; US20120029052A1; KR101384880B1; US8084600B2; KR20090007785A; US9493771B2; WO2007128477A9; KR101378199B1; EP2765196A1; WO2007128477A3; US20100015707A1; WO2007128477A2; IN2014DN10872A; EP2013343A2; KR20130087635A; EP2135950A2; US8344128B2

Abstract

Un ácido ribonucleico de interferencia corto (siARN) para administración oral, comprendiendo este siARN dos cadenas de ARN separadas que son complementarias una con la otra sobre cuando menos 15 nucleótidos, en donde cada cadena es de 49 nucleótidos o menos, y en donde cuando menos una de cuyas cadenas contiene al menos una modificación química.

Description

ÁCIDO RIBON UCLEICO DE INTERFE RENCIA CORTO (siARN) PARA ADM INISTRACIÓN ORAL Antecedentes La interferencia de ARN inicialmente descubierta en las plantas como un Silenciamiento Genético Posterior a la Transcripción (PTGS), es un mecanismo altamente conservado desencadenado por el ARN de doble cadena (dsARN ), y es capaz de sub-regular la transcripción de los genes homólogos al dsARN 1. El dsARN es primeramente procesado por Dicer en dúplexes cortos de 21 a 23 nucleótidos, denominados como ARNs de interferencia cortos (siARNs)2. I ncorporados en el complejo de silenciamiento inducido por ARN (RISC), son capaces de mediar el silenciamiento genético a través de la disociación del ARNm objetivo en el centro de la región de homolog ía mediante el Argonauta 2 , un componente de RISC3. En el 2001 , Elbashir y colaboradores4 demostraron que la introducción directa de los siARNs sintéticos mediaría el silenciamiento genético de interferencia del ARN en Drosophila, pero también en células de mamífero . Desde entonces, el silenciamiento genético mediado por siARN ha llegado a ser una herramienta de biolog ía molecular poderosa y ampliamente utilizada en ambos estudios de validación de objetivo de identificación de objetivo. El uso de siARN para el silenciamiento genético en estudios con animales ha sido descrito en una cantidad limitada de modelos animales. Los siARNs no modificados se suministraron localmente en el ojo5, intratecalmente, o intracerebelarmente en el sistema nervioso central6, e intranasalmente para la inhibición de los virus respiratorios7. También se ha estudiado la inyección hidrodinámica i ntravenosa en la vena de la cola de siARNs no modificados. Este planteamiento permite tener un rápido suministro, principalmente al hígado8. Un número muy limitado de estudios han reportado sobre la administración sistémica de siARNs no modificados. Duxbury y colaboradores9 administraron intravenosamente siARNs no modificados que se dirigen a la Cinasa de Adhesión Focal a un modelo de ratón de xenoinjerto de tumor ortotópico, y observaron una inhibición del crecimiento tumoral , así como una quimiosensibilización a la gemcitabina . Southscheck y colaboradores reportaron el uso sistémico de siARNs altamente modificados químicamente para el silenciamiento endógeno de la Apolipoproteína B . La administración intraperitoneal de la mayoría de los siARNs anti-ApoB en la alta dosis de 50 miligramos/kilogramo, redujo el nivel de proteína ApoB y la concentración de lipoproteína1 0. A pesar de estos ejemplos, el uso in vivo de siARNs sobre el suministro sistémico requiere de mejoras con el objeto de hacer que esta tecnología sea ampliamente aplicable para la validación de objetivo o para aplicaciones terapéuticas. En realidad , los siARNs no modificados están sujetos a la digestión enzimática, principalmente por las nucleasas abundantes en la corriente sanguínea. Con el objeto de mejorar las propiedades farmacológicas de los siARNs, varios grupos investigaron la modificación química de estos reactivos. Aunque los planteamientos descritos son muy diferentes entre ellos mismos, y todavía no se ha llevado a cabo un estudio sistemático, un panorama de los resultados permite determinar la tolerancia de los siARNs a las modificaciones químicas. Se han investigado varias químicas, tales como de fosforotioatos1 1 o boranofosfatos12, 2'-0-metilo1 3, 2'-0-alilo1 4, 2'-metoxi-etilo (MOE), y 2'-desoxi-fluoro-nucleótidos1 5, o de los Ácidos Nucleicos Trabados (LNA)1 6. Estos estudios resaltaron que la tolerancia para la modificación no solamente depende de la química, sino que también depende de la posición . La presente invención proporciona un siARN m ínimamente modificado con mejores propiedades farmacológicas . Los siARNs m ínimamente modificados son ARN de doble cadena de 1 9 pares de bases modificados sobre el extremo 3' de cada cadena , con el objeto de prevenir la digestión de 3'-exonucleasa: la colgadura del 3'-didesoxi-nucleótido del siARN de 21 nucleótidos ha sido reemplazada por una fracción de fosfodiéster de 3'-hidroxi-propilo universal , y la modificación de los dos primeros nucleótidos con bases emparejadas sobre el extremo 3' de cada cadena mejora adicionalmente la estabilidad en suero. Aplicados intraperitonealmente u oralmente a ratones adultos, los siARNs modificados exhibieron una potencia más alta en el modelo de angiogénesis inducida por factor de crecimiento que se correlaciona con su mayor estabilidad en suero.

Breve Descri pción de la I nvención En un aspecto, la presente invención proporciona un ácido ribonucleico de interferencia corto (siARN ) para administración oral , comprendiendo este siARN dos cadenas de ARN separadas que son complementarias una con la otra sobre cuando menos 1 5 nucleótidos, en donde cada cadena es de 49 nucleótidos o menos, y en donde cuando menos una de cuyas cadenas contiene al menos una modificación química. En una modalidad , el siARN comprende cuando menos un nucleótido modificado. En otra modalidad , el siARN comprende cuando menos una tapa de extremo 3' . En otra modalidad , el nucleótido modificado se selecciona de entre 2'-alcoxi-ribonucleótido, 2'-alcoxi-alcoxi-ribonucleótido, un ribonucleótido de ácido nucleico trabado (LNA), 2'-fluoro-ribo nucleótido, morfolino-nucleótido. En otra modalidad , el nucleótido modificado se selecciona de entre los nucleótidos que tienen un enlace inter-nucleósido modificado seleccionado de entre enlaces de fosforotioato, fosforoditioato , fosforamidato, boranofosfonoato, y amida . En otra modalidad , estas dos cadenas de ARN son completamente complementarias una con la otra. En otra modalidad , el siARN comprende una colgadura de 1 a 6 nucleótidos sobre cuando menos uno del extremo 5' o el extremo 3' . En otra modalidad , el siARN contiene cuando menos una tapa 3', que es una fracción química conjugada con el extremo 3' por medio del átomo de carbono 3', y se selecciona de entre los compuestos de la Fórmula I: [Fórmula I] en donde: X es O ó S, Ri y R2 son independientemente OH, NH2, SH, alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo pueden estar sustituidos por heteroátomos y grupos funcionales adicionales, de preferencia un heteroátomo seleccionado a partir del grupo de N, O, ó S, o un grupo funcional seleccionado a partir del grupo de OH, NH2, SH, ácido carboxílico, o éster; o R1 y R2 pueden ser de la Fórmula Y-Z, en donde Y es O, N, S; y Z es H, alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo pueden estar sustituidos por heteroátomos adicionales, de preferencia un heteroátomo seleccionado a partir del grupo de N, O, ó S. En otra modalidad, el siARN contiene cuando menos una cadena que es complementaria sobre cuando menos 15 nucleótidos con el ARNm o el pre-ARNm de VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR3, Tie2, bFGFR, IL8RA, IL8RB, Fas, ó IGF2R.

En otra modalidad , el siARN contiene cuando menos una cadena que comprende una secuencia seleccionada a partir de la SEQ I D NO: 1 -900. En otra modalidad , el siARN se selecciona a partir del grupo que consiste en las SEQ I D NOs:901 -930. En otra modalidad , el siARN tiene una estabilidad en un ensayo de ácido gástrico estándar que es mayor que un siARN no modificado con la misma secuencia de nucleótidos. En otra modalidad , el siARN tiene una estabilidad en un ensayo de ácido gástrico estándar que es mayor o igual al 50 por ciento después de una exposición de 30 minutos. En otra modalidad , el siARN tiene una estabilidad en un ensayo de suero estándar mayor que el siARN no modificado. En otra modalidad , el siARN tiene una estabilidad en un ensayo de suero estándar que es mayor o igual al 50 por ciento después de una exposición de 30 minutos. En otra modalidad , el siARN tiene una estabilidad en un ensayo de lavado intestinal estándar que es mayor que el siARN no modificado. En otra modalidad , el siARN tiene una mejor biodisponi bilidad oral , comparándose con un siARN no modificado de la misma secuencia de nucleótidos. En un aspecto , la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un siARN con cualquiera o más de las propiedades anteriores.

En otro aspecto, la invención proporciona un siARN con cualquiera o más de las propiedades anteriores, para utilizarse como un medicamento. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un siARN con cualquiera o más de las propiedades anteriores, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno angiogénico. En otro aspecto, la invención proporciona el uso de un siARN con cualquiera o más de las propiedades anteriores, para inhibir un proceso angiogénico in vitro. Breve Descri pción de los Dibujos Figuras 1 a, 1 b, 1 c, 1 d, y 1 e: Degradación metabólica del siARN no modificado pG 1 3 (siARN de tipo silvestre en suero de ratón ); a-c) análisis de HPLC con intercambio de iones de los siARNs no modificados después de la incubación en suero de ratón durante 0, 30 , y 180 minutos; después de 30 minutos de incubación a 37°C , se aisló el pico mayor en la H PLC con intercambio de iones, y se re-inyectó en la LC-MS, d) tabla de pesos moleculares detectados y sus asignaciones; e) espectro ESI-MS. Figura 2: Ilustración de cuatro formatos de ARN de doble cadena: siARN de tipo silvestre (o no modificado), siARN , MOE o/h , siARN C3, y siARN C3-MOE. Figura 3: Estabilidad de siARN en tres formatos diferentes en ácido gástrico de ratón . Las muestras se incubaron a 37°C en ácido gástrico de ratón a una concentración 2 micromolar. La desaparición del compuesto progenitor fue seguida durante un período de 2 a 6 horas, mediante la cuantificación de la banda del compuesto progenitor. Pistas 1-7:siARN de tipo silvestre en ácido gástrico a t=0, 5, 10, 15, 30, 60, y 120 minutos. Pista 8: Escala de dsARN (30, 21, 19, 16, 13, 10 pares de bases). Pistas 9-15: siARN de C3 en ácido gástrico a t=0, 5, 10, 15, 30, 60 y 120 minutos. Pista 16: Escala de dsRNA (30, 21, 19, 16, 13, 10 pares de bases). Pistas 17-24: siRNA de C3-MOE en ácido gástrico a t=0, 5, 10, 15, 30, 60 y 120 minutos. Figura 4: Estabilidad del siARN en cuatro formatos diferentes en el lavado intestinal. Las muestras se lavaron a 37°C en microsomas de hígado a una concentración 5 micromolar. (De izquierda a derecha) Pista 1: Escala de dsARN (30, 21, 19, 16, 13, 10 pares de bases). Pistas 2-7: siARN de tipo silvestre en el lavado intestinal a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Pistas 8-13: siARN de moe o/h en el lavado intestinal a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Pistas 14-19: siARN C3 en el lavado intestinal a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos.

Pistas 20-25: siARN de C3-MOE en el lavado intestinal a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Figura 5: Estabilidad del siARN en cuatro formatos diferentes en microsomas de hígado. Las muestras se incubaron a 37°C en el fluido intestinal del lavado intestinal de rata a una concentración 2 micromolar. (De izquierda a derecha) Pista 1 : ds Figura 6: Estabilidad del siARN en cuatro formatos diferentes en suero de ratón. Las muestras se incubaron a 37°C en suero de ratón a una concentración 2 micromolar. La desaparición del compuesto progenitor fue seguida durante un período de 6 horas mediante la cuantificacion de la banda del compuesto progenitor. (De izquierda a derecha) Pista 1: Escala de dsARN (30, 21, 19, 16, 13, 10 pares de bases), escala de ARN (30, 21, 19, 16, 13, 10 pares de bases). Pista 2: siARN de tipo silvestre no tratado. Pista 3: siARN de moe o/h no tratado. Pista 4: siARN de C3 no tratado. Pista 5: siARN de C3-MOE no tratado. Pistas 6-9: Iguales que 2-5 en los microsomas de hígado, t=0. Pistas 10-13: Iguales que 2-5 en los microsomas de hígado, t=60 minutos. Pistas 14-17: Iguales que 2-5 en el sobrenadante S12, t=0. Pistas 18-21: Iguales que 2-5 en el sobrenadante S12, t=60 minutos. Pistas 2-7: siARN de tipo silvestre en suero de ratón a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Pistas 8-13: siARN de moe o/h en suero de ratón a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Pistas 14-19: siARN de C3 en suero de ratón a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Pistas 20-25: siARN de C3-MOE en suero de ratón a t=0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Figura 7: Caracterización in cellulo de tres formatos del siARN anti-VEGFR2 (dos secuencias independientes). Los siARN de tipo silvestre, siARN de C3, y siARN de C3-MOE se transfectaron en células MS1 en tres concentraciones (1, 5, 10 nM). La potencia de silenciamiento fue evaluada midiendo el nivel en superficie celular de VEGFR2 mediante FACS. Figuras 8a y 8b: Prueba in vivo de siARN de tipo silvestre, siARN de C3, y siARN de C3-MOE en un modelo de ratón de "cámara de ágar" de angiogénesis inducida por factor de crecimiento. La Figura 8a muestra los resultados de los controles, el siARN de VEGFR2 no modificado y el siARN de VEGFR2 modificado con C3 a 1, 5, y 25 microgramos por ratón al día. La Figura 8b muestra los controles, el siARN de VEGFR2 modificado por C3 y el siARN de VEGFR2 de C3-MOE a 0.2, 1, y 5 microgramos por ratón al día. En cada caso, a los grupos de dos siARNs anti-VEGFR2 se les dieron intraperitonealmente durante 3 días.

Figura 9: Prueba in vivo del siARN de C3-MOE anti-VEG FR2 dado intraperitonealmente (i .p. ) en un modelo de ratón de tumor de melanoma de homoinjerto B 1 6 a 5 y 20 microgramos por ratón al d ía . La Figura 9a muestra que el tratamiento intraperitoneal con el siARN de VEGFR2 modificado reduce de una manera significativa el desarrollo del tumor. La Figura 9b también muestra que la inyección intraperitoneal del siARN de VEG FR2 a 20 microgramos por ratón , da como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral . Figura 1 0 : Prueba in vivo de siARN de C3-MOE en un modelo de ratón de angiogénesis inducida por factor de crecimiento. Los siARNs anti-VEG FR2 se dieron oralmente diario durante 3 d ías a 20 microgramos por ratón al día. Figura 1 1 : Prueba in vivo del siARN de C3-MOE en un modelo de ratón de angiogénesis inducida por factor de crecimiento. Los siARNs anti-Tie2 se dieron diario intraperitonealmente (a 1 y 0.2 microgramos por ratón al d ía), u oralmente (a 20 y 5 microgramos por ratón al d ía), durante 3 días. Figura 1 1 a: peso del tejido cortado; Figura 1 1 b: eliminación genética de proteína Tie2. Descri pción Detallada de la Invención La presente invención se refiere a composiciones y métodos para el tratamiento de trastornos angiogénicos en un mamífero. De una manera específica, la invención se refiere a ARN de interferencia pequeño ("siARN"), el cual se puede utilizar para tratar trastornos angiogénicos después de su administración oral a un mamífero.

Los objetivos de la angiogénesis en las células endoteliales vasculares incluyen los siguientes objetivos/genes: VEGFR-1 (GenBank Acceso #AF06365); VEGF R-2 (Gen Bank Acceso #AF063658); VEGFR-3 (GenBank Acceso # ( N M_002020); Tie2 (TEK) (GenBank Acceso # NM_000459); bFGFR (GenBank Acceso # M60485); I L8RA (GenBank Acceso # L 1 9591 ); I L8RB (GenBank Acceso # L 1 9593); Fas (GenBank Acceso # X891 01 ); IGF2R (GenBank Acceso # N M_000876). Las moléculas de siARN de acuerdo con la presente invención median la interferencia del ARN ("ARNi"). El término "ARNi" es bien conocido en la técnica, y se entiende comúnmente que significa la inhibición de uno o más genes objetivo en una célula por el siARN con una región que es complementaria para el gen objetivo. Se conocen diferentes ensayos en este campo para probar el siARN con el fin de determinar su capacidad para mediar la ARNi (véase, por ejemplo, Elbashir y colaboradores, Methods 26 (2002), 1 99-21 3). El efecto del siARN de acuerdo con la presente invención , sobre la expresión genética, típicamente dará como resultado la expresión del gen objetivo que sea inhibido por cuando menos el 1 0 por ciento, el 33 por ciento, el 50 por ciento, el 90 por ciento , el 95 por ciento , o el 99 por ciento, al compararse con una célula no tratada con las moléculas de ARN de acuerdo con la presente invención. "siARN" o "ácido ribonucleico de interferencia pequeño", de acuerdo con la invención, tiene los significados conocidos en la materia , incluyendo Los siguientes aspectos, el siARN consiste en dos cadenas de ribonucleótidos que se hibridan a lo largo de una región complementaria bajo condiciones fisiológicas. Las cadenas están separadas, pero se pueden unir mediante un enlazador molecular en ciertas modalidades. Los ribonucleótidos individuales pueden ser ribonucleótidos que se presenten naturalmente no modificados, desoxi-ribonucleótidos que se presenten naturalmente no modificados, o pueden ser químicamente modificados o sintéticos, como se describe en cualquier otra parte de la presente . Las moléculas de siARN de acuerdo con la presente invención comprenden una región de doble cadena que es sustancialmente idéntica a una región del ARNm del gen objetivo. Es adecuada una región con una identidad del 1 00 por ciento con la secuencia correspondiente del gen objetivo. Este estado es referido como "completamente complementaria". Sin embargo, la región también puede contener uno, dos o tres malos emparejamientos, comparándose con la región correspondiente del gen objetivo , dependiendo de la longitud de la región del ARNm al que se dirija , y como tal , puede no ser completamente complementaria. En una modalidad , las moléculas de ARN de la presente invención se dirigen específicamente a un gen dado. Con el objeto de dirigirse solamente al ARNm deseado, el reactivo de siARN puede tener un 1 00 por ciento de homolog ía con el ARNm objetivo, y cuando menos dos nucleótidos mal emparejados con todos los demás genes presentes en la célula o en el organismo. En la técnica se conocen métodos para analizar e identificar los siARN con suficiente identidad de secuencias, con el objeto inhibir efectivamente la expresión de una secuencia objetivo específica. La identidad de secuencias se puede optimizar mediante los algoritmos de comparación y alineación de secuencias conocidos en este campo (véase Gribskov y Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1 991 , y las referencias citadas en el mismo), y calculando el porcentaje de diferencia entre las secuencias de nucleótidos, por ejemplo, mediante el algoritmo de Smith-Waterman como se implementa en el programa de software BESTFIT, utilizando los parámetros por omisión (por ejemplo, University of Wisconsin Genetic Computing Group). Otro factor que afecta a la eficiencia del reactivo ARNi es la región objetivo del gen objetivo. La región de un gen objetivo efectiva para la inhibición mediante el reactivo de ARNi puede determinarse mediante experimentación . Una región objetivo de ARNm adecuado sería la región codificante. También son adecuadas las regiones no traducidas, tales como la 5'-UTR, la 3'-UTR, y las uniones de empalme. Por ejemplo, para este propósito, se pueden llevar a cabo los ensayos de transfección descritos en Elbashir S . M . y colaboradores, 2001 EMBO J. , 20, 6877-6888. Existe un número de otros ensayos adecuados y métodos en la técnica, que son bien conocidos por la persona experta . La longitud de la región del siARN complementario con el objetivo , de acuerdo con la presente invención, puede ser de 1 0 a 1 00 nucleótidos, de 12 a 25 nucleótidos, de 1 4 a 22 nucleótidos, o de 1 5, 1 6, 1 7, ó 1 8 nucleótidos. Cuando hay malos emparejamientos con la región objetivo correspondiente, en general se requiere que la longitud de la región complementaria sea un poco más larga. Debido a que el siARN puede llevar extremos colgantes (que pueden o no ser complementarios con el objetivo), o nucleótidos adicionales complementarios consigo mismo, pero no con el gen objetivo, la longitud total de cada cadena separada de siARN puede ser de 1 0 a 1 00 nucleótidos, de 1 5 a 49 nucleótidos, de 1 7 a 30 nucleótidos, o de 19 a 25 nucleótidos. La frase "cada cadena es de 49 nucleótidos o menos" significa el número total de nucleótidos consecutivos en la cadena , incluyendo todos los nucleótidos modificados o no modificados, pero sin incluir cualesquiera fracciones qu ímicas que se puedan agregar al extremo 3' o 5' de la cadena . Las fracciones qu ímicas cortas insertadas en la cadena no se cuentan, pero un enlazador qu ímico diseñado para unir dos cadenas separadas no se considera que un enlazador químico diseñado para unir dos cadenas separadas crea nucleótidos consecutivos. La frase "una colgadura de 1 a 6 nucleótidos sobre cuando menos uno del extremo 5' o el extremo 3"' se refiere a la arquitectura del siARN complementario que forma dos cadenas separadas bajo condiciones fisiológicas. Si los nucleótidos terminales son parte de la región de doble cadena del siARN , se considera que el siARN es de extremos romos. Si uno o más nucleótidos están no emparejados sobre un extremo, se crea una colgadura. La longitud de la colgadura se mide por el número de nucleótidos colgantes. Los nucleótidos colgantes pueden estar sobre el extremo 5' o sobre el extremo 3' de cualquier cadena . El siARN de acuerdo con la presente invención confiere una alta estabilidad in vivo, adecuada para el suministro oral , mediante la inclusión de cuando menos un nucleótido modificado en cuando menos una de las cadenas. Por consiguiente, el siARN de conformidad con la presente invención , contiene cuando menos un ribonucleótido modificado o no natural . Se estipula una larga descripción de muchas modificaciones qu ímicas conocidas en la Solicitud de Patente del TCP Publicada Número WO 20037091 8, y no se repetirá aquí. Las modificaciones adecuadas para suministro oral se estipulan más específicamente en los Ejemplos y en la descripción de la presente. Las modificaciones adecuadas incluyen , pero no se limitan a, modificaciones a la fracción de azúcar (es decir, la posición 2' de la fracción de azúcar, tal como, por ejemplo , 2'-0-(2-metoxi-etilo) o 2'-MOE) (Martin y colaboradores, Helv. Chim. Acta, 1 995, 78 , 486-504), es decir, un grupo alcoxi-alcoxilo), o la fracción de base (es decir, una base no natural o modificada que mantiene su capacidad para emparejarse con otra base específica en una cadena de nucleótidos alternada). Otras modificaciones incluyen las modificaciones denominadas como de "estructura base", incluyendo, pero no limitándose a , el reemplazo del grupo fosfoéster (que conecta los ribonucleótidos adyacentes con , por ejemplo, fosforotioatos, fosforotioatos quirales, o fosforoditioatos). Finalmente, pueden ser significativas las modificaciones de extremo, algunas veces referidas en la presente como tapas3' o tapas 5' . Como se ilustra en la Tabla 1 , las tapas pueden consistir en simplemente agregar nucleótidos adicionales, tales como "T-T" , que se ha encontrado que confiere estabilidad a un siARN . Las tapas pueden consistir en químicas más complejas que son conocidas por los expertos en este campo. En una modalidad utilizada en los Ejemplos que se encuentran más adelante, la tapa 3' es una fracción química conjugada con el extremo 3' por medio del átomo de carbono3' , y se selecciona de entre los compuestos de la Fórmula I : I 3' O— P-R, I I 2 x [Fórm u la I] en donde: X es O ó S, Ri y R2 son independientemente OH , N H2, SH , alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo, arilo, alquil-arilo , aril-alquilo pueden estar sustituidos por heteroátomos y grupos funcionales adicionales, de preferencia un heteroátomo seleccionado a parti r del grupo de N , O, ó S , o un grupo funcional seleccionado a partir del grupo de OH , N H2, SH , ácido carboxílico, o éster; o Ri y R2 pueden ser de la Fórmula Y-Z, en donde Y es O , N , S ; y Z es H , alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo , arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, o pueden estar sustituidos por heteroátomos adicionales, de preferencia un heteroátomo seleccionado a partir del grupo de N, O, ó S. Los ejemplos de las modificaciones sobre la fracción de azúcar incluyen 2'-alcoxi-ribonucleótido, 2'-alcoxi-alcoxi-ribonucleótido, ribonucleótido de ácido nucleico trabado (LNA), 2'-fluoro-ribonucleótido, morfolino-nucleótido. El enlace internucleósidos también se puede modificar. Los ejemplos del enlace internucleósidos incluye los enlaces de fosforotioato, fosforoditioato, fosforamidato, y amida. Ri puede ser OH. Ri y R2 pueden comprender juntos de 1 a 24 átomos de carbono, de 1 a 12 átomos de carbono, de 2 a 10 átomos de carbono, de 1 a 8 ó 2 a 6 átomos de carbono. En otra modalidad, R^ y R2 son independientemente OH, alquilo inferior, arilo inferior, alquilo inferior-arilo, arilo inferior-alquilo, en donde alquilo inferior, arilo inferior, alquilo inferior-arilo, arilo inferior-alquilo pueden estar sustituidos por heteroátomos y grupos funcionales adicionales, como se definen anteriormente. En otra modalidad, R1 y R2 no son ambos OH. El término "inferior", en relación con los radicales o compuestos orgánicos, significa un compuesto o radical que puede estar ramificado o no ramificado con hasta e incluyendo 7 átomos de carbono, de preferencia de 1 a 4 átomos de carbono. Alquilo inferior representa por ejemplo, metilo, etilo, propilo normal, isopropilo, butilo normal, butilo secundario, butilo terciario, pentilo normal, y pentilo ramificado , hexilo normal , y hexilo ramificado. Los ejemplos de los alcoxilos incluyen O-Met, O-Eth , O-prop , O-but, O-pent, O-hex. Los métodos para la síntesis del siARN , incluyendo el siARN que contiene cuando menos un ribonucleótido modificado o no natural , son bien conocidos y están fácilmente disponibles para los expertos en la materia . Por ejemplo, se estipula una variedad de química sintética sin las Solicitudes de Patente del TCP Publicadas Números WO2005021 749 y WO20037091 8, ambas incorporadas a la presente como referencia. La reacción se puede llevar a cabo en solución, o de preferencia, en fase sólida, o mediante la utilización de reactivos soportados por polímero, seguido por combinación de las cadenas de ARN sintetizadas bajo condiciones en donde se forme una molécula de siARN , que sea capaz de mediar la ARNi . La presente invención proporciona un siARN que contiene cuando menos un nucleótido modificado que es adecuado para suministro oral . En términos funcionales, esto significa que el siARN tendrá una farmacocinética y biodistribución adecuadas después de su administración oral , para lograr el suministro al tejido objetivo de interés. En particular, esto requiere de estabilidad en suero , falta de respuesta inmune, y comportamiento de tipo fármaco . Muchas de estas características del siARN se pueden anticipar basándose en los ensayos de ácido gástrico convencionales, y en los ensayos de suero convencionales dados a conocer en cualquier otra parte de la presente.

En otro aspecto, la presente invención proporciona métodos para la inhibición de un gen objetivo, los cuales comprenden introducir en una célula, un siARN de acuerdo con la presente invención , que sea capaz de inhibir cuando menos un gen objetivo mediante la ARNi . También , se pueden introducir más de una especie de siARN , que sean específicas cada una para otra región objetivo, en una célula, al mismo tiempo o en secuencia. La presente invención no está limitada a cualquier tipo de gen o secuencia de nucleótidos objetivo. Por ejemplo , el gen objetivo puede ser un gen celular, un gen endógeno, un gen asociado con patógeno, un gen viral , o un oncogén . Los genes angiogénicos son de una importancia particular para la invención , debido a que algunos de los ejemplos realzan que el siARN oralmente suministrado de la invención puede acumularse en los sitios de vasculogénesis, neovascularización, o angiogénesis. Un listado actualizado de los genes angiogénicos en estos sitios de interés particular para la invención se enlistan en AngioDB : datábase of angiogénesis and angiogenesis-related molecules, Tae-Kwon Sohn , Eun-Joung Moon l , Seok-Ki Lee1 , Hwan-Gue Cho2 y Kyu-Won Kim3, Nucleic Acids Research, 2002, Volumen 30, Número 1 369-371 , y en l ínea en http://angiodb.snu .ac.kr/. Se han analizado con detalle los genes de un significado particular, y se estipulan en cualquier otra parte de la presente. En otro aspecto, la invención también proporciona un kit que comprende reactivos para inhibir la expresión de un gen objetivo en una célula, en donde este kit comprende dsARN de acuerdo con la presente invención . El kit comprende cuando menos uno de los reactivos necesarios para llevar a cabo la introducción in vitro o in vivo del dsARN de acuerdo con la presente invención , para probar muestras o sujetos. En una modalidad preferida , estos kits también comprenden instrucciones que detallan los procedimientos mediante los cuales se van a utilizar los componentes del kit. "Tratamiento de un trastorno angiogénico" , como se utiliza en esta divulgación, significa el uso de un siARN modificado de la invención en una composición farmacéutica para el tratamiento de enfermedades que involucren los procesos fisiológicos y patológicos de la neovascularización, vasculogénesis, y/o angiogénesis. Como tales, estas composiciones farmacéuticas son útiles para el tratamiento de enfermedades, condiciones, y trastornos que requieran de la inhibición de neovascularización , vasculogénesis, o angiogénesis, incluyendo, pero no limitándose a, crecimiento tumoral de cáncer y metástasis, neoplasma, neovascularización ocular (incluyendo degeneración macular, retinopatía diabética, retinopatía isquémica , retinopatía de prematuridad , neovascularización coroidal ), artritis reumatoide, osteoartritis, asma crónico, choque espéctico, enfermedades inflamatorias, sinovitis, destrucción de hueso y cartílago, crecimiento de pannus, formación de osteofitos, osteomielitis, soriasis, obesidad , hemangioma, sarcoma de Kaposi , ateroesclerosis (incluyendo ruptura de placa ateroesclerótica), endometriosis, verrugas, exceso de crecimiento de pelo, queloides de cicatrices, edema alérgico, hemorragia uterina disfuncional , quistes foliculares, híper-estímulo de ovario, endometriosis, osteomielitis, procesos inflamatorios e infecciosos (hepatitis, neumonía, glomerulonefritis), asma , pólipos nasales, trasplante, regeneración de h ígado, leucomalasia, tiroiditis, agrandamiento de tiroides, trastornos linfoproliferativos, malignidades hematológicas, malformaciones vasculares, y pre-eclampsia. Como se utiliza en la presente, "tratamiento" significa una acción que se toma para inhibir o reducir un proceso de una enfermedad , trastorno, o condición, para inhibir o reducir un síntoma de una enfermedad , trastorno, o condición , o para prevenir profilácticamente el establecimiento o el desarrollo adicional de una enfermedad , trastorno, o condición. "Tratar" es el verbo cognitivo del mismo. Una dosis efectiva del agente terapéutico de la invención es la dosis requerida para tratar un estado de enfermedad . La dosis efectiva depende del tipo de enfermedad , de la composición utilizada , de la vía de administración , del tipo de mam ífero que se esté tratando, de las características físicas del mam ífero específico en consideración , de la medicación concurrente, y de otros factores que reconocerán los expertos en la técnica médica. En términos generales, se administra una cantidad de entre 0.1 miligramos/kilogramo y 100 miligramos/kilogramo de peso corporal al d ía de siARN , dependiendo de la potencia. Las moléculas de ácido nucleico de la invención , y las formulaciones de las mismas, se pueden administrar oralmente, tópicamente, parenteralmente, mediante inhalación o rocío, o rectalmente, en formulaciones unitarias de dosificación que contengan portadores, adyuvantes, y/o veh ículos farmacéuticamente aceptables no tóxicos convencionales. El término "parenteral", como se utiliza en la presente, incluye inyección percutánea, subcutánea, intravascular (por ejemplo, intravenosa), intramuscular, intraperitoneal , o intratecal , o técnicas de infusión, y similares. En adición, se proporciona una formulación farmacéutica que comprende una molécula de ácido nucleico de la invención , y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Una o más moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar presentes en asociación con uno o más portadores y/o diluyentes y/o adyuvantes farmacéuticamente aceptables no tóxicos, y si se desea , otros ingredientes activos. Las composiciones farmacéuticas que contienen las moléculas de ácido nucleico de la invención pueden estar en una forma adecuada para uso oral , por ejemplo, como tabletas, trociscos, grageas, suspensiones acuosas u oleosas, polvos o gránulos dispersables, emulsión , cápsulas duras o blandas, o jarabes o el íxires. Las composiciones pretendidas para uso oral se pueden preparar de acuerdo con cualquier método conocido en la técnica para la fabricación de composiciones farmacéuticas, y estas composiciones pueden contener uno o más agentes edulcorantes, agentes saborizantes, agentes colorantes, o agentes conservadores, con el objeto de proporcionar preparaciones farmacéuticamente elegantes y agradables al paladar. Las tabletas contienen al ingrediente activo mezclado con excipientes farmacéuticamente aceptables no tóxicos que sean adecuados para la fabricación de tabletas. Estos excipientes pueden ser, por ejemplo, diluyentes inertes, tales como carbonato de calcio, carbonato de sodio, lactosa, fosfato de calcio, o fosfato de sodio; agentes de granulación o desintegrantes, por ejemplo almidón de maíz, o ácido algínico; agentes aglutinantes, por ejemplo almidón , gelatina, o acacia ; y agentes lubricantes, por ejemplo estearato de magnesio, ácido esteárico , o talco. Las tabletas pueden no estar recubiertas, o se pueden recubrir mediante las técnicas conocidas. Las formulaciones para uso oral también se pueden presentar como cápsulas de gelatina dura , en donde el ingrediente activo se mezcla con un diluyente sólido inerte, por ejemplo carbonato de calcio, fosfato de calcio, o caol ín , o como cápsulas de gelatina blanda, en donde el ingrediente activo se mezcla con agua y un medio oleoso, por ejemplo aceite de cacahuate, parafina l íquida, o aceite de oliva . Las suspensiones acuosas contienen a los materiales activos en una mezcla con los excipientes adecuados para la fabricación de suspensiones acuosas. La administración oral de las composiciones de la invención incluye todas las técnicas convencionales para la administración de sustancias directamente al estómago o al intestino, más importante mediante el tragado controlado por el paciente de la forma de dosificación, pero también mediante otros medios mecánicos y asistidos de dicho suministro. Son útiles los niveles de dosificación del orden de aproximadamente 0.1 miligramos a aproximadamente 1 40 miligramos por kilogramo de peso corporal al d ía en el tratamiento de las condiciones anteriormente indicadas (de aproximadamente 0.5 miligramos a aproximadamente 7 gramos por sujeto al d ía). La cantidad de ingrediente activo que se puede combinar con los materiales portadores para producir una sola forma de dosificación varía dependiendo del huésped tratado y del modo de administración particular. Las formas unitarias de dosificación generalmente contienen de aproximadamente 1 miligramo a aproximadamente 500 miligramos de un ingrediente activo . Se entiende que el nivel de dosis específico para cualquier sujeto particular depende de una variedad de factores, incluyendo la actividad del compuesto específico empleado, la edad , el peso corporal , la salud general , el sexo, la dieta , el tiempo de administración, la vía de administración , y la velocidad de excreción, la combinación de fármacos, y la gravedad de la enfermedad particular que se esté sometiendo a terapia . El efecto terapéutico de los agentes terapéuticos de la invención se puede mejorar mediante su combinación con otros agentes. Típicamente, estos otros agentes incluirán los agentes conocidos para utilizarse en el tratamiento de enfermedades similares, tales como trastornos angiogénicos. De una manera alternativa, estos agentes se pueden utilizar para reducir los efectos secundarios o los efectos indeseados provocados por los agentes terapéuticos de la invención . El siARN de la invención también puede tener importantes usos en investigación . Un estudio incluye la investigación de un proceso angiogénico in vitro. Un "proceso angiogénico in vitro" significa cualquier proceso para estudiar la angiogénesis o la vasculogénesis que no emplee a un animal entero. Como tales, los métodos in vitro o ex vivo y los ensayos que estudian los pasos del proceso angiogénico utilizando marcadores o indicadores de angiogénesis, se incluyen mediante la presente. Secuencia de N ucleótidos de Cadena de ARN Las secuencias de cadena de siARN identificadas en la Tabla 1 se han identificado como las secuencias de siARN adecuadas contra los siguientes objetivos: VEGFR-1 (GenBank Acceso #AF06365); VEGFR-2 (GenBank Acceso #AF063658); VEG FR-3 (GenBank Acceso #(N M_002020); Tie2 (TEK) (GenBank Acceso #N M_000459); bFGFR (GenBank Acceso #M60485); I L8RA (GenBank Acceso #L 1 9591 ); I L8RB (GenBank Acceso # L 1 9593); Fas (GenBank Acceso #X891 01 ); IG F2R (GenBank Acceso #N M_000876). Tabla 1 : siARNs contra VEGFR-1 , VEGFR-2, VEGFR-3, Tie2, bFGFR, IL8RA, IL8RB, Fas, IGF2R h umanos Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-1 1731 UAUAAGAACUUGUUAACUGTG 1 CAGUUAACAAGUUCUUAUATT 451 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-1 1021 UACGGUUUCAAGCACCUGCTG 2 GCAGGUGCUUGAAACCGUATT 452 VEGFR-1 1209 UUUAUGCUCAGCAAGAUUGTA 3 CAAUCUUGCUGAGCAUAAATT 453 VEGFR-1 2904 UUAUCUUCCUGAAAGCCGGAG 4 CCGGCUUUCAGGAAGAUAATT 454 VEGFR-1 1363 UUGAGGGAUACCAUAUGCGGT 5 CGCAUAUGGUAUCCCUCAATT 455 VEGFR-1 1158 UUGAUAAUUAACGAGUAGCCA 6 GCUACUCGUUAAUUAUCAATT 456 VEGFR-1 1091 UUAACCAUACAACUUCCGGCG 7 CCGGAAGUUGUAUGGUUAATT 457 VEGFR-1 471 UUAGGUGACGUAACCCGGCAG 8 GCCGGGUUACGUCACCUAATT 458 VEGFR-1 2751 UUGCUCUUGAGGUAGUUGGAG 9 CCAACUACCUCAAGAGCAATT 459 VEGFR-1 636 UUUGUCUUAUACAAAUGCCCA 10 GGCAUUUGUAUAAGACAAATT 460 VEGFR-1 1254 UUGACAAUUAGAGUGGCAGTG 11 CUGCCACUCUAAUUGUCAATT 461 VEGFR-1 2375 UUAUAAUUGAUAGGUAGUCAG 12 GACUACCUAUCAAUUAUAATT 462 VEGFR-1 3536 UUGAGUAUGUAAACCCACUAT 13 AGUGGGUUUACAUACUCAATT 463 VEGFR-1 2971 UUCCAUAGUGAUGGGCUCCTT 14 GGAGCCCAUCACUAUGGAATT 464 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-1 1774 UCUGUUAUUAACUGUCCGCAG 15 GCGGACAGUUAAUAACAGATT 465 VEGFR-1 3494 UUGGGAUGUAGUCUUUACCAT 16 GGUAAAGACUACAUCCCAATT 466 VEGFR-1 2269 UGUUAGAGUGAUCAGCUCCAG 17 GGAGCUGAUCACUCUAACATT 467 VEGFR-1 525 UUUCCAUCAGGGAUCAAAGTG 18 CUUUGAUCCCUGAUGGAAATT 468 VEGFR-1 769 UUGAACUCUCGUGUUCAAGGG 19 CUUGAACACGAGAGUUCAATT 469 VEGFR-1 2246 UAGACUUGUCCGAGGUUCCTT 20 GGAACCUCGGACAAGUCUATT 470 VEGFR-1 732 UUGAGGACAAGAGUAUGGCCT 21 GCCAUACUCUUGUCCUCAATT 471 VEGFR-1 3813 UUACUGGUUACUCUCAAGUCA 22 ACUUGAGAGUAACCAGUAATT 472 VEGFR-1 3925 UUCCAGCUCAGCGUGGUCGTA 23 CGACCACGCUGAGCUGGAATT 473 VEGFR-1 1414 UGCUUCGGAAUGAUUAUGGTT 24 CCAUAAUCAUUCCGMGCATT 474 VEGFR-1 615 UUGACUGUUGCUUCACAGGTC 25 CCUGUGAAGCAACAGUCAATT 475 VEGFR-1 3300 UCAUCCAUUUGUACUCCUGGG 26 CAGGAGUACAAAUGGAUGATT 476 VEGFR-1 2845 UGGUUUCUUGCCUUGUUCCAG 27 GGAACAAGGCAAGAAACCATT 477 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: VEGF -1 2802 UUAGGCUCCAUGUGUAGUGCT 28 CACUACACAUGGAGCCUAATT 478 VEGFR-1 1564 UCUAGAGUCAGCCACAACCAA 29 GGUUGUGGCUGACUCUAGATT 479 VEGFR-1 1154 UAAUUAACGAGUAGCCACGAG 30 CGUGGCUACUCGUUAAUUATT 480 VEGFR-1 1090 UAACCAUACAACUUCCGGCGA 31 GCCGGAAGUUGUAUGGUUATT 481 VEGFR-1 1260 UUCACAUUGACAAUUAGAGTG 32 CUCUAAUUGUCAAUGUGAATT 482 VEGFR-1 3530 AUGUAAACCCACUAUUUCCTG 33 GGAAAUAGUGGGUUUACAUTT 483 VEGFR-1 1177 AUCCUCUUCAGUUACGUCCTT 34 GGACGUAACUGAAGAGGAUTT 484 VEGFR-1 1193 UUGUAUAAUUCCCUGCAUCCT 35 GAUGCAGGGAAUUAUACAATT 485 VEGFR-1 1092 UUUAACCAUACAACUUCCGGC 36 CGGAAGUUGUAUGGUUAAATT 486 VEGFR-1 627 UACAAAUGCCCAUUGACUGTT 37 CAGUCAAUGGGCAUUUGUATT 487 VEGFR-1 474 AUGUUAGGUGACGUAACCCGG 38 GGGUUACGUCACCUAACAUTT 488 VEGFR-1 2761 UAAGUCACGUUUGCUCUUGAG 39 CAAGAGCAAACGUGACUUATT 489 VEGFR-1 2752 UUUGCUCUUGAGGUAGUUGGA 40 CAACUACCUCAAGAGCAAATT 490 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de sLARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-1 3516 UUUCCUGUCAGUAUGGCAUTG 41 AUGCCAUACUGACAGGAAATT 491 VEGFR-1 1790 UACUGUAGUGCAUUGUUCUGT 42 AGAACAAUGCACUACAGUATT 492 VEGFR-1 1155 AUAAUUAACGAGUAGCCACGA 43 GUGGCUACUCGUUAAUUAUTT 493 VEGFR-1 1370 UUGUAGGUUGAGGGAUACCAT 44 GGUAUCCCUCAACCUACAATT 494 VEGFR-1 2227 UUGMCAGUGAGGUAUGCUGA 45 AGCAUACCUCACUGUUCAATT 495 VEGFR-1 3481 UUUACCAUCCUGUUGUACATT 46 UGUACAACAGGAUGGUAAATT 496 VEGFR-1 1261 UUUCACAUUGACAAUUAGAGT 47 UCUAAUUGUCAAUGUGAAATT 497 VEGFR-1 1791 AUACUGUAGUGCAUUGUUCTG 48 GAACAAUGCACUACAGUAUTT 498 VEGFR-1 3805 UACUCUCAAGUCAAUCUUGAG 49 CAAGAUUGACUUGAGAGUATT 499 VEGFR-1 2764 AAAUAAGUCACGUUUGCUCTT 50 GAGCAAACGUGACUUAUUUTT 500 VEGFR-2 617 UAAUAGACUGGUAACUUUCAT 51 GAAAGUUACCAGUCUAUUATT 501 52 VEGFR-2 2686 UAGAAGGUUGACCACAUUGAG CAAUGUGGUCAACCUUCUATT 502 53 VEGFR-2 561 UAGCUGAUCAUGUAGCUGGGA CCAGCUACAUGAUCAGCUATT 503 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-2 54 525 UUGCUGUCCCAGGAAAUUCTG GAAUUUCCUGGGACAGCAATT 504 VEGFR-2 2277 AUGAUUUCCAAGUUCGUCUTT 55 AGACGAACUUGGAAAUCAUTT 505 VEGFR-2 56 395 UAAUGUACACGACUCCAUGTT CAUGGAGUCGUGUACAUUATT 506 VEGFR-2 57 2410 UUCAUCUGGAUCCAUGACGAT CGUCAUGGAUCCAGAUGAATT 507 VEGFR-2 2007 58 UGAUUCUCCAGGUUUCCUGTG CAGGAAACCUGGAGAAUCATT 508 VEGFR-2 1323 UAGACCGUACAUGUCAGCGTT 59 CGCUGACAUGUACGGUCUATT 509 VEGFR-2 60 3382 UUCUGGUGUAGUAUAAUCAGG UGAU UAUACUACACCAGAATT 510 VEGFR-2 3078 61 UUUCGUGCCGCCAGGUCCCTG GGGACCUGGCGGCACGAAATT 511 VEGFR-2 1432 UUCUUCACAAGGGUAUGGGTT 62 CCCAUACCCUUGUGAAGAATT 512 VEGFR-2 1817 UCAAUUUCCAAAGAGUAUCCA 63 GAUACUCUUUGGAAAUUGATT 513 VEGFR-2 688 UAGUUCAAUUCCAUGAGACGG 64 GUCUCAUGGAAUUGAACUATT 514 65 VEGFR-2 2310 AACAUGGCAAUCACCGCCGTG CGGCGGUGAUUGCCAUGUUTT 515 66 VEGFR-2 2130 UCCUUCAAUACAAUGCCUGAG CAGGCAUUGUAUUGAAGGATT 516 VEGFR-2 799 UACAAGUUUCUUAUGCUGATG 67 UCAGCAUAAGAAACUUGUATT 517 VEGFR-2 3523 UGAUAUCGGAAGAACAAUGTA 68 CAUUGUUCUUCCGAUAUCATT 518 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-2 1843 UGUGCUAUUAGAGAACAUGGT 69 CAUGUUCUCUAAUAGCACATT 519 70 VEGFR-2 2941 UUCUACAUCACUGAGGGACTT GUCCCUCAGUGAUGUAGAATT 520 71 VEGFR-2 2088 UCUUUAAACCACAUGAUCUGT AGAUCAUGUGGUUUAAAGATT 521 72 VEGFR-2 472 UCUUGCACAAAGUGACACGTT CGUGUCACUUUGUGCAAGATT 522 73 VEGFR-2 180 UGAUUAUUGGGCCAAAGCCAG GGCUUUGGCCCAAUAAUCATT 523 VEGFR-2 1568 AUUUGUACAAAGCUGACACAT 74 GUGUCAGCUUUGUACAAAUTT 524 75 VEGFR-2 3141 UAAAUAUCCCGGGCCAAGCCA GCUUGGCCCGGGAUAUUUATT 525 76 VEGFR-2 3769 AACCAUACCACUGUCCGUCTG GACGGACAGUGGUAUGGUUTT 526 77 VEGFR-2 3920 UGUCAUCGGAGUGAUAUCCGG GGAUAUCACUCCGAUGACATT 527 78 VEGFR-2 1718 UCUCAAACGUAGAUCUGUCTG GACAGAUCUACGUUUGAGATT 528 79 VEGFR-2 2919 UCCUCCACAAAUCCAGAGCTG GCUCUGGAUUUGUGGAGGATT 529 VEGFR-2 324 UAAAUGACCGAGGCCAAGUCA 80 ACUUGGCCUCGGUCAUUUATT 530 VEGFR-2 1050 UAACCAAGGUACUUCGCAGGG 81 CUGCGAAGUACCUUGGUUATT 531 VEGFR-2 56 UAGGCAAACCCACAGAGGCGG 82 GCCUCUGUGGGUUUGCCUATT 532 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-2 2453 UGGCAUCAUAAGGCAGUCGTT 83 CGACUGCCUUAUGAUGCCATT 533 VEGFR-2 1303 UUGAGUGGUGCCGUACUGGTA 84 CCAGUACGGCACCACUCAATT 534 VEGFR-2 1813 UUUCCAAAGAGUAUCCAAGTT 85 CUUGGAUACUCUUUGGAAATT 535 VEGFR-2 2015 UUGUCGUCUGAUUCUCCAGGT 86 CUGGAGAAUCAGACGACAATT 536 VEGFR-2 3088 UAAGAGGAUAUUUCGUGCCGC 87 GGCACGAAAUAUCCUCUUATT 537 VEGFR-2 625 UAUGUACAUAAUAGACUGGTA 88 CCAGUCUAUUAUGUACAUATT 538 VEGFR-2 800 UUACAAGUUUCUUAUGCUGAT 89 CAGCAUAAGAAACUUGUAATT 539 VEGFR-2 811 UAGGUCUCGGUUUACAAGUTT 90 ACUUGUAAACCGAGACCUATT 540 VEGFR-2 812 UUAGGUCUCGGUUUACAAGTT 91 CUUGUAAACCGAGACCUAATT 541 VEGFR-2 3093 UCCGAUAAGAGGAUAUUUCGT 92 GAAAUAUCCUCUUAUCGGATT 542 VEGFR-2 801 UUUACAAGUUUCUUAUGCUGA 93 AGCAUAAGAAACUUGUAAATT 543 VEGFR-2 2009 UCUGAUUCUCCAGGUUUCCTG 94 GGAAACCUGGAGAAUCAGATT 544 VEGFR-2 2127 UUCAAUACMUGCCUGAGUCT 95 ACUCAGGCAUUGUAUUGAATT 545 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-2 1585 UUUGUUGACCGCUUCACAUTT 96 AUGUGAAGCGGUCAACAAATT 546 VEGFR-2 562 AUAGCUGAUCAUGUAGCUGGG 97 CAGCUACAUGAUCAGCUAUTT 547 VEGFR-2 3906 98 UAUCCGGACUGGUAGCCGCTT GCGGCUACCAGUCCGGAUATT 548 VEGFR-2 1316 UACAUGUCAGCGUUUGAGUGG 99 ACUCAAACGCUGACAUGUATT 549 1 VEGFR-2 3520 UAUCGGAAGAACAAUGUAGTC 00 CUACAUUGUUCUUCCGAUATT 550 VEGFR-3 453 UUCCUGUUGACCAAGAGCGTG 101 CGCUCUUGGUCAACAGGAATT 551 VEGFR-3 2694 UUGAGCUCCGACAUCAGCGCG 102 CGCUGAUGUCGGAGCUCAATT 552 VEGFR-3 1689 UUGGAUUCGAUGGUGAAGCCG 103 GCUUCACCAUCGAAUCCAATT 553 VEGFR-3 988 UUCAUGCACMUGACCUCGGT 104 CGAGGUCAUUGUGCAUGAATT 554 VEGFR-3 4374 UUACCAAGGAAUAAUCGGCGG 105 GCCGAUUAUUCCUUGGUAATT 555 VEGFR-3 2142 UCUUUGUACCACACGAUGCTG 106 GCAUCGUGUGGUACAAAGATT 556 VEGFR-3 1833 UUGCAGUCGAGCAGAAGCGGG 107 CGCUUCUGCUCGACUGCAATT 557 108 VEGFR-3 3903 UUCAGCUACCUGAAGCCGCTT GCGGCUUCAGGUAGCUGAATT 558 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-3 109 3273 UACACCUUGUCGAAGAUGCTT GCAUCUUCGACAAGGUGUATT 559 110 VEGFR-3 1107 UACCACUGGAACUCGGGCGGG CGCCCGAGUUCCAGUGGUATT 560 VEGFR-3 111 336 UAGCAGACGUAGCUGCCUGTG CAGGCAGCUACGUCUGCUATT 561 112 VEGFR-3 2607 UUGUGGAUGCCGAAAGCGGAG CCGCUUUCGGCAUCCACAATT 562 VEGFR-3 113 1556 UCACAGUCUUAUUCUUUCCCT GGAAAGAAUAAGACUGUGATT 563 VEGFR-3 114 108 UCCGUGAUGUUCAAGGUCGGG CGACCUUGAACAUCACGGATT 564 115 VEGFR-3 1954 AUAGUGGCCCUCGUGCUCGGG CGAGCACGAGGGCCACUAUTT 565 116 VEGFR-3 2100 AAGCACUGCAUCUCCAGCGAG CGCUGGAGAUGCAGUGCUUTT 566 117 VEGFR-3 693 UCAUAGAGCUCGUUGCCUGTG CAGGCAACGAGCUCUAUGATT 567 118 VEGFR-3 2337 AGGAUCACGAUCUCCAUGCTG GCAUGGAGAUCGUGAUCCUTT 568 119 VEGFR-3 2054 UCAAGUUCUGCGUGAGCCGAG CGGCUCACGCAGAACUUGATT 569 120 VEGFR-3 860 UCUGUUGGGAGCGUCGCUCGG GAGCGACGCUCCCAACAGATT 570 121 VEGFR-3 2436 UAGCCCGUCUUGAUGUCUGCG CAGACAUCAAGACGGGCUATT 571 122 VEGFR-3 3759 UUCAUCCUGGAGGAACCACGG GUGGUUCCUCCAGGAUGAATT 572 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de sLARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: 123 VEGFR-3 288 AACACCUUGCAGUAGGGCCTG GGCCCUACUGCAAGGUGUUTT 573 124 VEGFR-3 1485 UGCGUGGUCACCGCCCUCCAG GGAGGGCGGUGACCACGCATT 574 VEGFR-3 2502 UCGUAGGACAGGUAUUCGCAT 125 GCGAAUACCUGUCCUACGATT 575 126 VEGFR-3 925 AUACGAGCCCAGGUCGUGCTG GCACGACCUGGGCUCGUAUTT 576 127 VEGFR-3 426 UUGUUGAUGAAUGGCUGCUCA AGCAGCCAU UCAUCAACAATT 577 VEGFR-3 128 3189 UAGAUGUCCCGGGCAAGGCCA GCCUUGCCCGGGACAUCUATT 578 129 VEGFR-3 2274 UUGACGCAGCCCUUGGGUCTG GACCCAAGGGCUGCGUCAATT 579 130 VEGFR-3 2196 UUCUGGUUGGAGUCCGCCAAG UGGCGGACUCCAACCAGAATT 580 131 VEGFR-3 2019 UGCACCGACAGGUACUUCUTG AGAAGUACCUGUCGGUGCATT 581 VEGFR-3 360 AUGCGUGCCUUGAUGUACUTG 132 AGUACAUCAAGGCACGCAUTT 582 133 VEGFR-3 1755 UACUUGUAGCUGUCGGCUUGG AAGCCGACAGCUACAAGUATT 583 134 VEGFR-3 3037 UUCCAUGGUCAGCGGGCUCAG GAGCCCGCUGACCAUGGAATT 584 135 VEGFR-3 1018 UUUGAGCCACUCGACGCUGAT CAGCGUCGAGUGGCUCAAATT 585 VEGFR-3 1684 UUCGAUGGUGAAGCCGUCGGG 136 CGACGGCUUCACCAUCGAATT 586 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: VEGFR-3 4373 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81 AAUGGUUUGAUCUAACUGAAG 290 UCAGUUAGAUCAAACCAUUTT 740 IL8RA 1372 UCCAUGGAGGUGCAAAGGCCG 291 GCCUUUGCACCUCCAUGGATT 741 IL8RA 1388 AUGAUGGUGCUUCGUUUCCAT 292 GGAAACGAAGCACCAUCAUTT 742 IL8RA 643 UGUUUGGAUGGUAAGCCUGGC 293 CAGGCUUACCAUCCAAACATT 743 IL8RA 1784 UUCUUGUGGCAUAGAUCUGGC 294 CAGAUCUAUGCCACAAGAATT 744 IL8RA 1524 AGGGUCMCGAGAGCAUCCAG 295 GGAUGCUCUCGUUGACCCUTT 745 IL8RA 237 AUAGGCGAUGAUCACAACATA 296 UGUUGUGAUCAUCGCCUAUTT 746 IL8RA 219 AUACUUGUUGAGUGUCUCAGT 297 UGAGACACUCAACAAGUAUTT 747 IL8RA 1389 AAUGAUGGUGCUUCGUUUCCA 298 GAAACGAAGCACCAUCAUUTT 748 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de sLARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: IL8RA 1972 CUUUAUUAGGAACAUCUGCCT 299 GCAGAUGUUCCUAAUAAAGTT 749 IL8RA 1115 UAGGAGGUAACACGAUGACGT 300 GUCAUCGUGUUACCUCCUATT 750 IL8RB 2648 UUAAGUGUCAAUUUAGUGGCA 301 CCACUAAAUUGACACUUAATT 751 IL8RB 2184 UUUCUUGUGGGUCAAUUCCTA 302 GGAAUUGACCCACAAGAAATT 752 IL8RB 2250 UUGGGUCUUGUGAAUAAGCTG 303 GCUUAUUCACAAGACCCAATT 753 IL8RB 1746 UUCACUUCUUAGAACAUAGAG 304 CUAUGUUCUAAGAAGUGAATT 754 IL8RB 960 UUGGAUGAGUAGACGGUCCTT 305 GGACCGUCUACUCAUCCAATT 755 IL8RB 454 AUUACUAAGAUCUUCACCUTT 306 AGGUGAAGAUCUUAGUAAUTT 756 IL8RB 2750 UUGGUUUAAUCAGCCUUGGTG 307 CCAAGGCUGAU U AAACCAATT 757 IL8RB 2604 AUCACUACUGUUUAUCUGCAG 308 GCAGAUAAACAGUAGUGAUTT 758 IL8RB 1026 AUCCGUAACAGCAUCCGCCAG 309 GGCGGAUGCUGUUACGGAUTT 759 IL8RB 1384 AUGUAUAGCUAGAAUCUUGAG 310 CAAGAUUCUAGCUAUACAUTT 760 IL8RB 1149 AAGAUGACCCGCAUGGCCCGG 311 GGGCCAUGCGGGUCAUCUUTT 761 IL8RB 2464 UCUCAGUACCUCAUGUAGGTG 312 CCUACAUGAGGUACUGAGATT 762 Nombre SEO. SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: IL8RB 877 UUUGACCAAGUAGCGCUUCTG 313 GAAGCGCUACUUGGUCAAATT 763 IL8RB 2324 UUCGUUAGGUACAUAUCACAT 314 GUGAUAUGUACCUAACGAATT 764 IL8RB 2360 AUGAGUACUUCAUUCCUCUTT 315 AGAGGAAUGAAGUACUCAUTT 765 IL8RB 265 UUGGGUGGUAGUCAGAGCUGT 316 AGCUCUGACUACCACCCAATT 766 IL8RB 1642 UUUCUAAACCAUGCAAGGGAA 317 CCCUUGCAUGGUUUAGAAATT 767 IL8RB 2146 UCAUGUGUUAAUUCUAUGUCT 318 ACAUAGAAUUAACACAUGATT 768 IL8RB 2627 UUAAGUCACAUUGCGGUACAA 319 GUACCGCAAUGUGACUUAATT 769 IL8RB 1000 UGUAUUGUUGCCCAUGUCCTC 320 GGACAUGGGCAACAAUACATT 770 IL8RB 315 UGACCUGCUGUUAUUGGAGTG 321 CUCCAAUAACAGCAGGUCATT 771 IL8RB 2774 AAAUAUAGGCAGGUGGUUCTA 322 GAACCACCUGCCUAUAUUUTT 772 IL8RB 219 ACCUUGACGAUGAAACUUCTG 323 GAAGUUUCAUCGUCAAGGUTT 773 IL8RB 2389 UUUCAAGGUUCGUCCGUGUTG 324 ACACGGACGAACCUUGAAATT 774 IL8RB 385 UGAGGUAAACUUAAAUCCUGA 325 AGGAUUUAAGUUUACCUCATT 775 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de sLARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: IL8RB 1347 UUCUGGCCAAUGAAGGCGUAG 326 ACGCCUUCAUUGGCCAGAATT 776 IL8RB 2649 UUUAAGUGUCAAUUUAGUGGC 327 CACUAAAUUGACACUUAAATT 777 IL8RB 1737 UAGAACAUAGAGUGCCAUGGG 328 CAUGGCACUCUAUGUUCUATT 778 IL8RB 455 AAUUACUAAGAUCUUCACCTT 329 GGUGAAGAUCUUAGUAAUUTT 779 IL8RB 965 UAACAUUGGAUGAGUAGACGG 330 GUCUACUCAUCCAAUGUUATT 780 IL8RB 1740 UCUUAGAACAUAGAGUGCCAT 331 GGCACUCUAUGUUCUAAGATT 781 IL8RB 2632 UGGCAUUAAGUCACAUUGCGG 332 GCAAUGUGACUUAAUGCCATT 782 IL8RB 2755 UAGCCUUGGUUUAAUCAGCCT 333 GCUGAUUAAACCAAGGCUATT 783 IL8RB 2183 UUCUUGUGGGUCAAUUCCUAT 334 AGGAAUUGACCCACAAGAATT 784 IL8RB 2605 UAUCACUACUGUUUAUCUGCA 335 CAGAUAAACAGUAGUGAUATT 785 IL8RB 2340 UCAGGCUGAAGGAUACUUCGT 336 GAAGUAUCCUUCAGCCUGATT 786 IL8RB 2143 UGUGUUAAUUCUAUGUCUGAA 337 CAGACAUAGAAUUAACACATT 787 IL8RB 998 UAUUGUUGCCCAUGUCCUCAT 338 GAGGACAUGGGCAACAAUATT 788 IL8RB 2180 UUGUGGGUCAAUUCCUAUAAG 339 UAUAGGAAUUGACCCACAATT 789 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de sLARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: IL8RB 2185 AUUUCUUGUGGGUCAAUUCCT 340 GAAUUGACCCACAAGAAAUTT 790 IL8RB 307 UGUUAUUGGAGUGGCCACCGA 341 GGUGGCCACUCCAAUAACATT 791 IL8RB 2481 UCUGUAAAUUUGUUCACUCTC 342 GAGUGAACAAAUUUACAGATT 792 IL8RB 2617 UUGCGGUACAACUAUCACUAC 343 AGUGAUAGUUGUACCGCAATT 793 IL8RB 956 AUGAGUAGACGGUCCUUCGGA 344 CGAAGGACCGUCUACUCAUTT 794 IL8RB 456 UAAUUACUAAGAUCUUCACCT 345 GUGAAGAUCUUAGUAAUUATT 795 IL8RB 226 UGAAACAACCUUGACGAUGAA 346 CAUCGUCAAGGUUGUUUCATT 796 IL8RB 1394 UGAUCAAGCCAUGUAUAGCTA 347 GCUAUACAUGGCUUGAUCATT 797 IL8RB 458 UGUAAUUACUAAGAUCUUCAC 348 GAAGAUCUUAGUAAUUACATT 798 IL8RB 881 UGAAUUUGACCAAGUAGCGCT 349 CGCUACUUGGUCAAAUUCATT 799 IL8RB 2327 UACUUCGUUAGGUACAUAUCA 350 AUAUGUACCUAACGAAGUATT 800 Fas 109 UGUAGUAACAGUCUUCCUCAA 351 GAGGAAGACUGUUACUACATT 801 Fas 41 UGGACGAUAAUCUAGCAACAG 352 GUUGCUAGAUUAUCGUCCATT 802 Fas 161 UAUGGCAGAAUUGGCCAUCAT 353 GAUGGCCAAUUCUGCCAUATT 803 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de sLARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: Fas 182 UUUCACCUGGAGGACAGGGCT 354 CCCUGUCCUCCAGGUGAAATT 804 Fas 62 UCACUUGGGCAUUAACACUTT 355 AGUGUUAAUGCCCAAGUGATT 805 Fas 377 ACUUCCUCUUUGCACUUGGTG 356 CCAAGUGCAAAGAGGAAGUTT 806 Fas 349 UGAGUGUGCAUUCCUUGAUGA 357 AUCAAGGAAUGCACACUCATT 807 Fas 245 UCCCUUCUUGGCAGGGCACGC 358 GUGCCCUGCCAAGAAGGGATT 808 Fas 205 GACUGUGCAGUCCCUAGCUTT 359 AGCUAGGGACUGCACAGUCTT 809 Fas 145 AUCAUGAUGCAGGCCUUCCAA 360 GGAAGGCCUGCAUCAUGAUTT 810 Fas 123 UUCUGAGUCUCAACUGUAGTA 361 CUACAGUUGAGACUCAGAATT 811 Fas 34 UAAUCUAGCAACAGACGUAAG 362 UACGUCUGUUGCUAGAUUATT 812 Fas 114 UCAACUGUAGUAACAGUCUTC 363 AGACUGUUACUACAGUUGATT 813 Fas 115 CUCAACUGUAGUAACAGUCTT 364 GACUGUUACUACAGUUGAGTT 814 Fas 28 AGCAACAGACGUAAGAACCAG 365 GGUUCUUACGUCUGUUGCUTT 815 Fas 122 UCUGAGUCUCAACUGUAGUAA 366 ACUACAGUUGAGACUCAGATT 816 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: Fas 186 UUCCUUUCACCUGGAGGACAG 367 GUCCUCCAGGUGAAAGGAATT 817 Fas 42 UUGGACGAUAAUCUAGCAACA 368 UUGCUAGAUUAUCGUCCAATT 818 Fas 111 ACUGUAGUAACAGUCUUCCTC 369 GGAAGACUGUUACUACAGUTT 819 Fas 144 UCAUGAUGCAGGCCUUCCAAG 370 UGGAAGGCCUGCAUCAUGATT 820 Fas 92 UCAAUUCCAAUCCCUUGGAGT 371 UCCAAGGGAUUGGAAUUGATT 821 Fas 201 GUGCAGUCCCUAGCUUUCCTT 372 GGAAAGCUAGGGACUGCACTT 822 Fas 128 CCAAGUUCUGAGUCUCAACTG 373 GUUGAGACUCAGAACUUGGTT 823 Fas 36 GAUAAUCUAGCAACAGACGTA 374 CGUCUGUUGCUAGAUUAUCTT 824 Fas 162 UUAUGGCAGAAUUGGCCAUCA 375 AUGGCCAAUUCUGCCAUAATT 825 Fas 127 CAAGUUCUGAGUCUCAACUGT 376 AGUUGAGACUCAGAACUUGTT 826 Fas 202 UGUGCAGUCCCUAGCUUUCCT 377 GAAAGCUAGGGACUGCACATT 827 Fas 82 UCCCUUGGAGUUGAUGUCAGT 378 UGACAUCAACUCCAAGGGATT 828 Fas 160 AUGGCAGAAUUGGCCAUCATG 379 UGAUGGCCAAUUCUGCCAUTT 829 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: Fas 150 UGGCCAUCAUGAUGCAGGCCT 380 GCCUGCAUCAUGAUGGCCATT 830 Fas 63 GUCACUUGGGCAUUAACACTT 381 GUGUUAAUGCCCAAGUGACTT 831 Fas 164 GCUUAUGGCAGMUUGGCCAT 382 GGCCAAUUCUGCCAUAAGCTT 832 Fas 37 CGAUAAUCUAGCAACAGACGT 383 GUCUGUUGCUAGAUUAUCGTT 833 Fas 116 UCUCAACUGUAGUAACAGUCT 384 ACUGUUACUACAGUUGAGATT 834 Fas 32 AUCUAGCAACAGACGUAAGAA 385 CUUACGUCUGUUGCUAGAUTT 835 Fas 64 AGUCACUUGGGCAUUAACACT 386 UGUUAAUGCCCAAGUGACUTT 836 Fas 167 AGGGCUUAUGGCAGAAUUGGC 387 CAAUUCUGCCAUAAGCCCUTT 837 Fas 120 UGAGUCUCAACUGUAGUAACA 388 UUACUACAGUUGAGACUCATT 838 Fas 125 AGUUCUGAGUCUCAACUGUAG 389 ACAGUUGAGACUCAGAACUTT 839 Fas 43 UUUGGACGAUAAUCUAGCAAC 390 UGCUAGAUUAUCGUCCAAATT 840 Fas 94 CCUCAAUUCCAAUCCCUUGGA 391 CAAGGGAUUGGAAUUGAGGTT 841 Fas 159 UGGCAGAAUUGGCCAUCAUGA 392 AUGAUGGCCAAUUCUGCCATT 842 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: Fas 110 CUGUAGUAACAGUCUUCCUCA 393 AGGAAGACUGUUACUACAGTT 843 Fas 31 UCUAGCAACAGACGUAAGAAC 394 UCUUACGUCUGUUGCUAGATT 844 Fas 38 ACGAUAAUCUAGCAACAGACG 395 UCUGUUGCUAGAUUAUCGUTT 845 Fas 118 AGUCUCAACUGUAGUAACAGT 396 UGUUACUACAGUUGAGACUTT 846 Fas 169 ACAGGGCUUAUGGCAGAAUTG 397 AUUCUGCCAUAAGCCCUGUTT 847 Fas 33 AAUCUAGCAACAGACGUAAGA 398 UUACGUCUGUUGCUAGAUUTT 848 Fas 163 CUUAUGGCAGAAUUGGCCATC 399 UGGCCAAUUCUGCCAUAAGTT 849 Fas 233 AGGGCACGCAGUCUGGUUCAT 400 GAACCAGACUGCGUGCCCUTT 850 IGF2R 6340 UUUGUCACCUAUGACACCCAG 401 GGGUGUCAUAGGUGACAAATT 851 IGF2R 2936 UUAUAGAGCAAGCCUGGUCTG 402 GACCAGGCUUGCUCUAUAATT 852 IGF2R 1331 UCUGAUUGUGGUAUCUUCCTG 403 GGAAGAUACCACAAUCAGATT 853 IGF2R 4491 UAUUUCAGGACAAUUAUGCCA 404 GCAUAAUUGUCCUGAAAUATT 854 IGF2R 2562 UUAAUGUAGUAUUUCCUCCAC 405 GGAGGAAAUACUACAUUAATT 855 IGF2R 1456 UUUCCCAUCGUUACCUGCGGT 406 CGCAGGUAACGAUGGGAAATT 856 IGF2R 2253 UAGUUCAGUUGGAUCAUCCCA 407 GGAUGAUCCAACUGAACUATT 857 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de siA N ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: IGF2R 3570 UUGCCUUCUGACACUAAGCAA 408 GCUUAGUGUCAGAAGGCAATT 858 IGF2R 2274 UUAUAGGGUGUGCCGCCUCTG 409 GAGGCGGCACACCCUAUAATT 859 IGF2R 1197 UUUCCAUCUGAAAUAUAGGAT 410 CCUAUAUUUCAGAUGGAAATT 860 IGF2R 897 UUGCGCACCAGCUUCAGUCCG 411 GACUGAAGCUGGUGCGCAATT 861 IGF2R 5205 UUGAUGUAGAAAUCAGGGUTG 412 ACCCUGAUUUCUACAUCAATT 862 IGF2R 8904 UUCUCAGCAAUAGAACACCAG 413 GGUGUUCUAUUGCUGAGAATT 863 IGF2R 8604 UAAGGCUUCUUAUAGGUCGAA 414 CGACCUAUAAGAAGCCUUATT 864 IGF2R 3629 UCAAAGAUCCAUUCGCCGCGG 415 GCGGCGAAUGGAUCUUUGATT 865 IGF2R 4344 UUGAUGAGGUAGUGCUCCGGG 416 CGGAGCACUACCUCAUCAATT 866 IGF2R 1419 UUUAUGACGCUCAUCCGCUGA 417 AGCGGAUGAGCGUCAUAAATT 867 IGF2R 7185 UAUUUGUAGGACACGUUGGAA 418 CCAACGUGUCCUACAAAUATT 868 IGF2R 4447 UACCCUGCCGAGGUUCACGGG 419 CGUGAACCUCGGCAGGGUATT 869 IGF2R 3706 UAUCUGAGCACACUCAAACGT 420 GUUUGAGUGUGCUCAGAUATT 870 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de sLARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: IGF2R 6422 UCUUUGUACAGGUCAAUUCTA 421 GAAUUGACCUGUACAAAGATT 871 IGF2R 1306 UUUGACUUGAGAGGUAUCGCT 422 CGAUACCUCUCAAGUCAAATT 872 IGF2R 6129 UUGUGUUUCUGGACGAAUUTG 423 AAUUCGUCCAGAAACACAATT 873 IGF2R 5105 UAGAGCUUCCAUUCCUCACGG 424 GUGAGGAAUGGAAGCUCUATT 874 IGF2R 4572 UUCACUUGGCUCUCGCUGCAG 425 GCAGCGAGAGCCAAGUGAATT 875 IGF2R 5308 UACCCGGCCGAUAUCUAUGGG 426 CAUAGAUAUCGGCCGGGUATT 876 IGF2R 3153 UUCUCAAUUCCGACUGGCCTT 427 GGCCAGUCGGAAUUGAGAATT 877 IGF2R 9029 UAUUACAGUAAAGUUGAUUGA 428 AAUCAACUUUACUGUAAUATT 878 IGF2R 1530 UUAACACAGGCGUAUUCCGTG 429 CGGAAUACGCCUGUGUUAATT 879 IGF2R 8364 AAAUGUGCUCUGUACGCCCAG 430 GGGCGUACAGAGCACAUUUTT 880 IGF2R 5400 UAGUUGAAAUGCUUGUCCGCT 431 CGGACAAGCAUUUCAACUATT 881 IGF2R 6702 UUGGCUCCAGAGCACGCCGGG 432 CGGCGUGCUCUGGAGCCAATT 882 IGF2R 8479 UUCUCUGACACCUCAACUCCA 433 GAGUUGAGGUGUCAGAGMTT 883 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guía de sLARN ID Complemento de sLARN ID Objetivo NO: NO: IGF2R 4723 UAAGGAGCUCAGAUCAAACAG 434 GUUUGAUCUGAGCUCCUUATT 884 IGF2R 4237 UGAACAUUCAGUCAGAUCGAA 435 CGAUCUGACUGAAUGUUCATT 885 IGF2R 6203 UAUAGUACGAGACUCCGUUGT 436 AACGGAGUCUCGUACUAUATT 886 IGF2R 753 AUGAAUAGAGAAGUGUCCGGA 437 CGGACACUUCUCUAUUCAUTT 887 IGF2R 8554 AUAAGCACAGUAAAGGUGGTA 438 CCACCUUUACUGUGCUUAUTT 888 IGF2R 5462 UUAACAGCUUAGGCGUUCCCA 439 GGAACGCCUAAGCUGUUAATT 889 IGF2R 1460 UUCCUUUCCCAUCGUUACCTG 440 GGUAACGAUGGGAAAGGAATT 890 IGF2R 5206 AUUGAUGUAGAAAUCAGGGTT 441 CCCUGAUUUCUACAUCAAUTT 891 IGF2R 2559 AUGUAGUAUUUCCUCCACGTG 442 CGUGGAGGAAAUACUACAUTT 892 IGF2R 8605 UUAAGGCUUCUUAUAGGUCGA 443 GACCUAUAAGAAGCCUUAATT 893 IGF2R 4345 AUUGAUGAGGUAGUGCUCCGG 444 GGAGCACUACCUCAUCAAUTT 894 IGF2R 1187 AAAUAUAGGAUGAACCUCCGC 445 GGAGGUUCAUCCUAUAUUUTT 895 IGF2R 1184 UAUAGGAUGAACCUCCGCUCT 446 AGCGGAGGUUCAUCCUAUATT 896 Nombre SEQ SEQ de pos Secuencia de guia de siARN ID Complemento de siARN ID Objetivo NO: NO: IGF2R 7190 UUGAGUAUUUGUAGGACACGT 447 GUGUCCUACAAAUACUCAATT 897 IGF2R 7182 UUGUAGGACACGUUGGAACTT 448 GUUCCAACGUGUCCUACAATT 898 IGF2R 2941 AUCCCUUAUAGAGCAAGCCTG 449 GGCUUGCUCUAUAAGGGAUTT 899 IGF2R 3693 UCAAACGUGAUCCUGGUGGAG 450 CCACCAGGAUCACGUUUGATT 900 Modificación Química de Nucleótidos de Cadena de ARN El siARN de acuerdo con la i nvención puede comprender cuando menos un nucleótido modificado en al menos una de las cadenas de ARN . En cualquier otra parte de la presente se dan a conocer un número de nucleótidos modificados potenciales. Las modificaciones útiles y las combinaciones de modificaciones para utilizarse de acuerdo con la invención se muestran en la Tabla 2 : Tabla 2: Modificaciones Químicas y Arq uitectura de Secuencias Nombre de # Formato Modificación 1 PS ADN o/h NNNNNNNNNNNNNNNNNNNsnsn nsnsNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 2 PS Completo NsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsN NsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsN Nombre de # Formato Modificación 3 ARN o/h NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 4 Extremos Romos NNNNNNNNNNNNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNN 5 2'-OMe o/h NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNPNP NPNPNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 6 2'-OMe/2'F NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNPNP NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN 7 LNA (3-7 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNsnsn incorporaciones nsnsNNNNNNNNNNNNNNNNNNN en la región ds) N = cualquier nucleótido de ARN no modificado, n = Nucleótido de ADN no modificado. N- = Nucleótido de ARN modificado. s = Identifica el enlace internucleósidos de fosforotioato. o/h = Colgadura. Las siguientes modificaciones agregadas a la posición 3' del término 3' de las cadenas de siARN, algunas veces referidas como "tapa de extremo 3"', también son reconocidas como modalidades útiles de la invención, y se pueden utilizar con cualquiera de los siARNs de acuerdo con la invención: Los compuestos específicos con actividad de acuerdo con la invención incluyen los siguientes, mostrados en la Tabla 3: Tabla 3: Secuencias y Químicas de siARN utilizadas en los Ejem plos SEQ Secuencia (N: ARN; dN: ADN; n: ARN de 2'- Nombre Cadena ID moe; s: fosforotioato) NO: Cadena de 901 siARN de pG13 guía UCG AAG UAC UCA GCG UAA GdTdT Cadena de 902 complemento CUU ACG CUG AGU ACU UCG AdTdT SEQ Secuencia (N: ARN; dN: ADN; n: ARN de 2'- Nombre Cadena ID moe; s: fosforotioato) NO: siARN de pG13 MOE Cadena de 903 o/h guía CUU ACG CUG AGU ACU UCG Atst Cadena de 904 complemento UCG AAG UAC UCA GCG UAA Gtst Cadena de 905 siARN de pG13-C3 guía UCG AAG UAC UCA GCG UAA G-C3 Cadena de 906 complemento CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-C3 siARN de pG13-C3- Cadena de 907 MOE guía UCG AAG UAC UCA GCG UAa g-C3 Cadena de 908 complemento CUU ACG CUG AGU ACU UCg a-C3 Cadena de 909 siARN 1 de VEGFR2 guía UUG AGG UUU GAA AUC GAC CdCdT Cadena de 910 complemento GGU CGA UUU CAA ACC UCA AdTdT Cadena de 911 SEQ Secuencia (N: ARN; dN: ADN; n: ARN de 2'- Nombre Cadena ID moe; s: fosforotioato) NO: s¡ARN2 de VEGFR2 guía UAA UUU GUU CCU GUC UUC CdAdG Cadena de 912 complemento GGA AGA CAG GAA CAA AUU AdTdT Cadena de 913 Control de siRNA guía ACG UGA CAC GUU CGG AGA AdTdT Cadena de 914 complemento UUC UCC GAA CGU GUC ACG UdTdT SÍARN1 de VEGFR2- Cadena de 915 C3 guía UUG AGG UUU GAA AUC GAC C-C3 Cadena de 916 complemento GGU CGA UUU CAA ACC UCA A-C3 s¡ARN2 de VEGFR2- Cadena de 917 C3 guía UAA UUU GUU CCU GUC UUC C-C3 Cadena de GGA AGA CAG GAA CAA AUU A-C3 918 complemento Cadena de 919 SEQ Secuencia (N: ARN; dN: ADN; n: ARN de 2'- Nombre Cadena ID moe; s: fosforotioato) NO: control de C3-siARN guía ACG UGA CAC GUU CGG AGA A-C3 Cadena de 920 complemento UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-C3 SÍARN1 de VEGFR2- Cadena de 921 C3-MOE guía UUG AGG UUU GAA AUC GAc C-C3 Cadena de 922 complemento GGU CGA UUU CAA ACC UCa a-C3 SÍARN2 de VEGFR2- Cadena de 923 C3-MOE guía UAA UUU GUU CCU GUC UUc c-C3 Cadena de 924 complemento GGA AGA CAG GAA CAA AUu a-C3 SÍARN1 de T¡e2-C3- Cadena de UUC UUC UUU AAU UAA CAc C-C3 MOE guía 925 Cadena de 926 complemento GGU GUU AAU UAA AGA AGa a-C3 SÍARN2 de T¡e2-C3- Cadena de 927 SEQ Secuencia (N: ARN; dN: ADN; n: ARN de 2'- Nombre Cadena ID moe; s: fosforotioato) NO: MOE guía UCU GAG UUU GUA AAU AUc g-C3 Cadena de 928 complemento CGA UAU UUA CAA ACU CAg a-C3 control de siA N de Cadena de 929 C3-MOE guía ACG UGA CAC GUU CGG AGa a-C3 Cadena de 930 complemento UUC UCC GAA CGU GUC ACg t-C3 Ejemplos : Los siguientes Ejemplos ilustran aspectos de la invención , y no pretenden limitar las modalidades incluidas en las reivindicaciones mencionadas más adelante. La sección de resultados y discusión que se encuentra además más adelante, se refiere a los experimentos conducidos de acuerdo con los siguientes protocolos, y empleando los siguientes materiales. Se considera que los materiales y protocolos que no se describan de una manera específica, están rutinariamente disponibles para los expertos en este campo. Ejemplo 1 Preparación de siARNs Se sintetizaron derivados de siARN de una sola cadena mediante la tecnolog ía estándar de fosforamidita 2'-0-TOM , y se purificaron mediante Placas de Extracción HLB Oasis® (Waters). Se mezclaron siARNs de cadena en sentido y anti-sentido en el regulador de hibridación (acetato de potasio 1 00 mM , acetato de magnesio 2 mM , Hepes 30 mM , pH de 7.6), se desnaturalizaron por calor a 90°C durante 3 minutos, y se templaron a 37°C durante 60 minutos. Las soluciones de suministro 1 00 µ ? de los dúplexes de siARN se almacenaron a -20°C. Ejemplo 2 Incubación en suero y análisis mediante IE-HPLC (LC-MS) En un ensayo de suero estándar, se mezclaron 6 microlitros de 20 µ? de cada siARN con 54 microlitros de suero o CSF , y se calentaron a 37°C en una incubadora. Se cargaron 50 microlitros de la mezcla enfriada sobre una columna analítica DNA-pac PA-1 00 (Díonex), y se analizaron con un gradiente de NaCI (de 0 a 0.6 M en 30 minutos), en una solución de 1 : 1 0 de acetonitrilo:regulador (acetato de sodio 20mM , acetato de magnesio 1 mM , pH de 6.5). Para el análisis de LC-MS , se mezclaron 1 00 microlitros (20 µ? o 50 µ?) de cada siARN con 900 microlitros de suero bovino fetal estéril (GI BCO), se incubaron a 37°C, y se separaron mediante HPLC como se indica anteriormente (excepto del gradiente de NaCI : 0M a 0.36M en 9 minutos/0.36M a 0.6M en 1 2 minutos). Los productos de degradación se desalaron sobre columnas NAP, y se analizaron mediante LC-EST-MS.

Ejemplo 3 Incubación en ácido gástrico Para preparar un ensayo de ácido gástrico estándar, se obtuvieron los ratones FVB y C57BL6, con un peso de 18 a 20 gramos (de 6 a 8 semanas de edad) en Charles River Laboratories (Les Oncins, Francia). Los animales se sacrificaron utilizando C02, y luego se recuperaron rápidamente los estómagos. Se recolectó y se agrupó el fluido gástrico, así como el contenido del estómago, y luego se cargó en dispositivos de filtro centrífugos (Ultrafree MC, Millipores). Las unidades de filtro se centrifugaron durante 10 minutos de acuerdo con las recomendaciones del fabricante. El filtrado, correspondiente al fluido gástrico de ratón, se recuperó, se puso en alícuotas, y se congeló antes de los experimentos adicionales. Para cada ensayo, se diluyeron soluciones de 20 µ? de siARN en 9 veces el volumen de ácido gástrico, como se describe anteriormente, y se incubaron a 37°C durante 0, 5, 10, 15, 30, 60, y 120 minutos. Ejemplo 4 Incubación en lavado intestinal Para preparar un ensayo de lavado intestinal estándar, la rata Wistar macho se puso en ayunas, y se anestesió con isoflurano. Se obtuvo el lavado intestinal mediante perfusión in situ del intestino delgado (duodeno, yeyuno, íleo) con 10 mililitros de suero (0.5 mililitros/minuto), seguidos por 20 mililitros de agua (1 mililitro/minuto). La salida recolectada se centrifugó (3,000 x g, 15 minutos, 22°C), y el sobrenadante se pasó a través de un filtro de 1.2micras, y se almacenó a -20°C. Para cada ensayo, las soluciones de siARN 20 µ? se diluyeron en 9 veces el volumen de lavado intestinal, y se incubaron a 37°C durante 0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Ejemplo 5 Incubación en microsomas de hígado de ratón En un ensayo de microsomas de hígado estándar, a 10 microlitros de una solución 250 µ? de siARN se les agregaron 25 microlitros de microsomas de hígado de ratón (GEntest 452701, Carga 11) en 20 miligramos de proteína/mililitro, 365 microlitros de regulador de fosfato 100 mM (pH de 7.4), 50 microlitros de co-factor UDPGA(24 mM en agua), 50 microlitros de NADPH. La incubación se apagó mediante congelación a t=0 minutos y a t=60 minutos. Ejemplo 6 Incubación en el sobrenadante S12 de rata Para un ensayo de sobrenadante S12 de rata estándar, se agregaron 10 microlitros de una solución 250 µ? de siARN a 17 microlitros de S12 de hígado de rata, en 29.9 miligramos de proteína/mililitro, 373 microlitros de regulador de fosfato 100 mM (pH de 7.4), 50 microlitros de co-factor UDPGA (24mM en agua), y 50 microlitros de NADPH. La incubación se apagó mediante congelación a t=0 minutos y a t=60 minutos.

Ejemplo 7 Incubación en suero de ratón Para una incubación estándar en suero de ratón, se diluyeron soluciones de siARN 20 µ? en 9 veces el volumen de suero de murino (ratón sin pelo Harían), y se incubaron a 37°C durante 0, 15, 30, 60, 180, y 360 minutos. Ejemplo 8 Ensayo de estabilidad en electroforesis de gel Se tomó una alícuota de 10 microlitros de solución de incubación inmediatamente después de la agitación y de la congelación por choque sobre hielo seco; las mezclas se incubaron a 37°C, y las alícuotas se congelaron por choque en diferentes puntos del tiempo. Las alícuotas se descongelaron en 30 microlitros (15 microlitros, respectivamente) de Regulador de Carga (Elchrom Se, Cham, Suiza), y se separaron sobre geles SF50 (Elchrom Se, Cham, Suiza) a 120 V, 8°C durante 240 minutos. Las bandas se tiñeron con Oro SYBR (Molecular Probes), y se tomaron imágenes con un sistema BIORAD ChemiDocMR XRS. Ejemplo 9 Cultivo celular La línea celular endotelial inmortalizada de ratón MS1 (ATCC CRL-2279) se cultivó en DMEM alto en glucosa (4.5 gramos/litro) complementado con L-glutamina y suero fetal de becerro inactivado por calor al 10 por ciento (AMIMED, Suiza) en platos de cultivo recubiertos con gelatina al 1.5por ciento. Las células MS1 se transfectaron en un formato de 24 pozos con siARN, utilizando HiPerfect (QIAGEN) de acuerdo con el procedimiento del fabricante (tetraplicado, la concentración final de siARN fue de 10 nM o como se indica). Ejemplo 10 Análisis FACS Las células MS1 no transfectadas y transfectadas con siARN se analizaron mediante FACS para determinar los niveles de VEGFR2. Dicho de una manera breve, las células se tripsinizaron a partir de los pozos duplicados o triplicados, se reservaron para cada una de las condiciones, luego se lavaron dos veces con suero regulado con fosfato + suero fetal de becerro al 10 por ciento, y se incubaron durante 10 minutos sobre hielo antes de la adición del anticuerpo anti-VEGFR2 conjugado con RPE (1 microgramo/106 células; Avas 12a1, BD Pharmingen). Se utilizó el isotipo lgG2a marcado con RPE como el control de FACS (BD Pharmingen). La adquisición y análisis FACS se llevaron a cabo en un FACScalibur utilizando el software Cell Quest (Becton Dickinson). Ejemplo 11 Estudios con animales Los ratones FVB hembras (de 6 a 8 semanas de edad) se obtuvieron en Charles River Laboratories (Les Oncins, Francia). Los ratones se identificaron mediante marcas en las orejas, y se guardaron en grupos (6 animales por jaula) bajo condiciones normales, y se observaron diariamente. Se utilizaron 6 ratones por grupo de tratamiento, y todos los experimentos con animales se llevaron a cabo en estricta adherencia a la ley suiza para la protección de los animales. El modelo de la cámara de referencia se ha descrito en las publicaciones (por ejemplo, Wood J . Bold G , Buchdunger E . , y colaboradores, PTK787/ZK 222584, a novel and potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, impairs vascular endothelial growth factor-induced responses and tumor growth after oral administration . Cáncer Res. 2000;60:21 78-89). En breve, las cámaras de tejido poroso hechas de perfluoro-alcoxi-Teflón (Teflón®-PFA, 21 milímetros x 8 mil ímetros de diámetro, volumen de550 microlitros), se llenaron con ágar al 0.8 por ciento (BBL® Número 1 1 849, Becton Dickinson , Meylan , Francia), y 20 Unidades/mililitro de heparina (Novo Nordisk A/S , Bagsvaerd , Dinamarca), complementados con o sin 3 microgramos/mililitro de VEGF humano recombinante y siARNs, como se indican . Las soluciones se mantuvieron a 42°C antes del procedimiento de llenado. Los ratones se anestesiaron utilizando inhalación de isofluorano al 3 por ciento (Forene®, Abbott AG , Cham , Suiza). Para el implante subcutáneo, se hizo una pequeña incisión en la piel , en la base de la cola, para permitir la inserción de un trocar de implante. La cámara se implantó bajo condiciones asépticas a través de la pequeña incisión sobre el lomo del animal . La incisión de la piel se cerró mediante sujetadores de heridas (Autoclip 9 mm Clay Adams). Dependiendo de la dosis requerida , los siARNs se diluyeron en una solución salina al 0.9 por ciento de "grado de calidad inyectable" , y luego se suministraron a los animales ya sea intraperitonealmente (200 microlitros/dosis) o bien oral mente mediante intubación ( 1 00 microlitros/dosis). Los ratones estuvieron recibiendo la primera dosis de 2 a 4 horas antes de implantar las cámaras; luego se trataron diariamente durante 2 d ías. Si no se indica de otra manera, los ratones se sacrificaron 3 d ías después del implante, se cortaron las cámaras, y se removió cuidadosamente el tejido fibroso vascularizado formado alrededor de cada implante. Se utilizó el peso corporal para monitorear la condición general de los ratones. El análisis estad ístico se hizo utilizando ANOVA de una vía , seguido por la prueba de Dunnett. Ejemplo 12 Modelo de xenoinjerto de melanoma B 16 Se utilizó el modelo de melanoma de murino B 1 6/BL6 singenéico, previamente identificado por responder a la terapia anti-angiogénica (por ejemplo, LaMontagne K, Littlewood-Evans A, Schnell C, O'Reilly T, Wyder L, Sánchez T, Probst B , Butler J , Wood A, Liau G , Billy E , Theuer A, Hla T, Wood J . Antagonism of sphingosine-1 -phosphate receptors by FTY720 inhibits angiogenesis and tumor vascularization . Cáncer Res. 1 de enero de 2006; 66( 1 ): 221 -31 ), para evaluar la actividad anti-tumoral de los siARNs estándares o modificados. Se inyectaron células tumorales ( 1 microlitro, 5 x 1 04/microlitro) intradérmicamente en la pinna dorsal de ambas orejas de los ratones C57BL/6 hembras singenéicos. Las mediciones del área tumoral primaria (mil ímetros cuadrados) se llevaron a cabo en los días 7 , 14, y 21 después de la inoculación de las células tumorales, utilizando el software de análisis de imágenes asistido por computadora (sistema de toma de imágenes KS-400 3.0, Zeiss), y un macro específicamente diseñado. A partir de los d ías 7 a 21 , los ratones estuvieron recibiendo los siARNs diluidos en solución salina al 0.9 por ciento de "grado de calidad inyectable", ya sea intraperitonealmente (200 microlitros/dosis), o bien oralmente mediante intubación ( 100 microlitros/dosis) una vez al d ía . Los ratones se sacrificaron en el d ía 21 , y se pesaron las metástasis de nodo linfáticos craneales, y luego se congelaron. En estos resultados, las secuencias reales de siARN y las químicas empleadas se pueden determinar haciendo referencia a la Tabla 3. Los siARNs de tipo si lvestre se degradan en el suero de ratón desde ambos extremos 3' La degradación de oligonucleótidos mediante las nucleasas es predominantemente 3'-exonucleol ítica . La modificación de los oligonucleótidos anti-sentido en sus términos mediante la introducción de residuos aromáticos o lipofílicos, retarda su degradación nucleolítica1 7. Con el fin de verificar si esta senda metabólica también sería dominante para el siARN , incubamos a 37°C un siARN no modificado (siARN de tipo silvestre) en suero de ratón durante hasta 3 horas. La secuencia de siARN no modificado empleada fue la del s¡ARN-pG 1 3 (véase la Tabla 3). Las mezclas se analizaron con H PLC de intercambio de aniones fuerte a t=0 minutos, t=30 minutos, t= 1 80 minutos. Como se muestra en las Figuras 1 a, 1 b, y 1 c, a t=30 minutos, se observó un pico bien definido correspondiente al siARN de extremos romos. Para el t=3 horas, se observa una degradación sustancial . Las Figuras 1 d y 1 e ilustran los metabolitos identificados mediante el análisis de HPLC-ESI-MS. Este análisis reveló la presencia de varios metabolitos correspondientes a la pérdida de las colgaduras 3' y del ribonucleótido del primer emparejamiento de bases 3'-terminal sobre ambas cadenas. También se observó la digestión del ribonucleótido 5'-terminal de la cadena gu ía. La Figura 1 sugiere la senda de degradación de los siARNs no modificados en suero. Primero se digieren las colgaduras de ADN , posiblemente mediante las 3'-exonucleasas. En la LC-MS, también se detectaron metabolitos adicionales, que corresponden a la pérdida del ribonucleótido 3' del primer emparejamiento de bases de ambas cadenas, y también el ribonucleótido de emparejamiento de bases 5' de la cadena gu ía. Los siARNs 3'-modif icados son estables a través del tracto gastroi ntesti nal Se sintetizaron los siARNs con las colgaduras de los 2'-metox¡-etil-ribonucleótidos (siARN de MOE o/h), los siARNs de extremos romos 3'-tapados con una fracción de hidroxi-propoxi-fosfodiéster (siARN de C3), y los siARNs 3'-tapados con hidroxi-propoxi- fosfodiéster, en donde el nucleótido de los dos primeros emparejamientos de bases en el extremo 3' de cada cadena se modificó mediante los residuos de los 2'-metoxi-metil-ribonucleótidos (siARN de C3- OE). Estos compuestos se ilustran esquemáticamente en la Figura 2. Los primeros siARNs se incubaron en ácido gástrico de ratón durante 2 horas (Figura 3). No se observó degradación algunas en los casos del siARN de C3 y del siARN de C3-MOE , mientras que se observó degradación del siARN de tipo silvestre después de 30 minutos. La estabilidad en el fluido intestinal obtenido del lavado intestinal de las ratas reveló una degradación casi completa del siARN de tipo silvestre después de 1 5 minutos, mientras que se observó el compuesto progenitor en siARN de MOE o/h , siARN de C3, y siARN de C3-MOE durante 60 minutos ( Figura 4). Se evaluó la estabilidad en el hígado utilizando un ensayo de microsomas de h ígado y un ensayo S 1 2 (representativo de la actividad enzimática citosólica del hígado). Los resultados se muestran en la Figura 5. En ambos casos, no se observó degradación alguna después de 60 minutos de incubación. Finalmente, se probaron los siARNs en suero de ratón mediante incubación a 2 micromolar durante hasta 6 horas a 37°C (los resultados se encuentran en la Figura 6). La estabilidad del compuesto progenitor fue seguida mediante electroforesis de gel . En los casos de los siARNs modificados (siARN de C3, siARN de 03- MOE, o siARN de MOE o/h), no se observó una degradación significativa, como en el siARN de tipo silvestre. Este estudio indica que los siARNs de tipo silvestre (no modificados) son metabolizados en el ácido gástrico de ratón y en el suero de ratón. En el caso de los siARNs modificados en los extremos 3', no se observó degradación alguna en el tracto gastrointestinal. Por consiguiente, es probable que los siARNs modificados tengan una biodisponibilidad oral más alta que los siARNs de tipo silvestre, Los siARNs 3'-modif icados sistémicamente suministrados son más activos en un modelo de angiogénesis inducida por factor de crecimiento in wVo18. Primeramente, se verificó la capacidad de los siARNs modificados (siARN de C3 y siARN de C3-MOE) para sub-regular un gen objetivo in cellulo, midiendo el nivel superficial de VEGFR2 de las células MS1 transfectadas con siARNs anti-VEGFR2. Las reservas de dos siARNs anti-VEGFR2 como los siARNs de tipo silvestre, siARNs de C3, y siARNs de C3-MOE se administraron intraperitonealmente. Los resultados se muestran en la Figura 7. Los siARNs de tipo silvestre reservados redujeron de una manera significativa la vascularización inducida por VEGF en la dosis más alta de 25 microgramos por ratón al día. Se observó el mismo nivel de inhibición a una dosis cinco veces más baja con el siARN de C3.

En el caso de la reserva de siARNs de C3-MOE, se observó una reducción significativa del peso del tejido vascularizado en todas las dosis probadas, incluyendo la más baja de 0.2 microgramos por ratón al día. Las Figuras 8a y 8b muestran que, cuando se dan intraperitonealmente, ambos siARNs de C3 y de C3-MOE de VEGFR2 fueron activos en una dosis debajo de 1 microgramo por ratón al d ía .

Prueba in vivo de siARN de C3-MOE anti-VEGFR2 dado intraperitonealmente (i .p. ) en un modelo de ratón de tumor de melanoma de homoinjerto B1 6. La Figura 9a muestra que el tratamiento intraperitoneal con el siARN de VEGFR-C3 MOE modificado, reduce de una manera significativa el desarrollo de tumor. La Figura 9b también muestra que la inyección intraperitoneal del siARN de VEGFR2-C3-MOE en 20 microgramos por ratón , da como resultado una inhibición significativa del crecimiento tumoral . Suministro oral de siARN para el tratamiento de trastornos angiogén icos La Figura 10 muestra que, dado oralmente, en una dosis de 20 microgramos por ratón al d ía, el si-ARN 1 de VEGFR2-C3-MOE redujo el peso de la vascularización hasta el nivel basal (por ejemplo, peso sin inducción con factor de crecimiento). Las secuencias del siARN reales utilizadas son referidas en la Tabla 3. También se probaron los siARNs de C3-MOE anti-Ti2 en el modelo de angiogénesis inducida por factor de crecimiento bajo suministro tanto intraperitoneal como oral . Las Figuras 1 1 a y 1 1 b muestran que, dados oralmente, ambos siARNs de C3-MOE dirigidos a Tie2, fueron activos en 20 microgramos por ratón al d ía. Las secuencias de siARN reales utilizadas pueden ser determinadas haciendo referencia a la Tabla 3. Los datos muestran que los siARNs modificados en el extremo 3' con o sin modificaciones internas adicionales, son capaces de demostrar el efecto terapéutico en dosis razonables después de su administración oral . REFERENCIAS 1 . a) Y. Tomari y colaboradores, Genes and Development 19 (2005), 51 7; b) P. Shankar y colaboradores, JAMA 1 1 (2005), 1 367; c) Y. Dorsett y colaboradores, Nature Reviews 3 (2004), 31 8. 2. a) P . D. Zamore y colaboradores, Cell 101 , (2000), 25 ; b) S . M . Hammond y colaboradores, Nature 404 (2000), 293. 3. a) G . Meister y colaboradores, Molecular Cell 15 (2004), 1 85. 4. S. M . Elbashir y colaboradores, Genes Dev. 1 5 (2001 ), 1 88. 5. S. J. Reich y colaboradores, Molecular Vision 9 (2003), 21 0. 6. a) Dorn y colaboradores, Nucleic Acids Research 32 (2004), e49; b) D. R. Thakker y colaboradores, PNAS 101 (2004), 1 7270; c) D. R. Thakker y colaboradores, Molecular Psychiatry 10 (2005), 71 4. 7. V. Bitko y colaboradores, Nature Medicine 1 1 (2005), 50. 8. E. Song y colaboradores, Nature Medicine 9 (2003), 347. 9. D. A. Braasch y colaboradores, Biochemistry 42 (2003), 10. Harborth, Antisense Nucleic Acid Drug Devt, 2003. 11. A. H. S. Hall y colaboradores, Nucleic Acids Research 32 (2004) , 5991. 12. M. Amarzguioui y colaboradores, Nucleic Acids Research 31 (2003), 589. 13. F. Czauderna y colaboradores, Nucleic Acids Research 31 (2003), 2705. 14. T. Prakash y colaboradores, Journal of Medicinal Chemistry 48 (2005), 4247. 15. J. Elmen y colaboradores, Nucleic Acids Research 33 (2005) , 439. 16. A. S. Boutorin, L. V. Guskova, E. M. Ivanova, N. D. Kobetz, V. F. Zafytova, A. S. Ryte, L. V. Yurchenko Y V. V. Vlassov FEBS Lett.254 (1989), página 129. 17. J. Wood y colaboradores, Cáncer Research 60 (2000), 2178. 18. K. La ontagne y colaboradores, Cáncer Res. 66 (2006), 221.

Claims

REIVINDICACION ES 1 . Un ácido ribonucleico de interferencia corto (siARN ) para administración oral , comprendiendo este siARN dos cadenas de ARN separadas que son complementarias una con la otra sobre cuando menos 1 5 nucleótidos, en donde cada cadena es de 49 nucleótidos o menos, y en donde cuando menos una de cuyas cadenas contiene al menos una modificación química . 2. El siARN de acuerdo con la reivindicación 1 , el cual comprende cuando menos un nucleótido modificado. 3. El siARN de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2 , en donde este siARN comprende cuando menos una tapa de extremo 3' . 4. El siARN de acuerdo con la reivindicación 2 ó 3, en donde el nucleótido modificado mencionado se selecciona de entre 2'-alcoxi-ribonucleótido, 2'-alcoxi-alcoxi-ri bonucleótido, un ribonucleótido de ácido nucleico trabado (LNA), 2'-fluoro-ribo nucleótido, morfolino-nucleótido. 5. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2 a 4, en donde el nucleótido modificado mencionado se selecciona de entre los nucleótidos que tiene un enlace internucleósido modificado seleccionado de entre los enlaces de fosforotioato , fosforoditioato, fosforamidato, boranofosfonoato , y amida . 6. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde las dos cadenas de ARN mencionadas son completamente complementarias una con la otra. 7. El siARN de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 6, el cual comprende una colgadura de 1 a 6 nucleótidos sobre cuando menos uno del extremo 5' o el extremo 3'. 8. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 3 a 7, en donde la cuando menos una tapa 3', cuando está presente, es una fracción química conjugada con el extremo 3' por medio del átomo de carbono 3', y se selecciona de entre los compuestos de la Fórmula I: 3' O— P-R, II 2 x [Fórmula I] en donde: X es O ó S, F y R2 son independientemente OH, NH2, SH, alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo, arito, alquil-arilo, aril-alquilo pueden estar sustituidos por heteroátomos y grupos funcionales adicionales, de preferencia un heteroátomo seleccionado a partir del grupo de N, O, ó S, o un grupo funcional seleccionado a partir del grupo de OH, NH2, SH, ácido carboxílico, o éster; o Ri y R2 pueden ser de la Fórmula Y-Z, en donde Y es O, N, S; y Z es H, alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo, en donde alquilo, arilo, alquil-arilo, aril-alquilo pueden estar sustituidos por heteroátomos adicionales, de preferencia un heteroátomo seleccionado a partir del grupo de N, O, ó S. 9. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde cuando menos una cadena es complementaria sobre cuando menos 15 nucleótidos con el ARNm o el pre-ARNm de VEGFR-1 , VEGFR-2, VEGFR3, Tie2, bFGFR, IL8RA, IL8RB, Fas, ó IGF2R. 10. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde cuando menos una cadena comprende una secuencia seleccionada a partir de las SEQ ID NOs:1-900. 11. El siARN seleccionado a partir del grupo que consiste en las SEQ ID NOs:901-930. 12. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el cual tiene estabilidad en un ensayo de ácido gástrico estándar, que es mayor que la de un siARN no modificado con la misma secuencia de nucleótidos. 13. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el cual tiene estabilidad en un ensayo de ácido gástrico estándar, que es mayor o igual al 50 por ciento después de una exposición de 30 minutos. 14. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el cual tiene estabilidad en un ensayo de suero estándar, que es mayor que la del siARN no modificado. 15. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, el cual tiene estabilidad en un ensayo de suero estándar que es mayor o igual al 50 por ciento después de una exposición de 30minutos. 1 6. El siARN de las reivindicaciones 1 a 1 1 , el cual tiene estabilidad en un ensayo de lavado intestinal estándar que es mayor que la del siARN no modificado. 1 7. El siARN de las reivindicaciones 1 a 1 1 , el cual tiene una mejor biodisponibilidad oral , comparándose con un siARN no modificado de la misma secuencia de nucleótidos. 1 8. Una composición farmacéutica, la cual comprende un siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 7. 1 9. El siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 7, para utilizarse como un medicamento. 20. El uso de un siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 1 7, en la preparación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno angiogénico. 21 . El uso de acuerdo con la reivindicación 20, en donde el gen dirigido por el siARN se expresa en células endoteliales. 22. El uso de acuerdo con la reivindicación 21 , en donde el gen dirigido por el siARN se selecciona a parti r del grupo que consiste e: VEGFR-1 (GenBank Acceso #AF06365); VEG FR-2 (GenBank Acceso #AF063658); VEGFR-3 (GenBank Acceso # (NM_002020); Tie2 (TEK) (GenBank Acceso #NM_000459); bFG FR (GenBank Acceso #M60485); IL8RA (GenBank Acceso #L1 9591 ); IL8RB (GenBank Acceso #L1 9593); Fas (GenBank Acceso #X891 01 ); IGF2R (GenBank Acceso #N M_000876). 23. El uso de un siARN de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, para inhibir un proceso angiogénico in vitro. RESU MEN Un ácido ribonucleico de interferencia corto (siARN ) para administración oral , comprendiendo este siARN dos cadenas de ARN separadas que son complementarias una con la otra sobre cuando menos 1 5 nucleótidos, en donde cada cadena es de 49 nucleótidos o menos, y en donde cuando menos una de cuyas cadenas contiene al menos una modificación qu ímica .