MX2007015944A - Anticuerpos cd19 y sus usos. - Google Patents

Anticuerpos cd19 y sus usos.

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David John King
Jie Liu
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Do To Uyen Thi
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Abstract

La presente descripcion proporciona anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos que se enlazan especificamente a CD 19 con alta afinidad. Tambien se proporcionan moleculas de acido nucleico que codifican para tales anticuerpos CD 19, vectores de expresion, celulas huesped y metodos para expresar los anticuerpos CD 19. Tambien se proporcionan inmunoconjugados, moleculas biespecificas y composiciones farmaceuticas que comprenden los anticuerpos CD 19. Se describen metodos para detectar CD 19, asi como metodos para tratar diversas malignidades de celulas B, incluyendo linfoma no de Hodgkin.

Description

ANTICUERPOS CDl9 Y SUS USOS Referencia Cruzada a Solicitudes Relacionadas Esta solicitud reivindica el beneficio de la Solicitud Provisional de Patente de E.U. No. 60/692,531, presentada en Junio 20 de 2005; la Solicitud Provisional de Patente de E.U. No. 60/748,956, presentada en Diciembre 8, de 2005; y la Solicitud Provisional de Patente de E.U. No. 60/804,083, presentada en Junio 6 de 2006; todas las cuales se incorporan en la presente mediante la referencia en su totalidad. ANTECEDENTES El CD19 es un receptor de membrana de 95 kDa que se expresa tempranamente en la diferenciación de célula B y se continúa expresado hasta que las células B se activan para diferenciarse finalmente (Pezzutto et al . , (1987), J. Immunol . , 138:2793; Tedder e t al . , (1994) Immunol . Today, 15:437) . El dominio extracelular de CD19 contiene dos dominios tipo inmunoglobulina (IG) tipo C2 separados por un dominio más pequeño potencialmente enlazado a disulfuro. El dominio citoplásmico de CD19 es estructuralmente único, pero altamente conservado entre humano, ratón y conejillo de Indias (Fujimoto et al . , (1998), Semin . Immunol . , 10:267). El CD19 es parte de un complejo de proteinas encontrado en la superficie celular de linfocitos B. El complejo de proteinas incluye CD19, CD21 (receptor de complemento, tipo 2), CD81 (TAPA-1), y CD225 (Leu-13) (Fujimoto, supra ) . El CD19 es un importante regulador de señales transmembrana en células B. Un incremento o disminución en la densidad de superficie celular del CD19 afecta el desarrollo y la función de la célula B, dando como resultado enfermedades tales como autoinmunidad o hipogamaglobulinemia (Fujimoto, supra ) . El complejo de CD19 potencia la respuesta de las células B al antigeno in vivo a través de la reticulación de dos complejos de transducción de señal separados encontrados en membranas de célula B. Los dos complejos de transducción de señal, asociados con IgM y CD19 de membrana, activan la fosfolipasa C (PLC) mediante diferentes mecanismos. La reticulación de CD19 y el receptor de célula B reduce el número de moléculas de IgM requerido para activar PLC (Fujimoto, supra ; Ghetie, supra ) . Adicionalmente, el CD19 funciona como una proteina adaptadora especializada para la amplificación de cinasas de la familia Are (Hasega a et al . , (2001) J. Immunol . , 167:3190). La unión de CD19 ha mostrado tanto mejorar como inhibir la activación y proliferación de la célula B, dependiendo de la cantidad de reticulación que se presenta (Tedder, supra ) . El CD19 se expresa en más del 90% de los linfomas de célula B y se predice que afecta el crecimiento de linfomas in vi tro e in vivo (Ghetie, supra ) . Los anticuerpos generados para CD19 han sido anticuerpos murinos.
Una desventaja del uso de un anticuerpo murino en el tratamiento de sujetos humanos es la respuesta anti-ratón humana (HAMA) en la administración al paciente. Por consiguiente, existe la necesidad de anticuerpos terapéuticos mejorados contra CD19 que sean más efectivos para el tratamiento y/o prevención de enfermedades mediadas por CD19. SUMARIO La presente invención proporciona anticuerpos monoclonales aislados, en particular anticuerpos monoclonales humanos, que se unen a CD19 y que exhiben numerosas propiedades deseables. Estas propiedades incluyen alta afinidad de unión a CD19 humano. También se proporcionan métodos para tratar una variedad de enfermedades mediadas por CD19 utilizando los anticuerpos y composiciones de la invención. En un aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo: [a) se une al CD19 humano con un KD de 1 x 107 M o menor; ,b) se une a células tumorales de célula B Raji y Daudi . Preferentemente, el anticuerpo es un anticuerpo humano, aunque en modalidades alternativas, el anticuerpo puede ser un anticuerpo murino, un anticuerpo quimérico o un anticuerpo humanizado. En una modalidad, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 5 x 10~8 M o menor, se une a CD19 humano con un KD de 2 x 10~8 M o menor, se une a CD19 humano con un KD de 1 x 10~8 M o menor, se une a CD19 humano con un KD de 5 x 10~9 M o menor, se une a CD19 humano con un KD de 4 x 10~9 M o menor, se une a CD19 humano con un KD de 3 x 10~9 M o menor, 0 se une a CD19 humano con un KD de 2 x 10"9 M o menor. En otra modalidad, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo compite de manera cruzada por la unión a CD19 con un anticuerpo de referencia en donde el anticuerpo: (a) se une a CD19 humano con un KD de 1 x 10~7 M o menor; y (b) se une a células tumorales de célula B Raji y Daudi . En varias modalidades, el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; o el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15; En otro aspecto, la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 5-51 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. La invención proporciona también un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 1-69 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. La invención proporciona aún adicionalmente un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? L18 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. La invención proporciona aún adicionalmente un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? A27 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. La invención proporciona aún adicionalmente un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? L15 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. En una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada de un gen VH 5-51 o 1-69 humano; (b) una región variable de cadena ligera de un gen V? L18, A27 o V? L15 humano; en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. En otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia CDR3 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35, y 36, y modificaciones conservadoras de las mismas; (b) la secuencia CDR3 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57, y 58, y modificaciones conservadoras de las mismas; (c) el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 1 x 10~7 M o menor; y (d) se une a células tumorales de célula B Raji y Daudi . Preferentemente, la secuencia CDR2 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28, y 29, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDR2 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49, y 50, y modificaciones conservadoras de las mismas. Preferentemente, la secuencia CDRl de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21, y 22, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDRl de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42, y 43, y modificaciones conservadoras de las mismas. Una combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 51. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 52.
Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 38; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 45; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 53. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 39; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 46; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 54. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 40; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 47; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 55. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 20; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 27; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 41; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 48; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 56. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 57. Otra combinación preferida comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 22; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 29; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 36; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 43; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 50; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 58. Otros anticuerpos preferidos de la invención, o porciones de unión a antígeno de los mismos comprenden: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 2 y 3, 4, 5, 6 y 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y ; en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. Una combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 8. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 9. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 10. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 11. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 12. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 13. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 14. Otra combinación preferida comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto de la invención, se proporcionan anticuerpos, o porciones de unión a antígeno o fragmentos de los mismos, que compiten por la unión a CD19 con cualquiera de los anticuerpos antes mencionados.
Los anticuerpos de la invención, por ejemplo, pueden ser anticuerpos de longitud total, por ejemplo de un isotipo IgGl o IgG4. Alternativamente, los anticuerpos pueden ser fragmentos de anticuerpo, tales como fragmentos Fab, Fab' o Fab' 2, o anticuerpos monocatenarios. La invención proporciona también un inmunoconjugado que comprende un anticuerpo de la invención, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, unido a un agente terapéutico, tal como una citotoxina o un isótopo radiactivo. La invención proporciona también una molécula biespecífica que comprende un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, de la invención, unido a un segundo residuo funcional que tiene una especificidad de unión diferente a la de dicho anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo. También se proporcionan composiciones que comprenden un anticuerpo o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, o un inmunoconjugado o molécula biespecífica de la invención y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos, o porciones de unión a antígeno o fragmentos de los mismos, de la invención también se encuentran abarcadas por la invención, así como los vectores de expresión que comprenden tales ácidos nucleicos y células huésped que comprenden tales vectores de expresión. Otras características y ventajas de la presente invención se harán aparentes a partir de la siguiente descripción detallada y ejemplos que no deben tomarse como limitantes. El contenido de todas las referencias, entradas al Genbank, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud, se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS La Figura ÍA muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 59) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 1) de la región variable de cadena pesada de los anticuerpos monoclonales humanos 21D4 y 21D4a. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 16), CDR2 (SEQ ID NO: 23) y CDR3 (SEQ ID NO: 30) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V, D y J. La Figura IB muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 66) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 8) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 21D4. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 44) y CDR3 (SEQ ID NO: 51) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J. La Figura 1C muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 67) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 9) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 21D4a. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 37), CDR2 (SEQ ID NO: 44) y CDR3 (SEQ ID NO: 52) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J. La Figura 2A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 60) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 47G4. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 17), CDR2 (SEQ ID NO: 24) y CDR3 (SEQ ID NO: 31) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J. La Figura 2B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 68) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 10) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 47G4. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 38), CDR2 (SEQ ID NO: 45) y CDR3 (SEQ ID NO: 53) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J- La Figura 3A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 61) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 3) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 27F3. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 18), CDR2 (SEQ ID NO: 25) y CDR3 (SEQ ID NO: 32) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V, D y J. La Figura 3B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 69) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 11) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 27F3. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 39), CDR2 (SEQ ID NO: 46) y CDR3 (SEQ ID NO: 54) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V Y J- La Figura 4A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 62) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 4) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 3C10. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 19), CDR2 (SEQ ID NO: 26) y CDR3 (SEQ ID NO: 33) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V, D y J. La Figura 4B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 70) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 12) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 3C10. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 40), CDR2 (SEQ ID NO: 47) y CDR3 (SEQ ID NO: 55) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J- La Figura 5A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 63) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 5) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 5G7. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 20), CDR2 (SEQ ID NO: 27) y CDR3 (SEQ ID NO: 34) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V. D y J. La Figura 5B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 71) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 13) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 5G7. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 41), CDR2 (SEQ ID NO: 48) y CDR3 (SEQ ID NO: 56) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J. La Figura 6A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 64) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 6) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 13F1. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 21), CDR2 (SEQ ID NO: 28) y CDR3 (SEQ ID NO: 354) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V, D y J. La Figura 6B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 72) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 14) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 13F1. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 42), CDR2 (SEQ ID NO: 49) y CDR3 (SEQ ID NO: 57) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J.
La Figura 7A muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 65) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 7) de la región variable de cadena pesada del anticuerpo monoclonal humano 46E8. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 22), CDR2 (SEQ ID NO: 29) y CDR3 (SEQ ID NO: 36) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V, D y J. La Figura 7B muestra la secuencia de nucleótidos (SEQ ID NO: 73) y la secuencia de aminoácidos (SEQ ID NO: 15) de la región variable de cadena ligera del anticuerpo monoclonal humano 46E8. Las regiones CDRl (SEQ ID NO: 43), CDR2 (SEQ ID NO: 50) y CDR3 (SEQ ID NO: 58) se encuentran delineadas y se indican las derivaciones de línea germinal V y J. La Figura 8 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 21D4 (SEQ ID NO: 1) y 21D4a (SEQ ID NO: 1) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 5-51 (SEQ ID NO: 74). La línea germinal JH4b se describe como SEQ ID NO: 80. La Figura 9 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 47G4 (SEQ ID NO: 2) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 1-69 (SEQ ID NO: 75) . La línea germinal JH5b se describe como SEQ ID NO: 81. La Figura 10 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 27F3 (SEQ ID NO: 3) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 5-51 (SEQ ID NO: 74) . La línea germinal JH6b se describe como SEQ ID NO: 82. La Figura 11 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3C10 (SEQ ID NO: 4) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 1-69 (SEQ ID NO: 75). La línea germinal JH6b se describe como SEQ ID NO: 82. La Figura 12 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 5G7 (SEQ ID NO: 5) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 5-51 (SEQ ID NO: 74) . La línea germinal JH6b se describe como SEQ ID NO: 83. La Figura 13 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 13F1 (SEQ ID NO: 6) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 5-51 (SEQ ID NO: 74) . La línea germinal JH6b se describe como SEQ ID NO: 82. La Figura 14 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 46E8 (SEQ ID NO: 7) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana VH 5-51 (SEQ ID NO: 74) . La línea germinal JH6b se describe como SEQ ID NO: 82. La Figura 15 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 21D4 (SEQ ID NO: 8) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V? L18 (SEQ ID NO: 76) . La línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 84. La Figura 16 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 21D4a (SEQ ID NO: 9) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V? L18 (SEQ ID NO: 76) . La línea germinal JK3 se describe como SEQ ID NO: 85. La Figura 17 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 47G4 (SEQ ID NO: 10) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V? A27 (SEQ ID NO: 77) . La línea germinal JK3 se describe como SEQ ID NO: 85. La Figura 18 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 27F3 (SEQ ID NO: 11) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V L18 (SEQ ID NO: 76) . La línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 84. La Figura 19 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3C10 (SEQ ID NO: 12) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V? L15 (SEQ ID NO: 78). La línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 84. La Figura 20 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 5G7 (SEQ ID NO: 13) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V? L18 (SEQ ID NO: 76) . La línea germinal JK1 se describe como SEQ ID NO: 86. La Figura 21 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 13F1 (SEQ ID NO: 14) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana Vk L18 (SEQ ID NO: 76) . La línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 87. La Figura 22 muestra la alineación de la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 46E8 (SEQ ID NO: 15) con la secuencia de aminoácidos de la línea germinal humana V? L18 (SEQ ID NO: 76) . La línea germinal JK2 se describe como SEQ ID NO: 87. La Figura 23 es una gráfica que muestra los resultados de experimentos demostrando que el anticuerpo monoclonal humano, 47G7, dirigidos contra CD19 humano, se unen específicamente a CD19 humano. La Figura 24 es una gráfica que muestra los resultados de experimentos demostrando que los anticuerpos monoclonales humanos contra CD19 compiten por la unión con células Raji. La Figura 25A-D muestra los resultados de experimentos de citometría de flujo demostrando que los anticuerpos monoclonales humanos 21D4, 21D4a, 47G7, 3C10, 5G7 y 13F1, dirigidos contra CD19 humano, se unen a la superficie celular de líneas celulares de tumor de célula B. (A) Citometría de flujo de HuMAbs 21D4 y 47G4 en células CHO transfectadas con CD19 humano. (B) Citometría de flujo de HuMAbs 47G4 en células tumorales B Daudi . (C) Citometría de flujo de HuMAbs 21D4 y 47G4 en células tumorales B Raji. (D) Citometría de flujo de HuMAbs 21D4, 21D4a, 3C10, 5G7 y 13F1 en células tumorales B Raji. Las Figuras 26A-B muestran los resultados de experimentos de internalización demostrando que los anticuerpos monoclonales humanos 21D4 y 47G7, dirigidos contra CD19 humano, entran en las células tumorales B Raji CHO-CD19 y de expresión de CD19 mediante un ensayo de liberación de timidina 3H. (A) internalización del HuMAb 47G7 dentro de las células CHO-CD19. (B) internalización de los HuMAbs 21D4 y 47G7 dentro de células tumorales B Raji. La Figura 27 muestra los resultados de un análisis de incorporación de timidina demostrando que los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CD19 humano destruyen las células tumorales de célula B Raji. La Figura 28 muestra una curva Kaplan-Meier de supervivencia de ratón en un modelo sistémico Ramos. La Figura 29 muestra el cambio en el peso corporal de ratones en un modelo sistémico Ramos. La Figura 30A-B muestra los resultados de un estudio de modelo de tumor de ratón in vivo demostrando que el tratamiento con anticuerpo 21D4 anti-CD19 desnudo tiene un efecto directamente inhibidor sobre los tumores linfoma in vivo . (A) tumores ARH-77 (B) tumores Raji. La Figura 31 muestra los resultados de un análisis de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) demostrando que los anticuerpos anti-CD19 monoclonales humanos no fucosilados tienen citotoxicidad celular aumentada en células de leucemia humana de manera dependiente de ADCC. La Figura 32 muestra los resultados de un estudio de modelo de tumor de ratón in vivo demostrando que los anticuerpos anti-CD19 conjugados con toxina reducen el volumen del tumor. La Figura 33 muestra el cambio en el peso corporal de ratones en un estudio de modelo de tumor Raji. La Figura 34 muestra los resultados de un estudio en mono cynomolgus mostrando una disminución en la población de células CD20+ después del tratamiento de HuMAbs anti-CD19 fucosilados o no fucosilados. La Figura 35 muestra los resultados de monos cynomolgus individuales siguiendo el tratamiento con HuMAbs anti-CD19 fucosilados o no fucosilados. La Figura 36A-C muestra los resultados de un análisis de incorporación de timidina demostrando que los anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CD19 humano solos o conjugados con toxina destruyen a las células tumorales y células B Raji y SU-DHL-6. DESCRIPCIÓN DETALLADA La presente descripción se refiere a anticuerpos monoclonales aislados, particularmente anticuerpos monoclonales humanos, que se unen específicamente a CD19 con alta afinidad. En ciertas modalidades, los anticuerpos de la invención se derivan de secuencias particulares de línea germinal de cadena pesada y ligera y/o comprenden características estructurales particulares tales como las regiones CDR que comprenden secuencias de aminoácidos particulares. La invención proporciona anticuerpos aislados, métodos para producir tales anticuerpos, inmunoconjugados y moléculas biespecíficas que comprenden tales anticuerpos y composiciones farmacéuticas que contienen los anticuerpos, inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. La invención se refiere también a métodos para utilizar los anticuerpos, tales como para detectar CD19, así como para tratar enfermedades asociadas con la expresión de CD19, tales como malignidades de célula B que expresan CD19. En consecuencia, la invención proporciona también métodos para utilizar los anticuerpos anti-CD19 de la invención para tratar malignidades de célula B, por ejemplo, en el tratamiento de linfoma no de Hodgkin, leucemias linfocíticas crónicas, linfomas foliculares, linfomas de célula grande difusa de linaje B y mielomas múltiples. A fin de que la presente invención se entienda más fácilmente, se definen primero ciertos términos. Se describen definiciones adicionales a lo largo de la descripción detallada. El término "CD19" se refiere, por ejemplo, a variantes, isoformas, y especies homologas de CD19 humano. En consecuencia, los anticuerpos humanos de esta descripción pueden, en ciertos casos, reaccionar de manera cruzada con CD19 de otras especies no humanas. En ciertas modalidades, los anticuerpos pueden ser completamente específicos para una o más proteínas de CD19 humanas y pueden no exhibir especies u otros tipos de reactividad cruzada no humana. La secuencia de aminoácidos completa de un CD19 humano ejemplar tiene el número de acceso Genbank NM_001770 (SEQ ID NO: 79) . El término "respuesta inmune" se refiere a la acción, por ejemplo, de linfocitos, células que presentan antígeno, células fagocíticas, granulocitos, y macromoléculas solubles producidas por las células anteriores o el hígado (incluyendo anticuerpos, citosinas, y complementos) que da como resultado un daño selectivo a, la destrucción de, o la eliminación de patógenos . invasores, células o tejidos infectados con patógenos, células cancerosas, o en casos de autoinmunidad o inflamación patológica, células o tejidos normales humanos del cuerpo humano.
Una "trayectoria de transducción de señal" se refiere a la relación bioquímica entre una variedad de moléculas de transducción de señal que juegan un papel en la transmisión de una señal desde una porción de una célula hasta otra porción de una célula. Como se utiliza en la presente, la frase "receptor de superficie celular" incluye, por ejemplo, moléculas y complejos de moléculas capaces de recibir una señal y la transmisión de tal señal a través de la membrana de plasma de una célula. Un ejemplo de un "receptor de superficie celular" de la presente invención es el receptor CD19. El término "anticuerpo" como se refiere en la presente incluye anticuerpos y cualquier fragmento de unión a antígeno (i.e., "porción de unión a antígeno") o cadenas únicas de los mismos. Un "anticuerpo" se refiere a una glicoproteína que comprende al menos dos cadenas pesadas (H) y dos cadenas ligeras (L) interconectadas por uniones disulfuro, o una porción de unión a antígeno de la misma. Cada cadena pesada se encuentra comprendida de una región variable de cadena pesada (abreviada en la presente como VH) y una región constante de cadena pesada. La región constante de cadena pesada se encuentra comprendida de tres dominios, CH1, CH2 y CH3. Cada cadena ligera se encuentra comprendida de una región variable de cadena ligera (abreviada en la presente como VL) y una región constante de cadena ligera.
La región constante de cadena ligera se encuentra comprendida de un dominio CL. Las regiones VH y VL pueden subdividirse adicionalmente en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de complementariedad (CDR) , intercaladas con regiones que se encuentran más conservadas, denominadas regiones de estructura (FR) . Cada VH y VL se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestas desde la terminación amino hasta la terminación carboxi en el siguiente orden: FR1, CDRl, FR2 , CDR2, FR3, CDR3, FR4. Las regiones variables de las cadenas pesada y ligera contienen un dominio de unión que interactúa con un antígeno. Las regiones constantes de los anticuerpos pueden mediar la unión de la inmunoglobulina a tejidos huésped o factores, incluyendo diversas células del sistema inmune (e.g., células efector) y el primer componente (CIq) del sistema clásico de complemento. El término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo (o simplemente "porción de anticuerpo") como se utiliza en la presente, se refiere a uno o más fragmentos de un anticuerpo que retienen la capacidad para unirse específicamente a un antígeno (e.g., CD19) . Se ha demostrado que la función de unión a antígeno de un anticuerpo puede efectuarse mediante fragmentos de un anticuerpo de longitud total. Ejemplos de fragmentos de unión abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo incluyen (i) un fragmento Fab, un fragmento monovalente que consiste de los dominios VL, VH, C y CH1; (ii) un fragmento F(ab')2, un fragmento bivalente que comprende dos fragmentos Fab unidos mediante un puente disulfuro en la región de articulación; (iii) un fragmento Fab', que es esencialmente un Fab con parte de la región de articulación (ver, FUNDAMENTAL IMMUNOLOGY, Paul ed . , 3.sup.rd ed. 1993); (iv) un fragmento Fd que consiste de los dominios VH y CH1; (v) un fragmento Fv que consiste de los dominios VL y VH de una sola sección de un anticuerpo, (vi) un fragmento dAb (Ward et al . , (1989) Nature 341:544-546), que consiste de un dominio VH; (vii) una región determinante de complementariedad aislada (CDR); y (viii) un nanocuerpo, una región variable de cadena pesada que contiene un único dominio variable y dos dominios constantes. Además, aunque los dos dominios del fragmento Fv, VL y VH, se encuentran codificados por genes separados, pueden unirse utilizando métodos recombinantes, mediante una unión sintética que permite prepararlos como una cadena de proteína única en la cual las regiones VL y VH forman un par para formar moléculas monovalentes (conocidas como Fv monocatenario (scFv); ver e . g. , Bird et al . , (1988) Science 242:423-426; y Huston e t al . , (1988) Proc . Na tl . Acad . Sci . EUA 85:5879-5883). Tales anticuerpos monocatenarios también pretenden encontrarse abarcados dentro del término "porción de unión a antígeno" de un anticuerpo. Estos fragmentos de anticuerpo se obtienen utilizando técnicas convencionales conocidas por los expertos en la técnica, y los fragmentos se visualizan por utilidad de la misma manera que los anticuerpos intactos. Un "anticuerpo aislado" como se utiliza en la presente, pretende referirse a un anticuerpo que se encuentra sustancialmente libre de otros anticuerpos que tienen diferente especificidad antigénica (e.g., un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD19 se encuentra sustancialmente libre de anticuerpos que se unen específicamente a antígenos diferentes a CD19) . Sin embargo, un anticuerpo aislado que se une específicamente a CD19, tiene reactividad cruzada a otros antígenos, tales como moléculas CD19 de otras especies. Además, un anticuerpo aislado puede encontrarse sustancialmente libre de otro material celular y/o químicos. Los términos "anticuerpo monoclonal" o "composición de anticuerpo monoclonal" como se utiliza en la presente se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de composición molecular única. Una composición de anticuerpo monoclonal despliega una única especificidad y afinidad de unión para un epítope particular. El término "anticuerpo humano" como se utiliza en la presente, pretende incluir anticuerpos que tienen regiones variables en las cuales las regiones tanto de estructura como CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Además, si el anticuerpo contiene una región constante, la región constante se deriva también de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Los anticuerpos humanos de la invención pueden incluir residuos de aminoácido no codificados por secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana (e.g., mutaciones introducidas por mutagénesis aleatoria o específica del sitio in vi tro o mediante mutación somática in vivo) . Sin embargo, el término "anticuerpo humano" como se utiliza en la presente, no pretende incluir anticuerpos en los cuales las secuencias CDR derivadas de la línea germinal de otra especie de mamífero, tal como un ratón, se han injertado en secuencias de estructura humana. El término "anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que despliegan una única especificidad de unión que tienen regiones variables en las cuales las regiones tanto de estructura como CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. En una modalidad, los anticuerpos monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, e.g., un ratón transgénico que tiene un genoma que comprende un transgen humano de cadena pesada y un transgen de cadena ligera fusionado a una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo humano recombinante" como se utiliza en la presente, incluye todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aislan mediante medios recombinantes, tales como (a) anticuerpos aislados de un animal (e.g., un ratón) que es transgénico o transcromosomal para genes de inmunoglobulina humana o un hibridoma preparado de los mismos (descrito adicionalmente abajo), (b) anticuerpos aislados de una célula huésped transformada para expresar el anticuerpo humano, e.g., de un transfectoma, (c) anticuerpos aislados de una biblioteca de anticuerpos humanos recombinante de combinación, y (d) anticuerpos preparados, expresados, creados o aislados mediante otros medios que implican la división de secuencias de gen de inmunoglobulina humana en otras secuencias de ADN. Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen regiones variables en las cuales las regiones de estructura y CDR se derivan de secuencias de inmunoglobulina de línea germinal humana. Sin embargo, en ciertas modalidades, tales anticuerpos humanos recombinantes pueden someterse a mutagénesis in vi tro (o cuando se utiliza un animal transgénico para las secuencias Ig humanas, mutagénesis somática in vivo) y por consiguiente las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque se derivan de, y se relacionan con secuencias VH y VL de línea germinal humana, pueden no existir naturalmente dentro del repertorio de la línea germinal de anticuerpo humano in vivo . Como se utiliza en la presente, "isotipo" se refiere a la clase de anticuerpo (e.g., IgM o IgGl) que se codifica por los genes de la región constante de cadena pesada . Las frases "un anticuerpo que reconoce un antígeno" y "un anticuerpo específico para un antígeno" se utilizan de manera intercambiable en la presente con el término "un anticuerpo que se une específicamente a un antígeno". El término "derivativos de anticuerpo humano" se refiere a cualquier forma modificada del anticuerpo humano, e.g., una conjugación del anticuerpo y otro agente o anticuerpo. El término "anticuerpo humanizado" pretende referirse a anticuerpos en los cuales las secuencias CDR se derivan de la línea germinal de otras especies mamíferas, tales como un ratón, se han injertado en secuencias de estructura humana. Se pueden efectuar modificaciones de región de estructura dentro de las secuencias de estructura humana . El término "anticuerpo quimérico" pretende referirse a anticuerpos en los cuales las secuencias de región variable se derivan de una especie y las secuencias de región constante se derivan de otra especie, tal como un anticuerpo en el cual las secuencias de región variable se derivan de un anticuerpo de ratón y las secuencias de región constante se derivan de un anticuerpo humano. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo que "se une específicamente a CD19 humano" pretende referirse a un anticuerpo que se une a CD19 humano con un KD de 1 x 10"7 M o menor, más preferentemente 5 x 10~8 M o menor, más preferentemente 3 x 10"8 M o menor, más preferentemente 1 x 10"8 M o menor, e incluso más preferentemente 5 x 10~9 M o menor. El término "Kassoc" o "Ka" como se utiliza en la presente, pretende referirse a la proporción de asociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno, mientras que el término "Kdj.s" o "Kd," como se utiliza en la presente, pretende referirse a una proporción de disociación de una interacción particular de anticuerpo-antígeno. El término "KD" como se utiliza en la presente, pretende referirse a la constante de disociación que se obtiene de la relación de Kd a Ka (i.e., Kd/Ka) y se expresa como una concentración molar (M) . Los valores KD para anticuerpos pueden determinarse utilizando métodos muy establecidos en la técnica. Un método preferido para determinar el KD de un anticuerpo es utilizando la resonancia plasmon de superficie, preferentemente utilizando un sistema de biosensor tal como el sistema Biacore®.
Como se utiliza en la presente, el término "alta afinidad" para un anticuerpo IgG se refiere a un anticuerpo que tiene un KD de 1 x 10"7 M o menor, más preferentemente de 5 x 10"8 M o menor e incluso más preferentemente de 1 x 10"9 M o menor e incluso más preferentemente de 5 x 10~9 M o menor para un antígeno objetivo. Sin embargo, la unión de "alta afinidad" puede variar para otros isotipos de anticuerpo. Por ejemplo, la unión de "alta afinidad" para un isotipo IgM se refiere a un anticuerpo que tiene un KD de 10~6 M o .menor, más preferentemente de 10~7 M o menor, e incluso más preferentemente de 10"8 M o menor. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" incluye cualquier animal humano o no humano. El término "animal no humano" incluye todos los vertebrados, e.g., mamíferos y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, caballos, vacas, pollos, anfibios, reptiles, etc. Anticuerpos Anti-CD19 Los anticuerpos de la invención, se caracterizan por características o propiedades funcionales particulares de los anticuerpos. Por ejemplo, los anticuerpos se unen específicamente a CD19 humano. Preferentemente, un anticuerpo de la invención se une a CD19 con alta afinidad, por ejemplo con un KD de 1 x 10"7 M o menor. Los anticuerpos anti-CD19 de la invención exhiben preferentemente una o más de las características siguientes: (a) se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10~7 M o menor; (b) se une a células tumorales de células B Raji y Daudi. Preferentemente, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 5 x 10~8 M o menor, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 1 x 10~8 M o menor, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 5 x 10"9 M o menor, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 4 x 10~9 M o menor, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 3 x 10~9 M o menor, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 2 x 10" 9 M o menor, el anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 1 x 10~9 M o menor. Se conocen en la técnica análisis estándar para evaluar la capacidad de unión de los anticuerpos hacia CD19, incluyendo por ejemplo, ELISAs, inmunoanálisis Western, RIAs y análisis de citometría de flujo. Los análisis adecuados se describen en detalle en los Ejemplos. La cinética de unión (e.g., afinidad de unión) de los anticuerpos también puede, establecerse mediante análisis estándar conocidos en la técnica, tal como mediante análisis Scatchard o Biacore®. Para establecer la unión de células tumorales de células B Raji o Daudi, las células Raji (ATCC Deposito No. CCL-86) o Daudi (ATCC Deposito No. CCL-213) pueden obtenerse de fuente públicamente disponibles, tales como la American Type Culture Collection, y utilizarse en análisis estándar, tales como análisis de citometría de flujo. Anticuerpos Monoclonales 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 Los anticuerpos preferidos de la invención son los anticuerpos monoclonales humanos 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8, aislados y estructuralmente caracterizados como se describe en los Ejemplos 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22. Las secuencias de aminoácidos VH de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 1, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7, respectivamente. Las secuencias de aminoácidos VL de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15, respectivamente. Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a CD19, las secuencias VH y VL pueden "mezclarse e igualarse" para crear otras moléculas de unión a anti-CD19 de la invención. La unión a CD19 de tales anticuerpos "mezclados e igualados" puede probarse utilizando los análisis de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (e.g., ELISAs) . Preferentemente, cuando las cadenas VH y VL se mezclan e igualan, una secuencia VH de un par particular de VH/VL se reemplaza con una secuencia VH estructuralmente similar. De manera similar, preferentemente una secuencia VL de un par particular de VH/VL se reemplaza con una secuencia VL estructuralmente similar. En consecuencia, en un aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15; en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19, preferentemente a CD19 humano. Las combinaciones preferidas de cadena pesada y ligera incluyen : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14; o (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15. En otro aspecto, la invención proporciona anticuerpos que comprenden las CDRls, CDR2s y CDR3s de cadena pesada y de cadena ligera de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8, o combinaciones de las mismas. Las secuencias de aminoácidos de las CDRls VH de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s VH de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s VH de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36. Las secuencias de aminoácidos de las CDRls V? de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43. Las secuencias de aminoácidos de las CDR2s V? de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50. Las secuencias de aminoácidos de las CDR3s V? de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58. Las regiones CDR se delinean utilizando el sistema Kabat (Kabat, E. A., et al . , (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242) . Dado que cada uno de estos anticuerpos puede unirse a CD19, y que la especificidad de unión a antígeno se proporciona principalmente por las regiones CDRl, CDR2 y CDR3, las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 VH y las secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 V? pueden "mezclarse e igualarse" (i.e., las CDRs de diferentes anticuerpos pueden mezclarse e igualarse, aunque cada anticuerpo debe contener una CDRl, CDR2 y CDR3 VH y una CDRl, CDR2 y CDR3 V?) para crear otras moléculas de unión a anti-CD19 de la invención. La unión a CD19 de tales anticuerpos "mezclados e igualados" puede probarse utilizando los análisis de unión descritos anteriormente y en los Ejemplos (e.g., ELISAs, análisis Biacore®) . Preferentemente, cuando las secuencias CDR VH se mezclan e igualan, la secuencia CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia VH particular se reemplaza con una secuencia (s) CDR estructuralmente similar (es). De manera similar, cuando las secuencias CDR V? se mezclan e igualan, la secuencia CDRl, CDR2 y/o CDR3 de una secuencia V? particular se reemplaza preferentemente con una o más secuencias CDR estructuralmente similares. Será fácilmente aparente para el técnico de experiencia ordinaria que las nuevas secuencias VH y VL pueden crearse sustituyendo una o más secuencias de región CDR VH y/o VL con secuencias estructuralmente similares de las secuencias CDR descritas en la presente para anticuerpos monoclonales 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8. En consecuencia, en otro aspecto, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58; en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19, preferentemente CD19 humano. En una modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 51. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 52. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 38; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 45; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 53. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 39; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 46; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 54. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 40; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 47; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 55. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 20; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 27; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 41; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 48; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 56. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 57. En otra modalidad preferida, el anticuerpo comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 22; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 29; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 36; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 43; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 50; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 58. Es muy conocido en la técnica que el dominio CDR3, independientemente de el (los) dominio (s) CDRl y/o CDR2, por si solo puede determinar la especificidad de unión de un anticuerpo para un antígeno cognado y que de manera predecible pueden generarse múltiples anticuerpos que tienen la misma especificidad de unión basada en una secuencia CDR3 común. Ver, por ejemplo, Klimka et al . , Bri tish J. of Cáncer 88 (2 ): 252-260 (2000) (que describe la producción de un anticuerpo anti CD19 humanizado utilizando únicamente la CDR3 de dominio variable de cadena pesada de anticuerpo anti CD30 murino Ki-4); Beiboer et al . , J. Mol . Biol . 296:833-849 (2000) (que describe anticuerpos recombinantes de glicoproteína-2 epitelial (EPG-2) utilizando únicamente la secuencia CDR3 de cadena pesada del anticuerpo de origen murino MOC-31 anti-EGP-2); Arder et al . , Proc . Na tl . Acad . Sci . U. S . A . 95:8910-8915 (1998) (que describe un panel anticuerpos humanizados anti-integrina avß3 utilizando un dominio CDR3 variable de cadena pesada y ligera de un anticuerpo LM609 anti-integrina avß3 murino en donde cada anticuerpo miembro comprende una secuencia distinta fuera del dominio CDR3 y capaz de unirse al mismo epítope como un anticuerpo murino de origen con afinidades tan altas o más altas que el anticuerpo murino de origen); Barbas et al . , J. Am . Chem . Soc . 116:2161-2162 (que describe que el dominio CDR3 proporciona la contribución más significativa a la unión antigen); Barba et al . , Proc . Na tl . Acad. Sci . U. S . A . 92:2529-2533 (1995) (que describe el injerto de las secuencias CDR3 de cadena pesada de tres Fabs (SI-1, SI-40, y SI-32) contra ADN de placenta humano dentro de la cadena pesada de un Fab toxoide anti tétanos reemplazando de esa forma al CDR3 de cadena pesada existente y demostrando que el dominio CDR3 por sí solo confiere especificidad de unión) ; Ditzel et al . , J. Immunol . 157:739-749 (1996) (que describe los estudios de injerto en donde la transferencia únicamente de CDR3 de cadena pesada de un Fab LNA3 poliespecífico de origen a una cadena pesada de un anticuerpo Fab p313 que se une a IgG monoespecífico de toxoide tétanos fue suficiente para retener la especificidad de unión del Fab de origen) . Cada una de estas referencias se incorporan en la presente en su totalidad mediante la referencia. Por consiguiente, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo derivado de un animal humano o no humano, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a CD19. Dentro de ciertos aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano, tales como un anticuerpo de ratón o rata, en donde el anticuerpo monoclonal es capaz de unirse específicamente a CD19. En algunas modalidades, tales anticuerpos de la invención que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo no humano (a) son capaces de competir por la unión con; (b) retienen las características funcionales; (c) se unen al mismo epítope; y/o (d) tienen afinidad de unión similar a la del anticuerpo no humano de origen correspondiente. Dentro de otros aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a CD19. En otros aspectos, la presente invención proporciona anticuerpos monoclonales que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera de un primer anticuerpo humano, tal como, por ejemplo, un anticuerpo humano obtenido de un animal no humano, en donde el primer anticuerpo humano es capaz de unirse específicamente a CD19 y en donde el dominio CDR3 del primer anticuerpo humano reemplaza a un dominio CDR3 en un anticuerpo humano que carece de especificidad de unión a CD19 para generar un segundo anticuerpo humano que es capaz de unirse específicamente a CD19. En algunas modalidades, tales anticuerpos de la invención que comprenden uno o más dominios CDR3 de cadena pesada y/o ligera del primer anticuerpo humano (a) son capaces de competir por unión con; (b) retienen las características funcionales; (c) unirse al mismo epítope; y/o (d) tiene afinidad de unión similar al primer anticuerpo humano de origen correspondiente. Anticuerpos que Tienen Secuencias Particulares de Línea Germinal En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada de un gen de inmunoglobulina de cadena pesada de línea germinal particular y/o una región variable de cadena ligera de un gen de inmunoglobulina de cadena ligera de línea germinal particular.
Por ejemplo, en una modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 5-51 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. En otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 1-69 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. Aún en otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? L18 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. Aún en otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? A27 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. Aún en otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? L15 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19. Aún en otra modalidad preferida, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, en donde el anticuerpo : (a) comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 5-51 o 1-69 humano (cuyos genes codifican para las secuencias de aminoácido descritas en las SEQ ID Nos: 74 y 75, respectivamente) ; (b) comprende una región variable de cadena ligera que es el producto o se deriva de un gen V? L18, V? A27 o V? L15 humano (cuyos genes codifican para las secuencias de aminoácidos descritas en la SEQ ID NO: 76, 77 y 78, respectivamente) ; y (c) se une específicamente a CD19, preferentemente CD19 humano. Ejemplos de anticuerpos que tienen VH y V? de VH 5-51 y Vk L18, respectivamente, incluyen 21D4, 21D4a, 27F3, 5G7, 13F1 y 46E8. Un ejemplo de un anticuerpo que tiene VH y V? de VH 1-69 y Vk L15, respectivamente, es 3C10. Como se utiliza en la presente, un anticuerpo humano comprende regiones variables de cadena pesada o ligera que son "el producto de" o "se derivan de" una secuencia particular de línea germinal si las regiones variables del anticuerpo se obtienen de un sistema que utiliza genes de inmunoglobulina de línea germinal humana. Tales sistemas incluyen inmunizar un ratón transgénico portador de genes de inmunoglobulina humana con el antígeno de interés o visualizar una biblioteca de gen de inmunoglobulina humana desplegada en fago con el antígeno de interés. Un anticuerpo humano que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede identificarse como tal comparando la secuencia de aminoácidos del anticuerpo humano con las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulinas de línea germinal humana y seleccionando la secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana que se encuentra más cercana en secuencia (i.e., mayor % de identidad) a la secuencia del anticuerpo humano. Un anticuerpo que es "el producto de" o "se deriva de" una secuencia de inmunoglobulina de línea germinal humana puede contener diferencias de aminoácido en comparación con la secuencia de línea germinal, debido, por ejemplo, a mutaciones somáticas de origen natural o a la introducción intencional de una mutación dirigida al sitio. Sin embargo, un anticuerpo humano seleccionado es típicamente al menos 90% idéntico en secuencia de aminoácidos a una secuencia de aminoácidos codificada por un gen de inmunoglobulina de línea germinal humana y que contiene residuos de aminoácido que identifican el anticuerpo humano como humano al compararse a las secuencias de aminoácidos de inmunoglobulina de línea germinal de otras especies ( e . g. , secuencias murinas de línea germinal). En ciertos casos, un anticuerpo humano puede ser al menos 95%, o incluso al menos 96%, 97%, 98% o 99% idéntico en secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Típicamente, un anticuerpo humano derivado de una secuencia particular de línea germinal humana desplegará no más de 10 diferencias de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal humana. En ciertos casos, el anticuerpo humano puede desplegar no más de 5, o incluso no más de 4, 3, 2, o 1 diferencia de aminoácido de la secuencia de aminoácidos codificada por el gen de inmunoglobulina de línea germinal. Anticuerpos Homólogos Aún en otra modalidad, un anticuerpo de la invención comprende regiones variables de cadena pesada y ligera que comprenden secuencias de aminoácidos que son homologas a las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos preferidos descritos en la presente, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CD19 de la invención. Por ejemplo, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada y una región variable de cadena ligera, en donde: (a) la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; (b) la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15; (c) el anticuerpo se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10"7 M o menor; (d) el anticuerpo no se une a células tumorales de células B Raji y Daudi. En diversas modalidades, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, un anticuerpo humano, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. En otras modalidades, las secuencias de aminoácido VH y VL pueden ser 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% o 99% homologas a las secuencias descritas anteriormente. Un anticuerpo que tiene regiones VH y VL que tienen alta homología ( i . e . , 80% o mayor) a las regiones VH y VL de las secuencias descritas anteriormente, puede obtenerse mediante mutagénesis (e.g., mutagénesis dirigida al sitio o mediada por PCR) de moléculas de ácido nucleico que codifican para las SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 62, 63, 64, 65, 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 y 73, seguida por el análisis del anticuerpo alterado codificado por función retenida (i.e., las funciones descritas en (c) y (d) arriba) utilizando los análisis funcionales descritos en la presente. Como se utiliza en la presente, la homología porcentual entre dos secuencias de aminoácidos es equivalente a la identidad porcentual entre las dos secuencias. La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias ( i . e . , % homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que es necesario introducir para una alineación óptima de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación de la identidad porcentual entre dos secuencias puede lograrse utilizando un algoritmo matemático, como se describe en los ejemplos no limitantes abajo. La identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller ( Comput . Appl . Biosci . , 4:11-17 (1988)) que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0) utilizando una tabla de residuo de peso PAM120, una falla de longitud de espacio de 12 y una falla de espacio de 4. Adicionalmente, la identidad porcentual entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo Needleman y Wunsch ( J. Mol . Biol . 48:444-453 (1970)) algoritmo que se ha incorporado en el programa GAP en el equipo de software GCG (disponible en (www. gcg, com) , utilizando ya sea una matriz Blossum 62 o una matriz PAM250, y un peso de espacio de 16, 14, 12, 10, 8, 6 o 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, o 6. Adicionalmente o alternativamente, las secuencias de proteínas de la presente invención pueden utilizarse además como una "secuencia de búsqueda" para efectuar una búsqueda contra bases de datos públicas, por ejemplo, para identificar secuencias relacionadas. Tales búsquedas pueden efectuarse utilizando el programa XBLAST (versión 2.0) de Altschul et al . , (1990) J. Mol . Biol . , 215:403-10. Las búsquedas de proteína BLAST pueden efectuarse con el programa XBLAST, marcador = 50, longitud de palabra = 3, para obtener secuencias de aminoácidos homologas a las moléculas de anticuerpo de la invención. Para obtener alineaciones separadas para propósitos de comparación, puede utilizarse Gapped BLAST como se describe en Altschul et al . , (1997) Nucleic Acíds Res . , 25 ( 17 ): 3389-3402. Al utilizar los programas BLAST y Gapped BLAST, pueden utilizarse los parámetros de falla de los programas respectivos (e.g., XBLAST y NBLAST). Ver www.ncbi.nlm.nih.gov. Anticuerpos con Modificaciones Conservadoras En ciertas modalidades, un anticuerpo de la invención comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde una o más de estas secuencias CDR comprende secuencias de aminoácidos especificadas en base a los anticuerpos preferidos descritos en la presente (e.g., 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8), o sus modificaciones conservadoras, y en donde los anticuerpos retienen las propiedades funcionales deseadas de los anticuerpos anti-CD19 de la invención. En consecuencia, la invención proporciona un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36, y sus modificaciones conservadoras; (b) la secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58, y sus modificaciones conservadoras; (c) el anticuerpo se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10"7 M o menor; (d) el anticuerpo no se une a células tumorales de célula B Raji y Daudi. En una modalidad preferida, la secuencia CDR2 de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDR2 de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y modificaciones conservadoras de las mismas. En otra modalidad preferida, la secuencia CDRl de la región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, y modificaciones conservadoras de las mismas; y la secuencia CDRl de la región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43, y modificaciones conservadoras de las mismas. En diversas modalidades, el anticuerpo puede ser, por ejemplo, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados o anticuerpos quiméricos.
Como se utiliza en la presente, el término "modificaciones de secuencia conservadoras" pretende referirse a modificaciones de aminoácidos que no afectan o alteran significativamente las características de unión del anticuerpo que contiene la secuencia de aminoácidos. Tales modificaciones conservadoras incluyen sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos. Las modificaciones pueden introducirse en un anticuerpo de la invención mediante técnicas estándar conocidas en la técnica, tales como mutagénesis dirigida al sitio y mutagénesis mediada por PCR. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son aquellas en las cuales el residuo de aminoácido se reemplaza con un residuo de aminoácido que tiene una cadena lateral similar. Las familias de residuos de aminoácido que tienen cadenas laterales similares se han definido en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas laterales básicas (e.g., lisina, arginina, histidina), cadenas laterales acídicas (e.g., ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (e.g., glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptofan) , cadenas laterales no polares (e.g., alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina) , cadenas laterales beta ramificadas (e.g., treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (e.g., tirosina, fenilalanina, triptofan, histidina) . En consecuencia, pueden reemplazarse uno o más residuos de aminoácido dentro de las regiones CDR de un anticuerpo de la invención con otros residuos de aminoácido de la misma familia de cadena lateral y el anticuerpo alterado puede probarse por función retenida ( i . e . , las funciones descritas en (c) y (d) anteriores) utilizando los análisis funcionales descritos en la presente. Anticuerpos que se Unen al Mismo Epítope que los Anticuerpos Anti-CD19 de la Invención En otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos que se unen al mismo epítope en el CD19 humano como cualquiera de los anticuerpos monoclonales CD19 de la invención (i.e., anticuerpos que tienen la capacidad para competir de manera cruzada por la unión a CD19 con cualquiera de los anticuerpos monoclonales de la invención) . En modalidades preferidas, el anticuerpo de referencia para estudios de competencia cruzada puede ser el anticuerpo monoclonal 21D4 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID NOs: 1 y 8, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 21D4a (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 1 y 9, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 47G7 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 2 y 10, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 27F3 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 3 y 11, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 3C10 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 4 y 12, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 5G7 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 5 y 13, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 13F1 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 6 y 14, respectivamente), o el anticuerpo monoclonal 46E8 (que tiene secuencias VH y VL como se muestra en las SEQ ID Nos: 7 y 15, respectivamente) . Tales anticuerpos de competencia cruzada pueden identificarse en base a su capacidad para competir de manera cruzada con 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 en análisis estándar de unión a CD19. Por ejemplo, puede utilizarse análisis BIAcore®, análisis ELISA, o citometría de flujo para demostrar la competencia cruzada con los anticuerpos de la presente invención. La capacidad de un anticuerpo de prueba para inhibir la unión, por ejemplo, de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8, a CD19 humano demuestra que el anticuerpo de prueba puede competir con 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 para unirse a CD19 humano y por consiguiente se une al mismo epítope en CD19 humano como 21D4, 2lD4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8. En una modalidad preferida, el anticuerpo que se une al mismo epítope en CD19 humano como 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 es un anticuerpo monoclonal humano. Tales anticuerpos monoclonales humanos pueden prepararse y aislarse como se describe en los Ejemplos.
Anticuerpos Fabricados y Modificados Puede utilizarse un anticuerpo que tiene una o más secuencias VH y/o VL descritas en la presente como material de inicio para fabricar un anticuerpo modificado, cuyo anticuerpo modificado puede tener propiedades alteradas del anticuerpo de inicio. Un anticuerpo puede fabricarse modificando uno o más aminoácidos dentro de una o ambas regiones variables (i.e., VH y/o VL) por ejemplo, dentro de una o más regiones CDR y/o dentro de una o más regiones de estructura. Adicionalmente o alternativamente, un anticuerpo puede fabricarse modificando los residuos dentro de la(s) región(es) constante (s) , por ejemplo para alterar la(s) función (es) efector del anticuerpo. En ciertas modalidades, puede utilizarse un injerto de CDR para fabricar regiones variables de anticuerpos. Los anticuerpos interactúan con antígenos objetivo predominantemente a través de residuos de aminoácido ubicados en las seis regiones de determinación de complementariedad (CDRs) de cadena pesada o ligera. Por esta razón, las secuencias de aminoácidos dentro de las CDRs son más diversas entre anticuerpos individuales que las secuencias fuera de las CDRs. Debido a que las secuencias CDR son responsables de la mayoría de las interacciones de anticuerpo-antígeno, es posible expresar anticuerpos recombinantes que imitan las propiedades de anticuerpos específicos de origen natural construyendo vectores de expresión que incluyen secuencias CDR a partir del anticuerpo específico de origen natural injertado en secuencias de estructura de un anticuerpo diferente con diferentes propiedades (ver, e.g., Riechmann L. et al . , (1998) Na ture 332:323-327 ; Jones P. et al . , (1986) Na ture 321:522-525; Queen C. et al . , (1989) Proc . Na tl . Acad. Sci . EUA 86:10029-10033; Patente de E.U. No. 5,225,539 para Winter; y Patentes de E.U. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al ) . En consecuencia, otra modalidad de la invención se refiere a un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29, y SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36, respectivamente, y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3 que comprenden una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43, SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50 y SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58, respectivamente. En consecuencia, tales anticuerpos contienen las secuencias CDR VH y VL de los anticuerpos monoclonales 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 y sin embargo, pueden contener diferentes secuencias de estructura de estos anticuerpos. Tales secuencias de estructura pueden obtenerse de bases de datos públicas de ADN o de referencias publicadas que incluyen secuencias del gen de anticuerpo de línea germinal. Por ejemplo, las secuencias de ADN de línea germinal para genes humanos de región variable de cadena pesada y ligera, pueden encontrarse en la base de datos de secuencia de línea germinal humana "Vbase" (disponible en la internet en www.mrc-cpe.cam.ac.uk/vbase), así como en Kabat E. A. et al . , (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publicación No. 91-3242; Tomlinson I. M., et al . , (1992) "The Repertoire of Human Germline VH Sequences Reveáis about Fifty Groups of VH Segments with Different Hypervariable Loops" J. Mol . Biol . , 227:776-798; y Cox J. P. L. et al . , (1994) "A Directory of Human Germ-Line VH Segments Reveáis a Strong Bias in Their Usage", Eur. J. Immunol . , 24:827-836; cuyo contenido se incorpora expresamente en la presente mediante la referencia. Como otro ejemplo, las secuencias de ASDN de línea germinal para los genes humanos de región variable de cadena pesada y ligera pueden encontrarse en la base de datos Genbank. Por ejemplo, las siguientes secuencias de línea germinal de cadena pesada encontradas en el ratón HuMAb HCo7 se encuentran disponibles con los siguientes números de acceso Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 3-33 (NG_0010109 y NT_024637) y 3-7 (NG_0010109 y NT_024637). Como otro ejemplo, las siguientes secuencias de línea germinal de cadena pesada encontradas en el ratón HuMAb HCol2 se encuentran disponibles con los siguientes números de acceso Genbank: 1-69 (NG_0010109, NT_024637 y BC070333), 5-51 (NG_0010109 y NT_024637), 4-34 (NG_0010109 y NT_024637), 3-3.3 (CAJ556644) y 3-23 (AJ406678). Las secuencias de proteína de anticuerpo se comparan contra una base de datos de secuencia de proteína compilada utilizando uno de los métodos de búsqueda de similitud de secuencia llamado Gapped BLAST (Altschul et al . , (1997) Nucleic Acids Research 25:3389-3402), que es muy conocido por aquellos expertos en la técnica. BLAST es un algoritmo heurístico en el que es probable que una alineación estadísticamente significativa entre la secuencia del anticuerpo y la secuencia de la base de datos contenga pares de segmento de alta puntuación (HSP) de palabras alineadas. Los pares de segmento cuyas marcas no pueden mejorarse mediante extensión o recorte se conocen como un hi t .
Brevemente, las secuencias de nucleótido de origen VBASE ( h ttp Xvbase . mrc-cpe . cam . ac . uk/vhasel/ list2.php se traducen y la región entre y que incluye las regiones de estructura FR1 hasta FR3 se retienen. Las secuencias de base de datos tienen una longitud promedio de 98 residuos. Se remueven las secuencias de duplicado que coinciden con exactitud a lo largo de la longitud total de la proteína. Una búsqueda BLAST para proteínas utilizando el programa blastp con los parámetros estándar de falla excepto el filtro de complejidad baja, que se desactiva, y la matriz de sustitución de BLOSUM62, filtra para 5 hits superiores produciendo coincidencia de secuencia. Las secuencias de nucleótido de traducen en todos las seis estructuras y la estructura sin codones de paro en el segmento que coincide de la secuencia de base de datos se considera el hit potencial. Esto se confirma a su vez utilizando el programa BLAST tblastx, que traduce la secuencia de anticuerpo en todas las seis estructuras y compara aquellas traducciones con las secuencias de nucleótido VBASE traducidas dinámicamente en todas las seis estructuras. Las identidades son aminoácidos que coinciden exactamente entre la secuencia de anticuerpo y la base de datos de proteína a lo largo de la longitud total de la secuencia. Los positivos (identidades y coincidencia de sustitución) no son idénticos sino sustituciones de aminoácido guiadas por la matriz de sustitución BLASUM62. Si la secuencia de anticuerpo coincide con dos de las secuencias de la base de datos con la misma identidad, el hit con más positivos decidirá ser el hit de secuencia de coincidencia Las secuencias de estructura preferidas para su uso en los anticuerpos de la invención, son aquellas que son estructuralmente similares a las secuencias de estructura utilizadas por los anticuerpos seleccionados de la invención, e.g., similares a las secuencias de estructura VH 5-51 (SEQ ID NO: 74) y/o las secuencias de estructura VH 1-69 (SEQ ID NO: 75) y/o las secuencias de estructura VL L18 (SEQ ID NO: 76) y/o la secuencia de estructura V? A27 (SEQ ID NO: 77) y/o la secuencia de estructura V? L15 (SEQ ID NO: 78) utilizadas por los anticuerpos monoclonales preferidos de la invención. Las secuencias VH CDRl, CDR2 y CDR3 y las secuencias V? CDRl, CDR2 y CDR3 pueden injertarse sobre regiones de estructura que tienen secuencias idénticas a las encontradas en el gen de inmunoglobulina de línea germinal del cual se deriva la secuencia de estructura, o las secuencias CDR pueden injertarse sobre regiones de estructura que contienen una o más mutaciones en comparación a las secuencias de línea germinal. Por ejemplo, se ha encontrado que en ciertas instancias es benéfico mutar residuos dentro de regiones de estructura para mantener o mejorar la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo (ver, e.g., Patentes de E.U. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et a l ) . Otro tipo de modificación de región variable es mutar los residuos de aminoácido dentro de las regiones VH y/o V? CDRl, CDR2 y/o CDR3 para mejorar así una o más propiedades de unión (e.g., afinidad) del anticuerpo de interés. Puede efectuarse mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR para introducir la(s) mutación (es) y puede evaluarse el efecto en la unión de anticuerpo, u otra propiedad funcional de interés, en análisis in vi tro o in vivo como se describe en la presente y se proporciona en los Ejemplos. Preferentemente, se introducen las modificaciones conservadoras (como se trató anteriormente). Las mutaciones pueden ser sustituciones, adiciones o supresiones de aminoácidos, pero preferentemente son sustituciones. Además, típicamente se alteran no más de uno, dos, tres, cuatro o cinco residuos dentro de una región CDR. En consecuencia, en otra modalidad, la invención proporciona anticuerpos monoclonales anti-CD19 aislados, o porciones de unión a antígeno de los mismos, que comprenden una región variable de cadena pesada que comprende: (a) una región VH CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido, en comparación con las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22; (b) una región VH CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido, en comparación con las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29; (c) una región VH CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido, en comparación con las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36; (d) una región V? CDRl que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido, en comparación con las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43; (e) una región V? CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido, en comparación con las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50; y (f) una región V? CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58, o una secuencia de aminoácidos que tiene una, dos, tres, cuatro o cinco sustituciones, supresiones o adiciones de aminoácido, en comparación con las SEQ ID Nos: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58. Los anticuerpos fabricados de la invención incluyen aquellos en los cuales las modificaciones se han producido en residuos de estructura dentro de VH y/o V?, e.g., para mejorar las propiedades del anticuerpo. Típicamente, tales modificaciones de estructura se producen para disminuir la inmunogenicidad del anticuerpo. Por ejemplo, un procedimiento es "retro-mutar" uno o más residuos de estructura a la secuencia de línea germinal correspondiente. Más específicamente, un anticuerpo que ha experimentado mutación somática puede contener residuos de estructura que difieren de la secuencia de línea germinal de la cual se deriva el anticuerpo. Tales residuos pueden identificarse comparando las secuencias de estructura del anticuerpo con las secuencias de línea germinal de las cuales se deriva el anticuerpo. Por ejemplo, la Tabla 1 abajo muestra un número de cambios de aminoácido en las regiones de estructura de los anticuerpos anti-PD-1 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3 y 5F4 que difieren de la secuencia de línea germinal de origen de cadena pesada. Para regresar uno o más de los residuos de aminoácido en las secuencias de región de estructura a su configuración de línea germinal, las mutaciones somáticas pueden "retro-mutarse" a la secuencia de línea germinal, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis mediada por PCR. Tabla 1. Modificaciones a los anticuerpos 17D8, 2D3, 4H1, 5C4, 4A11, 7D3, y 5F4 de la configuración de la línea germinal de cadena pesada.
Otro tipo de modificación de estructura implica mutar uno o más residuos dentro de la región de estructura, o incluso dentro de una o más regiones CDR, para retirar epítopes de célula T para reducir así la inmunogenicidad potencial del anticuerpo. Este procedimiento se refiere también como "desinmunización" y se describe en mayor detalle en la Publicación de Patente de E.U. No. 20030153043 por Carr et al . Adicionalmente o alternativamente a las modificaciones efectuadas dentro de las regiones de estructura o CDR, los anticuerpos de la invención pueden fabricarse para incluir modificaciones dentro de la región Fc, típicamente para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo, tales como la vida media en suero, fijación de complemento, unión del receptor Fc, y/o citotoxicidad celular dependiente del antígeno. Además, un anticuerpo de la invención puede modificarse químicamente (e.g., uno o más residuos químicos pueden unirse al anticuerpo) o modificarse para alterar su glicosilación, de nuevo para alterar una o más propiedades funcionales del anticuerpo. Cada una de estas modalidades se describe en mayor detalle abajo. La numeración de los residuos en la región Fc es la del índice EU de Kabat. En una modalidad, la región de articulación de CH1 se modifica de manera que se altera el número de residuos cisteína en la región de articulación, e . g. , aumentarlo o disminuirlo. Este procedimiento se describe adicionalmente en la Patente de E.U. No. 5,677,425 por Bodmer et al . El número de residuos cisteína en la región de articulación de CH1 se altera, por ejemplo, para facilitar la instalación de las cadenas ligera y pesada o para incrementar o disminuir la estabilidad del anticuerpo. En otra modalidad, la región de articulación Fc de un anticuerpo se muta para disminuir la vida media biológica del anticuerpo. Más específicamente, se introducen una o más mutaciones de aminoácidos en la región de interfaz del dominio CH2-CH3 del fragmento Fc-articulación de manera que el anticuerpo tiene un daño en la unión de proteína A Staphylococcyl (SpA) en relación a la unión del dominio Fc-articulación natural de SpA. Este procedimiento se describe en mayor detalle en la Patente de E.U. No. 6,165,745 por Ward et al . En otra modalidad, el anticuerpo se modifica para incrementar su vida media biológica. Diversos procedimientos son posibles. Por ejemplo, pueden introducirse una o más de las siguientes mutaciones: T252L, T254S, T256F, como se describe en la Patente de E.U. No. 6,277,375 para Ward. Alternativamente, para incrementar la vida media biológica, el anticuerpo puede alterarse dentro de la región CH1 o CL para contener un epítope de unión de receptor salvaje tomado de dos circuitos de un dominio CH2 de una región Fc de una IgG, como se describe en las Patentes de E.U. Nos. 5,869,046 y 6,121.022 por Presta et al . Aún en otras modalidades, la región Fc se altera reemplazando al menos un residuo de aminoácido con un residuo de aminoácido diferente para alterar la(s) función (es) efector del anticuerpo. Por ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 234, 235, 236, 237, 297, 318, 320 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tiene una afinidad alterada para un ligante efector, pero retiene la capacidad de unión a antígeno del anticuerpo original. El ligante efector del cual se altera la afinidad, puede ser, por ejemplo, un receptor Fc o el componente Cl del complemento. Este procedimiento se describe en mayor detalle en las Patentes de E.U. Nos. 5,624,821 y 5,648,260, ambas por Winter et al . En otro ejemplo, uno o más aminoácidos seleccionados de los residuos de aminoácido 329, 331 y 322 pueden reemplazarse con un residuo de aminoácido diferente de manera que el anticuerpo tiene una unión CIq alterada y/o reducida o abolida citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) . Este procedimiento se describe en mayor detalle en las Patentes de E.U. Nos. 6,194,551 por Idusogie et al . En otro ejemplo, uno o más residuos de aminoácido dentro de las posiciones de aminoácido 2316, 17, 18, 19, 20, 21 y 2239 se alteran para alterar así la capacidad del anticuerpo para fijarse al complemento. Este procedimiento se describe adicionalmente en la Publicación PCT WO 94/29351 por Bodmer et al . Aún en otro ejemplo, la región Fc se modifica para incrementar la capacidad del anticuerpo para mediar la citotoxicidad celular dependiente del anticuerpo (ADCC) y/o para incrementar la afinidad del anticuerpo para un receptor Fcy modificando uno o más aminoácidos en las siguientes posiciones: 238, 239, 248, 249, 252, 254, 255, 256, 258, 265. 267, 268, 269, 270, 272, 276, 278, 280, 283, 285, 286, 289, 290, 292, 293, 294, 295, 296, 298, 301, 303, 305, 307, 309, 312, 315, 320, 322, 324, 326, 327, 329, 330, 331, 333, 334, 335, 337, 338, 340, 360, 373, 376, 378, 382, 389, 398, 414, 416, 419, 430, 434, 435, 437, 438 o 439. Este procedimiento se describe adicionalmente en la Publicación PCT WO 00/42072 por Presta. Además, se han mapeado los sitios de unión en IgGl humana para Fc?RI, Fc?RII, Fc?RIII y FcRn, y se han descrito las variantes con unión mejorada (ver Shields, R. L., et al . , (2001) J. Biol . Chem . , 276:6591-6604).
Mutaciones específicas en las posiciones 256, 290, 298, 333, 334 y 339 mostraron mejorar la unión a FcyRIII. Adicionalmente, las siguientes mutantes de combinación mostraron mejorar la unión a Fc?RIII: T256A/S298A, S298A/E333A, S298A/K224A y S298A/E333A/K334A . Aún en otra modalidad, se modifica la glicosilación de un anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo aglicosilado puede producirse (i.e., el anticuerpo carece de glicosilación) . La glicosilación puede alterarse, por ejemplo, para incrementar la afinidad para el antígeno. Tales modificaciones de carbohidrato pueden lograrse, por ejemplo, alterando uno o más sitios de glicosilación dentro de la secuencia de anticuerpos. Por ejemplo, pueden efectuarse una o más sustituciones de aminoácido que dan como resultado la eliminación de uno o más sitios de glicosilación de estructur-a de la región variable para así eliminar la glicosilación en ese sitio. Tal aglicosilación puede incrementar la afinidad del anticuerpo para el antígeno. Tal procedimiento se describe en mayor detalle en las Patentes de E.U. Nos. 5,714,350 y 6, 350, 861 por Co et al . Adicionalmente, o alternativamente, puede producirse un anticuerpo que tiene un tipo de glicosilación alterado, tal como un anticuerpo hipofucosilado que tiene cantidades reducidas de residuos fucosil o un anticuerpo que-tiene estructuras GlcNac de bisección incrementadas. Tales patrones de glicosilación alterados han demostrado incrementar la capacidad ADCC de los anticuerpos. Tales modificaciones de carbohidrato pueden lograrse, por ejemplo, expresando el anticuerpo en una célula huésped con funcionamiento de glicosilación alterado. -Las células con funcionamiento de glicosilación alterado se han descrito en la técnica y pueden utilizarse como células huésped en las cuales expresar los anticuerpos recombinantes de la invención, para así producir un anticuerpo con glicosilación alterada. Por ejemplo, las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen del gen fucosiltransferasa, FUT8 (alfa (1,6) fucosiltransferasa) , de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 carecen de fucosa en sus carbohidratos. Las líneas celulares Ms704, Ms705 y Ms709 FUT8~ _ se crearon mediante la fractura dirigida del gen FUT8 en células CHO/DG44 utilizando dos vectores de reemplazo (ver Publicación de Patente de E.U. No. 20040110704 por Yamane et al . , y Yamane-Ohnuki et al . , (2004) Biotechnol . Bioeng. 87:614-22). Como otro ejemplo, la EP 1,176,195 por Hanai et al . , describe una línea celular con un gen FUT8 de funcionalidad fracturada, que codifica para una fucosil transferasa, de manera que los anticuerpos expresados en tal línea celular exhiben hipofucosilación reduciendo o eliminando la enzima alfa 1,6 relacionada a la unión. Hanai et al . , describe también líneas celulares que tienen una baja actividad enzimática para agregar fucosa a la N-acetilglucosamina que se une a la región Fc del anticuerpo, o que no tienen la actividad enzimática, por ejemplo, la línea celular de mieloma de rata YB2/0 (ATCC CRL 1662) . La Publicación PCT WO 03/035835 por Presta, describe una línea celular CHO variante, células Lecl3, con capacidad reducida para unir fucosa a carbohidratos unidos por Asn(297), dando también como resultado la hipofucosilación de los anticuerpos expresados en esa célula huésped (ver también Shields, R. L. et al . , (2002) J. Biol . Chem . , 277 :26733-26740) . La Publicación PCT WO 99/54342 por Umana et al . , describe líneas celulares fabricadas para expresar glicosil transferasas modificadoras de glicoproteína (e.g., beta (1,4) -N-acetilglucosaminiltransferasa III (GnTIII) de manera que los anticuerpos expresados en las líneas celulares fabricadas exhiben estructuras GlcNac de bisección incrementadas lo cual da como resultado una actividad ADCC incrementada de los anticuerpos (ver también Umana et al . , (1999) Na t . Biotech . , 17:176-180). Alternativamente, los residuos fucosa del anticuerpo pueden dividirse utilizando una enzima fucosidasa. Por ejemplo, la fucosidasa alfa-L-fucosidasa retira los residuos fucosil de los anticuerpos (Tarentino, A. L. et al . , (1975) Biochem . 14:5516-23). Otra modificación de los anticuerpos en la presente contemplada por la invención, es la pegilación. Un anticuerpo puede pegilarse, por ejemplo, para incrementar la vida media biológica (e.g., en suero) del anticuerpo. Para pegilar un anticuerpo, el anticuerpo, o fragmento del mismo, típicamente se reactiva con polietileno glicol (PEG), tal como un éster reactivo o derivado aldehido de PEG, bajo condiciones en las cuales uno o más grupos PEG se unen al anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Preferentemente, la pegilación se lleva a cabo a través de una reacción de acilación o una reacción de alquilación con una molécula PEG reactiva (o un polímero análogo reactivo soluble en agua). Como se utiliza en la presente, el término "polietileno glicol" pretende abarcar cualquiera de las formas de PEG que se han utilizado para derivatizar otras proteínas, tales como mono (Cl-ClO) alcoxi- o ariloxi-polietileno-glicol o polietileno glico-maleimida . En ciertas modalidades, el anticuerpo que va a pegilarse es un anticuerpo aglicosilado . Los métodos para pegilar proteínas se conocen en la técnica y pueden aplicarse a los anticuerpos de la invención. Ver, por ejemplo, EP 0 154 316 por Nishimura et al . , y EP 0 401 384 por Isikawa et al . Propiedades Físicas del Anticuerpo Los anticuerpos de la presente invención pueden caracterizarse además por las diversas propiedades físicas de los anticuerpos anti CD19. Pueden utilizarse varios análisis para detectar y/o diferenciar las diferentes clases de anticuerpos basadas en las propiedades físicas. En algunas modalidades, los anticuerpos de la presente invención pueden contener uno o más sitios de glicosilación en la región variable de cadena tanto pesada como ligera. La presencia de uno o más sitios de glicosilación en la región variable puede resultar en un aumento de inmunogenicidad del anticuerpo o la alteración del pK del anticuerpo debido a unión de antígeno alterada (Marshall et al . , (1972) Annu Rev Biochem 41:673-702; Gala FA y Morrison SL (2004) J. immunol 172:5489-94; Wallick et al . , (1988) J. Exp . Med. 168:1099-109; Spiro RG (2002) Glycobíology 12:43R-56R; Parekh et al . , (1985) Na ture 316:452-7; Mimura et al . , (2000) Mol . Immunol 37:697-706). Se sabe que la glicosilación ocurre en motifs que contienen una secuencia N-X-S/T. la glicosilación de región variable puede probarse utilizando un análisis Glycoblot, que parte al anticuerpo para producir un Fab, y después prueba la glicosilación utilizando un análisis que mide la oxidación periódica y la formación de base Schiff. Alternativamente, la glicosilación de región variable puede probarse utilizando cromatografía de luz Dionex (Dionex-LC), que parte los sacáridos de un Fab en monosacáridos y analiza el contenido de sacárido individual. En algunos ejemplos, es preferible tener un anticuerpo anti CD19 que no contenga glicosilación de región variable. Esto puede lograrse ya sea seleccionando anticuerpos que no contengan el motif de glicosilación en la región variable o mediante la mutación de residuos dentro del motif de glicosilación utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica.
En una modalidad preferida, los anticuerpos de la presente invención no contienen sitios de isomerismo asparagina. Puede ocurrir una deamidación o efecto de ácido isoaspártico en las secuencias N-G o D-G, respectivamente. La deamidación o efecto de ácido isoaspártico tiene como resultado la creación de ácido isoaspártico que disminuye la estabilidad de un anticuerpo creando una estructura quinqueada de un término carboxi de cadena lateral en lugar de la cadena principal. La creación de ácido isoaspártico puede medirse utilizando un análisis iso-quant, que utiliza un HPLC de fase reverso para probar el ácido isoaspártico. Cada anticuerpo tendrá un punto isoeléctrico (pl) único, pero generalmente los anticuerpos caerán en el rango de pH de entre 6 y 9.5. El pl para un anticuerpo IgGl típicamente cae dentro del rango de pH de 7-9.5 y el pl para un anticuerpo IgG4 típicamente cae dentro del rango de pH de 6-8. Los anticuerpos pueden tener un pl fuera de este rango. Aunque los efectos son generalmente desconocidos, se especula que los anticuerpos con un pl fuera del rango normal pueden tener alguna extensión e inestabilidad bajo condiciones in vivo . El punto isoeléctrico puede probarse utilizando un análisis de enfoque isoeléctrico capilar, que crea una pendiente de pH y puede utilizar enfoque láser para aumentar la precisión (Janini et al., (2002) Electrophoresis 23:1605-11; Ma et al. (2001) Chromatographia 53:S75-89; Hunt et al., (1998) J Chromatogr A 800:355-67). En laudos ejemplos, es preferible tener un anticuerpo anti CD19 que contenga un valor pl que cae dentro de los rangos normales. Esto puede lograrse ya sea seleccionando los anticuerpos que tienen un pl en el rango normal, o mediante mutación de residuos de superficie cargados utilizando técnicas estándar bien conocidas en la técnica. Cada anticuerpo tendrá una temperatura de fusión que indica la estabilidad térmica (Krishnamurthy R y Manning MC (2002) Curr Pharm Biotechnol 3:361-71). Una estabilidad térmica mayor indica mejor estabilidad de anticuerpo in vivo en general. El punto de fusión de un anticuerpo puede medirse utilizando técnicas tales como una caliometría de búsqueda diferencial (Chen et al (2003) Pharm Res 20:1952-60; Ghirlando et al (1999) Immunol Lett 68:47-52). TMl indica la temperatura del despliegue inicial del anticuerpo. TM2 indica la temperatura de despliegue completo del anticuerpo. Generalmente, es preferible que la TMl de un anticuerpo de la presente invención sea mayor a 60°C, preferentemente mayor que 65°C, e incluso más preferentemente mayor que 70°C. Alternativamente, la estabilidad termal de un anticuerpo puede medirse utilizando un dicroísmo circular (Murria et al. (2002) J. Chromatogr Sci 40:343-9) En una modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que no se degraden rápidamente. La fragmentación de un anticuerpo anti CD19 puede medirse utilizando electroforésis capilar (CE) y MALDI-MS, como es bien entendido en la técnica (Alexander AJ y Huges DE (1995) Anal Chem 67:3626-32) . En otra modalidad preferida, se seleccionan anticuerpos que tienen efectos de agregación mínimos. La agregación puede llevar a desencadenar una respuesta inmune no requerida y/o propiedades farmacoquinéticas alteradas o no favorables. Generalmente, los anticuerpos son aceptables con con agregación de 25% o menor, preferentemente 20% o menor, aún más preferentemente 15% o menor, aún más preferentemente 10% o menor y aún más preferentemente 5% o menor. La agregación puede medirse mediante varias técnicas bien conocidas en la técnica, que incluyen columna de exclusión de tamaño (SEC) cromatografía de líquido de alto desempeño (HPLC), y dispersión de luz para identificar monómeros, dímeros, trímeros, o multímeros. Métodos para Fabricar Anticuerpos Como se trató anteriormente, los anticuerpos anti-CD19 que tienen secuencias VH y V? tratados en la presente, pueden utilizarse para crear nuevos anticuerpos anti-CD19 modificando las secuencias VH y/o V?, o la(s) región (es) constante (s) unida (s) a las mismas. En consecuencia, en otro aspecto de la invención, las características estructurales de un anticuerpo anti-CD19 de la invención, e.g., 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8, se utilizan para crear anticuerpos anti-CD19 estructuralmente relacionados que retienen al menos una propiedad funcional de los anticuerpos de la invención, tal como la unión a CD19 humano. Por ejemplo, una o más regiones CDR de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8, o mutaciones de las mismas, pueden combinarse de manera recombinante con regiones de estructura conocidas y/o otras CDRs para crear los anticuerpos anti-CD19 de la invención fabricados de manera recombinante, como se trató anteriormente. Otros tipos de modificaciones incluyen aquellas descritas en la sección previa. El material de inicio para el método de elaboración es una o más de las secuencias VH y/o V? proporcionadas en la presente, o una o más de sus regiones CDR. Para crear el anticuerpo fabricado, realmente no es necesario preparar (i.e., expresar como una proteína) un anticuerpo que tiene una o más de las secuencias VH y/o V? proporcionadas en la presente, o una o más de sus regiones CDR. Por el contrario, la información contenida en la(s) secuencia (s) se utiliza como material de inicio para crear una secuencia (s) de "segunda generación" derivada de la(s) secuencia(s) original (es) , y después la(s) secuencia(s) de "segunda generación" se prepara (n) y expresa (n) como una proteína . En consecuencia, en otra modalidad, la invención proporciona un método para preparar un anticuerpo anti-CD19, que comprende: (a) proporcionar: (i) una secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena pesada que comprende una secuencia CDRl seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36; y/o (ii) una secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena ligera que comprende una secuencia CDRl seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 37,38, 39, 40, 41, 42 y 43, una secuencia CDR2 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y/o una secuencia CDR3 seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58; (b) alterar al menos un residuo de aminoácido dentro de la secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena pesada y/o de la secuencia de anticuerpo de la región variable de cadena ligera para crear al menos una secuencia de anticuerpo alterada; y (c) expresar la secuencia de anticuerpo alterada como una proteína. Pueden utilizarse técnicas estándar de biología molecular para preparar y expresar la secuencia de anticuerpos alterada.
Preferentemente, el anticuerpo codificado por la(s) secuencia (s) de anticuerpo alterada (s) es uno que retiene una, alguna o todas las propiedades funcionales de los anticuerpos ant?-CD19 descritos en la presente, cuyas propiedades funcionales incluyen, pero no se limitan a: (i) se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10~7 M o menor; (n) se une a células tumorales de células B Rají y Daudí . Las propiedades funcionales de los anticuerpos alterados pueden establecerse utilizando análisis estándar disponibles en la técnica y/o descritos en la presente, tales como los descritos en los Ejemplos (e.g., citometria de flujo, análisis de unión) . En ciertas modalidades de los métodos para fabricar los anticuerpos de la invención, pueden introducirse mutaciones aleatoriamente o selectivamente a lo largo de todo o parte de una secuencia de codificación del anticuerpo anti-CD19 y los anticuerpos ant?-CD19 resultantes modificados pueden visualizarse por actividad de unión y/o otras propiedades funcionales como se describe en la presente. Los métodos de mutación se han descrito en la técnica. Por ejemplo, la Publicación PCT WO 02/092780 por Short describe métodos para crear y visualizar mutaciones de anticuerpo utilizando mutagénesis de saturación, instalación de ligadura sintética, o una combinación de las mismas. Alternativamente, la Publicación PCT WO 03/074679 por Lazar et al . , describe métodos para utilizar métodos de visualización computarizada para optimizar las propiedades fisioquímicas de los anticuerpos. Moléculas de Ácido Nucleico que Codifican para Anticuerpos Otro aspecto de la invención se refiere a moléculas de ácido nucleico que codifican para los anticuerpos de la invención. Los ácidos nucleicos pueden encontrarse presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma pura parcialmente purificada o sustancialmente pura. Un ácido nucleico se encuentra "aislado" o "se hace sustancialmente puro" cuando se purifica de otros componentes celulares u otros contaminantes, e.g., otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándar, incluyendo tratamiento alcalino/SDS, formación de banda CsCl, cromatografía de columna, electroforesis de gel de agarosa y otras muy conocidas en la técnica. Ver, F. Ausubel et al . , ed. (1987) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York. Un ácido nucleico de la invención puede ser, por ejemplo, ADN o ARN y puede o no contener secuencias intrónicas. En una modalidad preferida, el ácido nucleico es una molécula de ADNc. Los ácidos nucleicos de la invención pueden obtenerse utilizando técnicas estándar de biología molecular.
Para anticuerpos expresados por hibridomas ( e . g. , hibridomas preparados a partir de ratones transgénicos portadores de genes de imnunoglobulina humana como se describe adicionalmente abajo), pueden obtenerse ADNcs que codifican para las cadenas ligera y pesada del anticuerpo producidas por el hibridoma mediante amplificación PCR estándar o técnicas de clonación ADNc. Para anticuerpos obtenidos de una biblioteca de gen de inmunoglobulina (e.g., utilizando técnicas de despliegue fago) , pueden recuperarse de la biblioteca uno o más ácidos nucleicos que codifican para el anticuerpo . Las moléculas de ácido nucleico preferidas de la invención son aquellas que codifican para las secuencias VH y VL de los anticuerpos monoclonales 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8. Las secuencias de ADN que codifican para las secuencias VH de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 59, 60, 61, 62, 63, 64 y 65, respectivamente. Las secuencias de ADN que codifican para las secuencias VL de 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se muestran en las SEQ ID NOs: 66, 67, 68, 69, 70, 71, 72 y 73, respectivamente. Una vez obtenidos los fragmentos de ADN que codifican para segmentos VH y VL, estos fragmentos de ADN pueden manipularse adicionalmente mediante técnicas estándar recombinantes de ADN, por ejemplo para convertir los genes de la región variable en genes de cadena de anticuerpo de longitud total, en genes de fragmento Fab o en un gen scFv. En estas manipulaciones, un fragmento de ADN que codifica VL o VH se une operativamente a otro fragmento de ADN que codifica para otra proteína, tal como una región constante de anticuerpo o una unión flexible. El término "unido operativamente" como se utiliza en este contexto, pretende significar que los dos fragmentos de ADN se encuentran unidos de tal manera que las secuencias de aminoácidos codificadas por los dos fragmentos de ADN permanecen en la estructura. El ADN aislado que codifica para la región VH puede convertirse en un gen de cadena pesada de longitud total uniendo operativamente el ADN que codifica para VH a otra molécula de ADN que codifica para las regiones constantes de cadena pesada (CH1, CH2 y CH3) . Las secuencias de genes humanos de la región constante de cadena pesada se conocen en la técnica ( ver e . g. , Kabat E. A., et al . , (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación PCR estándar. La región constante de cadena pesada puede ser una región constante IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA, IgE, IgM o IgD, pero más preferentemente es una región constante IgGl o IgG4. Para un gen de cadena pesada de fragmento Fab, el ADN que codifica para VH puede unirse operativamente a otra molécula de ADN que codifica solo para la región constante CH1 de cadena pesada. El ADN aislado que codifica para la región V puede convertirse en un gen de cadena ligera de longitud total (así como en un gen Fab de cadena ligera) uniendo operativamente el ADN que codifica para VL a otra molécula de ADN que codifica para la región constante de cadena ligera, CL. Las secuencias de genes humanos de la región constante de cadena ligera se conocen en la técnica ( ver e . g. , Kabat E. A., et al . , (1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest, Quinta Edición, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242) y los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación PCR estándar. En modalidades preferidas, la región constante de cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda. Para crear un gen scFv, los fragmentos de ADN que codifican para VH y VL se unen operativamente a otro fragmento que codifica para una unión flexible, e.g., que codifica para la secuencia de aminoácidos (Gly4-Ser)3, de manera que las secuencias VH y VL pueden expresarse como una proteína contigua de cadena lateral, con las regiones VL y VH unidas por una unión flexible (ver, e.g., Bird et al . , (1988) Science 242:423-426; Huston et al . , (1988) Proc . Na tl . Acad, Sci . EUA 85:5879-5883); MaCafferty et al . , (1990) Na ture 348:552-554) . Producción de Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos monoclonales (mAbs) de la presente invención pueden producirse mediante una variedad de técnicas, incluyendo metodología convencional de anticuerpos monoclonales e.g., la técnica estándar de hibridación de célula somática de Kohier y Milstein (1975) Na ture 256:495. Aunque se prefieren procedimientos de hibridación de célula somática, en principio, pueden emplearse otras técnicas para producir anticuerpos monoclonales, e.g., transformación viral u oncogénica de linfocitos B. El sistema animal preferido para preparar hibridomas es el sistema murino. La producción de hibridomas en el ratón es un procedimiento muy establecido. Se conocen en la técnica protocolos y técnicas de inmunización para el aislamiento de esplenocitos inmunizados para fusión. También se conocen socios de fusión (e.g., células de mieloma murino) y procedimientos de fusión. Los anticuerpos quiméricos o humanizados de la presente invención pueden prepararse en base a la secuencia de un anticuerpo monoclonal murino preparado como se describió anteriormente. El ADN que codifica las inmunoglobulinas de cadena pesada y ligera puede obtenerse a partir del hibridoma no humano de interés y fabricarse para contener secuencias de inmunoglobulina no murina ( e . g. , humana) utilizando técnicas estándar de biología molecular. Por ejemplo, para crear un anticuerpo quimérico, las regiones variables murinas pueden unirse a regiones constantes humanas utilizando métodos conocidos en la técnica ( ver e . g. , Patente de E.U. No. 4,816,567 para Cabilly et al ) . Para crear un anticuerpo humanizado, las regiones CDR murinas pueden insertarse en una estructura humana utilizando métodos conocidos en la técnica (ver e.g., Patente de E.U. No. 5,225,539 para Winter, y las Patentes de E.U. Nos. 5,530,101; 5,585,089; 5,693,762 y 6,180,370 para Queen et al . ) . En una modalidad preferida, los anticuerpos de la invención son anticuerpos monoclonales humanos. Tales anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra CD19 pueden generarse utilizando ratones transgénicos o transcromosómicos portadores de partes del sistema inmune humano en lugar de partes del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos y transcromosómicos incluyen ratones referidos en la presente como HuMAb Mouse® y KM Mouse®, respectivamente, y se refieren colectivamente en la presente como "ratones de Ig humano". El HuMAb Mouse® (Medarex®, Inc.) contiene mini sitios del gen de inmunoglobulina humana que codifica para secuencias de inmunoglobulina humana no reordenadas de cadena pesada (µ y y) y ligera K, conjuntamente con mutaciones dirigidas que desactivan los sitios endógenos de cadena µ y K (ver e.g., Lonberg, et al., (1994) Nature 368 ( 6474 ): 856-859) . En consecuencia, los ratones exhibieron expresión reducida de IgM de ratón o K, y en respuesta a la inmunización, los transgenes humanos de cadena pesada y ligera introducidos experimentan un intercambio de clase y una mutación somática para general anticuerpos monoclonales IgG? humanos de alta afinidad (Lonberg, N., et al., (1994), supra; revisada en Lonberg, N. (1994) Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101; Lonberg, N. y Huszar D. (1995) Intern. Rev. Immunol. 13:65-93; y Harding, F. Y Lonberg, N. (1995) Ann. N.Y. Acad. Sci., 764:536-546). La preparación y el uso del HuMAb Mouse®, y las modificaciones genómicas portadas por tales ratones, se describen adicionalmente en Taylor, L. et al., (1992) Nucleic Acids Research 20:6287-6295; Chen, J. et al., (1993) International Immunology 5:647-656; Tuaillon et al., (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 90:3720-3724; Choi et al., (1993) Nature Genetics 4:117-123; Chen J. et al., (1993) EMBO J. 12:821-830; Tuaillon et al., (1994) J. Immunol., 152:2912-2920; Taylor L. et al., (1994) International Immunology 6:579-591; y Fishwild, D. et al., (1996) Nature Biotechnology 14:845-851, cuyo contenido se incorpora específicamente en la presente en su totalidad. Ver además, Patentes de E.U. Nos. 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; 5,789,650; 5,877,397; 5,661,016; 5,814,318; 5,874,299; y 5,770,429; todas para Lonberg y Kay; Patente de E.U. No. 5,545,807 para Surani et al . , Publicaciones PCT Nos WO 92/03918, WO 93/12227, WO 94/25585, WO 97/13852, WO 98/24884 y WO 99/45962, todas para Lonberg y Kay; y la Publicación PCT No. WO 01/14424 para Korman et al . En otra modalidad, los anticuerpos humanos de la invención pueden criarse utilizando un ratón portador de secuencias de inmunoglobulina humana en transgenes y transcromosomas, tal como un ratón portador de un transgen humano de cadena pesada y un transcromosoma humano de cadena ligera. Tales ratones, referidos en la presente como "KM mice™", se describen en detalle en la Publicación PCT WO 92/43478 para Ishida et al . Aún adicionalmente, los sistemas de animales transgénicos alternativos que expresan genes de inmunoglobulina humana se encuentran disponibles en la técnica y pueden utilizarse para criar los anticuerpos anti-CD19 de la invención. Por ejemplo, puede utilizarse un sistema transgénico alternativo referido como Xenomouse (Abgenix, Inc.); tales ratones se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U. Nos. 5,939,598; 6,075,181; 6,114,598; 6,150,584 y 6,162,963 para Kucherlapati et al . Además, se encuentran disponibles en la técnica sistemas de animales transcromosómicos alternativos y pueden utilizarse para criar los anticuerpos anti-CD19 de la invención. Por ejemplo, pueden utilizarse ratones portadores tanto de transcromosoma humano de cadena pesada como transcromosoma humano de cadena ligera, referidos como "ratones TC"; tales ratones se describen en Tomizuka et al . , (2000) Proc . Na tl . Acad . Scí . EUA 97 -. 122 -121 . Además, se han descrito en la técnica vacas portadoras de transcromosomas humanos de cadena pesada y ligera (Kuroiwa et al . , (2002) Na ture Biotechnology 20:889-894 y pueden utilizarse para criar anticuerpos anti-CD19 de la invención. Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando métodos de despliegue fago para visualizar bibliotecas de genes de inmunoglobulina humana. Tales métodos de despliegue fago para aislar anticuerpos humanos se establecen en la técnica. Ver, por ejemplo; Patentes de E.U. Nos. 5,223,409; 5,403,484; y 5,571,698 para Ladner et al . ; Patentes de E.U. Nos. 5,427,908 y 5,580,717 para Dower et al; Patentes de E.U. Nos. 5,969,108 y 6,172,197 para McCafferty et al; y las Patentes de E.U. Nos. 5,885,793; 6,521,404; 6,544,731; 6,555,313; 6,582,9130, 31, 32, 33, 34, 35 y 36,593,081 para Griffiths et al . Los anticuerpos monoclonales humanos de la invención también pueden prepararse utilizando ratones SCID en los cuales se han reconstituido células humanas inmunes de manera que puede generar una respuesta del anticuerpo humano a la inmunización. Tales ratones se describen, por ejemplo, las Patentes de E.U. Nos. 5,476,996 y 5,698,767 para Wilson et al . Inmunización de Ratones con Ig Humano Cuando se utilizan ratones con Ig humano para criar los anticuerpos humanos de la invención, tales ratones pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno CD19 y/o CD19 recombinante, o células que expresan CD19, o una proteína de fusión de CD19, como se describe por Lonberg, N et al . , (1994) Na ture 368 ( 647 ): 856-859; Fishwild, D. et al . , (1996) Na ture Biotechnology 14:845-851; y Publicaciones PCT WO 98/24884 y WO 01/14424. Preferentemente, los ratones tendrán de 6-16 semanas de edad a la primera infusión. Por ejemplo, puede utilizarse una preparación purificada o recombinante (5-50 µg) de antígeno CD19 para inmunizar a los ratones con Ig humano intraperitonealmente . Los procedimientos detallados para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos para CD19 se describen en el Ejemplo 1 abajo. La experiencia acumulativa con diversos antígenos ha mostrado que los ratones transgénicos responden cuando se inmunizan inicialmente intraperitonealmente (IP) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido por inmunizaciones cada dos semanas IP (hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Sin embargo, también se encuentran efectivos otros adyuvantes diferentes al de Freund. Adicionalmente, se encuentra que las células completas en ausencia de un adyuvante son altamente inmunogénicas. La respuesta inmune puede monitorearse durante el curso del protocolo de inmunización con muestras de plasma obtenidas mediante sangrados retroorbitales . El plasma puede visualizarse mediante ELISA (como se describe abajo), y los ratones con titulaciones suficientes de inmunoglobulina humana anti-CD19 pueden utilizarse para fusiones. Puede reforzarse a los ratones de manera intravenosa con antígeno 3 días antes del sacrificio y retiro del bazo. Se espera que sean necesarias 2-3 fusiones para cada inmunización. Entre 6 y 24 ratones se inmunizan típicamente para cada antígeno. Comúnmente se utilizan especies tanto HCo7 como HCol2. Adicionalmente, puede criarse un transgen tanto HCo7 como HCol2 conjuntamente en un solo ratón que tiene dos diferentes transgenes humanos de cadena pesada (HCo7/HCol2) . Alternativamente o adicionalmente, puede utilizarse la especie KM Mouse®, como se describe en el Ejemplo 1. Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos Para generar hibridomas que producen los anticuerpos monoclonales humanos de la invención, pueden aislarse esplenocitos y/o células de nodo linfático de ratones inmunizados y fusionarse a una línea celular inmortalizada apropiada, tal como una línea celular de mieloma de ratón. Los hibpdomas resultantes pueden visualizarse para la producción de anticuerpos específicos al antígeno. Por ejemplo, pueden fusionarse suspensiones unicelulares de linfocitos espíemeos de ratones inmunizados a un sexto del número de células no secretorias de mieloma de ratón P3X63-Ag8.653 (ATCC, CRL 1580) con PEG al 50%. Alternativamente, la suspensión unicelular de lmfocitos espíemeos de ratones inmunizados pueden fusionarse utilizando un método de electrofusion basado en campo eléctrico, utilizando un electroporador de fusión de célula de cámara grande CytoPulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie Maryland) . Las células se colocan en placas a aproximadamente 2 x 105 en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación de dos semanas en un medio selectivo conteniendo suero fetal Clone al 20%, medio acondicionado "653" al 18%, origen al 5% (IGEN), 4 mM de L-glutamma, 1 mM de piruvato de sodio, 5 mM de HEPES, 0.055 mM de 2-mercaptoetanol, 50 umdades/ml de penicilina, 50 mg/ml de estreptomicina, 50 mg/ml de gentamicma y IX HAT (Sigma: el HAT se agrega 24 horas después de la fusión) . Después de aproximadamente dos semanas, las células pueden cultivarse en un medio en el cual el HAT se reemplaza con HT . Los pozos individuales pueden entonces visualizarse mediante ELISA para anticuerpos IgM e IgG monoclonales humanos. Una vez que se presenta el crecimiento extenso del hibridoma, puede observarse el medio comúnmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpo pueden re-emplacarse, visualizarse de nuevo, y si son aún positivos para IgG humano, los anticuerpos monoclonales pueden subclonarse al menos dos veces limitando la disolución. Los subclones estables pueden cultivarse entonces in vi tro para general pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterización. Para purificar anticuerpos monoclonales humanos, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces giratorios de dos litros para purificación de anticuerpos monoclonales. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida puede verificarse mediante electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución de amortiguador puede intercambiarse en PBS, y la concentración puede determinarse por OD280 utilizando un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden alicuotarse y almacenarse a -80°C. Generación de Transfectomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Los anticuerpos de la invención también pueden producirse en un transfectoma de célula huésped utilizando, por ejemplo, una combinación de técnicas de ADN recombinante y métodos de transfección de gen como es muy conocido en la técnica (e.g., Morrison, S. (1985) Science 229:1202). Por ejemplo, para expresar los anticuerpos, o sus fragmentos de anticuerpo, pueden obtenerse ADNs que codifican para cadenas ligera y pesada parciales o de longitud total mediante técnicas estándar de biología molecular (e.g., amplificación PCR o clonación de ADNc utilizando un hibridoma que expresa al anticuerpo de interés) y los ADNs pueden insertarse en vectores de expresión de manera que los genes se unen operativamente a secuencias de control transcripcionales y translacionales . En este contexto, el término "operativamente unido" significa que un gen de anticuerpo se encuentra ligado en un vector de manera que las secuencias de control transcripcionales y translacionales dentro del vector sirven para su función pretendida de regular la transcripción y translación del gen de anticuerpo. El vector de expresión y las secuencias de control de expresión se seleccionan para ser compatibles con la célula huésped de expresión utilizada. El gen de cadena ligera del anticuerpo y el gen de cadena pesada del anticuerpo pueden insertarse en un vector separado o, más típicamente, ambos genes se insertan dentro del mismo vector de expresión. Los genes de anticuerpo se insertan en el vector de expresión mediante métodos estándar (e.g., ligación de sitios de restricción complementarios en el fragmento del gen del anticuerpo y el vector, o ligación de extremo si no se encuentran presentes sitios de restricción) . Las regiones variables de cadena ligera y pesada de los anticuerpos descritos en la presente pueden utilizarse para crear genes de anticuerpo de longitud total de cualquier isotipo de anticuerpo insertándolas en vectores de expresión que ya codifican para las regiones constantes de cadena pesada y de cadena ligera del isotipo deseado de manera que el segmento VH se encuentra operativamente unido a el (los) segmento (s) CH dentro del vector, y el segmento V? se encuentra operativamente unido al segmento CL dentro del vector. Adicionalmente, o alternativamente, el vector de expresión recombinante puede codificar un péptido de señal que facilita la secreción de la cadena de anticuerpo desde una célula huésped. El gen de cadena de anticuerpo puede clonarse en el vector de manera que el péptido de señal se encuentra unido en la estructura, a la terminación amino del gen de cadena de anticuerpo. El péptido de señal puede ser un péptido de señal de inmunoglobulina o un péptido de señal heterólogo (i.e., un péptido de señal de una proteína no inmunoglobulina) . Adicionalmente a los genes de cadena de anticuerpo, los vectores de expresión recombinantes de la invención portan secuencias reguladoras que controlan la expresión de los genes de cadena de anticuerpo en una célula huésped. El término "secuencia reguladora" pretende incluir promotores, mejoradores y otros elementos de control de expresión (e.g., señales de poliadenilación) que controlan la transcripción o translación de los genes de cadena de anticuerpo. Tales secuencias reguladoras se describen, por ejemplo, en Goeddel (Gene Expression Technology, Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego, CA (1990)). Se apreciará por los expertos en la técnica que el diseño del vector de expresión, incluyendo la selección de secuencias reguladoras, puede depender de factores tales como la selección de la célula huésped que va a transformarse, el nivel de expresión de proteína deseado, etc. Las secuencias reguladoras preferidas para expresión de la célula huésped de mamífero incluyen elementos virales que dirigen altos niveles de expresión de proteína en células de mamífero, tales como promotores y/o mejoradores derivados de citomegalovirus (CMV) , Simian Virus 40 (SV40), adenovirus, (e.g., el promotor final principal de adenovirus (AdMLP) y polioma. Alternativamente, pueden utilizarse secuencias reguladoras no virales, tales como el promotor ubicuitina o el promotor ß-globina. Aún adicionalmente, los elementos reguladores compuestos de secuencias de diferentes fuentes, tales como el sistema de promotor SRa, que contiene secuencias del promotor primero SV40 y la repetición terminal larga del virus de leucemia de célula T humana tipo 1 (Takebe, Y. et al . , (1988) Mol . Cell . Biol . 8:466-472) . Adicionalmente a los genes de cadena de anticuerpo y las secuencias reguladoras, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden portar secuencias adicionales, tales como las secuencias que regulan la repetición del vector en células huésped (e.g., orígenes de repetición) y genes marcadores seleccionables. El gen marcador seleccionable facilita la selección de las células huésped dentro de las cuales se ha introducido el vector ( ver, e . g. , Patentes de E.U. Nos. 4,399,216, 4,634,665 y 5,179,017 todas por Axel et al . ) . Por ejemplo, el gen marcador seleccionable típicamente confiere resistencia a drogas tales como G418, higromicina o metotrexato, en una célula huésped dentro de la cual se ha introducido el vector. Los genes marcadores seleccionables preferidos incluyen el gen dihidrofolato reductasa (DHFR) (para uso en células huésped dhfr con selección/amplificación de metotrexato) y el gen neo (para selección de G418) . Para la expresión de las cadenas ligera y pesada, el (los) vector (es) de expresión que codifica (n) para las cadenas pesada y ligera se transfecta (n) en una célula huésped mediante técnicas estándar. Las diversas formas del término "transfección" pretenden abarcar una amplia variedad de técnicas comúnmente utilizadas para la introducción de ADN exógeno en una célula huésped procariótica o eucariótica, e.g., electroporación, precipitación de calcio-fosfato, transfección DEAE-dextran y lo similar. Aunque es teóricamente posible expresar los anticuerpos de la invención en células huésped tanto procarióticas como eucarióticas, la expresión de anticuerpos en células eucarióticas, y de mayor preferencia en células huésped de mamífero, es la más preferida debido a que es más probable que tales células eucarióticas, y en particular las células de mamífero, se ensamblen y secreten un anticuerpo apropiadamente dividido e inmunológicamente activo. La expresión procariótica de los genes de anticuerpo se ha reportado como no efectiva para la producción de altos rendimientos del anticuerpo activo (Boss, M. A., y Wood, C. R., (1985) Immunology Today 6:12-13). Las células huésped de mamífero preferidas para expresar los anticuerpos recombinantes de la invención incluyen células Ováricas de Hámster Chino (células CHO) (incluyendo las células dhfr-CHO descritas en Urlaub y Chasin (1980) Proc . Na tl . Acad. Sci . EUA 77:4216-4220, utilizadas con un marcador DHFR seleccionable, e.g., como se describe en R. J. Kaufman y P. A. Sharp (1982) J. Mol . Biol . 159:601-621), células NSO de mieloma, células COS y células SP2. En particular, para uso con células NSO de mieloma, otro sistema de expresión preferido es el sistema GS de expresión de gen descrito en WO 87/04462 (para Wilson) , WO 89/01036 (para Bebbington) y EP 338,841 (para Bebbington) . Cuando se introducen vectores de expresión recombinantes que codifican para genes de anticuerpo en células huésped de mamífero, los anticuerpos se producen cultivando las células huésped durante un período de tiempo suficiente para permitir la expresión del anticuerpo en las células huésped o, más preferentemente, la secreción del anticuerpo en el medio de cultivo en el cual se cultivan las células huésped. Los anticuerpos pueden recuperarse del medio de cultivo utilizando métodos estándar de purificación de proteína. Caracterización de la Unión del Anticuerpo al Antígeno Los anticuerpos de la invención pueden probarse por su unión a CD19, por ejemplo, mediante ELISA estándar. Brevemente, se recubren placas de microtitulación con CD19 purificado a 0.25 µg/ml en PBS, y después se bloquean con albúmina de suero bovino al 5% en PBS. Las disoluciones de anticuerpo (e.g., disoluciones de plasma de ratones inmunizados con CD19) se agregan a cada pozo y se incuban durante 1-2 horas a 37°C. Las placas se lavan con PBS/Tween y después se incuban con un reactivo secundario (e.g., para anticuerpos humanos, un reactivo policlonal específico para Fc de IgG de cabra anti-humano) conjugado a fosfatasa alcalina durante 1 hora a 37°C. Después de lavarse, las placas se revelan con substrato pNPP (1 mg/ml) y se analizan a OD de 405-650. Preferentemente, los ratones que revelan las titulaciones más altas se utilizarán para fusiones. También puede utilizarse un análisis ELISA como se describió anteriormente para visualizar por hibridomas que muestran reactividad positiva con el inmunogen CD19. Los hibridomas que se unen con alta avidez a CD19 se subclonan y se caracterizan adicionalmente. Un clon de cada hibridoma, que retiene la reactividad de las células originales (mediante ELISA) puede seleccionarse para preparar un banco celular de 5-10 viales almacenado a -140°C y para purificación del anticuerpo. Para purificar los anticuerpos anti-CD19, pueden cultivarse hibridomas seleccionados en matraces giratorios de dos litros para purificación del anticuerpo monoclonal. Los sobrenadantes pueden filtrarse y concentrarse antes de la cromatografía de afinidad con proteína A-sefarosa (Pharmacia, Piscataway, N.J.). La IgG eluida puede verificarse mediante electroforesis de gel y cromatografía líquida de alto desempeño para asegurar la pureza. La solución de amortiguador puede intercambiarse en PBS, y la concentración puede determinarse por OD280 utilizando un coeficiente de extinción de 1.43. Los anticuerpos monoclonales pueden alicuotarse y almacenarse a -80°C. Para determinar si los anticuerpos monoclonales anti-CD19 seleccionados se unen a epítopes únicos, cada anticuerpo puede biotinilarse utilizando reactivos comercialmente disponibles (Pierce, Rockford, IL) . Pueden efectuarse estudios de competencia utilizando anticuerpos monoclonales no marcados y anticuerpos monoclonales biotinilados utilizando placas ELISA cubiertas con CD19 como se describió anteriormente. La unión de mAb biotinilado puede detectarse con una sonda de strep-avidina-fosfatasa alcalina . Para determinar el isotipo de los anticuerpos purificados, el isotipo de ELISA puede efectuarse utilizando reactivos específicos para anticuerpos de un isotipo particular. Por ejemplo, para determinar el isotipo de un anticuerpo monoclonal humano, pueden recubrirse pozos de microtitulación con 1 µg/ml de inmunoglobulina anti-humana durante la noche a 4°C. Después de bloquear con BSA al 1%, las placas se reactivan con 1 µg/ml o menos de anticuerpos monoclonales de prueba o controles de isotipo purificados, a temperatura ambiente durante una a dos horas. Los pozos pueden reactivarse entonces ya sea con IgGl humana o sondas conjugadas con alcalina fosfatasa específicas para IgM humana. Las placas se revelan y se analizan como se describió anteriormente. Las IgGs humanas anti-CD19 puede probarse adicionalmente por reactividad con antígeno CD19 mediante inmunoanálisis Western. Brevemente, CD19 puede prepararse y someterse a electroforesis de gel de sodio docecil sulfato poliacrilamida. Después de la electroforesis, los antígenos separados se transfieren a membranas de nitrocelulosa, se bloquean con suero fetal de ternera al 10%, y se sondean con los anticuerpos monoclonales que van a probarse. La unión de IgG humana puede detectarse utilizando alcalina fosfatasa de IgG anti-humano y se revela con tabletas de substrato BCIP/NBT (Sigma Chem. Co . , St. Louis, Mo.). Inmunoconjugados En otro aspecto, la presente invención proporciona un anticuerpo anti-CD19, o un fragmento del mismo, conjugado a un residuo terapéutico, tal como una citotoxina, una droga (e.g., un inmunosupresor) o una radiotoxina. Tales conjugados se refieren en la presente como "inmunoconjugados". Los inmunoconjugados que incluyen una o más citotoxinas se refieren como "inmunotoxinas" . Una citotoxina o agente citotóxico incluye un agente que es dañino para (e.g., destruye) las células. Los ejemplos incluyen taxol, citocalasina B, gramicidina D, bromuro de etidio, emetina, mitomicina, etoposida, tenoposida, vincristina, vinblastina, colquicina, doxorrubicina, daunorrubicina, dihidroxi antracin diona, mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucorticoides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol, y puromicina y análogos u homólogos de los mismos. Los agentes terapéuticos incluyen también, por ejemplo, antimetabolitos (e.g., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, 5-fluoroacil decarbazina, agentes de alquilación (e.g., mecloretamina, tioepa clorambucil, melfalan, carmustina (BSNU) y lomustina (CCNU) , ciclofosfamida, busulfan, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C y cis-diclorodiamina platino (II) (DDP) cisplatin), antraciclinas (e.g., daunorrubicina (anteriormente daunomicina) y doxorrubicina), antibióticos (e.g., dactinomicina (anteriormente actinomicina), bleomicina, mitramicina y antramicina (AMC) ) , y agentes anti-mitóticos (e.g., vincristina y vinblastina). Otros ejemplos preferidos para citotoxina terapéuticas que pueden conjugarse a un anticuerpo de la invención, incluyen duocarmicinas, caliqueamicinas, maytansinas y auristatinas y sus derivados. Un ejemplo de un conjugado de anticuerpo caliqueamicina se encuentra comercialmente disponible (Mylotarg®; American Home Products) . Las citotoxinas pueden conjugarse a los anticuerpos de la invención utilizando tecnología de unión disponible en la técnica. Ejemplos de tipos de unión que se han utilizado para conjugar una citotoxina a un anticuerpo incluyen, pero no se limitan a, hidrazonas, tioéteres, esteres, disulfuros y uniones que contienen péptido. Puede seleccionarse, por ejemplo, una unión susceptible a división mediante bajo pH dentro del compartimento lisosomal o susceptible a división por proteasas, tales como las proteasas preferentemente expresadas en tejido de tumor tales como catepsinas (e.g., catepsinas B, C, D) . Para tratar adicionalmente los tipos de citotoxinas, uniones y métodos para conjugar agentes terapéuticos a anticuerpos, ver también Saito, G. et al . , (2003) Adv. Drug Deliv. Rev. , 55:199-215; Trail, P. A., et al . , (2003) Cáncer Immunol . Immunother . 52:328-337; Payne, G. (2003) Cáncer Cell 3:207-212; Alien, T. M., (2002) Na t . Rev. Cáncer 2:750-763; Pastan I. y Kreitman R. J. (2002) Curr . Opin . Investig. Drugs 3:1089-1091; Senter P. D., y Springer C. J. (2001) Adv. Drug Deliv. Rev. , 53:247-264. Los anticuerpos de la presente invención también pueden conjugarse a un isótopo radiactivo para generar radiofarmacéuticos citotóxicos, referidos también como radioinmunoconjugados . Ejemplos de isótopos radiactivos que pueden conjugarse a los anticuerpos para su uso diagnóstico o terapéutico incluyen, pero no se limitan a, yodo131, indio111, itrio90 y lutecio177. Se establecen en la técnica métodos para preparar radioinmunoconjugados. Ejemplos de radioinmunoconjugados se encuentran comercialmente disponibles, incluyendo Zevalin™ (IDEC Pharmaceuticals) y Bexxar™ (Corixa Pharmaceuticals), y pueden utilizarse métodos similares para preparar radioinmunoconjugados utilizando los anticuerpos de la invención. Los conjugados de anticuerpo de la invención pueden utilizarse para modificar una respuesta biológica dada, y el residuo de droga no debe tomarse como limitado a los clásicos agentes terapéuticos químicos. Por ejemplo, el residuo de droga puede ser una proteína o polipéptido que posee una actividad biológica deseada. Tales proteínas pueden incluir, por ejemplo, una toxina enzimáticamente activa o un fragmento de la misma, tal como abrin, ricin A, exotoxina pseudomonas, o toxina de difteria; una proteína tal como el factor de necrosis de tumor o interferón-?; o, modificadores de respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfosinas, interleusina-1 ("IL-1"), interleusina-2 ("IL-2"), interleusina-6 ("IL-6"), factor estimulador de colonia de granulocito macrófago ("GM-CSF"), factor estimulador de colonia de granulocito ("G-CSF"), u otros factores de crecimiento . Las técnicas para conjugar tal residuo terapéutico a anticuerpos son muy conocidas, ver, e.g., Arnon et al . , "Monoclonal Antibodies for Immunotargeting of Drugs in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies and Cáncer Therapy, Reisfeld et al . , (eds.) pp. 243-56 (Alan R. Liss, Inc. 1985); Hellstrom et al . , "Antibodies for Drug Delivery", en Controlled Drug Delivery (2a ed.), Robinson et al . , (eds.) pp. 623-53 (Marcel Dekker, Inc. 1987); Thorpe, "Antibody Carriers of Citotoxic Agents in Cáncer Therapy: A Review", en Monoclonal Antibodies '84: Biological and Clinical Applications, Pinchera et ai., (eds.) pp . 475-506 (1985); "Analysis Results, and Future Prospective of the Therapeutic Use of Radiolabeled Antibody in Cáncer Therapy", en Monoclonal Antibodies for Cáncer Detection and Therapy, Baldwin et al . , (eds.) pp . 303-16 (Academic Press 1985), y Thorpe et al . , Immunol . Rev. 62:119-58 (1982). Moléculas Biespecíficas En otro aspecto, la presente invención proporciona moléculas biespecíficas que comprenden un anticuerpo anti-CD19 o fragmento del mismo, de la invención. Un anticuerpo de la invención, o porciones de unión a antígeno del mismo, puede derivatizarse o unirse a otra molécula funcional, e.g., otro péptido o proteína (e.g., otro anticuerpo o ligante para un receptor) para generar una molécula biespecífica que se une a al menos dos diferentes sitios de unión o moléculas objetivo. El anticuerpo de la invención puede, de hecho, derivatizarse o unirse a más de una molécula funcional diferente para generar moléculas multiespecíficas que se unen a más de dos sitios de unión y/o moléculas objetivo diferentes; tales moléculas multiespecíficas también pretenden encontrarse abarcadas por el término "molécula biespecífica" como se utiliza en la presente. Para crear una molécula biespecífica de la invención, un anticuerpo de la invención puede unirse funcionalmente (e.g., mediante acoplamiento químico, fusión genética, asociación no covalente o de otra manera) a una o más moléculas de unión diferentes, tal como otro anticuerpo, fragmento de anticuerpo, péptido o mimético de unión, de manera que resulta una molécula biespecífica. En consecuencia, la presente invención incluye moléculas biespecíficas que comprenden al menos una primera especificidad de unión para CD19 y una segunda especificidad de unión para un segundo epítope objetivo. En una modalidad particular de la invención, el segundo epítope objetivo es un receptor Fc, e.g., Fc?RI humano (CD64) o un receptor Fca humano (CD89) . Por consiguiente, la invención incluye moléculas biespecíficas capaces de unirse a células efector que expresan tanto Fc?RI, como Fca (e.g., monocitos, macrófagos o células polimorfonuclear (PMNs)), y a células objetivo que expresan CD19. Estas moléculas biespecíficas dirigen las células que expresan CD19 a la célula efector y activan las actividades de la célula efector mediadas por el receptor Fc, tales como fagocitosis de las células que expresan CD19, citotoxicidad mediada por la célula dependiente de anticuerpo (ADCC), liberación de citosina, o generación de anión superóxido. En una modalidad de la invención en la cual la molécula biespecífica es multiespecífica, la molécula puede incluir además una tercera especificidad de unión adicional a la especificidad de unión anti-Fc y a la especificidad de unión anti-CD19. En una modalidad, la tercera especificidad de unión es una porción del factor anti-aumento (EF) , e.g., una molécula que se une a una proteína de superficie implicada en la actividad citotóxica y en consecuencia aumenta la respuesta inmune contra la célula objetivo. La "porción de factor anti-aumento" puede ser un anticuerpo, fragmento de anticuerpo funcional, o un ligante que se une a una molécula dada, e.g., un antígeno o un receptor, y en consecuencia da como resultado un aumento del efecto de las determinantes de unión para el receptor Fc o el antígeno de célula objetivo. La "porción del factor anti-aumento" puede unir un receptor Fc o un antígeno de célula objetivo. Alternativamente, la porción del factor anti-aumento puede unirse a una entidad diferente a la entidad a la cual se unen las primera y segunda especificidades de unión. Por ejemplo, la porción del factor anti-aumento puede unirse a una célula T citotóxica (e.g., a través de CD2, CD3, CD8, CD28, CD4, CD40, ICAM-1 u otra célula inmune que de cómo resultado un aumento en la respuesta inmune contra la célula objetivo) . En una modalidad, las moléculas biespecíficas de la invención comprenden como una especificidad de unión al menos un anticuerpo, o un fragmento de anticuerpo del mismo, que incluye, e.g., Fab, Fab', F(ab')2, Fv, Fd, dAb o un Fv monocatenario. El anticuerpo también puede ser un dímero de cadena ligera o de cadena pesada, o cualquier mínimo fragmento del mismo tal como un Fv o una construcción monocatenaria como se describe en la Patente de E.U. No. 4,946,778 para Ladner et al Cuyo contenido se incorpora expresamente mediante la referencia. En una modalidad, la especificidad de unión para un receptor Fv se proporciona por un anticuerpo monoclonal, cuya unión no se bloquea por la inmunoglobulina humana G (IgG) . Como se utiliza en la presente, el término "receptor IgG" se refiere a cualquiera de los ocho genes de cadena y ubicados en el cromosoma 1. Estos genes codifican para un total de doce isoformas de receptor transmembrana o soluble que se encuentran agrupadas en tres clases del receptor Fcy: Fc?RI (CD64), Fc?RII (CD32) y FcyRIII (CD16). En una modalidad preferida el receptor Fcy es Fc?RI humano de alta afinidad. El Fc?RI humano es una molécula de 72 kDa que muestra alta afinidad para IgG monomérica (108-109 M"1) . La producción y caracterización de ciertos anticuerpos monoclonales anti-Fc? preferidos se describe en la Publicación PCT WO 88/00052 y en la Patente de E.U. No. 4,954,617 para Fanger et al . , cuyas enseñanzas se incorporan totalmente mediante la referencia en la presente. Estos anticuerpos se unen a un epítope de Fc?RI, Fc?RII o FcyRIII en un sitio distinto al sitio de unión FCY del receptor y, por tanto, su unión no se bloquea sustancialmente por los niveles fisiológicos de IgG. Los anticuerpos anti-Fc?RI útiles en esta invención son mAb 22, mAb 32, mAb 44, mAb 62 y mAb 197. El mAb 32 que produce hibridoma se encuentra disponible de la American Type Culture Collection, No de acceso ATCC HB9469. En otras modalidades, el anticuerpo receptor anti-Fc? es una forma humanizada del anticuerpo monoclonal 22 (H22) . La producción y caracterización del anticuerpo H22 se describe en Graziano, R. F. et al . , (1995) J. Immunol . 155 ( 10) : 4996-5002 y la Publicación PCT WO 94/10332 para Tempest et al . El anticuerpo H22 que produce línea celular se depositó en la American Type Culture Collection bajo la designación HA022CL1 y tiene el no. de acceso CRL 11177. Aún en otras modalidades preferidas, la especificidad de unión para un receptor Fc se proporciona mediante un anticuerpo que se une a un receptor IgA humano, e.g., un receptor Fc-alfa (FcaRI (CD89) ) , cuya unión preferentemente no se bloquea por la inmunoglobulina A humana (IgA). El término "receptor IgA" pretende incluir el producto de gen de un gen a (FcaRI) ubicado en el cromosoma 19. Se sabe que este gen codifica diversas isoformas transmembrana alternativamente divididas de 55 a 110 kDa. FcaRI (CD89) se expresa constitutivamente en monocitos/macrófagos, granulocitos eosinófilos y neutrófilos, pero no en poblaciones de célula no efector. El FcaRI tiene una afinidad media (~ 5 x 107 M"1) tanto para IgAl como para IgA2, que aumenta al exponerse a citosmas tales como G-CSF o GM-CSF (Morton, H. C, et al . , (1996) Cri tical Reviews m Immunology 16:423-440). Se han descrito cuatro anticuerpos monoclonales específicos para FcaRI , identificados como A3, A59, A62 y A77, que se unen a FcaRI fuera del dominio de unión del ligante IgA (Monteiro, R. C, et al . , (1992) J. Immunol . 148 : 1764) . FcaRI y Fc?RI son receptores de accionamiento preferidos para su uso en las moléculas biespecíficas de la invención debido a que (1) se expresan principalmente en células efector inmunes, e.g., monocitos, PMNs, macrófagos y células dendríticas; (2) se expresan a altos niveles (e.g., 5,000-100,000 por célula); (3) son mediadores de actividades citotóxicas (e.g., ADCC, fagocitosis); y (4) median la presentación de antígeno aumentada de los antígenos incluyendo auto-antígenos, dirigidos a ellos. Aunque se prefieren los anticuerpos monoclonales humanos, otros anticuerpos que pueden emplearse en las moléculas biespecíficas de la invención son los anticuerpos monoclonales murmos, quiméricos y humanizados. Las moléculas biespecíficas de la presente invención pueden prepararse conjugando las especificidades de unión constituyentes, e.g., las especificidades del anti-FcR y anti-CD19, utilizando métodos conocidos en la técnica. Por ejemplo, cada especificidad de unión de la molécula biespecífica puede generarse por separado y después conjugarse entre sí. Cuando las especificidades de unión son proteínas o péptidos, pueden utilizarse una diversidad de agentes de acoplamiento o de reticulación para la conjugación covalente. Ejemplos de agentes de reticulación incluyen proteína A, carbodiimida, N-succinimidil-S-acetil-tioacetato (SATA), 5, 5' -ditiobis (2-ácido nitrobenzoico) (DTNB), o-fenilenodimaleimida (oPDM) , N-succinimidil-3- (2-piridiltio) propionato (SPDP), y sulfosuccinimidil 4-(N-maleimidometil) ciclohexano-1-carboxilato (Sulfo-SMCC) (ver, e.g., Karpovsky et al . , (1984) J. Exp . Med. , 160:1686; Liu, MA et al . , (1985) Proc . Na tl . Acad. Sci . EUA 82:8648). Otros métodos incluyen aquellos descritos en Paulus (1985) Behring Ins. Mitt. No. 78, 118-132; Brennan et al . , (1985) Science 229:81-83), y Glennie et al . , (1987) J. Immunol . 139:2367-2375). Los agentes de conjugación preferidos son SATA y sulfo-SMCC, ambos disponibles de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL) . Cuando las especificidades de unión son anticuerpos, pueden conjugarse a través de unión sulfhidrilo de las regiones de articulación de terminación C de las dos cadenas pesadas. En una modalidad particularmente preferida, la región de articulación se modifica para contener un número impar de residuos sulfhidrilo, preferentemente uno, previo a la conjugación. Alternativamente, ambas especificidades de unión pueden codificarse en el mismo vector y expresarse e instalarse en la misma célula huésped. Este método es particularmente útil cuando la molécula específica es una proteína de fusión mAb x mAb, mAb x Fab, Fab x F(ab')2 o ligante x Fab. Una molécula biespecífica de la invención puede ser una molécula monocatenaria que comprende un anticuerpo monocatenario y una determinante de unión, o una molécula biespecífica monocatenaria que comprende dos determinantes de unión. Las moléculas biespecíficas pueden comprender al menos dos moléculas monocatenarias. Los métodos para preparar moléculas biespecíficas se describen por ejemplo en las Patentes de E.U. Números 5,260,203, 5,455,030, 4,881,175, 5,132,405, 5,091,513, 5,476,786, 5,013,653, 5,258,498, y 5,482,858, las cuales se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. La unión de las moléculas biespecíficas a sus objetivos específicos puede confirmarse, por ejemplo, mediante análisis inmunoabsorbente unido a enzima (ELISA) , radioinmunoanálisis (RÍA), análisis FACS, bioanálisis (e.g., inhibición de crecimiento), o inmunoanálisis Western. Cada uno de estos análisis generalmente detecta la presencia de complejos de proteína-anticuerpo de particular interés empleando un reactivo marcado (e.g., un anticuerpo) específico para el complejo de interés. Por ejemplo, los complejos de FcR-anticuerpo pueden detectarse utilizando e.g., un anticuerpo unido a enzima o fragmento de anticuerpo que reconoce y se une específicamente a los complejos de anticuerpo-FcR. Alternativamente, los complejos pueden detectarse utilizando cualquiera de una diversidad de otros inmunoanálisis. Por ejemplo, el anticuerpo puede marcarse radiactivamente y utilizarse en un radioinmunoanálisis (RÍA) (ver, por ejemplo, Weintraub, B., Principies of Radioimmunoassays, Seventh Training Course on Radioligand Assay Techniques, The Endocrine society, Marzo 1986, que se incorpora mediante la referencia en la presente) . El isótopo radiactivo puede detectarse por medios tales como el uso de un contador Y o un contador de escintilación o mediante autorradiografía. Composiciones Farmacéuticas En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, e.g., una composición farmacéutica, que contiene uno o una combinación de anticuerpos monoclonales, o porción (es) de unión a antígeno de los mismos, de la presente invención, formulados conjuntamente con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Tales composiciones pueden incluir uno o una combinación de (e.g., dos o más diferentes) anticuerpos, o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas de la invención. Por ejemplo, una composición farmacéutica de la invención puede comprender una combinación de anticuerpos (o inmunoconjugados o moléculas biespecíficas) que se unen a diferentes epítopes en el antígeno objetivo o que tienen actividades complementarias. Las composiciones farmacéuticas de la invención también pueden administrarse en terapia de combinación, i.e., combinadas con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación puede incluir un anticuerpo anti-CD19 de la presente invención combinado con al menos un agentes antiinflamatorio o inmunosupresor diferente. Ejemplos de agentes terapéuticos que pueden utilizarse en terapia de combinación se describen en mayor detalle abajo en la sección de usos de los anticuerpos de la invención. Como se utiliza en la presente, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualquiera y todo solvente, medio de dispersión, recubrimiento, agentes antibacteriales y anti hongos, agentes isotónicos y de retraso de absorción, y lo similar, que sean fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el vehículo es adecuado para administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (e.g., por inyección o infusión) . Dependiendo de la vía de administración, el compuesto activo, i.e., anticuerpo, inmunoconjugado o molécula biespecífica, puede recubrirse en un material para proteger el compuesto de la acción de ácidos y otras condiciones naturales que puedan desactivar el compuesto. Los compuestos farmacéuticos de la invención pueden incluir una o más sales farmacéuticamente aceptables. Una "sal farmacéuticamente aceptable" se refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del compuesto original y no imparte ningún efecto toxicológico indeseable (ver e.g., Berge, S. M. et al . , (1977) J. Pharm . Sci . 66:1-19). Ejemplos de tales sales incluyen sales de adición de ácido y sales de adición de base. Las sales de adición de ácido incluyen aquellas derivadas de ácidos inorgánicos no tóxicos, tales como ácido clorhídrico, nítrico, fosfórico, sulfúrico, bromhídrico, yodhídrico, fosforoso y lo similar, así como ácidos orgánicos no tóxicos tales como ácidos alifáticos mono y dicarboxílicos, ácidos alcanoicos fenil sustituidos, ácidos hidroxi alcanoicos, ácidos aromáticos, ácidos sulfónicos alifáticos y aromáticos y lo similar. Las sales de adición de base incluyen aquellas derivadas de metales de tierra alcalina, tales como sodio, potasio, magnesio, calcio y lo similar, así como aminas orgánicas no tóxicas tales como N .N' -dibenciletilenodiamina, N-metilglucamina, cloroprocaina, colina, dietanolamina, etilenodiamina, procaína y lo similar. Una composición farmacéutica de la invención también puede incluir un antioxidante farmacéuticamente aceptable. Ejemplos de antioxidantes farmacéuticamente aceptables incluyen: (1) antioxidantes solubles en agua tales como ácido ascórbico, cisteína hidrocloruro, sodio bisulfato, sodio metabisulfito, sodio sulfito y lo similar; (2) antioxidantes solubles en aceite, tales como ascorbil palmitato, hidroxianisolo butilado (BHA) , hidroxitolueno butilado (BHT), lecitina, propil galato, alfa-tocoferol, y lo similar; y (3) agentes quelantes de metal, tales como ácido cítrico, ácido etilenodiamina tetraacético (EDTA), sorbitol, ácido tartárico, ácido fosfórico y lo similar. Ejemplos de vehículos acuosos y no acuosos adecuados que pueden emplearse en las composiciones farmacéuticas de la invención incluyen agua, etanol, polioles (tales como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, y lo similar) , y mezclas adecuadas de los mismos, aceites vegetales, tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tales como etil oleato. Puede mantenerse una fluidez apropiada, por ejemplo, mediante el uso de materiales de recubrimiento tales como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersiones y mediante el uso de surfactantes. Estas composiciones también pueden contener adyuvantes tales como preservativos, agentes humectantes, agentes emulsificantes y agentes dispersantes. Puede asegurarse la prevención de la presencia de microorganismos tanto por procedimientos de esterilización, supra, como por la inclusión de diversos agentes antibacteriales y anti hongos, por ejemplo, paraben, clorobutanol, ácido fenol sórbico, y lo similar. También puede ser deseable incluir agentes isotónicos, tales como azúcares, cloruro de sodio y lo similar en las composiciones. Adicionalmente, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable puede lograrse mediante la inclusión de agentes que retardan la absorción tales como monoestearato de aluminio y gelatina. Los vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen soluciones o dispersiones acuosas estériles y polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas se conoce en la técnica. Excepto cuando cualquier medio o agente convencional es incompatible con el compuesto activo, se contempla el uso de los mismos en las composiciones farmacéuticas de la invención. También pueden incorporarse compuestos activos suplementarios en las composiciones. Las composiciones terapéuticas típicamente deben ser estériles y estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración de droga. El vehículo puede ser un solvente o medio de dispersión que contiene, por ejemplo agua, etanol, poliol (por ejemplo, glicerol, propileno glicol, y polietileno glicol líquido, y lo similar), y mezclas adecuadas de los mismos. La fluidez apropiada puede mantenerse, por ejemplo mediante el uso de un recubrimiento tal como lecitina, manteniendo el tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de surfactantes. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro de sodio en la composición. La absorción prolongada de las composiciones puede lograrse mediante la inclusión en la composición de agentes que retardan la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con uno o una combinación de los ingredientes antes enumerados, según se requiera, seguido por microfiltración de esterilización. Generalmente, las dispersiones se preparan incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado por congelamiento (liofilización) que producen un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente adicional deseado de una solución del mismo previamente estéril-filtrada . La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con un material de vehículo para producir una forma de dosis única variará dependiendo del sujeto que se trata y del modo de administración particular. La cantidad de ingrediente activo que puede combinarse con material de vehículo para producir una forma de dosis única será generalmente la cantidad de la composición que produce un efecto terapéutico. Generalmente, del cien por ciento, esta cantidad variará de aproximadamente 0.01 por ciento hasta aproximadamente noventa y nueve por ciento de ingrediente activo, preferentemente de aproximadamente 0.1 por ciento hasta aproximadamente 70 por ciento, más preferentemente de aproximadamente 1 por ciento hasta aproximadamente 30 por ciento de ingrediente activo en combinación con un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los regímenes de dosis se ajustan para proporcionar la respuesta óptima deseada (e.g., una respuesta terapéutica) . Por ejemplo, puede administrarse una única dosis, pueden administrarse varias dosis divididas al paso del tiempo o la dosis puede reducirse o incrementarse proporcionalmente como lo indiquen las exigencias de la situación terapéutica. Esto es especialmente ventajoso para formular composiciones parenterales en forma de dosis unitaria para fácil administración y uniformidad de dosis. La forma de dosis única como se utiliza en la presente, se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos que van a tratarse; cada unidad contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo calculada para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. La especificación para las formas de dosis única de la invención se dicta por, y depende directamente de (a) las características únicas del compuesto activo y el efecto terapéutico particular que va a lograrse, y (b) las limitaciones inherentes en la técnica para componer tal compuesto activo para el tratamiento de sensibilidad en individuos. Para la administración del anticuerpo, la dosis varía de aproximadamente 0.0001 a 100 mg/kg, y más comúnmente de 0.01 a 5 mg/kg, del peso corporal del huésped. Por ejemplo, las dosis pueden ser de 0.3 mg/kg de peso corporal, 1 mg/kg de peso corporal, 3 mg/kg de peso corporal, 5 mg/kg de peso corporal o 10 mg/kg de peso corporal, o dentro de un rango de 1-10 mg/kg. Un régimen ejemplar de tratamiento comprende la administración una vez por semana, una vez cada dos semanas, una vez cada tres semanas, una vez cada cuatro semanas, una vez al mes, una vez cada 3 meses o una vez cada 6 meses. Los regímenes preferidos de dosis para el anticuerpo anti-CD19 de la invención incluyen 1 mg/kg de peso corporal o 3 mg/kg de peso corporal a través de administración intravenosa, siendo dado el anticuerpo utilizando uno de los siguientes programas de dosificación: (i) cada cuatro semanas por seis dosis, después cada tres meses; (ii) cada tres semanas; (iii) 3 mg/kg de peso corporal una vez seguido por 1 mg/kg de peso corporal cada tres semanas . En algunos métodos, se administran simultáneamente dos o más anticuerpos monoclonales con diferentes especificidades de unión, en cuyo caso la dosis de cada anticuerpo administrado recae dentro de los rangos indicados. El anticuerpo se administra comúnmente en múltiples ocasiones. Los intervalos entre dosis únicas pueden ser, por ejemplo, semanalmente, mensualmente, cada tres meses o anualmente. Los intervalos también pueden ser irregulares como lo indiquen los niveles de medición en sangre del anticuerpo para el antígeno objetivo en el paciente. En algunos métodos, la dosis se ajusta para lograr una concentración de anticuerpo en plasma de aproximadamente 1-1000 µg/ml y en algunos métodos de aproximadamente 25-300 µg/ml . Alternativamente, el anticuerpo puede administrarse como una formulación de liberación sostenida, en cuyo caso se requiere una administración menos frecuente. La dosis y frecuencia varían dependiendo de la vida media del anticuerpo en el paciente. En general, los anticuerpos humanos muestran la vida media más larga, seguidos por los anticuerpos humanizados, anticuerpos quiméricos, y anticuerpos no humanos. La dosis y frecuencia de administración pueden variar dependiendo de si el tratamiento es profiláctico o terapéutico. En aplicaciones profilácticas, se administra una dosis relativamente baja a intervalos relativamente infrecuentes durante un largo período de tiempo. Algunos pacientes continúan recibiendo el tratamiento por el resto de sus vidas. En aplicaciones terapéuticas, se requiere una dosis relativamente alta a intervalos relativamente cortos hasta reducir o terminar el progreso de la enfermedad, y preferentemente hasta que el paciente muestra una mejoría parcial o completa de los síntomas de la enfermedad. Enseguida, puede administrarse al paciente un régimen profiláctico . Los niveles de dosis reales de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden variar a fin de obtener una cantidad del ingrediente activo que sea efectiva para lograr la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particular, sin ser tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una variedad de factores farmacocinéticos incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención empleadas, o su éster, sal o amida, la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de excreción del compuesto particular empleado, la duración del tratamiento, otras drogas, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad, sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del paciente que se trata, y factores similares muy conocidos en la técnica médica. Una "dosis terapéuticamente efectiva" de un anticuerpo anti-CD19 de la invención da como resultado preferentemente una disminución en la severidad de los síntomas de la enfermedad, un aumento en la frecuencia y duración de períodos libres de síntomas de enfermedad, o una prevención del daño o discapacidad debida a la aflicción de la enfermedad. Por ejemplo, para el tratamiento de tumores CD19+, una "dosis terapéuticamente efectiva" inhibe el crecimiento celular o el crecimiento del tumor en al menos aproximadamente 20%, más preferentemente, en al menos aproximadamente 40%, incluso más preferentemente en al menos aproximadamente 60%, y aún más preferentemente en al menos aproximadamente 80% en relación a los sujetos no tratados. La capacidad de un compuesto para inhibir el crecimiento del tumor puede evaluarse en un sistema de modelo animal que predice la eficacia en tumores humanos. Alternativamente, esta propiedad de una composición puede evaluarse examinando la capacidad del compuesto para inhibir el crecimiento celular, tal inhibición puede medirse in vi tro mediante análisis conocidos para el técnico experto. Una cantidad terapéuticamente efectiva de un compuesto terapéutico puede disminuir el tamaño del tumor o de otra manera disminuir los síntomas en un sujeto. El de experiencia ordinaria en la técnica será capaz de determinar tales cantidades en base a factores tales como la talla del sujeto, la severidad de los síntomas del sujeto, y la composición particular o vía de administración seleccionada. Una composición de la presente invención puede administrarse a través de una o más vías de administración utilizando uno o más de una diversidad de métodos conocidos en la técnica. Como se apreciará por el técnico experto, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. Las vías de administración preferidas para los anticuerpos de la invención incluyen vías de administración intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, subcutánea, espinal u otras parenterales, por ejemplo mediante inyección o infusión. La frase "administración parenteral" como se utiliza en la presente significa modos de administración diferentes a la administración enteral o tópica, comúnmente por inyección, e incluyen, sin limitación, inyección e infusión intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardiaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoide, intraespinal, epidural e intraesternal . Alternativamente, un anticuerpo de la invención puede administrarse a través de una vía no parenteral, tal como una vía de administración tópica, epidérmica o mucosa, por ejemplo, intranasalmente, oralmente, vaginalmente, rectalmente, sublingualmente o tópicamente. Los compuestos activos pueden prepararse con vehículos que protegerán el compuesto contra una rápida liberación, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos, sistemas de suministro microencapsulados. Pueden utilizarse polímeros biodegradables biocompatibles, tales como etileno vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Muchos métodos para la preparación de tales formulaciones se encuentran patentados o • se conocen generalmente por los expertos en la técnica. Ver, e.g., Sustained and Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R., Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York. 1978. Las composiciones terapéuticas pueden administrarse con dispositivos médicos conocidos en la técnica. Por ejemplo, en una modalidad preferida, una composición terapéutica de la invención puede administrarse con un dispositivo de inyección hipodérmica sin aguja, tal como los dispositivos descritos en las Patentes de E.U. Nos. 5,399,163; 5,383,851; 5,312,335; 5,064,413; 4,941,880; 4,790,824; o 4,596,556. Ejemplos de implantes y módulos muy conocidos útiles en la presente invención incluyen: Patente de E.U. No. 4,487,603 que describe una bomba de micro-infusión implantable para suministrar medicamento a una tasa controlada; Patente de E.U. No. 4,486,194 que describe un dispositivo terapéutico para administrar medicamentos a través de la piel; Patente de E.U. No. 4,447,233 que describe una bomba de infusión de medicamento para suministrar medicamento a una tasa de infusión precisa; Patente de E.U. No. 4,447,224 que describe un aparato de infusión implantable de flujo variable para continuo suministro de droga; Patente de E.U: No. 4,439,196 que describe un sistema de suministro de droga osmótico que tiene compartimentos de cámara múltiple; y la Patente de E.U. No. 4,475,196 que describe un sistema de suministro de droga osmótico. Estas patentes se incorporan en la presente mediante la referencia. Muchos otros implantes tales, sistemas de suministro y módulos son conocidos por los expertos en la técnica. En ciertas modalidades, los anticuerpos monoclonales humanos de la invención pueden formularse para asegurar una apropiada distribución in vivo. Por ejemplo, la barrera de sangre-cerebro (BBB) excluye muchos compuestos altamente hidrófilos. Para asegurar que los compuestos terapéuticos de la invención crucen la BBB (si se desea), pueden formularse, por ejemplo, en liposomas. Para métodos para fabricar liposomas, ver, e.g., Patentes de E.U. No. 4,522,811; 5,374,548 y 5,399,331. Los liposomas pueden comprender uno o más residuos que se transportan selectivamente en células u órganos específicos, aumentando así el suministro de droga dirigido (ver, e.g., V. V. Ranade (1989) J. Clin. Pharmacol. 29:685). Los residuos de dirección ejemplares incluyen folato o biotina (ver, e.g., Patente de E.U. 5,416,016 para Low et al.); mannosidas (Umezawa et al., (1988) Biochem. Biophys. Res. Commun. 153:1038); anticuerpos (P. G. Bloeman et al., (1995) FEBS Lett. 357:140; M. Owais et al., (1995) Antimicrob. Agents Chemother. 39:180); receptor surfactante de proteína A (Briscoe et al., (1995) Am. J. Physiol. 1233:134); pl20 (Schreier et al., (1994) J. Biol. Chem. 269:9090); ver también K. Keinanen; M. L. Laukkanen (1994) FEBS Lett 346:123; J. J. Killion; I. J. Fidler (1994) Immunomethods 4:273. Usos y Métodos Los anticuerpos, particularmente los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención tienen numerosas utilidades diagnósticas y terapéuticas in vi tro e in vivo, que implican el diagnóstico y tratamiento de trastornos mediados por CD19. Por ejemplo, estas moléculas pueden administrarse a células en cultivo, in vivo o ex vivo o a sujetos humanos, e.g., in vivo, para tratar, evitar y diagnosticar una diversidad de trastornos. Como se utiliza en la presente, el término "sujeto" pretende incluir animales humanos y no humanos. Animales no humanos incluyen todo vertebrado, e.g., mamíferos, y no mamíferos, tales como primates no humanos, ovejas, perros, gatos, vacas, caballos, pollos, anfibios, y reptiles. Los sujetos preferidos incluyen pacientes humanos que tienen trastornos mediados por la actividad CD19. Los métodos son particularmente adecuados para tratar pacientes humanos que tienen un trastorno asociado con la expresión aberrante de CD19. Cuando se administran anticuerpos a CD19 conjuntamente con otro agente, los dos pueden administrarse en cualquier orden o simultáneamente. Dada la unión específica de los anticuerpos de la invención para CD19, los anticuerpos de la invención pueden utilizarse para detectar específicamente la expresión de CD19 en la superficie de las células, además, puede utilizarse para purificar CD19 a través de purificación por inmunoafinidad. Además, dada la expresión de CD19 en diversas células tumorales, los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención pueden utilizarse para tratar a un sujeto con un trastorno tumorigénico, e.g., un trastorno caracterizado por la presencia de células tumorales que expresan CD19 incluyendo, por ejemplo, linfoma no de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (ALL) , leucemia linfocítica crónica (CLL) , linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL) , mieloma múltiple, linfomas cutáneos de célula T, linfomas de célula dividida pequeña nodular, linfomas linfocíticos, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas de leucemia de célula T (ATLL) , leucemia de célula T adulta (T-ALL) , cánceres de linfoma folicular entroblástico/centrocítico (cb/cc) , linfomas de célula grande difusa de linaje B, linfoma de célula T similar a linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas en base a cavidad corporal asociados con VIH, Carcinomas Embrionales, carcinomas no diferenciados de rinofaringe (e.g., tumor de Schmincke) , enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, Mieloma Múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom, y otros linfomas de célula B. Adicionalmente, la sobre expresión de CD19 puede llevar a la pérdida de tolerancia de célula B y a la generación de trastornos auto inmunes (Tender et al . (2005) Curr Dir Autoimmun 8:55). Este efecto autoinmune se ha observado mediante la acumulación de células B CD19+ en las articulaciones inflamadas de los pacientes con artritis reumatoide (He et al . (2001) J Rheuma tol 28:2168). De tal forma, los anticuerpos humanos, composiciones de anticuerpo y métodos de la presente invención pueden utilizarse para tratar a un sujeto con un trastorno autoinmune, e . g. , un trastorno caracterizado por la presencia de células B que expresan CD19 incluyendo, por ejemplo, artritis reumatoide. En una modalidad, los anticuerpos (e.g., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la invención, pueden utilizarse para detectar niveles de CD19 o niveles de células que contienen CD19 en su superficie de membrana, cuyos niveles pueden vincularse entonces a ciertos síntomas de la enfermedad. Alternativamente, los anticuerpos pueden utilizarse para inhibir o bloquear la función CD19 que a su vez, pueden vincularse a la prevención o disminución de ciertos síntomas de la enfermedad, implicando así a CD19 como mediador de la enfermedad. Esto puede lograrse poniendo en contacto una muestra y una muestra de control con el anticuerpo anti-CD19 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo y CD19. Cualquier complejo formado entre el anticuerpo y CD19 se detecta y se compara en la muestra y el control. En otra modalidad, los anticuerpos (e.g., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones) de la invención pueden probarse inicialmente por actividad de unión asociada con el uso terapéutico o diagnóstico in vi tro . Por ejemplo, las composiciones de la invención pueden probarse utilizando los análisis citométricos de flujo descritos en los Ejemplos abajo . Los anticuerpos (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, inmunoconjugados y composiciones) de la invención, tienen utilidad adicional en terapia y diagnóstico de enfermedades relacionadas con CD19. Por ejemplo, los anticuerpos monoclonales humanos, las moléculas multiespecíficas o biespecíficas y los inmunoconjugados pueden utilizarse para emitir in vivo o in vi tro una o más de las siguientes actividades biológicas: inhibir el crecimiento y/o destruir una célula que expresa CD19; mediar la fagocitosis o ADCC de una célula que expresa CD19 en presencia de células efector humanas, o bloquear la unión de ligante CD19 a CD19. En una modalidad particular, los anticuerpos (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y composiciones), se utilizan in vivo para tratar, prevenir o diagnosticar una variedad de enfermedades relacionadas con CD19. Ejemplos de enfermedades relacionadas con CD19 incluyen, entre otras, trastornos autoinmunes, artritis reumatoide, cáncer, linfoma no de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL) , mieloma múltiple, linfomas cutáneos de célula T, linfomas de célula dividida pequeña nodular, linfomas linfocíticos, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas de leucemia de célula T (ATLL) , leucemia de célula T adulta (T-ALL) , cánceres de linfoma folicular entroblástico/centrocítico (cb/cc), linfomas de célula grande difusa de linaje B, linfoma de célula T similar a linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas en base a cavidad corporal asociados con VIH, Carcinomas Embrionales, carcinomas no diferenciados de rino-faringe (e.g., tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, Mieloma Múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B. Las vías adecuadas para administrar las composiciones de anticuerpo (e.g., anticuerpos monoclonales humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas, e inmunoconjugados) de la invención, in vivo e in vi tro son muy conocidas en la técnica y pueden seleccionarse por los de experiencia ordinaria. Por ejemplo, las composiciones de anticuerpo pueden administrarse mediante inyección (e.g., intravenosa o subcutánea) . Las dosis adecuadas de las moléculas utilizadas dependerán de la edad y peso del sujeto y de la concentración y/o formulación de la composición de anticuerpo. Como se describió previamente, los anticuerpos anti-CD19 de la invención pueden co-administrarse con uno o más u otros agentes terapéuticos, e.g., un agente citotóxico, un agente radiotóxico, o un agente inmunosupresor. El anticuerpo puede unirse al agente (como un inmunocomplejo) o puede administrarse separado del agente. En el último caso (administración separada), el anticuerpo puede administrarse antes, después o concurrentemente con el agente o puede coadministrarse con otras terapias conocidas, e.g., una terapia anti-cáncer, e.g., radiación. Tales agentes terapéuticos incluyen, entre otros, agentes anti-neoplásicos tales como doxorrubicina (adriamicina) , cisplatin bleomicina sulfato, carmustina, clorambucil, y ciclofosfamida hidroxiurea que por si mismos, son solo efectivos en niveles tóxicos o subtóxicos para un paciente. Cisplatina se administra de manera intravenosa como una dosis de 100 mg una vez cada cuatro semanas y adriamicina se administra de manera intravenosa como una dosis de 60-75 mg/ml una vez cada 21 días. La coadministración de los anticuerpos anti-CD19 humanos, o sus fragmentos de unión a antígeno, de la presente invención con agentes quimioterapéuticos proporcionan dos agentes anti-cáncer que operan a través de diferentes mecanismos que producen un efecto citotóxico en células tumorales humanas. Tal co-administración puede resolver problemas debido al desarrollo de resistencia a drogas o a un cambio en la antigenicidad de las células tumorales que las hace no reactivas con el anticuerpo. Las células efector específicas al objetivo, e.g., células efector unidas a composiciones (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención, también pueden utilizarse como agentes terapéuticos. Las células efector para objetivo pueden ser leucocitos humanos tales como macrófagos, neutrófilos, o monocitos. Otras células incluyen eosinófilos, células destructoras naturales y otras células portadoras de receptor IgG o IgGA. Si se desea, pueden obtenerse células efector del sujeto que va a tratarse. Las células efector específicas al objetivo pueden administrarse como una suspensión de células en una solución fisiológicamente aceptable. El número de células administrado puede encontrarse en el orden de 108-109 pero variará dependiendo del propósito terapéutico. En general, la cantidad será suficiente para obtener la localización en la célula objetivo, e.g., un tumor que expresa CD19, y para efectuar la destrucción de la célula, e.g., por fagocitosis. Las vías de administración también pueden variar. La terapia con células efector específicas al objetivo puede efectuarse en conjunción con otras técnicas para retiro de células objetivo. Por ejemplo, la terapia anti-tumor utilizando las composiciones (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención y/o las células efector armadas con estas composiciones pueden utilizarse en conjunción con quimioterapia. Adicionalmente, puede utilizarse inmunoterapia de combinación para dirigir dos poblaciones de efector citotóxico distintas hacia el rechazo de la célula de tumor. Por ejemplo, los anticuerpos anti-CD19 unidos a anti-Fc-gama Rl o anti-CD3 pueden utilizarse en conjunción con agentes de unión específicos para el receptor IgG o IgA. Las moléculas biespecíficas y multiespecíficas de la invención también pueden utilizarse para modular los niveles de Fcy o Fo?R en células efector, tal como tapando y eliminando los receptores en la superficie celular. También pueden utilizarse receptores anti-Fc para este propósito. Las composiciones (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención que tienen sitios de unión de complemento, tales como porciones de IgGl, 2 o 3 o IgM que se unen al complemento, también pueden utilizarse en presencia del complemento. En una modalidad, el tratamiento ex vivo de una población de células que comprende células objetivo con un agente de unión de la invención y las células efector apropiadas, puede suplementarse mediante la adición de complemento o suero que contiene complemento. La fagocitosis de células objetivo recubiertas con un agente de unión de la invención, puede mejorarse uniendo proteínas de complemento. En otra modalidad, las células objetivo recubiertas con las composiciones (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención, también pueden usarse mediante complemento. Aún en otra modalidad, las composiciones de la invención no activan el complemento. Las composiciones (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas e inmunoconjugados) de la invención, también pueden administrarse conjuntamente con el complemento. En ciertas modalidades, la presente descripción proporciona composiciones que comprenden anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas y suero o complemento. Estas composiciones son ventajosas en que el complemento se ubica en cercana proximidad a los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas. Alternativamente, los anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas de la invención y el complemento o suero pueden administrarse por separado. También dentro del alcance de la presente invención se encuentran equipos que comprenden las composiciones de anticuerpo de la invención (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas o inmunoconjugados) e instrucciones de uso. El equipo puede contener además uno o más reactivos adicionales, tales como un reactivo inmunosupresor, un agente citotóxico o un agente radiotóxico, o uno o más anticuerpos humanos adicionales de la invención (e.g., un anticuerpo humano que tiene una actividad complementaria que se une a un epítope en el antígeno CD19 distinto del primer anticuerpo humano) . En consecuencia, puede administrarse adicionalmente a los pacientes tratados con las composiciones de anticuerpo de la invención (previo a o simultáneo a o después de la administración de un anticuerpo humano de la invención) otro agente terapéutico tal como un agente citotóxico o radiotóxico, que mejora o aumenta el efecto terapéutico de los anticuerpos humanos. En otras modalidades, puede tratarse adicionalmente al sujeto con un agente que modula, e.g., mejora o inhibe, la expresión o actividad de Fcy o de los receptores Fcy, por ejemplo, mediante el tratamiento del sujeto con una citosina. Las citosinas preferidas para administración durante el tratamiento con la molécula multiespecífica incluyen el factor estimulador de colonia de granulocitos (G-CSF) , factor estimulador de colonia de granulocito macrófago (GM-CSF) , interferon-? (IFN-?) y factor de necrosis de tumor (TNF) .
Las composiciones (e.g., anticuerpos humanos, moléculas multiespecíficas y biespecíficas) de la invención también pueden utilizarse para dirigir células que expresan FcyR o CD19, por ejemplo para marcar tales células. Para tal uso, el agente de unión puede unirse a una molécula que puede detectarse. Por consiguiente, la invención proporciona métodos para localizar células ex vivo o in vi tro que expresan receptores Fc, tales como FcyR o CD19. La marca detectable puede ser, e.g., un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima o un co-factor de enzima. En una modalidad particular, la invención proporciona métodos para detectar la presencia de antígeno CD19 en una muestra, o para medir la cantidad de antígeno CD19, que comprenden poner en contacto la muestra, y una muestra de control, con un anticuerpo monoclonal humano, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a CD19 bajo condiciones que permiten la formación de un complejo entre el anticuerpo o la porción del mismo y CD19. La formación de un complejo se detecta entonces, en donde una diferencia de formación de complejo entre la muestra comparada con la muestra de control indica la presencia del antígeno CD19 en la muestra. En otras modalidades, la invención proporciona métodos para tratar un trastorno mediado por CD19 en un sujeto, e.g. trastornos autoinmunes, artritis reumatoide, cáncer, linfoma no de Hodgkin, leucemia linfocítica aguda (ALL), leucemia linfocítica crónica, linfoma de Burkitt, linfomas de célula grande anaplástica (ALCL) , linfomas cutáneos de célula T, linfomas de célula dividida pequeña nodular, linfomas linfocíticos, linfomas de célula T periférica, linfomas de Lennert, linfomas inmunoblásticos, linfomas de leucemia de célula T (ATLL) , leucemia de célula T adulta (T-ALL) , cánceres de linfoma folicular enteroblástico/centrocítico (cb/cc) , linfomas de célula grande difusa de linaje B, linfoma de célula T similar a linfadenopatía angioinmunoblástica (AILD) , linfomas en base a cavidad corporal asociados con VIH, Carcinomas Embrionales, carcinomas no diferenciados rino-faríngeos (e.g., tumor de Schmincke), enfermedad de Castleman, sarcoma de Kaposi, Mieloma Múltiple, macroglobulinemia de Waldenstrom y otros linfomas de célula B, administrando al sujeto los anticuerpos humanos descritos anteriormente. Tales anticuerpos y sus derivados se utilizan para inhibir las actividades inducidas por CD19 asociadas con ciertos trastornos, e.g., proliferación y diferenciación. Poniendo en contacto el anticuerpo con CD19 (e.g., administrando el anticuerpo a un sujeto) , la capacidad de CD19 para inducir tales actividades se inhibe, y por tanto, se trata el trastorno asociado. La composición de anticuerpo puede administrarse sola o conjuntamente con otro agente terapéutico, tal como un agente citotóxico o radiotóxico que actúa en conjunción con o sinergísticamente con la composición de anticuerpo para tratar o prevenir la enfermedad mediada por CD19. Aún en otra modalidad, los inmunoconjugados de la invención pueden utilizarse para dirigir compuestos (e.g., agentes terapéuticos, marcas, citotoxinas, radiotoxinas, inmunosupresores, etc.) a células que tienen receptores de superficie celular CD19 uniendo tales compuestos al anticuerpo. Por ejemplo, un anticuerpo anti CD19 puede conjugarse a cualquiera de los compuestos de toxina descritos en las Patentes de E.U. No. 6,281,354 y 6,548,530, Publicaciones de Patente Nos. 20030050331, 20030064948, 20030073852, y 20040087497, o publicados en WO 30/022806. Por consiguiente, la invención proporciona también métodos para localizar ex vivo o in vivo células que expresan CD19 ( e . g. , con una marca detectable, tal como un radioisótopo, un compuesto fluorescente, una enzima, o un co-factor de enzima) . Alternativamente, los inmunoconjugados pueden utilizarse para destruir células que tienen receptores de superficie celular CD19 dirigiendo citotoxinas o radiotoxinas a CD19. La presente invención se ilustra adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no deben tomarse como limitantes adicionales. El contenido de todas las figuras y todas las referencias, patentes y solicitudes de patente publicadas citadas a lo largo de esta solicitud se incorporan expresamente en la presente mediante la referencia. Ejemplos Ejemplo 1: Generación de Anticuerpos Monoclonales Humanos Contra CD19 Antígeno Se utilizaron las líneas celulares de célula de tumor B Raji (ATCC Acceso #CCL-86) y Daudi (ATCC Acceso #CCL-213) como antígenos para inmunización. KM-MOUSE® Transgénico Transcromosómico Se prepararon anticuerpos monoclonales totalmente humanos para CD19 utilizando la especie KM de ratones transgénicos transcromosómicos, que expresa genes de anticuerpo humano. En esta especie de ratón, el gen endógeno de ratón de cadena ligera kappa se ha fracturado de manera homózigua como se describe en Chen et al . , (1993) EMBO J. 12:811-820 y el gen endógeno de ratón de cadena pesada se ha fracturado de manera homózigua como se describe en el Ejemplo 1 de la Publicación PCT WO 01/09187 para ratones HuMAb. El ratón porta el transgen humano kappa de cadena ligera, KCo5, como se describe en Fishwild et al . , (1996) Nature Biotechnology 14:845-851. El ratón porta también un transcromosoma humano de cadena pesada, SC20, descrito en la Publicación PCT WO 02/43478. Inmunizaciones KM MOUSE®: Para generar los anticuerpos monoclonales totalmente humanos para CD19, se inmunizaron cohortes del KM MOUSE® con líneas celulares de tumor de célula B tanto Raji como Daudi. Se describen esquemas generales de inmunización en Lonberg, N et al . , (1994) Na ture 368 ( 6474 ): 856-859) ; Fishwild D. et al . , (1996) Na ture Biotechnology 14:845-851; y Publicación PCT WO 98/24884. Los ratones tenían 6-16 semanas de edad a la primera infusión de antígeno. Se utilizó una preparación para inmunizar a los ratones (KM MOUSE®) intraperitonealmente (IP). Los ratones transgénicos se inmunizaron dos veces con antígeno en adyuvante completo de Freund o adyuvante Ribi IP, seguido por 3-21 días IP (hasta un total de 11 inmunizaciones) con el antígeno en adyuvante incompleto de Freund o adyuvante Ribi. La respuesta inmune se monitoreó mediante sangrados retroorbitales . El plasma se visualizó mediante ELISA (como se describe abajo), y los ratones con titulaciones suficientes de inmunoglobulina humana anti-CD19 se utilizaron para fusiones. Se reforzó a los ratones de manera intravenosa con antígeno 3 días antes del sacrificio y el retiro del bazo. Selección de un KM-MOUSE® que Produce Anticuerpos Anti-CD19: Para seleccionar un KM-MOUSE® que produce anticuerpos que se unen a CD19, se probó el suero de ratones inmunizados mediante un ELISA modificado como se describió originalmente por Fishwild D. et al . , (1996), supra . Brevemente, se recubrieron placas de microtitulación con proteína de fusión CD19 recombinante purificada a 1-2 µg/ml en PBS, 50 µl/pozo incubadas a 4°C durante la noche bloqueadas después con 200 µl/pozo de BSA al 5% en PBS. Se agregaron diluciones de plasma de ratones inmunizados con CD19 a cada pozo y se incubó durante 1-2 horas a temperatura ambiente. Las placas se lavaron con PBS/Tween y después se incubaron con un anticuerpo policlonal de cadena ligera kappa de cabra-anti-humano conjugado con alcalina fosfatasa durante 1 hora a temperatura ambiente. Después del lavado, las placas se revelaron con substrato pNPP y se analizaron mediante espectrofotómetro a OD 415-650. Los ratones que revelaron las titulaciones más altas de anticuerpos anti-CD19 se utilizaron para fusiones. Las fusiones se efectuaron como se describe abajo y los sobrenadantes de hibridoma se probaron por actividad anti-CD19 mediante ELISA. Generación de Hibridomas que Producen Anticuerpos Monoclonales Humanos para CD19: Los esplenocitos de ratón, aislados de un KM- MOUSE®, se fusionaron con PEG a una línea celular de mieloma de ratón utilizando ya sea PEG en base a protocolos estándar o electrofusión en base a campo eléctrico utilizando un electroporador de fusión de célula de cámara grande Cyto Pulse (CytoPulse Sciences, Inc., Glen Burnie MD) . Los hibridomas resultantes se visualizaron entonces para la producción de anticuerpos específicos al antígeno. Se fusionaron suspensiones celulares únicas de linfocitos esplénicos de ratones inmunizados a un cuarto del número de células de mieloma de ratón de no secreción SP2/0 (ATCC, CRL 1581) con PEG al 50% (Sigma). Las células se colocaron en placas a aproximadamente 1 x 105/pozo en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido por una incubación de aproximadamente dos semanas en medio selectivo conteniendo suero fetal de ternera al 10%, medio acondicionado a 10% P388D1 (ATCC, CRL TIB-63), 3-5% origen (IGEN) en DNEM (Mediatech, CRL 10013, con glucosa alta, L-glutamina y piruvato de sodio) más 5 mM HEPES, 0.055 mM 2-mercaptoetnol, 50 mg/ml de gentamicina y lx HAT (Sigma, CRL P-7185) . Después de 1-2 semanas, las células se cultivaron en un medio en el cual el HAT se reemplaza con HT . Los pozos individuales se visualizaron entonces mediante ELISA (antes descrito) por anticuerpos IgG monoclonales humanos anti-CD19. Una vez que se presentó el crecimiento extenso del hibridoma, el medio se monitoreó comúnmente después de 10-14 días. Los hibridomas que secretan anticuerpo se re-emplacaron, se visualizaron de nuevo, y si son aún positivos para IgG humano, los anticuerpos monoclonales anti-CD19 se subclonaron al menos dos veces limitando la disolución. Los subclones estables se cultivaron entonces in vi tro para general pequeñas cantidades de anticuerpo en medio de cultivo de tejido para su caracterización posterior. Los clones de hibridoma 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se seleccionaron para análisis posterior. Ejemplo 2 : Caracterización Estructural de Anticuerpos Monoclonales Humanos 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7 , 13F1 y 46E8. Las secuencias de ADNc que codifican para las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 21D4 y 2lD4a se obtuvieron del hibridoma 21D4 utilizando técnicas PCR estándar y se secuenciaron utilizando técnicas de secuenciado de ADN estándar. Se nota que el hibridoma 21D4 produce anticuerpos que tiene una cadena pesada que se empareja con una de las dos cadenas ligeras (SEQ ID Nos: 8 y 9) . Ambos anticuerpos (i.e., 21D4 con secuencias VH y VL de las SEQ ID Nos: 1 y 8, respectivamente, y 21D4a con secuencias VH y VL de SEQ ID Nos: 1 y 9, respectivamente) se unen a CD19. Las secuencias 'de ADNc que codifican para las regiones variables de cadena pesada y ligera de los anticuerpos monoclonales 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8 se obtuvieron de los hibridomas 21D4, 21D4a, 47G7, 27F3, 3C10, 5G7, 13F1 y 46E8, respectivamente, utilizando técnicas PCR estándar y se secuenciaron utilizando técnicas de secuenciado ADN estándar.
Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 21D4 se muestran en la Figura ÍA y en la SEQ ID NO: 59 y 1, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 21D4 se muestran en la Figura IB y en la SEQ ID NO: 66 y 8, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 21D4 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 21D4 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 3-10 y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia VH de 21D4 con la secuencia V 5-51 de línea germinal se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia VH de 21D4 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras ÍA y 8 , y en las SEQ ID NOs: 16, 23 y 30, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 21D4 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 21D4 utiliza un segmento V de la línea germinal humana V? L18 y un segmento J? de la línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia VL de 21D4 con la secuencia V? L18 de línea germinal se muestra en la Figura 15. Un análisis adicional de la secuencia V de 21D4 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras IB y 15, y en las SEQ ID NOs: 37, 44 y 51, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 21D4a se muestran en la Figura ÍA y en la SEQ ID NO: 59 y 1, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 21D4a se muestran en la Figura 1C y en la SEQ ID NO: 67 y 9, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 21D4a con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 21D4a utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D línea germinal humana 3-10, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 4b. La alineación de la secuencia VH de 21D4a con la secuencia VH 5-51 de línea germinal se muestra en la Figura 8. Un análisis adicional de la secuencia VH de 21D4a utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras ÍA y 8, y en las SEQ ID NOs: 16, 23 y 30, respectivamente.
La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 21D4a con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 21D4a utiliza un segmento VL de la línea germinal humana V? L18 y un segmento J? de la línea germinal humana JK 3. La alineación de la secuencia VL de 21D4a con la secuencia V? L18 de línea germinal se muestra en la Figura 16. Un análisis adicional de la secuencia VL de 21D4a utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 1C y 16, y en las SEQ ID NOs: 37, 44 y 52, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 47G7 se muestran en la Figura 2A y en la SEQ ID NO: 60 y 2, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 47G7 se muestran en la Figura 2B y en la SEQ ID NO: 68 y 10, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 47G7 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 47G7 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 1-69, un segmento D de la línea germinal humana 6-19, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 5b. La alineación de la secuencia VH de 47G7 con la secuencia VH 1-69 de línea germinal se muestra en la Figura 9. Un análisis adicional de la secuencia VH de 47G7 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 2A y 9, y en las SEQ ID NOs: 17, 24 y 31, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 47G7 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 47G7 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana V? A27 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 3. La alineación de la secuencia VL de 47G7 con la secuencia V? A27 de línea germinal se muestra en la Figura 17. Un análisis adicional de la secuencia VL de 47G7 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 2B y 17, y en las SEQ ID NOs: 38, 45 y 53, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 27F3 se muestran en la Figura 3A y en la SEQ ID NO: 61 y 3, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 27F3 se muestran en la Figura 3B y en la SEQ ID NO: 69 y 11, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 27F3 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 27F3 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 6-19, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b. La alineación de la secuencia VH de 27F3 con la secuencia VH 5-51 de línea germinal se muestra en la Figura 10. Un análisis adicional de la secuencia VH de 27F3 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 3A y 10, y en las SEQ ID NOs: 18, 25 y 32, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 27F3 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 27F3 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana V? L18 y un segmento J? de la línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia VL de 27F3 con la secuencia V? L18 de línea germinal se muestra en la Figura 18. Un análisis adicional de la secuencia VL de 27F3 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 3B y 18, y en las SEQ ID NOs: 39 46 y 54, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 3C10 se muestran en la Figura 4A y en la SEQ ID NO: 32 y 4, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 3C10 se muestran en la Figura 4B y en la SEQ ID NO: 70 y 12, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 3C10 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 3C10 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 1-69, un segmento D de la línea germinal humana 1-26, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b. La alineación de la secuencia VH de 3C10 con la secuencia VH 1-69 de línea germinal se muestra en la Figura 11. Un análisis adicional de la secuencia VH de 3C10 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 4A y 11, y en las SEQ ID NOs: 19, 26 y 33, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 3C10 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 3C10 utiliza un segmento V de la línea germinal humana V? L15 y un segmento JK de la línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia VL de 3C10 con la secuencia V? L15 de línea germinal se muestra en la Figura 18. Un análisis adicional de la secuencia VL de 3C10 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 4B y 19, y en las SEQ ID NOs: 40, 47 y 55 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 5G7 se muestran en la Figura 5A y en la SEQ ID NO: 63 y 5, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 5G7 se muestran en la Figura 5B y en la SEQ ID NO: 71 y 13, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 5G7 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 5G7 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 3-10, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b. La alineación de la secuencia VH de 5G7 con la secuencia VH 5-51 de línea germinal se muestra en la Figura 12. Un análisis adicional de la secuencia VH de 5G7 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 5A y 12, y en las SEQ ID NOs: 20,. 27 y 34, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 5G7 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 5G7 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana V? L18 y un segmento J? de la línea germinal humana JK 1. La alineación de la secuencia VL de 5G7 con la secuencia V? L18 de línea germinal se muestra en la Figura 20. Un análisis adicional de la secuencia V de 5G7 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 5B y 20, y en las SEQ ID NOs: 41, 48 y 56 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 13F1 se muestran en la Figura 6A y en la SEQ ID NO: 64 y 6, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 13F1 se muestran en la Figura 6B y en la SEQ ID NO: 72 y 14, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 13F1 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 13F1 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 6-19, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b. La alineación de la secuencia VH de 13F1 con la secuencia VH 5-51 de línea germinal se muestra en la Figura 13. Un análisis adicional de la secuencia V de 13F1 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 6A y 13, y en las SEQ ID NOs: 21, 28 y 35, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 13F1 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 13F1 utiliza un segmento VL de la línea germinal humana V? L18 y un segmento J? de la línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia VL de 13F1 con la secuencia V? L18 de línea germinal se muestra en la Figura 21. Un análisis adicional de la secuencia VL de 13F1 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 6B y 21, y en las SEQ ID NOs: 42, 49 y 57 respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena pesada de 46E8 se muestran en la Figura 7A y en la SEQ ID NO: 65 y 7, respectivamente. Las secuencias de nucleótidos y de aminoácidos de la región variable de cadena ligera de 46E8 se muestran en la Figura 7B y en la SEQ ID NO: 73 y 15, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena pesada de 46E8 con las secuencias conocidas de cadena pesada de inmunoglobulina de línea germinal humana, demostró que la cadena pesada de 46E8 utiliza un segmento VH de la línea germinal humana VH 5-51, un segmento D de la línea germinal humana 6-19, y un segmento JH de la línea germinal humana JH 6b. La alineación de la secuencia VH de 46E8 con la secuencia VH 5-51 de línea germinal se muestra en la Figura 14. Un análisis adicional de la secuencia VH de 46E8 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena pesada como se muestra en las Figuras 7A y 14, y en las SEQ ID NOs: 22, 29 y 36, respectivamente. La comparación de la secuencia de inmunoglobulina de cadena ligera de 46E8 con las secuencias conocidas de inmunoglobulina cadena ligera de línea germinal humana, demostró que la cadena ligera de 46E8 utiliza un segmento VL de la línea germinal, humana V? L18 y un segmento J? de la línea germinal humana JK 2. La alineación de la secuencia VL de 46E8 con la secuencia V? L18 de línea germinal se muestra en la Figura 22. Un análisis adicional de la secuencia VL de 46E8 utilizando el sistema Kabat de determinación de región CDR condujo a la delineación de las regiones CDRl, CDR2 y CDR3 de cadena ligera como se muestra en las Figuras 7B y 22, y en las SEQ ID NOs: 43, 50 y 58 respectivamente. Ejemplo 3 : Caracterización de Especificidad de Unión y la Cinética de Unión de Anticuerpos Monoclonales Humanos Anti CD19 En este ejemplo, la afinidad de unión de los anticuerpos anti CD19 21D4 y 47G4 se examinó mediante análisis ELISA. Especificidad de unión mediante ELISA Se cubrieron placas de microtitulación con 50 µl de proteína de fusión CD19-Fc purificada de longitud completa a 1.0 µg/ml en PBS, y después se bloquearon con 150 µl de albúmina de suero bovino al 1% en PBS. Se permitió que las placas se incubaran de 30 minutos a 1 hora y se lavaron tres veces. Se agregaron diluciones del anticuerpo 47G4 anti CD19 HuMAb a cada pozo e incubaron durante 1 hora a 37°C. Se utilizó un anticuerpo antiCD19 murino conocido como un control positivo. Se lavaron las placas con PBS/Tween y después se incubaron con un reactivo secundario de Kappa específico de cabra IgG anti humano conjugado con peroxidasa de horseradish durante 1 hora a 37°C. después del lavado, se revelaron las placas con sustrato de ABTS (1.46 mMol/L) , y analizaron en OD de 490nm. Los resultados se ilustran en la Figura 23. El CD19 HuMAb 47G4 se une específicamente al péptido CD19 humano. Mapeo de Epítope de Anticuerpos Anti-CD19 Se utilizó citometría de flujo para determinar la agrupación de epítope de HuMAbs anti-CD19. Se analizó la unión de epítope de los anticuerpos monoclonales humanos anti CD19 21D4, 21D4a, 3C10, 5G7, 5G7-N19K, 5g7-N19Q y 13F1 mediante la incubación de células tumorales B Raji con 0.3 µg/ml tanto de 21D4 biotinilado como del anticuerpo monoclonal humano anti CD19 21D4a, lavado, y seguido de la adición de un anticuerpo monoclonal humano anti CD19 frío. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo como control negativo. Se detectó la unión con un IgG Ab anti humano marcado con FITC. Los análisis de citometría de flujo se llevaron a cabo utilizando un FACScan de citometría de flujo (Becton Dickinson, San José, CA) . Los resultados se muestran en la Figura 24. Durante el análisis de datos, los anticuerpos anti CD19 21D4, 21D4a, 3C10, 5G7 Y 13F1 compiten por la misma región de epítope. Ejemplo 4 : Unión de los anticuerpos CDl9 a lineas celulares de tumor derivadas de célula B Se evaluó la unión de los HuMAbs CD19 mediante citometría de flujo a las líneas de tumor de célula B Raji y Daudi, o a una línea de célula transfectada CHO-CD19. Las células CHO se transfectaron con un plásmido de expresión que contiene el ADNc de longitud completa que codifica la forma transmembrana de CD19. Las líneas de célula Raji, Daudi, y CD19-CHO se incubaron con uno de los siguientes HuMAbs CD19: 21D4, 21D4a, 47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, 3C10 o 13F1. Se utilizó un anticuerpo anti CD19 murino conocido como control positivo. Las células se lavaron y detectaron ya sea mediante ficoeritrina marcada anti humano o anticuerpo secundario anti ratón y se analizaron mediante citometría de flujo. Los resultados para la unión a línea de célula CHO-CD19, línea de célula B Daudi, línea de célula B Raji y una unión expandida ajustada contra la línea de célula B Raji se muestran en las Figuras 25A, 25B, 25C y 25D, respectivamente. Los anticuerpos monoclonales humanos anti CD19 21D4 y 47G4, se unieron a la línea de célula CH0-CD19. Los anticuerpos monoclonales humanos anti CD19, 21D4; 21D4a, 47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, 3C10 y 13F1 se unieron a la línea de célula B Raji. Los anticuerpos monoclonales humanos anti CD19, 21D4, 21D4a, 47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, y 13F1 tuvieron valores EC50 calculados de 0.1413, 0.1293, 0.2399, 0.1878, 0.2240, 0.2167 y 0.2659, respectivamente. Se mostró también que 47G4 se une a la línea de célula de tumor B Daudi. Todos los resultados se muestran como se midieron mediante la intensidad fluorescente de medio geométrico (GMFI) de coloración. Estos datos muestran que la proteína CD19 se expresa en la superficie de líneas de célula de tumor de origen de célula B y que los anticuerpos HuMAb anti CD19 21D4, 21D4a, 47G4, 5G7, 5G7-N19K, 5G7-N19Q, 3C10 y 13F1 se unen a CD19 expresado en la superficie celular. Ejemplo 5: Análisis de Unión Scatchard de los Anticuerpos Humanos Anti CD19 21D4 y 47G4 a Células tumorales B Raji Las células Raji se obtuvieron de ATCC (Acceso #CCL-86) y se cultivaron en RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino (FBS) . Las células se lavaron dos veces con RPMI que contiene 10% FBS a 4°C y las células se ajustaron a 4 x 107 células/ml en un medio RPMI que contiene 10% de suero fetal bovino (el amortiguador de unión que contiene 24 mM Tris pH 7.2, 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 2 mM de glucosa, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl, 0.1% BSA). Se cubrieron placas Millipore (MAFB NOB) con 1% de leche seca sin grasa en agua y almacenadas a 4°C durante la noche. Las placas se lavaron con amortiguador de unión y 25 µl de anticuerpo no marcado (exceso de 1000 veces) en amortiguador de unión se agregaron a pozos de control en una placa de filtro de fibra de vidrio Millipore de 96 pozos (unión NSB no específica) . Se agregaron veinticinco microlitros de amortiguador solo al pozo de control de unión máxima (unión total) . Se agregaron veinticinco microlitros de concentraciones variantes de anticuerpo 125I anti CD19 21D4 o 47G4 y 25 µl de células Raji (4 x 107 células/ml) en el amortiguador de unión. Las placas se incubaron durante 2 horas a 200 RPM en un agitador a 4°C. Al completar la incubación las placas Millipore se lavaron tres veces con 0.2 ml de amortiguador de lavado en frío (24 mM Tris pH 7.2, 500 mM NaCl, 2.7 mN KCl, 2 mM de glucosa, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, 0.1% BSA). Se retiraron los filtros y se contaron en un contador gamma. Se realizó evaluación de equilibrio de unión utilizando parámetros de unión de sitio único con el software Prism (San Diego, CA) . Utilizando el análisis de unión Scatchard anterior, el KD del anticuerpo para las células Raji fue aproximadamente 2.14 nM para 21D4 y 12.02 nM para 47G4. Ejemplo 6: Internalización del Anticuerpo Monoclonal Anti CD19 Se probó la capacidad de HuMAbs anti CD19 para internalizar dentro de células tumorales B Raji que expresan CD19 o células CHO humanas transfectadas con CD19 utilizando un análisis de internalización Hum-Zap. Se probó Hum-Zap para la internalización de un anticuerpo humano primario a través de la unión de un anticuerpo secundario con afinidad para IgG conjugado con la toxina saporin. El CHO-CD19 o línea de célula de tumor B Raji se sembró a 1.0 x 104 células/pozo en pozos de 100 µl ya sea por la noche o al día siguiente por un periodo de dos horas. Se agregó ya sea anticuerpo anti CD19 21D4 o 47G4 a los pozos en la concentración inicial de 30 nM y dosificado en 1:3 diluciones seriales. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo humano que no es específico para CD19 como control negativo. El Hum-Zap (Advanced Targeting Systems, IT-22-25) se agregó a la concentración de 11 nM y se permitió incubar las placas durante 48 horas. Después, las placas se pulsaron con 1.0 µCi de 3H-timidina durante 18-24 horas, se cosecharon y se leyeron en un Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments). Los resultados para la internalización en CHO-CD19 y células tumorales B se muestran en las Figuras 26A y 26B, respectivamente. Se probó únicamente el HuMAb 47G4 en células CHO-CD19. Ambos HuMAbs 21D4 y 47G4 mostraron una disminución dependiente de la concentración de anticuerpo en la incorporación de 3H-timidina en las células tumorales B Raji. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti CD19 21D4 y 47G4 internalizan dentro de las células transfectantes CHO-CD19 que expresan CD19 y las células tumorales B. Ejemplo 7 : Evaluación de Destrucción de Célula de un Anticuerpo Anti CDl9 Conjugado con Toxina En este ejemplo, se probó la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti CD19 conjugados a una toxina para destruir líneas de célula CD19+ en un análisis de incorporación de timidina. Se conjugó un anticuerpo monoclonal anti CD19 con una toxina por medio de un ligante, tal como un ligante peptidilo, hidrazona o disulfuro. La línea de célula Raji que expresa CD19+ se plantó en 2.5 x 104 células/pozos durante 3 horas. Se agregó un anticuerpo anti CD19 conjugado con toxina a los pozos en la concentración inicial de 30 nM dosificado en 1:3 diluciones seriales. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo que no es específico para CD19 como control negativo. Se utilizó anticuerpo en frío con exceso de diez veces, ya sea 21D4a o anticuerpo de control de isotipo para competir por la unión. Se permitió incubar las placas durante 69 horas. Después las placas se pulsaron con 1.0 µCi de 3H-timidina durante 24 horas, se cosecharon y se leyeron en un Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT). Los resultados se muestran en la Figura 27 junto con los valores EC50. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti CD19 21D4 destruye a las células tumorales de célula B Raji. Ejemplo 8: Tratamiento de Tumores de Célula B in vivo Utilizando Anticuerpos Anti CDl9 En este ejemplo, se trataron ratones SCID implantados con tumores de célula B cancerígenos in vivo ya sea con anticuerpos anti CD19 desnudos o anticuerpos anti CD19 conjugados con toxina para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos en el cultivo de tumor. Se prepararon anticuerpos anti CD19 conjugados con toxina como se describió anteriormente. Se utilizaron ratones inmuno deficientes severos combinados (SCID) , que carecen de linfocitos funcionales B y T para estudiar las enfermedades de célula B. Se inyectaron células de la línea de célula de tumor B Ramos de manera intravenosa. Los ratones fueron tratados ya sea con 19.6 mg/kg de anticuerpo anti CD19 conjugado con toxina o 30 mg/kg de anticuerpo anti CD19 desnudo. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo o formulación de amortiguador como control negativo. Se dosificó a los animales mediante inyección intraperitoneal con aproximadamente 200 µl de PBS que contiene anticuerpo o vehículo. El conjugado anticuerpo toxina se inyectó en una única dosis en el día 7, mientras que el anticuerpo desnudo fue inyectado ya sea inyectado como un modelo profiláctico de dosis única en el día 1 o como un modelo de tratamiento en los días 7, 14 y 21. Los ratones fueron monitoreados diariamente para una parálisis de patas traseras durante aproximadamente seis semanas. Utilizando un compás electrónico, se midieron los tumores en tres dimensiones (altura x anchura x longitud) y se calculó el volumen del tumor. Se practicó eutanasia a los ratones cuando hubo parálisis de patas traseras. Como se documentó mediante análisis Kaplan-Meier (Figura 28), se encontró un aumento en el tiempo de supervivencia principal durante el tratamiento con anticuerpos anti CD19 conjugados con toxina, anticuerpos anti CD19 administrados profilácticamente o anticuerpos anti CD19 administrados como régimen de tratamiento. El mayor incremento mostrado en el tiempo de supervivencia principal fue mediante tratamiento profiláctico utilizando el anticuerpo anti CD19 desnudo. El cambio en peso corporal se midió y calculó también como cambio porcentual en peso. Los datos se muestran en la Figura 29. Durante un periodo de 30 días, hubo un aumento neto de cambio de peso corporal con un anticuerpo conjugado con toxina y una disminución neta de cambio de peso corporal con anticuerpo y toxina (no conjugado) . Hubo un aumento neto de cambio en peso corporal ya sea con el anticuerpo anti CD19 desnudo profiláctico o el régimen de tratamiento de anticuerpo anti CD19. Ejemplo 9: Tratamiento de un Modelo de Xenoinjerto de Tumor in vivo Utilizando Anticuerpos Anti CDl9 Desnudos Se trataron ratones in vivo implantados con un tumor de linfoma con anticuerpos anti CD19 desnudos para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos en el cultivo de tumor. Se expandieron células ARH-77 (leucemia de linfoblasto B humano; ATCC Acceso No. CRL-1621) y Raji (linfoma de Burkitt linfocito B humano; ATCC Acceso No. CCL-86) in vi tro utilizando procedimientos de laboratorio estándar. Ratones macho CB17.SCID (Taconic, Hudson, NY) de entre 6-8 semanas de edad fueron implantados de manera subcutánea en el flanco derecho con 5 x 105 ARH-77 o células Raji en 0.2 ml de PBS/Matrigel (1:1) por ratón. Los tumores de los ratones se pesaron y midieron de forma tridimensional utilizando un compás electrónico dos veces por semana después de la implantación. Los volúmenes de tumor se calcularon como altura x anchura x longitud/2. Los ratones con tumores ARH-77 promediando 80 mm3 o tumores Raji promediando 170 mm3 se ordenaron en grupos de tratamiento al azar. Se impartieron dosis a los ratones de forma intraperitoneal con vehículo PBS, anticuerpo de control de isotipo o HuMAb 2H5 anti CD19 desnudo en el día 0. Se aplicó eutanasia a los ratones cuando los tumores alcanzaron el punto final de tumor (2000 mm3) . Los resultados se muestran en la Figura 30A (tumores ARH-77) y 30B (tumores Raji). El anticuerpo 21D4 anti CD19 desnudo extendió el tiempo principal para alcanzar el volumen de punto final de tumor (2000 mm3) y retardó la progresión de crecimiento del tumor. Por tanto, el tratamiento con solo anticuerpo anti CD19 tiene un efecto inhibitorio directo in vivo en el crecimiento del tumor. Ejemplo 10: Producción de HuMAbs no fucosilados Los anticuerpos con cantidades reducidas de residuos de fucosilo han demostrado aumentar la capacidad ADCC del anticuerpo. En este ejemplo, el HuMAb 21D4 anti CD19 se ha producido carente de residuos de fucosilo. La línea de célula CHO Ms704-PF, que carece del gen fucosiltransferasa, FUT 8 (Biowa, Inc., Princeton, NJ) se electroporó con un vector que expresa las cadenas pesada y ligera del anticuerpo 21D4. Se seleccionaron clones resistentes a droga mediante cultivo en medio Ex-célula 325-PF CHO (JRH Biosciences, Lenexa, KS) con 6 mM L-glutamina y 500 µg/ml G418 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Los clones se visualizaron para expresión igG mediante análisis ELISA estándar . Cara cterización Oligosacárido de Mabs median te CE-LIF El análisis comparativo de oligosacáridos N-enlazados derivados de anticuerpos anti CD19 de una línea de célula fucosilante CHO y las muestras de anticuerpo monoclonal anti CD19 derivado de Ms704-PF, se llevo a cabo mediante electroforesis capilar de fluorescencia láser inducida (cLIF) (Chen y Evangelista (1998) Electroforesis 15:1892). Los oligosacáridos N-enlazados del anticuerpo purificado se liberaron de las muestras IgG (100 µg) mediante la incubación de las muestras durante la noche con 12.5 mU PNGasaF (prozima) a 40°C. Bajo las condiciones utilizadas, se liberaron los glicanos N-enlazados de la porción Fc del HuMAb 21D4 expresado en células CHO fucosiladas y no fucosiladas. Después de la precipitación de etanol para retirar la proteína Mab, el sobrenadante que contiene a los glicanos se secó mediante centrifugación de vacío y se resuspendió en 19 mM 8-aminopireno-l, 3, 6-trisulfonato (APTS) (Beckman) ba o condiciones de aminación reductiva suaves en las cuales se minimizó la desialilación y pérdida de residuos de fucosa (15% de ácido acético y 1 M de cianobrohidruro de sodio en THF (Sigma) ) . Se dejó continuar la reacción de marcado de glicano durante la noche a 40°C seguida de dilución de la muestra en agua 25 veces. Se aplicaron glicanos marcados como APTS a la electroforesis capilar con fluorescencia inducida por láser en un sistema P/ACE MDQ CE (Beckman) con polaridad inversa, utilizando un capilar recubierto N-CHO de diámetro interno (Beckman) con 50 cm de longitud efectiva. Las muestras se presurizaron (8 segundos) se inyectaron y la separación de efectuó a 20°C utilizando un Amortiguador de Gel de Separación de Carbohidrato (Beckman) a 25 kV durante 20 min. Las separaciones se monitorearon utilizando un sistema de detección de fluorescencia inducida por láser (Beckman) con un 3 mW láser de ion argón y longitud de onda de excitación de 488 nm y emisión de 520nm. (Ma y Nashabeh (1999) Anal. Chem. 71:5185). Se observaron diferencias en el perfil del oligosacárido entre el anticuerpo obtenido de una línea de célula fucosilante en comparación con la línea de célula Ms704-PF, consistente con una ausencia de residuos fucosa en los anticuerpos anti CD19 derivados de Ms704-PF. Análisis de monosa cárido mediante HPLC con HPAE-PAD Las muestras de IgG (200 ug) se sometieron a hidrólisis de ácido utilizando ya sea 2 N TFA (para estimar los azúcares neutrales) o 6 N HCl (para estimar amino azúcares) a 100°C durante 4 horas. Las muestras se secaron mediante centrifugación de vacío a temperatura ambiente y se reconstituyeron en 200 µl de agua antes del análisis mediante HPAE-PAD (Dionex). Los monosacáridos se separaron utilizando una columna CarboPac PA10 4 x 250 mm con pre-columna Amino Trap y Borate Tra (Dionex) . Los procedimientos se siguieron de acuerdo con la Nota Técnica 53 de Dionex. El pico de identidad de monosacárido y la abundancia relativa se determinaron utilizando estándares de monosacárido (Dionex). El anticuerpo anti CD19 no fucosilado se probó también utilizando un análisis de equipo de enfoque isoeléctrico capilar estándar (Beckamn Coulter) . El análisis regresó los valores pl observados de pH 8.45 para 21D4 fucosilado, 8.44 y 8.21 para 21D4a fucosilado y 8.52 y 8.30 para los anticuerpos 21D4 no fucosilados. Ejemplo 11 : Evaluación de la Actividad ADCC del Anticuerpo Anti CDl9 En este ejemplo, se probó la capacidad de los anticuerpos monoclonales anti CD19 fucosilados y no fucosilados para destruir células CD19+ en presencia de células efector por medio de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo (ADCC) en un análisis de citotoxicidad de fluorescencia. El anticuerpo monoclonal anti CD19 humano 21D4 no fucosilado se preparó como se describió anteriormente. Las células efector humanas se prepararon a partir de sangre completa de la siguiente forma. Las células mononucleares de sangre periférica humana se purificaron a partir de sangre completa heparinizada mediante separación Ficoll-paque estándar. Las células se resuspendieron en un medio RPMI1640 que contiene 10% de FBS (medio de cultivo) y 200 U/ml de IL-2 humano y se incubaron durante la noche a 37°C. Al día siguiente, las células se recolectaron y se lavaron una vez en un medio de cultivo y se resuspendieron a 2 x 107 células/ml. Las células CD19+ objetivo se incubaron con reactivo BATDA (Perkin Elmer, Wellesley, MA) a 2.5 µl BATDA por 1 x 106 células objetivo/mL en un medio de cultivo suplementado con 2.5 mM de probenecid (medio de análisis) durante 20 minutos a 37°C. Las células objetivo se lavaron cuatro veces en PBS con 20 mM HEPES y 2.5 mM probenecid, se giraron y se llevaron a un volumen final de 1 x 105 células /ml en medio de análisis. La línea de célula CD19+ ARH-77 (leucemia de linfoblasto B humano; ATCC Acceso No. CRL-1621) se probó para ADCC específica de anticuerpo al anticuerpo monoclonal anti CD19 humano 21D4 fucosilado y no fucosilado utilizando el análisis de emisión de fluorescencia Delfia de la siguiente manera. La línea de célula objetivo ARH77 (100 µl de células objetivo marcadas) se incubó con 50 µl de células efector y 50 µl de anticuerpo ya sea 21D4 o 21D4 no fucosilado. Se utilizó una relación de objetivo a efector de 1:50 a lo largo de los experimentos. Se utilizó un control de isotipo IgGl humano como control negativo. Después de un giro de pulso de 2100 rpm y 1 hora de incubación a 37°C, los sobrenadantes se recolectaron, se giraron rápidamente de nuevo, y se transfirieron 20 µl del sobrenadante a una placa de fondo plano, a la que se agregó 180 µl de solución Eu (Perlin Elmer, Wellesley, MA) y se leyó en un lector de placas de Fusión Alfa TRF (Perkin Elmer) . El % de lisis se calculó de la siguiente forma: (liberación de muestra- liberación espontánea * 100) / (liberación máxima-liberación espontánea), en donde la liberación espontánea es la fluorescencia de los pozos que únicamente contenían células objetivo y liberación máxima es la fluorescencia de los pozos que contienen células objetivo y que se han tratado con 3% de Lisol. El % de lisis específico de citotoxicidad de célula para la línea de célula ARH-77 se muestra en la Figura 31. La línea de célula ARH-77 que expresa CD19+ mostró citotoxicidad mediada por el anticuerpo con el anticuerpo anti CD19 HuMAb 21D4 y un aumento en el porcentaje de lisis específica asociado con la forma no fucosilada del anticuerpo anti CD19 21D4. Estos datos demuestran que los anticuerpos anti CD19 HuMAb no fucosilados muestran un aumento en la citotoxicidad específica a las células que expresan CD19+. Ejemplo 12: Termoestabilidad de los Anticuerpos Monoclonales Anti CD19 mediante Calorimetria de Exploración Diferencial La estabilidad térmica de los anticuerpos monoclonales anti CD19 se comparó utilizando análisis de calorimetría de sus temperaturas de fusión. Las mediciones calorimétricas de temperaturas de fusión™ se llevaron a cabo en una plataforma de microcalorímetro de exploración diferencial DSC de VP Capilar que se combina con una auto muestra (Micro Cal LLC, Northampton, MA, EUA). El volumen de célula muestra es 0.144 mL . Los datos de desnaturación en las formas glicosilada y desglicosilada de los anticuerpos se obtuvo calentando las muestras, en una concentración de 2.3 µM, desde 30 hasta 95°C en una tasa de l°C/min. Las muestras de proteína se presentaron en salina amortiguada con fosfato (PBS) a un pH de 7. . El mismo amortiguador se utilizó en la célula de referencia para obtener la capacidad de calentamiento molar mediante comparación. Los termogramas observados se corrigieron en la línea base y se analizaron los datos de normalización en base a un modelo de 2 estados, utilizando el software Origin v7.0. Los datos se muestran en la tabla 2. Tabla 2. Medición de estabilidad térmica de anticuerpos anti-CDl9 Ejemplo 13: Evaluación de Sitios de Glicosilación Se encontró que el anticuerpo HuMAb anti-CD19 5G7 tiene un motivo de glicosilación N-X-S/T en la región variable mediante análisis de secuencia. La presencia de un sitio de secuencia N-enlazado (N-X-S/T) es necesario pero no suficiente para la adición del carbohidrato a Mab. Es decir, es posible tener una secuencia N-X-S/T que no agrega realmente un carbohidrato debido al doblamiento de proteína y a la accesibilidad del solvente. La confirmación de un sitio de glicosilación en la región variable de 5G7 se examinó mediante análisis tanto LC-MS como Western. La espectrometría de masa de cromatografía líquida (LC-MS) es una herramienta estándar para determinar la masa de una proteína, tal como un anticuerpo. Previo al análisis, los oligosacáridos N-enlazados de los HuMAbs anti-CD19 5G7 y 13F1 se liberaron de muestras de IgG (100 µg) mediante la incubación de las muestras durante la noche con 12.5 mU de PNGasaF (Prozyme) a 40°C. Bajo las condiciones utilizadas, los glicanos N-enlazados de la porción Fc de los HuMAbs se liberó. Para el clon 5G7, observamos dos masas en alta abundancia; una (49,855 Da) correspondió a la masa predicha después de la digestión de PNGasaF para remover azúcares en la región constante en el sitio N-enlazado conservado (N297), y una segunda masa (52,093 Da) consistente con la adición de un carbohidrato en el 2° sitio. Descubrimos que los glicanos de la región Fab no se remueven mediante digestión de PNGasaF; en consecuencia, estos datos soportan la presencia de carbohidratos en la región variable del clon 5G7. Para el clon 13F1, la masa observada correspondió a la masa predicha de la secuencia de proteínas sin carbohidratos anexos. Para confirmar el resultado anterior, completamos el análisis de manchado Western en fragmentos Fab de los clones 5G7 y 13F1, con un método de coloración específica del carbohidrato. Los fragmentos Fab y Fc se produjeron agregando 1.25 µg de papaína activada para 25 µg de muestras de IgG conteniendo 1 mM de cisteína. Las muestras se incubaron a 40°C durante 4 horas y las reacciones se detuvieron con 30 mM de yodoacetamida. Las muestras se analizaron mediante 4-20% Tris-Glicina SDS-PAGE seguido por electro-manchado sobre membrana de PVDF. La coloración específica de carbohidratos del manchado se llevó a cabo utilizando el equipo Gel Coded Glycoprotein Staining Kit (Pierce) siguiendo el protocolo sugerido por el fabricante, los resultados detectaron la glicosilación en el anticuerpo 5G7, pero no en el anticuerpo 13F1. Estos resultados mostraron que el anticuerpo 5G7 es glicosilado en la región Fab. Como se trató anteriormente, el anticuerpo monoclonal anti-CDl9 5G7 contiene una región variable que tiene un sitio de glicosilación. Dado que los sitios de glicosilación en la región variable pueden conducir a un incremento en la inmunogenicidad del anticuerpo o valores pK alterados debido a la unión de antígeno alterada, puede ser ventajoso mutar la secuencia del motivo de glicosilación N-X-S/T de región variable para reducir la glicosilación. Utilizando técnicas estándar de biología molecular, la secuencia de anticuerpo 5G7 se modificó para cambiar la secuencia N-I-S comenzando en la posición 19 ya sea a K-I-S (5G7-N19K) o Q-I-S (5G7-N19Q) . Ejemplo 14: Estabilidad de Anticuerpos Monoclonales Anti-CD19 mediante Espectroscopia de Fluorescencia Se comparó la estabilidad de los anticuerpos monoclonales anti-CD19 midiendo el punto medio de desnaturalización química mediante espectroscopia de fluorescencia. Las mediciones de fluorescencia de desnaturalización química se llevaron a cabo en un lector de placa Micromax (SPEX, Edison, NJ) . Las mediciones se llevaron a cabo en muestras de anticuerpo que se habían dejado durante 24 horas para equilibrarse en 16 diferentes concentraciones de hidrocloruro de guanidio en amortiguador PBS. Las mediciones se efectuaron en placas negras, de bajo volumen, de superficie de no unión de 384 pozos (Corning, Acton, MA) y requirieron 2 µM de anticuerpo en un volumen de pozo de 12 µl. La fluorescencia se excitó a 280 nm y el espectro de emisión se midió entre 300 y 400 nm. La velocidad de exploración fue de 1 segundo por nm y las grietas se ajustaron a 5 nm de paso de banda. Se llevó a cabo un blanco en amortiguador utilizando PBS y se sustrajo automáticamente de los datos. Los datos se muestran en la Tabla 3. Tabla 3. Estabilidad de fluorescencia de anticuerpos anti-CD19 Ejemplo 15: Tratamiento de Tumores Raji de célula B in vivo Utilizando Anticuerpos Anti-CD19 En este ejemplo, ratones SCID implantados con tumores cancerosos de célula B se tratan in vivo ya sea con anticuerpos anti-CD19 desnudos o con anticuerpos anti-CD19 conjugados a toxinas para examinar el efecto in vivo de los anticuerpos en el crecimiento del tumor. Los anticuerpos anti-CD19 conjugados a toxinas se prepararon como se describió anteriormente. se utilizaron ratones severos inmuno deficientes combinados (SCID) , que carecen de linfocitos funcionales B y T para estudiar malignidades de célula B. las células de la línea celular de tumor B Raji se inyectaron de manera subcutánea. Los ratones se trataron con 30 mg/kg de anticuerpo o 0.3 µmol/kg (toxina) de conjugado de anticuerpo-toxina. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo o amortiguador de formulación como control negativo. Se dosificó a los animales mediante inyección intraperitoneal con aproximadamente 200 µl de PBS conteniendo anticuerpo o vehículo. El anticuerpo se inyectó ya sea como una dosis única (SD) en el día 0 o como una dosis repetida (RD) en los días 0, 7 y 14. Se monitoreó a los ratones diariamente por crecimiento del tumor utilizando un calibre electrónico; los tumores se midieron de manera tridimensional (altura x ancho x longitud/2) y se calculó el volumen del tumor. Se eutanizó a los ratones cuando los tumores alcanzaron el punto final del tumor (2000 mm3) o mostraron más de 20% de pérdida de peso. Los resultados se muestran en la Figura 32. En cada caso, el anticuerpo anti-CD19 exhibe volúmenes de tumor más pequeños en comparación con los controles negativos, mostrando los anticuerpos conjugados a toxinas menores volúmenes de tumor que en el tratamiento con anticuerpo desnudo. El cambio en el peso corporal también se midió y se calculó como cambio porcentual en peso. Los resultados se muestran en la Figura 33. Los resultados mostraron un cambio neto disminuido en el peso corporal con los anticuerpos conjugados a toxinas y un cambio neto incrementado en el peso ya sea con vehículo o anticuerpos desnudos. Ejemplo 16. Estudios de célula B en Monos Cynomolgus En este ejemplo se inyectaron monos cynomolgus de manera intravenosa ya sea con anticuerpo anti-CD19 original o anticuerpos anti-CD19 no fucosilados (nf) . Los cálculos de leucocito absolutos y los sub-conjuntos de leucocitos se determinaron después de la dosis y se compararon con valores pre-dosis . Muestras de sangre tomadas de los monos cynomolgus se colorearon ya sea con anticuerpo CD19 original o anticuerpo anti-CD19 nf y se analizaron mediante FACS utilizando métodos estándar. Las células B de todos los monos incluidos en el estudio se colorearon positivo con anticuerpos anti-CD19 tanto de origen como nf. Se incluyeron en cada grupo dos monos macho y dos hembras. Se tomaron muestras de sangre en el día 7 y pre-dosis. Se llevó a cabo una inyección intravenosa en bolo lento en una vena safenosa y se dosificó a los animales con 1 mg/kg de anticuerpo anti-CD19 original o nf. Se tomaron muestras de sangre 24 horas, 48 horas, 72 horas y 7, 14, 21 y 28 días posterior a la dosis. Se tomaron muestras de sangre para la determinación de pK, hematología y para citometría de flujo. En cada punto de tiempo, se monitorearon los siguientes antígenos de superficie celular de la sangre: CD2+/CD20+ (todos linfocitos), CD20+ (linfocitos B) , CD3+ (linfocitos T) , CD3+/CD4+ (linfocitos T auxiliares), CD3+/CD8+ (linfocitos T citotóxicos), CD3-/CD16+ (células NK) , CD3-/CD14+ (monocitos) . La Figura 34 muestra el cambio en el número de células CD20 positivas al compararse con los valores promedio en el día 7 y pre-dosis. Aunque el anticuerpo anti-CD19 original indujo una disminución del 55% en el número de células B CD20 positivas después de 24 horas, el anticuerpo nó fucosilado produjo una más profunda inhibición en la caída de los cálculos de célula B por aproximadamente 90% . En el grupo de anti-CD19 nf, los cálculos de célula B permanecieron en este nivel en los días 2, 3 y 7 posteriores al tratamiento, mientras que el anticuerpo original parece comenzar un regreso a la línea de base. La Figura 35 muestra el % de cambio desde la línea de base para células CD20 positivas para cada uno de los monos individuales. Los cuatro monos tratados con anticuerpo anti-CDl9 nf mostraron una caída más significativa en el % de células CD20 positivas al compararse con el anticuerpo anti-CD19 original.
Conjuntamente estos datos implican que el anticuerpo anti-CD19 es más eficaz en el agotamiento de las células B circulantes en comparación con el anticuerpo original. Ejemplo 17: Estudios de Inmunohistoquimica de Anticuerpos Anti-CD19 Para evaluar los perfiles de unión de tejido de anti-CD19 HuMAb, se examinaron 21D4 conjugado a FITC (21D4-FITC, F:P = 4) y 21D4 no fucosilado (nf21D4) (nf21D4-FITC, F:P = 3) en un panel de tejidos humanos normales (no neoplásicos), incluyendo de bazo, amígdala, intestino delgado, cerebelo, cerebro, corazón, hígado, pulmón, y riñon (1-2 muestras/cada uno), así como neoplasmas de célula B, incluyendo leucemia linfocítica crónica, linfoma folicular, linfoma de zona marginal, linfoma de célula de corteza cerebral, y linfoma de célula B grande difusa (1-2 muestras/cada uno). Se prepararon anticuerpos 21D4 no fucosilados como se describió anteriormente. se utilizó Hu-IgGi conjugado a FITC (Hu-IgGi-FITC) como anticuerpo de control de isotipo. Se adquirieron tejidos normales y de linfoma congelados y embebidos en OCT de Cooperative Human Tissue Network (Philadelphia, PA) o National Disease Research Institute (Philadelphia, PA) . Se fijaron secciones cryostat a 5 µm con acetona durante 10 minutos a temperatura ambiente y se almacenaron a -80°C hasta su uso. Se llevó a cabo una inmuno coloración indirecta de peroxidasa utilizando En Vision + System (Dako, Carpintería, CA) siguiendo nuestro protocolo de rutina. Brevemente, se lavaron los portaobjetos con PBS (Sigma, St. Louis, MO) dos veces, y después se incubaron con bloque de peroxidasa suministrado en Dako En Vision + System durante 10 minutos. Después de dos lavados con PBS los portaobjetos se incubaron con bloque de proteína Dako suplementado con 1% de gamma globulinas humanas y 1 mg/ml de IgG humana agregada con calor durante 20 minutos para bloquear los sitios de unión no específicos, subsecuentemente, se aplicaron anticuerpos primarios (21D4-FITC y nf21D4-FITC a 0.4 o 2 µg/ml) o control de isotipo (Hu-IgGl-FITC a 0.4 o 2 µg/ml), sobre las secciones y se incubaron durante 1 hora. Después de tres lavados con PBS, los portaobjetos se incubaron con anticuerpo anti-FITC de ratón (20 µg/ml) durante 30 minutos. Después de otros tres lavados con PBS, los portaobjetos se incubaron con el polímero IgG anti-ratón conjugado a peroxidasa suministrado en el Dako En Vision + System durante 30 minutos. Finalmente, los portaobjetos se lavaron como anteriormente y se hicieron reaccionar con solución DAB de sustrato-cromógeno suministrada en el Dako En Vision + System durante 6 minutos. Los portaobjetos se lavaron entonces con agua desionizada, se contra colorearon con hematoxilina de Mayer (Dako), se deshidrataron, se aclararon y se cubrieron con Permount (Fischer Scientific, Fair Lawn, NJ) siguiendo el procedimiento histológico de rutina. Se observó coloración específica tanto con 21D4-FITC como con nf21D4-FITC en tejidos linfoides o ricos en linfoide (bazo, amígdala e intestino delgado) y tejidos de linfoma. En bazo y amígdala, una fuerte coloración específica se distribuyó principalmente en las regiones de célula B, i.e., nodulos linfáticos del bazo, zona de corteza cerebral y centro germinal de la amígdala. En el intestino delgado, una fuerte inmunoreactividad específica se localizó principalmente en el parche de Peyer o agregados linfoide, así como una coloración de débil a fuerte en linfocitos difusos en lamina propria de la mucosa. También se desplegó una fuerte coloración en células tumorales de linfoma folicular y linfoma de zona marginal, así como una coloración de moderada a fuerte en leucemia linfocítica crónica, linfoma de célula B grande difusa y linfoma de célula de corteza cerebral . En tejidos normales de cerebelo, cerebro, corazón, hígado, pulmón y riñon, no se observó una coloración significativa al colorearse ya sea con 21D4-FITC o nf21D4-FITC excepto alguna coloración en células linfoide focales o agregados en tejidos de pulmón y riñon. Adicionalmente, estos tejidos se colorearon a concentraciones más altas de hasta 10 µg/ml. De manera similar, no se observó una coloración específica en comparación con el anticuerpo de control de isotipo. Las comparaciones de 21D4-FITC y nf21D4-FITC desplegaron patrones de coloración similares en todos los tejidos. La coloración específica se saturó o se acercó a la saturación a 0.4 µg/ml. Sin embargo, la intensidad de coloración mediante 21D4-FITC es de aproximadamente 0.5-1 grado más fuerte que mediante nf21D4-FITC. Esto puede deberse parcialmente a la mayor relación de F:P de 21D4-FITC (4 vs. 3) . Ejemplo 18: Evaluación de Inactivación Celular de un Anticuerpo Anti-CDl9 En este ejemplo, los anticuerpos monoclonales anti-CD19 solos o conjugados a una toxina, se probaron por la capacidad de desactivar líneas celulares CD19+ en un análisis de incorporación de timidina. Se conjugó un anticuerpo monoclonal anti-CD19 a una toxina mediante un enlace, tal como un enlace peptidilo, hidrazona o disulfuro. Las líneas celulares Raji o SU-DHL-6 que expresan CD19+ se sembraron a 1 x 104 células/pozo. Se agregó ya sea anticuerpo . anti-CD19 solo o conjugado de anticuerpo anti-CDl9-toxina a los pozos a una concentración inicial de 30 nM y se titularon a diluciones seriales de 1:3 para 8 diluciones. Se utilizó un anticuerpo de control de isotipo que es no específico para CD19 como control negativo.
Las placas se dejaron incubar durante 69 horas. Las placas se impulsaron entonces con 0.5 µCi de 3H-timidina durante 24 horas, se cosecharon y se leyeron en un Top Count Scintillation Counter (Packard Instruments, Meriden, CT) . Los resultados se muestran en la Figura 36 conjuntamente con los valores EC50. La Figura 36A muestra el anticuerpo desnudo en células Raji. La Figura 36B muestra el anticuerpo desnudo en células SU-DHL. La Figura 36C muestra el anticuerpo anti-CD19 conjugado a toxinas en células SU-DHL-6. Estos datos demuestran que el anticuerpo anti-CD19 21D4 se une a e inactiva las células tumorales de célula B Raji y tiene un inesperado alto nivel de desactivación celular en células SU-DHL-6. Ejemplo 19: Estudios de Agotamiento de Célula B Para determinar si los anticuerpos anti-CD19 fueron capaces de agotar las células B, se estableció un análisis de agotamiento de célula B en sangre completa. Se adquirió sangre completa humana de AllCells Inc. (Berkeley, CA) y se entregó el mismo día a temperatura ambiente. Dos ml de sangre completa se incubaron en ausencia o presencia de 1-30 mg/ml de los anticuerpos indicados, o PBS como grupo no tratado. La mezcla de sangre-anticuerpo se incubó a 37°C con 5% de C02. En el día del experimento, la sangre se liso dos veces con amortiguador de lisis RBC a una relación de 1:10 incubando durante 10 minutos seguido por centrifugación. Después del segundo giro, las pildoras celulares se lavaron una vez con amortiguador FACS (PBS más calcio y magnesio con 2% de FBS y 20% de verseno) , y seguido por coloración FACS con anticuerpo anti-CD3 (Becton Dickinson catálogo # 555332) como marcadores de célula T y anticuerpo anti-CD22 (Becton Dickinson catálogo # 340708) como marcadores de célula B utilizando protocolos estándar de citometría de flujo. Las células se incubaron en hielo durante 20 minutos previo a los lavados finales y se resuspendieron en 5 mg/ml de solución de yoduro de propidio (Sigma cat # P4864) en amortiguador FACS. Los datos se recolectaron mediante citometría de flujo utilizando un sistema FASCalibur y software CellQuest por Becton Dickinson, y se analizaron mediante software FlowJo utilizando entrada de tamaño de linfocitos. Se calculó el cambio porcentual determinando el % de células B positivas en el grupo no tratado menos el % de células B positivas en el grupo tratado con anticuerpo dividido por el % de células B positivas en el grupo no tratado 100 veces. Los resultados se muestran en la Tabla 4. De un donante de sangre sano, el 8.7% de las células B permanecieron en la sangre después de una incubación durante la noche (sin anticuerpo). La incubación de sangre completa con 30 mg/ml de Rituxan de control positivo, condujo a un agotamiento de 46% en el número de células B al compararse con el grupo no tratado, sin anticuerpo. El grupo tratado con anticuerpo anti-CD19 no fucosilado (nf) tuvo un pronunciado efecto en el agotamiento de célula B, inhibiendo las células B por -40%. El anticuerpo original tuvo un modesto efecto en los cálculos de célula B. Tabla 4. Agotamiento de Célula B de sangre completa SUMARIO DE LISTA DE SECUENCIAS

Claims (63)

  1. REIVINDICACIONES 1. Un anticuerpo monoclonal aislado o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo : (a) se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10"7 M o menor; y (b) se une a células tumorales de células B Raji y Daudi .
  2. 2. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo humano.
  3. 3. El anticuerpo de la reivindicación 1, que es un anticuerpo quimérico o humanizado.
  4. 4. El anticuerpo de la reivindicación 2, que es un anticuerpo de longitud total de un isotipo IgGl o IgG4.
  5. 5. El anticuerpo de la reivindicación 2, que es un fragmento de anticuerpo o un anticuerpo monocatenario.
  6. 6. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde el anticuerpo es no fucosilado;
  7. 7. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 5 x 10"8 M o menor .
  8. 8. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo se une a CD19 humano con un KD de 5 x 10~9 M o menor.
  9. 9. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde dicho anticuerpo tiene una temperatura de termoestabilidad mayor que 65°C.
  10. 10. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde el CD19 humano comprende un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos como se establece en la SEQ ID NO: 79 [Genbank Acc. No. NM_001770] .
  11. 11. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, en donde el anticuerpo compite de* manera cruzada por la unión a CD19 con un anticuerpo de referencia, en donde el anticuerpo: (a) se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10"7 M o menor; y (b) se une a células tumorales de células B Raji y Daudi .
  12. 12. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
  13. 13. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.
  14. 14. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
  15. 15. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.
  16. 16. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
  17. 17. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
  18. 18. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
  19. 19. El anticuerpo de la reivindicación 11, en donde el anticuerpo de referencia comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
  20. 20. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 5-51 humano, o un gen VH 1-69 humano en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19.
  21. 21. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende una región variable de cadena . ligera que es el producto o se deriva de un gen V? L18 humano, V? A27 o un gen V? L15 humano, en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19.
  22. 22. El anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo de la reivindicación 21 que comprende además una región variable de cadena pesada que es el producto o se deriva de un gen VH 5-51 humano o un gen humano VH 1-69.
  23. 23. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 51.
  24. 24. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 16; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 23; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 30; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 37; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 44; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 52.
  25. 25. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 17; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 24; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 31; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 38; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 45; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 53.
  26. 26. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 18; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 25; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 32; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 39; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 46; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 54.
  27. 27. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 19; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 26; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 33; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 40; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 47; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 55.
  28. 28. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 20; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 27; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 34; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 41; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 48; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 56.
  29. 29. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende: (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 21; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 28; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 35; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 42; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 49; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 57.
  30. 30. El anticuerpo de la reivindicación 1, que comprende : (a) una CDRl de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 22; (b) una CDR2 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 29; (c) una CDR3 de región variable de cadena pesada que comprende la SEQ ID NO: 36; (d) una CDRl de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 43; (e) una CDR2 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 50; y (f) una CDR3 de región variable de cadena ligera que comprende la SEQ ID NO: 58.
  31. 31. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende : una región variable de cadena pesada que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3; y una región variable de cadena ligera que comprende secuencias CDRl, CDR2 y CDR3, en donde: (a) la secuencia CDR3 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 30, 31, 32, 33, 34, 35 y 36, y sus modificaciones conservadoras; (b) la secuencia CDR3 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 51, 52, 53, 54, 55, 56, 57 y 58, y sus modificaciones conservadoras; (c) el anticuerpo se une al CD19 humano con un KD de 1 x 10~7 M o menor; y (d) se une a células tumorales de células B Raji y Daudi .
  32. 32. El anticuerpo de la reivindicación 31, en donde la secuencia CDR2 de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 23, 24, 25, 26, 27, 28 y 29, y sus modificaciones conservadoras; y la secuencia CDR2 de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 44, 45, 46, 47, 48, 49 y 50, y sus modificaciones conservadoras.
  33. 33. El anticuerpo de la reivindicación 32, en donde la secuencia CDRl de región variable de cadena pesada comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 16, 17, 18, 19, 20, 21 y 22, y sus modificaciones conservadoras; y la secuencia CDRl de región variable de cadena ligera comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOs: 37, 38, 39, 40, 41, 42 y 43, y sus modificaciones conservadoras.
  34. 34. El anticuerpo de la reivindicación 31, que es un anticuerpo humano.
  35. 35. El anticuerpo de la reivindicación 31, que es un anticuerpo quimérico o humanizado.
  36. 36. Un anticuerpo monoclonal aislado, o una porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, que comprende : (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste de las SEQ ID NOs: 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 y 15; en donde el anticuerpo se une específicamente a CD19.
  37. 37. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 8.
  38. 38. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 1; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 9.
  39. 39. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 2; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 10.
  40. 40. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 11.
  41. 41. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 12.
  42. 42. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 13.
  43. 43. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 14.
  44. 44. Un anticuerpo monoclonal aislado o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo que comprende: (a) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 7; y (b) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 15.
  45. 45. Una composición que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, de la reivindicación 1, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  46. 46. Un inmunoconjugado que comprende el anticuerpo, o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, de la reivindicación 1, unido a un agente terapéutico.
  47. 47. Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 46 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  48. 48. El inmunoconjugado de la reivindicación 46, en donde el agente terapéutico es una citotoxina.
  49. 49. Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 48 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  50. 50. El inmunoconjugado de la reivindicación 46, en donde el agente terapéutico es un isótopo radiactivo.
  51. 51. Una composición que comprende el inmunoconjugado de la reivindicación 50 y un vehículo farmacéuticamente aceptable.
  52. 52. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica para el anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, de la reivindicación 1.
  53. 53. Un vector de expresión que comprende la molécula de ácido nucleico de la reivindicación 52.
  54. 54. Una célula huésped que comprende el vector de expresión de la reivindicación 53.
  55. 55. Un método para preparar un anticuerpo anti CD19 que comprende expresar el anticuerpo en la célula huésped de la reivindicación 54 y aislar el anticuerpo de la célula huésped.
  56. 56. Un método para inhibir el crecimiento de células tumorales que expresan CD19, que comprende poner en contacto las células con el anticuerpo, o porción de unión a antígeno o fragmento del mismo, de la reivindicación 1 en una cantidad efectiva para inhibir el crecimiento de las células tumorales .
  57. 57. El método de la reivindicación 56, en donde dichas células tumorales son malignidades de célula B.
  58. 58. El método de la reivindicación 57, en donde dicha malignidad de célula B es linfoma no de Hodgkin.
  59. 59. El método de la reivindicación 57, en donde dicha malignidad de célula B es linfoma de célula de corteza cerebral .
  60. 60. Un método de agotamiento de células B en un sujeto que comprende administrar al sujeto un anticuerpo anti CD19 en una cantidad efectiva para agotar las células B del sujeto .
  61. 61. El método de la reivindicación 60, en donde dicho anticuerpo anti CD19 es el anticuerpo de cualquiera de las reivindicaciones 1-44.
  62. 62. Un anticuerpo anti CD19 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-44 para uso terapéutico para agotar las células B en un sujeto.
  63. 63. El uso de un anticuerpo anti CD19 de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-44 para la elaboración de un medicamento para el agotamiento de las células B en un sujeto.
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