KR101345062B1 - 경구 투여용 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA) - Google Patents
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Abstract
뉴클레오티드 15개 이상에 걸쳐 서로에 대해 상보적인 2개의 별개의 RNA 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 뉴클레오티드 49개 이하이며, 이들 가닥 중 하나 이상이 하나 이상의 화학적 변형을 함유하는, 경구 투여용 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA).
짧은 간섭 리보핵산 (siRNA), RNA 간섭, 3'-말단 변형 siRNA, 혈관형성 장애
Description
전사후 유전자 침묵 (PTGS: Post-Transcriptional Gene Silencing)으로 식물에서 처음으로 발견된 RNA 간섭은 이중-가닥 RNA (dsRNA)에 의해 촉발되고 dsRNA와 상동성인 유전자의 전사체를 하향 조절할 수 있는 고도로 보존된 메커니즘이다1. dsRNA는 Dicer에 의해 짧은 간섭 RNA (siRNA)로 칭해지는, 21-23 nt의 짧은 이중나선(duplex)으로 최초로 프로세싱되었다2. 이는 RNA-유도 침묵 복합체 (RISC) 내로 혼입되어, RISC의 성분인 아거노트(Argonaute) 2에 의한 상동성 영역의 중심에서의 표적 mRNA의 절단을 통해 유전자 침묵을 매개할 수 있다3. 2001년에, Elbashir 등4은 합성 siRNA의 직접적인 도입이 초파리 뿐만 아니라 포유동물 세포에서 RNA 간섭 유전자 침묵을 매개할 것임을 증명하였다. 그 이후로, siRNA-매개 유전자 침묵이 표적 식별 및 표적 확인 연구 모두에서 강력하고 광범위하게 사용되는 분자생물학 도구가 되었다. 동물 연구에서의 유전자 침묵에 대한 siRNA의 사용이 한정된 양의 동물 모델에서 기술되었다. 미변형 siRNA가 국소적으로 눈에 전달되고5, 중추 신경 계에서 수막강내 또는 소내뇌로 전달되고6, 호흡기 바이러스의 억제를 위해 비내 전달되었다7. 미변형 siRNA의 정맥내 유체역학적 꼬리 정맥 주사가 또한 연구되었다. 이러한 접근법은, 주로 간으로의, 신속한 전달을 허용한다8. 미변형 siRNA의 전신 투여에 대해 매우 제한된 수의 연구가 보고되었다. Duxbury 등9은 병소 부착 키나제(Focal Adhesion Kinase)를 표적으로 하는 미변형 siRNA를 동소이식 종양 이종이식편 마우스 모델에게 정맥내 투여하였고, 종양 성장 억제 뿐만이 아니라 젬시타빈에 대한 화학물질 민감화(chemosensitization)를 관찰하였다. Soutscheck 등은 내인성 침묵화 아포지단백질(Apolipoprotein) B에 대한 고도로 화학적으로 변형된 siRNA의 전신 사용을 보고하였다. 대부분의 항-ApoB siRNA의 50 mg/kg의 높은 용량으로의 복강내 투여는 ApoB 단백질 수준 및 지단백질 농도를 감소시켰다10. 이러한 예들에도 불구하고, 전신 전달 시의 siRNA의 생체내 사용은 이러한 기술을 표적 확인 또는 치료 용도에 광범위하게 적용가능하도록 만들기 위해 개선을 필요로 한다. 실제로, 미변형 siRNA에 효소에 의한 소화가 적용되고, 이는 주로 혈류 내에 풍부한 뉴클레아제에 의한 것이다. siRNA의 약리적 성질을 개선하기 위해, 여러 집단들이 이러한 시약의 화학적 변형을 조사하였다. 기술된 접근법들은 서로 매우 상이하고 전신 연구는 아직 수행되지 않았지만, 개략적인 결과들은 화학적 변형에 대한 siRNA의 허용성이 결정되도록 한다. 여러 화학물질들 예컨대 포스포로티오에 이트11 또는 보라노포스페이트12, 2'-O-메틸13, 2'-O-알릴14, 2'-메톡시에틸 (MOE) 및 2'-데옥시플루오로뉴클레오티드15 또는 잠금 핵산 (LNA: Locked Nucleic Acid)16이 조사되었다. 이러한 연구들은 변형에 대한 허용성이 화학물질-의존적일 뿐만 아니라, 또한 위치-의존적이라는 것을 강조하였다.
본 발명은 약리학적 성질이 개선된, 최소 변형 siRNA를 제공한다. 최소 변형 siRNA는 3'-엑소뉴클레아제 소화를 방지하기 위해 각각의 3'-말단에서 변형된 19bp 이중-가닥 RNA이다: 21-nt siRNA의 3'-디데옥시뉴클레오티드 오버행(overhang)이 보편적인 3'-히드록시프로필 포스포디에스테르 부분(moiety)으로 치환되었고, 각각의 가닥의 3'-말단 상의 처음 2개의 염기-쌍형성 뉴클레오티드의 변형은 혈청 안정성을 추가로 증강시킨다. 성체 마우스에 복강내 또는 경구 적용되어, 변형 siRNA는 성장 인자-유도 혈관형성 모델에서 더 높은 효능을 나타냈고, 이는 이들의 증가된 혈청 안정성과 상호관련된다.
발명의 개요
한 양상에서, 본 발명은 뉴클레오티드 15개 이상에 걸쳐 서로에 대해 상보적인 2개의 별개의 RNA 가닥을 포함하고, 각각의 가닥은 뉴클레오티드 49개 이하이며, 이들 가닥 중 하나 이상이 하나 이상의 화학적 변형을 함유하는, 경구 투여용 짧은 간섭 리보핵산 (siRNA)을 제공한다.
한 실시양태에서, siRNA는 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함한다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 하나 이상의 3' 말단 캡(cap)을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 2'-알콕시리보뉴클레오티드, 2'-알콕시알콕시 리보뉴클레오티드, 잠금 핵산 리보뉴클레오티드 (LNA), 2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 상기 변형된 뉴클레오티드는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포노에이트, 및 아미드 결합으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드간(internucleoside) 결합이 있는 뉴클레오티드로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, 상기 2개의 RNA 가닥은 서로에 대해 완전히 상보적이다.
또다른 실시양태에서, 상기 siRNA는 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나 이상에 1개 내지 6개 뉴클레오티드의 오버행을 포함한다.
또다른 실시양태에서, 상기 siRNA는 3' 탄소를 통해 3' 말단에 접합된 화학 부분이고 하기 화학식 I의 화합물로부터 선택되는 하나 이상의 3' 캡을 함유한다:
식 중,
X는 O 또는 S이고,
R1 및 R2는 독립적으로 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이고, 이때 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가적인 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O, 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있거나, 또는
R1 및 R2는 화학식 Y-Z (식 중, Y는 O, N, S이고, Z는 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 이때 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가적인 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)의 기일 수 있다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 VEGFR-1, VEGFR-2, VEGFR-3, Tie2, bFGFR, IL8RA, IL8RB, Fas, 또는 IGF2R의 mRNA 또는 프리(pre)-mRNA에 뉴클레오티드 15개 이상에 걸쳐 상보적인 하나 이상의 가닥을 함유한다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 서열 1-900으로부터 선택된 서열을 포함하는 하나 이상의 가닥을 함유한다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 서열 901-930으로 구성된 군으로부터 선택된다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 표준 위산 분석법에서의 안정성이 동일 뉴클레오티드 서열의 미변형 siRNA보다 더 높다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 30분 노출 후 표준 위산 분석법에서의 안정성이 50% 이상이다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 표준 혈청 분석법에서의 안정성이 미변형 siRNA보다 더 높다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 30분 노출 후 표준 혈청 분석법에서의 안정성이 50% 이상이다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 표준 장 세척액 분석법에서의 안정성이 미변형 siRNA보다 더 높다.
또다른 실시양태에서, siRNA는 동일 뉴클레오티드 서열의 미변형 siRNA와 비교하여 경구 생체이용률이 증강된다.
한 양상에서, 본 발명은 상기 성질들 중 임의의 것이 하나 이상 있는 siRNA를 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은은 약제로서 사용하기 위한, 상기 성질들 중 임의의 것이 하나 이상 있는 siRNA를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 혈관형성 장애 치료용 약제의 제조에 있어서 상기 성질들 중 임의의 것이 하나 이상 있는 siRNA의 용도를 제공한다.
또다른 양상에서, 본 발명은 시험관 내에서 혈관형성 과정을 억제하는데 있어서 상기 성질들 중 임의의 것이 하나 이상 있는 siRNA의 용도를 제공한다.
도 1a, 1b, 1c, 1d 및 1e: 미변형 siRNA pGl3-siRNA의 대사 분해 (마우스 혈청 내의 야생형 siRNA); a-c) 0', 30' 및 180' 동안의 마우스 혈청 내에서의 인큐베이션 후의 미변형 siRNA의 이온 교환-HPLC 분석; 37℃에서의 30'의 인큐베이션 후, 이온 교환 HPLC에서의 주요 피크를 단리하여 LC-MS에 재-주입하였다, d) 검출 된 분자량 및 이들의 할당의 표; e) ESI-MS 스펙트럼
도 2: 4개의 이중-가닥 RNA 포맷의 도해: 야생형 (또는 미변형) siRNA, MOE o/h siRNA, C3-siRNA 및 C3-MOE siRNA.
도 3: 마우스 위산에서의 3가지 상이한 포맷의 siRNA의 안정성. 샘플들을 2 마이크로몰 농도로 마우스 위산 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 모(parent) 화합물 밴드의 정량에 의해 모 화합물의 소실을 2-6시간에 걸쳐 추적하였다.
레인 1-7: t=0분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분 및 120분의 위산 내의 야생형 siRNA
레인 8: ds RNA 사다리 (30, 21, 19, 16, 13, 10 bp)
레인 9-15: t=0분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분 및 120분의 위산 내의 C3 siRNA
레인 16: ds RNA 사다리 (30, 21, 19, 16, 13, 10 bp)
레인 17-24: t=0분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분 및 120분의 위산 내의 C3-MOE siRNA
도 4: 장 세척액에서의 4가지 상이한 포맷의 siRNA의 안정성. 샘플들을 5 마이크로몰 농도로 간 미세소체 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
(왼쪽에서 오른쪽으로)
레인 1 : ds RNA 사다리 (30, 21 , 19, 16, 13, 10 bp)
레인 2-7: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 장 세척액 내의 야생형 siRNA
레인 8-13: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 장 세척액 내의 moe o/h siRNA
레인 14-19: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 장 세척액 내의 C3 siRNA
레인 20-25: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 장 세척액 내의 C3-MOE siRNA
도 5: 간 미세소체에서의 4가지 상이한 포맷의 siRNA의 안정성. 샘플들을 2 마이크로몰 농도로 래트 장 세척액으로부터의 장액 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다.
(왼쪽에서 오른쪽으로)
레인 1 : ds
도 6: 마우스 혈청에서의 4가지 상이한 포맷의 siRNA의 안정성. 샘플들을 2 마이크로몰 농도로 마우스 혈청 내에서 37℃에서 인큐베이션하였다. 모 화합물 밴드의 정량에 의해 모 화합물의 소실을 6시간에 걸쳐 추적하였다.
(왼쪽에서 오른쪽으로)
레인 1 : ds RNA 사다리 (30, 21, 19, 16, 13, 10 bp) RNA 사다리 (30, 21, 19, 16, 13, 10 bp)
레인 2: 야생형 siRNA 미처리
레인 3: moe o/h siRNA 미처리
레인 4: C3 siRNA 미처리
레인 5: C3-MOE siRNA 미처리
레인 6-9: t=0의 간 미세소체 내의 2-5와 동일물
레인 10-13: t=60'의 간 미세소체 내의 2-5와 동일물
레인 14-17: t=0의 상청액 S12 내의 2-5와 동일물
레인 18-21: t=60'의 상청액 S12 내의 2-5와 동일물
레인 2-7: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 마우스 혈청 내의 야생형 siRNA
레인 8-13: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 마우스 혈청 내의 moe o/h siRNA
레인 14-19: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 마우스 혈청 내의 C3 siRNA
레인 20-25: t=0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분의 마우스 혈청 내의 C3-MOE siRNA
도 7: 3가지 포맷의 항-VEGFR2 siRNA (2개의 독립적인 서열)의 세포내 특성화. 야생형 siRNA, C3-siRNA 및 C3-MOE siRNA를 MS1 세포 내로 3가지 농도 (1, 5, 10 nM)로 형질감염시켰다. FACS에 의해 VEGFR2 세포 표면 수준을 측정함으로써 침묵 효능을 평가하였다.
도 8a 및 8b: 성장 인자 유도 혈관형성 "한천 챔버(Agar Chamber)" 마우스 모델에서의 야생형 siRNA, C3-siRNA 및 C3-Moe siRNA의 생체내 시험. 도 8a는 1, 5 및 25 ㎍/마우스/일의 대조군, 미변형 VEGFR2 siRNA 및 C3 변형 VEGFR2 siRNA의 결과를 나타낸다. 도 8b는 0.2, 1 및 5 ㎍/마우스/일의 대조군, C3 변형 VEGFR2 siRNA 및 C3-MOE VEGFR2 siRNA를 나타낸다. 각각의 경우에, 2개의 항-VEGFR2 siRNA의 풀(pool)을 3일 동안 매일 복강내로 제공하였다.
도 9: 5 및 20 ㎍/마우스/일로 B16 동종이식 흑색종 종양 마우스 모델에서 복강내 (i.p.) 제공된 항-VEGFR2 C3-MOE siRNA의 생체내 시험. 도 9a는 변형 VEGFR2 siRNA를 사용한 복강내 처치가 종양 발달을 현저하게 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 9b 또한 20 ug/마우스의 VEGFR2 siRNA의 복강내 주사로 종양 성장의 현저한 억제가 초래된다는 것을 나타낸다.
도 10: 성장 인자 유도 혈관형성 마우스 모델에서의 C3-MOE siRNA의 생체내 시험. 항-VEGFR2 siRNA를 20 ㎍/마우스/일로 3일 동안 매일 경구 제공하였다.
도 11: 성장 인자 유도 혈관형성 마우스 모델에서의 C3-MOE siRNA의 생체내 시험. 항-Tie2 siRNA를 3일 동안 매일 복강내 (1 및 0.2 ㎍/마우스/일) 또는 경구 (20 및 5 ㎍/마우스/일) 제공하였다. 도 11a: 절제된 조직의 중량; 도 11b: Tie2 단백질 녹-다운(knock-down).
본 발명은 포유동물에서 혈관형성 장애를 치료하기 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 포유동물에게 경구 투여 시 혈관형성 장애를 치료하는데 사용될 수 있는 소형-간섭 RNA ("siRNA")에 관한 것이다.
혈관 내피 세포 내의 혈관형성 표적에는 하기의 표적/유전자가 포함된다: VEGFR-1 (진뱅크(GenBank) 관리 번호 AF06365), VEGFR-2 (진뱅크 관리 번호 AF063658), VEGFR-3 (진뱅크 관리 번호 NM_002020), Tie2 (TEK) (진뱅크 관리 번호 NM_000459), bFGFR (진뱅크 관리 번호 M60485), IL8RA (진뱅크 관리 번호 L19591), IL8RB (진뱅크 관리 번호 L19593), Fas (진뱅크 관리 번호 X89101), IGF2R (진뱅크 관리 번호 NM_000876).
본 발명에 따른 siRNA 분자는 RNA 간섭 ("RNAi")을 매개한다. 용어 "RNAi"는 당업계에 주지되어 있고, 표적 유전자에 상보적인 영역이 있는 siRNA에 의한 세포 내의 하나 이상의 표적 유전자의 억제를 의미하는 것으로 통상적으로 이해된다. 다양한 분석법들이 RNAi를 매개하는 능력에 대해 siRNA를 시험하기 위해 공지되어 있다 (예를 들어 [Elbashir et al., Methods 26 (2002), 199-213] 참조). 유전자 발현에 대한 본 발명에 따른 siRNA의 효과로 본 발명에 따른 RNA 분자로 처리되지 않은 세포와 비교하여 표적 유전자의 발현이 적어도 10%, 33%, 50%, 90%, 95% 또는 99% 억제되는 것이 전형적으로 초래될 것이다.
본 발명에 따른 "siRNA" 또는 "소형-간섭 리보핵산"은 하기의 양상들을 포함하여 당업계에 그 의미가 공지되어 있다. siRNA는 생리학적 조건 하에 상보적인 영역을 따라 혼성화하는 2개의 리보뉴클레오티드 가닥으로 구성된다. 가닥들은 분리되어 있지만, 특정 실시양태에서는 분자성 링커(linker)에 의해 연결될 수 있다. 개별적인 리보뉴클레오티드들은 미변형 천연 발생 리보뉴클레오티드, 미변형 천연 발생 데옥시리보뉴클레오티드일 수 있거나, 또는 본원의 다른 곳에 기술된 바와 같이 화학적으로 변형되거나 또는 합성 물질일 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA 분자는 표적 유전자의 mRNA의 영역에 실질적으로 동일한 이중-가닥 영역을 포함한다. 표적 유전자의 상응하는 서열에 대한 동일성이 100%인 영역이 적절하다. 이러한 상태는 "완전히 상보적"인 것으로 지칭된다. 그러나, 이러한 영역은, 표적이 되는 mRNA의 영역의 길이에 따라, 표적 유전자의 상응하는 영역과 비교하여 1개, 2개 또는 3개의 미스매치(mismatch)를 또한 함유할 수 있고, 따라서 완전히 상보적이지 않을 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명의 RNA 분자는 1개의 소정의 유전자를 특이적으로 표적으로 한다. 원하는 mRNA만을 표적으로 하기 위해, siRNA 시약은 표적 mRNA에 대한 100%의 상동성 및 세포 또는 생물 내에 존재하는 모든 다른 유전자에 대한 2개 이상의 미스매치 뉴클레오티드를 가질 수 있다. 특정 표적 서열의 발현을 효과적으로 억제하기 위해 서열 동일성이 충분한 siRNA를 분석 및 확인하기 위한 방법은 당업계에 공지되어 있다. 서열 동일성은 당업계에 공지된 서열 비교 및 정렬 알고리즘 ([Gribskov and Devereux, Sequence Analysis Primer, Stockton Press, 1991] 및 이에 인용된 참고문헌 참조) 및 뉴클레오티드 서열들 간의 백분율 차이를 계산하는 것 (예를 들어, 디폴트(default) 파라메터 (예를 들어, <University of Wisconsin Genetic Computing Group>)를 사용하여 베스트핏(BESTFIT) 소프트웨어 프로그램에서 실행된 바와 같은 스미스-워터맨(Smith-Waterman) 알고리즘에 의해)에 의해 최적화될 수 있다.
RNAi 시약의 효율에 영향을 미치는 또다른 인자는 표적 유전자의 표적 영역이다. RNAi 시약에 의한 억제에 대해 효과적인 표적 유전자의 영역은 실험에 의해 결정될 수 있다. 적절한 mRNA 표적 영역은 코딩 영역일 것이다. 비번역 영역, 예컨대 5'-UTR, 3'-UTR, 및 스플라이스 정션(splice junction)이 또한 적절하다. 예를 들어, [Elbashir S.M. et al, 2001 EMBO J., 20, 6877-6888]에 기술된 형질감염 분석법을 이러한 목적을 위해 수행할 수 있다. 다수의 기타 적절한 분석법 및 방법이 당업계에 존재하고, 이들은 당업자에게 주지되어 있다.
본 발명에 따른, 표적에 상보적인 siRNA의 영역의 길이는 뉴클레오티드 10개 내지 100개, 뉴클레오티드 12개 내지 25개, 뉴클레오티드 14개 내지 22개 또는 뉴클레오티드 15개, 16개, 17개 또는 18개일 수 있다. 상응하는 표적 영역에 대한 미스매치가 있는 경우, 일반적으로 상보성 영역의 길이가 다소 더 길어질 필요가 있다.
siRNA가 오버행 말단 (표적에 대해 상보적일 수 있거나 상보적이지 않을 수 있음), 또는 자신에 대해서는 상보적이지만 표적 유전자에 대해서는 그렇지 않은 추가적인 뉴클레오티드를 보유할 수 있기 때문에, siRNA의 각각의 별개의 가닥의 전체 길이는 뉴클레오티드 10 내지 100개, 뉴클레오티드 15개 내지 49개, 뉴클레오티드 17개 내지 30개, 또는 뉴클레오티드 19개 내지 25개일 수 있다.
"각각의 가닥은 뉴클레오티드 49개 이하이다"라는 구절은 모든 변형 또는 비-변형 뉴클레오티드를 포함하지만 가닥의 3' 또는 5' 말단에 부가될 수 있는 임의의 화학 부분을 포함하지 않는 가닥 내의 연속적인 뉴클레오티드의 총 개수를 의미한다. 가닥 내로 삽입된 짧은 화학 부분은 계수되지 않지만, 2개의 별개의 가닥들을 연결하도록 디자인된 화학 링커는 연속적 뉴클레오티드를 생성하는 것으로 간주되지 않는다.
"5' 말단 또는 3' 말단 중 하나 이상에 1개 내지 6개 뉴클레오티드의 오버행"이라는 구절은 생리학적 조건 하에 2개의 별개의 가닥으로부터 형성되는 상보적 siRNA의 구조를 지칭한다. 말단 뉴클레오티드가 siRNA의 이중-가닥 영역의 일부인 경우, siRNA는 평활(blunt) 말단으로 간주된다. 하나 이상의 뉴클레오티드가 말단에서 쌍을 이루고 있지 않으면, 오버행이 생성된다. 오버행 길이는 오버행 뉴클레오티드의 개수에 의해 측정된다. 오버행 뉴클레오티드는 임의의 가닥의 5' 말단 또는 3' 말단 상에 있을 수 있다.
본 발명에 따른 siRNA는 가닥들 중 하나 이상 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함함으로써 경구 전달에 적절한 높은 생체내 안정성을 부여한다. 따라서 본 발명에 따른 siRNA는 하나 이상의 변형된 또는 비-천연 리보뉴클레오티드를 함유한다. 다수의 공지된 화학적 변형의 장황한 설명은 PCT 특허 출원 공개공보 WO 200370918에 기재되어 있고, 본원에서 반복되지 않을 것이다. 경구 전달에 적절한 변형이 본원의 실시예 및 상세한 설명에 더욱 상세하게 기재되어 있다. 적절한 변형에는 당 부분 (즉, 당 부분의 2' 위치, 예컨대 예를 들어 2'-O-(2-메톡시에틸) 또는 2'-MOE) ([Martin et al., Helv. Chim. Acta, 1995, 78, 486-504]) 즉, 알콕시알콕시 기) 또는 염기 부분 (즉, 교대 뉴클레오티드 사슬 내의 또다른 특이적 염기와 쌍을 형성하는 능력이 유지된 비-천연 또는 변형된 염기)에 대한 변형이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다. 기타 변형에는 포스포에스테르 기 (인접한 리보뉴클레오티드들을 연결시킴)를 예를 들어 포스포로티오에이트, 키랄(chiral) 포스포로티오에이트 또는 포스포로디티오에이트로 치환하는 것을 포함하지만 이에 한정되지 않는 소위 '골격' 변형이 포함된다. 마지막으로, 때때로 3' 캡 또는 5' 캡으로 본원에서 지칭되는 말단 변형이 중요할 수 있다. 표 1에 설명된 바와 같이, 캡은 단순히 추가적인 뉴클레오티드, 예컨대 siRNA에 안정성을 부여하는 것으로 발견된 "T-T"를 부가하는 것으로 구성될 수 있다. 캡은 당업자에게 공지된 더욱 복잡한 화학으로 구성될 수 있다.
하기의 실시예에서 사용된 한 실시양태에서, 3' 캡은 3' 탄소를 통해 3' 말단에 접합된 화학 부분이고, 화학식 I의 화합물들로부터 선택된다:
<화학식 I>
식 중,
X는 O 또는 S이고,
R1 및 R2는 독립적으로 OH, NH2, SH, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이고, 이때 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가적인 헤테로원자 및 관능기, 바람직하게는 N, O, 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자 또는 OH, NH2, SH, 카르복실산 또는 에스테르의 군으로부터 선택된 관능기로 치환될 수 있거나, 또는
R1 및 R2는 화학식 Y-Z (식 중, Y는 O, N, S이고, Z는 H, 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬이며, 이때 알킬, 아릴, 알킬-아릴, 아릴-알킬은 추가적인 헤테로원자, 바람직하게는 N, O, 또는 S의 군으로부터 선택된 헤테로원자로 치환될 수 있음)의 기일 수 있다.
당 부분 상에서의 변형의 예로는 2'-알콕시리보뉴클레오티드, 2'-알콕시알콕시 리보뉴클레오티드, 잠금 핵산 리보뉴클레오티드 (LNA), 2'-플루오로 리보뉴클레오티드, 모르폴리노 뉴클레오티드가 포함된다.
뉴클레오시드간 결합이 또한 변형될 수 있다. 뉴클레오시드간 결합의 예로는 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 및 아미드 결합이 포함된다.
R1은 OH일 수 있다.
R1 및 R2는 함께 1개 내지 24개의 C 원자, 1개 내지 12개의 C 원자, 2개 내지 10개의 C 원자, 1개 내지 8개의 C 원자 또는 2개 내지 6개의 C 원자를 포함할 수 있다. 또다른 실시양태에서, R1 및 R2는 독립적으로 OH, 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬이고, 이때 저급 알킬, 저급 아릴, 저급 알킬-아릴, 저급 아릴-알킬은 상기 정의된 바와 같은 추가적인 헤테로원자 및 관능기로 치환될 수 있다. 또다른 실시양태에서, R1 및 R2는 모두 OH가 아니다.
유기 라디칼 또는 화합물과 관련된 용어 "저급"은 7개 이하의 탄소 원자, 바람직하게는 1-4개의 탄소 원자가 있는 분지될 수 있거나 또는 분지되지 않을 수 있는 화합물 또는 라디칼을 의미한다. 저급 알킬은, 예를 들어 메틸, 에틸, n-프로필, 이소프로필, n-부틸, sec-부틸, tert-부틸, n-펜틸 및 분지형 펜틸, n-헥실 및 분지형 헥실을 나타낸다.
알콕시의 예로는 O-Met, O-Eth, O-prop, O-but, O-pent, O-hex가 포함된다.
하나 이상의 변형된 또는 비-천연 리보뉴클레오티드를 함유하는 siRNA를 포함하여 siRNA의 합성을 위한 방법은 당업자에게 주지되어 있고, 당업자가 쉽게 입수가능한다. 예를 들어, 다양한 합성 화학이 거명에 의해 본원에 포함된 PCT 특허 출원 공개공보 WO2005021749 및 WO200370918에 기재되어 있다. 반응은 용액에서, 또는 바람직하게는 고체상 상에서, 또는 중합체 지지 시약을 사용함으로써 수행될 수 있고, 이어서 합성된 RNA 가닥들이 RNAi를 매개할 수 있는 siRNA 분자가 형성되는 조건하에 조합된다.
본 발명은 경구 전달에 적절한 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 함유하는 siRNA를 제공한다. 기능적인 면에서, 이는 경구 투여시 siRNA의 약동학 및 생체분포(biodistribution)가 적절하여 고려되는 표적 조직으로의 전달을 달성할 것임을 의미한다. 특히, 이는 혈청 안정성, 면역 응답의 결여, 및 약물 유사 거동을 필요로 한다. siRNA의 다수의 이러한 양상들이 본원의 다른 곳에 개시된 표준 위산 분석법 및 표준 혈청 분석법을 기초로 예상될 수 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 RNAi에 의해 하나 이상의 표적 유전자를 억제할 수 있는 siRNA를 세포 내로 도입하는 것을 포함하는, 표적 유전자의 억제 방법을 제공한다. 또한, 또다른 표적 영역에 대해 각각 특이적인, 1가지를 초과하는 종의 siRNA가 동시에 또는 순차적으로 세포 내로 도입될 수 있다.
본 발명은 임의 유형의 표적 유전자 또는 뉴클레오티드 서열에 한정되지 않는다. 예를 들어, 표적 유전자는 세포 유전자, 내인성 유전자, 병원체-관련 유전자, 바이러스 유전자 또는 종양유전자일 수 있다. 혈관형성 유전자가 본 발명에 특히 중요한데, 일부 실시예가 경구 전달된 본 발명의 siRNA가 혈관생성, 신생혈관증식 또는 혈관형성 부위에 축적될 수 있다는 것을 강조하기 때문이다. 본 발명에 특히 흥미로운 이러한 부위에서의 혈관형성 유전자의 최신 목록이 [AngioDB: database of angiogenesis and angiogenesis-related molecules, Tae-Kwon Sohn, Eun-Joung Moon1, Seok-Ki Lee1, Hwan-Gue Cho2 and Kyu-Won Kim3, Nucleic Acids Research, 2002, Vol. 30, No. 1 369-371] 및 온라인 http://angiodb.snu.ac.kr/에 열거되어 있다. 특히 중요한 유전자들이 상세하게 분석되었고, 본원의 다른 곳에서 기재되어 있다.
또다른 양상에서, 본 발명은 본 발명에 따른 dsRNA를 포함하는, 세포 내의 표적 유전자의 발현을 억제하기 위한 시약을 포함하는 키트를 또한 제공한다. 키트는 시험 샘플 또는 대상으로의 본 발명에 따른 dsRNA의 시험관내 또는 생체내 도입을 수행하기 위해 필요한 시약들 중 적어도 하나 이상을 포함한다. 바람직한 실시양태에서, 이같은 키트는 키트 성분들이 사용되는 절차를 상술하는 지침서를 또한 포함한다.
본 명세서에서 사용된 "혈관형성 장애의 치료"는 신생혈관증식, 혈관생성 및/또는 혈관형성의 생리학적 및 병리학적 과정을 수반하는 질환의 치료를 위한 제약 조성물에서의 본 발명의 변형 siRNA의 용도를 의미한다. 따라서, 이러한 제약 조성물은 암 종양 성장 및 전이, 신생물, 안구 신생혈관증식 (황반 변성, 당뇨병성 망막병증, 허혈성 망막병증, 미숙아 망막병증, 맥락막 신생혈관증식 포함), 류머티스 관절염, 골관절염, 만성 천식, 패혈성 쇼크, 염증성 질환, 활액막염, 뼈 및 연골 파괴, 판누스 성장, 골증식체 형성, 골수염, 건선, 비만, 혈관종, 카포시 육종, 죽상동맥경화증 (죽상 경화판 파열 포함), 자궁내막증, 사마귀, 과도한 모발 성장, 흉터 켈로이드, 알러지성 부종, 기능부전 자궁 출혈, 난포낭, 난소 과다자극, 자궁내막증, 골수염, 염증성 및 감염성 과정 (간염, 폐렴, 사구체신염), 천식, 비강 폴립, 이식, 간 재생, 백질연화증, 갑상선염, 갑상선 비대, 림프세포증식성 장애, 혈액학적 악성종양, 혈관 기형, 및 자간전증이 포함되지만 이에 한정되지 않는, 신생혈관증식, 혈관생성 또는 혈관형성의 억제를 필요로 하는 질환, 상태 및 장애를 치료하는데 유용하다.
본원에서 사용된 "치료"는 질환, 장애 또는 상태의 과정을 억제하거나 감소시키기 위해, 질환, 장애 또는 상태의 증상을 억제하거나 감소시키기 위해, 또는 질환, 장애 또는 상태의 발병 또는 추가적인 발달을 예방적으로 방지하기 위해 취해진 행위를 의미한다. "치료하다"는 이의 인지 동사이다.
본 발명의 치료제의 유효 용량은 질환 상태를 치료하는데 필요한 용량이다. 유효 용량은 질환의 유형, 사용된 조성물, 투여 경로, 치료될 포유동물의 유형, 고려되는 특정 포유동물의 신체적 특성. 동시 투약, 및 당업자가 인식할 기타 요인에 좌우된다. 일반적으로, 동물 체중 1 ㎏ 당 0.1 mg/일 내지 100 mg/일 사이의 양의 siRNA가 효능에 따라 투여된다. 본 발명의 핵산 분자 및 이의 제형은 경구적으로, 국소적으로, 비경구적으로, 흡인 또는 스프레이에 의해, 또는 직장 내로 통상적인 비-독성의 제약상 허용가능한 담체, 보조제 및/또는 비히클을 함유하는 투약 단위 제형으로 투여될 수 있다. 본원에서 사용된 용어 비경구는 경피, 피하, 혈관내 (예를 들어, 정맥내), 근육내, 복강내, 또는 수막강내 주사, 또는 주입 기술 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 제형이 제공된다. 하나 이상의 본 발명의 핵산 분자가 하나 이상의 비-독성의 제약상 허용가능한 담체 및/또는 희석제 및/또는 보조제, 및 필요하다면 기타 활성 성분과 함께 존재할 수 있다. 본 발명의 핵산 분자를 함유하는 제약 조성물은 경구 사용에 적절한 형태, 예를 들어 정제, 트로키, 로젠지, 수성 또는 유성 현탁액, 분산성 분말 또는 과립, 에멀션, 경질 또는 연질 캡슐, 또는 시럽 또는 엘릭시르일 수 있다.
경구 사용을 목적으로 하는 조성물은 제약 조성물의 제작에 대한 업계에 공지된 임의의 방법에 따라 제조할 수 있고, 이같은 조성물은 제약상 편안하고 맛좋은 제제를 제공하기 위해 하나 이상의 감미제, 풍미제, 착색제 또는 방부제를 함유할 수 있다. 정제는 정제의 제작에 적절한 비-독성의 제약상 허용가능한 부형제와 부가혼합된 활성 성분을 함유한다. 이러한 부형제는, 예를 들어 불활성 희석제; 예컨대 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산칼슘 또는 인산나트륨; 과립화 및 붕해 작용제, 예를 들어 옥수수 전분, 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어 전분, 젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어 스테아르산마그네슘, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 정제는 코팅되지 않을 수 있거나, 또는 공지된 기술에 의해 코팅될 수 있다. 경구 사용을 위한 제형은 활성 성분이 불활성 고체 희석제, 예를 들어 탄산칼슘, 인산칼슘 또는 카올린과 혼합되는 경질 젤라틴 캡슐, 또는 활성 성분이 물 또는 오일 매질, 예를 들어 땅콩유, 액체 파라핀 또는 올리브 오일과 혼합되는 연질 젤라틴 캡슐로 또한 제시될 수 있다. 수성 현탁액은 수성 현탁액의 제작에 적절한 부형제와 혼합된 활성 성분을 함유한다.
본 발명의 조성물의 경구 투여는, 가장 중요하게는 투약 제형물의 환자-제어 삼키기에 의해, 그러나 또한 이같은 전달의 기타 기계적 및 보조 수단에 의해, 위 또는 장에 직접적으로 물질을 투여하기 위한 모든 표준 기술을 포함한다.
체중 1 ㎏ 당 약 0.1 ㎎/일 내지 약 140 ㎎/일의 투여량 수준이 상기에서 지시된 상태의 치료에 유용하다 (약 0.5 ㎎ 내지 약 7 g/대상/일). 단일 투약 제형이 생산되도록 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 치료될 호스트 및 특정 투여 방식에 따라 변한다. 투약 단위 제형은 일반적으로 약 1 ㎎ 내지 약 500 ㎎의 활성 성분을 함유한다. 임의의 특정 대상에 대한 명확한 용량 수준은 사용된 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반적인 건강, 성별, 식이, 투여 시간, 투여 경로, 및 배출 속도, 약물 조합 및 치료법이 진행되는 특정 질환의 중증도를 포함하는 다양한 인자에 좌우되는 것으로 이해된다.
본 발명의 치료제의 치료 효과는 다른 작용제와의 조합에 의해 증강될 수 있다. 전형적으로, 이같은 기타 작용제에는 유사한 질환, 예컨대 혈관형성 장애를 치료하는 것에서의 사용에 대해 공지된 작용제들이 포함될 것이다. 별법적으로, 이같은 작용제들은 본 발명의 치료제에 의해 야기되는 부작용 또는 원치않는 효과를 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
또한 본 발명의 siRNA에는 중요한 연구 용도가 있다. 한 이같은 연구에는 시험관 내에서의 혈관형성 과정에 대한 연구가 포함된다. "시험관 내에서의 혈관형성 과정"은 전체 동물을 사용하지 않는, 혈관형성 또는 혈관생성을 연구하기 위한 임의의 과정을 의미한다. 따라서, 혈관형성의 마커 또는 지표를 사용하여 혈관형성 과정의 단계들을 연구하는 시험관내 또는 생체외 방법 및 분석법이 이로써 포함된다.
RNA 가닥 뉴클레오티드 서열
표 1에서 확인되는 siRNA 가닥 서열들이 하기의 표적들에 대한 적절한 siRNA 서열로 확인되었다: VEGFR-1 (진뱅크 관리 번호 AF06365), VEGFR-2 (진뱅크 관리 번호 AF063658), VEGFR-3 (진뱅크 관리 번호 NM_002020), Tie2 (TEK) (진뱅크 관리 번호 NM_000459), bFGFR (진뱅크 관리 번호 M60485), IL8RA (진뱅크 관리 번호 L19591), IL8RB (진뱅크 관리 번호 L19593), Fas (진뱅크 관리 번호 X89101), IGF2R (진뱅크 관리 번호 NM_000876).
RNA 가닥 뉴클레오티드에 대한 화학적 변형
본 발명에 따른 siRNA는 하나 이상의 RNA 가닥 내에 하나 이상의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 가능한 변형된 뉴클레오티드의 범위가 본원의 다른 곳에 개시된다. 본 발명에 따라 사용하기 위한 유용한 변형 및 변형의 조합이 표 2에 제시된다:
siRNA 가닥의 3'-말단의 3' 위치에 부가된 하기의 변형 (때때로 '3' 말단 캡'으로 칭해짐)이 본 발명의 유용한 실시양태로 또한 인식되고, 임의의 본 발명에 따른 siRNA와 함께 사용될 수 있다:
본 발명에 따른 활성이 있는 특정 화합물에는 표 3에 제시된 하기의 화합물들이 포함된다:
하기의 실시예들은 본 발명의 양상들을 설명하고, 하기에 열거된 청구항에 포함되는 실시양태들을 제한하도록 의도되지 않는다. 결과 및 논의 섹션은 하기의 프로토콜에 따라서, 그리고 하기의 재료들을 사용하여 수행된 실험들을 가리킨다. 명확하게 기술되지 않은 재료 및 프로토콜은 당업자에게 통상적으로 입수가능한 것으로 간주된다.
실시예 1
siRNA의 제조
단일 가닥 siRNA 유도체를 표준 2'-O-TOM 포스포아미디트 기술에 의해 합성 하고, Oasis? HLB 추출 플레이트 (Waters)에 의해 정제하였다. 센스- 및 안티센스 가닥 siRNA를 혼성화 완충제 (100 mM 아세트산칼륨, 2 mM 아세트산마그네슘, 30 mM Hepes, pH 7.6)에서 혼합하고, 90℃에서 3분 동안 열-변성시키고, 37℃에서 60분 동안 어닐링(annealing)시켰다. siRNA 이중나선의 100 μM 모액을 -20℃에서 보관하였다.
실시예 2
혈청에서의 인큐베이션 및 IE-HPLC (LC-MS)에 의한 분석.
표준 혈청 분석법에서, 20 μM의 각각의 siRNA 6 ㎕을 54 ㎕ 혈청 또는 CSF와 혼합하고, 인큐베이터 내에서 37℃에서 가열하였다. 냉각된 혼합물 50 ㎕를 분석용 DNA-pac PA-100 컬럼 (Dionex) 상에 로딩하고, 1:10 아세토니트릴:완충제 (20 mM 아세트산나트륨, 1 mM 아세트산마그네슘, pH 6.5) 용액 내의 NaCl 구배 (30분 내에 0 - 0.6 M)로 분석하였다.
LC-MS 분석을 위해, 각각의 siRNA (20 μM 또는 50 μM) 100 ㎕를 900 ㎕의 무균성 소 태아 혈청 (GIBCO)과 혼합하고, 37℃에서 인큐베이션하고, 상기 지시된 바와 같이 HPLC에 의해 분리하였다 (단, NaCl 구배: 9' 내에 0 M - 0.36 M / 12' 내에 0.36 M - 0.6 M). 분해 생성물을 NAP 컬럼 상에서 탈염시키고, LC-ESI-MS에 의해 분석하였다.
실시예 3
위산에서의 인큐베이션
표준 위산 분석법을 준비하기 위해, 무게 18 내지 20 g (6 내지 8주령)의 FVB 및 C57BL6 마우스를 Charles River Laboratories (Les Oncins, France)로부터 수득하였다. 동물들을 CO2를 사용하여 희생시킨 후, 위를 신속하게 회수하였다. 위액 뿐만 아니라 위 내용물을 수집하고, 풀링(pooling)한 후, 원심분리 필터 기구 (Ultrafree MC, Millipores) 상에 로딩하였다. 필터 유닛을 제조업자의 권고에 따라 10분 동안 회전시켰다. 마우스 위액에 상응하는 여과액을 회수하고, 분취하고, 추가적인 실험 전에 동결시켰다.
각각의 분석법에 대해, 20 μM의 siRNA 용액을 9× 부피의 상기 기술된 바와 같은 위산에 희석하고, 37℃에서 0분, 5분, 10분, 15분, 30분, 60분 및 120분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 4
장 세척액에서의 인큐베이션
표준 장 세척액 분석법을 준비하기 위해, 수컷 위스타(Wistar) 래트를 금식시키고, 이소플루란으로 마취하였다. 10 ㎖ 염수 (0.5 ㎖/분)에 이어서 20 ㎖ 물 (1 ㎖/분)로의 소장 (십이지장, 공장, 회장)의 원위치 관류에 의해 장 세척액을 수득하였다. 수집된 배출물을 원심분리하고 (3000×g, 15분, 22℃), 상청액을 1.2-㎛ 필터에 통과시키고, -20℃에서 보관하였다.
각각의 분석법에 대해, 20 μM siRNA 용액을 9× 부피의 장 세척액에 희석하고, 37℃에서 0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 5
마우스 간 미세소체에서의 인큐베이션
표준 간 미세소체 분석법에서, siRNA의 250 μM 용액 10 ㎕에 20 mg 단백질/㎖의 마우스 간 미세소체 (GEntest 452701 Charge 11) 25 ㎕, 100 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.4) 365 ㎕, UDPGA 보조인자 (수 중 24 mM) 50 ㎕, NADPH 50 ㎕를 첨가하였다. t=0분 및 t= 60분에 동결에 의해 인큐베이션을 켄칭(quenching)시켰다.
실시예 6
래트 S12 상청액에서의 인큐베이션
표준 래트 S12 상청액 분석법을 위해, siRNA의 250 μM 용액 10 ㎕를 29.9 mg 단백질/㎖의 래트 간 S12 17 ㎕, 100 mM 포스페이트 완충제 (pH 7.4) 373 ㎕, UDPGA 보조인자 (수 중 24 mM) 50 ㎕, NADPH 50 ㎕에 첨가하였다. t=0분 및 t= 60분에 동결에 의해 인큐베이션을 켄칭시켰다.
실시예 7
마우스 혈청에서의 인큐베이션
마우스 혈청에서의 표준 인큐베이션을 위해, 20 μM siRNA 용액을 9× 부피의 뮤린 혈청 (할란(Harlan) 누드 마우스)에 희석하고, 37℃에서 0분, 15분, 30분, 60분, 180분 및 360분 동안 인큐베이션하였다.
실시예 8
젤 전기영동 안정성 분석법.
인큐베이션 용액의 10 ㎕ 분취량을 진탕 직후에 취하여 드라이 아이스 상에서 쇼크-동결시키고, 혼합물을 37℃에서 인큐베이션하고, 분취량을 다양한 시점에 쇼크-동결시켰다. 분취량을 30 ㎕ (각각 15 ㎕) 로딩 완충제 (Elchrom Sc, Cham, Switzerland)에서 해동시키고, SF50 젤 (Elchrom Sc, Cham, Switzerland) 상에서 120 V, 8℃에서 240분 동안 분리시켰다. 밴드들을 SYBR 골드 (Molecular Probes)로 염색하고, BIORAD ChemiDoc™ XRS 시스템으로 사진을 찍었다.
실시예 9
세포 배양
마우스의 불멸화 내피 세포주 MS1 (ATCC CRL-2279)을 1.5% 젤라틴-코팅 배양 접시 상에서 L-글루타민 및 10% 열-비활성화 FCS (AMIMED, Switzerland)가 보충된 DMEM 고 글루코스 (4.5 g/ℓ)에서 성장시켰다. MS1 세포를 HiPerfect (QIAGEN)를 사용하여 제조업자의 절차에 따라 siRNA로 24 웰-포맷으로 형질감염시켰다 (4중, 최종 siRNA 농도는 10 nM이거나 또는 지시된 바와 같았음).
실시예 10
FACS 분석
형질감염되지 않은 MS1 세포 및 siRNA로 형질감염된 MS1 세포를 FACS에 의해 VEGFR2 수준에 대해 분석하였다. 간략하게, 세포를 이중 또는 삼중 웰로부터 트립신처리하고, 각각의 조건에 대해 풀링한 후, PBS+10% FCS로 2회 세척하고, 10분 동안 얼음 상에서 인큐베이션한 후, RPE-접합 항-VEGFR2 Ab (1 ㎍/106 개의 세포; Avas 12α1, BD Pharmingen)를 첨가하였다. RPE-표지 이소타입 IgG2α (BD Pharmingen)를 FACS 대조군으로 사용하였다. FACS 취득물 및 분석을 FACScalibur 상에서 Cell Quest Software (Becton- Dickinson)를 사용하여 수행하였다.
실시예 11
동물 연구
암컷 FVB 마우스 (6 내지 8주령)를 Charles River Laboratories (Les Oncins, France)로부터 수득하였다. 마우스들을 귀 마킹에 의해 식별하였고, 일반적인 조건 하에 집단 (우리 당 6마리)으로 유지시키고, 매일 관찰하였다. 처치 군 당 6마리의 마우스를 사용하였고, 모든 동물 실험은 동물 보호에 대한 스위스 법을 엄격하게 고수하여 수행하였다.
참조용 챔버(chamber) 모델이 간행물이 기술되어 있다 (예를 들어 [Wood J, Bold G, Buchdunger E, et al. PTK787/ZK 222584, a novel and potent inhibitor of vascular endothelial growth factor receptor tyrosine kinases, impairs vascular endothelial growth factor-induced responses and tumor growth after oral administration. Cancer Res 2000;60:2178-89]). 간략하게, 퍼플루오로-알콕시-테플론(Teflon)으로 제조된 다공성 조직 챔버 (Teflon?-PFA, 21 mm × 8 mm 직경, 550 ㎕ 부피)에 3 ㎍/㎖ 재조합 인간 VEGF 및 지시된 바와 같은 siRNA가 보충된 또는 보충되지 않은 0.8% 한천 (BBL? Nr. 11849, Becton Dickinson, Meylan, France) 및 20 U/㎖ 헤파린 (Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd, Denmark)을 채웠다. 채우기 절차 전에 용액을 42℃에서 유지하였다. 마우스를 3% 이소플루란 (Forene?, Abbott AG, Cham, Switzerland) 흡입을 사용하여 마취시켰다. 피하 이식을 위해, 꼬리의 기저부에서 피부를 작게 절개하여, 이식물 투관침이 삽입되도록 하였 다. 챔버를 무균 조건 하에 소형 절개부위를 통해 동물의 등 상에 이식하였다. 피부 절개부위를 상처 클립 (Autoclip 9 mm Clay Adams)으로 닫았다. 필요한 용량에 따라, siRNA를 "주사용 품질 등급"의 0.9% 염수 용액에 희석한 후, 동물에게 복강내로 전달하거나 (200 ㎕/용량), 또는 위관영양에 의해 경구 전달하였다 (100 ㎕/용량). 챔버를 이식하기 2 내지 4시간 전에 마우스에게 1차 용량을 제공하였다. 그후, 2일 동안 매일 처치하였다. 달리 지시되지 않는 한, 이식하고 나서 3일 후에 마우스들을 희생시키고, 챔버를 절제하고, 각각의 이식물 주변에 형성된, 혈관증식된 섬유성 조직을 조심스럽게 제거하였다. 체중을 사용하여 마우스의 일반적인 건강을 모니터링하였다. 일원 ANOVA에 이어서 던넷(Dunnett) 시험을 사용하여 통계학적 분석을 수행하였다.
실시예 12
B16 흑색종 이종이식 모델
항-혈관형성 치료법에 응답성인 것으로 이전에 발견된, 동계(同系) B16/BL6 뮤린 흑색종 모델 (예를 들어 [LaMontagne K, Littlewood-Evans A, Schnell C, O'Reilly T, Wyder L, Sanchez T, Probst B, Butler J, Wood A, Liau G, Billy E, Theuer A, Hla T, Wood J. Antagonism of sphingosine-1-phosphate receptors by FTY720 inhibits angiogenesis and tumor vascularization. Cancer Res. 2006 Jan 1;66(1):221-31])을 사용하여 표준 또는 변형 siRNA의 항종양 활성을 평가하였다. 종양 세포 (1 ㎕, 5×104개/㎕)를 동계 암컷 C57BL/6 마우스의 양쪽 귀의 등쪽 귓바 퀴 내로 피내 주사하였다. 컴퓨터-보조 영상 분석 소프트웨어 (KS-400 3.0 영상화 시스템, Zeiss) 및 특수하게 디자인된 매크로를 사용하여 원발성 종양 면적 (㎟)을 종양 세포 접종 7일 후, 14일 후 및 21일 후에 측정하였다. 제7일부터 제21일까지, 마우스에게 "주사용 품질 등급"의 0.9% 염수 용액에 희석된 siRNA를 하루에 한번 복강내로 제공하거나 (200 ㎕/용량), 또는 위관영양에 의해 경구 전달하였다 (100 ㎕/용량). 제21일에 마우스를 희생시키고, 두개 림프절 전이를 칭량한 후 동결시켰다.
이러한 결과에서, 사용된 실제 siRNA 서열 및 화학은 표 3을 참조로 결정될 수 있다.
야생형 siRNA는 마우스 혈청에서 양쪽 3'-말단으로부터 분해된다
뉴클레아제에 의한 올리고뉴클레오티드 분해는 주로 3'-엑소뉴클레오라이틱(exonucleolytic)이다. 방향족 또는 친지성 잔기의 도입에 의한 말단에서의 안티센스 올리고뉴클레오티드의 변형은 이의 뉴클레오라이틱 분해를 지연시킨다17. 이러한 대사 경로가 siRNA에 대해서도 또한 우세할 것인지를 확인하기 위해, 본 발명가들은 37℃에서 미변형 siRNA (야생형 siRNA)를 마우스 혈청 내에서 3시간까지 인큐베이션하였다.
사용된 미변형 siRNA 서열은 pGl3-siRNA였다 (표 3 참조).
t=0분, t=30분, t=180분에 혼합물을 강한 음이온 교환 HPLC로 분석하였다.
도 1a, 1b 및 1c에 나타난 바와 같이, t=30분에, 평활 말단 siRNA에 상응하 는, 잘 한정된 피크가 관찰되었다. t=3h에 실질적인 분해가 관찰되었다. 도 1d 및 1e는 HPLC-ESI-MS 분석에 의해 확인된 대사물을 도해한다. 이러한 분석은 양쪽 모두의 가닥 상에서의 3' 오버행 및 3'-말단의 첫번째 염기 쌍형성 리보뉴클레오티드의 손실에 상응하는 여러 대사물의 존재를 나타냈다. 가이드 가닥의 5'-말단 리보뉴클레오티드의 소화 또한 관찰되었다.
도 1은 혈청 내에서의 미변형 siRNA의 분해 경로를 시사한다. DNA 오버행이 먼저 소화되고, 아마 3'-엑소뉴클레아제에 의해서일 것이다. LC-MS에서, 양쪽 가닥의 첫번째 염기-쌍형성 3'-리보뉴클레오티드, 그리고 또한 가이드 가닥의 첫번째 5'-염기-쌍형성 리보뉴클레오티드의 손실에 상응하는 추가적인 대사물이 또한 검출되었다.
3'-변형 siRNA는 위장관에서 안정적이다
2'-메톡시에틸 리보뉴클레오티드 오버행이 있는 siRNA (MOE o/h siRNA), 히드록시프로폭시 포스포디에스테르 부분으로 3'-캡핑된 평활-말단 siRNA (C3-siRNA), 및 각각의 가닥의 3'-말단에서의 처음 2개의 염기 쌍형성 뉴클레오티드가 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오티드 잔기로 변형된, 히드록시프로폭시 포스포디에스테르 3'-캡핑된 siRNA (C3-MOE siRNA)를 합성하였다. 이러한 화합물들이 도 2에 개략적으로 도해된다.
먼저, siRNA를 마우스 위산에서 2시간 동안 인큐베이션하였다 (도 3). C3 siRNA 및 C3-MOE sRNA의 경우 분해가 관찰되지 않은 반면, 야생형 siRNA의 분해가 30분 후에 관찰되었다.
래트의 장 세척액으로부터 수득된 장액에서의 안정성은 15분 후 야생형 siRNA의 거의 완전한 분해를 나타낸 반면, MOE o/h siRNA, C3-siRNA 및 C3-Moe siRNA 내의 모 화합물은 60분 동안 관찰되었다 (도 4).
간에서의 안정성을 간 미세소체 분석법 및 S12 분석법 (간 세포질 효소 활성을 나타냄)을 사용하여 평가하였다. 결과가 도 5에 제시된다. 양쪽 경우 모두에서, 60분의 인큐베이션 후 분해가 관찰되지 않았다.
마지막으로, siRNA를 37℃에서의 6시간까지의 2 마이크로몰의 인큐베이션에 의해 마우스 혈청에서 시험하였다 (도 6의 결과). 모 화합물 안정성을 젤 전기영동에 의해 추적하였다. 변형된 siRNA (C3 siRNA, C3-M0E siRNA 또는 MOE o/h siRNA)의 경우, 야생형 siRNA와는 달리 현저한 분해가 관찰되지 않았다.
이러한 연구는 야생형 (미변형) siRNA는 마우스 위산 및 마우스 혈청에서 대사된다는 것을 가리킨다. 3'-말단 변형 siRNA의 경우, 위장관에서 분해가 관찰되지 않았다. 따라서, 3'-변형 siRNA가 야생형 siRNA에 비해 경구 생체이용률이 더 높을 것이다.
전신 전달된 3'-변형 siRNA는 생체내 성장 인자 유도 혈관형성 모델
18
에서 더욱 활성이다.
먼저, 표적 유전자를 하향 조절하는 변형 siRNA (C3-siRNA 및 CE-MOE siRNA)의 능력을 항-VEGFR2 siRNA로 형질감염된 MS1 세포의 VEGFR2 표면 수준을 측정함으로써 세포 내에서 점검하였다.
야생형 siRNA, C3-siRNA 및 C3-MOE siRNA로서의 2개의 항-VEGFR2 siRNA의 풀을 복강내 투여하였다. 결과가 도 7에 제시된다. 풀링된 야생형 siRNA는 25 ㎍/마우스/일의 더 높은 용량에서 VEGF 유도 혈관증식을 현저하게 감소시켰다. 동일한 수준의 억제가 C3-siRNA로 5배 더 낮은 용량에서 관찰되었다. C3-M0E siRNA 풀의 경우, 혈관증식된 조직 중량의 현저한 감소가 최저 0.2 ㎍/마우스/일을 포함하는 모든 시험된 용량에서 관찰되었다.
도 8a 및 8b는, 복강내 제공되었을 때, VEGFR2-C3 및 C3-MOE siRNA 모두가 1 ㎍/마우스/일 미만의 용량에서 활성이었음을 나타낸다.
B16 동종이식 흑색종 종양 마우스 모델에서의 복강내 (i.p.) 제공된 항-VEGFR2 C3-MOE siRNA의 생체내 시험. 도 9a는 변형 VEGFR2-C3-MOE-siRNA를 사용한 복강내 처치가 종양 발달을 현저하게 감소시킨다는 것을 나타낸다. 도 9b 또한 20 ug/마우스의 VEGFR2-C3-MOE-siRNA의 복강내 주사로 종양 성장의 현저한 억제가 초래된다는 것을 나타낸다.
혈관형성 장애의 치료를 위한 siRNA의 경구 전달
도 10은 경구 제공되었을 때, 20 ㎍/마우스/일의 용량에서, VEGFR2-C3-MOE-siRNA 1이 혈관증식 중량을 기저 수준 (예를 들어 성장 인자 유도가 없는 중량)으로 감소시켰다는 것을 나타낸다. 사용된 실제 siRNA 서열은 표 3에서 지시된다.
항-Tie2 C3-MOE siRNA를 복강내 전달 및 경구 전달 모두 하에 성장 인자 유도 혈관형성 모델에서 또한 시험하였다. 도 11a 및 11b는 경구 제공되었을 때, Tie2에 지시된 양쪽 C3-MOE siRNA 모두 20 ㎍/마우스/일에서 활성이었음을 나타낸 다. 사용된 실제 siRNA 서열은 표 3을 참조로 결정될 수 있다.
데이타는 추가적인 내부 변형이 있거나 없는 3'-말단 변형 siRNA가 경구 투여 시 합리적인 용량에서 치료 효과를 나타낼 수 있다는 것을 나타낸다.
참조문헌
SEQUENCE LISTING
<110> Novartis International Pharmaceutical, Ltd.
<120> Short interfering ribonucleic acid (siRNA) for oral
administration
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<170> PatentIn version 3.3
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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uucguuucca uggaggugca a 21
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<211> 21
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<213> homo sapiens
<400> 256
ucaucuaaug ucagauucgg g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 257
uacuuguuga gugucucagt t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 258
augacgugcc aagaacucct t 21
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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uuucccagga ccucauagca a 21
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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aagagauauu ccuucaucga t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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augcauagcc aggaucuuga g 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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aucuguaaua uuugacaugt c 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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ugaucuaacu gaagcaccgg c 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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ucuguaaauu uguucacuct c 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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acuuccucuu ugcacuuggt g 21
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<213> homo sapiens
<400> 357
ugagugugca uuccuugaug a 21
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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uucugagucu caacuguagt a 21
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<213> homo sapiens
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uaaucuagca acagacguaa g 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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cucaacugua guaacaguct t 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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ucugagucuc aacuguagua a 21
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<213> homo sapiens
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uuccuuucac cuggaggaca g 21
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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uuggacgaua aucuagcaac a 21
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<213> homo sapiens
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acuguaguaa cagucuucct c 21
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<212> DNA
<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<211> 21
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<213> homo sapiens
<400> 374
gauaaucuag caacagacgt a 21
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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uuauggcaga auuggccauc a 21
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<212> DNA
<213> homo sapiens
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caaguucuga gucucaacug t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 377
ugugcagucc cuagcuuucc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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ucccuuggag uugaugucag t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 379
auggcagaau uggccaucat g 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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uggccaucau gaugcaggcc t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 381
gucacuuggg cauuaacact t 21
<210> 382
<211> 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<212> DNA
<213> homo sapiens
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<212> DNA
<213> homo sapiens
<400> 499
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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ccagcuacau gaucagcuat t 21
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<213> homo sapiens
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gaauuuccug ggacagcaat t 21
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<212> DNA
<213> homo sapiens
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<212> DNA
<213> homo sapiens
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caggaaaccu ggagaaucat t 21
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<212> DNA
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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<211> 21
<212> DNA
<213> homo sapiens
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<211> 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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ugacuucggu gcuacuuaat t 21
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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<213> homo sapiens
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Claims (35)
- 제1항에 있어서, 각각의 가닥의 3' 말단에서의 처음 2개의 염기 쌍형성 뉴클레오티드가 변형된 것인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 각각의 가닥의 3' 말단에서의 처음 2개의 염기 쌍형성 뉴클레오티드가 2'-메톡시에틸 리보뉴클레오티드 잔기인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 2개의 가닥이 뉴클레오티드 19개 이상에 걸쳐 서로에 대해 상보적인 siRNA.
- 제4항에 있어서, 각각의 가닥이 뉴클레오티드 19개인 siRNA.
- 제1항에 있어서, siRNA의 두 말단이 평활(blunt)-말단인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 각각의 가닥이 뉴클레오티드 19개인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 2개의 가닥이 뉴클레오티드 19개에 걸쳐 서로에 대해 완전히 상보적이고, siRNA가 평활-말단인 siRNA.
- 제2항에 있어서, 1개 이상의 추가 뉴클레오티드가 변형된 것인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 표준 위산 분석법에서의 안정성이 동일 뉴클레오티드 서열의 미변형 siRNA보다 더 높은 siRNA.
- 제1항에 있어서, 표준 위산 분석법에서의 안정성이 30분 노출 후 50% 이상인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 표준 혈청 분석법에서의 안정성이 동일 뉴클레오티드 서열의 미변형 siRNA보다 더 높은 siRNA.
- 제1항에 있어서, 표준 혈청 분석법에서의 안정성이 30분 노출 후 50% 이상인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 표준 장 세척액 분석법에서의 안정성이 동일 뉴클레오티드 서열의 미변형 siRNA보다 더 높은 siRNA.
- 제1항에 있어서, 동일 뉴클레오티드 서열의 미변형 siRNA와 비교하여 생체이용률이 증강된 siRNA.
- 제1항에 따른 siRNA 및 제약상 허용가능한 담체를 포함하는 제약 조성물.
- 제1항에 있어서, 약제로서 사용하기 위한 siRNA.
- 제1항에 있어서, 각각의 가닥의 3' 말단에서의 처음 2개의 염기 쌍형성 뉴클레오티드가 변형되고, 각각의 변형된 뉴클레오티드가 아미드 결합인 뉴클레오시드간(internucleoside) 결합을 갖는 것인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 비경구적으로 투여되는 약제로서 사용하기 위한 siRNA.
- 제1항에 있어서, 각각의 가닥의 3' 말단에서의 처음 2개의 염기 쌍형성 뉴클레오티드가 변형되고, 각각의 변형된 뉴클레오티드가 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트, 포스포르아미데이트, 보라노포스포노에이트 및 아미드 결합으로부터 선택된 변형된 뉴클레오시드간 결합을 갖는 뉴클레오티드로부터 선택되는 것인 siRNA.
- 제4항에 있어서, siRNA의 한 말단이 평활-말단인 siRNA.
- 제1항에 있어서, 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나 이상에 1개 내지 6개 뉴클레오티드의 오버행(overhang)을 포함하는 siRNA.
- 제1항에 있어서, 경구적으로, 국소적으로, 비경구적으로, 흡인 또는 스프레이에 의해, 또는 직장 내로 투여되거나, 경피, 피하, 혈관내, 정맥내, 근육내, 복강내, 수막강내 또는 주입 기술에 의해 투여되는 약제로서 사용하기 위한 siRNA.
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