ES2372237B1 - Oligonucleótidos modificados como reguladores de la expresión génica. - Google Patents

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Abstract

Oligonucleótidos modificados como reguladores de la expresión génica.#La presente invención se refiere a un compuesto de pARNi y un grupo R, donde R se selecciona entre alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, arilo y heteroarilo y sus procesos de síntesis. Además también se describen composiciones farmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención, así como sus usos en medicina.

Description

Oligonucleótidos modificados como reguladores de la expresión génica.
La presenteinvención se refierea un compuestodepARNiy un grupoR, dondeR se selecciona entre alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, ariloyheteroariloy sus procesos de síntesis. Además también se describen composicionesfarmacéuticas que comprenden los compuestos de la invención, así como sus usos en medicina. Por lo tanto pertenece al campo de la técnica de la biotecnología.
Estado de la técnica anterior
El ARN de interferencia (ARNi) es un importante mecanismo de regulación génica que puede ser utilizado para el silenciamiento específico de genes. El proceso es iniciado por ARNs de doble cadena que se denominan pARNi, pequeños ARN de interferencia (small interfering RNAs, siRNAs). Los pARNi, complementarios a un ARN mensajero determinado, se unen a un complejo proteico conocido como RISC. El complejo formado por la unión de la cadena antisentidooguíaconRISC catalizaladegradacióneficientedeunARNmensajero específico,provocandoun descenso de la proteína Diana. Durante los últimos años, se han realizado numerosos estudios con el fin de utilizar este fenómeno de regulación génica natural como base para una nueva terapia encaminada hacia la reducción específica de una proteína determinada previamente. Así, dicha terapia podría ser utilizada para el tratamiento de enfermedades en las que se conoce que son causadas por la sobreexpresión de genes tales como el cáncer o enfermedades inflamatorias
[D. Brumcoty col.RNAi therapeutics: a potential new classof pharmaceutical drugs. Nature Chemical Biology2 (2006), páginas711-719;A.deFougerollesycol.RNAinterference in vivo:toward synthetic small inhibitory RNAbased therapeutics Methods in Enzymology 392 (2005), páginas 278-296; C. Chakraborty Potentiality of small interfering RNAs (siRNA) as recent therapeutic targets for gene-silencing. Current DrugTargets8(2007) páginas. 469482],Paraqueeste mecanismoderegulaciónsepuedaconvertirenun tratamientoefectivoes necesarioquelospAR-Ni produzcan un efecto inhibitorio prolongado, se puedan distribuir eficazmente en el organismoy se puedan dirigir con eficiencia haciaelórganoo tejidoo grupo celular dañado.En estainvención se describen nuevosderivados del ARN con modificacionesenelextremo3’en ambas cadenas,guíayacompañante. Estos nuevos derivados producen pARNi que son más estables a la degradación por nucleasas sin afectar el poder inhibitorio que transcurre a través del mecanismo mediadopor RISC.Conelfinde utilizarlospARNiparael tratamiento efectivodelas enfermedades es necesario tener efectos inhibidores más duraderos, obtener unabuena distribución de los pARNi en el cuerpoyla liberación controlada de los pARNi en el órgano, tejido o tipo de célula diana.
La introducción de modificaciones químicas en pARNi es una estrategia de gran utilidad para el desarrollo de nuevos compuestos con actividades inhibitoriasyfarmacológicas interesantes. Normalmente las modificaciones se han introducido en la cadena acompañante, ya que las modificaciones de la cadena guía pueden eliminar totalmente la actividadinhibitoriaal comprometerla unión conel complejo proteico responsabledelaacción inhibitoria conocido comoRISC(RNAInferferenceSilencingComplex)[J.Elmenycol.(2005).UseofsiRNAmodifiedat5’-endofsense strand resultingin impairedmRNAcleavageof activated RISC complexforusein treatmentof cáncer.PCT Int.Appl. WO2005/073378 A1].
Descripción de la invención
En la presente invención se describen nuevos compuestosde pARNi que son más estables y/o eficaces en la inhibicióndelaexpresión génica, como por ejemploeldelaluciferasa en célulasSH-SY5YyHeLa así como enla inhibición del gen de necrosis tumoral alfa de ratón implicado en varias enfermedades inflamatorias tales como enfermedaddeCrown, artritis reumatoideycáncer.Tambiénse describela síntesisde oligoribonucleótidosque contienen moléculas alquílicas o aromáticas en el extremo terminal 3’.
La presenciadelos grupos alifáticosyaromáticosenelextremo3’ tantodela cadenaguíaoacompañante mantiene
o mejora la estabilidad termodinámica de los dúplex resultantes de la mezcla de las cadenas guía o acompañante para formar un dúplex inhibidoro pARNi. Los duplexes pARNi unidos covalentementea grupos alifáticosyaromáticos enla posición terminal en3’ pueden ser transfectadosa células humanasylos conjugados entran eficientemente enel mecanismodeARNde interferenciadeformasemejantealosdúplexdepARNisin modificar induciendola inhibición específica del gen cuya secuencia es complementaria a la secuencia de los pARNi. Además los pARNi modificados tienenuna estabilidadalas nucleasaspresentesenelsueromuchomaselevadaquelospARNisinmodificarporloque lospARNi descritosenestainvenciónpueden mantenerel silenciamientogénico durantemástiempoquelospARNi sin modificar.
Porlo tanto, un primer aspectodela presenteinvención es un compuestode pARNiyun grupoRunidos covalentemente entre sí representados por la siguiente fórmula (I):
donde:
Yes un dúplexde pARNi,o una cadena sencillade pARNi, unido mediante un enlace tipofosfatoaX;
R se selecciona entre alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, ariloyheteroarilo (p. ej. azoarilo), estandoR opcionalmente sustituido conal menosun grupo seleccionado entre halógeno(F,Cl,Br,I), haloalquilo, alquilo,C2-C5 alquenilo, heterocicloalquilo, -NO2,-CN, -CO2Ra,-CORb,-SRc,-CONRdRe,-NRfRg,-ORh,-SO2NRiRj,dondeRa,Rb, Rc,Rd,Re,Rf,Rg,Rh,RiyRj, se seleccionan independientemente entreHyC1-C6 alquilo (como por ejemplo, metilo, etilo, propilo, isopropilo,butiloe isobutilo);
Xes una molécula puente unida al pARNi (Y) mediante el enlace tipo fosfato a la posición 3’ de la cadena guía o acompañante.
Los compuestos de pARNi que contienen grupos alifáticosyaromáticos en la posición terminal en 3’ pueden ser sintetizadosconbuenos rendimientos.Portanto,unsegundoaspectoesunprocesoparala síntesisenfasesólidadelos compuestos según se definen el primer aspecto o en cualquiera de sus realizaciones particulares, caracterizado porque comprendelas siguientes etapas (A.Aviñóycol. Solid-phase synthesis of oligomers carrying several chromophore units linkedby phosphodiester backbones. Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,18 (2008) 2306-2310]:
i) enlazar covalentementeelgrupoRyla molécula puente;
ii) unir el compuesto obtenido en el paso (i) a un soporte sólido;
iii) ensamblar de manera secuencial una de las cadenas de pARNi sobre la molécula X-R unida al soporte sólido;
iv) romperel enlace entreel soporte sólidoy elproductoyeliminar los grupos protectores obteniéndose una de las cadenas del pARNi conteniendo el grupo X-R;
v) mezclar cantidades equivalentesde las cadenas guíayacompañante para generarel dúplexde pARNi.
Un tercer aspecto es una composición farmacéutica que comprende los compuestos de pARNi de la presente invenciónyal menos unexcipienteovehículofarmacéuticamente aceptable.
Otro aspecto es el uso de los compuestos de la invención o de las composiciones farmacéuticas de la presente invención para la preparación de un medicamento.
Descripción de las figuras
Figura1muestrala estabilidaddelospARNi modificadosenelextremo3’dela cadenaguíaen suero fetalbovino. LospARNi modificadosse incubaronconsuerofetalbovinoa37ºC.Atiemposdeterminados(0-9horas)se sacaron alícuotasyse analizaronpor electroforesisengelesdel20%de poliacrilamida.TodoslospRNAi modificados contiene la moléculapuentedetipo treoninol.WT:sin modificación(pARNinº30,Tabla2);Py:pireno(pARNinº37);Antra: antraceno (pARNi nº 38); Naph: naftaleno (pARNi nº 39); CF3: trifluorometilfenilo (pARNi nº 40); F: fluorofenilo (pARNi nº 41); Me: metilo (pARNi nº 42).
Figura2muestralaactividad inhibitoriadelospARNi modificados:a)ActividaddelospARNi modificadosenla cadena guía a una concentración 320 pM en células SH-SY5Y. b) Actividad de los pARNi modificados en la cadena acompañante a una concentración 320 pM en SH-SY5Y. c) Actividad de los pARNi modificados en la cadena guía a una concentración 32 pM en células HeLa después de 24 h. d) Actividad de los pARNi modificados en la cadena acompañanteauna concentración32pMen célulasHeLadespuésde24h.TodoslospRNAi modificados contienela molécula puente de tipo treoninol. Buffer: control negativo, solución tampón sin pARNi.. WT:pARNi sin modificación (pARNinº30,Tabla2);Py:pARNi conteniendoel derivadodel pireno(pARNinº37,enayc; pARNinº31enby d); Antra:pARNi antraceno(pARNinº38,enayc;pARNinº32enbyd);Naph:pARNinaftaleno(pARNinº39, enayc;pARNinº33enbyd);CF3:pARNi trifluorometilfenilo(pARNinº40,enayc;pARNinº34enbyd);F: pARNi fluorofenilo(pARNinº41,enayc;pARNinº35enbyd);Me:pARNi metilo(pARNinº42,enayc;pARNi nº36 enbyd);
Figura3 muestralaactividad inhibitoriadelospARNiquecontienen acridinayquindolinaenelextremo3’de la cadena acompañante contra el gen del TNF-α de ratón en células HeLa. s.m.: pARNi dúplex sin modificar; 63: pARNidúplexque contiene acridinaenelextremo3’dela cadena acompañante(63);64:pARNidúplexque contiene quindolina en el extremo 3’ de la cadena acompañante (64); Ser: ARN dúplex control de secuencia aleatoria. Las barras de control representan la desviación estándar de la media. El análisis estadístico se hizo con el método de ANOVAmodificado por Bonferroni. ***p<0,001 comparando con el pARNi de secuencia aleatoria.
Figura4 muestrala actividad inhibitoriade los pARNi modificados enelextremo3’dela cadena guía enfrente al gen del TNF-α de ratón en células HeLa usando Oligofectamina. Células HeLa fueron cotransfectadas con 250 ng de plásmido pCAm TNF-α usando lipofectamina como vector de transfección, una hora después se transfectaron 50 nMde cada unode lospARNi usando Oligofectamina. Despuésde48 horas se midieron losnivelesdeTNF-α por ELISA, s.m.: pARNidúplex sin modificar; 101: pARNi dúplex que contiene acridina en el extremo 3’ de la cadena acompañante (101); 103: pARNidúplex que contiene quindolina en el extremo 3’ de la cadena acompañante (103); Ser: ARNdúplex control de secuencia aleatoria. Los datos representan las medias ±ES, n=3y son comparados conla secuencia aleatoria. ***p<0,001. test ANOVA.
Descripción detalladadelainvención
La actividady/o estabilidad de los compuestos de pARNi de lapresente invención se puede modular en función delos gruposRseleccionados.Seha observado una relación entreel tamañodelamodificación enla cadena guíayla actividadde silenciamientogénico,siendolosderivadosdetipofeniloyacetilolosderivadosmas eficientesenlaactividad inhibitoria. Por ejemploel compuesto dondeRes alquiloo alquenilode cadena corta, esdecirdeC1aC5, como por ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo,butiloo isobutilo, presentanbuenas actividades, inclusive mejorando las del ARN natural. LosRmás preferidos sonel metiloo etilo, siendo aun más preferidoel metilo.El grupoX-R de los derivadosde alquiloyalquenilo está introducido preferentemente enla posición terminal3’dela cadena guía.
De acuerdo con una realización particular,R es alquiloC1-C6o alqueniloC2-C5, comopor ejemplo metilo, etilo, propilo, isopropilo,butilooisobutilo. PreferiblementeR es metiloo etilo, más preferiblemente metilo.
La estabilidad de los compuestos se puede incrementar seleccionado derivados cíclicos, como son los cicloalquilos, comoelciclobutilo, ciclopentiloo ciclohexilo, arilos, como fenilo, naftilo, antraciloo pireno,o heteroarilos.Enel casodelos ariloslosdos gruposmás preferidos son feniloo naftilo,yaúnmás preferiblemente fenilo.Los heteroarilo preferidos son acridinilo, quindolinilo, quinolinilo, tienilo, pirrolilo,oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tia-4H-pirazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzoxazolilo, benzimidazolilo, benzotriazolilo, indazolilo, indolilo, isoindolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, triazinilo, isoquinolinilo, azocinilo, indolizinilo,purinilo, cinnolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftapiridinilo, pteridinilo, carbazolilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, xanteniloo oxapinilo, preferiblemente acridinilo,quindolinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pteridiloyftalazinilo.Aligualqueenel casodelos grupos alquiloyalqueniloel grupoX-Restá preferiblementeunidoala posiciónterminal3’yaseadela cadenaguíao acompañante,aunqueéste está preferiblemente unido en la posición 3’ de la acompañante porque el dúplex muestra mayor estabilidad que el ARN natural, pero sin perdida de actividad.
Comoyaseha comentado anteriormente,el grupoRpuede estar sustituido. Sorprendentemente cuandoRestá sustituido con al menos un grupo electroatrayente, como por ejemploF, Cl, Br,IyC1-C3 haloalquilo, estos compuestos muestran un mayor actividadque su análogo sin dicha sustitución. Ejemplos de haloalquilos útiles para la presente invención son los grupos -CH2F, -CHF2, -CF3, -CCl3y-CBr3. Excelente resultados se han obtenido conRsustituidos con fluoroderivados comoel propio flúoro bien derivados del metilo comoel -CH2F, -CHF2y-CF3. Preferiblemente Fy-CF3.La mejoradela actividadde los gruposRsustituidos con flúor,o fluoroderivados, seha observado particularmente cuandoRes un grupoC1-C6 alquilo,ymás claramente cuandoR es un grupoC1-C3 alquilo sustituido conal menosun grupoF.Unodelos mejores resultados respecto actividadseha vistocuandoResun grupo-CF3.La mejora delaactividad graciasalos gruposelectroatrayentesnose limitasoloalosRalquílicos,sinoque tambiénesextensible aRcíclicos, como cicloalqueno, ariloo heteroarilo,yaligualqueenlos alquílicoslos sustituyentespreferidospara los grupos cíclicos,y en especial para los arilos, sonFo -CF3. PreferiblementeRes un grupo fenilo sustituido con un grupoF o -CF3,ymás preferiblementeR es 4-fluorofeniloo 4-trifluorometilfenilo.
Acontinuación se detallanalgunos gruposRparticulares útiles parala presenteinvención:
Comoya seha comentado anteriormenteel grupoR no se enlaza directamente a las posiciones terminalesdela cadena de pARNi, sino que se utiliza una molécula puente, que a su vez está unida a la posición terminal de la cadenade pARNia travésde un enlace tipo fosfato. Estos puentes son conocidos enla técnica(verA.Aviñóy col. Solid-phase synthesis of oligomers carrying several chromophore units linked by phosphodiester backbones. Bioorganic&Medicinal Chemistry Letters,18(2008) 2306-2310).En una realización particular,la molécula puenteXes treoninol, glicerol,2-amino-1,3-propandiol,2-amino-1,4-butandiol,3-amino-1,4-butandiol,3-amino-1,2-propandiol, hidroxiprolinol, serinol, o cualquier otro aminoalquildiol. Preferiblemente X es treoninol. De manera particular, el compuesto de pARNi puede tener la siguiente fórmula (II):
donde: Wesgrupoopcional,yesuno,ovarios, sustituyentesquepuedehaberencadaunidaddemetilenoyse selecciona,
o seleccionan independientemente, entreH,C1-C3 alquilooZ3; Z1,Z2yZ3 se seleccionan independientemente entre -OH, -O-R, -NHC(=O)Ry-NH2; R1yR2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C6-alquilo; nesun número enteroqueseselecciona entre1,2,3,4y5; mesun número enteroqueseselecciona entre0,1,2,3y4; Yes según se ha definido anteriormente; Rse selecciona independientemente entre losRdefinidos anteriormente.
Evidentementeen casodequemsea superiora1puedehaber diferentes gruposW.Estos gruposWno tienenporque ser todos idénticos sino que pueden ser seleccionados de manera independiente de entre los diversos significados deWespecificados anteriormente.
En una realización particularZ1 comprende un enlace amida unidoa un grupo puente, porlo que se podría representar por la siguiente fórmula (III): donde:
Y,R,Z2,R1,R2,W, ny m son según se han definido anteriormente.
Tanto en los compuestosde fórmula (II)y(III) se suele preferir puentes relativamente cortos, es decir quen sea1, 2o3,ymás preferiblementequen sea1.Tambiénse prefierequem sea0,1o2,ymáspreferiblementeque sea0.
En una realización preferidaR1yR2 seseleccionan independientemente entreHyC1-C3-alquilo, preferiblemente entreHymetilo.
En una realización preferida los compuestos de fórmula (II)y (III) derivan de la introducción, entre el enlace fosfatoyel grupoR, de una molécula de treoninol, glicerol,2-amino-1,3-propandiol,2-amino-1,4-butandiol,3-amino-1,4-butandiol,3-amino-1,2-propandiol, hidroxiprolinol, serinol,o cualquier otro aminoalquildiol. Preferiblemente proviene de treoninol.
En otra realización preferida el compuesto de pARNi comprende alguna de las siguientes estructuras:
La longitud de la cadena de pARNi (Y) de los compuestos de la invención es normalmente de entre 15 y 40 nucleótidospor cadena,más preferiblemente entre15y40,ytodavíamás preferiblemente entre19y25 nucleótidos por cadena.
Adicionalmente, el dúplex o la cadena sencilla de pARNi puede comprender modificaciones, como por ejemplo sustituciones seleccionadas entre 2’-O-metil-ribonucleótidoo 2’-desoxirribonucleótidoo 2’-metoxietil-ribonucleótido
o 2’-fluoro-desoxirribonucleótido, o 2’-fluoro-arabinonucleótido, nucleósidos de conformación restringida (como los conocidos en inglés con las siglas LNA o HNA), ARN con enlaces fosforotioato, o residuos abásicos o ribitoles o nucleósidos quecontienen bases modificadas tales como5-metilcitosina,5-metiluracilo,4-alquinilcitosina,5-alquiniluracilo,5-halogenocitosina,5-halogenouracilo,u otras pirimidinas modificadas,7-deazaadenina,7-deazaguanina, hipoxantina u otras purinas modificadas.
El dúplex de pARNi (Y) puede inhibir y/o silenciar, siendo esta inhibición/silenciamiento total o parcial respecto de un control, diversos genes de interésfarmacológico como elfactor de necrosis tumoral alfa (TNFα),factor de crecimiento endotelialyvascular(VEGF), receptorde VEGF (VEGF R1/2),factor supresorde coloniasde granulocitos(GM-CSF-1)yde macrófagos(M-CSF-1), angiopoyetina (ANGPT),apolipoproteína(ApoB), neovascularización vascular (CNV), carboxiquinasa fosfoenol piruvato (PEPCK), receptor delfactor de crecimiento epidérmico humano (HER2), proteína inflamatoriade macrófagos (MIP2), receptordeN-metil-Daspartato (NMDA), citoquina derivadas deloskeratocitos(KC), receptoropiode delta(DOR), receptordel dominiode Discoidina(DDR1),gendelafosfoproteína PIV (PIV-P), oxigenasa hemo (HMOX1), caveloina, transportador de dopamina, proteína fluorescente verde y/o proteína del sarcoma de Swing (EWS-FL/1). Los genes preferidos para silenciar/inhibir son elfactor de necrosis tumoral alfa (TNFα),factorde crecimiento endotelialy vascular (VEGF), receptorde VEGF (VEGF R1/2),factor supresorde coloniasde granulocitos(GM-CSF-1)yde macrófagos(M-CSF-1).TNF-α es un mediador importante de la apoptosis tanto en inflamación como en la respuesta inmunitaria. Además, la sobreexpresión de TNF-α está confirmada enel desencadenamientodela patogénesisde muchas enfermedades humanas. Por todo ellola inhibición de esta citoquina es relevante desdeel puntode vista biomédico. PEPCK es una proteína importante enel procesode gluconeogénesisy se encuentra sobreexpresadaenla diabetes.Esla responsabledeun aumentoenla producciónde glucosa hepática en pacientes diabéticosy en modelos animales.
Secuencias específicas pARNi útiles para la presente invención son 1) contra luciferasa: UCGAAGUAUUCCGC GUACGT (SEQ ID NO: 5), CGUACGCGGAAUACUUCGAT (SEQ ID NO: 6); 2) contra TNF: GUGCCUAUGU CUCAGCCUCTT (SEQID NO:2),GAGGCUGAGACAUAGGCA CTT (SEQID NO:1).
CuandoY es una cadena sencillade pARNi, dicha cadena sencilla puede ser,o bien una secuenciadela cadena guía o antisentido del ARN, o bien una secuencia de la cadena acompañante o sentido delARN.
El soporte sólido utilizado en el proceso de síntesis se puede elegir entre vidrio, gel de sílice, vidrio poroso, oxido de silicio, poliestireno, polietilenglicol, poliestireno-polietilenglicol, poliamida, poliacrilamida, cloruro de polivinilo, teflón, derivadosde teflón, papelycelulosa.
Enuna realización preferida,enel procesode síntesisR seunealsoporte sólidoatravésdeunamoléculapuente yal menos unade las cadenas del pARNi se sintetiza utilizandoel procedimientode síntesis enfase sólida utilizando el soporte sólido funcionalizado con el grupo R.
En otrarealización preferidadel procesoel grupoR se uneaun soporte sólidoyal menos unadelas cadenasdel pARNi se sintetiza por adición sucesiva de derivados de los nucleósidos que constituyenla secuencia de la cadena incluyendo los fosforamiditos, los H-fosfonatos, los fosfatos diésterylos fosfatosmonoéster
El grupoRtambiénsepuedeuniral soportesólidoyalmenos unadelas cadenasdelpARNise sintetizadapor adición sucesiva de los fosforamiditos de los nucleósidos que constituyen la secuencia de la cadena.
En el siguiente esquema se describe el proceso de síntesis en el caso particular de que la molécula puente provenga de treoninol:
Esquema1
El esquema 1 muestra las diferentes etapas necesarias para la síntesis de los soportes sólidos funcionalizados con algunosde los compuestosdelainvención. Reactivosycondiciones:a)R-COOH, diisopropilcarbodiimida,Nhidroxisuccinimida;b) Clorurode dimetoxitritilo(DMTr);c)i) anhídrido succínico, N,N-dimetilaminopiridina, diclorometano, temperatura ambiente, agitación durante 16 horas, ii) vidrio de poro controlado con grupos aminos (amino-CPG), N,N-dimetilaminopiridina, trifenilfosfina, 2,2-ditio-bis-(5-nitropiridina).
Diversos compuestos con un grupo carboxílico obtenidos de fuentes comerciales se han hecho reaccionar con L-treoninol en presencia de diisopropilcarbodiimida rindiendo los correspondientes derivados 1a-h. La protección del alcoholprimarioconelgrupo dimetoxitritilo(DMTr)seefectuóencondiciones habitualesgenerandolosDMTrderivados2a-h.Por reaccióndelos compuestos2a-hcon anhídrido succínicoyposterior acoplamientodelos hemisuccinatos correspondientes a los soportes de vidrio de poro controlado (CPG) funcionalizado con grupos amino se obtuvieron los soportes de vidrio funcionalizado con los derivados alifáticosy aromáticos 3a-h listos para su utilización enla síntesis de oligonucleótidos.
Las composicionesfarmacéuticasdel tercer aspectodelainvención comprendenal menosunexcipienteovehículo farmacéuticamente aceptable. Los excipientes incluyen cualquier material inerte o no activo usado en la preparación deunaformadedosificaciónfarmacéutica.Por ejemplo,losexcipientesdecomprimido incluyen,peronoselimitan
a: fosfato de calcio, celulosa, almidón o lactosa. Las formas de dosificación líquidas también incluyen líquidos orales por ejemploen formade licoreso suspensiones,asícomo disolucionesinyectables.Se puede formularla composición farmacéuticaparalaadministración transdérmicaenformadeparche.Todaslascomposicionesanteriormente descritas pueden conteneropcionalmenteunoomásdecadaunodelos siguientesexcipientes:vehículos, diluyentes, colorantes, agentes aromatizantes, lubricantes, agentes solubilizantes, desintegrantes, ligantesy conservantes.
Un tipode particulardeexcipientes que se puede comprender las composicionesfarmacéuticas son los agentes de transfección, este se puede adicionarala composiciónfarmacéutica paramejorar aunsi cabe las propiedadesde ésta, o para vectorizarla. Los agentes de transfección preferidos se seleccionan entre uno o mezclas de los siguientes compuestos lipofectina, liptofectamina, oligofectamina, effectene, cellfectina, DOTAP, DOPE, fugene, polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI), Jet-polietilenimida, péptidos de penetración celular, péptidos troyanos, péptido TAT, penetratina, oligoarginina, poli-lisina, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubosde carbono, lípidos catiónicosyliposomas.
Los compuestosdepARNiylas composicionesfarmacéuticas descritasenla presente memoriapueden tenervarios usos médicos, pero los preferidos son para el tratamiento del cáncer,inflamación, colitis, colitis ulcerativa, enfermedad deCrohny/o artritis reumatoides.En general,las compuestos/composicionesdela presenteinvención son útilespara la preparación de medicamentos para el silenciamiento génico.
Las composicionesfarmacéuticas preferidas parala presenteinvención son una formaadaptadaala administración oral o parenteral, preferiblemente parenteral.
La administración de los compuestos de esta invención se puede realizar a través de cualquier procedimiento que libere el compuesto, preferentemente al tejido deseado. Estos procedimientos incluyen las vías oral, intravenosa, intramuscular, subcutáneao intramedular, intraduodenal, etc. Preferiblementela composiciónfarmacéuticadela presente invención puede administrarse localmente mediante inyección en una zona cercana a la región de interés (intramuscularmente, subcutáneamente, intradérmicamente), inyección en una zona cercana a la región de interés o inyección intravenosa.
Con el propósito de la administración parenteral, se pueden usar así como soluciones acuosas estériles. Si es necesario, tales soluciones acuosas pueden tamponarsede forma adecuada,yel diluyente líquido se convirtió primero en isotónico con el suficiente suero salino o glucosa. Estas soluciones acuosas son especialmente adecuadas para propósitosdeinyección intravenosa, intramuscular, subcutánea e intraperitoneal.A este respecto, todos los medios acuosos estériles empleados se pueden obtener confacilidad mediante técnicas estándar bien conocidas por aquéllos expertos en la técnica.
Definiciones
Por pARNi se entiende en el contexto de la presente invención como pequeños fragmentos de ARN de interferencia de doble cadena de origen sintético o natural complementarios a la secuencia de los genes que se utilizan para la inhibición específica de los genes de losque son complementarios. Los pARNi están formados por dos cadenas de ARNquese denominan cadenaguía(en inglés“guide strand”o “antisense strand”)ycadena acompañante(eninglés “passenger strand” o “sense strand”). La cadena guía del pARNi se une a un complejo de proteínas denominado complejo silenciador del RNA de interferencia (en inglés “RNA interference silencing complex”, abreviado como “RISC”)yel complejo resultanteesel responsabledeladegradación celulardelRNAmensajero complementarioa la cadena guía.Parala unióndela cadena guíaal complejo RISC es necesario administrarel ARNde doble cadenao pARNi ya que la cadena guía por sí sola no puede unirse al complejo RISC.
Por el término “expresión génica” se entiende por la producción celular de una proteína determinada codificada por el gen correspondiente. De forma general el gen que se encuentra en los cromosomas presentes en el núcleo de las células se transcribe generando una moléculade ARN mensajero que se libera enel citoplasma. Allíla secuenciadel ARN mensajero dirige la síntesis de la proteína. El resultado de este proceso, que se conoce como expresión génica, es le síntesis de una proteína cuya secuencia esta codificada por el gen correspondiente.
El término “soporte sólido” se refierea unpolímero orgánicoo inorgánico que se utiliza parafacilitarla síntesisde oligonucleótidos, péptidosu otro compuestoorgánicoporel procedimientode síntesisenfase sólida.Eneste procedimientounodelosreactivosseunecovalentementealsoportesólidoylosotrosreactivosseañaden secuencialmente.Los productosdela reacciónse unenalreactivofijadoenel soportefacilitandoel aislamientopor filtracióndel producto. Los materiales que normalmente se utilizan como soportes para la síntesis enfase sólida son vidrio, gel de sílice, poliestireno, polietilenglicol, poliamidasycelulosa.
Dentrodel contextodela presente aplicación,los términos mencionadosenla descripciónyenlasreivindicaciones tienen preferiblemente los siguientes significados:
El término“alquilo” comprende preferiblemente alquilos ramificadosy no ramificadosde1 a10, preferiblemente de 1 a 6, más preferiblemente de entre 1 a 3, átomos de carbono, como por ejemplo metilo, etilo, n-propilo, isopropilo,n-butilo, iso-butilo, tert-butilo, sec-butilo, pentilo, iso-pentilo,hexilo, heptilo, octilo, noniloy deciloy sus correspondientes isómeros.
El término “haloalquilo” comprende preferiblemente alquilos ramificadosy no ramificados, definidos anteriormente,enlos cuales unoomáshidrógenos están reemplazadosdela misma maneraonoporun halógeno(F,Cl,Bro I), preferiblementepor flúor.Particularmente preferible, llamamos haloalquiloa clorometilo, fluoropropilo, fluorometilo, difluorometilo, triclorometilo, trifluorometilo, 2,2,2-trifluoroetilo, pentafluoroetilo, bromobutilo, trifluorometilo, yodoetilo,y sus correspondientes isómeros.
El término “cicloalquilo” comprende preferiblemente un grupoC3-C10,cicloalquilo, más particularmente un grupo cicloalquilo saturado con la medida indicada del anillo, por ejemplo; ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, cicloroctilo, ciclononilo,o ciclodecilo.También comprenden cicloalquilos insaturadosque contengan uno o más dobles enlaces en la cadena carbonada por ejemplo grupos cicloalqueniloC3-C10 como ciclopropenilo, ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, cicloctenilo, ciclononenilo o ciclodecenilo. En lo que respectaalos enlaces,parael restodela molécula,el grupo cicloalquilopuede contener enlaces simpleso doblesesdecir puede estar saturadoo insaturadoypuede ser opcionalmente sustituido unaovariasveces, independientementede los otros grupos por un grupo alquiloC1-C6 y/o un halógeno y/o un grupo -O-Alquilo y/o un grupo -N(alquilo)2-como por ejemplo los grupos2-metilciclopropilo, 2,2-dimetilciclopropilo, 2,2-dimetilciclobutilo,3-hidroxiciclopentilo,3hidroxiciclohexilo, 3-dimetilaminociclobutilo, 3-dimetilaminociclopentiloy4-dimetilaminociclohexilo.
El término “heterocicloalquilo” comprende preferiblemente un grupocicloalquiloC3-C10, definido anteriormente, dondealgunodelos átomosdel anilloesun heteroátomo comoNH,-N(Alquilo)-,O,S o grupos comoC(O),S(O), S(O)2,o bienun grupoCn-ciclo alquilo (dondenesun número entero seleccionado entre3,4,5,6,7,8,9y10) donde uno o más átomos de carbono están sustituidos por los heteroátomos o grupos anteriormente citados para dar un grupoCn-ciclo heteroalquilo; también comprenden los grupos cicloheteroalquilo insaturados que contengan unoo más dobles enlaces en la cadena carbonada, por tanto en lo que respecta a los enlaces, para el resto de la molécula, el grupo cicloheteroalquilo puede contener enlaces simpleso dobles es decir puede estar saturadoo insaturadoypuede seropcionalmente sustituido unaovariasveces,independientementedelos otros gruposporun grupo alquiloC1-C6 y/o un halógeno y/o un grupo -O-Alquilo y/o un grupo NH y/o un grupo -N(Alquilo)-.
Sedefineelusodel término “arilo”encadacasocomoaquellos compuestosque contienendesde6 a20átomos de carbono, preferiblemente6 a18,más preferiblemente entre6y16, átomosdecarbonocomopor ejemplo fenilo, tropilo, indenilo, naftilo, azulenilo, bifenilo, fluorenilo, antracenilo, pirenilo, etc. Preferiblemente es fenilo.
Se define el uso del término “heteroarilo” como un sistema de anillos aromáticos que comprende3-16 átomos, preferiblemente anillos con5ó6ó9ó10 átomos, que contienen como mínimo unheteroátomo que esidénticoo diferentealos heteroátomos anteriormente citados siendopor ejemplo nitrógeno,NH,-N(Alquilo)-,O,Sypuedeser monocíclico, bicíclico, o tricíclico. Además en este caso puede estar benzocondensado. Preferiblemente el heteroarilo está seleccionado entre tienilo, furanilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tia-4H-pirazolilo etc.,y benzoderivados como por ejemplo benzofuranilo, benzotienilo, benzoxazolilo, benzimidazolilo, benzotriazolilo, indazolilo, indolilo, isoindolilo, etc.o piridilo, piridazinilo, pirimidinilo, pirazinilo, triazinilo, etc., otros benzoderivados como por ejemplo quinolinilo, isoquinolinilo, etc.,
o azocinilo, indolizinilo, purinilo, etc.,yademás de otros benzoderivados como cinnolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftpiridinilo, pteridinilo, carbazolilo, acridinilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, xantenilo, o oxapinilo, etc.
El término“C1-C6”se usaenloreferentealtextopor ejemploenel contextodela definición“C1-C6 alquilo”,o“C1C6 alcoxi” comoel grupode alquilosque tienenunnúmero finitode átomosde carbonodesde1a6,es decir1,2,3,4, 5,ó6átomosde carbono.Eltérmino“C1-C6”se interpreta como cualquier subintervalocomprendido entreC1-C6,C2C5,C3-C4C1-C2C1-C3,C1-C4,C1-C5,C1-C6,preferentementeC1-C2,C1-C3,C1-C4,C1-C5,C1-C6;más preferiblemente C1-C3.
De la misma manera el termino usado como “C4-C10” se usa en lo referente al texto por ejemplo en el contexto de las definiciones “C4-C10-cicloalquilo”, se entiende como grupos alquenilo o alquinilo con un numero finito de átomos de carbonode4 a10,es decir4,5,6,7,8,9ó10 átomosde carbono, preferiblemente4,5ó6átomosde carbono.Se entiendequeel término“C4-C10” implica cualquier subrango comprendido entreC4-C9,C5-C8,C6-C7. Preferiblemente C4-C6.
La presenteinvención también comprende los isómeros, isómeros constitucionalesyestereoisómerosde los compuestosde formula (I), fórmula (II)yfórmula (III).
El término isómeros se entiende como diferentes especies químicas o compuestos químicos, con el mismo número ytipode átomos. Existen dosgrandes clasesde isómeros, isómeros constitucionalesyesteroisómeros.
El término isómeros constitucionales se entiende con un significado químico donde los compuestos químicos tienen elmismonúmeroytipode átomosperoestán conectadospor diferentessecuencias.Éstosson isómeros funcionales, isómeros estructurales, tautómeros o isómeros de valencia.
Los estereoisómeros, son aquellos que tienen sus átomos conectados secuencialmente de la misma manera, por tanto las dos fórmulas condensadas de los isómeros son idénticas. Los isómeros difieren en la manera en que los átomos están orientados en el espacio. Existen dos grandes subclases de esteroisómeros; conformacionales, los cuales se pueden interconvertir por rotaciónde enlaces sencillos,yconfiguracionales, los cuales no pueden interconvertirse.
En los isómeros configuracionales están comprendidos los enantiómerosydiastereómeros. Los enantiómeros que están relacionados con los demás ya que son como las imágenes de un espejo a partir de ahora imagen especular. Los enantiómeros deben contener algún númerode centrosesterogénicos,ycada estereocentroesla imagen especular que corresponde al centro de la otra molécula. Si uno o más de estos centros difieren en la configuración, las dos moléculas no son imágenes especulares. Los estereoisómeros que no son enantiómeros, son llamados diastereómeros
o diasteroisómeros.
Para poder limitar los diferentes tipos de isómeros se hace referencia a las normas establecidas por la IUPAC. “IUPACRules SectionE(PuréAppl Chem 45, 11-30, 1976)”.
Alo largodela descripciónylas reivindicacionesla palabra “comprende”y susvariantes no pretendenexcluir otras características técnicas, aditivos, componenteso pasos.Para losexpertos enla materia, otros objetos,ventajas ycaracterísticas de la invención se desprenderán en parte de la descripciónyen parte de la práctica de la invención. Los siguientes ejemplosyfigurasse proporcionana modode ilustración,y nose pretendeque sean limitativosdela presente invención.
Ejemplos
Los soportes sólidos de vidrio se han utilizado en la preparación de cadenas de ARN utilizando un sintetizador automático. Las secuencias diana seleccionadas han sido el gen de la luciferasa, una proteína luminiscente muy utilizada para el análisis del silenciamiento génico por tener un ensayo bioquímico de su actividad enzimática muy robusto.También se ha utilizado como diana el gen delfactor de necrosis tumoral (TNF-α). Esta proteína es un mediadorenla apoptosis,en procesosde inflamacióny enlos procesosde inmunidad. Ademásseha demostradoquela sobreexpresión de TNF-α estáimplicadaenmuchas enfermedades humanas tales como enfermedadde Crohn, artrosis reumatoideyotras enfermedadesdetipo autoinmune.Tambiénla sobreexpresiónde TNF-α empeora el pronóstico del cánceryaquefacilitalaextensióndelas metástasis.Por todo ellola inhibiciónde TNF-α tiene una especial relevancia biomédica.
Se han preparado ambas cadenas, acompañanteyguía, conla modificación enelextremo 3’.De esta manera se puede comparar los resultados obtenidos por la modificacióny las diferencias observadas en la cadena guía serán debido sobretodo a la interacción con RISC ya que sólo la cadena guía se une al complejo RISC. Los monómeros de ARN utilizados estaban protegidos en su posición 2’ por el grupo t-butildimetilsilil (TBDMS). Los rendimientos de acoplamiento de los monómeros fueron de alrededor del 97-98%.Para la eliminación de los protectoresyliberación del ARN del soporte se ha utilizado un protocolo que consta de dos etapas: I) amoniaco concentrado-etanol 3:1 a 55ºC,yII) fluorurode tetrabutilammonio(TBAF)en tetrahidrofurano(THF)a temperatura ambiente.Las secuencias deARNse purificaronporHPLCylosproductos purificadosse caracterizaronpor espectrometríade masas(MALDITOF).
LospARNise prepararon mezclando cadenasequimolaresdelas cadenasguíayacompañante siguiendounprotocolo de hibridación habitual. La estabilidad térmica de los dúplexde pARNi modificados se comparó con la estabilidad térmica del dúplex natural (WT), sin modificar. Los pARNi modificados presentaron una temperatura de fusión(T) igualoligeramentesuperiorala temperaturadefusión(Tm)deldúplexsin modificar sobretodoenalgunoscompuestos aromáticosycuandola modificación estaba enelextremo3’dela cadena guía.
Posteriormentese estudiola estabilidaddelospARNi modificadosalas ARNasaspor incubacióndelosdúplexde pARNi en suero fetal bovino. En todos los casos la estabilidad de los pARNi modificados fue mejor que el pARNi sin modificar (WT).Alas9horas el pARNi sin modificaciones fue digerido por las RNasas del suero mientras que los pARNi modificados estaban aún presentes en la muestra (figura 1).
La actividad de los pARNi modificados se evaluó utilizando el ensayo de las dos luciferasas a diferentes concentracionesydiferentes tiempos.La actividadde los pARNi modificados se comparó conla actividad del pARNi sin modificar.SóloadosismuybajasdepARNiseobservaron diferencias significativas.Enelcasodelíneas celularesSHSY5YyHeLase utilizaron concentraciones320pMy32pM respectivamentepara observar diferencias significativas. Aestas concentracionesse observóuna correlaciónentreeltamañodela modificaciónylaactividad(figura2).
Inhibición de TNF-α
Lascadenas guíayacompañante diseñadas para inhibirel gen del TNF-α sehibridaronylos dúplex resultantes se usaron para el estudio de la inhibición del gen de TNF-α. En primer lugar se estudiaron las propiedades inhibitorias de los pARNi en células HeLa. Estas células no expresan el gen del TNF-α de ratón por lo que se transfectaron con el correspondiente plásmido. Se utilizó el siguiente protocolo: Células HeLa se transfectaron con 250 ng del plásmido conelgenque codificaelTNF-α de ratón (pCAm TNF-α)utilizando lipofectinay1hmastardese transfectaronconel dúplexde pARNi(50nM) utilizando oligofectamina.Al cabode48hla cantidadde TNF-α producido por las células se analizó utilizando un ensayo enzimático (ELISA). En la figura3 se muestra la actividad inhibitoria de los pARNi modificadosenelextremo3’dela cadena acompañante.TantoelpARNi modificadocon acridina comoel modificado con quindolina tienen una actividad inhibitoria semejante o mayor a la actividad inhibitoria del pARNi sin modificar.
Delamisma manerasehan preparadopARNique contienen moléculasde acridinaoquindolinaenelextremo3’de lacadenaguía.Enlafigura4semuestralaactividadinhibitoriadelospARNimodificadosenelextremo3’delacadena guía.Tal como seha descrito con los derivados anteriores con grupos pirenoyantraceno los pARNi modificadoscon acridina o quindolina tienen una actividad inhibitoria ligeramente menor, aunque muestran una excelente estabilidad.
Todaslas reaccionessehanllevadoacabobajo atmósferapositivadeargónyen disolventes anhidros.Los reactivos fueron obtenidosde fuentes comercialesylos disolventes anhidros se utilizaron directamente sin purificación adicional.Algunosdisolventesse destilaronantesdeusoyse secaron utilizandométodosconvencionales.La homogeneidad de los productos obtenidos se confirmó por cromatografía en capa fina (TLC)y se obtuvieron los datos espectroscópicos esperados para cada uno de los compuestos sintetizados. Los desplazamientos químicos se describen en partes por millón (ppm) en relación al singulete del CHCl3 a δ =7,24ppmparalos espectrosdeNMRdeprotónyenlaseñal central del triplete del CDCl3 a δ = 77,0 ppm para los espectros de NMR-13C. Los espectros de IR se midieron en forma de film en un espectrómetro BOMEM MB-120. La cromatografía en capa fina (TLC) se realizó en cromatofolios de gel de sílice (Alugram Sil G/UV). Los espectros de MALDI se obtuvieron en un espectrómetro de masas Fisons VGTofspecyun FisonsVGPlattform II. Los oligonucleótidos se prepararon en un sintetizador automático Applied Biosystems modelo 3400.
Procedimientos Generales de síntesis
ProcedimientoA
Formación de la amida
Los derivados con un grupo ácido carboxílico (1,2 equiv) disueltos en N,N-dimetilformamida (DMF) generando una solución 0.5M se mezclaron con N-hidroxibenzotriazol (1,1 equiv)ydiisopropilcarbodiimide (1,1 equiv)a temperatura ambiente.Despuésdeagitarlamezcla durante5minutosseañadió L-treoninol(1equiv).Lamezclaseagitóa temperatura ambiente durante24hyacontinuaciónse detuvolareacciónpor adiciónde metanol.La mezcla resultante seevaporóa sequedadyel residuose purificópor cromatografíaen columnadegeldesílicedetipo flash.
ProcedimientoB
Introducción del grupo protector DMTr
Una solución0,2M en piridinadel diol resultantedela reacción anterior(1equiv)se enfrióa0ºCenun bañode hielo.Ala solución resultantese añadieron N,N,N-diisopropiletilamina (1,5 equiv), cloruro de 4,4’-dimetoxitritilo (1,2 equiv)y N,N-dimetilaminopiridina (0,1 equiv). Despuésde15 minla mezcla resultante se sacó del bañode hieloy se dejórecuperarla temperatura ambiente dejándose agitando durante24h. Finalmentese detuvola reacciónpor adición de metanol.La mezcla resultante seevaporóa sequedadyel residuo se purificó por cromatografía en columnadegel de sílice de tipo flash.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)pireno-1-carboxamida (1a)
El compuesto 1a se obtuvo siguiendo el procedimiento A. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 4/CH2Cl2 4/MeOH 0,5) se obtuvieron 302 mg(0,906 mmol) de un sólido blanco (79%).
1HNMR (400 MHz,D3OD): 8,53 (d, J= 9,3 Hz, 1H), 8,25 (t, J= 7,5 Hz, 3H), 8,21-8,02 (m, 5H), 4,28 (dt, J= 6,2y3,6 Hz, 1H), 4,18 (dq, J= 6,4y3,6 Hz, 1H), 3,87 (System ABX, JAB = 11,1 Hz, JAX = 5,8 Hz,y JBX =6,6Hz, 2H), 1,38 (d, J= 6,4 Hz, 3H). 13CNMR (100 MHz,D3OD): 173,4, 133,9, 132,8, 132,6, 132,1, 129,7, 129,6, 129,5, 128,3, 127,6, 126,9, 126,8, 126,1, 125,8, 125,61, 125,59, 125,51, 67,5, 63,0, 58,5, 20,8. HRMS m/z: Calculado para C21H20NO3 (M+H+)334,1437, encontrado 334,1449.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il)-pireno-1-carboxamida (2a)
El compuesto 2a se obtuvo siguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 2/EtOAc1) se obtuvieron 133mg (0,209mMol) en formade un sólido blancoy se recuperaron24 mg del compuesto inicial.(Rendimiento 70%,o 92%si se tiene en cuentael compuesto inicial recuperado).
1HNMR (400 Mz, CDCl3):8,62 (d,J= 9,3 Hz, 1H), 8,21 (d, J=7,7Hz, 2H), 8,12(s,3H),8,09(d, J= 2,1 Hz, 1H), 8,04 (t, J= 7,7 Hz, 2H), 7,45 (d, J= 7,6 Hz, 2H), 7,34 (d, J= 8,7 Hz, 4H), 7,28 (t, J= 7,7 Hz, 2H), 7,20 (t, J= 7,2 Hz, 1H), 6,89 (d, J= 8,7 Hz, 1H), 6,81 (dd, J=8,9y2,8Hz,4H), 4,38-4,32(m,1H), 4,28-4,22(m,1H),3,73(s,3H),3,72 (s, 3H), 3,63 (sistema ABX), JAB =9,6Hz, JAX =3,7Hz, JBX =3,6Hz,2H),1,35(d,J= 6,3Hz, 3H). 13CNMR(100 MHz, CDCl3): 170,29, 158,6, 158,5, 144,3, 135,4, 135,2, 132,6, 131,1, 130,7, 130,6, 129,9(4C), 128,7, 128,6, 128,5, 128,0 (2C), 127,9 (2C), 127,0, 126,9, 126,3, 125,8, 125,7, 124,7, 124,5, 124,5, 124,3, 124,2, 113,3 (4C), 86,9, 69,0, 65,6, 55,1 (2C), 54,3, 20,3. HRMS m/z: teórico paraC42H37NO5Na(M+Na+)658,2563, experimental 658,2563.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)antraceno-9-carboxamida (1b)
El compuesto 1b se obtuvo siguiendo el procedimiento A. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 6/CH2Cl2 3/MeOH 0,5) se obtuvieron 273 mg(1,052 mMol) de un sólido amarillento (49%).
1HNMR (400 MHz,D3OD): 8,56 (s, 1H), 8,27-8,15 (m, 2H), 8,06 (d, J= 8,3 Hz, 2H), 7,57-7,47 (m, 4H), 4,40 (ddd, J= 6,7, 5,6y3,9 Hz, 1H), 4,15 (dq, J= 6,4y3,8 Hz, 1H), 3,87 (ABXSystem: JAB = 11,0 Hz, JAX =5,6Hz, JBX = 6,9 Hz, 2H), 3,35 (s, 1H), 1,39 (d, J= 6,4 Hz, 3H). 13CNMR (100 MHz,D3OD): 172,7, 133,5, 132,7, 129,6 (2C), 129,3,129,2(2C),127,7(2C),126,6(4C), 126,4,67,4,63,0,58,8,20,9.HRMSm/z:teóricoparaC19H19NNaO3(M+ Na)+ 332,1257, experimental 332,1258.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il)-antraceno-9-carboxamida (2b)
El compuesto 2b se obtuvo siguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 3/EtOAc1) se obtuvieron 130mg (0,213 mMol) en formade un sólidoblanco (62%).
1HNMR (400 Mz, CDCl3): 8,48 (s, 1H), 8,11 (bs, 1H), 8,01 (d, J= 9,2 Hz, 2H), 7,47(t, J= 8,2 Hz, 2H), 7,41 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,31 (d, J= 8,8 Hz, 4H), 7,26 (t, J= 7,4 Hz, 2H), 7,21 (d, J= 7,0 Hz, 1H), 6,80 (d, J= 8,8 Hz, 4H), 6,73 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 4,49 (td, J=7,3y3,9Hz,1H),4,16(m,1H),3,77(s,3H),3,76(s,3H),3,62 (sistemaABX, JAB = 9,6 Hz, JAX =3,6Hz, JBX = 4,4 Hz, 2H), 3,07 (s, 1H), 1,35 (d, J= 6,3 Hz, 3H). 13CNMR (100 MHz, CDCl3): 169,9, 158,6 (2C), 144,2 (2C), 135,4, 135,1, 131,7, 131,1 (2C), 130,0 (3C), 129,9 (3C), 128,5 (2C), 128,3, 128,1, 128,0 (2C), 127,9 (2C), 127,0, 126,7 (2C), 125,4, 125,2, 113,3 (2C), 113,2 (2C), 86,9, 68,8, 65,5, 55,2 (2C), 54,6, 20,6. HRMS m/z: teórico paraC40H37NNaO5(M+Na)+ 634,2564, experimental 634,2570.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)-1-naftamida (1c)
El compuesto1c se obtuvo siguiendo el procedimiento A. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 6/CH2Cl2 3/MeOH 0,5) se obtuvieron273mg (1,052 mMol)de un sólido amarillento (92%).
1H-NMR (400 MHz,D3OD): 8,26 (d, J = 9,1 Hz, 1H), 7,95 (d, J= 8,3 Hz, 1H), 7,90 (d, J= 7,3 Hz, 1H), 7,69 (d, J= 7,0 Hz, 1H), 7,57-7,47 (m, 3H), 4,21-4,16 (m, 1H), 4,15-4,09 (m, 1H), 3,79 (Sistema ABX; JAB = 11,1 Hz, JAX =5,8Hz, JBX = 6,5 Hz, 2H), 1,30(d, J= 6,4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz,D3OD): 173,1, 136,1, 135,3, 131,7, 131,6, 129,6, 128,2, 127,6, 126,6, 126,5, 126,1, 67,6, 63,1, 58,4, 20,9. HRMS m/z: teórico paraC15H18NO3(M+H+ ) 260,1281, experimental 260,1291.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il)-1-naftamida (2c)
El compuesto 2c se obtuvo siguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 3/EtOAc1) se obtuvieron 146mg (0,259 mMol) en formade un sólidoblanco (31%).
1H-NMR (400 Mz, CDCl3): 8,37-8,32 (m, 1H), 7,95 (d, J= 8,2 Hz, 1H), 7,92-7,87 (m, 1H), 7,66 (dd, J= 7,0y1,1 Hz, 1H), 7,56-7,52 (m, 2H), 7,48 (dd,J = 8,2y7,1 Hz, 1H), 7,40 (d, J= 7,2 Hz, 2H), 7,31 (d, J= 8,9 Hz, 4H), 7,26 (t, J= 7,3 Hz, 2H), 7,20 (t, J= 7,1 Hz, 1H), 6,80 (dd, J= 8,8y3,7 Hz, 4H), 6,71 (d, J= 8,8 Hz, 1H), 4,28-4,24 (m, 1H), 4,23-4,18 (m, 1H), 3,76 (s, 3H), 3,75 (s, 3H), 3,56 (sistema ABX, JAB =9,7Hz, JAX =3,8Hz, JBX = 3,6 Hz, 2H), 3,17 (s, 1H), 1,29 (d, J= 6,34 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 169,8, 158,7, 158,6, 144,2, 135,4, 135,2, 134,4, 133,7, 130,7, 130,1, 129,9 (4C), 128,3, 128,0 (2C), 127,9 (2C), 127,2, 127,0, 126,4, 125,5, 124,9, 124,7, 113,3 (4C), 86,9, 69,1, 65,7,55,2 (2C), 53,9,20,2. HRMSm/z: teórico paraC36H35NNaO5(M+Na)+ 584,2407, experimental 584,2402.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)-4-(trifluorometil)benzamida (1d)
El compuesto 1d se obtuvo siguiendo el procedimiento A. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 4/CH2Cl2 4/MeOH 0,5) se obtuvieron 157 mg(0,566 mMol) de un sólido blanco (60%).
1H-NMR (400 MHz,D3OD): 8,03(d, J= 8,2 Hz, 2H), 7,78 (d, J= 8,2 Hz, 2H), 4,14-4,04 (m, 2H), 3,75 (sistema ABX: JAB = 11,2 Hz, JAX =5,6Hz, JBX = 6,2 Hz, 2H), 1,22 (d, J= 6,2 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz,D3OD): 169,4, 139,7, 134,1 (q, JF−C = 32,4 Hz, 1C), 129,3 (2C), 126,5 (q, JF−C = 3,8 Hz, 2C), 124,0, 67,3, 62,8, 58,4, 20,6. 19F-NMR (376 MHz,D3OD): -64,86. HRMS m/z: teórico paraC12H15NO5F3(M+H+)278,0998, experimental 278,0999.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il)-4-(trifluorometil)benzamida (2d)
El compuesto 2d se obtuvo siguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 3/EtOAc1) se obtuvieron 580mg (0,828 mMol) en formade un sólidoblanco (77%).
1H-NMR (400 Mz,CDCl3): 7,89 (d, J= 8,1 Hz, 2H), 7,73 (d, J = 8,2 Hz, 2H), 7,38 (d, J = 7,2 Hz, 2H), 7,307,18 (m, 4H), 6,79 (dd, J=8,8y6,8Hz, 2H), 4,28-4,20(m, 1H),4,15-4,10(m, 1H), 3,76(s, 3H), 3,75(s, 3H), 3,49 (System ABX: JAB =9,8Hz, JAX =4,2Hz, JBX = 3,4 Hz, 2H), 3,07 (s, 1H), 1,21 (d, J= 6,4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 166,3, 158,6 (2C), 144,2, 137,6, 135,3,135,2, 133,3 (q, JF−C = 32,8 Hz, 1C), 129,9 (2C), 129,8 (2C), 128,0 (2C), 127,8 (2C), 127,4 (2C), 127,0, 125,7 (q, JF−C = 3,8 Hz, 2C), 124,9, 113,3 (2C), 113,2 (2C), 86,9, 68,5, 65,2, 55,1 (2C), 54,0, 20,1. 19F-NMR (376 MHz, CDCl3): -63,36. HRMSm/z: calculado paraC33H32F3NNaO5(M+ Na)+ 602,2125, encontrado 602,2126.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)-4-fluorobenzamida (1e)
El compuesto1e se obtuvo siguiendo el procedimiento A. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 5/CH2Cl2 4/MeOH 0,5) se obtuvieron180mg (0,792 mmol)de un sólido blanco (69%).
1H-NMR (400 MHz,D3OD): 7,92 (dd, J= 8,8y5,4 Hz, 2H), 7,20(t, J= 8,7 Hz, 2H), 4,13-4,02 (m, 2H), 3,73 (sistema ABX, JAB = 11,2 Hz, JAX =5,9Hz, JBX = 6,3 Hz, 2H), 1,21 (d, J = 6,4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, D3OD): 169,5, 166,2(d, JF−C = 250,5 Hz, 1C), 132,1, 131,0 (d, JF−C=8,9Hz, 2C),116,4(d, JF−C = 22,1 Hz, 2C),67,3, 62,8, 58,2, 20,6. 19F-NMR (376 MHz,D3OD): -111,2. HRMS m/z: teórico paraC11H15NO3F(M+H+)228,1030, experimental 228,1035.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il)-4-fluorobenzamida (2e)
El compuesto 2e se obtuvo siguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 3/EtOAc1) se obtuvieron 313mg (0,591 mmol) en formade sólido blanco (45%).
1H-NMR(400 Mz, CDCl3): 7,81 (dd, J= 8,8y5,3 Hz, 2H), 7,37 (d, J= 7,1 Hz, 2H), 7,30-7,18 (m, 7H), 7,14 (t, J= 8,6 Hz, 2H), 6,79 (dd, J= 8,9y6,8 Hz, 4H), 4,21 (d, J= 6,3 Hz, 1H), 4,15-4,05(m, 1H), 3,77 (s,3H), 3,76 (s, 3H), 3,56 (dd, J= 9,7y4,2 Hz, 1H), 3,38 (dd, J= 9,7y3,4 Hz, 1H), 3,13 (s, 1H), 1,20 (d, J= 6,37 Hz, 3H). 13CNMR (100 MHz, CDCl3): 166,6, 164 (d, JF−C = 252 Hz, 1C), 158,6 (2C), 144,2, 135,4, 135,2, 130,5 (d, JF−C = 3,2 Hz, 1C), 129,9 (2C), 129,8 (2C), 129,3 (d, JF−C= 8,9 Hz, 2C), 128,0 (2C), 127,8 (2C), 127,0, 115,6 (d, JF−C = 21,8 Hz, 2C), 113,3 (4C), 86,9, 68,9, 65,5, 55,2 (2C), 53,9, 20,0.
19F-NMR(376MHz,CDCl3):-108,44.HRMSm/z: teóricoparaC32H32NO5FNa(M+Na+)552,2156,experimental 552,2143.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)-acetamida (1f)
El compuesto 1f se obtuvo siguiendo el procedimiento A. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 4/CH2Cl2 4/MeOH 0,5) se obtuvieron 159 mg(1,08 mmol) en forma de aceite incoloro (76%).
1HNMR (400 MHz,D3OD): 4,04-3,94 (m, 1H), 3,84-3,76 (m, 1H), 3,61 (sistema ABX, JAB = 11,0 Hz, JAX =5,9 Hz, JBX = 6,3 Hz, 2H), 2,00 (s, 3H), 1,14 (d, J= 6,4 Hz, 3H). 13CNMR (100 MHz,D3OD): 173,8, 67,2, 62,8, 57,6, 22,7, 20,4.
HRMS m/z: teórico paraC6H14NO3(M+H+)147,0895, experimental 147,1325.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il)-acetamida (2f)
El compuesto 2f se obtuvo siguiendo elprocedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (ciclohexano 1/EtOAc3) se obtuvieron 137mg (0,29 mmol) en formade sólido amarillento (27%).
1H-NMR (400 Mz, CDCl3): 7,38 (d, J = 7,3 Hz, 2H), 7,27 (d, J = 8,8 Hz, 6H), 7,22 (t, J = 7,2 Hz, 1H), 6,83 (d, J = 8,74 Hz, 4H), 6,05 (d, J = 8,7 Hz, 1H), 4,15-4,06 (m, 1H), 3,94-3,88 (m, 1H), 3,79 (s, 6H), 3,35 (sistema ABX, JAB =9,7Hz, JAX =4,4Hz, JBX = 3,5 Hz, 2H), 3,02 (s, 1H), 2,02 (s, 3H), 1,13 (d,J = 6,4 Hz, 3H). 13C-NMR (100 MHz, CDCl3): 170,4, 158,7 (2C), 144,3, 135,5, 135,3, 129,9 (2C), 129,8 (2C), 128,0 (2C), 127,9 (2C), 127,0, 113,3(4C),86,9,68,7,65,4,55,2(2C),53,4,23,3,19,9.HRMSm/z: teóricoparaC27H31NNaO5(M+Na)+ 472,2100, experimental: 472,2096.
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il)acridina-9-carboxamida (1g)
El compuesto 1g se obtuvo siguiendo el procedimiento A, a partir de 0,95 mmol del ácido. Al finalizar la purificación por cromatografíade tipo flash(0-2% gradientede metanol enCH2Cl2)se obtuvieron 0,69g(0,66 mmol) de un sólido amarillento (70%). UV(λ max):249,343,359y385 nm. Espectrode fluorescencia:exc:385nm,em: 433 nm.1H-NMR [CDCl3, δ, ppm]: 8,82 (m, 1H, NH), 8,35 (m, 2H), 8,05 (m, 2H), 7,8 (m, 2H), 7,6 (m, 2H), 5,3 (s, 2H, OH), 4,21 (m, 1H, CH), 3,85 (m, 1H, CH), 3,49 (m, 2H, CH2), 1,26 (d, 3H, CH3). MS (Cl/NH3)teórico para C18H20N2O3 312,1 experimental 311,1.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-methoxyphenyl)(phenyl)methoxy)-3-hydroxybutan-2-yl]acridine-9-carboxamide (2g)
El compuesto 2g se obtuvo siguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (0-2% metanol en CH2Cl2 con un 1% de trietilamina) se obtuvieron 490 mg (0,80 mmol) en forma de sólido amarillento (60%). 1H-NMR [CDCl3, δ, ppm]: 8,3-8,2 (m, 2H), 8,1 (m, 2H), 7,8 (m, 2H), 7,5-7,1 (m, 11H), 6,8-6,7 (m, 4H), 4,5 (m, 1H, OH), 4,2 (m, 1H), 3,7 (m, 7H), 3,5 (m, 2H, CH2), 1,1 (d, 3H, CH3).
N-[(2S,3R)-1,3-dihidroxibutan-2-il]-10H-indolo[3,2-d]quinolina-11-carboxamida, (1h)
Elcompuesto1hse obtuvo siguiendoel procedimientoA,apartirde0,95mmoldel ácido.El productofue cristalizadode cloroformo obteniendo300mg(0,85mmol)deun sólido amarillento(90%).UV(λ max): 276, 306, 347 y400nm. Espectrodefluorescenciaexc:347nm,em:495nm. 1H-NMR[DMSO-d6, δ, ppm]: 8,41 (ancho d, 1H, NH), 8,2 (m, 2H), 7,9 (m, 1H), 7,3-7,6 (m, 5H), 5,44 (ancho, 2H, OH), 4,14 (m, 1H, CH), 3,99 (m, 1H, CH), 3,4-3,6 (m, 2H, CH2), 1,21 (d, J=6,6Hz,3H,CH3).MS (Cl/NH3)teórico paraC20H19N3O3 349,1experimental 350,1.
N-[(2S,3R)-1-(bis(4-metoxifenil)(fenil)metoxi)-3-hidroxibutan-2-il]-10H-indolo[3,2-d]quinolina-11-carboxamida (2h)
El compuesto 2h se obtuvosiguiendo el procedimiento B. Al finalizar la purificación por cromatografía de tipo flash (0-2% metanol en CH2Cl2 con un 1% trietilamina) se obtuvieron 110 mg (0,17 mmol) en forma de sólido amarillento (55%). 1H-NMR [CDCl3, δ-ppm]: 9,3(s, 1H), 8,5 (d, 1H), 8,3 (d, 1H), 8,4 (d, 1H), 7,7-7,2 (14 H, aromáticos), 6,8 (m, 4H),4,4(d, 1H),4,2(m, 1H),3,8(m, 1H),3,7(s, 6H),3,3(s, 1H),1,1(d, 3H).
ProcedimientoC
Funcionalización del CPG(DosPasos)(3)
PasoI
Se hicieron reaccionar los alcoholes 2a-h(1equiv)disueltos en diclorometano (0,2M)con anhídrido succínico (1,3 equiv) en presencia de diisopropiletilamina (1,4 equiv)y N,N-dimetilaminopiridina (DMAP) (0,1 equiv). La mezcla dereacciónseagitó durantetodalanochea temperatura ambiente.Lamezclade reacciónsediluyócon diclorometano (5 mL)yla capa orgánica se lavó con una solución acuosa al 1% de Na2HPO4. La capa orgánica se seco con sulfato sódicoyel disolventeseevaporóa sequedad.Los productos obtenidos (hemisuccinatos)se utilizaron directamentesin más purificación.
Paso II
Se disolvió 2,2-Ditio-bis-(5-nitropiridina) (DTB, 0,1 mmol) en 400 µLde acetonitriloyla solución se mezcló con una solución que conteníael hemisuccinato (0,1 mmol)y DMAP (0,1mmol) en acetonitrilo (500 µL). Finalmente se añadió una solución de trifenilfosfina (TPP) (0,1 mmol) disuelta en acetonitrilo (200 µL), todo ello a temperatura ambiente.
Lamezclaseagitóvigorosamente duranteunossegundosyseañadióaunajeringaque conteníaelsoportepoliméricode vidriode poro controlado(LCAA-CPG)(500mg,0,05mmolde grupos amino)y sedejó reaccionar durante 2h a temperatura ambiente. La reacción se detuvo por adición de metanol (500 µL). El soporte polimérico se lavó con metanol(3x10mL), acetonitrilo(3x10mL)ydietiléter(3x10mL).El soportesesecóalvacíoy se bloquearon losgrupos aminos residuales por acetilación con una mezcla de anhídrido acético/piridina/tetrahidrofurano (500 µL) y1-metilimidazolen tetrahidrofurano (500 µL). Al cabo de 30 minutos, el soporte polimérico se lavó con metanol (3x10 mL), acetonitrilo(3x10 mL)ydietil éter (3x10 mL). El soporte resultante se secó primero al aireydespués aplicando vacío. El soporte polimérico se almacenó a 4ºC. El grado de funcionalización de los soportes se determinó por eliminaciónde los grupos DMTr en una pequeña alícuotayleyendola absorbancia del catión DMTra 500 nm desprendidos de los soportes durante la eliminación. El grado de funcionalización de los soportes preparados estuvo entre 15-35 nmol/g.
Síntesis de oligonucleótidos
Los oligoribonucleótidos se prepararon utilizando un sintetizador de la casa comercial Applied Biosystems modelo 3400 utilizando fosforamiditos de2-cianoetiloylos protectores de tipo tert-butildimetilsilil (TBDMS) para la proteccióndel grupo hidroxilo en la posición 2’. Se utilizaron las siguientes soluciones: 0,4M1H-tetrazol enACN (catalizador); 3% ácido tricloroacético en DCM (destritilación), anhídrido acético/piridina/tetrahidrofurano (1:1: 8) (capping A), 10% N-metilimidazolin tetrahidrofurano (cappingB),0,01Miodoen tetrahidrofurano/piridina/agua(7:
2:1) (oxidación).Enlas secuenciasdeARN,se eliminóelúltimoDMTyaqueel grupoDMTnoestotalmente estable al tratamientode fluoruro.El rendimientomediopor etapade adicióndeun nucleótidosfue alrededordel 97-98%para los monómeros de ARN. Los soportes poliméricos obtenidos se trataron con una solución concentrada de amoniacoetanol(3:1)durante1ha55ºC.Lossoportesselavaronconetanolylassoluciones resultantesse combinaronyseevaporaronasequedad.Los productos resultantesse trataron con0,15mlde trietilaminatris(hidrofluoruro)/trietilamina/Nmetilpirrolidona (4:3:6) durante2,5h a 65ºC conel finde eliminar los grupos TBDMS. Las reacciones se detuvieron por adiciónde0,3mlde isopropoxitrimetilsilanoy0,75mLdeéter.Las mezclas resultantesse agitaronyse enfriaron a 4ºC.Se formó unprecipitado que fue centrifugadoa 7000 rpm durante5 mina 4ºC. Los precipitados selavaron con étery se centrifugaronde nuevo. Los residuos se disolvieron en aguaylos conjugados se purificaron por HPLC. Columna: Nucleosil 120-10C18 (250x4 mm); se utilizó un gradiente linealde20 min desde0%a 50%B; con un flujo de3mL/min. Las composiciónde las soluciones utilizadas enel HPLC fueron: soluciónA:5% acetonitrilo(ACN) en 100mM acetatode trietilamonio(pH6,5)ysoluciónB:70%ACNen100mM acetatode trietilamoniopH6,5.Los productos purificados se analizaron por espectrometría de masas MALDI-TOF.
Los espectros de MALDI-TOF se realizaron en un espectrómetro de masas PerseptiveVoyager DETMRP,equipado conun láserde nitrógenode337nm utilizandounpulsode3ns.Lamatriz utilizada contenía2,4,6-trihidroxiacetofenona(THAP,10mg/mlenACN/agua1:1)ycitrato amónico(50mg/mlenagua).
TABLA1
Análisis por espectrometría de masas de los oligonucleótidos sintetizados
Experimentos de desnaturalización de las hebras de pARNi
La hibridación de los dúplexes de pARNi se llevó a cabo por incubación a 90ºC de una solución 20 µM de las cadenas guíayacompañante en tampónde hibridación (100mM acetatode potasio,2mM acetato magnésico30mM HEPES-KOHapH 7,4) durante1minyenfriamiento lento hasta alcanzarla temperatura ambiente.
Los experimentos de desnaturalización se siguieron en un espectrofotómetro de luz UV. Los pARNis (0,5 µM) se disolvieron en solución tampón (50 mM acetato de potasio,1 mM acetato magnésico, 15 mM HEPES-KOH at pH 7,4). Los experimentos se realizaron en cubetas de cuarzo de 1 cm de camino óptico con un tapón de teflón en un espectrofotómetro de luz UV Jasco V-650 equipado con programador de temperaturas. El experimento de desnaturalización se realizóa unavelocidadde 1ºC/mindesde 20ºC hasta 90ºC, registrandola absorcióna 260nm. En todos los casos se observó una curva que se ajustó a un proceso de dos estados. Los datos se analizaron por el programade desnaturalización MeltWinv.3,0.Las temperaturasde fusión(Tm)se determinaronpor ordenadorpor ajuste de la primera derivada de la absorbancia con respecto al inverso de la temperatura.Todas las determinaciones se hicieron por triplicado.
(Tabla pasa a página siguiente) TABLA2
Temperaturasde fusión (Tm,ºC)de los derivadosde ARN diseñados parala inhibiciónde luciferasa,yque contienen moléculas alifáticasy aromáticasensuextremo3’unidasporuna moléculapuentedetipoL-treoninol
TABLA3
Temperaturas de fusión (Tm, ºC) de los derivados de ARN diseñados para la inhibición de TNF-α yque contienen moléculasde acridinayquindolinaenelextremo3’ unidaspor una molécula puentedetipotreoninol
Estabilidad en suero
LaestabilidaddelospARNien suerosellevóacabopor incubacióna37ºCde5 µLde los pARNi que se añadieron a 45 µLde suero fetalbovino. Despuésde un periodo determinadode tiempo10µLde la mezcla se añadieron a 15µL de solución tampónde electroforesisyla mezcla resultante se congeló.
Las muestras se cargaron en un gel de poliacrilamida desnaturalizante: acrilamida/bisacrilamida 19:1 (25 mL), formamida(12,5mL),TBE10X(5mL),agua(5mL)yelgel resultantesetiñóconSYBRGreenII.
Cultivos celulares,transfecciónyensayos celulares. Ensayode luciferasa
Células SH-SY5YyHeLa se cultivaron en condiciones habituales: 37ºC, 5% CO2 en medio Eagles’s modificado por Dulbecco (DMEM, GIBCO) suplementado con 10% suerobovino fetal(FBS), 100 U/mL penicilinay100 µg/mL estreptomicina. Las células se mantuvieron en crecimiento exponencial. Las células se sembraron en placas de 24pocillos (0,5 mL medio/pocillo) hasta alcanzar alrededor del 50% de confluencia para la transfección. Las células se incubaron durante24hyel medio celularse cambióa OPTIMEM1(GIBCO),0,5 mL/pocillo.Seutilizarondos plásmidos que contienen los genesde dos luciferasas: luciferasadeluciérnaga(Photinus pylaris)(pGL2)yluciferasa deRenilla(Renilla reniformis)(pRL-CMV) de la casa comercial Promega. Uno de los genes actúa como gen informador de la inhibición (el gen de luciferasa de luciérnaga incluido en pGL2) ya que el pARNi es complementario a este gen. El gen de luciferasade Renilla incluido en el plásmido pRL-CMV se utiliza como control. La co-transfeccióndelos plásmidosylospARNissellevoacabocon lipofectamina2000(Invitrogen) siguiendolas instrucciones delfabricante para líneas celulares adherentes.En cada pocillo,se añadieron1,0 µg pGL2, 0,1 µg pRL-CMVy la cantidad requerida de pARNis, formulada con liposomas. El volumen final fue de 500 µLpor pocillo. Las células se aislaron24hr despuésdela transfecciónyfueron lisadas por lisis pasivautilizandoel tampónde lisis (PLB), 100 µL por pocillo, siguiendo las instrucciones defabricante del equipo del sistema de ensayo de las dos luciferasas (Dual-Luciferase Reporter Assay, Promega,USA). Las actividadesde luciferasa en las muestras se midieron en un Luminómetro Fluoroskan AscentFL (Thermo ElectronCorporation, USA) con un tiempode demorade2 sy un tiempode integración de 10 s. Se utilizaron 20 µLde muestray30µLde cada uno de las soluciones que contienen los sustratos delas luciferasas(luciferase assay reagentIIyStop&Glo Reagent).Laactividadinhibitoria generadaporlospARNis se muestran como cantidades normalizadas entre las actividades delgen de la luciferasa de luciérnaga que es elgen informadordela inhibición(GL2, Photinus pylaris)yel gen control de luciferasa de renilla RL(Renilla reniformis).
Oligoribonucleótidos controles utilizados en la inhibición de TNF-α
Las siguientes secuencias de ARN se obtuvieron de fuentes comerciales(Sigma-Proligo, Dharmacon): cadena antisense o guía control negativo 5’-CAGUCGCGUUUGCGACUGGTT-3’ (SEQ ID NO: 3), cadena sense o acompañante control negativo 5’-CCAGUCGCAAACGCGACUGTT-3’ (SEQ ID NO: 4), cadena antisense o guía antiTNF-α:5’-GAGGCUGAGACAUAGGCACTT-3’ (SEQID NO:1)ycadena senseo acompañante anti-TNF-α: 5’GUGCCUAUGUCUCAGCCUCTT-3’ (SEQ ID NO: 2). Los monómeros de tipo ARN se detallan en letras mayúsculas,la abreviaciónTcorrespondea timidina. Las secuenciasde pARNi anti-TNF-α habían sido descritas pARNi en la bibliografía para inhibir el ARN mensajero de TNF-α de ratón[S D.R. Sorensenycol. Gene silencingby systemic delivery of synthetic siRNAin adult mice. Journal of Molecular Biology 327 (2003) páginas 761-766].
Cultivos celulares, transfecciónyensayos celulares
Células HeLa se cultivaron en condiciones habituales: 37ºC, 5% CO2, medio de Dulbecco Eagle modificado, 10% suero fetalbovino,2mML-glutamina, suplementado con penicilina (100 U/ml)yestreptomicina (100 mg/ml).Todos losexperimentossehicierona una confluenciadel 40-60%.Las célulasHeLase transfectaron con250ngdel plásmido que expresa el gen de TNF-α de ratón utilizando lipofectina(Invitrogen)ysiguiendo las instrucciones delfabricante.
Al cabo de una hora después de la transfección, las células HeLa que expresan m-TNF-α se transfectaron con 50nMde pARNi(SEQID NO:1ySEQID NO:2) diseñado para inhibir TNF-α, utilizando oligofectamina (Invitrogen). La concentración deTNF-α en los sobrenadantes del cultivo celular se determinó utilizando el ensayo de immunoabsorciónligadoa enzimas (ELISA) (Bender MedSystems) siguiendolasinstruccionesdelfabricante.

Claims (43)

  1. REIVINDICACIONES
    1. Un compuesto depARNiy un grupoRunidos covalentemente entre sí representados porla siguiente fórmula
    (I):
    donde:
    Yes un dúplex de pARNi unido mediante un enlace tipo fosfato a X;
    Rse selecciona entre alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, ariloyheteroarilo, estandoRopcionalmente sustituido conal menosun grupo seleccionado entre halógeno(F,Cl,Br,I), haloalquilo, alquilo,C2-C5 alquenilo, heterocicloalquilo, -NO2, -CN, -CO2Ra, -CORb, -SRc, -CONRdRe, -NRfRg, -ORhy-SO2NRiRj, dondeRa,Rb,Rc,Rd,Re,Rf, Rg,Rh,RiyRj, se seleccionan independientemente entreH, metilo, etilo, propilo, isopropilo,butiloe isobutilo;
    Xes una molécula puente unidaal dúplexde pARNi(Y) medianteel enlacetipo fosfatoala posición3’dela cadena guía o acompañante.
  2. 2.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porque R es metilo, etilo, propilo, isopropilo,butiloo isobutilo.
  3. 3.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porqueR es metiloo etilo, preferiblemente es metilo.
  4. 4.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el grupo X-Restá unido a la posición terminal 3’ de la cadena guía.
  5. 5.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación 1, caracterizado porqueR es ciclobutilo, ciclopentiloo ciclohexilo.
  6. 6.El compuestodepARNisegúnlareivindicación1, caracterizado porqueRes fenilo, naftilo, antraciloo pireno.
  7. 7.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porqueRes feniloo naftilo, preferiblemente fenilo.
  8. 8.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación 1, caracterizado porque cuando R es heteroarilo se selecciona del grupo formado por acridinilo, quindolinilo, quinolinilo, tienilo, pirrolilo, oxazolilo, tiazolilo, imidazolilo, pirazolilo, isoxazolilo, isotiazolilo, oxadiazolilo, triazolilo, tiadiazolilo, tia-4H-pirazolilo, benzofuranilo, benzotienilo, benzoxazolilo, benzimidazolilo, benzotriazolilo, indazolilo, indolilo, isoindolilo, piridilo, piridazinilo, pirimidilo, pirazinilo, triazinilo, isoquinolinilo, azocinilo,indolizinilo, purinilo, cinnolinilo, ftalazinilo, quinazolinilo, quinoxalinilo, naftapiridinilo, pteridinilo, carbazolilo, fenazinilo, fenotiazinilo, fenoxazinilo, xanteniloyoxapinilo.
  9. 9.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porque cuando R es heteroarilo se selecciona del grupo formado por acridinilo, quindolinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, pteridiloyftalazinilo.
  10. 10.El compuestode pARNi según cualquierade las reivindicaciones5 a9, caracterizado porque el grupoX-R está unido a la posición terminal 3’ de la cadena guía.
  11. 11.El compuestode pARNi según cualquierade las reivindicaciones5 a9, caracterizado porque el grupoX-R está unido a la posición terminal 3’ de la cadena acompañante.
  12. 12. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque R está sustituido conal menosungrupo seleccionado entreF,Cl,Br,IyC1-C3 haloalquilo.
  13. 13.El compuestodepARNisegúnlareivindicación anterior, caracterizado porqueRestá sustituido conal menos ungrupo seleccionado entreF,Cl,Br,I,-CH2F,-CHF2,-CF3,-CCl3y-CBr3.
  14. 14.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porqueRestá sustituido conal menos un grupo seleccionado entreF, -CH2F, -CHF2y-CF3, preferiblementeFy-CF3.
  15. 15.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porqueR es un grupoC1-C6 alquilo sustituido conal menos un grupoF, preferiblemente un grupoC1-C3 alquilo sustituido conal menos un grupoF, más preferiblementeR es un grupo -CF3.
  16. 16.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación anterior, caracterizado porqueResun grupo arilo sustituidoal menos conun grupoFo-CF3,preferiblementeun grupofenilo sustituido conun grupoFo-CF3,ymás preferiblemente Res 4-fluorofenilo o 4-trifluorometilfenilo.
  17. 17.
    El compuesto de pARNi según la reivindicación 1, caracterizado porqueR se seleccionadeentre unode los siguientes grupos:
  18. 18.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto de formula (I) comprende un compuesto de fórmula (II):
    donde: Wesgrupoopcional,yesuno,ovarios, sustituyentesquepuedehaberencadaunidaddemetilenoyse selecciona,
    o seleccionan independientemente, entreH,C1-C3 alquilooZ3; Z1,Z2yZ3 se seleccionan independientemente entre -OH, -O-R, -NHC(=O)Ry-NH2; R1yR2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C6-alquilo; n es un número entero que se selecciona entre1,2,3,4y5; m es un número entero que seselecciona entre0,1,2,3y4; Yes según se ha definido en las reivindicaciones anteriores; Rse selecciona independientemente entre losRdefinidos en las reivindicaciones anteriores.
  19. 19. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque presenta la fórmula (III):
    donde:
    Y,R,Z2,R1,R2,W, nym son según se han definido en las reivindicaciones anteriores.
  20. 20.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizado porquen es un número entero que se selecciona entre1,2y3, preferiblementen es1.
  21. 21.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizado porque m es un número entero que se selecciona entre0,1y2, preferiblementem es0.
  22. 22.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizado porqueR1y R2 se seleccionan independientemente entreHyC1-C3-alquilo, preferiblemente entreHymetilo.
  23. 23.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el compuesto puente proviene de una molécula de treoninol, glicerol,2-amino-1,3-propandiol,2-amino-1,4-butandiol, 3-amino-1,4-butandiol, 3,-amino-1,2-propandiol, hidroxiprolinol o serinol, preferiblemente proviene de treoninol.
  24. 24.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las cinco reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende alguna de las siguientes estructuras:
  25. 25.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el oligonucleótidode pARNi(Y) tieneentre15y40 nucleótidos.
  26. 26.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplex de pARNi(Y) tiene entre15y40 nucleótidos por cadena.
  27. 27. El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplex de pARNi(Y) tiene entre19y25 nucleótidospor cadena.
  28. 28.El compuestodepARNisegún cualquieradelasreivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplexde pARNi comprende al menos una sustitución seleccionada entre 2’-O-metilo-ribonucleótido, 2’-desoxirribonucleótido, 2’-metoxietil-ribonucleótido, 2’-fluoro-desoxirribonucleótido, 2’-fluoro-arabinonucleótido, ARN con enlaces fosforotioato, residuos abásicos,ribitoles,5-metilcitosina, 5-metiluracilo, 4-alquinilcitosina, 5-alquiniluracilo,5-halogenocitosina, 5-halogenouracilo, 7-deazaadenina, 7-deazaguanina o hipoxantina.
  29. 29.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque dicho dúplexdesiARN(Y) inhibe/silencia, totalo parcialmente,laexpresióndeal menos unodelos siguientes genesfactorde necrosis tumoral alfa (TNFα),factorde crecimiento endotelialy vascular (VEGF), receptorde VEGF (VEGF R1/2), factor supresorde coloniasde granulocitos(GM-CSF-1)yde macrófagos(M-CSF-1), angiopoietina (ANGPT),apolipoproteína (ApoB), neovascularización vascular (CNV), carboxiquinasa fosfoenol piruvato (PEPCK), receptor del factorde crecimiento epidérmico humano (HER2), proteína inflamatoriade macrófagos (MIP2), receptordeN-metilDaspartato(NMDA),citoquinaderivadasdeloskeratocitos(KC),receptoropiodedelta(DOR),receptordeldominio de discoidina(DDR41),gendela fosfoproteínaPIV (PIV-P), oxigenasahemo(HMOX1),caveloina, transportadorde dopamina, proteína fluorescenteverdeyproteína del sarcomade Swing (EWS-FL/1).
  30. 30.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el dúplex depARNi(Y) inhibe/silencia, totalo parcialmente,almenos unode los siguientes genesfactorde necrosis tumoral alfa (TNFα),factorde crecimiento endotelialyvascular(VEGF), receptorde VEGF (VEGF R1/2),factor supresorde coloniasde granulocitos(GM-CSF-1)yde macrófagos (M-CSF-1).
  31. 31.
    El compuesto de pARNi según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la secuencia depARNise seleccionaentreSEQIDNO:5,SEQIDNO:6,SEQIDNO:2ySEQIDNO:1.
  32. 32. Un compuesto de fórmula (I):
    donde:
    Yes una cadena sencilla de pARNi unida mediante un enlace tipo fosfato a X;
    Rse selecciona entre alquilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, ariloyheteroarilo, estandoRopcionalmente sustituido conal menosun grupo seleccionado entre halógeno(F,Cl,Br,I), haloalquilo, alquilo,C2-C5 alquenilo, heterocicloalquilo, -NO2, -CN, -CO2Ra, -CORb, -SRc, -CONRdRe, -NRfRg, -ORh, -SO2NRiRj;dondeRa,Rb,Rc,Rd,Re,Rf, Rg,Rh,RiyRj, se seleccionan independientemente entreH, metilo, etilo, propilo, isopropilo,butiloe isobutilo;
    Xesuna moléculapuenteunidaalacadena sencilladepARNi(Y) medianteelenlacetipofosfatoalaposición3’.
  33. 33.
    Un proceso para la síntesis enfase sólida de los compuestos según se definen en cualquiera de las reivindicaciones1 a 31, caracterizado porque comprende las siguientes etapas: i) enlazar covalentementeelgrupoRyel puente; ii) unir el compuesto obtenido en el paso (i) a un soporte sólido; iii) ensamblardemanera secuencial unadelas cadenasdepARNi sobrela moléculaX-Runidaal soporte sólido; iv) romper el enlace entre el soporte sólidoyel productoyeliminar los grupos protectores obteniéndose
    una de las cadenas del pARNiconteniendo el grupo X-R; v) mezclar cantidades equivalentesde las cadenas guíayacompañante para generarel dúplexde pARNi.
  34. 34.
    El proceso según la reivindicación anterior, caracterizado porque el soporte sólido se selecciona entre vidrio, gel de sílice, vidrio poroso, óxido de silicio, poliestireno, polietilenglicol, poliestireno-polietilenglicol, poliamida, poliacrilamida, clorurodepolivinilo, teflón, papelycelulosa.
  35. 35.
    El proceso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores, caracterizado porqueel grupoR es unido aunsoportesólidoatravésdeunamoléculapuenteyalmenosunadelascadenasdelpARNies sintetizadautilizando el procedimientode síntesis enfase sólida utilizandoel soporte sólido funcionalizado conel grupoR.
  36. 36.
    El proceso según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores, caracterizado porqueel grupoR esunido a un soporte sólidoyal menos una de las cadenas del pARNi es sintetizada por adición sucesiva de derivados de los nucleósidos que constituyen la secuencia de la cadena incluyendo los fosforamiditos, losH-fosfonatos, los fosfatos diésterylos fosfatos monoéster.
  37. 37.
    El proceso según cualquiera de las cuatro reivindicaciones anteriores, caracterizado porqueel grupoResunido aun soporte sólidoyal menosunadelas cadenasdelpARNies sintetizadapor adición sucesivadelos fosforamiditos de los nucleósidos que constituyen la secuencia de la cadena.
  38. 38.
    Una composiciónfarmacéutica que comprende cualquierade los compuestosde pARNi como se describen en las reivindicaciones1 a32yal menos unexcipienteovehículofarmacéuticamente aceptable.
  39. 39.La composiciónfarmacéutica segúnla reivindicación anterior, caracterizada porque comprende un agente de transfección.
  40. 40.La composiciónfarmacéutica segúnla reivindicación anterior, caracterizada porque el agente de transfección se selecciona entre uno o mezclas de los siguientes compuestos lipofectina, liptofectamina, oligofectamina, effectene, cellfectina, DOTAP, DOPE, fugene, polietilenglicol, colesterol, polietilenimida (PEI), Jet-polietilenimida, péptidos de penetración celular, péptidos troyanos, péptidoTAT, penetratina, oligoarginina, poli-lisina, glicoproteína del virus de la rabia, nanopartículas de oro, dendrímeros, nanotubos de carbono, lípidos catiónicos y/o liposomas.
  41. 41.El usodelos compuestosde pARNi según cualquierade las reivindicaciones1 a32ode las composiciones según cualquiera de las tres reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento.
  42. 42. El uso según la reivindicación anterior para la preparación de un medicamento para el silenciamiento génico.
  43. 43. El uso según cualquiera de las dos reivindicaciones anteriores para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer, inflamación, colitis, colitis ulcerativa, enfermedad de Crohn y/o artritis reumatoides.
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