CN101437944B - 口服施用的短干扰核糖核酸（siRNA） - Google Patents

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Abstract

用于口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)，所述siRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的，其中每条链有49个核苷酸或更少的核苷酸，并且其中至少一条链含有至少一个化学修饰。

Description

口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)
背景技术
作为转录后基因沉默(PTGS)而最初发现于植物中的RNA干扰，是由双链RNA(dsRNA)引起的高度保守的机制，并能够下调与dsRNA1同源的基因的转录。该dsRNA首先由Dicer加工成21-23核苷酸的短双链体，其称为短干扰RNA(siRNA)2。合并入RNA诱导的沉默复合体(RISC)后，它们能够通过由Argonaute2(RISC3的组件)在同源区域的中心切割靶mRNA从而介导基因沉默。2001年，Elbashir等人4证实在果蝇以及哺乳细胞中直接引入合成的siRNA将介导RNA干扰基因沉默。从那时起，siRNA介导的基因沉默已成为靶标鉴定和靶标确认研究中强大且广泛使用的分子生物学工具。在动物研究中使用siRNA进行基因沉默已在有限量的动物模型中有所描述。将未修饰的siRNA在眼中局部递送、在中枢神经系统中向鞘内或脑内递送、以及鼻内递送用于抑制呼吸病毒7。未修饰的siRNA的静脉内波浪传播尾静脉注射(intravenous hydrodynamic tail veininjection)也已有所研究。该方法允许快速递送，主要是向肝脏8。很少研究报道过未修饰siRNA的全身施用。Duxbury等人9经静脉将靶向黏着斑激酶的未修饰siRNA施用于原位肿瘤异种移植小鼠模型，并观察肿瘤生长抑制以及对吉西他滨的化学敏感性。Soutscheck等人报道了全身使用高度化学修饰的siRNA用于内源沉默脱脂载脂蛋白B。以50mg/kg的高剂量腹膜内施用大多数抗ApoB siRNA降低了ApoB蛋白质水平和脂蛋白浓度。尽管有这些例子，在体内基于全身递送的siRNA使用仍需要改进以便使该技术可广泛应用于靶标确认或治疗应用。实际上，未修饰的siRNA主要是通过血流中丰富的核酸酶来进行酶消化。为了加强siRNA的药物特性，几个小组研究了这些试剂的化学修饰。而所描述的方法之间大相径庭并且仍未进行全身性研究，这些结果的概述允许确定siRNA对化学修饰的耐受性。几种化学修饰例如硫代磷酸酯类11或boranophosphates12、2’-O-甲基13、2’-O-烯丙基14、2’-甲氧乙基(MOE)和2’-脱氧氟代核苷酸类(2’-deoxyfluoronucleotides)15或锁定核酸(LNA)16已有所研究。这些研究突出显示对修饰的耐受性不仅是化学依赖性的，而且是位置依赖性的。
本发明提供了具有改进的药物特性的最低程度修饰的siRNA。这些最低程度修饰的siRNA是19bp双链RNA，其在每条链的3’-末端经修饰以防止3’-外切核酸酶消化：21-nt siRNA的3’-双脱氧核苷酸突出端已由通用的3’-羟丙基磷酸二酯部分所替代，且每条链的3’-末端前两个碱基配对核苷酸的修饰进一步增强了血清稳定性。经腹膜内或口服施用于成年小鼠后，修饰的siRNA在生长因子诱导的血管发生模型中显示出更高的效力，这与其增加的血清稳定性相关。
发明概述
在一方面，本发明提供了用于口服施用的短干扰核糖核酸(siRNA)，所述siRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的，其中每条链有49个核苷酸或更少，并且其中至少一条链含有至少一个化学修饰。
在一项实施方案中，siRNA包含至少一个修饰的核苷酸。
在另一实施方案中，siRNA包含至少一个3’末端帽。
在另一实施方案中，所述修饰的核酸选自2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸、锁定核酸核糖核苷酸(LNA)、2’-氟代核糖核苷酸、吗啉代核苷酸。
在另一实施方案中，所述修饰的核苷酸选自具有修饰的核苷间键合的核苷酸，所述核苷间键合选自硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、硼烷膦酸酯(boranophosphonoate)和酰胺键合。
在另一实施方案中，所述两条RNA链彼此间是完全互补的。
在另一实施方案中，所述siRNA在5’末端或3’末端中至少一端上包含1至6个核苷酸突出端。
在另一是实施方案中，siRNA含有至少一个3’帽，其为经3’碳连接至3’末端的化学部分，且为选自式I的化合物：
     [式I]
其中
X为O或S
R1和R2独立地为OH、NH2、SH、烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基，其中烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基可由另外的杂原子和官能团取代，优选地由选自N、O或S的杂原子或选自OH、NH2、SH、羧酸或酯的官能团取代；
或者R1和R2可为式Y-Z，其中Y为O、N、S并且Z为H、烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基，其中烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基可由另外的杂原子取代，优选地由选自N、O或S的杂原子取代。
在另一实施方案中，siRNA含有至少一条与VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR3、Tie2、bFGFR、IL8RA、IL8RB、Fas或IGF2R的mRNA或前mRNA在至少15个核苷酸上互补的链。
在另一实施方案中，siRNA含有至少一条包含选自SEQ ID NO1-900的序列的链。
在另一实施方案中，siRNA选自SEQ ID NO901-930。
在另一实施方案中，siRNA具有在标准胃酸试验中高于具有相同核苷酸序列的未修饰siRNA的稳定性。
在另一实施方案中，siRNA具有在标准胃酸试验中暴露30分钟后高于或等于50％的稳定性。
在另一实施方案中，siRNA具有在标准血清试验中高于未修饰siRNA的稳定性。
在另一实施方案中，siRNA具有在标准血清试验中暴露30分钟后高于或等于50％的稳定性。
在另一实施方案中，siRNA具有在标准肠道灌洗试验中高于未修饰siRNA的稳定性。
在另一实施方案中，siRNA与相同核苷酸序列的未修饰siRNA相比具有提高的口服生物利用率。
在一方面，本发明提供了包含具有任意一种或多种上述特性的siRNA的药物组合物。
在另一方面，本发明提供了用作药物的具有任意一种或多种上述特性的siRNA。
在另一方面，本发明提供了具有任意一种或多种上述特性的siRNA在制备用于治疗血管发生紊乱的药物中的用途。
在另一方面，本发明提供了具有任意一种或多种上述特性的siRNA在体外抑制血管发生过程的用途。
附图简述
图1a，1b，1c，1d和1e：未修饰的pGl3-siRNA(小鼠血清中的野生型siRNA)的代谢性降解；a-c)未修饰的siRNA在小鼠血清中孵育0’、30’和180’后的离子交换HPLC分析；在37℃下孵育30’后，分离离子交换HPLC中的主峰并再注入LC-MS中；d)所检测的分子量及其分布的表；e)ESI-MS图谱。
图2：四种双链RNA形式的图解：野生型(或未修饰型)siRNA、MOEo/h siRNA、C3-siRNA和C3-MOE siRNA。
图3：3种不同形式的siRNA在小鼠胃酸中的稳定性。在37℃下将样品以2微摩尔的浓度在小鼠胃酸中孵育。根据定量母体化合物条带，在超过2-6小时的时间段之后母体化合物消失。
第1-7泳道：在t＝0、5、10、15、30、60和120分钟时胃酸中的野生型siRNA。
第8泳道：dsRNA梯度(30、21、19、16、13、10bp)。
第9-15泳道：在t＝0、5、10、15、30、60和120分钟时胃酸中的C3siRNA。
第16泳道：dsRNA梯度(30、21、19、16、13、10bp)。
第17-24泳道：在t＝0、5、10、15、30、60和120分钟时胃酸中的C3-MOE siRNA。
图4：4种不同形式的siRNA在肠道灌洗液中的稳定性。在37℃下将样品以5微摩尔的浓度在肝微粒体中进行孵育。
(从左至右)
第1泳道：dsRNA梯度(30、21、19、16、13、10bp)。
第2-7泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时肠道灌洗液中的野生型siRNA。
第8-13泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时肠道灌洗液中的moeo/h siRNA。
第14-19泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时肠道灌洗液中的C3siRNA。
第20-25泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时肠道灌洗液中的C3-MOE siRNA。
图5：4种不同形式的siRNA在肝微粒体中的稳定性。在37℃下将样品以2微摩尔的浓度在来自大鼠肠道灌洗的肠液中进行孵育。
(从左至右)
第1道：ds
图6：4种不同形式的siRNA在小鼠血清中的稳定性。在37℃下将样品以2微摩尔的浓度在小鼠血清中进行孵育。根据定量母体化合物条带，在超过6小时的时间段后母体化合物消失。
(从左至右)
第1泳道：dsRNA梯度(30、21、19、16、13、10bp)RNA梯度(30、21、19、16、13、10bp)。
第2泳道：未处理的野生型siRNA。
第3泳道：未处理的moe o/h siRNA。
第4泳道：未处理的C3siRNA。
第5泳道：未处理的C3-MOE siRNA。
第6-9泳道：在t＝0时的肝微粒体中，与2-5泳道相同。
第10-13泳道：在t＝60’时的肝微粒体中，与2-5泳道相同
第14-17泳道：在t＝0时的上清液S12中，与2-5泳道相同。
第18-21泳道：在t＝60时的上清液S12中，与2-5泳道相同。
第2-7泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时小鼠血清中的野生型siRNA。
第8-13泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时小鼠血清中的moe o/h siRNA。
第14-19泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时小鼠血清中的C3siRNA。
第20-25泳道：在t＝0、15、30、60、180和360分钟时小鼠血清中的C3-MOE siRNA。
图7：3种形式的抗-VEGFR2siRNA(2种独立的序列)在细胞内的表征。将野生型siRNA、C3-siRNA和C3-MOE siRNA以三种浓度(1、5、10nM)转染至MS1细胞中。通过利用FACS测定VEGFR2细胞表面水平来评估沉默效力。
图8a和8b：野生型siRNA、C3-siRNA和C3-Moe siRNA在生长因子诱导的血管发生“琼脂小室”小鼠模型中的体内测试。图8a显示了每只小鼠每天1、5和25微克的对照、未修饰VEGFR2siRNA和C3修饰的VEGFR2siRNA的结果。图8b显示了每只小鼠每天0.2、1和5微克对照、C3修饰的VEGFR2siRNA和C3-MOE VEGFR2siRNA的结果。在每种情况下每天向腹膜内给予2种抗VEGFR2siRNA的混合物，共三天。
图9：抗-VEGFR2C3-MOE siRNA的体内测试，在B16同种移植黑素瘤肿瘤小鼠模型中腹膜内(i.p.)给予每只小鼠每天5和20微克。图9a显示用修饰的VEGFR2 siRNA的腹膜内治疗显著减轻了肿瘤的发展。图9b也显示每只小鼠20μg VEGFR2siRNA的腹膜内注射获得了肿瘤生长的显著抑制。
图10：C3-MOE siRNA在生长因子诱导的血管发生小鼠模型中的体内测试。每天口服给予抗VEGFR2siRNA共三天，每只小鼠每天20微克。
图11：C3-MOE siRNA在生长因子诱导的血管发生小鼠模型中的体内测试。每天腹膜内(每只小鼠每天1和0.2微克)或口服(每只小鼠每天20和5微克)给予抗-Tie2siRNA共三天。图11a：切割的组织的重量；图11b：Tie2蛋白敲除。
发明详述
本发明涉及用于治疗哺乳动物中血管发生紊乱的组合物和方法。特别地，本发明涉及可通过口服施用给哺乳动物而用于治疗血管发生紊乱的小干扰RNA(“siRNA”)。
血管内皮细胞中的血管发生靶标包括下列靶标/基因：VEGFR-1(GenBank登录号AF06365)、VEGFR-2(GenBank登录号AF063658)、VEGFR-3(GenBank登录号(NM_002020))、Tie2(TEK)(GenBank登录号NM_000459)、bFGFR(GenBank登录号M60485)、IL8RA(GenBank登录号L19591)、IL8RB(GenBank登录号L19593)、Fas(GenBank登录号X89101)、IGF2R(GenBank登录号NM_000876)。
本发明的siRNA分子介导了RNA干扰(“RNAi”)。该术语“RNAi”是本领域中公知的并通常理解为意味着通过具有与靶基因互补的区域的siRNA抑制细胞中的一种或多种靶基因。本领域中已知多种试验来检测siRNA介导RNAi的能力(见例如Elbashir等人，Methods26(2002)，199-213)。当与未经本发明的RNA分子处理的细胞相比时，本发明的siRNA对基因表达的效果将通常导致靶基因的表达受到至少10％、33％、50％、90％、95％或99％的抑制。
本发明的“siRNA”或“小干扰核糖核酸”具有本领域已知的意义，其包括下列方面。siRNA由两条核苷酸链组成，其在生理条件下沿着互补区域杂交。链是分离的，但可通过特定实施方案中的分子接头而连接。单个的核苷酸可为未修饰的天然存在的核苷酸、未修饰的天然存在的脱氧核苷酸或者其可为其中别处所述的经化学修饰或合成的。
本发明的siRNA分子包含双链区域，其与靶基因的mRNA区域基本上是同一的。与靶基因的相应序列具有100％同一性的区域是合适的。这种状态称为“完全互补”。然而，该区域与靶基因的相应区域相比也可含有一个、两个或三个错配，取决于所靶向的mRNA区域的长度，而如此可为非完全互补。在一个实施方案中，本发明的RNA分子特异靶向一个给定基因。为了仅靶向目的mRNA，siRNA试剂可具有与靶mRNA100％的同源性和与细胞或组织中存在的所有其他基因至少2个错配的核苷酸。分析和鉴定具有足够序列同一性的siRNA以便有效抑制特异靶序列的表达的方法是本领域中已知的。序列同一性可通过本领域已知的序列比较和比对算法来优化(见Gribskov和Devereux，Sequence Analysis Primer，StocktonPress，1991，以及此处所引用的文献)，且通过例如BESTFIT软件程序中使用缺省参数而实施的Smith-Waterman算法来计算核苷酸序列之间的百分比差异(例如，University of Wisconsin Genetic Computing Group)。
影响RNAi试剂效果的另一因素是靶基因的靶区域。通过RNAi试剂有效用于抑制的靶基因区域可通过实验来确定。合适的mRNA靶区域将为编码区域。另外合适的为非翻译区域，例如5’-UTR、3’-UTR和剪接点。例如，可因此而进行Elbashir S.M.等人，2001EMBO J.，20，6877-6888中所述的转染试验。本领域中存在许多技术人员所公知的其他合适的试验和方法。
根据本发明，与靶标互补的siRNA区域的长度可为10至100个核苷酸，12至25个核苷酸，14至22个核苷酸或者15、16、17或18个核苷酸。当与相应的靶区域存在错配时，互补区域的长度通常需要稍微长些。
由于siRNA可携带突出端(其可与靶标互补或不互补)、或携带与其本身而不是靶基因互补的附加核苷酸，siRNA的每条单独的链的总长度可为10至100个核苷酸、15至49个核苷酸、17至30个核苷酸或19至25个核苷酸。
短语“每条链为49个核苷酸或更少”是指链中的连续核苷酸的总数，其包括所有修饰的或未修饰的核苷酸，但不包括可添加于链的3’或5’末端的任何化学部分。插入链中的短的化学部分不计算在内，但设计用于连接两条单独链的化学接头并不被认为产生了连续核苷酸。
短语“突出于5’末端或3’末端中至少一端的1至6个核苷酸”指的是在生理条件下从两条单独的链形成的互补siRNA的结构。如果末端核苷酸是siRNA双链区域的一部分，则认为siRNA是平端的。如果末端上的一个或多个核苷酸是未配对的，则产生了突出端。通过突出的核苷酸的数量来测定突出端长度。突出的核苷酸可在每条链的5’末端或3’末端上。
本发明的siRNA具有适合于口服递送的高体内稳定性，其通过在至少一条链上包括至少一个修饰的核苷酸来实现。因此，本发明的siRNA含有至少一个修饰的或非天然的核苷酸。许多已知化学修饰的冗长描述在公开的PCT专利申请WO200370918中有所描述，此处将不再赘述。在此将用于口服递送的合适修饰在实施例和说明书中更特别地加以描述。合适的修饰包括但不限于对糖部分的修饰(即糖部分的2’位置，例如2’-O-(2-甲氧乙基)或2’-MOE(Martin等人，Helv.Chim.Acta，1995，78，486-504)即烷氧基烷氧基)或碱基部分(即非天然或修饰的碱基，其维持了与另一核苷酸链中的其他特异碱基配对的能力)。其他修饰包括所谓的“主链”修饰，包括但不限于替换磷酸酯基团(用例如硫代磷酸酯、手性硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯连接相邻的核糖核苷酸)。最后，此处有时称作3’帽或5’帽的末端修饰可具有重要意义。如表1中所示的，帽可以仅由添加的附加核苷酸组成，例如已发现对siRNA提供稳定性的“T-T”。帽可由更复杂的化学结构组成，这是本领域技术人员已知的。
在下面实施例中所用的实施方案中，3’帽是经3’碳连接至3’末端的化学部分，且其选自式I的化合物：
Figure G2007800161675D00101
     [式I]
其中
X为O或S
R1和R2独立地为OH、NH2、SH、烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基，其中烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基可由另外的杂原子和官能团取代，优选地由选自N、O或S的杂原子或选自OH、NH2、SH、羧酸或酯的官能团取代；
或者R1和R2可为式Y-Z，其中Y为O、N、S并且Z为H、烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基，其中烷基、芳基、烷基芳基、芳基烷基可由另外的杂原子取代，优选地由选自N、O或S的杂原子取代。
在糖部分上的修饰的例子包括2’烷氧基核糖核苷酸、2’烷氧基烷氧基核糖核苷酸、锁定核酸核糖核苷酸(LNA)、2’氟代核糖核苷酸、吗啉代核苷酸。
核苷酸间键合也可进行修饰。核苷酸间键合的例子包括硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、氨基磷酸酯和酰胺键合。
R1可为OH。
R1和R2共可包含1至24个C原子、1至12个C原子、2至10个C原子、1至8个C原子或2至6个C原子。在另一实施方案中，R1和R2独立地为OH、低级烷基、低级芳基、低级烷基-芳基、低级芳基-烷基，其中低级烷基、低级芳基、低级烷基-芳基、低级芳基-烷基可由上述另外的杂原子和官能团取代。在另一实施方案中，R1和R2不能同时为OH。
与有机基团或化合物有关的术语“低级”是指这样的化合物或基团，其可为分支或不分支的，带有高达7个并包括7个碳原子，优选1-4个碳原子。低级烷基代表例如甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基和支链戊基、正己基和支链己基。
烷氧基的例子包括O-Met、O-Eth、O-prop、O-but、O-pent、O-hex。
合成siRNA(包括含有至少一个修饰或非天然核糖核苷酸的siRNA)的方法是本领域技术人员所公知且容易利用的。例如，公开的PCT专利申请WO2005021749和WO200370918中展示了多种合成的化学物质，这两份申请均在此处被引用作为参考。该反应可在溶液中或优选地在固相或使用聚合物支持试剂来实施，随后在各条件下将合成的RNA链结合，其中形成了能够介导RNAi的siRNA。
本发明提供了含有至少一个修饰的核苷酸的siRNA，其适于口服递送。在功能性术语中，这指的是一旦口服施用，siRNA将具有合适的药物动力学和生物分布，从而完成向目标靶组织的递送。特别是这需要血清稳定性，免疫反应的缺失，和药物样行为。在此文的别处所公开的标准胃酸试验和标准血清试验的基础上，可预期siRNA的许多这些特征。
在另一方面，本发明提供了用于抑制靶基因的方法，其包括向细胞引入本发明的siRNA，其能够通过RNAi而抑制至少一种靶基因。另外，可将多于一种的siRNA同时或顺序引入细胞，所述每种siRNA特异于不同的靶区域。
本发明并不限于任何类型的靶基因或核苷酸序列。例如，靶基因可为细胞基因、内源基因、病原体相关基因、病毒基因或癌基因。血管发生基因对于本发明是特别重要的，因为一些实施例强调了本发明的口服递送的siRNA可在血管生成、新生血管生成或血管发生位置上积聚。对本发明具有特别重要性的这些位点上的血管发生基因的最新列表列于AngioDB中：血管发生和血管发生相关分子的数据库Tae-Kwon Sohn，Eun-JoungMoon1，Seok-Ki Lee1，Hwan-Gue Cho2和Kyu-Won Kim3，Nucleic AcidsResearch，2002，第30卷，第1期，369-371，且在线位于http://angiodb.snu.ac.kr/。已对特别重要的基因进行了详细分析并在此文的别处展开。
在另一方面，本发明还提供了试剂盒，其包含用于抑制细胞中靶基因表达的试剂，其中所述试剂盒包含本发明的dsRNA。试剂盒包含至少一种实施体外或体内引入本发明的dsRNA从而检测样品或受试者所必需的试剂。在优选的实施方案中，此类试剂盒还包含详细说明步骤的说明书，通过其来使用试剂盒组分。
在此公开中如此处所用的“治疗血管发生紊乱”指的是本发明修饰的siRNA在药物组合物中的用途，其用于治疗涉及新生血管生成、血管生成和/或血管发生的生理和病理过程的疾病。像这样，这些药物组合物对于治疗那些需要抑制新生血管生成、血管生成或血管发生的疾病、病症或紊乱是有用的，所述疾病、病症或紊乱包括但不限于癌症肿瘤生长和转移、瘤、眼睛新生血管生成(包括黄斑变性、糖尿病性视网膜病、局部缺血性视网膜病、早产儿视网膜病、脉络膜新生血管)、风湿性关节炎、骨关节炎、久喘、感染性休克(spectic shock)、炎性疾病、滑膜炎、骨和软骨损坏、血管翳生长、骨赘形成、骨髓炎、银屑病、肥胖症、血管瘤、皮肤多发性出血性肉瘤、动脉粥样硬化(包括动脉粥样硬化斑块破裂)、子宫内膜异位、疣、过度的毛发生长、伤疤瘢痕瘤、过敏性水肿、功能障碍性子宫出血、毛囊囊肿、卵巢过度刺激、子宫内膜异位、骨髓炎、炎症和感染过程(肝炎、肺炎、glumerulonephtritis)、哮喘、鼻息肉、移植、肝再生、周脑室白质软化症(leukomalacia)、甲状腺炎、甲状腺肿大、淋巴细胞增殖紊乱、血液学恶性肿瘤、血管畸形和先兆子痫。
如此处所用，“治疗(treatment)”指的是为抑制并减轻疾病、紊乱或病症的过程，抑制或减轻疾病、紊乱或病症的症状、或预防性阻止疾病、紊乱或病症的进一步发展所采取的行动。“治疗(treat)”是其动词形式。
本发明的治疗物质的有效剂量是治疗疾病状态所需要的剂量。有效剂量依赖于疾病类型、所用的组合物、施用途径、所治疗的哺乳动物类型、所考虑的具体哺乳动物的身体特征、共用的药物、和医药领域技术人员所认可的其他因素。通常，依赖于效力，每天施用0.1mg/kg至100mg/kg体重的量的siRNA。本发明的核酸分子及其制剂可以剂量单位制剂的形式口服、局部、肠胃外、通过吸入或喷雾、或经直肠施用，所述剂量单位制剂含有常规的非毒性可药用载体、佐剂和/或介质。如此处所用的术语肠胃外包括经皮肤、皮下、血管内(例如静脉)、肌内、腹膜内或鞘内注射或输注技术等等。另外，提供了包含本发明的核酸分子和可药用载体的药物制剂。如果期望其他活性成分，一种或多种本发明的核酸分子可与一种或多种非毒性的药物可接受载体和/或稀释剂和/或佐剂相结合而存在。含有本发明的核酸分子的药物组合物可以是适合于口服施用的形式，例如，作为片剂、含片、锭剂、水悬液或油悬液、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬胶囊或软胶囊、或糖浆剂或酏剂。
旨在口服使用的组合物可根据本领域已知用于制造药物组合物的任何方法来制备，且此类组合物可含有一种或多种此类甜味剂、增香剂、着色剂或防腐剂，以便提供药物上精致和适口的制剂。片剂含有活性成分，其与无毒的可药用赋形剂混合，所述无毒的可药用赋形剂适合制备片剂。这些辅料可为，例如，惰性稀释剂、例如碳酸钙、碳酸钠、乳糖、磷酸钙或磷酸钠、颗粒剂或崩解剂，例如，玉米淀粉、海藻酸；结合剂，例如淀粉、明胶或阿拉伯胶；和润滑剂例如硬脂酸镁、硬脂酸或滑石粉。片剂可为未包衣的或者可通过已知技术进行包衣。口服使用的制剂还可以硬胶囊的形式存在，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或白陶土相混和，或者以软胶囊的形式存在，其中活性成分与水或油介质例如花生油、液体石蜡或橄榄油相混和。水悬液含有与适于制备水悬液的辅料相混合的活性物质。
本发明组合物的口服施用包括直接向胃或肠施用物质的所有标准技术，最重要地通过剂量形式的病人控制的吞咽，以及通过此类递送的其他机械和辅助方式。
每天每千克体重大约0.1mg至140mg级别的剂量水平在治疗上面指出的病症中是有用的(每个受试者每天大约0.5mg至大约7g)。可与载体材料相组合产生单剂型的活性成分的量依赖于所治疗的宿主和施用的特定形式而不同。剂量单位形式通常含有大约1mg至大约500mg的活性成分。可以理解，针对特定受试者的特定剂量水平依赖于多种因素，包括所使用的特定化合物的活性、年龄、体重、一般健康、性别、饮食、施用时间、施用途径、排泄速率、药物组合和所治疗的特定疾病的严重性。
本发明治疗物质的治疗效果可通过与其他药剂组合而得到加强。通常此类其他物质将包括已知用于治疗类似疾病例如血管发生紊乱的物质。另外，此类物质可用于降低由本发明的治疗剂引起的副作用或非期望的效果。
本发明的siRNA具有重要的研究用途。一种此类研究包括在体外研究血管发生过程。通过“体外血管发生过程”意味着任何不使用完整动物来研究血管发生或血管生成的过程。像这样，本文由此包括利用血管发生的标记或指示剂研究血管发生步骤的体外或离体方法和试验。
RNA链核苷酸序列
已将表1中所鉴定的siRNA链序列鉴定为针对下列靶标的合适的siRNA序列：VEGFR-1(GenBank登录号AF06365)、VEGFR-2(GenBank登录号AF063658)、VEGFR-3(GenBank登录号(NM_002020))、Tie2(TEK)(GenBank编号#NM_000459)、bFGFR(GenBank登录号M60485)、IL8RA(GenBank登录号L19591)、IL8RB(GenBank登录号L19593)、Fas(GenBank编号#X89101)、IGF2R(GenBank登录号NM_000876)。
表1：针对人VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、Tie2、bFGFR、IL8RA、IL8RB、Fas、IGF2R的siRNA。
Figure G2007800161675D00171
Figure G2007800161675D00191
Figure G2007800161675D00201
Figure G2007800161675D00211
Figure G2007800161675D00221
Figure G2007800161675D00241
Figure G2007800161675D00251
Figure G2007800161675D00261
Figure G2007800161675D00271
Figure G2007800161675D00281
Figure G2007800161675D00291
RNA链核苷酸的化学修饰
本发明的siRNA可在至少一条RNA链上包含至少一个修饰的核苷酸。可能的修饰核苷酸的范围在此文的别处公开。根据本发明可用的修饰或修饰的组合显示于表2中：
表2：化学修饰和序列结构
 
#    修饰名称         形式                                          
1 PS DNA o/h NNNNNNNNNNNNNNNNNNNsnsnnsnsNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
2 Full PS NsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsNsN
3 RNA o/h NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
4 平端 NNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
5 2’-OMe o/h NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN P N P N P N P NNNNNNNNNNNNNNNNNNN                       
6 2‘-OMe/2‘F NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN P N P N P N P NNNNNNNNNNNNNNNNNNN                       
7   LNA(在双        NNNNNNNNNNNNNNNNNNNsnsn                       
 
链区域中并入的3-7个) nsnsNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
N＝任何未修饰的RNA核苷酸
n＝未修饰的DNA核苷酸
Np＝修饰的RNA核苷酸
s＝鉴定硫代磷酸酯核苷酸间键合
o/h＝突出端
添加至siRNA链3’端的3’位置的下列修饰，有时称作“3’末端帽”，也认为是本发明有用的实施方案，并可和本发明的任一siRNA一起使用。
Figure G2007800161675D00301
具有本发明的活性的特定化合物包括下列，示于表3中：
表3：实施例中所用的siRNA的序列和化学物质
 
名称 链 序列(N:RNA:dN:DNA:n:2′-moe RNA;s:硫代磷酸酯 SEQ ID NO
pGl3-siRNA 指导链 UCG AAG UAC UCAGCG UAAGdTdT 901
互补链 CUU ACG CUG AGU ACU UCGAdTdT 902
pGL3MOE o/hsiRNA 指导链 CUU ACG CUG AGU ACU UCG Atst 903
互补链 UCG AAG UAC UCA GCG UAA Gtst 904
pGl3-C3-siRNA 指导链 UCG AAG UAC UCA GCG UAA G-C3 905
互补链 CUU ACG CUG AGU ACU UCG A-C3 906
pGl3-C3-MOE-siRNA 指导链 UCG AAG UAC UCA GCG UAa g-C3 907
互补链 CUU ACG CUG AGU ACU UCg a-C3 908
 
VEGFR2-siRNA1 指导链 UUG AGG UUU GAA AUC GACCdCdT 909
互补链 GGU CGA UUU CAA ACC UCAAdTdT 910
VEGFR2-siRNA2 指导链 UAA UUU GUU CCU GUC UUCCdAdG 911
互补链 GGA AGA CAG GAA CAA AUUAdTdT 912
siRNA对照 指导链 ACG UGA CAC GUU CGG AGAAdTdT 913
互补链 UUC UCC GAA CGU GUC ACGUdTdT 914
VEGFR2-C3-siRNA1 指导链 UUG AGG UUU GAA AUC GAC C-C3 915
互补链 GGU CGA UUU CAA ACC UCAA-C3 916
VEGFR2-C3-siRNA2 指导链 UAA UUU GUU CCU GUC UUC C-C3 917
互补链 GGA AGA CAG GAA CAA AUU A-C3 918
 
C3-siRNA对照 指导链 ACG UGA CAC GUU CGG AGA A-C3 919
互补链 UUC UCC GAA CGU GUC ACG U-C3 920
VEGFR2-C3-MOE-siRNA1 指导链 UUG AGG UUU GAA AUC GAc c-C3 921
互补链 GGU CGA UUU CAA ACC UCa a-C3 922
VEGFR2-C3-MOE-siRNA2 指导链 UAA UUU GUU CCU GUC UUc c-C3 923
互补链 GGA AGA CAG GAA CAA AUu a-C3 924
Tie2-C3-MOE-siRNA1 指导链 UUC UUC UUU AAU UAA CAc c-C3 925
互补链 GGU GUU AAU UAA AGA AGa a-C3 926
Tie2-C3-MOE-siRNA2 指导链 UCU GAG UUU GUA AAU AUc g-C3 927
互补链 CGA UAU UUA CAA ACU CAg a-C3 928
C3-MOE-siRNA对照 指导链 ACG UGA CAC GUU CGG AGa a-C3 929
互补链 UUC UCC GAA CGU GUC ACg l-C3 930
实施例：
下列实施例举例说明了本发明的多个方面，并不有意限制包括在下述权利要求中的实施方案。下面的结果和讨论部分进一步涉及根据下列方法和使用下列材料所进行的实验。认为那些未具体描述的材料和方法是本领域技术人员常规使用的。
实施例1
siRNA的制备
通过标准的2’-O-TOM亚磷酰胺(phosphoamidite)技术合成单链siRNA衍生物并通过
Figure G2007800161675D00321
HLB Extraction Plates(Waters)进行纯化。将正义和反义链的siRNA混合于杂交缓冲液中(100mM乙酸钾、2mM乙酸镁、30mM Hepes，pH7.6)，在90℃下热变性3分钟并在37℃下退火60分钟。将siRNA双链体的100μM储液储存于-20℃。
实施例2：
血清中的孵育和通过IE-HPLC(LC-MS)的分析
在标准的血清试验中，将6μL20μM的每种siRNA与54μL血清或CSF混合并在培养箱中在37℃下加热。将50μL冷却的混合物上样于分析型DNA-pac PA-100柱(Dionex)上并用在1:10的乙腈:缓冲液(20mM乙酸钠、1mM乙酸镁，pH6.5)溶液中的NaCl梯度(30分钟内0-0.6M)进行分析。
为进行LC-MS分析，将100μL(20μM或50μM)每种siRNA与在37℃下孵育的900μL无菌胎牛血清(GIBCO)混合，并通过HPLC如前所示进行分离(NaCl梯度除外：9’内0M-0.36M/12’内0.36M-0.6M)。将降解产物在NAP柱上除盐并通过LC-ESI—MS进行分析。
实施例3
胃酸中的孵育
为准备标准的胃酸试验，从Ch arles River Laboratories(Les Oncins，法国)实验室获得FVB和C57BL6小鼠，重18至20g(6至8周龄)。利用CO2将动物处死，然后迅速回收胃。收集并混合胃液以及胃内容物，然后上样于离心式过滤器(Ultrafree MC，Millipores)。根据厂商的建议将过滤器部件旋转10分钟。回收对应于小鼠胃液的过滤液，在进一步的实验前将其等分并冷冻。
对于每次试验，如上所述在9倍体积的胃酸中稀释20μM的siRNA并在37℃下孵育0、5、10、15、30、60和120分钟。
实施例4
在肠道灌洗液中的孵育
为准备标准的肠道灌洗试验，将雄性Wistar大鼠禁食，用异氟烷(isoflurane)将其麻醉。用10mL盐水(0.5mL/分钟)然后用20mL水(1mL/分钟)通过对小肠(十二指肠、空肠、回肠)的原位灌注获得肠道灌洗液。离心(3000xg，15分钟，22℃)收集洗出物，并将上清液通过1.2-μm的滤器并在-20℃储存。
对于每次试验，在9倍体积的肠道灌洗液中稀释20μM siRNA并在37℃下孵育0、15、30、60、180和360分钟。
实施例5
在小鼠肝微粒体中的孵育
在标准的肝微粒体试验中，向10μl的250μM siRNA溶液中添加25μl的20mg蛋白质每毫升的小鼠肝微粒体(GEntest452701Charge11)、365μl的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)、50μl的UDPGA辅因子(在水中24mM)、50μl的NADPH。在t＝0分钟和t＝60分钟时通过冷冻终止孵育。
实施例6
在大鼠S12上清液中孵育
为进行大鼠S12上清液试验，将10μl的250μM siRNA溶液添加至17μl的29.9mg蛋白质每毫升的大鼠肝脏S12、373μl的100mM磷酸盐缓冲液(pH7.4)、50μl的UDPGA辅因子(在水中24mM)、50μl的NADPH中。在t＝0分钟和t＝60分钟时通过冷冻终止孵育。
实施例7
在小鼠血清中孵育
为进行小鼠血清中的标准孵育，在9倍体积的鼠血清(Harlan裸鼠)中稀释20μM siRNA溶液并在37℃下孵育0、15、30、60、180和360分钟。
实施例8
凝胶电泳稳定性试验
在干冰上振动和震荡冷冻后立即取出10μL等分试样的孵育溶液，37℃下孵育混合物并将等分试样在不同时间点进行震荡冷冻。将等分试样解冻于30μL(各15μL)上样缓冲液(Elchrom Sc.，Cham，瑞士)并在SF50凝胶(Elchrom Sc.，Cham，瑞士)上在120V，8℃下分离240分钟。用SYBRGold(分子探针)对条带进行染色并利用BIORAD ChemiDocTM XRS系统获取图像。
实施例9
细胞培养
在1.5％明胶包被的培养皿中，将小鼠永生的内皮细胞系MS1(ATCCCRL-2279)在添加有L-谷氨酰胺和10％热失活的FCS(AMIMED，瑞士)的DMEM高葡萄糖(4.5g/l)中进行培养。根据厂商的方法利用HiPerfect(QIAGEN)在24孔板中用siRNA转染MS1细胞(一式四份，最终的siRNA浓度为10nM或根据指示)。
实施例10
FACS分析
通过FACS分析未转染的和siRNA转染的MS1细胞的VEGFR2水平。简要地，用胰蛋白酶消化来自两份或三份孔中的细胞，来自每种条件的混和，然后用PBS+10％FCS洗涤两次，并在添加RPE缀合的抗VEGFR2Ab(1μg/106细胞；Avas12α1，BD Pharmingen)之前在冰上孵育10分钟。将RPE标记的同种型IgG2α用作FACS对照(BD Pharmingen)。FACS采集和分析是在FACScalibur上利用Cell Quest软件(Becton-Dickinson)来完成的。
实施例11
动物研究
雌性FVB小鼠(6至8周龄)是从Charles River Laboratories(LesOncins，法国)获得的。经耳朵标记鉴定小鼠并将其分组(每笼6只动物)饲养在相同条件下，并每天进行观察。每个处理组使用6只小鼠，且所有动物实验均严格遵守瑞士动物保护法。
参考小室模型已在出版物中有所描述(例如Wood J，Bold G，Buchdunger E等人PTK787/ZK222584，a novel and potent inhibitor ofvascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases，impairsvascular endothelial growth factor-induced responses and tumor growthafter oral administration.Cancer Res2000；60:2178-89)。简要地，用0.8％琼脂(BBL
Figure G2007800161675D0036083648QIETU
Nr.11849，Becton Dickinson，Meylan，法国)和20U/ml肝素(Novo Nordisk A/S，Bagsvaerd，丹麦)填充由全氟-烷氧基-聚四氟乙烯树脂(Teflon-PFA，21mm x8mm直径，550μl体积)组成的多孔组织小室，根据指示补充有或未补充3μg/ml重组人VEGF和siRNA。在填充步骤前将溶液保持在42℃下。利用3％异氟烷(Forene，Abbott AG，Cham，瑞士)吸入麻醉小鼠。为进行皮下移植，在尾巴基部制造小的皮肤切口以允许植入物穿刺器(trocar)的插入。在无菌状态下通过在动物背部的小切口植入小室。通过缝合夹(Autoclip 9mm Clay Adams)封闭皮肤切口。依赖于所需的剂量，将siRNA在“可注射质量等级”的0.9％盐溶液中稀释，然后通过腹腔内(200μL/剂)或通过管饲法口服(100μL/剂)递送至动物。小鼠接受最初剂量2至4小时后植入小室，然后每天处理共计2天。如果不另外指出，在移植后三天处死小鼠，切除小室并仔细地将每个植入物周围所形成的血管化纤维组织移除。利用体重来监测小鼠的大致状态。利用单因素方差分析(one-way ANOVA)然后是Dunnett测试来进行统计学分析。
实施例12
B16黑素瘤异种移植模型
使用以前鉴定为对抗血管生成治疗响应的同系B16/BL6鼠黑素瘤模型(例如，LaMontagne K，Littlewood-Evans A，Schnell C，O′Reilly T，WyderL，Sanchez T，Probst B，Butler J，Wood A，Liau G，Billy E，Theuer A，HlaT，Wood J.Antagonism of sphingosine-1-phosphate receptors by FTY720inhibits angiogenesis and tumor vascularization.Cancer Res.2006年1月1日；66(1)：221-31)来评估标准或修饰的siRNA的抗肿瘤活性。将肿瘤细胞(1μL，5x104/μL)皮内注射入同系雌性C57BL/6小鼠双耳的耳廓背面(dorsal pinna)。在肿瘤细胞接种后的7、14和21天，利用计算机辅助图像分析软件(KS-4003.0成像系统，Zeiss)和特别设计的宏来进行原发肿瘤(primary tumor)区域的测量(mm2)。从第7至21天，通过腹腔内(200μL/剂)或通过管饲法口服(100μL/剂)，小鼠每天一次接受稀释于“可注射质量等级”的0.9％盐溶液中的siRNA。在第21天处死小鼠，并称重颅内淋巴结转移灶然后将其冷冻。
在这些结果中，使用的实际siRNA序列和化学结构可通过参考表3来确定。
小鼠血清中的野生型siRNA从两个3’末端被降解
通过核酸酶的寡核苷酸降解主要是3’-核酸外切的。通过在反义寡核苷酸末端引入芳香或亲脂残基的修饰延迟了其核酸降解降解。为证实此代谢途径是否对于siRNA也是主要的，我们在37℃下在小鼠血清中孵育了未修饰的siRNA(野生型siRNA)达3小时。
所使用的未修饰siRNA序列是pGl3-siRNA(见表3)。
用强阴离子交换HPLC在t＝0分钟、t＝30分钟、t＝180分钟时对混合物进行分析。
如图1a、1b和1c中所示，在t＝30分钟时，观察到了对应于平端siRNA的轮廓分明的峰态。到t＝3小时时观察到大量降解。图1d和1e举例说明了通过HPLC-ESI-MS分析所鉴定的代谢产物。该分析揭示了与两条链上3’突出端和3’末端首个碱基配对核糖核苷酸的缺失相对应的几种代谢产物的存在。还观察到了指导链的5’末端核糖核苷酸的消化。
图1表明了血清中未修饰siRNA的降解途径。可能通过3’外切核酸酶DNA突出端首先被消化。在LC-MS中，还检测到其他的代谢物，其与两条链的首个碱基配对3’核糖核苷酸以及指导链的首个5’碱基配对核糖核苷酸的缺失相对应。
3’修饰的siRNA经过胃肠道是稳定的
合成了具有2’-甲氧基乙基核糖核苷酸突出端(MOE o/h siRNA)的siRNA、具有羟基丙氧基磷酸二酯部分的3’-加帽平端siRNA(C3-siRNA)、以及其中每条链3’-末端前两个碱基配对核苷酸经2’-甲氧基乙基核糖核苷酸残基修饰的羟基丙氧基磷酸二酯3’-加帽siRNA(C3-MOE siRNA)。图2中对这些化合物进行了图示举例说明。
第一种siRNA在小鼠胃酸中孵育2小时(图3)。30分钟后在C3siRNA和C3-MOE siRNA的情况下均未观察到降解，而观察到了野生型siRNA的降解。
在从大鼠肠道灌洗所获得的肠液中的稳定性显示出15分钟后野生型siRNA几乎完全降解，而观察到MOE o/h siRNA、C3-siRNA和C3-MoesiRNA中的母体化合物有共计60分钟的时间(图4)。
利用肝微粒体试验和S12试验(肝脏胞质酶活性的代表)评估了肝脏中的稳定性。结果显示于图5中。在两种情况下，在孵育60分钟后均未观察到降解。
最后，通过在37℃下以2微摩尔孵育多达6小时，在小鼠血清中测试了siRNA(结果在图6中)。随后通过凝胶电泳测试了母体化合物稳定性。在修饰的siRNA的情况下(C3siRNA、C3-MOE siRNA、MOE o/h siRNA)未观察到明显的降解，而野生型siRNA观察到了降解。
该研究表明野生型(未修饰的)siRNA在小鼠胃酸和小鼠血清中是代谢变化的。在3’末端修饰的siRNA情况下，在胃肠道中未观察到降解。因此，可能3’修饰的siRNA将比野生型siRNA具有更高口服生物利用率。
全身递送的3’修饰的siRNA在体内生长因子诱导的血管生成模型中更有活性
首先，在细胞内通过测定经抗VEGFR2siRNA转染的MS1细胞的VE GFR2表面水平验证了修饰的siRNA(C3-siRNA和CE-MOE siRNA)下调靶基因的能力。
将2种以野生型siRNA形式存在的抗VEGFR2siRNA、C3-siRNA和C3-MOE的混合物，进行腹膜内施用。结果显示于图7中。在每只小鼠每天25微克的较高剂量下，混和的野生型siRNA显著降低了VEGF诱导的血管形成。利用C3-siRNA在五分之一的剂量下观察到了同等水平的抑制。在C3-MOE siRNA混合物的情况下，在所有测试剂量包括最低的每只小鼠每天0.2微克下均观察到了血管化组织重量的显著降低。
图8a和8b显示，当腹膜内施用时，VEGFR2-C3和C3-MOE siRNA在低于每只小鼠每天1微克的剂量下都是有效的。
在B16同种移植黑素瘤肿瘤小鼠模型中腹膜内(i.p.)给予抗VEGFR2C3-MOEsiRNA的体内测试。图9a显示用修饰的VEGFR2-C3-MOE-siRNA的腹膜内治疗显著降低了肿瘤的发展。图9b也显示以每只小鼠20μg腹膜内注射VEGFR2-C3-MOE-siRNA获得了肿瘤生长的显著抑制。
口服递送siRNA用于治疗血管生成紊乱
图10显示，以每只小鼠每天20微克的剂量口服施用VEGFR2-C3-MOE-siRNA1将血管生成重量降低至基础水平(例如，无生长因子诱导的重量)。所用的实际siRNA序列参见表3。
还在生长因子诱导的血管生成模型中，腹膜内和口腔递送测试了抗Tie2C3-MOE siRNA。图11a和11b显示在口服施用的情况下，在每只小鼠每天20微克时两种针对Tie2的C3-MOE siRNA均是有活性的。所用的实际siRNA序列可通过参考表3来确定。
数据显示，有或没有其他内部修饰的3’末端修饰的siRNA在口服施用时能够以合理的剂量显示出疗效。
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Claims (8)

1.短干扰核糖核酸，siRNA，所述siRNA的两个末端是平端的且所述siRNA包含两条单独的RNA链，它们在至少15个核苷酸上是互补的，其中每条链有49个核苷酸或更少的核苷酸，其中所述siRNA每条链的3’-末端前两个碱基配对核苷酸均是2’-甲氧基乙基核糖核苷酸残基，并且至少一条链的3’-末端包含经3’碳连接至3’末端的化学部分，其中所述化学部分为
Figure FSB00001031744600011
2.权利要求1的siRNA，其中每条链的总长度是19个核苷酸。
3.根据权利要求1的siRNA，其具有在标准血清试验中高于具有相同核苷酸序列的未修饰siRNA的稳定性。
4.权利要求1的siRNA，其具有在标准肠道灌洗试验中高于具有相同核苷酸序列的未修饰siRNA的稳定性。
5.根据权利要求1的siRNA，其具有与相同核苷酸序列的未修饰siRNA相比提高的口服生物利用率。
6.药物组合物，其包含根据权利要求1-5中任一项的siRNA。
7.根据权利要求1-5中任一项的siRNA在制备药物中的用途。
8.根据权利要求7的用途，其中siRNA所靶向的基因表达于内皮细胞。
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